BR112015008618B1 - Método de análise de um embrião de milho isolado de uma planta de milho - Google Patents
Método de análise de um embrião de milho isolado de uma planta de milho Download PDFInfo
- Publication number
- BR112015008618B1 BR112015008618B1 BR112015008618-7A BR112015008618A BR112015008618B1 BR 112015008618 B1 BR112015008618 B1 BR 112015008618B1 BR 112015008618 A BR112015008618 A BR 112015008618A BR 112015008618 B1 BR112015008618 B1 BR 112015008618B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- embryo
- isolated
- piece
- plant
- scutellum
- Prior art date
Links
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 106
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 title claims 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims abstract description 28
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 75
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 13
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 9
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 7
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 5
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 4
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 4
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 4
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims description 4
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 4
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 54
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 13
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 5
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 5
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 5
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000003783 haploid cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 3
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 3
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 3
- 230000003322 aneuploid effect Effects 0.000 description 3
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- -1 pH changes Substances 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 2
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 2
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 2
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- 208000036086 Chromosome Duplication Diseases 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 241001520808 Panicum virgatum Species 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 2
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 2
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- 206010041662 Splinter Diseases 0.000 description 2
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 2
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000030118 somatic embryogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 241000228158 x Triticosecale Species 0.000 description 2
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 108010050181 aleurone Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- WHLATLJVYMNVTJ-UHFFFAOYSA-N methyl n-(1,2,3,10-tetramethoxy-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl)carbamate Chemical compound C1=C(OC)C(=O)C=C2C(NC(=O)OC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 WHLATLJVYMNVTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003203 nucleic acid sequencing method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000004382 potting Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/02—Devices for withdrawing samples
- G01N1/04—Devices for withdrawing samples in the solid state, e.g. by cutting
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
método de análise de um embrião isolado de uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea. a presente invenção provê novos métodos para facilitar atividades de melhoramento de germoplasma pelo uso de uma amostragem de embrião. um método que compreende a obtenção de pelo menos um embrião isolado, excisão de um pedaço de tecido de escutelo ou cotiledôneo de pelo menos um embrião isolado de forma que o potencial de germinação não seja significativamente reduzido e seja provida análise da(s) amostra(s) de tecido de escutelo ou cotiledôneo quanto à presença ou ausência de uma ou mais características indicativas de pelo menos um traço genético.
Description
[001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório dos EUA de N° 61/786968, depositado em 15 de março de 2013, e ao Pedido Provisório dos EUA de N° 61/722399, depositado em 05 de novembro de 2012, cujos conteúdos completos estão aqui incorporados por referência.
[002] A presente invenção está relacionada a métodos para a amostragem de embriões isolados para a identificação de embriões que podem se desenvolver para a formação de plantas que têm características desejáveis.
[003] Na reprodução tradicional de plantas, gerações de plantas baseadas em cruzamentos conhecidos ou autopolinizações são plantadas e em seguida testadas para se verificar se as linhas ou variedades estão se movendo em direção às características que são desejáveis no mercado. Como pode ser apreciado e é um fato bem conhecido no estado da técnica, esses experimentos podem ter uma escala de grande proporção. Eles envolvem uma enorme força de trabalho que vai de cientistas a pessoal de campo para projetar, plantar, manter e realizar os experimentos, que podem envolver milhares ou dezenas de milhares de plantas individuais. Eles também demandam substanciais recursos de extensões de terras. Lotes ou estufas podem ocupar milhares de acres de terra. Não somente isso ocupa grandes quantidades de terra durante muitos meses enquanto as plantas germinam, crescem, e produzem sementes, durante cujo tempo elas podem ser tomadas como amostras para testes em laboratório ou no campo, como também as enormes quantidades de sementes podem ser individualmente etiquetadas, cultivadas e processadas.
[004] Outra complicação é que grande parte do experimento dá em nada. Tem sido reportado na literatura que algumas empresas que trabalham com sementes descartam de 80% a 90% das plantas em qualquer geração logo no início do experimento. Dessa maneira, uma grande parte da terra, da mão-de-obra e dos recursos materiais gastos para o crescimento, cultivo, e processamento pós-cultivo em última análise são desperdiçados no trabalho com uma grande porcentagem das sementes.
[005] As pressões no que diz respeito a tempo são também um fator importante. Avanços significativos na reprodução de plantas colocaram mais pressão nos programas de reprodução para que avancem mais rapidamente nas linhagens ou variedades de plantas para a obtenção de mais e melhores particularidades e características genéticas. Os reprodutores de plantas e trabalhadores associados estão desse modo sob pressão cada vez maior para processarem mais eficiente e eficazmente essas gerações e para fazerem mais e mais precoces seleções de plantas que devem ser continuadas na próxima geração de reprodução.
[006] Um grande número de práticas utilizadas atualmente acelerou os ganhos produzidos pelas reproduções de plantas com considerável economia de custos. Por exemplo, os protocolos para a criação de haploides duplicados eliminaram a necessidade de muitos anos de individualizações e subsequentes avaliações para a obtenção de plantas de genes homozigotos. Além do mais, o poder dos dados dos marcadores genéticos, e a facilidade da obtenção de tais recursos, permitiram que as plantas que não contêm características desejadas sejam retiradas da população antes do gasto de recursos significantes. Além disso, as práticas recentes têm utilizados testes baseados em laboratório no estágio de semente, os quais geralmente são denominados de apicoamento do grão ou apicoamento da semente, nos quais a semente é testada de maneira não destrutiva para a obtenção de informações genéticas, bioquímicas ou a respeito do fenótipo (Sangtong, V. et al. (2001) Plant Molecular Biology Reporter 19:151-158). A ação de se testar a semente evita a necessidade de se deixar que a semente cresça e se desenvolva em plantas imaturas, com isso se poupando tempo, espaço e esforços.
[007] Entretanto, ainda existem melhorias que podem ser realizadas. Em particular, há uma necessidade de métodos para caracterizar embriões de forma molecular ainda na fase inicial do seu desenvolvimento, especialmente como parte do processo de haploide duplicado ou de outros processos que utilizam técnicas de recuperação de embriões.
[008] A presente invenção refere-se a métodos para facilitar as atividades de melhoria de plantas através da utilização da amostragem de embriões de plantas. Por meio do processo descrito neste pedido de patente, é possível se testar embriões isolados individuais e se selecionar somente aqueles embriões que podem se desenvolver em plantas que possuem uma ou mais características desejadas. Isso permite a criação de métodos novos e mais eficientes para o melhoramento e o gerenciamento de plantas, o que leva a melhores populações de reprodução.
[009] Métodos de analisar um embrião isolado de uma planta monocotiledônea são fornecidos neste artigo. Em tais métodos, um pedaço de tecido de escutelo (ou cotilédone modificado em formato de escudeto) é removido de um embrião isolado, no qual dita excisão de remoção não causa uma redução significativa no potencial de germinação do embrião. O pedaço de tecido de escutelo é então analisado quanto à presença ou ausência de uma ou mais características indicativas de pelo menos uma característica genética.
[010] O embrião isolado pode ser imaturo, e ele pode ser de milho, sorgo, trigo, arroz, cevada, aveia, centeio, milho miúdo, cana de açúcar, triticale, e switchgrass (gramínea dos EUA). O embrião isolado pode ser obtido diretamente de uma semente, ou pode ser derivado de outros tecidos. O embrião isolado pode ser fresco ou resfriado. O embrião isolado é viável e capaz de germinar e desenvolver-se como uma planta depois de dito pedaço de tecido de escutelo ser removido por corte. O embrião isolado pode ser de qualquer ploidia, tal como, porém não limitado a haploide, diploide, haploide duplicado, aneuploide, tetraploide, hexaploide, ou octaploide.
[011] O pedaço de tecido de escutelo retirado do embrião isolado pode ser liofilizado, fresco, congelado, ou resfriado após a amostragem.
[012] O pedaço de tecido de escutelo pode ser igual ou maior do que um único núcleo.
[013] A excisão do tecido de escutelo pode ocorrer por qualquer meio conhecido no estado da técnica, tal como, porém não limitado a: por uma broca de furadeira, por um jato de água, por um laser, por uma lâmina única, por um conjunto de lâminas opostas, por uma seringa, por um coletor de amostra de núcleo (ferramenta de coleta de núcleo), por uma lâmina de bisturi, por um arame de pequeno diâmetro, por uma corda de arame texturizado de pequeno diâmetro, por uma espátula, e por um cotonete de esfregaço. A excisão pode ser feita manualmente ou por meio de um processo automatizado.
[014] O embrião isolado pode ser posicionado com o meristema voltado para baixo onde o pedaço é removido por excisão a partir da extremidade oposta do meristema. O posicionamento pode ser feito manualmente ou de uma forma automatizada com utilização de movimento mecânico, acionamento, etc. A automação pode incluir robótica, sistemas de visão, ou uma combinação de ambos.
[015] O pedaço de tecido de escutelo pode ser analisado quanto a uma ou mais características selecionadas dentre o grupo consistente de: um marcador genético, poliformismo de um único nucleotídeo, uma repetição de sequência simples, um polimorfismo com extensão de fragmentos de restrição, um haplótipo, um SNP de etiqueta, um alelo de um marcador genético, um gene, uma sequência derivada de DNA, uma sequência derivada de RNA, um promotor, uma região de 5' não traduzida de um gene, uma região de 3' não traduzida de um gene, microRNA, siRNA, um QTL, um marcador de satélite, um transgene, mRNA, ds mRNA, um perfil transcricional, um padrão de metilação, e nível de ploidia.
[016] Métodos de análise de um embrião isolado de uma planta dicotiledônea são fornecidos aqui. Em tais métodos, um pedaço de tecido de cotilédone é removido por excisão de um embrião isolado, no qual dita excisão não causa uma redução significativa do potencial de germinação do embrião. O pedaço de tecido de cotilédone é então analisado quanto à presença ou ausência de uma ou mais características indicativas de pelo menos uma característica genética.
[017] O embrião isolado pode ser imaturo, e pode ser canola, soja, girassol, alfafa, ou algodão. O embrião isolado pode ser obtido diretamente de uma semente, ou pode ser derivado de outros tecidos. O embrião isolado pode ser fresco ou resfriado. O embrião isolado é viável e é capaz de germinar desenvolvendo-se numa planta depois de dito pedaço de tecido de cotilédone ser removido por excisão. O embrião isolado pode ser de qualquer ploidia tal como, porém não limitado a um haploide, diploide, haploide duplicado, aneuploide, tetraploide, hexaploide, ou octaploide.
[018] O pedaço de tecido de cotilédone excisado do embrião isolado pode ser liofilizado, fresco, congelado, ou resfriado após a amostragem.
[019] O pedaço de tecido de cotilédone pode ser igual a ou maior do que um único núcleo.
[020] A excisão do tecido de cotilédone pode ocorrer por qualquer meio conhecido no estado da técnica tal como, porém não limitado a: uma broca de furadeira, um jato de água, um laser, uma lâmina única, um jogo de lâminas opostas, uma seringa, um tomador de amostras de núcleo (ferramenta extratora de núcleo), um bisturi, um fio de diâmetro pequeno, uma corda de arame texturizado de pequeno diâmetro, uma espátula, e um cotonete de esfregaço. A excisão pode ser feita manualmente ou por meio de um processo automatizado.
[021] O pedaço de tecido de cotilédone pode ser analisado quanto a uma ou mais características selecionadas dentre o grupo consistente de: um marcador genético, um polimorfismo de nucleotídeo único, uma repetição de sequência simples, um polimorfismo com extensão de fragmentos de restrição, um haplótipo, um SNP de etiqueta, um alelo de um marcador genético, um gene, uma sequência derivada de DNA, uma sequência derivada de RNA, um promotor, uma região de 5' não traduzida de um gene, uma região de 3' não traduzida de um gene, microRNA, siRNA, um QTL, um marcador de satélite, um transgene, mRNA, ds mRNA, um perfil transcricional, um padrão de metilação, e nível de ploidia.
[022] A divulgação de cada referência estabelecida neste pedido de patente é incorporada por este artigo por referência em sua totalidade.
[023] Como usadas aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares um, uma e (o, a) incluem referência plural, a não ser que o contexto indique claramente de maneira diferente. Dessa maneira, por exemplo, referência a “uma planta” inclui uma pluralidade de tais plantas, referência a “uma célula” inclui uma ou mais células e equivalentes delas conhecidas daqueles versados no estado da técnica, e assim por diante.COMO USADO NESTE TEXTO
[024] “Callus” (ou calo) refere-se a uma massa de células em proliferação diferenciadas ou tecido.
[025] As frases “contatando”, “entra em contato com” ou “colocada em contato com” podem ser usadas para significar “contato direto” ou “contato indireto”. Por exemplo, o meio compreendendo um agente duplicador pode ter contato direto com a célula haploide ou o meio compreendendo o agente duplicador pode ser separado da célula haploide por papel-filtro, tecidos de planta, ou por outras células, desse modo o agente duplicador é transferido através do papel-filtro ou através das células para a célula haploide.
[026] Uma planta “diploide” tem dois conjuntos (genomas) de cromossomos e o número de cromossomos (2n) é igual ao número de cromossomos contido no zigoto.
[027] Um “haploide duplicado” ou planta ou célula haploide duplicada é uma que é desenvolvida pela duplicação de um conjunto haploide de cromossomos. Uma planta ou semente que é obtida de uma planta haploide duplicada que é individualizada por qualquer número de gerações ainda pode ser identificada como uma planta haploide duplicada. Uma planta haploide duplicada é considerada como uma planta homozigota. Uma planta é considerada ser uma haploide duplicada se for fértil, mesmo que toda a parte vegetativa da planta não consista das células com o conjunto duplicado de cromossomos. Por exemplo, uma planta será considerada como uma planta haploide duplicada se ela contiver gametas viáveis, mesmo se ela for quimérica.
[028] Um “embrião haploide duplicado” é um embrião que tem uma ou mais células que contêm 2 conjuntos de cromossomos homozigotos.
[029] “Embriogênese” pode ser definida como o processo de iniciação, proliferação e/ou desenvolvimento de embrião.
[030] “Embriogênico” no contexto de células ou tecidos significa que as células ou tecidos podem ser induzidos para formarem embriões de plantas viáveis em condições de cultura apropriadas.
[031] “Germinação” refere-se ao processo de desenvolvimento do embrião de uma semente em uma planta. A germinação pode ocorrer in vitro ou in vivo.
[032] “Potencial de germinação” pode ser definido como a capacidade de um embrião para completar a germinação. A frase “sem uma redução significativa do potencial de germinação” refere-se ao fato de que uma planta normal se desenvolverá. Uma planta normal pode ser definida como uma planta que pode estabelecer semente com sucesso.
[033] Uma planta “haploide" tem um único conjunto (genoma) de cromossomos e o número de cromossomos (n) é igual ao contido no gameta.
[034] Um “embrião isolado” é um embrião que não está associado a uma semente. Isso pode ocorrer devido à remoção de um embrião de uma semente ou porque o embrião é derivado de outros tecidos por meio da embriogênese somática ou gamética (de micro esporos).
[035] Um embrião “maduro” refere-se a um embrião que completou a embriogênese onde dito embrião maduro é desidratado e adormecido metabolicamente. Um embrião “imaturo” refere-se a um embrião a partir da iniciação da divisão celular num ovo através do término da embriogênese.
[036] O termo “embrião somático maduro” refere-se a um embrião plenamente desenvolvido derivado de tecido somático, com evidência de raiz e ápices de rebentos e apresentando uma estrutura bipolar. Nas plantas monocotiledôneas, o embrião somático maduro terá um cotilédone modificado (de escutelo).
[037] O termo “meio” inclui compostos nos estados líquido, gasoso ou sólido.
[038] Os termos “monocotilédone” e “planta monocotiledônea” são usados de forma intercambiável neste documento.
[039] Os termos “dicotilédone” e “planta dicotiledônea” são usados de forma intercambiável neste documento.
[040] Como usados neste documento, o termo “planta” inclui referência a plantas completas, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes e células de plantas e descendência dos mesmos. O termo “célula de planta”, como utilizado neste documento inclui, sem limitação, sementes, culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido caloso, folhas, raízes, rebentos, gametófitos, esporófitos, pólen, e micro esporos.
[041] O termo “embrião somático primário” refere-se a um embrião somático que se origina de tecidos diferentes daqueles de outro embrião somático. Por “embrião somático” se quer dizer um embrião formado in vitro a partir de células somáticas ou de células embriogênicas por divisão celular mitótica.
[042] “Amostragem de escutelo” refere-se à excisão de uma porção do de escutelo de um embrião.
[043] “Amostragem de cotilédone” refere-se à excisão de uma porção de cotilédone de um embrião.
[044] O termo “embriogênese somática” refere-se ao processo de iniciação e desenvolvimento de embriões in vitro de células e tecidos de plantas sem a ocorrência da reprodução sexual.
[045] A amostragem de embriões permite a caracterização molecular precoce no desenvolvimento das plantas, permitindo que as seleções de um genótipo desejado sejam feita com semanas, e até mesmo com meses de antecedência em relação aos outros métodos de amostragem empregados atualmente.
[046] O de escutelo é o cotilédone modificado das plantas na família Poaceae, que é uma grande família de plantas monocotiledôneas que produzem flores. É uma estrutura em forma de escudo que envolve o eixo embriônico e que tem diversas funções. Durante a formação da semente, o de escutelo funciona como um órgão de armazenamento que acumula principalmente lipídios, mas também proteínas e amido. Então, durante a germinação, o de escutelo segrega ambos os hormônios que induzem a produção de enzimas hidrolíticas na camada aleurona e enzimas que ajudam na digestão de reservas de endoesperma. Além disso, o de escutelo também transporta os nutrientes digeridos do endoesperma para o eixo do embrião.
[047] O de escutelo tem uma alta densidade de células e, por conseguinte, mais núcleos por unidade de tecido em comparação a tecido de folha, resultando numa maior concentração de DNA. A alta densidade de DNA torna o tecido do de escutelo uma excelente fonte para a extração do DNA genômico; entretanto, esforços anteriores não focalizaram o tecido do de escutelo como uma fonte de amostragem porque se pensava que se removendo uma porção do de escutelo se causaria graves implicações no desenvolvimento do embrião.
[048] São fornecidos métodos de análise de um embrião de uma planta monocotiledônea nos quais um pedaço de escutelo é removido ou excisado do embrião isolado. Cotilédones de embriões isolados de plantas dicotiledôneas também podem ser tomados como amostras de uma maneira similar. Como tais, métodos de análise de um embrião de uma planta dicotiledônea também são fornecidos, nos quais um pedaço de tecido cotiledôneo é removido ou excisado do embrião isolado.
[049] Ao se excisar um pedaço de escutelo ou tecido de cotilédone de um embrião isolado, deve-se tomar cuidado no sentido de se remover o tecido sem se danificar as regiões meristemáticas do embrião. Isso permitirá que o embrião continue a se desenvolver, com um mínimo de perturbação, formando uma planta normal (isto é, o embrião não tem uma redução significativa do seu potencial de germinação).
[050] Os métodos da revelação atual podem ainda compreender o tratamento dos embriões amostrados para a manutenção do potencial de germinação. Tal tratamento pode geralmente incluir qualquer meio conhecido no estado da técnica para a proteção de um embrião, ou de uma planta ou plantinha derivada de um embrião, em relação às condições ambientais durante a armazenagem ou o transporte. Por exemplo, os embriões amostrados podem ser tratados com um polímero e/ou com um fungicida para proteger o embrião amostrado durante a armazenagem ou o transporte.
[051] Os métodos da revelação atual podem ainda compreender a anexação de um identificador ao receptáculo que contém a amostra bem como ao receptáculo que contém o embrião isolado do qual a amostra foi removida por excisão. Isso mantém a identidade da amostra e do embrião, permitindo que eles sejam apropriadamente rastreados de tal maneira que a amostra seja sempre associada com o embrião do qual ela foi excisada. O identificador pode ser um código de barra impresso ou um rótulo.
[052] Nos métodos da revelação, uma amostra pode ser excisada ou removida de um embrião de uma planta monocotiledônea no qual dita amostra é um pedaço de tecido de escutelo. A planta monocotiledônea pode ser, porém não está limitada a milho, sorgo, trigo, arroz, cevada, aveia, centeio, painço (ou milho miúdo), cana de açúcar, triticale, ou switchgrass (grama americana).
[053] O embrião isolado pode ser obtido de uma semente (isto é, embriogênese zigótica) ou pode ser “derivado de outros tecidos” por meio de embriogênese somática ou gamética (micro esporo). A embriogênese somática está relacionada à embriogênese que se origina de células somáticas (isto é, de células vegetativas ou não gaméticas), ou seja, de extratos somáticos isolados, ao passo que a embriogênese gamética está relacionada à embriogênese que é originada de células gaméticas (isto é, de micro esporos). Uma vez que as células somáticas e as células gaméticas não são naturalmente embriogênicas, tais células devem ser induzidas a se tornarem embriogênicas. A conversão para células embriogênicas pode ser conseguida por meio de estímulos externos tais como auxina, cito quinina, alterações de pH, reguladores de crescimento, e íons de metais pesados (Yeung, 1995 In: Thorpe TA (ed) In Vitro Embryogenesis in Plants (pp. 205-249; Dodeman et al. (1997)J. Exp. Bot. 48:1493-1509.
[054] O embrião isolado deve ser viável e capaz de germinar para desenvolver-se em uma planta após o pedaço de escutelo ou tecido de cotilédone ser excisado, de embriões de monocotiledôneas e de dicotiledôneas, respectivamente. O embrião isolado pode ser de qualquer ploidia que possa existir numa planta monocotiledônea da invenção. Por exemplo, o embrião isolado pode ser um haploide, diploide, haploide duplicado, aneuploide, tetraploide, hexaploide, ou octaploide.
[055] Pode ser apreciado que um embrião isolado pode ou não ser tomado como amostra imediatamente após a isolação. Dessa maneira, o embrião isolado pode ser fresco ou resfriado antes de e/ou durante a amostragem.
[056] Os métodos de amostragem podem ser mencionados neste artigo com termos diferentes (usados de modo intercambiável neste texto), tais como, por exemplo, amostragem, excisão, fragmentação, recorte, fatiamento, corte, recorte em tiras, ou retirada de uma amostra. A amostragem do de escutelo pode ocorrer por qualquer meio conhecido no estado da técnica tal como, porém não limitado a: uma broca de furadeira, um jato de água, um laser, uma lâmina única, um conjunto de lâminas opostas, uma seringa, um extrator de amostras de núcleo (ferramenta de remoção de amostra), um bisturi, um arame de diâmetro pequeno, uma corda de arame texturizado de diâmetro pequeno, uma espátula, e um cotonete de esfregaço. Além do mais, a amostragem pode ser feita manualmente ou por meio de um processo automatizado.
[057] A automação da excisão do pedaço de escutelo ou de tecido de cotilédone pode incluir um ou mais dos seguintes: a) determinação da localização e orientação de um embrião isolado de uma pluralidade de embriões isolados com o uso de um instrumento de visão automatizado; b) determinação das especificações físicas de um embrião isolado (por exemplo, comprimento, largura, área de superfície, espessura, e forma) utilizando um instrumento de visão automatizado; c) orientando um embrião isolado para uma localização prescrita utilizando instrumento de aperto pneumático ou de vácuo ou manipulação mecânico-física; d) orientando o instrumento de excisão com relação a um embrião isolado seja fisicamente, ou no caso de uma ferramenta de excisão orientada por laser, oticamente; e) acionando a ferramenta ou movendo um embrião isolado através da ferramenta para remover a amostra; f) colocando a amostra e o embrião restante em recipientes separados; g) rastreando a amostra e o embrião restante um em relação ao outro para uso e seleção no processo de reprodução; h) limpeza e/ou esterilização da ferramenta para evitar a contaminação cruzada ou a proliferação de bactérias; i) descarte da ferramenta se a limpeza e/ou a esterilização não forem feitas; j) colocação de um fragmento de uma ferramenta num recipiente para análise direta onde a amostra está em/sobre dito fragmento de tal maneira que o fragmento da ferramenta não interfira na extração (por exemplo, como com um arame usado para raspar ou furar um embrião isolado que é então cortado numa chapa de laboratório para extração de DNA); e k) enxágue da ferramenta em meio de extração.
[058] Se um arame de pequeno diâmetro for usado, o arame de pequeno diâmetro pode ter menos de 1 mm de diâmetro, e o arame pode ser frio ou quente. O arame também pode ser moldado para uma estrutura que facilite a amostragem.
[059] Qualquer laser conhecido por uma pessoa ordinariamente versada no estado da técnica do corte de tecidos biológicos pode ser usado. As ferramentas a laser que cortam na faixa dos Nanossegundos e dos Picossegundos são apropriadas para uso nos métodos da invenção. Outro tipo de ferramenta a laser que pode ser usada é a ferramenta a laser de Femtossegundos. Os lasers de Femtossegundos têm larguras de pulso na faixa dos femtossegundos (1 fs = 10-15 segundos), que produz um kerf (corte) estreito e que minimiza a zona afetada pelo calor, com isso se evitando a danificação pelo calor do material que está sendo cortado.
[060] A “amostra” também pode ser descrita neste instrumento como uma célula, um núcleo, uma peça, um clipe, uma lasca, um estilhaço, uma parte, uma porção, um fragmento, uma seção, uma fatia, ou qualquer outro termo que se refere a um pedaço monolítico que pode ser separado de um embrião sem destruir a viabilidade do embrião ou seu potencial para se desenvolver numa planta saudável (isto é, potencial de germinação). A amostra extraída por corte do embrião isolado pode ser liofilizada, fresca, congelada, ou resfriada após a amostragem.
[061] O tamanho de pedaço de tecido de escutelo excisado do embrião isolado pode ser igual a ou maior do que um núcleo único. O pedaço de tecido de escutelo pode também ser uma célula removida ou menos do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66,67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87,88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% do de escutelo total. O tamanho do pedaço pode ser qualquer parte do de escutelo que não cause uma redução significativa do potencial de germinação do embrião isolado.
[062] O tamanho do pedaço do tecido de cotilédone excisado do embrião de dicotiledônea pode ser igual a ou maior do que um núcleo único. O pedaço do tecido de cotilédone pode também ser uma célula esfoliada ou menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63,64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% da quantidade total de tecido de cotilédone. O pedaço pode ser de um dos dois cotilédones ou de ambos os cotilédones.
[063] A amostra pode ser tomada de qualquer área do de escutelo, e o embrião de monocotiledônea isolado pode ser posicionado com o meristema para baixo onde o pedaço de escutelo é cortado da extremidade oposta do meristema.
[064] De maneira similar, a amostragem pode ser tirada de qualquer área dos cotilédones do embrião de dicotiledônea isolado. O embrião de dicotiledônea isolado pode ser posicionado de tal forma a evitar danos ao meristema.
[065] O posicionamento pode ser feito manualmente ou de uma forma automatizada utilizando movimento mecânico, acionamento, etc. A automação pode incluir o uso de robótica, sistemas de visão, ou uma combinação das duas coisas.
[066] O pedaço de escutelo ou de tecido de cotilédone pode ser analisado quanto a uma ou mais características indicativas de uma característica genética. A característica genética pode incluir, porém não está limitada a um marcador genético, um polimorfismo de nucleotídeo único, uma repetição de sequência única, um polimorfismo com extensão de fragmentos de restrição, um haplótipo, um SNP de etiqueta, um alelo de um marcador genético, um gene, uma sequência derivada de DNA, uma sequência derivada de RNA, um promotor, uma região de 5' não traduzida de um gene, uma região de 3' não traduzida de um gene, microRNA, siRNA, um QTL, um marcador de satélite, um transgene, mRNA, ds mRNA, um perfil transcricional, um padrão de metilação, e nível de ploidia.
[067] DNA pode ser extraído da amostra usando-se qualquer método de extração de DNA conhecido por aqueles versados no estado da técnica que proporcione uma produção de DNA suficiente, de boa qualidade, resposta de PCR, e resposta de métodos de sequenciamento. Isso pode incluir, porém não está limitado a: Extrato N Amp (Sigma-Aldrich), protocolo CTAB padrão, métodos HotShot, etc. Além disso, o DNA extraído pode ser ampliado após a extração utilizando-se qualquer método de ampliação conhecido pelo versado na técnica.
[068] Ademais, o RNA pode ser extraído da amostra utilizando- se qualquer método de extração de RNA conhecido por aqueles versados no estado da técnica que produza uma quantidade de RNA suficiente, RNA de boa qualidade, resposta de PCR, e resposta de métodos de sequenciamento. Adicionalmente, o RNA extraído pode ser ampliado após a extração utilizando- se qualquer método de ampliação conhecido pelas pessoas versadas no estado da técnica.
[069] Os ácidos nucleicos extraídos podem ser analisados quanto à presença ou à ausência de um polimorfismo genético apropriado. Uma grande variedade de marcadores genéticos para a análise dos polimorfismos genéticos está disponível e é conhecida pelo versado na técnica. Como usado neste instrumento, os marcadores genéticos incluem, porém não estão limitados a repetições de sequências simples (“SSRs”), polimorfismos de nucleotídeo único (“SNPs”), inserções ou apagamentos (indels), perfis transcricionais, e sequências de ácido nucleico. Uma análise de ácido nucleico quanto à presença ou à ausência do marcador genético pode ser usada para a seleção de embriões como parte de um programa de melhoramento ou de reprodução de uma planta. A análise pode ser usada para se selecionar embriões que tenham genes, QTLs, alelos, ou haplótipos de interesse. Os métodos de análise são conhecidos no estado da técnica e incluem, porém não estão limitados a, métodos de detecção baseados-em-PCR (tal como, por exemplo, testes TaqMan), métodos de micro arranjos, e métodos de sequenciamento de ácido nucleico. Os genes, alelos, QTLs, ou haplótipos podem também ser identificados utilizando-se tecnologias mais modernas de biologia molecular.
[070] Os métodos da presente invenção que utilizam a amostragem de embriões para contribuírem para as atividades de melhoramento do germoplasma incluem, porém não estão limitados a: economia de programas de haploide duplicado pela seleção de somente embriões preferidos para a duplicação, análise de haploide e material de haploide duplicado para verificação de características de genótipo, integração e avaliação, e reprodução auxiliada por marcador.
[071] As plantas que apresentam haploide duplicado (“DH”) fornecem uma ferramenta valiosa para os reprodutores de plantas, particularmente para a geração de linhagens de procriação consanguínea ou puras. Poupa-se uma grande quantidade de tempo, uma vez que as linhagens de homozigotos são essencialmente geradas instantaneamente, negando a necessidade de procriação convencional de múltiplas gerações.
[072] Contudo, é um fato bem conhecido no estado da técnica que o processo de produção de haploides duplicados (“DHs”) é ineficiente e pode exigir uma grande quantidade de trabalho. Embora as plantas haploides possam ocorrer espontaneamente na natureza, isso é um acontecimento extremamente raro. A maior parte das aplicações de pesquisa e reprodução é baseada em métodos artificiais de produção de haploides duplicados. A etapa inicial envolve a haploidização da planta que resulta na produção de uma população que compreende semente haploide. Linhagens não homozigotas são cruzadas com um pai indutor, resultando na produção de semente haploide. Semente que tem um embrião haploide, porém endoesperma triploide normal avança para o segundo estágio. Isto é, as sementes e plantas haploides são qualquer planta que tenha um embrião haploide, independentemente do nível de ploidia do endoesperma. Após a seleção de sementes haploides dentre a população, as sementes selecionadas passam por um processo de duplicação de cromossomo para a produção de sementes haploides duplicadas. Uma duplicação de cromossomo espontânea na linhagem de uma célula levará a produção de gameta normal ou a produção de gametas não reduzidas das linhagens de células haploides. A aplicação de um composto químico, tal como colchicina, pode ser usada para se aumentar a taxa de diploidização. A colchicina se une à tubulina e impede sua polimerização em micro túbulos, dessa forma travando a mitose na metáfase, e pode ser usada para se aumentar a taxa de diploidização, isto é, a duplicação do número de cromossomos. Essas plantas quiméricas são autopolinizadas para produzirem uma semente diploide (de haploide duplicado). Essa semente de haploide duplicado (“DH”) é cultivada e subsequentemente avaliada e usada em produção de cruzamento-teste híbrido.
[073] Os métodos da presente invenção facilitam o potencial para a seleção na fase haploide bem como na fase do haploide duplicado. Como parte de um programa de haploide duplicado, embriões haploides imaturos são isolados, e os embriões haploides são então colocados em contato com um agente duplicador tal como a colchinina ou qualquer outro agente conhecido no estado da técnica. A amostragem pode ser feita antes da exposição ao agente duplicador ou posteriormente. Na primeira hipótese, os embriões tomados como amostra antes da duplicação podem ser identificados como candidatos para a duplicação com base no resultado da amostragem. Na segunda hipótese, assim que a fase de duplicação tiver sido concluída é necessário se transferir os embriões selecionados do meio duplicador para um meio isento de agente duplicador, tal como, por exemplo, um meio de germinação. Nessa etapa é conveniente e não dispendioso se remover um pedaço de escutelo ou tecido de cotilédone para análise molecular. Os métodos apresentados neste instrumento com isso permitem que decisões de avanço sejam tomadas precocemente no processo de haploide duplicado.
[074] Os métodos da invenção podem ser facilmente integrados em qualquer processo de resgate de embrião no qual um embrião é isolado e em seguida cultivado. Por exemplo, na reprodução de plantas, a utilização de técnicas de resgate de embrião diminui significativamente o tempo necessário para a transferência de uma característica benéfica de um progenitor doador para um progenitor recorrente com o patrimônio genético desejado (Wang et al. 2011. Plant Breeding. 130:569-573). As técnicas envolvem o cultivo deembriões imaturos num meio de nutrição que pode ou não ser suplementado com um agente seletivo para a seleção de explantes transgênicos, se transplantando os embriões ou as plantinhas derivadas dali para um ambiente de crescimento controlado durante um período de tempo suficiente, e em seguida se transplantando as plantinhas para o campo. Antes do gasto de recursos, é conveniente e não dispendioso se retirar um pedaço de escutelo ou tecido de cotilédone dos embriões imaturos para análise molecular para a identificação daqueles embriões que produzirão plantas com as características desejadas.
[075] A presente invenção é também ilustrada nos exemplos a seguir, nos quais partes e porcentagens estão em peso e graus são Celsius, desde que não conste indicação diferente. Naturalmente que esses exemplos, embora indiquem concretizações da invenção, estão indicados por via de ilustração somente. Da discussão acima e esses exemplos, o versado na técnica pode verificar que características essenciais desta invenção, e sem abandonar o espírito e escopo deste, podem executar várias alterações e modificações da invenção para adaptá-las aos vários usos e condições. Desse modo, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui ficarão patentes ao versado na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações também são concebidas para estarem enquadradas no escopo das reivindicações anexas.
[076] Tecido de escutelo foi cortado de embriões imaturos de tamanho de aproximadamente 2-4 mm e em seguida colocado no meio. As amostras foram colocadas no refrigerador pelo menos uma semana antes da extrair DNA, e as porções remanescentes dos embriões de milho foram plantadas na estufa.
[077] Amostras foram removidas do meio com pinças e lavadas em água HPLC e em seguida secadas com palmadinhas. As amostras foram depois colocadas em tubos de amostra dentro de uma placa de 96 cavidades. O tecido de folha de genótipo desconhecido também foi adicionado a tubos de amostra desocupados na placa de 96 cavidades como um meio de comparação. Duas placas de Petri em duplicatas foram feitas da mesma placa mestre. Uma etapa de moagem adicional foi utilizada para assegurar que as amostras foram moídas intensamente. Dois diferentes protocolos de extração foram usados em cada tipo de tecido, o protocolo de extração HotShot DNA e o protocolo de extração Sbeadex. Trinta e dois marcadores SNP foram inicialmente testados com uso de uma plataforma Invader Plus.
[078] Os resultados obtidos mostram que existe DNA extraído suficiente de cada amostra de escutelo para executar a análise de marcador molecular e de fato as amostras de escutelo amplificadas com a mesma “intensidade” como as amostras de folha na mesma placa.
[079] Desenvolvimento foi retardado dentro da primeira semana de germinação, porém o atraso foi temporário e não pode ser detectado uma semana após envasamento na estufa.EXEMPLO 2
[080] Uma amostra de tecido de escutelo foi retirada de cada embrião imaturo com uso de bisturi novo, estéril. As amostras foram colocadas em placas de campo e depois colocadas em tubos com uso de novos esfregaços, estéreis de algodão. Amostras de folha a partir de plantas haploide dobradas foram também coletadas no campo e congeladas. Duas punções de folha foram executadas por amostra.
[081] Dois protocolos de extração diferentes foram usados em cada tipo de tecido, o protocolo de extração HotShot DNA e o protocolo de extração Sbeadex. DNA extraído foi gerido com marcadores SNP de produção quarenta e oito. Concordância estava dentro dos padrões de produção com apenas 0,22% de viradas (i.e. denominações de alelo incorretas). Além disso, tanto amostras de folha como de escutelo executadas dentro de padrões de produção abaixo de 5% NF (não encontrado). Heterozigotos (Hets) foram classificados como equívocos quando amostras eram amostras haploides dobradas. TABELA 1DESEMPENHO DE MARCADOR: COMPARAÇÃO ENTRE AMOSTRAS DE ESCUTELO EDE FOLHA
EXEMPLO 3
[082] Tecido cotiledôneo foi retirado de embriões canola derivado de microesporo imaturo e colocados no meio. Amostras foram removidas do meio com pinças e levadas em água HPLC e em seguida secadas a palmadinhas. Em seguida, as amostras foram colocadas em tubos de amostra dentro de uma placa de 96 cavidades. Tecido de folha de genótipo desconhecido foi também adicionado a tubos de amostra desocupados na placa de 96 cavidades como um meio de comparação. Duas placas em duplicata foram feitas a partir da mesma placa mestre. Uma etapa de moagem adicional foi utilizada para assegurar que as amostras foram bem moídas. Os dois protocolos de extração diferentes foram usados em cada tipo de tecido, o protocolo de extração HotShot DNA e o protocolo de extração Sbeadex. Oito marcadores SNP foram testados com uso de uma plataforma Invader Plus.
[083] DNA extraído (com uso de método de extração Sbeadex ou Hotshot) foi gerido com oito marcadores SNP de produção. Os resultados são mostrados na tabela 3. O método Sbeadex resultou em uma elevada %NF (i.e. não encontrado). O método de extração Hotshot forneceu resultados ligeiramente fora de faixa aceitável (<5% NF) para os embriões imaturos pequenos, mas isso ainda foi melhor do que os resultados obtidos com o tecido de folha. As amostras “pequenas” tiveram melhor desempenho do que as amostras “grandes”. Sobretudo, os resultados mostraram que existe DNA suficiente extraído de cada amostra cotiledônea para realizar a análise de marcador molecular.
[084] Com relação a outro desenvolvimento dos embriões, não se verificou nenhum caso de desenvolvimento inesperado.TABELA 3RESULTADOS DE ANÁLISE DE MARCADOR SNP COM USO DE DNA OBTIDO DETECIDO COTILEDÔNEO
Claims (9)
1. MÉTODO DE ANÁLISE DE UM EMBRIÃO DE MILHO ISOLADO DE UMA PLANTA DE MILHO, caracterizado por compreender:a. excisão de um pedaço de tecido de escutelo do embrião de milho isolado, sendo que a dita excisão não provoca uma redução significativa no potencial germinativo do dito embrião de milho isolado; eb. análise do pedaço de tecido de escutelo quanto à presença ou ausência de uma ou mais características indicativas de pelo menos um traço genético, sendo que o dito embrião de milho isolado é capaz de germinar em uma planta após o dito pedaço de tecido de escutelo ser excisado.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito embrião de milho isolado ser obtido a partir de uma semente ou ser derivado de outros tecidos.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo dito embrião de milho isolado ser imaturo.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a3, caracterizado pelo dito embrião de milho isolado ser fresco ou resfriado.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo dito pedaço de tecido de escutelo ser liofilizado, fresco, congelado ou resfriado após amostragem.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 5, caracterizado pelo dito pedaço de tecido de escutelo ser igual ou superiora um núcleo simples.
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 6, caracterizado pela dita excisão ser realizada com uso de uma ferramentaselecionada do grupo consistindo em: uma broca de furadeira, um jato de água, um laser, uma lâmina única, um conjunto de lâminas opostas, uma seringa, um coletor de amostra de núcleo (ferramenta de coleta de núcleo), uma lâmina de bisturi, um arame de pequeno diâmetro, uma corda de arame texturizado de pequeno diâmetro, uma espátula, e um cotonete de esfregaço.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela dita excisão ser realizada por um processo automatizado.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo dito pedaço de tecido de escutelo ser analisado quanto a uma ou mais características selecionadas do grupo consistindo em: um marcador genético, um polimorfismo de nucleotídeo simples, uma repetição de sequência simples, um polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição, um haplotipo, um tag SNP, um alelo de um marcador genético, um gene, uma sequência derivada de DNA, uma sequência derivada de RNA, um promotor, uma região 5' não traduzida de um gene, uma região 3‘ não traduzida de um gene, microRNA, siRNA, um QTL, um marcador de satélite, um transgene, mRNA, ds mRNA, um perfil transcricional, um padrão de metilação e nível de ploidia.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261722399P | 2012-11-05 | 2012-11-05 | |
| US61/722,399 | 2012-11-05 | ||
| US201361786968P | 2013-03-15 | 2013-03-15 | |
| US61/786,968 | 2013-03-15 | ||
| PCT/US2013/068191 WO2014071271A1 (en) | 2012-11-05 | 2013-11-04 | Embryo sampling for molecular analysis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112015008618A2 BR112015008618A2 (pt) | 2017-07-04 |
| BR112015008618B1 true BR112015008618B1 (pt) | 2021-11-23 |
Family
ID=50628129
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR112015008618-7A BR112015008618B1 (pt) | 2012-11-05 | 2013-11-04 | Método de análise de um embrião de milho isolado de uma planta de milho |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20150285713A1 (pt) |
| EP (1) | EP2914093B1 (pt) |
| CN (1) | CN104981148A (pt) |
| AU (2) | AU2013337418B2 (pt) |
| BR (1) | BR112015008618B1 (pt) |
| CA (2) | CA2888143C (pt) |
| CL (1) | CL2015000943A1 (pt) |
| ES (1) | ES2795106T3 (pt) |
| IN (1) | IN2015DN02847A (pt) |
| MX (1) | MX363790B (pt) |
| RU (1) | RU2015121354A (pt) |
| WO (1) | WO2014071271A1 (pt) |
| ZA (1) | ZA201502891B (pt) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5347520B2 (ja) | 2009-01-20 | 2013-11-20 | ソニー株式会社 | 固体撮像装置の製造方法 |
| HUE053440T2 (hu) | 2014-01-09 | 2021-06-28 | Syngenta Participations Ag | Embrió-mintavételezõ eljárás |
| FR3016698B1 (fr) * | 2014-01-21 | 2020-10-30 | Limagrain Europe | Procede d'echantillonnage de tissu de graines |
| US10280472B2 (en) | 2014-08-29 | 2019-05-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Systems and methods for genotyping seed components |
| US9078427B1 (en) | 2014-08-29 | 2015-07-14 | Pioneer Hi Bred International Inc | Method of storing plant embryos |
| MX368325B (es) | 2014-08-29 | 2019-09-27 | Pioneer Hi Bred Int | Metodos y dispositivos que implican matrices de aceite. |
| US9706723B2 (en) | 2014-08-29 | 2017-07-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for creating doubled haploid maize embryos using oil matrices |
| US10945390B2 (en) * | 2015-07-09 | 2021-03-16 | Syngenta Participations Ag | Method of selecting corn embryos |
| JP6937750B2 (ja) * | 2015-10-28 | 2021-09-22 | ワールドビュー・サテライツ・リミテッド | 増大した通信容量を有する衛星システムおよび衛星システムの容量を増大させるための方法 |
| MX2018011964A (es) | 2016-03-31 | 2019-02-13 | Basf Se | Genotipificacion no destructiva de semillas. |
| CN113373199A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-09-10 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种种子组织微创取样方法及其应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7703238B2 (en) * | 2004-08-26 | 2010-04-27 | Monsanto Technology Llc | Methods of seed breeding using high throughput nondestructive seed sampling |
| EP1897434A3 (en) | 2004-08-26 | 2009-01-28 | Monsanto Technology, LLC | Automated seed sampler and methods of sampling, testing and bulking seeds |
| US8859846B2 (en) | 2005-09-21 | 2014-10-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Doubling of chromosomes in haploid embryos |
| US9286308B2 (en) | 2005-12-22 | 2016-03-15 | Alan Joshua Shapiro | System and method for metadata modification |
| CN101448391A (zh) * | 2006-03-02 | 2009-06-03 | 孟山都技术有限公司 | 使用高通量、非破坏性种子取样的种子选育方法 |
| WO2010022286A2 (en) | 2008-08-22 | 2010-02-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Apparatus for removal of specific seed tissue or structure for seed analysis |
| US8916383B2 (en) * | 2009-08-12 | 2014-12-23 | Pioneer Hi Bred International Inc | Apparatus and methods to gain access to and extract intact immature embryos from developing maize kernels or specific internal tissue or structures from one or more seeds |
| GB201106631D0 (en) * | 2011-04-19 | 2011-06-01 | Biohybrids Internat Ltd | Obtaining plants of atypical ploidy or zygosity |
-
2013
- 2013-11-04 BR BR112015008618-7A patent/BR112015008618B1/pt active IP Right Grant
- 2013-11-04 CN CN201380057584.XA patent/CN104981148A/zh active Pending
- 2013-11-04 WO PCT/US2013/068191 patent/WO2014071271A1/en active Application Filing
- 2013-11-04 EP EP13792808.1A patent/EP2914093B1/en not_active Revoked
- 2013-11-04 RU RU2015121354A patent/RU2015121354A/ru not_active Application Discontinuation
- 2013-11-04 AU AU2013337418A patent/AU2013337418B2/en active Active
- 2013-11-04 ES ES13792808T patent/ES2795106T3/es active Active
- 2013-11-04 MX MX2015005557A patent/MX363790B/es active IP Right Grant
- 2013-11-04 US US14/439,390 patent/US20150285713A1/en not_active Abandoned
- 2013-11-04 CA CA2888143A patent/CA2888143C/en active Active
- 2013-11-04 CA CA3098063A patent/CA3098063A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-04-07 IN IN2847DEN2015 patent/IN2015DN02847A/en unknown
- 2015-04-15 CL CL2015000943A patent/CL2015000943A1/es unknown
- 2015-04-28 ZA ZA2015/02891A patent/ZA201502891B/en unknown
-
2018
- 2018-08-29 AU AU2018222949A patent/AU2018222949A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2888143A1 (en) | 2014-05-08 |
| US20150285713A1 (en) | 2015-10-08 |
| CA3098063A1 (en) | 2014-05-08 |
| CN104981148A (zh) | 2015-10-14 |
| IN2015DN02847A (pt) | 2015-09-11 |
| CL2015000943A1 (es) | 2015-08-28 |
| MX363790B (es) | 2019-04-03 |
| EP2914093A1 (en) | 2015-09-09 |
| RU2015121354A (ru) | 2016-12-27 |
| ES2795106T3 (es) | 2020-11-20 |
| MX2015005557A (es) | 2015-08-05 |
| EP2914093B1 (en) | 2020-05-13 |
| BR112015008618A2 (pt) | 2017-07-04 |
| AU2013337418B2 (en) | 2018-09-13 |
| AU2018222949A1 (en) | 2018-09-20 |
| ZA201502891B (en) | 2016-11-30 |
| CA2888143C (en) | 2021-01-26 |
| AU2013337418A1 (en) | 2015-04-09 |
| WO2014071271A1 (en) | 2014-05-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2795106T3 (es) | Muestreo de embriones para análisis molecular | |
| Wang et al. | Characterization of in vitro haploid and doubled haploid Chrysanthemum morifolium plants via unfertilized ovule culture for phenotypical traits and DNA methylation pattern | |
| Deutsch et al. | Stable haploid poplar callus lines from immature pollen culture | |
| Abid et al. | Changes in DNA-methylation during zygotic embryogenesis in interspecific hybrids of beans (Phaseolus ssp.) | |
| AU2015307256B2 (en) | Systems and methods for genotyping plant material | |
| US10477859B2 (en) | Plant embryo storage and manipulation | |
| Kiran et al. | Investigation of modified WPM medium for the best meristem proliferation of Corylus avellana L. | |
| US20160060715A1 (en) | Systems and methods for genotyping seed components | |
| Fu et al. | Physiological characteristics and genetic diversity of Lilium distichum Nakai autotetraploids | |
| Sharma et al. | DNA methylation and epigenetic variation in Vaccinium plants | |
| US10280472B2 (en) | Systems and methods for genotyping seed components | |
| Kiran et al. | AHS | |
| Rajpal et al. | Nuclear and Organelle DNA Fingerprints as the Most Useful Markers to Evaluate Genetic Integrity of Micropropagated Plants | |
| MA et al. | Physico–Chemical Properties of Chromatin and Induction of Ploidy in Sugarcane |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06I | Publication of requirement cancelled [chapter 6.9 patent gazette] |
Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 6.6.1 NA RPI NO 2462 DE 13/03/2018 POR TER SIDO INDEVIDA. |
|
| B08F | Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE A 7A ANUIDADE. |
|
| B08H | Application fees: decision cancelled [chapter 8.8 patent gazette] |
Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 8.6 NA RPI NO 2601 DE 10/11/2020 POR TER SIDO INDEVIDA. UMA VEZ QUE A RESTAURACAO DA 7A ANUIDADE FOI REQUERIDA EM 06/11/2020, ATRAVES DA GRU 29409161925858005. |
|
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B09W | Correction of the decision to grant [chapter 9.1.4 patent gazette] |
Free format text: RETIFICA-SE A PUPBLICACAO DO DEFERIMENTO DA RPI 2648 DE 05/10/2021, POR TER SIDO EFETUADA COM INCORRECAO NO TITULO. |
|
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 04/11/2013, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |