CN113373199A - 一种种子组织微创取样方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种种子组织微创取样方法及其应用。本发明种子组织微创取样方法，包括如下步骤：S1、将植物种子浸泡在水或水溶液中，浸泡完毕，取出；S2、从经步骤S1处理的植物种子中的子叶和/或胚乳处切取一块组织，得到种子组织；所述组织的大小不超过种子大小的1/2。本发明种子组织微创取样方法在播种前获得种子组织，开展分子生物学相关鉴定工作，同时确保取样后的种子的萌发及生长活力，不仅显著提高了植物分子机理研究及分子育种相关工作的目的性，更节省了大量的物质和时间成本。本发明种子组织微创取样方法为种植前开展基因型鉴定、种子分选工作创造条件，可显著提高植物分子生物学研究效率及加快分子育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传育种领域，具体涉及一种种子组织微创取样方法及其应用。
背景技术
在植物分子遗传、分子育种等领域，及时开展植株个体基因型的鉴定工作，是植物分子生物学研究中必不可少的实验环节。在以往研究中，该实验通常需要先种植材 料，待种子萌发，并到植株生长到一定阶段，才对叶片等组织进行取样，提取DNA以 进行基因型鉴定工作。在实践操作中，低世代材料种子量少，为确保下一代种子的正 常收获，取样工作一般在生长旺盛时期才得以进行。该方法虽然有效的鉴定了植株个 体的基因型，但也存在诸多弊端。比如鉴定工作不及时，导致盲目种植材料，这不仅 耗费大量的人力物力，更关键的是不能够根据植株基因型分区种植材料，这就严重限 制了必要的分选工作。以生育期试验为例，根据基因型鉴定结果，选择适宜的生态区 域种植，可有效防止重要基因型的丢失，同时可以快速开展相关区域试验，这就要求 基因型等分子鉴定工作要在播种前进行。
发明内容
本发明的目的是提供一种种子组织微创取样方法及其应用，该种子组织微创取样方法，在播种前获得种子组织，开展分子生物学相关鉴定工作，同时确保取样后的种 子的萌发及生长活力；该方法不仅显著提高了植物分子机理研究及分子育种相关工作 的目的性，更节省了大量的物质和时间成本。
本发明提供的一种种子组织微创取样方法，包括如下步骤：
S1、将植物种子浸泡在水或水溶液中，浸泡完毕，取出；
S2、从经步骤S1处理的植物种子中的子叶和/或胚乳处切取一块组织，得到种子组织；所述组织的大小不超过种子大小的1/2。
上述的方法，步骤S1中，所述浸泡的时间可不超过24小时，具体可为3～24小 时、3小时或15小时。
所述浸泡的温度可为10℃～30℃，如20℃～25℃。
上述的方法，步骤S1中，所述水溶液中水的质量百分比可大于等于80％。
上述的方法，步骤S1中，所述植物种子可为双子叶植物种子或单子叶植物种子；
所述双子叶植物种子包括但不限于：大豆、绿豆、豌豆、鹰嘴豆、蚕豆等的种子；
所述单子叶植物种子包括但不限于：水稻、玉米、小麦、大麦等的种子。
上述的方法，步骤S2中，切取的位置为植物种子的子叶和/或胚乳，应注意避开 胚芽、胚轴和胚根；此外，切取时需注意避免种皮脱落。
优选地，所述组织的大小不超过种子大小的5％，如5％。
上述的方法，步骤S2中，优选地，所述方法在取样之后还可包括对取样后的种子进行干燥的步骤。
具体地，所述干燥可为阴干或烘干；
更具体地，所述阴干的时间可≥1周，如1周。
本发明进一步提供了上述任一项所述的种子组织微创取样方法在种子基因型鉴定 和/或种子分选中的应用；所述种子组织用于基因型鉴定。
本发明还提供了一种种子基因型的鉴定方法，它包括利用上述任一项所述的种子组织微创取样方法获取种子组织并对所述种子组织进行基因型鉴定的步骤。
一种种子分选方法，它包括上述的种子基因型的鉴定方法，也在本发明的保护范围内。
本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种种子组织微创取样方法及其应用，为种植前开展基因型鉴定、种子分选工作创造条件，可显著提高植物分子生物学研究效率及加快分子育种进程。
附图说明
图1为本发明种子组织微创取样示意图。
图2为实施例1种子组织微创取样阴干时间分析中不同处理组种子重量随阴干时间的变化曲线。
图3为实施例2种子组织微创取样后种子发芽活力测试(未阴干)中不同处理组 的发芽率随浸泡时间的变化曲线。
图4为实施例3种子组织微创取样后种子发芽活力测试(阴干一周)中不同处理 组的发芽率随浸泡时间的变化曲线。
图5为实施例4中种子微创取样后的PCR鉴定结果。
图6为实施例4中种子微创取样后种子萌发结果的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。
中黄13，中黄42：为大豆常规品种，公众可以从河南农业大学或者中国农业科学院作物科学研究所国家种质库获得。
实施例1、种子组织微创取样阴干时间
1.1供试材料
中黄42。
1.2仪器设备
电子天平(精度0.1mg)；玻璃培养皿；刀片；蛭石。
1.3实验方法
种子处理设置：吸胀后未取样处理的种子(如图1左)、吸胀后近胚端取样的种 子(如图1右上)，吸胀后远胚端取样的种子(如图1右下)。每组处理50粒，室温 水中吸胀处理时间为15小时。
阴干条件设置：将种子置于玻璃培养皿中，种子无堆叠，培养皿敞开；室温条件(20℃～25℃)，通风良好。
阴干时间设置：0周、1周、3周、6周、9周。
为检测种子的干燥程度，每周称量种子重量(其中，0周时即开始阴干前，均用 吸水纸去除种子表面水分)。实验设置3次独立重复。
1.4实验结果
如图2所示，各组材料在阴干1周后，种子重量显著下降，由吸胀取样时30克左 右下降到阴干1周时的12克左右；此后种子重量基本保持稳定。这一结果表明，种子 组织微创取样的适当阴干时间可为1周。
实施例2、种子组织微创取样后种子发芽活力测试(未阴干)
2.1供试材料
中黄13
2.2仪器设备
玻璃培养皿；刀片；蛭石。
2.3实验方法
(1)浸泡：每个实验处理均取50粒大小均匀、健康的种子，分别在室温条件下 水中浸泡3，6，9，12，15和24小时。
(2)取样：取步骤(1)中浸泡后的种子，在如图1所示，距离胚远近不同的两 个位置(近胚端和远胚端)，切除约5％子叶后，用吸水纸去除种子表面水分。
(3)播种：将每组种子分别种到装有疏松蛭石的花盆中，保持播种深度均匀一致，均为土下1cm。在托盘中浇下充足的水，保证萌发所需水分。
(4)统计：播种1周后，调查记录不同创伤处理下种子发芽情况。实验设置3 次独立重复。
2.4实验结果
如表1和图3所示，与未处理的种子(对照)相比，尽管吸胀处理后种子发芽率 有所下降，但发芽率仍能达到对照种子发芽率的80％以上。更为值得注意的是，各个 实验处理组别中，无论是近胚端还是远胚端取样的种子，它们的发芽率均能达到对照 的88％以上，甚至有些处理超过相应对照。这说明，微创取样不会显著影响种子发芽 率。
表1种子组织微创取样后种子发芽活力测试(未阴干)
实施例3、种子组织微创取样后种子发芽活力测试(阴干一周)
3.1供试材料
中黄13
3.2仪器设备
玻璃培养皿；刀片；蛭石。
3.3实验方法
(1)浸泡：每个实验处理均取50粒健康种子，分别在室温条件下水中浸泡3，6， 9，12，15和24小时。
(2)取样：取步骤(1)中浸泡后的种子，如图1所示，在距离胚远近不同的两 个位置(近胚端和远胚端)，分别进行切除取样，大小约为子叶的5％，然后用吸水纸 去除种子表面水分。
(3)阴干：将种子平铺于无盖的玻璃培养皿中，并保证种子单层无堆叠，置于室 温通风处(20℃～25℃)。
(4)播种：阴干一周后，将每组种子分别种到装有疏松蛭石的花盆中，保持播种 深度均匀一致，均为土下1cm。在托盘中浇下充足的水，保证萌所需水分。
(5)统计：播种1周后，调查记录不同取样部位对种子发芽情况的影响。实验设 置3次独立重复。
3.4实验结果
如表2和图4所示，与未处理的种子(对照)相比，吸胀后种子发芽率虽然有所 下降，但总体发芽率仍能达到对照的80％以上。更为值得注意的是，各实验处理组别 中，无论是近胚端还是远胚端取样的种子，它们的发芽率均达到对照的102％以上。 这同样说明，微创取不会显著影响种子发芽率。
表2种子组织微创取样后种子发芽活力测试(阴干一周)
实施例4、转基因种子组织微创取样实例
4.1供试材料
GmFULa过表达转基因株系(受体为自贡冬豆)，公众可以从河南农业大学获得。
4.2仪器设备
玻璃培养皿；刀片；蛭石。
4.3实验方法
(1)浸泡：随机选取20粒GmFULa过表达株系的种子，在水中浸泡3小时。
(2)取样：取浸泡后的种子，如图1所示，在远胚端进行切除取样，大小约为子 叶的5％，样品置于编号的1.5ml离心管中。
(3)阴干：将种子平铺于无盖的玻璃培养皿中，并保证种子单层无堆叠，置于室 温通风处(20℃～25℃)。
(4)分子鉴定：将取下的样品，提取基因组DNA(常规的CTAB提取方法)， 并做PCR鉴定。鉴定引物为：(35SF：GCTCCTACAAATGCCATCATTGC；FULAR：CTATTCATTTGAAGGACGAAGCATCCA)，目的片段长度为1300bp。
(5)播种：阴干一周后，根据第(4)鉴定结果对种子进行播种，保持统一的播 种条件(土下1cm，营养土：蛭石为1：1，25℃)。
(6)统计：播种1周后，调查种子发芽情况。
4.4实验结果
种子微损伤取样后PCR鉴定结果如图5所示：样品9、19与受体对照CK和负对 照水一致，为转基因阴性；样品5、11、16、17及18为转基因弱阳性；其余样品为转 基因阳性。更为值得注意的是，该实验中种子损伤后取样没有影响转基因材料的出苗 率，出苗率为100％，且长势一致(图6)。这说明，微创取样对种子基因型的鉴定是 行之有效的。
Claims (10)
1.一种种子组织微创取样方法，包括如下步骤：
S1、将植物种子浸泡在水或水溶液中，浸泡完毕，取出；
S2、从经步骤S1处理的植物种子中的子叶和/或胚乳处切取一块组织，得到种子组织；所述组织的大小不超过种子大小的1/2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中，所述浸泡的时间不超过24小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤S1中，所述水溶液中水的质量百分比大于等于80％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤S2中，所述组织的大小不超过种子大小的5％。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：步骤S2中，所述组织的大小为种子大小的5％。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法在取样之后还包括对取样后的种子进行干燥的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述干燥为阴干或烘干；
所述阴干的时间≥1周。
8.权利要求1-7中任一项所述的种子组织微创取样方法在种子基因型鉴定和/或种子分选中的应用；所述种子组织用于基因型鉴定。
9.一种种子基因型的鉴定方法，它包括利用权利要求1-7中任一项所述的种子组织微创取样方法获取种子组织并对所述种子组织进行基因型鉴定的步骤。
10.一种种子分选方法，它包括权利要求9所述的种子基因型的鉴定方法。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210910 |