CN115873865A - 一种大豆GmFAH1基因在提高大豆抗旱能力中的应用 - Google Patents

一种大豆GmFAH1基因在提高大豆抗旱能力中的应用 Download PDF

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Abstract

一种大豆GmFAH1基因在提高大豆抗旱能力中的应用,属于基因工程技术领域。为了在大豆中挖掘对干旱胁迫具有调控作用的基因,提高大豆的抗旱能力,本发明通过克隆大豆基因GmFAH1,荧光定量PCR分析干旱胁迫下大豆根和叶中GmFAH1表达量,发现大豆基因GmFAH1响应干旱胁迫;进一步通过构建重组载体和转化大豆植株获得了转GmFAH1基因的大豆植株,并证实了在干旱胁迫下,与野生型大豆相比转GmFAH1基因大豆植株表现为更好的生长状况,具有更高的耐旱能力。本发明所述的大豆GmFAH1基因可用于大豆抗旱品种的育种。

Description

一种大豆GmFAH1基因在提高大豆抗旱能力中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种大豆GmFAH1基因在提高大豆抗旱能力中的应用。
背景技术
目前干旱、高温被认为是导致农作物减产和绝产的两大主要非生物胁迫因子。外界空气过干或土壤含水量过低均可导致植物因缺水而形成干旱胁迫,其对植物的生长和发育具有严重的抑制作用。
大豆(Glycine max)原产于中国,是世界上食用蛋白质和油脂的重要来源。上世纪50年代以前中国是世界大豆第一生产国和净出口国。然而近年来,由于我国对大豆的需求量急速攀升,供需矛盾日益突出。造成我国大豆生产落后、供给严重不足的原因是多方面的,其中干旱胁迫是重要的环境因素。因此发现干旱调控基因对于培育抗旱植物品种具有重要意义。
然而迄今为止,在大豆中只鉴定到了少量的基因与大豆干旱胁迫相关,已克隆到的参与大豆干旱胁迫调控基因较少。因此,亟需在大豆中挖掘对干旱胁迫具有调控作用的基因。
发明内容
为了在大豆中挖掘对干旱胁迫具有调控作用的基因,提高大豆的抗旱能力,本发明提供了一种大豆GmFAH1基因在提高大豆抗旱能力中的应用,所述大豆GmFAH1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地限定,所述应用是利用大豆GmFAH1基因获得转基因大豆,以提高大豆的抗旱能力。
本发明还提供了一种含有所述大豆GmFAH1基因的重组载体在提高大豆抗旱能力中的应用。
进一步地限定,所述重组载体是将大豆GmFAH1基因重组到植物表达载体pBA-myc上。
本发明还提供了一种含有所述大豆GmFAH1基因的工程菌在提高大豆抗旱能力中的应用。
进一步地限定,所述工程菌包括大肠杆菌和农杆菌。
本发明还提供了一种获得抗旱大豆的方法,所述方法为构建含有如权利要求1所述大豆GmFAH1基因的重组载体,转化大豆获得转基因植株。
进一步地限定,所述重组载体的构建所用植物表达载体为pBA-myc。
进一步地限定,所述重组载体通过农杆菌介导转化大豆。
本发明还提供了一种提高大豆抗旱能力的制剂,所述制剂的活性成分包括上述的重组载体。
本发明的有益效果:
(1)本发明成功克隆了大豆基因GmFAH1,并通过荧光定量PCR分析发现,大豆基因GmFAH1响应干旱胁迫,GmFAH1基因受干旱胁迫影响在叶中的转录水平上升,在根中表达量下调。
(2)本发明成功构建了含有大豆基因GmFAH1的重组载体,并利用农杆菌介导的遗传转化方法成功构建了转GmFAH1基因大豆阳性植株,并发现在干旱胁迫下,与野生型相比转GmFAH1基因大豆植株表现为更好的生长状况,具有更高的耐旱能力,具体表现为:转GmFAH1基因植株能够降低叶片的相对失水速率,从而减少植物体内水分的流失,使大豆维持较好的生理状态;干旱胁迫引发了转GmFAH1基因大豆叶表皮蜡积累的增加和角质层的增厚,有助于植物更好的抵御干旱胁迫带来的影响,提高了植物的耐旱能力;转GmFAH1基因大豆能增强大豆的光合作用,在干旱条件下,仍能保持较高的净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度以及相对较低的蒸腾速率,生长受到的抑制明显小于野生型,近而更好的抵御大豆对干旱胁迫的耐受性;在转基因植株受到干旱胁迫以后,总抗氧化能力提高,植物体内积累大量的SOD、POD和CAT等抗氧化酶来清除活性氧,使细胞免受活性氧过渡积累造成的毒害,有助于植物抵御干旱胁迫,GmFAH1基因可以通过抑制MDA含量的增加而免受脂膜通透性降低,减少膜损伤的程度,近而提高了植株的抗旱性。
附图说明
图1为大豆GmFAH1基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果图;其中,M为MarkerDL5000,1,3为均目的基因的PCR扩增,2为水对照;
图2为pBA-myc-GmFAH1载体质粒酶切鉴定结果图;其中,M为Marker DL15000,1为阴性对照,2为pBA-myc-GmFAH1质粒,3为GmFAH1基因克隆,4为BamHI和Sac I酶切鉴定;
图3为大豆遗传转化流程图;其中,图3中的A为种子灭菌,B为种子萌发,C和D为丛生芽诱导为,E为芽伸长,F为生根培养;
图4为转pBA-myc-GmFAH1质粒T1代阳性苗PCR检测结果图;其中,M为DL2000,1-14号泳道均为转基因植株,15-16号泳道均为野生型大豆(WT),17为水对照;
图5为转pBA-myc-GmFAH1质粒T1代阳性苗RT-PCR检测结果图;其中,1-3泳道为野生型大豆植株,4-9为转pBA-myc-GmFAH1质粒T1代阳性苗;
图6为不同干旱胁迫处理下野生型大豆GmFAH1基因的表达水平分析结果图,其中,图6中的A为不同干旱胁迫处理下野生型大豆叶片中GmFAH1基因的表达水平分析结果图,图6中的B为不同干旱胁迫处理下野生型大豆根中GmFAH1基因的表达水平分析结果图;
图7为干旱胁迫下转GmFAH1基因大豆植株的表型分析结果图;其中,图7中的A为干旱胁迫前转GmFAH1基因大豆植株的表型分析结果图,图7中的B为干旱胁迫后转GmFAH1基因大豆植株的表型分析结果图;
图8为转GmFAH1基因大豆植株叶片失水速率的检测结果;
图9为扫描电镜分析转GmFAH1基因大豆植株叶片表皮蜡质密度的结果图;其中,图9中的A和a为不同放大倍数下野生型大豆植株叶片表皮蜡晶体,B、b、C和c为转GmFAH1基因大豆植株叶片表皮蜡晶体;
图10为透射电镜分析转GmFAH1基因大豆植株叶片角质层超微结构和厚度的结果图;其中,图10中的A为干旱处理前野生型大豆植株叶片角质层超微结构和厚度,D为干旱处理后野生型大豆植株叶片角质层超微结构和厚度,B和C为干旱处理前转GmFAH1基因大豆植株叶片角质层超微结构和厚度,E和F为干旱处理后转GmFAH1基因大豆植株叶片角质层超微结构和厚度;
图11为转GmFAH1基因大豆植株光合相关指标的测定结果图;其中,图11中的A为光合速率检测结果,B为蒸腾速率检测结果,C为气孔导度检测结果,D为胞间二氧化碳浓度检测结果;
图12为转GmFAH1基因大豆植株叶片脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)含量的测定结果图;其中图12中的A为脯氨酸检测结果图,B为超氧化物歧化酶检测结果,C为过氧化物酶检测结果,D为过氧化氢酶检测结果,E为丙二醛检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不用于限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的药品试剂,如无特殊说明,均可通过商业渠道购买获得。
实施例1:大豆GmFAH1基因的克隆
本发明所述的大豆GmFAH1基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示:ATGCCATCCTTGACTTTCCTTTCAAATCCTTATTTCTTTGCAGCATTGTCTGCATCTTTGACTCTTTTGATGGTTCAAGTTCTGTTCAGAAAACTGAACAAAAGGCATAGTAAAAAGAAGTACCACGCTGTTGCTGGCACCATCTTCAATCAGATGCTGAACTTCAACAGGCTGCACCATTACATGACTTATCTTGCTGCCAAGCACAGGACTTACAGGTTGTTCAACCCTTTCAGATATGAGGTTTACACTTCTGAACCAACTAATGTTGAGTATATTCTCAAAACCAATTTTGAGAACTATGGAAAGGGTTTGTACAACTACCACAATTTGAAGGATTTAGTAGGTGATGGGATTTTCGCTGTTGATGGCAAGAAATGGCGAGAACAAAGGAAGTTGTTAAGTCATGAATTCTCCACCAAGATGTTAAGGGATTTCAGCATTTCAATATTCAGAAAGAATGCAGCAAAACTTGCAAACATAGTGTCTGAAGCTGCGACTTCTAATAATACGTTGGAAATACAAGACCTTTTAATGAAATCAACACTGGATTCAATTTTCCATGTTGCATTTGGAACGGAACTTGACAGCATGTGTGGATCAAATCAAGAAGGGAAGATTTTTGCGGATGCTTTTGATACTTCCAGTGCACTGACCCTTTATCGTTATGTTGATGTCTTTTGGAAGATAAAGAAATTTCTGAATATTGGATCAGAGGCCAGATTAAAAAAGAACACTGAGGTTGTAATGGAATTTTTTTTTAAGCTAATCAACACAAGAATTCAGCAAATGCAGACTTCAAACGTAGATACTGATGGTAAACGAGAAGATATTCTGTCAAGGTTTCTGCAAGTGAAGGGAAGTGATTCAACATATTTACGAGATATAATTCTAAACTTTGTTGTTGCTGGGAGAGACACAACAGCAGGCACACTTTCTTGGTTCATGTACATGTTATGTAAGTATCCTTCTGTTCAAGAAAAAGCAGCAGAAGAAGTAAAAGAAGCAACAAACACAGAAACAATTACTAGCTATACTGAGTTTGTGTCTACTGTTACGGATGAAGCTCTTGAAAAGATGAACTATCTCCATGCAGCAATTACTGAAACTCTCAGACTTTATCCAGTAATTCCTGTGGATGCAAAGATTTGTTTTTCTGATGATACATTACCAGATGGGTATAGTGTAAATAAAGGAGACATGGTATCTTACCAACCTTATGCAATGGGTCGGATGAAATTTATTTGGGGTAATGATGCAGAGGATTTTAGACCAGAAAGATGGCTTGATGAGAATGGCATTTTTAAGCCAGAGAGCCCTTTCAAGTTTACAGCTTTTCAGGCTGGTCCTCGGATTTGTCTAGGAAAGGAGTATGCTTATAGACAGATGAAGATATTCTCAGCAGTTTTGTTAGGCTGTTTCCACTTTAAATTGAATGATGAGAAAAAAAATGTCAGTTACAAGACCATGATAACTCTTCATATTGATGGAGGTCTAGAAATCAAGGCATTCCACAGATACAGGGATTAG
通过如下方法克隆获得:
(1)大豆GmFAH1基因的克隆:
提取大豆品种Williams82叶片的RNA,并将获得的RNA反转录获得cDNA,在Phytozome上查询GmFAH1基因的编码序列信息,遵循引物设计基本原则设计引物,以大豆品种Williams82的cDNA为模板,利用PCR技术扩增目的基因,预期产物大小为1530bp。吸取PCR产物3μL与6×DNA loading Buffer按照体积比例1:1混合后进行琼脂糖凝胶电泳,确定产物位置与条带大小,检测正确后可用于后续实验。琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1,由图1可见大豆GmFAH1基因的PCR产物大小约为1530bp,与预期的目的片段大小吻合。
PCR扩增所用引物如下:
GmFAH1-F1(SEQ ID NO.2):5'-TGGAACGGAACTTGACAGCA-3';
GmFAH1-R1(SEQ ID NO.3):5'-ACTTGAAAGGGCTCTCTGGC-3'。
PCR反应体系如下:2×EasyTaq Mix 10μL,上下游引物各1μL,模板1μL,ddH2O 7μL,总体系共20μL。
PCR反应条件为:95℃5min,59℃30s,72℃15min,30个循环;72℃10min;降温至4℃终止反应。
(2)PCR产物的纯化、连接、转化和阳性克隆的鉴定及测序:
利用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化,将纯化产物与克隆载体pBA-myc进行连接,16℃过夜连接。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,以每个单克隆的菌液为模板,采用(1)中所用引物进行菌液PCR。PCR反应条件同(1)相同。每个反应取出8μL进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,将PCR阳性克隆产物送往测序公司测序,测序结果显示目的基因的核苷酸片段如SEQ ID NO.1所示,证明GmFAH1基因被成功克隆。
实施例2:含有GmFAH1基因的重组载体的构建
(1)目的基因的扩增:
根据GmFAH1序列信息,利用Primer 5.0软件查询基因的限制性内切酶位点,并根据植物表达载体pBA-myc图谱上的多克隆位点选择BamHI和Sac I酶切位点,利用BamHI和Sac I酶切位点序列修饰上下游引物的5'端。
获得的引物序列如下:
GmFAH1-F2(SEQ ID NO.4):5'-CCCTATCTCCCAATGCCATCC-3';
GmFAH1-R2(SEQ ID NO.5):5'-TCCCTGTATCTGTGGAATGCCT-3'。
以实施例1获得的cDNA为模板,利用上游引物GmFAH1-F2和下游引物GmFAH1-R2进行PCR扩增,获得PCR产物后利用胶回收进行纯化。
PCR反应体系如下:ddH2O 41μL,Primer mix 50μL,上下游引物各4μL(浓度均为10μM),模板1μL,总体系100μL。
PCR反应条件如下:98℃预变性5min;98℃变性25s,55℃退火25s,74℃复性35s,98℃变性25s,67℃退火25s,74℃复性35s,3个循环;98℃变性25s,74℃复性1min,72℃延伸10min,24个循环,4℃终止反应。
(2)利用全式金公司质粒提取试剂盒对根据植物表达载体pBA-myc进行质粒提取。
(3)pBA-myc质粒和目的片段的酶切与连接
利用BamHI和Sac I分别对pBA-myc质粒和(1)中获得的纯化后的PCR产物进行双酶切。
载体酶切体系:ddH2O 71μL,Buffer cutsmart 10μL,BamHI 2.5μL,Sac I 2.5μL,pBA-myc 14μL,总体积100μL。
目的基因酶切体系:ddH2O 65μL,Buffer cutsmart 10μL,BamHI 2.5μL,Sac I2.5μL,GmFAH120μL,总体积100μL。
反应条件:37℃培养箱反应2h。
分别对pBA-myc载体酶切产物和GmFAH1目的基因酶切产物进行胶回收纯化,使用酶标仪分别检测载体和目的基因的浓度,根据公式计算载体用量,将回收的目的片段与载体进行连接,获得重组载体pBA-myc-GmFAH1。
连接反应体系:ddH2O 5μL,10×Buffer 0.5μL,T4连接酶0.5μL,pBA-myc 2μL,GmFAH12μL,总体积10μL。
连接反应条件:16℃过夜。
(4)连接产物的转化与鉴定
将构建好的pBA-myc-GmFAH1载体经冻融法转入大肠杆菌DH5α中,方法如下:
①从-80℃冰箱中取出大肠杆菌DH5α至冰上解冻,融化后拿进无菌操作台。
②向100uLDH5α感受态中加入5μL需要转化的目的DNA,用移液枪轻轻吹吸混匀,冰浴放置30min。
③将离心管置于42℃水浴中热击90s,快速转移到冰上2min,再热击30s后置于冰上。
④向离心管中加入700uL LB液体培养基,37℃,100rpm摇床培养1h。
⑤转速5000rpm离心7min,弃大量上清,留50-100μL上清重悬菌体,取适量涂布于LB固体培养基(含100mg/L Spe)上,于37℃培养箱倒置过夜培养。
⑥待长出菌落后,选取单菌落进行编号并用灭菌牙签轻轻挑取单菌落进行PCR鉴定。
PCR反应体系如下:2×EasyTaq Mix 10μL,上下游引物各1μL,模板1μL,ddH2O 7μL,总体系共20μL。
PCR反应条件如下:98℃预变性5min;98℃变性25s,55℃退火25s,74℃复性35s,98℃变性25s,67℃退火25s,74℃复性35s,3个循环;98℃变性25s,67℃退火25s,74℃复性1min,24个循环;72℃延长10min;4℃终止反应。
对得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,判断目的条带的大小、位置,鉴定正确后根据购自全式金公司的质粒提取试剂盒提取质粒,并对其进行酶切鉴定,同时进行测序。
酶切反应体系如下:ddH2O 4.5μL,Buffer cutsmart 1μL,BamHI 0.25μL,Sac I0.25μL,质粒4μL,总体积10μL。
酶切反应条件:37℃水浴2h。
酶切鉴定结果如图2所示,测序结果显示目的基因序列与Phytozome中公布的GmFAH1基因序列一致,表明,GmFAH1基因已经成功连接到myc-pBA植物表达载体上。
实施例3:转GmFAH1基因大豆植株的获得
(1)电转法转化农杆菌
采用电转化法将实施例2获得的重组载体pBA-myc-GmFAH1转化根癌农杆菌EHA101感受态细胞。使用含有pBA-myc-GmFAH1的重组质粒的根癌农杆菌菌液为模板,利用实施例2中(4)所用方法进行PCR,经电泳鉴定,确定为获得了根癌农杆菌EHA101阳性菌。
(2)根癌农杆菌介导的大豆子叶节侵染转化法
①种子灭菌与萌发
首先挑选表面光滑、无菌斑、种皮完整的大豆Williams82品种种子,平铺在培养皿中,将平皿置于干燥器内(内含100mL次氯酸钠+4mL浓盐酸)进行氯气灭菌16h左右,注意将平皿的盖子打开立在干燥器壁上,最后用石蜡膜对干燥器进行封口,整个操作过程在通风橱内进行。将灭过菌的种子放在无菌操作台吹风至少15mim后,种脐朝下接种于萌发培养基(GM)上,22℃培养箱中培养1d。
②重组农杆菌的制备
取出-80℃冰箱保存的已成功转入重组载体pBA-myc-GmFAH1质粒的农杆菌EHA1012mL,加入到含有spe、kan、Rif的液体LB培养基中,以220rpm的转速,28℃条件下过夜,次日重新吸取1mL菌液加到50mL含有相应抗生素的液体LB中,进行二次活化,相同摇床条件摇至OD600为0.6~0.8之间。菌液置离心管中,5000rpm,离心7min,收集离心后的菌体用液体共培养基(LCCM)吹打重悬待用。
③外植体侵染及共培养
从GM培养基中取出发芽的种子,用无菌刀切去下胚轴并分成两瓣,用刷子在子叶节位置轻刷4~5下,浸泡在步骤②配好的菌液中,置于22℃培养箱中暗培养过夜。次日,将暗培养的大豆去皮后平铺在固体共培养基中,用保鲜袋装好置于暗培养箱中暗培养5天。
④不定芽诱导及伸长
将培养5天的种子取出放入锥形瓶内,先用无菌水冲洗一遍,再用液体芽诱导培养基(LSI)冲洗除菌三遍,平铺在铺有灭菌滤纸的平板上,切去胚轴过长的部分,插入固体芽诱导培养基(SI)中,在条件为18h光照/6h黑暗的培养箱中培养5~7天。将培养7天的种子取出,切除大芽和过长的胚轴,移入芽伸长培养基(SII)中,培养箱中培养14天。
⑤芽生根及移栽
在芽较长伸长苗的底部切掉重生芽,将茎蘸入IBA 1min,轻轻插入生根培养基(RM)中生根。期间观察芽继续伸长速度及生根情况,当根长达3cm左右时,将其转移到土壤中(蛭石与土壤的混合比例为3:1),在培养箱中生长稳定后移到气候室中培养直至成熟。
通过农杆菌介导的子叶节侵染法对大豆品种Williams82进行遗传转化(流程图见图3),并获得转基因阳性植株。实验共侵染4100个子叶节,获得T0代检测阳性植株6棵,阳性转化率为0.14%(见表1)。
表1大豆遗传转化情况统计结果
Figure BDA0003764621960000081
(3)阳性植株的鉴定
在植物适应外部环境后,使用草铵膦涂抹已完全伸展开的叶子(草铵膦的浓度为160ng/μL)。两周后,观察涂抹的叶子是否死亡,如果叶子生长良好,则是T0代阳性幼苗。将T0代种子进行种植获得T1代转基因植株,分别使用草铵膦涂抹方法和酶链式聚合反应的方法进行鉴定。首先对T1代幼苗进行涂抹,选取两周后叶片未枯萎的大豆植株取材,提取Williams 82和T1代植株叶片的DNA。以DNA为模板,使用Bar基因特异性引物对所有涂抹阳性的T1代植株进行PCR检测,以重组载体myc-pBA-GmFAH1的质粒DNA为阳性对照,分别以水和Williams 82植株提取的DNA模板为水对照和阴性对照,,预计产物大小为450bp。
PCR扩增Bar基因的检测引物为:
Bar-F(SEQ ID NO.6):5'-TGCCAGTTCCCGTGCTTGAA-3'
Bar-R(SEQ ID NO.7):5'-CTGCACCATCGTCAACCACTA-3'
PCR反应体系为:2×EasyTaq Mix 5μL,ddH2O 3μL,上下游引物各0.5μL,模板DNA1μL,总体系为10μL。
PCR反应程序为:95℃10min,95℃预变形5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸25s,72℃延伸25s,4℃终止反应。
鉴定结果如图4所示,阳性对照和部分转基因株系可以扩增出大小为450bp的bar基因目的条带。而两个阴性对照未能扩增出条带。结果表明,3个T1代株系均为转基因阳性苗,将其分别进行编号为OE#9、OE#12、OE#13。
抗性植株的RT-PCR检测:
①RNA的提取
对经Bar基因筛选后的转基因植株叶片进行取样,放进装有瓷珠的2mL EP管中,编好号并迅速置于液氮中,使用快速研磨仪研磨成粉末,提取RNA,RNA原液置于-80℃超低温冰箱中保存。
②cDNA的获得
使用全式金公司试剂盒进行反转录得到cDNA。
③RT-PCR检测
以TUA5作为内参基因,进行RT-PCR检测。
TUA5基因特异引物序列如下:
TUA5-F(SEQ ID NO.8):5'-TGCCACCATCAAGACTAAGAGG-3'
TUA5-R(SEQ ID NO.9):5'-ACCACCAGGAACAACAGAAGG-3'
GmFAH1基因特异引物序列:
GmFAH1-F4(SEQ ID NO.10):5'-TGGAACGGAACTTGACAGCAT-3'
GmFAH1-R4(SEQ ID NO.11):5'-ACGTTTGAAGTCTGCATTTGCT-3'
鉴定结果如图5所示,该结果说明,转基因植株中GmFAH1基因的表达量上升。
实施例4:不同干旱胁迫处理下野生型大豆GmFAH1基因的表达水平分析
为了探究GmFAH1基因是否参与大豆的干旱胁迫响应,待大豆品种Williams82生长至V2时期时对其分别进行20%PEG非生物胁迫处理。在处理0h、0.5h、1h、3h、6h和12h后的6个不同时间点,分别对叶片和根进行取材,提取总RNA,反转录成cDNA,根据植物基因组数据库Phytozome上查询GmFAH1的CDS序列,设计荧光定量特异引物,利用q-PCR检测GmFAH1基因在叶片和根中的表达量。其中以0h材料为对照,TUA5为参考基因,预计产物大小236bp。
荧光定量特异引物序列如下:
GmFAH1-F5(SEQ ID NO.12):5'-TGTTGATGGCAAGAAATGGCG-3'
GmFAH1-R5(SEQ ID NO.13):5'-CACACATGCTGTCAAGTTCCG-3'
RT-PCR反应体系如下:2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10μL,上下游引物各0.4μL,模板1.0μL,ddH2O 8.2μL,总体系20μL。
RT-PCR反应条件如下:95℃预变性1min,95℃变性10s,60℃退火15s,72℃延伸10s,4℃终止反应。
我们对GmFAH1基因在干旱胁迫下的表达特性进行分析,结果如图6所示。以0h为对照,发现在叶片中,经20%PEG处理后,在0.5h和1h时GmFAH1基因的表达量迅速下降,约为未处理的0.15倍和0.25倍左右,在3h时上升到未处理的3倍,6h时又下降至未处理的一半左右,在12h时又上升达到最大值,约为未处理的6.5倍。在根中,开始处理后GmFAH1基因表达量呈下降趋势,12h时缓慢上升,约为未处理的0.1倍左右。以上结果说明,GmFAH1基因受干旱胁迫影响在叶中的转录水平上升,在根中表达量下调,因此该基因响应干旱胁迫。
实施例5:转GmFAH1基因大豆植株的抗旱能力检测
(1)表型观察
为了验证GmFAH1基因对干旱胁迫有响应,分别对生长至V2期的转基因植株和野生型植株进行20%PEG霍格兰营养液的培养,进行模拟干旱处理,注意随时观察植株表型并拍照记录。结果如图7所示,在20%PEG处理24h后,转基因植株和野生型植株的表型出现明显差异,野生型植株叶片出现大面积萎蔫卷曲,发生脆化现象,萎蔫率达到55%以上(见表2)。而转基因植株叶片萎蔫不明显,只是轻微失绿变黄,几乎无脆化卷曲现象,萎蔫率仅达到9%左右。以上结果表明,在干旱胁迫下,与野生型相比转GmFAH1基因植株表现为更好的生长状况,具有更高的耐旱能力。
表2叶片萎蔫率分析
Figure BDA0003764621960000111
(2)叶片失水速率测定
为了测定离体叶片相对失水速率,剪取长势和生长时期基本一致的野生型和转基因大豆叶片并称其鲜重,然后将其置于相对湿度为50%的滤纸上进行避光保存,分别在0.5h、1h、2h、4h和8h时对离体叶片进行检测称重,最后放入烘箱烘干至恒重,记录其干重,计算叶片失水速率。
植物失水的主要器官是叶片,所以叶片的失水可以反映整个植物的水分状况。脱落的叶片在空中时,随着时间的推移,会很快通过气孔失水,同时也不会补水。因此,分离叶片的重量会相应地发生变化。因此,可以定量确定分离叶片的重量。确定叶片在不同时间段的失水程度(失水率)。植物的抗旱性与失水率呈负相关。我们可以通过测量离体叶片的失水率来间接识别植物的抗旱性。因此我们对水培生长处于V3期的转基因植株和野生型植株的真叶分别进行取样,对离体叶片相对失水速率进行测定。由图8可以看出,无论是转基因植株还是野生型植株,其叶片相对失水速率都随着时间的延长而上升;0.5-1h范围内,转基因株系OE#9和OE#13的失水率显著低于野生型植物,而OE#12株系与野生型植物相比不显著;2h时,3个转基因株系与野生型相比无明显差异;4h后趋于稳定,但野生型始终表现出较高的失水速率。实验结果表明,与野生型相比,转GmFAH1基因植株能够降低叶片的相对失水速率,从而减少植物体内水分的流失,使大豆维持较好的生理状态。
(3)扫描电镜和投射电镜检测
分别剪取野生型和转GmFAH1基因大豆叶片的同一部位,用双面刀片切成2×5mm的小条。用滴管向EP管中加入2.5%、PH=6.8的戊二醛溶液,抽真空排除样品空气使其沉底,置于4℃冰箱中黑暗环境固定1.5h以上。详细步骤参照李培京的研究进行([1]李培京.扫描电镜生物样品制备与观察[J].现代科学仪器,2008(03):124-125.)。
分别剪取野生型和转GmFAH1基因大豆叶片的同一部位,用双面刀片切成长3mm,宽1mm的长条。详细步骤参照高营营等人的研究进行(高营营,王超,张智杰.甘蓝CMS不育系和保持系的电镜观察[J].北方园艺,2014,000(002):15-19.)。
植物角质层是覆盖在植物地上器官表面的最外层,是表皮细胞壁的外部延伸,由角质和蜡质组成,共同形成疏水层,其中蜡质又根据分布位置不同分为表皮蜡质和内部蜡。角质层在保护植物免受逆境胁迫方面具有重要作用,是植物限制非气孔途径水分流失的主要蒸腾屏障。研究表明,角质层厚度与蜡质含量可作为植物抗旱性的一个重要促进因素,与植物的耐旱性密切相关。因此,为了更好的理解GmFAH1基因对干旱胁迫的响应,我们分别对转GmFAH1植株和野生型植株叶片进行制片和电子显微镜观察,用扫描电镜(SEM)对叶片表皮蜡质密度进行分析,使用透射电镜(TEM)观察叶片角质层超微结构和厚度。
结果如图9所示,在干旱处理后,与野生型植株相比,转基因植株叶片表现出蜡质晶体密度较高,尺寸较大,成板状分布排列,且表面密集地覆盖着1-2um棒状蜡晶体;而野生型植株叶片表皮蜡晶体仅稀疏地随机分布在表面上,且晶体尺寸较小,表皮蜡晶体没有进一步增加。透射电镜观察结果如图10所示,干旱处理后,转基因植株在细胞壁和角质层界面之间可观察到角质层脊和树丛状结构的存在,角质层内的电子致密片层结构变得更加明显,这些电子致密层被认为是角质层,表明角质含量随干旱胁迫的处理而增加。通过TEM图像测量角质层厚度,结果表明,干旱胁迫处理后,角质层厚度随之增加,与野生型相比,角质层厚度增加较大;而野生型植株角质层厚度没有表现出显著的变化。综上结果表明,干旱胁迫引发了转GmFAH1基因大豆叶表皮蜡积累的增加和角质层的增厚。干旱胁迫下蜡质晶体密度和含量的增加导致光照射时叶片辐射增加,降低叶片温度,可作为表面的保护屏障,保水能力间接增强,减少表皮蒸腾作用,有助于植物更好的抵御干旱胁迫带来的影响,提高了植物的耐旱能力。
(4)光合相关指标的测定
短期干旱处理:
对土培生长至V2期的野生型大豆植株和转GmFAH1基因大豆植株进行断水干旱处理,停止浇水7d,对照(正常条件)正常浇水。用便携式光合测定仪测定各个品种的净光合速率(AN)、蒸腾速率(E)、气孔导度(Gs)和胞间二氧化碳浓度(Ci)。每个处理重复测定三次。
在正常条件和断水干旱处理条件下,分别对转GmFAH1基因大豆和野生型大豆的光合指标进行测定。由图11可看出,在正常培养条件下,与野生型大豆相比,转GmFAH1基因大豆的净光合速率、气孔导度和胞间CO2浓度均高于野生型大豆,但差异不显著,而在干旱处理条件下,植株的生长都受到抑制,光合指标都有不同程度的下降,尤其是净光合速率。但与野生型大豆相比,干旱胁迫下转基因大豆的净光合速率和气孔导度的下降幅度均显著小于野生型大豆。蒸腾速率是表示植物蒸腾强度的一个重要指标。干旱处理后,虽然转基因植株和野生型植株蒸腾速率都降低,但与野生型相比,转基因植株蒸腾速率降低幅度更大,且始终低于野生型植株。说明转基因植株在干旱胁迫下减少水分丧失能力更强,蒸腾散失水分较少,而野生型植株蒸腾速率降低幅度较小,干旱胁迫下蒸腾散失水分仍较多。与野生型相比,转基因大豆胞间CO2浓度仍高于野生型,下降幅度较小,说明即使在干旱处理期间,仍能保持气孔略微开发和功能。以上结果表明,转GmFAH1基因大豆能增强大豆的光合作用,在干旱条件下,仍能保持较高的净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度以及相对较低的蒸腾速率,生长受到的抑制明显小于野生型,近而更好的抵御大豆对干旱胁迫的耐受性。
(5)大豆叶片脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)含量的测定步骤和计算方法参照购自于苏州科铭生物技术有限公司丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量试剂盒说明书、超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)试剂盒说明书(NBT法)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)试剂盒说明书、过氧化氢酶(Catalase,CAT)试剂盒说明书和进行脯氨酸(Proline,Pro)试剂盒说明书进行,每组实验重复三次。
为了进一步了解干旱胁迫的影响,测定了转基因植株和野生型植株体内的SOD、POD和CAT的含量。结果如图12所示,在正常条件下,转基因植株叶片超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)含量略微高于野生型植株,过氧化氢酶(CAT)含量无显著差异。但当20%PEG模拟干旱胁迫处理后,转基因植株与野生型植株SOD等三种酶的含量都有不同程度的提高,转基因植株体内SOD和POD含量与野生型相比提高更明显,差异极显著(p<0.001)。并且在干旱胁迫以后,转基因植株中CAT含量也显著(p<0.01)高于野生型植株。以上结果说明,在转基因植株受到干旱胁迫以后,总抗氧化能力提高,植物体内积累大量的SOD、POD和CAT等抗氧化酶来清除活性氧,使细胞免受活性氧过渡积累造成的毒害,有助于植物抵御干旱胁迫。
在干旱胁迫下,丙二醛(MDA)的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。它的含量是反映机体抗氧化潜在能力的重要参数,可以反映出植株过氧化损伤程度,间接测定植物的抗旱性。由图12可知,在正常条件下,野生型植株的MDA含量高于转基因植株,说明与野生型相比,转基因植株细胞结构更稳定。当干旱胁迫处理后,转基因植株与野生型植株MDA含量虽都有所上升,但与野生型相比,转基因株系上升幅度显著(p<0.05)低于野生型。说明转基因植株在干旱胁迫下MDA含量的积累低于野生型植株。结果表明,GmFAH1基因可以通过抑制MDA含量的增加而免受脂膜通透性降低,减少膜损伤的程度,近而提高了植株的抗旱性。以上结果表明,GmFAH1基因可以提高植株的耐旱性。

Claims (10)

1.一种大豆GmFAH1基因在提高大豆抗旱能力中的应用,其特征在于,所述大豆GmFAH1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述应用是利用大豆GmFAH1基因获得转基因大豆,以提高大豆的抗旱能力。
3.一种含有权利要求1所述大豆GmFAH1基因的重组载体在提高大豆抗旱能力中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述重组载体是将大豆GmFAH1基因重组到植物表达载体pBA-myc上。
5.一种含有权利要求1所述大豆GmFAH1基因的工程菌在提高大豆抗旱能力中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述工程菌包括大肠杆菌和农杆菌。
7.一种获得抗旱大豆的方法,其特征在于,所述方法为构建含有如权利要求1所述大豆GmFAH1基因的重组载体,转化大豆获得转基因植株。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述重组载体的构建所用植物表达载体为pBA-myc。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述重组载体通过农杆菌介导转化大豆。
10.一种提高大豆抗旱能力的制剂,其特征在于,所述制剂的活性成分包括权利要求3所述的重组载体。
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