MX2015005557A - Muestreo embrionario para analisis molecular. - Google Patents

Abstract

La presente descripción proporciona métodos nuevos para facilitar las actividades de mejoramiento germoplásmico a través del uso de un muestreo embrionario. Se proporciona un método que comprende obtener al menos un embrión aislado, extraer una pieza de tejido del escutelo o cotiledón de al menos un embrión aislado de manera que la germinación potencial del embrión no se reduzca significativamente y analizar la(s) muestra(s) de tejido del escutelo o cotiledón para determinar la presencia o ausencia de una o más características indicativas de al menos un rasgo genético.

Description

MUESTREO EMBRIONARIO PARA ANÁLISIS MOLECULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente descripción se refiere a métodos para muestrear embriones aislados para identificar embriones que pueden desarrollarse en plantas que tienen características deseadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En el cultivo tradicional de plantas, las generaciones de plantas con base en cruces conocidos o autopolinizaciones se plantan y, después, se prueban para observar si las líneas o variedades se encaminan hacia las características deseadas en el mercado. Como se puede apreciar y como se conoce en la materia, estos experimentos pueden ser masivos en escala. Implican una gran fuerza laboral desde los científicos hasta el personal de campo para diseñar, plantar, mantener y llevar a cabo los experimentos que pueden implicar centenas o decenas de centenas de plantas individuales. Requieren, además, recursos sustanciales de tierras. Las parcelas o invernaderos pueden ocupar cientos de acres de tierra. Esto no solo implica grandes cantidades de tierra durante meses mientras las plantas germinan, crecen y producen semillas, tiempo durante el cual estas se muestrean para pruebas de laboratorio o campo, sino que después las cantidades masivas de semillas deben etiquetarse, cosecharse y procesarse, Ref.255427 individualmente.

Una complicación adicional es que mucha de la experimentación no resulta ser de mucha utilidad. En la literatura se reportó que algunas compañías de semillas descartan el 80-90 % de las plantas de cualquier generación al comienzo del experimento. Por consiguiente, mucha tierra, trabajo y recursos materiales gastados para cultivar, cosechar y procesar la poscosecha se pierden por un gran porcentaje de la semilla.

La presión del tiempo es, además, un factor. Los avances significativos en el cultivo de plantas pusieron más presión en los programas de cultivo para desarrollar, más rápidamente, líneas o variedades de plantas con rasgos y características mayores y mejores. Los cultivadores de plantas y trabajadores asociados están, de esta manera, bajo una presión creciente para procesar, más eficazmente y efectivamente, estas generaciones y para realizar mayor número y selecciones más tempranas de plantas que deben continuar en la siguiente generación de cultivo.

Algunas prácticas actualmente usadas aceleraron las ganancias producidas al cultivar plantas con considerable reducción de costos. Por ejemplo, los protocolos para crear dobles haploides eliminaron la necesidad de años de autofertilización y evaluaciones posteriores para lograr plantas homocigóticas. Además, el poder de los datos de marcador genético y la facilidad para obtener estos, permitió que las plantas que no contienen las características deseadas se eliminen de la población antes de invertir recursos significativos. Además, las prácticas recientes usaron pruebas con base en laboratorios en la etapa de semilla, frecuentemente conocidas como "astillado de granos" o "astillado de semillas", en donde la semilla se prueba de manera no destructiva para obtener información genética, bioquímica o fenotípica (Sangtong, V. et al. (2001) Plan t Molecular Biology Rep rter 19:151-158). La semilla de prueba previene la necesidad de cultivar la semilla en plantas inmaduras, de esa manera se ahorra tiempo, espacio y esfuerzo.

Sin embargo, aún se puede realizar mejoras. Particularmente, existe una necesidad de métodos para caracterizar molecularmente embriones incluso más temprano en el desarrollo, particularmente, como parte del proceso de haploide doble u otros procesos que usan téenicas de rescate de embriones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente descripción se refiere a métodos para facilitar las actividades de mejora de plantas a través del uso de muestreo embrionario. Mediante el proceso descrito en la presente descripción, es posible analizar embriones aislados individuales y seleccionar aquellos embriones que pueden desarrollarse en plantas que poseen una o más características deseadas. Esto permite métodos nuevos y más eficientes para mejorar y gestionar plantas lo que conlleva a poblaciones de cultivo mejoradas.

En la presente descripción se proporciona los métodos para analizar un embrión aislado de una planta monocotiledónea. En los métodos, una pieza de tejido del escutelo se extrae de un embrión aislado, en donde la extracción no provoca una reducción significativa en el potencial de germinación del embrión. La pieza de tejido del escutelo se analiza, después, para determinar la presencia o ausencia de una o más características indicativas de al menos un rasgo genético.

El embrión aislado puede ser inmaduro, puede ser de maíz, sorgo, trigo, arroz, cebada, avena, centeno, mijo, caña de azúcar, triticale o césped. El embrión aislado puede obtenerse, directamente, de una semilla o puede derivarse de otros tejidos. El embrión aislado puede ser fresco o refrigerado. El embrión aislado es viable y capaz de germinar en una planta después que la pieza de tejido del escutelo se extrae. El embrión aislado puede ser cualquier ploidía tal como, pero no se limita a, un haploide, diploide, haploide doble, aneuploidía, tetraploide, hexaploide u octaploide.

La pieza de tejido del escutelo extraída del embrión aislado puede ser liofilizada, fresca, congelada o refrigerada después del muestreo.

La pieza de tejido del escutelo puede ser mayor o igual que un núcleo simple.

La extracción del tejido del escutelo puede ocurrir por cualquier medio conocido en la materia tal como, pero no se limita a: una broca, un chorro de agua, un láser, una cuchilla simple, un conjunto de cuchillas opuestas, una jeringa, una muestra de núcleo (herramientas para extraer núcleos), un bisturí, un cable de diámetro pequeño, un cable de acero texturado de diámetro pequeño, una espátula y un hisopo. La extracción puede realizarse manualmente o mediante un proceso automatizado.

El embrión aislado puede ubicarse abajo del meristemo, en donde la pieza se extrae del extremo opuesto del meristemo. La ubicación puede realizarse manualmente o de una manera automatizada mediante el uso de movimiento mecánico, activación, etc. La automatización puede incluir el uso de robótica, sistemas de visión o una combinación de ambos.

La pieza de tejido del escutelo puede analizarse para determinar una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: un marcador genético, un polimorfismo nucleótido simple, una repetición de secuencia simple, un polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción, un haplotipo, una etiqueta SNP, un alelo de un marcador genético, un gen, una secuencia derivada de ADN, una secuencia derivada de ARN, un promotor, una región no traducida de 5' de un gen, una región no traducida de 3' de un gen, microARN, ARNip, un QTL, un marcador satélite, un transgén, ARNm, ARNm ds, un perfil transcripcional, un patrón de metilación y un nivel de ploidía.

En la presente descripción se proporciona los métodos para analizar un embrión aislado de una planta dicotiledónea. En los métodos, una pieza de tejido de cotiledón se extrae de un embrión aislado, en donde la extracción no causa una reducción significativa en el potencial de germinación del embrión. La pieza de tejido cotiledón se analiza, después, para determinar la presencia o ausencia de una o más características indicativas de al menos un rasgo genético.

El embrión aislado puede ser inmaduro y puede ser cañóla, soja, girasol, alfalfa o algodón. El embrión aislado puede obtenerse, directamente, de una semilla o puede obtenerse de otros tejidos. El embrión aislado puede ser fresco o refrigerado. El embrión aislado es viable y es capaz de germinar en una planta después de extraer la pieza de tejido cotiledón. El embrión aislado puede ser cualquier ploidía tal como, pero no se limita a, un haploide, diploide, haploide doble, aneuploidía, tetraploide, hexaploide u octaploide.

La pieza de tejido cotiledón extraída del embrión aislado puede ser liofilizada, fresca, congelada o refrigerada después del muestreo.

La pieza de tejido cotiledón puede ser igual o mayor que un núcleo simple.

La extracción del tejido cotiledón puede ocurrir por cualquier medio conocido en la materia tal como, pero no se limita a: una broca, un chorro de agua, un láser, una cuchilla simple, un conjunto de cuchillas opuestas, una jeringa, una muestra de núcleo (herramientas para extraer núcleos), un bisturí, un cable de diámetro pequeño, un cable de acero texturado de diámetro pequeño, una espátula y un hisopo. La extracción puede realizarse manualmente o por un proceso automatizado.

La pieza de tejido cotiledón puede analizarse para determinar una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: un marcador genético, un polimorfismo nucleótido simple, una repetición de secuencia simple, un polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción, un haplotipo, una etiqueta SNP, un alelo de un marcador genético, un gen, una secuencia derivada de ADN, una secuencia derivada de ARN, un promotor, una región no traducida de 5' de un gen, una región no traducida de 3' de un gen, microARN, ARNip, un QTL, un marcador satélite, un transgén, ARNm, ARNm ds, un perfil transcripcional, un patrón de metilación y un nivel de ploidía.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La descripción de cada referencia indicada en la presente descripción se incorpora por este medio como referencia en su totalidad.

Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/una" y "el/la" incluyen la referencia del plural a menos que el contexto indique, claramente, lo contrario. Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a "una planta" incluye una pluralidad de las plantas, la referencia a "una célula" incluye una o más células y los equivalentes de estas que conoce un experimentado en la materia, etc.

Como se usan en la presente descripción: "Callo" se refiere a una masa de células o tejido de proliferación no diferenciada.

Las frases "está en contacto", "entra en contacto con" o "ubicada en contacto con" pueden usarse para significar "contacto directo" o "contacto indirecto". Por ejemplo, el medio que comprende un agente de duplicación puede tener contacto directo con la célula haploide o el medio que comprende un agente de duplicación puede separarse de la célula haploide mediante papel de filtro, tejidos de planta u otras células, de esa manera el agente de duplicación se transfiere a través del papel de filtro o células a la célula haploide.

Una planta "diploide" tiene dos conjuntos (genomas) de cromosomas y el número de cromosomas (2n) es igual a aquel en el cigoto.

Una planta o célula de "haploide duplicado" o de haploide doble es aquella que se desarrolla mediante la duplicación de un conjunto haploide de cromosomas. Una planta o semilla que se obtiene a partir de una planta haploide doble autopolinizada cualquier número de generaciones puede identificarse aún como una planta haploide doble. Una planta haploide doble se considera una planta homocigota. Se considera que una planta es haploide doble, si es fértil incluso si la parte completa vegetativa de la planta no consiste en las células con el conjunto de cromosomas duplicado. Por ejemplo, una planta se considerará una planta haploide doble si contiene gametos viables, incluso si es quimérica.

Un "embrión haploide doble" es un embrión que tiene una o más células que contienen 2 conjuntos de cromosomas homocigóticos.

"Embriogénesis" puede definirse como el proceso de iniciación, proliferación y/o desarrollo del embrión.

"Embriogénico", en el contexto de células o tejidos, significa que las células o tejidos pueden inducirse para formar embriones de plantas viables en condiciones de cultivo adecuadas.

"Germinación" se refiere al proceso para desarrollar el embrión de una semilla en una planta. La germinación puede ocurrir in vi tro o in vivo.

"Potencial de germinación" puede definirse como la capacidad de un embrión para completar la germinación. La frase "sin una reducción significativa en el potencial de germinación" se refiere al hecho que se desarrollará una planta normal. Una planta normal puede definirse como aquella que puede diseminar su semilla exitosamente.

Una planta "haploide" tiene un conjunto simple (genoma) de cromosomas y el número de cromosomas (n) es igual al del gameto.

Un "embrión aislado" es un embrión que no se asocia con una semilla. Esto puede ocurrir debido a la remoción de un embrión de una semilla o porque el embrión se deriva de otro tejido mediante embriogénesis somática o gamética (micróspora).

Un embrión "maduro" se refiere a un embrión que completó la embriogénesis, en donde el embrión maduro se deshidrata y se inactiva metabólicamente. Un embrión "inmaduro" se refiere a un embrión de la iniciación de la división celular del óvulo mediante la finalización de la embriogénesis.

El término "embrión somático maduro" se refiere a un embrión completamente desarrollado obtenido a partir de tejido somático, con evidencia de raíz y ápices de brote y que exhibe una estructura bipolar. En las monocotiledóneas, el embrión somático maduro tendrá un escutelo.

El término "medio" incluye compuestos en estado líquido, gaseoso o sólido.

Los términos "monocot" y "planta monocotiledónea" se usan indistintamente en la presente descripción.

Los términos "dicot" y "planta dicotiledónea" se usan indistintamente en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, el término "planta" incluye referencia a plantas completas, órganos de plantas (p. ej., hojas, tallos, raíces, etc.), semillas y células vegetales y progenie de esta. "Célula vegetal", como se usa en la presente descripción incluye, sin limitación, semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporófitos, polen y microsporas.

El término "embrión somático primario" se refiere a un embrión somático que se origina de tejidos diferentes de aquellos de otro embrión somático. Por "embrión somático" se entiende un embrión formado in vitro a partir de células somáticas o células embriogénicas mediante división celular mitótica.

"Muestreo del escutelo" se refiere a la extracción de una porción escutelar de un embrión.

Muestreo cotiledónico" se refiere a la extracción de una porción cotiledónea de un embrión.

El término "embriogénesis somática" se refiere al proceso de iniciación y desarrollo de embriones in vitro de células vegetales y tejidos con ausencia de reproducción sexual.

Ahora, en cuanto a las modalidades: El muestreo embrionario permite la caracterización molecular temprana en el desarrollo de la planta, lo que permite selecciones de un genotipo deseado por realizarse semanas, incluso meses antes que otros métodos de muestreo actualmente usados. Por consiguiente, los recursos pueden enfocarse antes en embriones que tienen la máxima probabilidad de desarrollo en plantas deseadas.

El escutelo es el cotiledón modificado de plantas en la familia Poaceae, una familia grande de plantas monocotiledóneas con flores. Es una estructura en forma de escudo que rodea el eje embrionario y tiene funciones diversas. Durante la formación de semillas, el escutelo actúa como un órgano de almacenamiento que acumula, principalmente, lípidos, pero además proteínas y almidón. Después, durante la germinación, el escutelo secreta ambas hormonas que inducen la producción de enzimas hidrolíticas en la capa de aleuronea que ayuda en la digestión de reservas de endosperma. Además, el escutelo transporta, además, a los nutrientes digeridos del endosperma al eje embrionario.

El escutelo tiene una densidad celular alta y, por lo tanto, más núcleos por unidad de tejido en comparación con el tejido de la hoja, lo que resulta en una mayor concentración de ADN. La densidad alta de ADN permite que el tejido del escutelo sea una fuente excelente para la extracción de ADN genómico; sin embargo, los esfuerzos anteriores no se enfocaron en el tejido del escutelo como una fuente de muestreo porque se pensó que eliminar una porción del escutelo tendría implicaciones severas en el desarrollo del embrión.

Se proporcionan métodos para analizar un embrión de una planta monocotiledónea, en los cuales una pieza del escutelo se elimina o extrae del embrión aislado. Los cotiledones de embriones aislados de plantas dicotiledóneas pueden muestrearse, además, de una manera similar. De esa manera, se proporciona métodos para analizar un embrión de una planta dicotiledónea, en los cuales una pieza de tejido cotiledón se retira o extrae del embrión aislado.

Cuando se extrae una pieza del escutelo o tejido cotiledón de un embrión aislado, se debe tener cuidado de retirar el tejido sin dañar las regiones meristemáticas del embrión. Esto permitirá que el embrión continúe el desarrollo, con una interrupción mínima, en una planta normal (es decir, el embrión no tiene una reducción significativa en el potencial de germinación).

Los métodos de la descripción actual pueden comprender, además, tratar los embriones muestreados para mantener el potencial de germinación. El tratamiento puede incluir, generalmente, cualquier medio conocido en la materia para proteger un embrión, o una planta o plántula obtenida de un embrión, de condiciones ambientales mientras se almacena o transporta. Por ejemplo, los embriones muestreados pueden tratarse con un polímero y/o un fungicida para proteger el embrión muestreado mientras se almacena o transporta.

Los métodos de la descripción actual pueden comprender, además, unir un identificador al receptáculo que contiene la muestra así como al receptáculo que contiene el embrión aislado del cual se extrajo la muestra. Esto mantiene la identidad de la muestra y embrión, lo que permite monitorearlos, adecuadamente, de manera que la muestra se asocie, siempre, con el embrión del cual se extrajo. El identificador puede ser un código de barras o etiqueta impresos.

En los métodos de la presente descripción, se puede extraer o retirar una muestra de un embrión de una planta monocotiledónea, en donde la muestra es una pieza de tejido del escutelo. La planta monocotiledónea puede ser, pero no se limita a, maíz, sorgo, trigo, arroz, cebada, avena, centeno, mijo, caña de azúcar, triticale o pasto.

El embrión aislado puede obtenerse de una semilla (es decir, embriogénesis cigótica) o puede "derivarse de otros tejidos" mediante embriogénesis somática o gamética (microspora). La embriogénesis somática se refiere a la embriogénesis que surge de células somáticas (es decir, células vegetativas o no gaméticas), específicamente de explantes somáticos aislados mientras que la embriogénesis gamética se refiere a embriogénesis que surge de células gaméticas (es decir, microsporas). Dado que las células somáticas y gaméticas no son naturalmente embriogénicas, las células deben inducirse para convertirse en embriogénicas. La conversión a células embriogénicas puede lograrse mediante estímulos externos tales como auxina, citoquinina, cambios de pH, reguladores de crecimiento y iones de metales pesados (Yeung, 1995 In: Thorpe TA (ed) In vitro Embryogenesis in Plants (pág. 205-249; Dodeman et al. (1997) J. Exp. Bot . 48:1493-1509.

El embrión aislado debe ser viable y capaz de germinar en una planta después que la pieza de tejido del escutelo o cotiledón se extrae, para embriones monocotiledóneos y dicotiledóneos, respectivamente. El embrión aislado puede ser de cualquier ploidía que pueda existir en una planta monocotiledónea de la presente descripción. Por ejemplo, el embrión aislado puede ser un haploide, diploide, haploide duplicado, aneuploide, tetraploide, hexaploide u octaploide.

Puede apreciarse que un embrión aislado puede o no puede muestrearse inmediatamente después del aislamiento. De esta manera, el embrión aislado puede ser fresco o refrigerado antes de y/o durante el muestreo.

Los métodos de muestreo pueden referirse a la presente descripción en términos diferentes (usados, indistintamente, en la presente descripción), tales como, por ejemplo, muestreo, extracción, astillado, recortado, rebanado, cortado, recortado o remoción de una muestra. El muestreo del escutelo puede ocurrir por cualquier medio conocido en la materia tal como, pero no se limita a: una broca, un chorro de agua, un láser, una cuchilla simple, un conjunto de cuchillas opuestas, una jeringa, una muestra de núcleo (herramientas para extraer núcleos), un bisturí, un cable de diámetro pequeño, un cable de acero texturado de diámetro pequeño, una espátula y un hisopo. Además, el muestreo puede realizarse manualmente o mediante un proceso automatizado.

La automatización de la extracción de la pieza de tejido del escutelo o cotiledón puede incluir uno o más de los siguientes: a) determinar la ubicación y orientación de un embrión aislado de una pluralidad de embriones aislados que usan un instrumento de visión automatizado; b) determinar especificaciones físicas de un embrión aislado (p. ej., longitud, ancho, área de superficie, grosor y forma) mediante el uso de un instrumento de visión automatizado; c) orientar un embrión aislado en/sobre una ubicación establecida mediante el uso de sujeción neumática/por vacío o manipulación mecánica/física; d) orientar la herramienta de extracción con relación a un embrión aislado ya sea físicamente o en el caso de una herramienta de extracción guiada con láser, ópticamente; e) activar la herramienta o mover un embrión aislado mediante la herramienta para retirar la muestra; f) ubicar la muestra y dejar el embrión en envases separados; g) monitorear la muestra y dejar el embrión uno en relación con el otro para uso y selección en el proceso de cultivo; h) limpiar y/o esterilizar la herramienta para prevenir la contaminación cruzada o el crecimiento bacteriano; i) eliminar la herramienta si no se realiza la limpieza y/o esterilización; j) ubicar un fragmento de una herramienta en un envase para análisis directo, en donde la muestra está en/sobre el fragmento de manera que el fragmento de la herramienta no interfiere con la extracción (p. ej., como con un alambre usado para raspar o perforar un embrión aislado que se corta, después, en una placa de laboratorio para la extracción de ADN); y k) enjuagar la herramienta en el medio de extracción.

Si se usa un alambre de diámetro pequeño, el alambre de diámetro pequeño puede tener un diámetro menor que 1 mm y el alambre puede estar frío o caliente. El alambre puede formarse, además, en una estructura que facilita el muestreo.

Se puede usar cualquier láser conocido por un experimentado en la materia para cortar tejido biológico. Los láseres que cortan en el intervalo de nanosegundo y picosegundo son adecuados para usarse en los métodos de la presente descripción. Otro tipo de láser que puede usarse es un láser de femtosegundo. Los láseres de femtosegundo tienen anchos de pulso en el dominio de femtosegundo (1 fs 10 ~15 segundos), que producen un corte estrecho y minimizan la zona afectada con calor, de esa manera, evitan daños térmicos al material que se corta.

La "muestra" puede describirse, además, en la presente descripción como una célula, un núcleo, una pieza, un clip, una astilla, una tajada, una parte, una porción, un fragmento, una sección, un pedazo o cualquier otro término que se refiera a una pieza monolítica que puede separarse de un embrión sin destruir la viabilidad del embrión o su potencial para el desarrollo en una planta sana (es decir, potencial de germinación). La muestra extraída del embrión aislado puede serliofilizada, fresca, congelada o refrigerada después del muestreo.

El tamaño de la muestra de la pieza del tejido del escutelo extraída del embrión aislado puede ser mayor o igual que un núcleo simple. La muestra de tejido del escutelo puede ser una célula descamada o menor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % del escutelo total. El tamaño de la pieza puede ser cualquier porción del escutelo que no cause una reducción significativa en el potencial de germinación del embrión aislado.

El tamaño de la pieza de tejido cotiledón extraída del embrión dicotiledóneo aislado puede ser mayor o igual que un núcleo simple. La pieza de tejido cotiledón puede ser una célula descamada o menor de l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 de la cantidad total de tejido cotiledón. La pieza puede ser de uno de los dos cotiledones o de ambos cotiledones.

La muestra puede tomarse de cualquier área del escutelo, y el embrión monocotiledóneo aislado puede ubicarse debajo del meristemo, en donde la pieza del escutelo se extrae del extremo opuesto del meristemo.

Similarmente, el muestreo puede tomarse en cualquier área del(los) cotiledón (es) del embrión dicotiledóneo aislado. El embrión dicotiledóneo aislado puede ubicarse de manera que se evita el daño al meristemo.

La ubicación puede realizarse manualmente o de una manera automatizada mediante el uso de movimiento mecánico, activación, etc. La automatización puede incluir el uso de robótica, sistemas de visión o una combinación de ambos.

La pieza del tejido del escutelo o cotiledón puede analizarse para determinar una o más características indicativas de un rasgo genético. El rasgo genético puede incluir, pero no se limita a, un marcador genético, un polimorfismo nucleótido simple, una repetición de secuencia simple, un polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción, un haplotipo, una etiqueta SNP, un alelo de un marcador genético, un gen, una secuencia derivada de ADN, una secuencia derivada de ARN, un promotor, una región no traducida de 5' de un gen, una región no traducida de 3' de un gen, microARN, ARNip, un QTL, un marcador satélite, un transgén, ARNm, ARNm ds, un perfil transcripcional, un patrón de metilación y un nivel de ploidía.

El ADN puede extraerse de la muestra mediante el uso de cualquier método de extracción de ADN conocido por un experimentado en la materia que proporcionará un rendimiento suficiente de ADN, calidad de ADN, respuesta PCR y respuesta de métodos de secuenciación. Esto puede incluir, pero no se limita a: extraer N Amp (Sigma-Aldrich), protocolo CTAB estándar, métodos HotShot, etc. Además, el ADN extraído puede amplificarse después de la extracción mediante el uso de cualquier método de amplificación conocido por los experimentados en la materia.

Además, el ARN puede extraerse de la muestra mediante el uso de cualquier método de extracción de ARN conocido por los experimentados en la materia que proporcionará un rendimiento suficiente de ARN, calidad ARN, respuesta PCR y respuesta de métodos de secuenciación. Además, el ARN extraído puede amplificarse después de la extracción mediante el uso de cualquier método de amplificación conocido por los experimentados en la materia.

Los ácidos nucleicos extraídos pueden analizarse para determinar la presencia o ausencia de un polimorfismo genético adecuado. Una gran variedad de marcadores genéticos para el análisis de polimorfismos genéticos está disponible y se conocen por los experimentados en la materia. Como se usa en la presente descripción, los marcadores genéticos incluyen, pero no se limita a, repeticiones de secuencia simple (SSR, por sus siglas en inglés), polimorfismos nucleótidos simples (SNP, por sus siglas en inglés) , inserciones o supresiones (indel, por sus siglas en inglés), perfiles transcripcionales y secuencias de ácido nucleico. Se puede usar un análisis de ácido nucleico para determinar la presencia o ausencia del marcador genético para la selección de embriones como parte de un mejoramiento de planta o programa de cultivo. El análisis puede usarse para seleccionar embriones que alojan genes, QTL, alelos o haplotipos de interés. Los métodos de análisis se conocen en la materia e incluyen, pero no se limitan a, métodos de detección con base en PCR (tales como, por ejemplo, ensayos TaqMan), métodos de micromatriz y métodos de secuenciación de ácido nucleico. Los genes, alelos, QTL o haplotipos pueden identificarse, además, mediante el uso de nuevas téenicas de biología molecular.

Métodos que usan el muestreo embrionario Los métodos de la presente descripción usan muestreo embrionario para contribuir a las actividades de mejoramiento del germoplasma que incluyen, pero no se limitan a: economización de programas de haploide doble al seleccionar solo embriones preferidos para duplicación, análisis de haploide y material de haploide doble para características genotípicas, integración y evaluación de rasgos y cultivo asistido por marcadores.

Las plantas haploide doble (DH, por sus siglas en inglés) proporcionan una herramienta individual para cultivadores de plantas, particularmente para generar líneas puras. Se ahorra mucho tiempo cuando las líneas homocigóticas se generan, esencialmente, instantáneamente, al negar la necesidad de cultivo convencional multigeneracional.

Sin embargo, se conoce en la materia que el proceso de producción de DH es ineficiente y puede demandar una labor intensa. Si bien las plantas haploide doble pueden ocurrir, espontáneamente, en la naturaleza, esto es, extremadamente, raro. La mayoría de investigaciones y aplicaciones de cultivo se basan en métodos artificiales de producción de DH. La etapa inicial implica la haploidización de la planta que resulta en la producción de una población que comprende semillas haploides. Las líneas no homocigóticas se cruzan con un progenitor inductor que resulta en la producción de semilla haploide. La semilla que tiene un embrión haploide, pero un endosperma triploide normal, avanza a la segunda etapa. Es decir, las plantas y semilla haploides son cualquier planta con un embrión haploide, independiente del nivel de ploidía de la endosperma. Después de seleccionar las semillas haploides de la población, las semillas seleccionadas experimentan una duplicación de cromosomas para producir semillas haploide doble. Una duplicación cromosomática espontánea en un linaje celular llevará a la producción de gameto normal o la producción de gametos no reducidos de linajes celulares haploides. La aplicación de un compuesto químico, tal como colquicina puede usarse para incrementar la velocidad de diploidización. La colquicina se une al tubulín y previene su polimerización en microtúbulos, de esta manera detiene la mitosis en la metafase y puede usarse para incrementar la velocidad de diploidización, es decir, la duplicación de la cantidad de cromosomas. Estas plantas quiméricas se autopolinizan para producir semillas diploides (haploide doble). Esta semilla DH se cultiva y evalúa, posteriormente, y se usa en la producción de retrocruzamiento híbrido.

Los métodos de la presente descripción facilitan el potencial para la selección en el haploide así como la etapa de haploide doble. Como parte de un programa de haploide doble, se aíslan embriones haploides inmaduros y, después, los embriones haploides se ponen en contacto con un agente de duplicación tal como colquicina u otro agente conocido en la materia. El muestreo puede realizarse antes de la exposición al agente de duplicación o después. Con los primeros, los embriones muestreados antes de la duplicación pueden identificarse como candidatos para la duplicación con base en la duplicación del muestreo. Con los últimos, tan pronto como la fase de duplicación se complete, es necesario transferir los embriones seleccionados del medio de duplicación a un medio desprovisto de agente duplicador tal como, por ejemplo, un medio de germinación. En esta etapa, es conveniente y económico retirar una pieza de tejido del escutelo o cotiledón para análisis molecular. Los métodos presentados en la presente descripción permiten de esta manerarealizar decisiones de progreso al comienzo del proceso de haploide doble.

Los métodos de la presente descripción pueden integrarse, fácilmente, en cualquier proceso de rescate de embrión en el cual se aísla un embrión y, después, se cultiva.

Por ejemplo, en el cultivo de plantas, el uso de téenicas de rescate de embrión disminuye, significativamente, el tiempo que toma transferir un rasgo benéfico de un donador progenitor donador a un progenitor recurrente con el antecedente genético deseado (Wang et al. 2011. Plant Breeding. 130:569-573). Las técnicas implican cultivar embriones inmaduros en un medio de nutriente que puede o no puede suplementarse con un agente selectivo para examinar explantes transgénicos, trasplantar los embriones o plántulas derivadas de estos a un ambiente de crecimiento controlado por un periodo de tiempo suficiente y, después, trasplantar las plántulas al campo. Antes de gastar los recursos, es conveniente y económico retirar una pieza de tejido del escutelo o cotiledón de los embriones inmaduros para identificar aquellos embriones que producirán plantas con rasgos deseados.

EJEMPLOS La presente invención se ilustra con mayor detalle en los siguientes ejemplos, en los cuales las partes y los porcentajes están en peso y los grados están en grados Celsius, a menos que se indique de otra manera. Debe entenderse que si bien estos ejemplos señalan las modalidades de la invención, se proporcionan solo a manera de ejemplo. A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, una persona con experiencia en la materia podrá determinar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu ni del alcance de ella, podrá introducir varios cambios y modificaciones en la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones. Por consiguiente, diversas modificaciones de la invención además de aquellas que se muestran y describen en la presente descripción serán evidentes para aquellos con experiencia en la materia a partir de la descripción anteriormente mencionada. Las modificaciones se incluirán, además, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 Muestreo del escutelo para obtener ADN para análisis molecular (Monocotiledóneas) Muestreo del escutelo El tejido del escutelo se extrajo de embriones inmaduros de aproximadamente 2-4 mm de tamaño y, después, se colocaron en el medio. Las muestras se ubicaron en el refrigerador al menos una semana antes de extraer ADN, y las porciones restantes de los embriones de maíz se plantaron en la casa sombra.

Extracción de ADN y prueba de marcadores Las muestras se retiraron del medio con pinzas y se enjuagaron en agua HPLC y, después, se secaron con toallas. Después, las muestras se ubicaron en tubos de ensayo dentro de una placa de 96 pozos. El tejido de la hoja de un genotipo desconocido se agregó, además, a tubos de ensayo desocupados en la placa de 96 pozos como un medio de comparación. Se elaboró dos placas de réplica a partir de la misma placa fuente. Se usó una etapa adicional de triturado para asegurar que las muestras se trituraron correctamente. Se usó dos protocolos de extracción diferentes en cada tipo de tejido; el protocolo de extracción de ADN HotShot y el protocolo de extracción Sbeadex. Se probaron, inicialmente, 32 marcadores SNP mediante el uso de una plataforma Invader Plus.

Los resultados obtenidos muestran que existe suficiente ADN extraído de cada muestra del escutelo para realizar un análisis de marcador molecular y de hecho, las muestras del escutelo se amplificaron con la misma "intensidad" que las muestras de hojas en la misma placa. Rendimiento de plantas derivadas de embriones muestreados El desarrollo se retrasó dentro de la primera semana de germinación; sin embargo, el retraso fue temporal y no pudo detectarse una semana después de plantarse en macetas en la casa sombra.

Ejemplo 2 Análisis comparativo entre el muestreo del escutelo y el muestreo de hojas para el análisis molecular Se extrajo una muestra de tejido del escutelo de cada embrión inmaduro mediante el uso de un escalpelo nuevo, esteril. Las muestras se ubicaron en placas de campo y, después, se pusieron, en tubos mediante el uso de hisopos de algodón nuevos y estériles. Las muestras de hojas de plantas haploide doble se recolectaron, además, en el campo y, después, se congelaron. Se presentaron dos perforaciones de hoja por muestra.

Se usaron dos protocolos de extracción simples en cada tipo de tejido, el protocolo de extracción de ADN HotShot DNA y el protocolo de extracción Sbeadex. El ADN extraído se ejecutó con cuarenta y ocho marcadores SNP de producción. La concordancia estuvo dentro de los estándares de producción con solo 0.22 % de errores (es decir, determinación incorrecta de alelos) . Además, las muestras de hojas y escutelo rindieron dentro de los estándares de producción menores que el 5 % de NF (no encontrados) . Los het eroc igotos (Hets) resultaron como equívocos ya que las muestras fueron muestras de haploide doble.

Tabla 1: Rendimiento de marcador: comparación entre muestras de escutelo y hojas Ejemplo 3 Muestreo de cotiledón (embriones dicotiledóneos) para obtener ADN para análisis molecular El tejido cotiledón se extrajo de embriones de cañóla derivados de microsporas inmaduros y se colocaron en el medio. Las muestras se retiraron del medio con pinzas y se enjuagaron en agua HPLC y, después, se secaron con toallas. Después, las muestras se colocaron en tubos de ensayo dentro de una placa de 96 pozos. El tejido de la hoja de un genotipo desconocido se agregó, además, a tubos de ensayo desocupados en la placa de 96 pozos como un medio de comparación. Se elaboró dos placas de réplica a partir de la misma placa fuente. Se usó una etapa adicional de triturado para asegurar que las muestras se trituraron correctamente. Se usó dos protocolos de extracción diferentes en cada tipo de tejido; el protocolo de extracción de ADN HotShot y el protocolo de extracción Sbeadex. Se probaron ocho marcadores SNP mediante el uso de una plataforma Invader Plus.

El ADN extraído (mediante el uso de ya sea el método de extracción Sbeadex o Hotshot) se ejecutó con ocho marcadores SNP de producción. Los resultados se muestran en la Tabla 2. El método Sbeadex dio como resultado un % alto de NF (es decir, no encontrado). El método de extracción Hotshot proporcionó resultados ligeramente fuera del intervalo aceptable (<5 % de NF) para los embriones inmaduros pequeños, pero esto fue aún mejor que los resultados obtenidos con el tejido de hojas. Las muestras "pequeñas" se desempeñaron mejor que las muestras "grandes". Generalmente, los resultados mostraron que existe suficiente ADN extraído de cada muestra de cotiledón para realizar el análisis de marcador molecular.

Con respecto al desarrollo adicional de los embriones, se observaron eventos de desarrollo inesperados.

Tabla 2: Resultados del análisis de marcador SNP mediante el uso de ADN obtenido de tejido cotiledón Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para analizar un embrión aislado de una planta monocotiledónea, caracterizado porque comprende: a. extraer una pieza de tejido del escutelo del embrión aislado, caracterizado porque la extracción no causa una reducción significativa en el potencial de germinación del embrión aislado; y b. analizar la pieza de tejido del escutelo para determinar la presencia o ausencia de una o más características indicativas de al menos un rasgo genético.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la planta monocotiledónea es maíz, sorgo, trigo, arroz, cebada, avena, centeno, mijo, caña de azúcar, triticale, o pasto.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el embrión aislado se obtiene de una semilla o se deriva de otros tejidos.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el embrión aislado es inmaduro.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el embrión aislado es capaz de germinar en una planta después de extraer la pieza tejido del escutelo.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el embrión aislado es fresco o refrigerado.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la pieza de tejido del escutelo es liofilizada, fresca, congelada o refrigerada después del muestreo.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la pieza de tejido del escutelo es mayor o igual que un núcleo simple.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la extracción se realiza mediante el uso de una herramienta seleccionada del grupo que consiste en: una broca, un chorro de agua, un láser, una cuchilla simple, un conjunto de cuchillas opuestas, una jeringa, un muestreador de núcleo (herramientas para extraer núcleos), un bisturí, un cable de diámetro pequeño, un cable de acero texturado de diámetro pequeño, una espátula y un hisopo.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la extracción se realiza mediante un proceso no automatizado.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la pieza de tejido del escutelo se analiza para determinar una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: un marcador genético, un polimorfismo nucleótido simple, una repetición de secuencia simple, un polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción, un haplotipo, una etiqueta SNP, un alelo de un marcador genético, un gen, una secuencia derivada de ADN, una secuencia derivada de ARN, un promotor, una región no traducida de 5 ' de un gen, una región no traducida de 3' de un gen, microARN, ARNip, un QTL, un marcador satélite, un transgén, ARNm, ARNm ds, un perfil transcripcional, un patrón de metilación y un nivel de ploidía.

12. Un método para analizar un embrión aislado de una planta dicotiledónea, caracterizado porque comprende: a. extraer una pieza de tejido cotiledón del embrión aislado caracterizado porque la extracción no causa una reducción significativa en el potencial de germinación del embrión aislado; y b. analizar la pieza de tejido cotiledón para determinar la presencia de una o más características indicativas de al menos un rasgo genético.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la planta dicotiledónea es cañóla, soja, girasol, alfalfa o algodón.

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el embrión aislado se obtiene de una semilla o se deriva de otros tejidos.

15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el embrión aislado es inmaduro.

16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el embrión aislado es capaz de germinar en una planta después de extraer la pieza de tejido cotiledón.

17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el embrión aislado es fresco o refrigerado.

18. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la pieza de tejido cotiledón es liofilizada, fresca, congelada o refrigerada después del muéstreo.

19. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la pieza de tejido cotiledón es mayor o igual que un núcleo simple.

20. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la extracción se realiza mediante el uso de una herramienta seleccionada del grupo que consiste en: una broca, un chorro de agua, un láser, una cuchilla simple, un conjunto de cuchillas opuestas, una jeringa, un muestreador de núcleo (herramientas para extraer núcleos), un bisturí, un cable de diámetro pequeño, un cable de acero texturado de diámetro pequeño, una espátula y un hisopo.

21. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la extracción se realiza mediante un proceso automatizado.

22. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la pieza de tejido cotiledón se analiza para determinar una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: un marcador genético, un polimorfismo nucleótido simple, una repetición de secuencia simple, un polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción, un haplotipo, una etiqueta SNP, un alelo de un marcador genético, un gen, una secuencia derivada de ADN, una secuencia derivada de ARN, un promotor, una región no traducida de 5' de un gen, una región no traducida de 3r de un gen, microARN, ARNip, un QTL, un marcador satélite, un transgén, ARNm, ARNm ds, un perfil transcripcional, un patrón de metilación y un nivel de ploidía.