DD279690A5 - Verfahren zur bestimmung der nukleotidbasenfolge eines dna molekuels - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidbasenfolge eines DNA-Molekuels unter Verwendung von DNA-Polymerase. Erfindungsgemaess erfolgt die Bestimmung der Nukleotidbasenfolge eines DNA-Molekuels durch Anlassen des DNA-Molekuels mit einem Primaer-Molekuel, das an das DNA-Molekuel hybridisieren kann; Inkubation getrennter Abschnitte des angelassenen Gemischs in mindestens vier Behaeltern, wobei jeder Behaelter vier verschiedene Deoxynukleosidtriphosphate, eine prozessive DNA-Polymerase, worin die Polymerase an das DNA-Molekuel fuer wenigstens 500 Basen gebunden bleibt, bevor die Dissoziation in einer Umgebung erfolgt, wie sie normalerweise bei der Erweiterungsreaktion einer DNA-Folgebildungsreaktion angewendet wird, und worin die Polymerase weniger als 500 Einheiten Exonukleaseaktivitaet je mg der Polymerase hat, und eines von vier die DNA-Synthese beendenden Agentien enthaelt, welche die DNA-Synthese an einer speziellen Nukleotidbase beendet, wobei jedes der Agentien die DNA-Synthese an einer unterschiedlichen Nukleotidbase beendet, und Trennung der DNA-Produkte aus jeder Inkubationsreaktion nach der Groesse, wodurch wenigstens ein Teil der Nukleotidbasenfolge des DNA-Molekuels bestimmt werden kann.

Description

Hierzu 22 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidbasenfolge eines DNA-Moleküls unter Verwendung von DNA-Polymerase.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Diese Patentanmeldung ist eine teilweise Weiterführung der Stanley Tabor u.a. am 14. Januar 1987 eingereihten Anmeldung unter dem Titel „T7 DNA-Polymerase" (DNA-Polymerase T7), Serien-Nr. 003 277, die in die vorliegende Anmeldung als Referenz einbezogen wird.

Die DNA-Folgebildung beinhaltet die Erzeugung von vier Populationen von einsträngigen DNA-Fragmenten mit einem definierten Terminus und pinem variablen Terminus. Der variable Terminus endet immer an einer speziellen gegebenen Nukleotidbasis (entweder Guanin (G], Adr,iin |A), Thymin IT) oder Zytosin [C]). Die vier verschiedenen Fragmentsätze werden jeweils auf der Grundlage ihrer Länge au. einem Polyakrylamidgel mit hoher Auflösung getrennt, jedes Band auf dem Gel entspricht kolinear einem speziellen Nukleotid in der DNA-Folge, wodurch die Positionen in der Folge der gegebenen Nukleotidbasis indentifiert werden.

Im allgemeinen gibt es 2 Verfahren der DNA-Folgebildung. Ein Verfahren (die Maxam- und Gilbert-Folgebildung) beinhaltet den chemischen Abbau von isolierten DNA-Fragmenten, die jeweils am definierten Terminus mit einer einzigen Radiomarkierung gekennzeichnet sind, wobei jede Reaktion eine begrenzte Spaltung speziell an einer odei mehreren der vier BPüen (G, A, T oder C) bewirkt. Das andere Verfahren (Dideoxy-Folgebildung) beinhaltet die enzymatische Synthese eines DNA-Stranges. Es werden vier gesonderte Synthesen ausgeführt, wobei bewirkt wird, daß jede Reaktion an einer speziellen Basis (G, A, T oder C) endet, wozu das entsprechende kettenbeendende Dideoxynukleotid einbezogen wird. Bevorzugt wird das letztgenannte Verfahren, da die DNA-Fragmente einheitlich markiert sind (nicht endmarkiert) und folglich die größeren DNA-Fragmente zunehmend mehr Radioaktivität enthalten. Außerdem können ³⁵S-markierte Nukleotide anstelle von ³²p-markierten N'ikleotiden verwendet werden, was zu einer schärferen Definition führt; und die Reaktionsprodukte sind einfach zu unterpretieren, da jede Bahn nur entwoder G, A, T oder C entspricht. Das für die meisten Dideoxy-Folgebildungen verwendete Enzym ist das große DNA-Polymerase I-Fragment von Escherichia coli („Klenow"). Eine andere verwendete Polymerase ist AMV-Reverstranskriptase.

Ziel der Erfindung

Mit der Erfindung wird ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidbasenfolge eines DNA-Moleküls zur Verfügung gestellt, da eine DNA Polymerase T7 eingesetzt wird, die prozessiv nichtunterscheidend ist und kurze Anlaßelemente oder Primäre nutzen kann und koine Exonukleaseaktivität besitzt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Bestimmung der Nukleoti^basenfolge unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit verbesserten Eigenschaften bereitzustellen.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidbasenfolge eines DNA-Moleküls, das darin besteht, das DNA-Molekül mit einem Anlaß-Molekül anzulassen, welches das DNA-Molekül hybridisieren kann; getrennte Portionen des angelassenen Gemischs in wenigstens vier Behältern mit vier verscniedenen Deoxynukleosidtriphosphaten zu inkubieren, einer prozessiven DNA-Polymerase, bei der die Polymerase für wenigstens 500 Basen an ein DNA-Molekül gebunden bleibt, bevor die Dissoziation in Umweltbedingungen erfolgt, wie sie normalerweise bei der Extensionsreaktion einer DNA-Folgebildungsreaktion angewendet werden, wobei dio Polymerase weniger als 500 Einheiten an Exonukleaseaktivität je mg der Polymerase hat, und einen der vier die DNA-Synthese beendenden Agenzien, welche die DNA-Synthese an einer speziellen Nukleotidbase beenden. Das Agens beendet bei einer unterschiedlichen, speziellen Nukleotidbasis in jedem der vier Behälter. Die DNA-Produkte der Inkubationsreaktion werden nach ihrer Größe getrennt, so daß zumindest ein Teil der Nukleotidbasenfolge des DNA-Moleküls bestimmt werden kann.

Bei den bevorzugten Ausführungsbeispielen bleibt die Polymerase für wenigstens 1000 Basen an das DNA-Molekül gebunden, bevor es dissoziiert; die Polymerase ist im wesentlichen die gleiche wie in Zellen, die mit einem Phag des T7-Typs infiziert sind (d. h., einem Phag, in welchem die DNA-Polymerase Wirts-Thioredoxin als Untereinheit brau> nt, beispielsweise ist das T7-Typ-Phag T7, T3,01,0II, H, W31, gh-1, Y, A1122 oder SP6, Studier, 95 Virology 70,1979); die Polymerase unterscheidet nicht nach Dideoxynukleoiidanalogen; die Polymerase ist so modifiziert, diß sie weniger als 50 Einheiten an Exonukleaseaktivität je mg Polymerase, vorzugsweise wengiger als 1 Einheit und günstigenfal's weniger als 0,1 Einheit bzw. keine feststellbare Exonukleaseaktivität hat; die Polymerase kann mit so kurzen Anlaßelementen wie 10 Basen oder vorzugsweise 4 Basen wirksam werden; das Anlaßelement besteht aus vier bis vierzig Nukleotidbasen und ist eine einsträngige DNA oder RNA; der Anlaßschritt besteht aus dem Erhitzen des ONA-Moleküls und des Anlaßelsmentes auf über 6S°C, vorzugsweise zwischen 65 und 100⁰C, worauf sich das erhitzte Gemisch auf unter 65⁰C, vorzugsweise auf 0 bis 3O⁰C abkühlen kann; der Inkubationsschritt setzt sich zusammen aus einem Impuls- und einem Prägeschritt, wobei der Impulsschritt darin besteht, das angelassene Gemisch mit allen vier verschiedenen Deoxynukleosidtriphosphaten und einer prozessiven DNA-Polymerase zu mischen, wobei wenigstens eines der Deoxynukleosidtriphosphate markiert ist; vorzugsweise wird der Impulsschritt unter Bedingungen ausgeführt, in denen die Polymerase nicht ihre Prozessivität aufweist, und währt 30s bis 20min bei O⁰C bis 2O⁰C, oder unter denen wenigstens eines der Nukleotidtriphosphate begrenzend ist; und der Prägeschritt besteht darin, daß vier Aliquoten eines Gemischs nach dem Impulsschritt eines der kettenbeendenden Agenzien zugesetzt wird; vorzugsweise dauert der Prägeschritt 1 bis 60 min bei 3O⁰C bis 5O⁰C; das beendende Agens ist ein Dideoxynukleotid oder ein begrenzender Wert eines Deoxynukleosidtriphosphats; eines der vier Deoxyr.ukleotide ist dlTP oder Deazaguanosin; es werden markierte Anlaßelemente ve.v/endet, so daß kein Impulsschritt erforderlich ist, ."Me Markierung ist vorzugsweise radioaktiv oder fluoreszent; und die Polymerase ist nicht in der Lage, ihre Prozessivität in einer zweiten Umweltbedingung zu erweisen, wie sie normalerweise bei der Impulsreaktion einer DNA-Folgebildungsreaktion angewendet wird.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine DNA-Polymerase verwendet, die prozessiv, nichtunterscheidend ist und kurze Anlaßelemente oder Primäre nutzen kann. Außerdem hat die Polymerase keine assoziierte Exonukleaseaktivität. Das sind ideale Eigenschaften für das oben beschriebene Verfahren und insbesondere für DNA-Folgebildungoreaktionen, da der Hintergrundwert dor Radioaktivität im Polyazylamidgel negierbar ist, nur wenig oder keine artifaktuellen Bänder vorhanden sind und die Bänder scharf sind-wodurch die DNA-Foi_de leicht zu lesen ist. Außerdem ermöglicht eine solche Polymerase neuartige Verfahren der Folgebildung bei langen DNA-Fragmenten, wie das unten ausführlich beschrieben wird. Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen ersichtlich.

Ausführungsbeispiele

Zuerst werden kurz die Zeichnungen beschrieben, in denen,

bis 3: schematische Darstellungen der Vektoren pTrx-2, mGP 1 -1 bzw. pGP-5 sind; Abb. 4: eine grafische Darstellung der selektiven Oxydation von DNA-Polymerase T7 ist; Abb. 5: eine grafische Darstellung der Fähigkeit der modifizierten T7-Polymerase ist, DNA bei Vorhandensein

von Etheno-dATP zu synthetisieren, und Abb. 6 eine schematische Darstellung der enzymatischen Erweiterung von genomisc-, DNA unter Verwendung

der modifizierten DNA-Polymerase T7 ist

Abb.7,8

und 9: sind die Nukleotidfolgen von pTrx-2, einem Teil von pGP5-5 bzw. mGP 1 -2. Abb. 10: ist eine schematische Darstellung von pGP5-6.

DNA-Polymerase

Im allgemeinen ist die DNA-Polymerase dieser Erfindung prozessiv, hat keine assoziierte Exonukleaseaktivität, wirkt nicht gegen die Einbeziehung von Nukleotidanalogen und kann kleine Oligonukleotide (wie Tetramere, Hexamere und Oktamere) als spezielle Primäre oder Anlaßelemente nutzen. Diese Eigenschaften werden nun ausführlich behandelt.

Prozessivität

Unter Prozessivität versteht man, daß die DNA-Polymerase kontinuierlich zahlreiche Nukleotide unter Nutzung desselben Primär-Templats einbeziehen kann, ohne Dissoziation vom Templat, unter Bedingungen, wie sie normalerweise für Erweiterungsreaktionen von DNA-Folgebildungen eingesetzt werden. Der Grad der Prozessivität ist bei den verschiedenen Polymerasen unterschiedlich: einige beziehen nur wenige Basen vorder Dissoziation ein (z.B. Klenow [etwa 15 Basen], DNA-Polymerase T4 [etwa 10 Basen], DNA-PolymeraseT5 [etwa 180 Basen) und Reverstranskriptase [etwa 200 Basen] [Das u.a.,J. Biol. Chem., 254:1227,1979; Bambara und a., J. Biol.Chem. 253,410,1978]), während andere, so die der vorliegenden Erfindung, für wenigstens 500 Basen und vorzugsweise wenigstens 1000 Basen unter geeigneten Umweltbedingungen gebunden bleiben. Zu diesen Umweltbedingungen gehören eine angemessene Zufuhr aller vier Deoxynukleosidtriphosphate und eine Inkubationstemperatur zwischen 10 und 50^cC.

Die Prozessivität wird durch das Vorhandensein von einsträngig gebundenem (ssb) Protein von E. coli stark vergrößert. Mit prozessiven Enzymen erfolgt eine Beendigung einer Folgebildungsreaktion nur an den Basen, in die ein keUenbeendendes Agens einbezogen wurde, beispielsweise ein Dideoxynukleoticl. Wenn die DNA-Polymerase nichtprozessiv ist, dann entstehen während der Folgebildungsreaktionen an den Positionen, die dem Nukleotid entsprechen, an dem die Polymeiase dissoziiert wird, artifaktuelle Bänder. Häufige Dissoziation bildet einen Hintergrund von Bändern an falschen Positionen und verschleiert die echte DNA-Folge. Dieses Problem wird teilweise durch Inkubation des Reaktionsgemischs über eine lange Zeit (30 bis 60min) bei einer hohen Konzentration der Substrate gelöst, wodurch die artifaktuellen Bänder in den Bereich des hohen Molekulargewichtes oben am Gel, weg aus dem Bereich „gejagt" werden, in welchem die DNA-Folge gelesen wird. Das ist keine ideale Lösung, da eine nichtprozessive DNA-Polymerase eine hohe Wahrscheinlichkeit der Dissoziation vom Templat in Bereichen mit kompakter Sekundärstruktur oder Haarnadeln hat. Die Reinitiierung der Primärverlängerung an diesen Stellen ist unwirksam, und das übliche Ergebnis ist die Bildung von Bändern an derselben Stelle für alle vier Nukleotide, wodurch die DNA-Folge verschleiert wird.

Analogdiskrimination

Dia DNA-Polymerasen dieser Erfindung unterscheiden nicht signifikant zwischen Dideoxynukleotidanalogen und normalen Nukleotiden. Das heißt, die Chance der Einbeziehung eines Analogs ist etwa die gleiche wie die eines normalen Nukleotids, oder das Analog wird mit wenigstens Vio der Effektivität eines normalen Analogs einbezogen. Die Polymerasen dieuer Erfindung unterscheiden auch nicht signifikant gegenüber einigen anderen Analogen. Das ist wichtig, da Folgsbildungsreaktionen neben den vier normalen Deoxynukleosidtriphosphaten (dGTP, dATP, dTTP und dCTP) die Einbeziehung von anderen Typen von Nukleotidderivaten verlangen wie radioaktiv oder fluoreszent markierten Nukleosidtriphosphaten, die für die Kennzeichnung von synthetisierten Strängen mit ³⁵S, 32 P oder anderen chemischen Agenzien üblich sind. Wenn eine DNA-Polymerase nicht gegen Analoge wirkt, besteht die gleiche Wahrscheinlichkeit für die Einbeziehung eines Analogs wie für die Einbeziehung eines normalen Nukleotids. Bei markierten Nukleosidtriphosphaten ist das wichtig, um die synthetisierten DNA-Stränge unter Verwendung eines Minimums an Radioaktivität wirksam kennzeichnen zu können. Außerdem sind bei diesen Enzymen niedrigere Werte der Analoge erforderlich, wodurch die Folgebildungsreaktionen billiger als mit einem diskriminierten Enzym werden.

Diskriminierende Polymerasen weisen ein unterschiedliches Maß an Diskrimination auf, wenn sie im prozessiven Modus polymerisieren als bei Stillstand, wenn sie kämpfen, durch ein zweites Strukturhindernis zu synthetisieren. An solchen Hindernissen tritt eine Variabilität in der Intensität der verschiedenen radioaktiven Bänder auf dem Gel auf, welche die Folge verschleiern kann.

Exonukleaseaktivität

Die DNA-Polymerase der Erfindung hat weniger als 50%, vorzugsweise weniger als 1 % und günstigstenfalls weniger als 0,1 % des normalen oder natürlich assoziierten Pegels der Exonukleaseaktivität (Menge der Aktivität je Polymerasemolekül). Unter dem normalen natürlich assoziierten Pegel versteht man die Exonukleaseaktivität der unmodifizierten Polymerase des Typs T7. Normalerweise beträgt die assoziierte Aktivität etwa 5000 Einheiten Exonukleaseaktivität je mg der Polymerase, gemessen, wie das unten nach einer Modifikation des Verfahrens von Chase u.a. (249, J. Biol. Chem., 4545,1974} beschrieben wird. Exonukleasen steigern die Wiedergabelreue der DNA-Synthese durch Ausstoßung aller neu synthetisierten Basen, die eine unkorrekte Basenpaarung zum Templat aufweisen. Diese assoziierten Exonukleaseaktivitäten sind für die Qualität von DNA-Folgebildungsreaktionen schädlich. Sie erhöhen die erforderliche Mindestkonzentration der Nukleotidvorläufer, die der Reaktion zugesetzt werden müssen, da sich, wenn die Nukleotidkonzentration fällt, die Polymeraseaktivität auf eine Rate verlangsamt, die mit der Exonukleaseaktivität vergleichbar ist, was dazu führt, daß netto keine DNA-Synthose oder sogar der Abbau der synthetisierten DNA erfolgt.

Wichtiger noch ist, daß die assoziierte Nukleaseaktivität die DNA-Polymerase in Bereichen im Templat mit sekundären Strukturhindernissen ?um Stillstand bringt. Wenn sich eine Polymerase einer solchen Struktur annähert, verringert sich ihre Syntheserate, da sie d'.. - Struktur zu passieren sucht. Eine assoziierte Exonuklease stößt die frisch synthetisierte DNA aus, wenn die Polymerase zum Stillstand kommt. Infolgedessen treten zahlreiche Zyklen von Synthese und Ausstoßung auf. Das kann dazu führen, daß die Polymerase schließlich hinter die Haarnadel polymerisiert (ohne Beeinträchtigung der Qualität der Folgebildungsreaktion); oder die Polymerase kann sich vom synthetisierten Strang dissoziieren (was zu einem artifaktuellen Band in derselben Position in allen vier Folgebildungsreaktionen führt); oder es kann ein kettenbeendendes Agens mit hoher Frequenz einbezogen und eine breite Variabilität in den Intensität der verschiedenen Fragmente in einem Folgebildungs-Gel

erzeugt werden. Das geschieht, weil die Frequenz der Einbeziehung eines kettenbeendenden Agens an einer gegebenen Stelle mit der Anzahl der Möglichkeiten zunimmt, welche die Polynerase zur Einbeziehung des kettenbeendenden Nukleotids hat, und so bezieht die DNA-Polymerase mit weit höherer Frequenz ein kettenbeendendes Agens an den Stellen mit Stillstand als an anderen Stellen ein.

Eine ideale Folgebildungsreaktion erzeugt Bänder von einheitlicher Intensität im gesandten GoI. Das ist wesentlich für das Erzielen der optimalen Pelichtung des Röntgenfilms für jedes radioaktive Fragment. Wenn die radioaktiven Bänder variabel sind, besteht die Gefahr, daß blassere Bänder unentdeckt bleiben. Um eine einheitliche radioaktive Intensität aller Fragmente zu erreichen, sollt die DNA-Polymerase das gleiche Zeitintervall in jeder Position auf der DNA verbringen und keine Vorliebe für das Hinzufügen oder Entfernen von Nukleotiden an einer der gegebenen Stellen aufweisen. Das ist dann der Fall, wenn die DNA-Polymerase keinerlei assoziierte Exonuklease hat, so daß nur eine Möglichkeit besteht, ein kettenbeendendes Nukleotid in jeder Position länps des Templats einzubeziehen.

Kurze Anlaßelemente

Die DNA-Poiymerase der Erfindung ist in der Lage, mit Anlaßelementen oder Primären von 10 Basen oder weniger sowie mit längeren, vorzugsweise solchen ν τη 4 bis 20 Basen, zu arbeiten. Die Fähigkeit, kurze Primäre nutzen zu können, bietet eine Reihe wichtiger Vorteile bei der DNA-Fol&ebildung. Die kürzeren Primäre sind billiger im Erwerb und leichter /u synthetisieren als die üblichen 15- bis 20 mer Primäre. Sie lassen sich auch schneller an komplementäre Stellen eines DNA-Templats anlassen, wodurch die Reaktion der Folgebildung beschleunigt wird. Außerdem gestattet die Fähigkeit, kleine (z. B. aus sechs oder sieben Basen bestehende) Oligonukleotidprimäre für die DNA-Folgebildung anzuwenden. Strategien, die andernfalls für die Folgebildung von langen DNA-Fragmenten nicht möglich sind. Beispielsweise könnte ein Satz geschaffen werden, der 80 zufällige Hexamere enthält, von denen keines für eine Stelle im Klonungsvektor komplementär ist. Statistisch gesehen, tritt eine der 80 Hexamerfolgen durchschnittlich alle 50 Basen längs der Folge des zu bildenden DNA-Fragmentes auf. Die Bestimmung einer Folge von 3000 Basen würde nur fünf Folgebildungszyklen verlangen. Zuerst würde ein „universelles" Pi ir (ζ. Β. Nr. 1211 der New England Biolabs, Folge 5', GTAAAACGACGGCCAGT3') benutzt, um eine Folge von etwa 600 Basen an einem Ende e'er Einfügung zu bilden. Unter Verwendung der Ergebnisse dieser Folgebildungsreaktion würde ein neues Primär aus dem Satz entnommen, das einem Bereich nahe dem Ende der bestimmten Folge homolog ist. Im zweiten Zyklus würde die Folge der nächsten 600 Basen unter Verwendung dieses Primärs bestimmt. Eine fünfmalige Wiederholung dieses Prozesses würde die komplette Folge von 3000 Basen bestimmen, ohne daß eine Subklonung erforderlich wäre und ohne das neue Oligonukleotidprimäre chemisch synthetisiert werden müßten. Die Verwendung solcher kurzen Primäre kann durch die Einbeziehung von Gen 2,5 und 4-Protein von T7 in die Reaktion der Folgebildung erweitert werden.

DNA-Polymerasen der vorliegenden Erfindung (d. h., solche mit den oben genannten Eigenschaften) schließen modifizierte Polymerasen des Typs T7 ein. Das heißt, die DNA-Polymerase braucht Wirtsthioredoxin als Untereinheit, und sie ist im wesentlichen mit einer modifizierten T7-DNA-Polymerase oder mit äquivalenten Enzymen, die aus dem verwandten Phag isoliert wurden, beispielsweise T3, ΦI, ΦII, H, W31, gh-1, Y, A1122 und SP6, identisch. Jedes dieser Enzyme kann so modifiziert werden, daß es ähnliche Eigenschaften wie das modifizierte T7-Enzym hat. Es ist möglich, das Enzym direkt aus phag-infizierten Zellen zu isolieren, vorzugsweise aber wird das Enzym als Zellen isoliert, die es überproduzieren. Unter im wesentlichen identisch versteht man, daß das Enzym Aminosäuresubstitutionen haben kann, welche die Gesamteigenschaften des Enzyms nicht beeinträchtigen. Ein Beispiel für eine besonders wünschenswerte Aminosäurensubstitution ist eine, bei der das natürliche Enzym modifiziert ist, um jede Exonukleaseaktivität zu beseitigen. Diese Modifikation kann auf genetischer oder chemischer Ebene ausgeführt werden (siehe unten).

Klonen von T7-Polymerasen

Als Beispiel für die Erfindung werden das Klonen, die Überproduktion, das Reinigen, die Modifikation und die Anwendung von T7-DNA-Polymerase beschrieben. Dieses prozessive Enzym besteht aus zwei Polypeptiden, die in einem stöchiometrischen Verhältnis von eins zu eins einen engen Komplex bilden. Eines ist das phag-T7-kodierte Gen-5-Protein von 84000 Dulton (Modrich u.a., 150, J. Biol. Chem., 5515,1975), das andere ist E. coli-kodiertes Thioredoxin von 12000 Dalton (Tabor u.a., J. Biol. Chem. 262:16,216,1987). Das Thioredoxin ist ein Akzessoirprotein und fügt das Gen5-Protein (die nichtprozessive tatsächliche DNA-Polymerase) an das Primär-Templat an. Der natürlichen DNA-Polymerase ist eine sehr aktive 3'- bis 5'-Excnuklease zugeordnet. Durch diese Aktivität ist die Polymerase für die DNA-Folgebildung nutzlos und muß inaktiviert oder modifiziert werden, bevor die Polymerase verwendet werden kann. Das geschieht, wie unten beschrieben wird, leicht entweder chemisch durch lokale Oxydation des Exonukleasebereichs oder genetisch durch Modifikation der Kodierungsregion des diese Aktivität kodierenden Polymerasegens.

pTrx-2

Um das trxA-Gen (Thioredoxin-Gen) des Wildtyps von E. coli zu klonen, wurde E. coli-DNA mit Sau3A teilweise gespalten und die Fragmente an BamHI-gespaltene T7-DNAgebunden, die vom Stamm T7 ST9 isoliert wurde (Tabor u. a. in „Thioredoxin and Glutaredoxin Systems: Structure and Function" (Thioredoxin- und Glutaredoxinsysteme. Struktur und Funktion) (Hsg. Holmgren u. a. j, S. 285-300, Raven Press, NY; und Tabor u.a., siehe oben). Die gebundene DNA wurde in E. coli-trxA"-Zellen transfiziert, das Gemisch auf trxA'-Zellen aufgebracht, und die resultierenden T7-Flecken ausgesucht. Da T7 nicht ohne ein aktives E. coli-trxA-Gen wachsen kann, konnten nur die Phage, welche das trxA-Gen enthielten, Flecken bilden. Die geklonten trxA-Gene wurden auf einem 470 Basen-Paar-Hincll-Fragment loziert.

Im Thioredoxin überzuproduzieren, wurde ein Plasmid, pTrx-2, konstruiert. Kurz gesagt, das aus 470 Basenpaaren bestehende Fragment Hincll, welches das trxA-Gen enthält, wurde nach dem Standard-Verfahren (Maniatis u. a., Cloning: A Labnoratory Manual (Klonen. Ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, N. Y.) isoliert und an ein Derivat von pBR322 gebunden, das ein Ptac-Promoter (ptac-12, Amman u.a., 25 Gene 167,1983) enthält. Es wird auf Abb.2 Bezug genommen. ptac-12, das ß-Laktamasse und Col-El-Ursprung enthält, wurde mit Pvull geschnitten und ergab ein Fragment von 2290 bp, das dann mit zwei Tandem-Kopien von trxA (Fragment Hincll) unter Verwendung kommerziell verfügbarer Bindeelemente (Smal-BamHI-Polylinker) gebunden wurde, um pTrx-2 zu bilden. Die komplette Nukleotidfolge von pTrx-2 wird in der Abb. 7 gezeigt. Die Thioredoxinproduktion erfolgt nun unter der Kontrolle des tac-Promoters und kann damit sepzifisch induziert werden, z. B. durch IPTG(lsopropyl-ß-D-thiegalaktosid).

pGP5-5undmGP1-2

Einige Gen-Produkte von T7 sind tödlich, wenn sie in E. cdi ausgedruckt werden. Es wurde ein Express!onssystem entwickelt, um das Klonen und die Expression von letalen Genen zu erleichtern, auf der Grundlage der induzierbaren Expression von T7-RNA-Folymerase. Gen-5-Protein ist in einigen E.coli-Stämmen tödlich, und ein Beispiel für ein solches System wird von Tabor u.a., 82 Proc. Nat. Acad. Sei., 1074 (1985) beschrieben, wo das T7-Gen 5 unter die Kontrolle des Promoters 10 gestellt wurde und nur ausgedrückt wird, wenn T7-RNA-Polymerase in eier Zelle vorhanden ist.

Kurz gesagt, pGP5-5 (Abb.3) wurde nach Standardverfallron unter Verwendung synthetischer BamHI-Bindeolemunte konstruiert, um dasT7-Fragment von 14306 (Ndel) bis 16869 (Ahalll), das Gen 5 enthält, an das 560 bp-Fragment von T7 von 5667 (Kincll) bis 6166 (Fnu4H1), welches die beiden Φ 1.1A- und Φ 1.1 B-Promoter enthält, die durch die T7-RNA-Polymerase erkannt werden, und das 3kb-BamHI-Hincll-Fragment von pACYC177 (Chang u.a., 134, J.Bacteriol. 1141,1978) zu binden. Die Nukleotidfolge der T7-Einfügungen und Bindeelemente wird in dor Abb. 8 gezeigt. Bei diesem Plasmid wird Gen 5 nur ausgedrückt, wenn T7-RNA-Polymerase in der Zelle vorhanden ist.

Es wird auf die Abb. 3 Bezug genommen. T7-RNA-Polymerase ist auf dom Phag-Vektor mGP1 -2 vorhanden. Das ist ähnlich wie pGP1-2 (Tabor u.a., ebenda), mit der Ausnahme, daß das Fragment von Γ7 von 3133 (Haelll) bis 5840 (Hinfl), weiches T7-RNA-Polymerase enthält, unter Verwendung der Bindeelemente (BgIII und SAH) an BamHI-SAII-geschnittenes M13 mp8 gebunden wurde, wodurch das Polymerasegen unter die Kontrolle des lac-Promoters gestellt wurde; die komplette Nukleotidfolge von mGP1 -2 wird in der Abb. 9 gezeigt.

Da pGP5-5 und pTrx-2 unterschiedliche Replikationsursprünge haben (einen P 15A- bzw. ColEI-Ursprung), können sie gleichzeitig in eine Zelie transformiert werden. pTrx-2 drückt große Mengen an Thioredoxin bbim Vorhandensein von IPTG aus. mGP1-2 kann in derselben Zelle vorhanden sein, wie diese beiden Plasmide, und es kann dazu genutzt werden, die Expression von T7-RNA-Polymerase aus pGP5-5 einfach durch die Veranlassung der Produktion von T7-RNA-Polymerase durch die Induzierung des lac-Promoters mit beispielsweise IPTG zu regulieren.

Überproduktion von T7-DNA-Polymerase

Es gibt verschiedene potentielle Strategien für die Überproduktion und Rekonstitution der beiden Gen-Produkte trxA und Gen 5. Für alle Strategien können dieselben Zellstämme und Plasmide verwendet werden. Bei der bevorzugten Strategie werden die beiden Gene in derselben Zelle gemeinsam zum Überexpression gebracht. (Das ist darauf zurückzuführen, daß Gen 5 gegenüber Proteasen anfällig ist, bis Thioredoxin daran gebunden ist.) Wie unten ausführlich beschrieben w rd, besteht ein Verfahren darin,die beiden Gene getrennt auf eines von zwei kompatiblen Plasmide in derselben Zelle zu bringen. Als Alternative dazu könnten die beiden Gene in Tandem auf dasselbe Plasmid gebracht werden. Es ist wichtig, daß das T7-Gen 5 unter die Kontrolle eines nichtundichten induzierbaren Promoters wie Φ1.1Α, Φ1.1Β und Φ 10 von T7 gebracht wird, da die Synthase selbst kleiner Mengen der beiden Polypeptide in den meisten Zellen von E.coil, toxisch ist. Unter nichtundicht versteht man, daß weniger als 500 Moleküle des Genproduktes je Zellgenerationszeit aus dem Gen produziert werden, wenn das Promoter, welches die Expression des Gens kontrolliert, nicht aktiviert wird. Vorzugsweise wird das T7-RNA-Polymerase-Expressionssystem verwendet, obwohl auch andere Expressionssysteme, die induzierbare Promoter nutzen, verwendet werden könnten. Ein undichtes Promoter, beispielsweise plac, ermöglicht die Synthetisierung von mehr als 500 Proteinmolekülen, selbst wenn keine Induzierung erfolgte, so daß Zellen, die letale Gene enthalten, unter der Kontrolle eines solchen Promoters schlecht wachsen und in dieser Erfindung nicht geeignet sind. Es ist natürlich möglich, diese Produkte in Zellen zu produzieren, in denen sie nicht tödlich sind, beispielsweise ist in solchen Fällen das plac-Promoter geeignet.

Bei einer zweiten Strategie kann jedes Gen gesondert geklont und zur Überexpression gebracht werden. Bei Anwendung dieser Strategie werden Zellen, welche die individuell überproduzierten Polypeptide enthalten, vor der Herstellung der Extrakte kombiniert, zu welchem Zeitpunkt dib beiden Polypeptide eine aktive T7-DNA-Polymerase bilden.

Beispiel 1:

Herstellung von T7-DNA-Polymerase

Für die Herstellung eines Vorrats von mGP1 -2 wird der E. coli-Stamm 71.18 (Messing u. a., Proc. Nat. Acad. Sei. 74: 3642,1977) verwendet. 71.18 wird in 50% Glyzerol bei -80°C aufbewahrt und auf eine Minimalmedien-Agar-Standardplatte gestrichen. Über Nacht wird eine einzige Kolonie in 25ml Standard-Medium M 9 bei 37°C gezogen, und durch Titrieren des Vorrats unter Verwendung von frisch hergestellten 71 .ΙΠ-Zellen erhält man einen einzigen Fleck von mGP1-2. Der Fleck wird zum Inokulieren von 10ml 2X LB (2% Bacto-Trypton, 1 % Hefeextrakt, 0,5% NaCI, BmM NaOH) verwendet, die JM103 enthalten, das für einen Wert Asm = 0,5 gezogen wurde. Diese Kultur bildet den Phag-Vorrat für die Herstellung einer großen Kultur von mGP1-2. Nach 3 bis 12 Stunden wird die 10-ml-Kultur zentrifugiert, und die obenaufschwimmende Schicht wird dazu genutzt, die große Kultur (2 L) zu infizieren. Für die große Kultur werden 4x 500 ml 2XLB mit 4x 5ml 71.18-Zellen, die in M 9 gezüchtet wurden, inokuliert und bei 37°C geschüttelt. Wenn die große Zellkultur auf einen Wert von A₆₉₀ = 1,0 gewachsen ist (etwa drei Stunden), wird diese mit 10ml der obenaufschwimmenden Schicht inokuliert, die das Startlysat von mGP1-2 enthält. Man läßt die infizierten Zellen dann über Nacht bei 37°C wachsen. Am nächsten Tag werden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt, und man kann die obenaufschwimmende Schicht für das Induzieren von K38/pGP5-5/pTrx-2 (siehe unten) verwenden. Di'' obenaufschwimmende Schicht kann bei 4°C bei einem Titer von ~ 5 χ 10" 0/ml für die Dauer von etwa sechs Monaten aubewahren. Bei diesem Titer infiziert 1 L des Phags 121 Zellen bei einem Wert von A₅₉₀ = 5 mit einer Infektionsmultiplizität von 15. Wenn das Titer niedrig ist, kann das Phag mGP1-2 durch Auflösung von NaCI (60g/l) und PEG-6000 (65g/l) in der obenaufschwimmenden Schicht, Absetzenlassen des Gemischs bei O⁰C über die Dauer von 1 bis 72 Stunden und anschließendes Zentrifugieren (7000 U/min für 20 Minuten) aus der obenaufschwimmenden Schicht konzentriert werden. Der Niederschlag, der das Phag mGP1 -2 enthält, wird in etwa '/20. des ursprünglichen Volumens des M 9-Mediums wieder zur Suspension gebracht.

K38/pGP5-5/pTrx-2 ist der E.coli-Stamm (Genotyp HfrC [λ]), der die beiden kompatiblen Plasmide pGP5-5 und pTrx-2 enthält. Plasmid pGP5-5 hat einen P15A-Replikationsursprung und bringt das Kanamyzin-Resist6nzgen (Km) zum Ausdruck. pTrx-2 hat einen ColEI-Replikationsursprung und drückt das Ampizillinresistenzgen (Ap) aus. Die Plasmide werden durch Standardverfahren in K38 eingeführt, wobei Km^R bzw. Ap" gewählt werden. Die Zellen K38/pGP5-5/pTrx-2 werden bei -8O⁰C in Glyzerol aufbewahrt. Vor der Verwendung werden sie auf eine Platte gestrichen, die 50 Mg/ml Ampizillin und Konamyzin, die bei 37⁰C gezogen wurde, enthält, und eine einzelne Kolonie, die in 10ml LB-Medium gezogen wurde, das 50|jg/rr,.' Ampizillin und Kanamyzin enthält, bei 37⁰C für die Dauer von 4 bis 6 Stunden. Die 10-ml-Zellkultur wird zum Inokulieren von 500 ml LB-Medium

verwendet, das δΟμρ/ηιΙ Ampizillin und Kanamycin enthält, und bei 37⁰C über Nacht geschüttelt. Am folgenden Tag wird die 500-ml-Kulturzum Inokulieren von 1212X LB-KPO₄-Medium (2% Bacto-Trypton, 1 % Hefeextrakt, 0,5% NaCI, 2OmM KPO₄,0,2% Dextrose und 0,2% Kasaminosäuren, pH-Wert 7,4) verwendet und unter Belüftung in einem Fermentor bei 37^CC gezogen. Wenn die Zellen einen Wert von A₅₉₀ = 5,0 erreichen (d. h., logarithmische oder Stationärphapenzellen), werden sie mit mGP1-2 bei einer Infektionsmultiplizität von 10 infiziert, und es wird IPTG zugesetzt (Endkonzentration 0,5 mM). IPTG induziert die Produktion von Thioredoxin und T7-RNA-Polymerase in mGP^-2 und induziert folglich die Produktion der geklonten DNA-Polymei ase. Man läßt die Zellen weitere 2,5 Stunden unter Rühren und Belüften wachsen und erntet sie dann, Das Zellpellet wird in 1,5110% Sukrose/20 mM Tris-HCI, pH-Wert 8,0,/25 mM EDTA wieder zur Suspension gebracht und wieder gewirbelt. Abschließend wird das Zellpellet wieder in 200ml 10% Sukrose/20mMTris-HCI, pH-Wert 8,/1,OmM EDTA zur Suspension gebracht und in flüssigem N₂ gefroren. Aus 121 induzierten Zellen gewinnt man 70g Zellpaste, die etwa 700mg Gen-5-Protcin und 100mg Thinredoxin enthalten.

K38/pTrx-2 (K38, das nur pTrx-2 enthält) bringt eine Überproduktion an Thioredoxin hervor und wird als „Beschleuniger" Extrakten von K38/pGP5-5/pTrx-2 zugesetzt, um zu gewährleisten, daß Thioredoxin gegenüber Gen-5-Protein zu Beginn der Reinigung im Überschuß vorhanden ist. Die K38/pTrx-2-Zellen werden bai -80°C in 50% Glyzerol aufbewahrt. Vor der Verwendung werden sie auf eine Platte gestrichen, die 50pg/ml Ampizillin enthält, bei 37°C für die Dauer von 24 h gezogen, und eine einzige Kolonie, die über Nacht bei 37⁰C in 20ml LB-Medium, das 50mg/ml Ampizillin enthält, gezogen wurde. Die 25-ml-Kultur wird dazu genutzt, 212X LB-Medium zu inokulieren, und bei 37⁰C geschüttelt. Wenn die Zellen einen Wert von As» = 3,0 erreichen, wird das ptac-Promoter und damit die Thioredoxin-Prcduktion durch den Zusatz von IPTG (Endkonzentration 0,5 mM) induziert. Die Zellen werden unter Schütteln weitere 12 bis 16 Stunden bei 37°C gezogen, geerntet, in 600 ml 10% Sukrose/20 mM Trix-HCI, pH-Wert 8,0,/25mM EDTA wieder zur Suspension gebracht und wieder gewirbelt. Abschließend werden die Zellen in 40ml 10% Sukrose/20mM Tris-HCL, pH-Wert 8,/0,5mM EDTA wieder zur Suspension gebracht, darauf in flüssigem N₂ gefroren. Aus 21 Zellen erhält man 16g Zellpaste, die 150mg Thioredoxin enthielten. Untersuchungen auf Polymerase beinhalten die Verwendung von einsträngiger Kalbsthymus-DNA IGmM) als Substrat. Diese wird unmittelbar vor der Benutzung durch Denaturierung von doppelsträngiyer Kalbsthymus-DNA mit 50 mM NaOH bei 20°C für die Dauer von 15min, gefolgt von der Neutralisierung mit HCI, durchgeführt. Jede gereinigte DNA kann als Templat für die Polymerasebestimmung verwendet werden, sie sollte aber vorzugsweise eine Länge von mehr als 1000 Basen haben. Die angewandte T7-DNA-Polymerase-Standardbestimmung ist eino Modifikation des Verfahrens, das von Grippo u. a. (246 J.Bio!. Chem. 6867,1971) beschrieben wurde. Das Reaktionsstandardgemisch (200μΙ Endvolumen) enthält 4OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,5mM Dithiothriotol, 10OnMoI alkalidenaturierte Kalbsthymus-DNA, 0,3mM dGTP, dATP, dCTP und [³HIdTTP (20cpm/pm), 50pg/ml BSA und unterschiedliche Mengen an T7-DNA-Polymerase. Die Inkubation erfolgt bei 37°C (10°C-45°C) für die Dauer von 30min (5-60 min). Die Reaktion wird durch den Zusatz von 3ml kaltem (0°C) 1 N HCI-0.1 M Pyrophosphat beendet. Die säureunlösliche Radioaktivität wird durch das Verfahren von Hinkle u. a. (250 J. Biol. Chem. 5523, 1974) bestimmt. Die DNA wird auf Eis 15min (5min-12h) ausgefällt, dann durch Filtern auf Glasfaserfilter ausgefällt. Die Filter werden fünfmal mit 4ml kaltem (0⁰C) 0,1 M HCI-0,1 M Pyrophcsphat und zweimal mit kaltem (0⁰C) 90%igem Ethanol gewaschen. Nach dem Trocknen wird die Radioaktivität der Filter durch Verwendung eines nichtwäßrigen Szintillationsfluors gezählt. Eine Einheit Polymeraseaktivität katalysiert die Einbeziehung von 1OnMoI des Gesamtnukleotid in eine säurelösliche Form innerhalb von 30min bei 37⁰C unter den oben gegebenen Bedingungen. Natürliche T7-DNA-Polymerase und modifizierte T7-DNA-Polymerase (siehn unten) haben die gleiche spezifische Polymeraseaktivität ± 20%, die zwischen 5000 und 20000 Einheiten/mg bei natürlicher und 5000 und 50000 Einheiten/mg bei modifizierter Polymerase liegt und von der Herstellung abhängig ist, wobei die oben gegebenen Standardbestimmungsbedingungen angewendet werden. T7-DNA-Polymerase wird aus den obigen Extrakten durch Ausfällung und Chromatografiet/erfahren gereinigt. Es wird ein Beispiel für eine solche Reinigung gegeben.

Ein Extrakt der gefrorenen Zellen (200ml K38/pGP5-5/pTrx-2 und 40ml K33/pTrx-2) wird bei O⁰C über Nacht aufgetaut. Die Zellen werden kombiniert, und es werden 5ml Lysozym (15mg/ml)und 10ml NaCI (5M) zugesetzt. Nach 45min bei O⁰C werden die Zellen in ein Wasserbad von 37⁰C gegeben, bis ihre Temperatur 2O⁰C erreicht. Dann werden die Zellen in flüssigem N₂ gefroren. Es werden weitere 50ml NaCI (5M) zugesetzt, und die Zellen werden in einem Wasserbad von 37°C aufgetaut. Nach dem Auftauen werden die Zellen bei 0°C vorsichtig 6C min lang gemischt. Dan Lysat wird eine Stunde lang bei 35000 U/min in einem Beckman-Rotor 45Ti zentrifugiert. Die obenaufschwimmeiide Schicht (250ml) ist Fraktion I. Sie enthält etwa 700mg Gen-5-Protein und 250 mg Thioredoxin (ein Verhältnis von 2:1 von Thioredoxin zu Gen-5-Protein).

In Fraktion I (250 ml werden 90g Ammoniumsulfat aufgelöst und eine Stunde lang gerührt. Man läßt die Suspension sich 60 min absetzen, der resultierende Niederschlag wird durch Zentrifugieren bei 8000U/min für 60min aufgefangen. Der Niederschlag wird wieder in 300ml 2OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,/5mM 2-Merkaptoethanol/0,1 mM EDTA/10% Glyzerol (Puffer A) aufgelöst. Das ist Fraktion II.

Es wird eine Kolonne von Wahtman DE52 DFAE (12,6cm² χ 18cm) hergestellt und mit Puffer A gewaschen. Fraktion Il wird über Nacht anhand von zwei Wechseln von 11 von Puffer A jeweils dialysiert, bis die Leitfähigkeit von Fraktion Il gleich der des Puffers A ist, der 10OmM NaCI enthält. Proteine werden mit einem Gradienten von 100 bis 40OmM NaCI bei 3,51 in Puffer A und einer Durchflußmenge von 60ml/h eluiert. Die Fraktionen, die T7-DNA-Polymerase enthalten, die bei 20OmM NaCI eluiert wird, werden zusammengefaßt. Das ist Fraktion III (190ml).

Es wird eine Kolonne von Whatman P11-Phosphozellulose (12,6cm² x 12cm) hergestellt und mit 2OmM KPO₄, pH-Wert 7,4,/ 5mivi 2-Merkaptoethanol/0,1 mM EDTA/10% Glyzerol (Puffer B) gewaschen. Fraktion IM wird zweifach (380ml) mit Puffer B verdünnt, dann der Kolonne mit einer Durchflußmenge von 60ml/h zugeführt, anschließend wird sie mit 200ml Puffer B, der 10OmM KCI enthält, gewaschen. Proteine werden mit einem 1,8-l-Gradientenvon 100 bis 40OmM KCI in Puffer B bei einer Durchflußmenge von 60ml je Stunde eluiert. Fraktionen, die T7-DNA-Polymerase enthalten, welche bei 30OmM KCI eluiert, werden zusammengefaßt. Das ist Fraktion IV (370ml).

Es wird eine Kolonne von DEAE-Sephadex A-50 (4,9cm²x 15cm) hergestellt und mit 2OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,0,/0,1 mM Dithiothreitol/0,1 mM EDTA/10% Glyzerol (Puffer C) gewaschen. Fraktion IV wird anhand von zwei Änderungen von 11 Puffer C auf eine Endleitfähigkeit dialysiert, die gleich der von Puffer C, das 10OmM NaCI enthält, ist. Die dialysierte Fraktion wird der

Kolonne mit einer Durchflußmenge von 40ml/h zugeführt, und sie wird mit 150ml von Puffer C, der 10OmM NaCI enthält, gewaschen. Proteine, die mit einein 1 -I-Gradienten von 100 bis 30OmM NaCI im Puffer C bei einer Durchflußrate von 40ml/h anfallen, werden eluiert. Fraktionen, die T7-DNA-Polymeraso enthalten, die bei 21OmM NaCI eluiert, werden zusammengefaßt. Das ist Fraktion V (120ml).

Es wird eine Kolonne von BioRad HTP-Hydroxylapatit (4,9cm² χ 15cm) hergestellt und mit 2OmM KPO₄, pH-Wert 7,4,/1OmM 2-Merkaptoethanol/2mM Zitrat/10% Glyzerol (Puffer D) gewaschen. Fraktion V wird anhand von zwei Wechseln von jaweils 500ml Puffer D dialysiert. Die dialysiene Fraktion V wird der Kolonne mit einer Durchflußmenge von 30ml/h zugeführt und mit 100ml von Puffer D gewaschen. Proteine werden mit einem 900-ml-Gradienten von 0 bis 180 KPO₄, pH-Wert 7,4, in Putfer D bei einer Durchflußmenge von 30ml/h eluiert. Fraktionen, welche T7-DNA-Polymerase enthalten, die bei 5OmM KPO₄ eluiert, werden zusammengefaßt. Das ist Fraktion Vl (130ml). Sie enthält 270mg homogene T7-DNA-Polymerase. Fraktion Vl wird im Verhältnis zu 2OmM KPO₄, pH-Wert 7,4,/0,1 mM Dithiothreitol/0,1 mM EDTA/50% Glyzerol dialysiert. Das ist die konzentrierte Fraktion Vl (~ 65ml, 4mg/ml), sie wird bei -20"C aufbewahrt.

Mit der isolierten T7-Polymerase ist Exonukleaseaktivität assoziiert. Wie oben ausgeführt wurde, muß diese inaktiviert werden. Es wird ein Beispiel für die Inaktivierung durch chemische Modifikation gegeben.

Die konzentrierte Fraktion Vl wird rher Nacht anhand von 2OmM KPO₄, pH-Wert 7,4,/0,1 mM Dithiothreitol/10% Glyzerol dialysiert, um die im Lagerungspurrer vorhandene EDTA zu entfernen. Nach dt, Dialyse wird die Konzentration auf 2 mg/ml abgestimmt, wozu 2OmM KPO₄, pH-Wert 7.4,/0,1 mM Dithiothreitol/10% Glyzerol eingesetzt wird, und Aliquote zu 30 ml (2 mg/ ml) werden in 50-ml-Polypropylenröhren gegeben (Bei 2 mg/ml beträgt die Moi!<onzentration von T7-DNA-Polymerase 22 μΜ.) Unmittell ar vor der Verwendung werden Dithiothreitol (DTT) und Eisen(ll)-ammoniumsulfat (Fe(NH₄)₂(SO₄)₂6 H₂O) frisch zubereitet und einem 30-ml-Aliquot von T7-DNA-Polymerase bis zu einer Konzentration von 5mM DTT (0,6ml einer Vorratsmenge von 25OmM) und 20μΜ Fe (NH₄)₂(SO₄)₂6H₂O (0,6ml einer Vorratsmenge von 1 mM) zugesetzt. Während der Modifikation betragen die Molkonzentrationen von T7-DNA-Polymerase und Eisen jeweils etwa 20 μΜ, während DTT im Molüberschuß von etwa 250 vorhanden ist.

Die Modifikation erfolgt bei 0°C unter einer gesättigten Sauerstoffatmosphäre auf folgende Weise. Das Reaktionsgemisch wird in einem Exsikkator auf Eis gegeben, der Exsikkator wird durch Evakuieren mit Luft gespült und anschließend mit 100% Sauerstoff gefüllt. Dieser Zyklus wird dreimal wiederholt. Die Reaktion kann in Luft (20% Sauerstoff) ausgeführt werden, läuft dann aber mit einem Drittel der Rate ab.

Der Zeitverlauf des Wegfalls der Exonukleaseaktivität wird in der Abb. 4 gezeigt, ^.-!-markierte, doppelsträngige DNA (6cpm/ pMol) wurde aus dem Bakteriophag T7 gewonnen, wie das von Richardson beschrieben wurde (15 J. Molec. Biol.49,1966). ³H-markierte einsträngige T7-DNA-Polymerase wurde unmittelbar vor der Verwendung durch Denaturierung der doppelsträngigen ³H-markierten T7-DNA mit 5OmM NaOH bei 20°C für die Dauer von 15min, gefolgt von der Neutralisierung mit HCI, gewonnen. Die Exonukleasestandardbestimmung ist eine Modifikation des von Chase u.a. (siehe oben) beschriebenen Verfahrens. Das Standardreaktionsgemisch (100μΙ Endvolumen) enthielt 4OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,1OmM Dithiothreitol, 6OnMoI ³H-markierte einsträngigeT7-DNA(6cpm/pM) und unterschiedliche Mengen an T7-DNA-Polymerase. Als Substrat kann auch ³H-markierte doppelsträngige T7-DNA verwendet werden. Außerdem kann für die Bestimmung jede einheitlich radioaktiv markierte DNA, ein- oder doppelsträngig, verwendet werden. Für die Bestimmung kann auch 3'-endmarkierte, einsträngige oder doppelsträngige DNA verwendet werden. Nach einer Inkubation für die Dauer von 15min bei 37⁰C wird die Reaktion durch den Zusatz von 30μΙ BSA (10mg/ml) und 25μΙ TCA (100% Gew./Vol.) gestoppt. Die Bestimmung kann bei 10°C bis 45⁰C für die Dauer von 1 bis 60 min erfolgen. Die DNA wird über 15 min (1 min bis 12 h) auf Eis ausgefällt, dann bei 12000g für 3Umin (5 min bis 3 h) zentrifugiert. 100 μί der obenaufschwimmenden Schicht werden zur Bestimmung der säurelöslichen Radioaktivität benutzt, wozu sei 400μΙ Wasser und 5ml des wäßrigen Szintillationscocktails zugesetzt werden. Eine Einheit Exonukleaseaktivität katalysiert die Säurelöslichmachung von 1OnMoI des Gesamtnukleotids in 30 min unter den Bestimmungsbedingungen. Natürliche T7-DNA-Polymerase hat eine spezifische Exonukleaseaktivität von 5000 Einheiten/mg, wenn die oben angegebenen Slandardbedingungen der Analyse und Bestimmung angewendet werden. Die spezifische Exor. jkleaseaktivität des modifizierten T7-DNA-Polymerase ist vom Umfang der chemischen Modifikation abhängig, im Idealfall ist sie aber um wenigstens das 10- bis lOOfache niedriger als die der natürlichen T7-DNA-Polymerase oder um 500 bis 50 oder weniger Einheiten/mg, wenn man die oben genannten Standardbedingungen der Bestimmung anwendet. Wird mit einem doppelsträngigen Substrat gearbeitet, ist die Exonukleaseaktivität etwa um das Siebenfache höher.

Unter den aufgezeigten Bedingungen fällt die Exonukleaseaktivität exponentiell ab. wobei die Halbwertzeit des Zerfalls acht Stunden beträgt. Einmal täglich wird das Reaktionsgefäß gemischt, um den löslichen Sauerstoff zu verteilen, andernfalls verläuft die Reaktion schneller an der Oberfläche, wo die Sauerstoffkonzentration höher ist. Einmal täglich werden 2,5 mM DTT (0,3 ml eines frischen 250-mM-Vorrats zu einer Reaktion von 30ml) zugesetzt, um das oxydierte DTT zu ersetzen. Nach acht Stunden ist die Exonukleaseaktivität der T7-DNA-Polymerase auf 50% reduziert worden, während der Verlust an Polymeraseaktivität negierbar ist. Der Verlust von 50% kann das Ergebnis der vollständigen Inaktivierung der Exonukleaseaktivität der Hälfte der der Polymerase, nicht eine generelle Reduzierung der Rate der Exonuklnaseaktivität in allen Molekülen sein. So haben nach einer Reaktionszeit von acht Stunden alle Molekül? eine normale Polymeraseaktivität, die Hälfte der Moleküle hat eine normale Exonukleaseaktivität, während die andere Hälfte < 0,1 % der ursprünglichen Exonukleaseaktivität hat.

Wenn 50% der Moleküle modifiziert sind (eine Reaktion von acht Stunden), ist das Enzym, wenn auch suboptimal, für die DNA-Folgebildung geeignet. Um eine optimalere Qualität der DNA-Folgebildung erreichen zu können, läßt man die Reaktion auf mehr als 99% Modifikation (mit weniger als 50 Einheiten Exonukleaseaktivität) weitergehen, wozu vier Tage erforderlich sind. Nach vier Tagen wird das Reaktionsgemisch anhand von zwei Wechseln von 250ml von 2OmM KPO₄, pH-Wert 7,4,/0,1 mM Dithiothreitol/0,1 mM EDTA/50% Glyzerol dialysiert, um das Eisen zu entfernen. Die modifizierte T7-DNA-Polymerase (~ 4mg/ml) wird bei -2O⁰C aufbewahrt.

Der Reaktionsmechanismus für die chemische Modifikation von T7-DNA-Polymerase ist von den reaktiven Sauerstoffspezies abhängig, die durch das Vorhandensein von reduzierten Übergangsmetallen wie Fe²⁺ und Sauerstoff erzeugt werden. Ein möglicher Reaktionsmechanismus für die Erzeugung von Hydroxylradikalen wird unten aufgeführt:

Fe^{2 f}+ O₂-> Fo³⁺+O₂ (1)

20^ + 2H⁺ -> H₂O₂ + O, (2)

Fe²⁺ + H₂O₂ -> Fe³* + OH' + OH" (3)

In der Gleichung (1, ergibt die Oxydation des reduzierton Metallions das Superoxidradikal, OJ. Das Superoxidradikal kann eine Dismutationsreaktic η durchlaufen, wodurch Wasserstoffperoxid entsteht (Gleichung 2). Schließlich kann Wasserstoffperoxid mit reduzierten Metailionen reagieren, um Hydroxyradikale, OH'. zu bilden (die Fenton-Reaktion, Gleichung 3). Das oxydierte Metallion wird durch Reduktionsmittel wie Dithiothreitol (DTT) in die reduzierte Form rückgefühit. Diese reaktiven Sauerstoffspezies inaktivieren vermutlich du^rch eine irreversible chemische Änderung von spezifischen Aminosäureresten die Proteine. Ein solcher Schaden wird bei SDS-PAGE der Fragmente von Gen 5 beobachtet, die durch CNBr oder Trypsin erzeugt werden. Einige Fragmente verschwinden, es tritt eine hochmolekulare Vernetzung ein, und einige Fragmente werden in zwei kleinere Fragmente aufgebrochen.

Wie bereits erwähnt, sind Sauerstoff, ein reduzierendes Mittel (z.B. DTT, 2-Merkaptoethanol)undein Übergangsmetall (z.B. Eisen) wesentliche Elemente der Modifikationsreaktion. Die Reaktion erfolgt in Luft, wird aber durch die Verwendung von 100% Sauerstoff auf das Dreifache stimuliert. Fehlen die zugesetzten Übergangsmetalle, erfolgt die Reaktion auf Grund des Vorhandenseins von Spurenmengen von Ütergangsmetallen (1-2μΜ) in den meisten Pufferpräparaten langsam. Wie erwartet, gehören zu den Inhibitoren der Modifikationsreaktion anaerobe Bedingungen (z. B. N,) und Metallchelatbildner (z.B. EDTA, Zitrat, Nitrilotriazetat). Außerdem können die Enzymkatalase und die Superoxiddismutase die Reaktion hemmen, was mit der wesentlichen Rolle der reaktiven Sauerstoffspezies bei der Erzeugung der modifizierten T7 DNA-Polymerase in Einklang steht.

Als Alter^ativverfahren kann man das T7-Gen 5 genetisch mutieren, um speziell den Exonukleasebereich des Proteins zu inaktivieren. Das T7-Gen5-Protein, gereinigt von solchen Mutanten, ist ideal für die Verwendung bei der DNA-Folgebildung ohne die Notweni ikeit, die Exonuklease chemisch durch Oxydation zu inaktivieren, und ohne die Sekundärschäden, die unvermeidlich während der chemischen Modifikation am Protein auftreten.

Genetisch modifizierte T7-DNA-Polymsrase kann dadurch isoliert werden, daß Gen 5 zufällig mutagenisiert wird und dann die Mutanten ausgesiebt werden, deren Exonukleaseaktivität ohne einen Verlust der Polymeraseaktivität verlorengegangen ist. Die Mutagenese wird folgendermaßen ausgeführt. Nach dem Standardverfahren wird einsträngige DNA hergestellt, die Gen 5 enthält (z. B. geklont in pEMBL-8, einem Plasmid, der einen Ursprung für einsträngige DNA-Replikation enthält), unter der Kontrolle eines T7-RNA-Polyrr.erasepromoters, und mit zwei verschiedenen chemischen Mutagentien behandelt: Hydrazin, das Cs und T's mutiert, und Methansäure, welche die G's und A's mutiert, Myers u.a., 229 Science 242,19&5. Die DNA wird bei einer Dosis mutagenisiert, welche dazu führt, daß durchschnittlich eine Base je Plasmidmolekül geändert wird. Die einsträngigen, mutagenisierten Plasmide werden dann mii einem universellen 17mer Primäre (siehe oben) angelassen und als Template zur Synthetisierung der gegenüberliegenden Stränge verwendet. Die synthetisierten Stränge enthalten zufällig einbezogene Basen in Positionen, die den mutierten Basen in den Templaten entsprechen. Die doppelsträngige, mutagenisierte DNA wird dann dazu genutzt, den Strang K38/pGP1-2 zu transformieren, wobei es sich um Strang38 handelt, der das Plasmid pGP1-2 enthält (Tabor u.a., siehe oben). Nach Wärmeinduktion bringt dieser Strang T7-RNA-Polymerase zum Ausdruck. Die transformierten Zellen werden auf Platten gebracht bei 3O⁰C, mit etwa 200 Kolonien je Platte.

Die Siebung nach Zellen mit T7-DNA-Polymerase, die keine Exonukleaseaktivität haben, bariert auf folgender Erkenntnis. Die 3'-bis 5'-Exor.uklease von DNA-Polymerasen hat eine „korrekturlesende" Funktion. Wenn Basen fehleinbezogen werden, sondert die Exonuklease die frisch einbezogene Base aus, die als „abnormal" erkannt wird. Das ist der Fall für das Analog von dATP, Etheno-dATP, das leicht anstelle von dATP durch T7-DNA-Polymerase einbezogen wird. Beim Vorhandensein von 3'- bis 5'-Exonuklease aber von T7-DNA-Polymerase wird es so schnell ausgestoßen, wie es eir.bezogen wird, so daß keine DNA-Nettosynthese auftritt. Wie in der Abb. 6 gezeigt wird, katalysiert bei der Verwendung des alternierenden Kopolymers Poly-d(AT) als Templat die natürliche T7-DNA-Polymerose eine umfangreiche DNA-Synthese nur bei Vorhandensein von dATP, nicht von Etheno-dATP. Im Gegensatz dazu bezieht modifizierte T7-DNA-Polymerase auf Grund des Fehlens von assoziierter Exonuklease Etheno-dATP stabil in die DNA mit einei dATP vergleichbaren Rate ein. Verwendet man also Poly-d(At) als Templat und dTTP und Etheno-dATP als Vorläufer, ist natürliche T7-DNA-Polymerase nicht in der Lage, aus diesem Templat DNA zu synthetisieren, während T7-DNA-Polymerase, die ihre Exonukleaseaktivität verloren hat, in der Lage ist, dieses Templat zur Synthetisierung von DNA zu verwenden.

Das Verfahren zur Spalten und Sichten einer großen Zahl von Kolonien wird in Raetz (72 Proc. Nat. Acad. Sei. 2274.. 1975) beschrieben. Kurz gesagt, die Zellen K38/dGP1-2, die mit den mutagenisierten gen 5-haltigen Plasmiden transformiert wurden, werden aus einer Petrischale übertragen, in der sie mit etwa 200 Kolonien je Platte vorhanden sind, auf ein Stück Filterpapier („Replika-Plattierung"). Dann werden die Filterpapierscheiben für die Dauer von 60min auf 42⁰C erhitzt, um die T7-RNA-Polymerase zu induzieren, die wiederum das Gen-5-Protein zur Expression bringt. Thioredoxin wird aus dem Chromosomalgen erzeugt. Dem Filterpapier wird Lysozym zugesetzt, um die Zellen zu spalten. Nach einem Gefrier-Tau-Schritt zur Gewährleistung der Zellspaltung werden die Filterpapierscheiben mit Poly-d(AT), [o.³²P]d1TP und Etheno-dATP bei 37°C für die Dauer von 60 min inkubiert. Dann werden die Filterscheiben mit Säure gewaschen, um das nichteinbezoggne [³²PJdATPP zu entfernen. Auf dem Filterpapier wird in Säure DNA ausgeschieden, während die Nukleotide löslich sind. Das gewaschene Filterpapier wird dann dazu benutzt, einen Röntgenfilm zu exponieren.

Kolonien, die eino aktive T7-DNA-Polymerase, der es an Exonuklease fehlt, induziert haben, haben säureunlösliche ³²p einbezogen und werden durch Autoradiografie sichtbar. Kolonien, die natürliche T7-DNA-Po!ymerase ausdrücken oder eine T7-DNA-Polymerase zur Expression bringen, die keine Polymeraseaktivität hat, erscheinen nicht auf dem Autradiografen. Kolonien, die positiv erscheinen, werden aus der Stamm-Petrischale gewonnen, welche die ursprünglichen Kolonien enthält. Zellen, die jedes potentielle positive Klon enthalten, werden im größeren Maßstab (1 Liter) induziert und die T7-DNA-Polymerase aus jedem Präparat gereinigt, um die Exonukleasepegel zu bestätigen, die den einzelnen Mutanten assoziiert sind. Enthalten sie einen geringen Exonukleasepegel, sind sie für die DNA-Folgebildung geeignet.

Zum Isolieren von genetischen Mutanten im Exonukleasebereich desT7-Gen-5-Proteins kann auch die gerichtete Mutagenese angewendet werden. Nachstehend wird ein Beispiel für dieses Verfahren gegeben.

T7-DNA-Polymerase mit verringerter Exonukleaseaktivität (modifizierte T7-DNA-Polymerase) kann von natürlicher '(7-DNA-Polymerase auch durch die Fähigkeit unterschieden werden, durch Bereiche mit Sekundärstruktur zu synthetisieren. So führt bei modifizierter DNA-Polymerase die DNA-Synthese von einem markierten Primär auf einem Templat mit Sekundärstruktur zu wesentlich längeren Erweiterungen, verglichen mit unmodifizierter oder natürlicher DNA-Polymerase. Diese Bestimmung bietet eine Grundlage für die Sichtung zur Umwandlung von geringen Prozentsätzen an DNA-Polymerase-Molekülen in eine modifiiiorte Form.

Die oben genannte Bestimmung wurde dazu verwendet, nach der Behandlung mit einer Reihe von chemischen Reagentien auf geänderte T7-DNA-Polymerase zu sichten. Drei Reaktionen führten zur Umwandlung des Enzyms in eine modifizierte Form. Die erste ist die Behandlung mit Eisen und einem Reduktionsmittel, wie das oben beschrieben wurde. Die anderen beiden beinhalten die Behandlung des Enzyms mit fotooxydierenden Farbstuffen, Rose Bengal und Methylen-Blau, bei Vorhandensein von Licht. Die Farbstoffe müssen sorgfältig titriert werde i, und selbst unter optimalen Bedingungen ist die Spezifizität der Inaktivierung der Exonukleaseaktivität gegenüber der Polymera.ieaktivität gering, verglichen mit der hohen Spezifizität der eiseninduzierten Oxydation. Da diese Farbstoffe ziemlich spezifisch für die Modifikation von Histidinresten sind, impliziert dieses Ergebnis stark, daß Histidinreste eine wesentliche Spezies in dei aktiven Exonuklease-Position sind.

Im 17-Gen-5-Protein gibt es 23 Histidinreste. Acht dieser Histidinreste liegen in der Amiriohälfte des Proteins, in dem Bereich, in dem auf der Grundlage der Homologie mit dem großen Fragment der E.coli-DNA-Polymerase I der Exonuklease-Bereich loziert sein kann (Ollis u.a., Nature 313,818,1984). Wie unten beschrieben wird, wurden sieben der acht Histidinreste einzeln durch Synthese entsprechender Oligonukleotide mutiert, die dann in Gen 5 einbezogen wurden. Sie entsprechen den Mutanten 1 und 6 bis 10 in Tabelle 1. Die Mutationen wurden so aufgebaut, daß zuerst T7-Gen 5 von pGP5-3 (Tabor u. a., J. Bio). Chem 282,1987) in die Stellung Smal und Hindill des Vektors M13 mp18 geklont wurden, um mPG5-2 zu ergeben. (Der verweidete Vektor und die Quelle für Gen 5 sind bei diesem Verfahren nicht von kritischer Bedeutung.) Aus einem Strang, oer Deoxyurazil anstelle von Deoxythidin einbezieht, wurde einsträngige mGP5-2-DNA hergestellt (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 82,48J, 1985). Dieses Verfahren ergibt eine starke Selektion für das Überleben nur des synthetisierten Stranges (der die Mutation enthält), wenn die Transfektion in den Wildtyp von E.coli. erfolgt, da vorzugsweise der Urazil enthaltende Strang abgebaut wird. Nach Standardverfahren wurden Mutansoligonukleotide mit einer Länge von 15 bis 20 Basen synthetisiert. Jedes Oligonukleotid wurde auf ein Templat angelassen, untor Verwendung von natürlicher T7-DNA-Polymerase erweitert und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase gebunden. Kovalent geschlossene runde Moleküle würden durch Agarose-Gel-Elektrophorese isoliert, die bei Vorhandensein von 0,5pg/ml Eiihidiumbromid ausgeführt wurde. Die resultierenden gereinigten Moleküle wurden dann zur Transformation von E. coli 71.18 verwendet. DNA aus dun resultierenden Flecken wurde isoliert und von dem relevanten Bereich wurde eine Folge gebildet, um jede Mutation zu bestätigen.

Nachstehend werden die Oligonukleotide zusammengefaßt, die zur Erzeugung von genetischen Mutanten in der Gen 5-Exonuklejse verwendet wurden. Die geschaffenen Mutationen wurden unterstrichen. Aminosäuren- und Basenpaarnummern wurden von Dunn u.a., 166 J. Molec. Biol 477,1983, entnommen. Gezeigt werden auch die relevanten Wildtypfolgen des Bereichs des mutierten Gens 5.

Wildtypfolge:

109(aa) 122 123

Leu Leu Arg Ser GyI Lys Leu Pro GIy Lys Arg Phe GIy Ser His AIa Leu GIu CTT CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGA AAA CGC TTT GGG TCT CAC GCT TTG GAG 14677 (T7bp)

Mutation 1: His 123 -> Ser 123

Verwendetes Primär: 5' CGC TTT GGA VCC TCC GCT TTG 3'

Mutansfolge: 123

Leu Leu Arg Ser GIy Lys Leu Pro GIy Lys Arg Phe GIy Ser Ser AIa Leu GIu CTT CTG- CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGA AAA CGC TTT GGA TCC TCC GCT TTG GAG

Mutation 2: Löschung von Ser 122 und His 123

Verwendetes Primär: 5' GGA AAA CGC TTT GGC GC, TTG GAG GCG 3'

6 Basen-ALöschung

Mutansfolge: GIy 123 123

Leu Leu Arg Ser GIy Lys Leu Pro GIy Lys' Arg ir'he AIa Leu GIu

CTT CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGA AAA CGC TTT GGC GCC TTG GAG

Mutation 3: Ser 122, His 123 -> AIa 122, GIu 123

Verwendetes Primär: 5' CGC TTT GGG GCT GAG GCT TTG G 3'

Mutansfolge: 122 123

Leu Leu Arg Ser GIy Lys Leu Pro GIy Lys Arg Phe GIy Ala GIu AIa Leu GIu CTT CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGA AAA CGC TTT GGG GCT GAG GCT TTG GAG

Mutation4: Lys 118,Arg 119^GIu 118,GIu 119

Verwendetes Primär: 5' 5' G CCC GGG GAA GAG TTT GGG TCT CAC GC 3'

His AIa Leu GIu CAC GCT TTG GAG

Mutansfolge:

Arg

Ser

GIy

Lys

Leu

Pro

GIy

118

119

Phe

GIy

Ser

Leu Leu

CGT

TCC

GGC

AAG

TTG

CCC

GGG

GIu

GIu

TTT

GGG

TCT

CTT CTG

GAA

GAG

Mutation 5: Art 111,Ser 112, Lys 114-GIu 111,AIa 112, GIu 114 Verwendetes Primär: 5' G GGT CTT CTG GAA GCC GGC GAG TTG CCC GG 3'

Mutansfolge:

111 112 114

Leu Leu GIu Ala GIy GIu Leu Pro GIy Lys Arg Phe GIy Ser His AIa Leu GIu

CTT CTG GAA GCC GGC GAG TTG CCC GGA AAA CGC ΤΓΤ GGG TCT CAC GCT TTG GAG

Mutation 6: His 59, His 62 -»· Ser 59, Ser 62

Verwendetes Primär: 5' ATT GTG TTC TCC AAC GGA TCC AAG TAT GAC G 3'

Wildtypfolge:

aa: 55 59 62

Leu lie VaI Pfie His Asn GIy His Lys Tyr Asp VaI

CTT ATT GTG TTC CAC AAC GGT CAC AAG TAT GAC GGT T7bp: 14515

Mutansfolge: 59 62

Leu He VaI Phe Ser Asn GIy Ser Lys Tyr Asp "al CTT ATT GTG TTC TCC AAC GGA TCC AAG TAT GAC GTT

Mutation 7: His 82 -> Ser 82

Verwendetes Primär: 5' GAG TTC TCC CTT CCT CG 3'

Wildtypfolge:

aa: 77 82

Leu Asn Arg GIu Phe His Leu Pro Arg GIu Asn

TTG AAC CGA GAG TTC CAC CTT CCT CGT GAG AAC T7bP: 14581

Mutansfolge: 82

Leu Asn Arg GIu Phe Ser Leu Pro A¹ j GIu Asn TTG AAC CGA GAG TTC TCC CTT CCT CGT GAG AAC

Mutation 8: Arg 96, His 99 -> Leu 96, Ser 99

Verwendetes Primär: 5' CGT TTG ATT TCT TCC ACC CTC 3'

Wildtypfolge:

aa: 93 96 99

VaI Leu Ser Arg Leu He His Ser Asn Leu Lys Asp Thi Asp GTG TTG TCA CGT TTG ATT CAT TCC AAC CTC AAG GAC ACC GAT

T7bp: 14629

Mutansfolge: 96 99

VaI Leu Ser Leu Leu He Ser Ser Asn Leu Lys Asp Thr Asp GTG TTG TCA CTG ZZG AAT TCT TCC AAC CTC AAG GAC ACC GAT

Mutation 9: His 190 -> Ser 190

Verwendetes Primär: 5' CT GAC AAA TCT TAC ITC CCT 3'

Wildtypfolge:

aa: 185 190

Leu Leu Ser Asp Lys His Tyr Phe Pro Pro GIu

CTA CTC TCT GAC AAA CAT TAC TTC CCT CCT GAG T7bp: 14905

Mutansfolge: 190

Leu Leu Ser Asp Lys Ser Tyr Phe Pro Pro GIu CTC CTC TCT GAC AAA TCT TAC TTC CCT CCT GAG

Mutation 10: His 218-» Ser 218

Verwendetes Primär: 5' GAC ATT GAA 9TCT CGT GCT GC 3'

Wildtypfoltie:

aa: 214 218

Va! Asp He GIu His Arg Ala AIa Trp Leu Leu

GTT GAC ATT GAA CAT CGT GCT GCA TGG CTG CTC T7bp: 14992

Mutansfolge: 218

VaI Asp He GIu Ser Arg Ala AIa Trp Leu Leu GTT GAC ATT GAA TCT CGT GCT GCA TGG CTG CTC

Mutation 11: Löschung der Aminosäuren 118 bis 123

Verwendetes Primär: 5' C GGC AAG TTG CCC GGG GCT TTG GAG GCG TGG G 3'

18 Basen-ALöschung

Wildtypfolge:

109 (aa) 118 122 123 126

Lei· Leu Arg Ser GIy Lys Leu Pro GIy Lys Ai g Pho GIy Ser His AIa Leu GIu CT~> CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGA AAA CGC TTT GGG TCT CAC GCT TTG GAG 14677 (T7bp)

Mutansfolge: 117 124

Leu Lsu Arg Ser GIy Lys Leu Pro GIy (6Aminosäuren) AIa Leu GIu

CTT CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGG (18Basen) GCT TTG GAG

Mutation 12: His 123-> GIu 123

Verwendetes Primär: 5' GGG TCT GAG GCT TTG G 3'

Mutansfolge: 123

Leu Leu Arg Ser GIy Lys Leu Po GIy Lys Arg Phe GIy Ser GIu AIa Leu GIu CTT CTG CGT TCC GCC AAG TTG CCC GGA AAA CGC TTT GGG TCT GAG GCT TTG GAG

Mutation 13: (Arg 131. Lys 136, Lys 140, Lys 144, Arg 145 -> GIu 131,GIu 136,GIu 140,GIu 144,GIu 145) Verwendetes Primär:

5' GGT TAT GAG CTC GGC GAG ATG GG GGT GAA TAC GAA GAC GAC TTT GAG GAA ATG CTT GAA G 3'

Wildtyp,olge:

129 (aa) 131 136 140 144 145

GIy Tyr Arg Leu GIy GIu Met Lys GIy GIu Tyr Lys Asp Asp Phe Lys Arg Met Leu GIu GIu GGT TAT CGC TTA TTC GAG ATG AAG GGT GAA TAC AAA GAC GAC TTT AAG CGT ATG CTT GAA G 14737 (T7 bp)

Mutansfolge:

131

Leu

GIy

GIu

Met

136

GIy

GIu

Tyr

140

Asp

Ac-

Phe

144

145

Met

Leu

GIu

GIu

129 (aa)

GIu

CTC

GGC

GAG

ATG

GIu

GGT

GAA

TAC

GIu

GAC

GAC

TTT

GIu

GIu

ATG

CTT

GAA

G

GIy Tyr

GAG

GAG

GAA

GAG

GAA

GGT TAT

14737(Tp)

Jedes Mutansgen-5-protein wurde durch Infektion des Mutansphags in K38/pGP1 -2 auf folgende Weise hergestellt. Dip Zellen wurden bei 30⁰C auf einen Wert von A₆₉₀ = 1,0 gezogen. Die Temperatur wurde für die Dauer von 30 min auf 42⁰C erhöht, um die T7-RNA-Polymerase zu induzieren. Auf 0,5 mM wurde IPTG zugesetzt, undbeimoi = 10 wurde ein Lysat jedes Phags zugegeben. Die Zellen wurden bei 37⁰C 90 min gezogen. Dann wurden die Zellen geerntet, und nach Standardverfahren für T7-Gen-5-Protein wurden Extrakte hergestellt.

Die Extrakte wurden durch Leitung über einr Photoze¹ .lose- und DEAE A-50-Kolonne leilv eise gereinigt und durch direkte Messung der Polymerase- und Exonukleaseaktivität bestimmt, wie das oben beschrieben wurde. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Zusammenfassung der Exonuklease- und Polymeraseaktivitäten von T7-Gen-5-Mutanten

Mutans Exnukleaseaktivität,% Polymeraseaktivität,%

|100]^b >90

>90 >90 >90 >90 >90 >90 >90

Wildtyp	[100]'
Mutans 1	10-25
(His123-»Ser123)
Mutans 2	0,2-0,4
(Δ Ser 122, His 123)
Mutans 3	<2
(Ser122,His123-»Ala122,Glu123)
Mutans 4	<30
(Lys 118, Arg 119-GIu 118, GIu 119)
Mutans F	>75
(Ar9 111 ?er 112, Lys 114 -> GIu 111, AIa 112, GIu 114)
Mutans 6	>75
(His 59, His 62 -> Ser 59, Ser 62)
Mutans 7	>'5
(His82->SerS2)
Mutans 8	>75
(Arg 96, His 99 -^ Leu 36, Ser 99)

Tabelle 1, fortgesetzt

Mutans txonukleaseaktivität,% Polymeraseaktivitat,%

Mutans9 >75 >90

(His190->Ser190) Mutans 10 >75 >90

(His218^Ser218) Mutans 11 <0,02 >90

(ALys118,Arg119,Phe120,

Gly121,Ser122,His123) Mutans 12 <30 >90

(His123->Glu123) Mutans 13 <30 >90

{Arg 131. Lys 136, Lys 140, Lys 144,

Arr 145-»Glu 131.GIu 136, GIu 140, GIu 144, GIu 145)

a. Die Exonukleaseaktivilät wurde an einsträngiger [³H]H-DNA gemessen. 100% Exonukleaseaktivität entspricht 5000 Einheiten/mg.

b. Die Polymeraseaktivität wurde unter Verwendung von oinsträngiger Kalbsthymus-DN A gemessen. 100% Polymeraseaktivität entspricht 8000 Einheiten/mg.

Von den sieben getesteten Histidinen hat nur eines (His 123: Mutans 1) die enzymatischen Aktivitäten, die für die modifizierte T7-DNA-Polymerase charakteristisch sind. Das T7-Gen-5-Protein wurde aus diesem Mutans unter Anwendung dor DEAE-Zellulose-, Photozellulose-, DEAE-Sephatex- und Hydroxylapatitchromatografie gereinigt. Während die Polymeraseaktivität annähernd normal war (> 90% des Wertes des natürlichen Enzyms), war die Exonukleaseaktivität auf das Vier- bis Zehnfache vermindert.

Es wurde eine Variante dieses Mutans konstruiert, bei der sowohl His 123 als auch Ser 122 gelöscht wurden. Das aus diesem Mutans gereinigte Gen-5-Protein hatte eine um das Zweihundert- bis Fünfhundertfache geringere Exonukleaseaktivität, wiederum bei Beibehaltung on > 90% der Polymeraseaktivität.

Aus diesen Daten geht stark hervor, daß His 123 auf der aktiven Seite des Exonukleasebereichs des T7-Gen-5-Proteins liegt.

Außerdem ist es wahrscheinlich, daß His 123 tatsächlich der Rest ist, der durch die Oxydation mit Eiser, Sauerstoff und einem Reduktionsmittel modifiziert wird, da gezeigt wurde, daß diese Oxydation Histidinreste in anderen Proteinen modifiziert (Levine,

J. Biol. Chem. 258; 11823,1983; und Hodgson u.a., Biochemistry 14; 5294,1975). Der Pegel der Restexonuklease in Mutans 11 ist mit den Pegeln vergleichbar, die durch chemische Modifikation erreicht werden können.

Obwohl Mutationen an His-Resten beschrieben werden, können auch Mutationen an nahegelegenen Stellen oder sogar an entfernten Stellen Mutansenzyme erzeugen, die in dieser Erfindung geeignet sind, z. B. lys und arg (Mutanten 4 und 15).

Ebenso besagt die Tatsache, daß Muia· "onen in einigen His-Resten wenig Wirkung auf die Exonukleaseakth'ität haben, nicht, daß Mutationen nahe dieser Reste die Exo: ukleaseaktivität nicht beeinflussen.

Zu den Mutationen, die besonders wirksam sind, gehören die mit Streichungen von 2 oder mehr Aminosäuren, insbesondere 6 bis 8, beispielsweise nahe dem Bereich His-123. Andere Mutationen Rollten die Exonukleaseaktivität weiter oder vollständig reduzieren.

Als Beispiel v/ird das folgende für d^;e Anwendung dieser Mutansstränge gegeben. Ein pGP5-6 (Mutation 11 )-haltiger Strang wurde mit ATCC deponiuit (siehe unten). Der Strang wird wie oben beschrieben gezogen und so induziert, wie das von Taber u.a., J. Biol. Chem. 262:16212 (1987) beschrieben wurde. Es können K38/pTrx-2-Zellen zugesetzt werden, um den Ertrag an genetisch modifizierte T7-DNA-Polymerase zu steigern.

Der oben genannte deponierte SUang enthält auch PlasniidpGPI-2, welches die T7-HNA-Polymeiase ausdrückt. Dieses Plasmid wird von Tabor u.a., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:1074,1985, beschrieben und wurde am 22. März 1985 bei ATCC deponiert und erhielt die Nr. 40175.

Es wird auf die Abb. 10 Bezug genommen. pGP5-6 schließt die folgenden Segmonte ein:

1. EcoRI-Sacl-Smal-BamHI-Polylinkerfolgevon M13mp10(21 bp).

2. T7 bp 14309 bis 16747, welches T7-Gen 5 mit den folgenden Modifikationen enthält: T7-bp 14703 wird von A auf G verändei t, wodurch eine Smal-Stelle entsteht. T7-bp 14304 bis einschließlich 14321 weiden gestrichen (18 bp).

3. Sall-Pstl-Hindill-Polylinkerfolge von M13 mpiO (15 bp).

4. pBR322-bp 29 (Hindlll-Stelle) bis pBR322-bp 375 (BamHI-Stelle).

5. T7-bp 22855 bis T7-bp 22927, welche das T7-RNA-Polyrnerase-Promoter 0 10 enthält, wobei an jedem Ende BamHI-Linker oder -Bindelemente eingefügt werden (82 bp).

6. pBR322-bp 375 (BamHI-Stelle) bis pBP322-bp 4361 (EcoRI-Stelle).

DNA-Folgebildung unter Verwendung von DNA-Polymerase des modifizierten T7-Typs DNA-Synthesereaktionen unter Verwendung von modifizierter T7-DNA-Polymerase führten zu kettenbeendeten Fragmenten von einheitlicher radioaktiver Intensität im Bereich von einigen Baser, bis zu Tausenden von Basen in der Länge. Es gibt faktisch keinen Hintorgrund auf Grund von Beendigungen an Stellen, die unabhängig von einer kettenbeendenden Agenseinbeziehung sind (d. h., an Leerstellen oder Sekundärstrukturbeeinträchtigungen).

Folgebildungsreaktionen unter Verwendung modifizierter T7-DNA-Polyme,ase bestehen aus einem Impuls und der Prägung.

Unter Impuls versteht man die Synthetisierung eines kurzen, markierten DNA-Fragmentes; unter Prägung versteht man, daß das kurze Fi agment verlängert wird, bis ein kettenbeendendes Agens einbezogen wird. Die dei. einzelnen Schritten zugrundeliegenden Überlegungen unterschieden sich von denen der herkömmlichen DNA-r olgebildungsreaktionen. Beim

Impuls wird die Reaktion für die Dauer von 0,5 bis 4 min bei Vorhandensein von hohen Werten der drei Nukleotidtriphisophate (z. B. dGTP, dCTP und dTTP) und Grenzwerten eines anderen markierten, trägerfreien Nukleotidtriphosphats, z. B. [³⁵S]-dATP, bei O⁰C bis 37⁰C inkubiert. In dieser Umgebung kann die modifizierte Polymerase ihren prozessiven Charakter nicht hervorbringen, und es wird eine Population von radioaktiven Fragmenten synthetisiert, deren Größe von einigen Basen bis zu mehreren hundert Basen reicht. Der Zweck des Impulses ist es, jedes Primär radioaktiv zu markieren, maximale Radioaktivität einzubeziehen, während mit minimalen Pegeln der radioaktiven Nukleotide gearbeitet wird. Bei diesem Beispiel verhindern zwei Bedingungen in der Impulsreaktion (niedrige Temperatur, z. B. von 0°C bis 20°C, und Grenzpegel von dATP, z. B. von 0,1 μΜ bis 1 μΜ), daß die modifizierte T7-DNA-Polymerase ihren prozessiven Charakter entfaltet. Andere wesentliche Umweltkomponenten der Mischung haben ähnliche Wirkungen, z. B. Begrenzung von mehr als einem Nukleotidtriphosphat oder Erhöhung der lonenfestigkeit der Reaktion. Wenn das Primär bereits markiert ist (z. B durch Kinnsereaktion), ist kein Impulsschritt erforderlich. In der Prägephase wird die Reaktion bei 45⁰C für i bis 30 Minuten bei Vorhandensein von hohen Pegeln (50 bis 500 μΜ) aller vier Deoxynukleosidtriphosphate und begrenzenden Pegeln (1 bis 50μΜ) von einem der vier kettenbeendenden Agentien, z. B. Didoxynukleosidtriphosphate, inkubiert, so daß die DNA-Synthese nach durchschnittlich 50 bis 600 Basen beendet ist. Der Zweck dieser Phase ist es, jedes radioaktiv markierte Primär unter den Bedingungen der prozessiven DNA-Synthese zu erweitern, wobei jede Erweiterung ausschließlich an den korrekten Stellen in vier getrennten Reaktionen unter Verwendung jedes der vier Dideoxynukl9osidtriphosphate beendet wird. Zwei Bedingungen der Prägung (hohe Temperatur, z. B. von 30°C-50°C) und hone Pegel (über 50μΜ aller vier Deoxynukleosidtriphosphate) erlauben es der modifizierten T7-DNA-Polymerase, den prozessiven Charakter für Zehntausende von Basen zu entfalten; so wird aus dem Primär-Templat immer dasselbe Polymerasemolekül synthetisiert, bis ein Dideoxynukleosid einbezogen wird. Bei einer Prägetemperatur von 45⁰C erfolgt die Synthese mit > 700 Nukleosid/s.

Folglich ist bei Folgebildungsreaktionen die Prägung in weniger als einer Sekunde abgeschlossen, ssb erhöht die Prozessivität, beispielsweise bei Verwendung von dlTP oder bei Anwendung niedriger Temperaturen oder einer hohen lonenfestigkeit oder von niedrigen Pegeln der Triphosphate während der Folgebildungsreaktion.

In DNA-Folgebildungsreaktionen mit modifizierter T7-DNA-Polymerase können entweder Ia³⁵SJdATP, (a³²P|dATP oder fluoreszent markierte Nukleotide eingesetzt werden. Befindet sich das fluoreszente Analog am Ende 5' des Primärs, ist kein Impulsschritt erforderlich.

Zwei Komponenten bestimmen die durchschnittlichen Erweiterungen der Synthesereaktionen. Erstens ist es die Zeitdauer der Impulsreaktion. Da der Impuls beim Fehlen von kettenbildenden Agentien abläuft, sind die Primärerweiterungen um so langer, je länger die Impulsrsaktionszeit ist. Bei O⁰C betragen die Polymerase-Erweiterungen durchschnittlich 10 Nukleotid/s. Zweitens ist es das Verhältnis der Deoxyribonukleosidtriphosphate zu den kettenbeendenden Agentien in der Prägereaktion. Eine modifizierte T7-ONA-Polymerase unterscheidet nicht gegen die Einbeziehung dieser Analoge, folglich beträgt die durchschnittliche Länge der Erweiterungen in der Prägung das Vierfache des Verhältnisses der Deoxynukleosidtriphosphatkonzentration zur Konzentration der kettenbeendenden Ageniien in der Prägereaktion. Um daher die durchschnittliche Größe der Erweiterungen zu verkürzen, wird die Impulszeit verkürzt, z. B. auf 30 Sekunden, und/oder das Verhältnis von kettenbeendenden Agentien zu Deoxynukleosidtriphosphatkonzentration in der Prägereaktion wird erhöht. Das kann entweder durch Anheben der Konzentration des kettenbeendenden Agens oder durch Senkung der Konzentration von Deoxynukleosidtriphosphat geschehen. Um die durchschnittliche Länge der Erweiterungen zu vergrößern, wird die Impulszeit verlängert, z. B. auf 3 bis 4 Minuten, und/oder die Konzentration des kettenbeendenden Agens in der Prägereaktion wird gesenkt (ζ.Β.νοη20μΜ8υί2μΜ).

Beispiel 2: DNA-Folgebildung unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase

Nachstehend wird ein Beispiel für ein Folgebildungsprotokoll unter Verwendung von Dideoxynukleotiden als beendendem Agens gegeben.

Es werden 9 μΙ einsträngiger M13-DNA (mGP1 -2, nach Standardverfahren hergestellt) bei einer Konzentration von 0,7 mM mit 1 μΙ eines komplementären Folgebildungs-Primärs Standard-Universal-17-mer, 0,5pMol Primär/μΙ) und 2,5μΙ 5X Anlaßpuffer (2OUmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,5OmM MgCI₂) gemischt, für .lie Dauer von 3min auf 65⁰C erhitzt und über 30min langsam auf Zimmertemperatur abgekühlt. In der Impulsreaktion werden 12,δμΙ des oben angelassenen Gemischs mit 11:! Dithiothreitol, 0,1 M, 2 μΙ der 3 dNTP (dGTP, dCTP, dTT"), jeweils 3 mM (P. L. Biochemicals, in TE) 2,5 μΙ Ia³⁵SIdATP (1500 Ci/mMol, New Er.Hand Nuclear) und 1 μΙ der modifizierten T7-DNA-Polymerase, die im Beispiel 1 beschrieben wurde, (0,4mg/ml, 2 500 Einheiten/ml, d.h., 0,4μς, 2,5 Einheiten) gemischt und nach der Wirbelbehandlung und dem Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge für die Dauer von 1 s bei O⁰C 2 min lang inkubiert. Die Inkubationszeit kann zwischen 30s und 20 min betragen, und dieTemperatür kann zwischen O⁰C und 37⁰C variieren. Längere Zeiten werden zur Bestimmung von Folgen angewendet, die vom Primär entfernt

Aliquote zu 4,5 μΙ aus der obigen Impulsreaktion werden jedem von vier Röhrchen zugesetzt, welche die Prägegemische enthalten, die auf 45⁰C vorerhitzt sind. Die vier Röhrchen, die mit G, A, T, C bezeichnet sind, enthalten jeweils Spurenmenga, .·.·„. Dideoxy- (dd-) G, -, -T oder -C 'P-L Biochemicals). Die speziellen Prägelösungen werden unten gegeben. Jedes Röhrchen enthält 1,5μΙ dATP, 1 mM, Ο,δμΙ 5X Anlaßpu*fer (20OmM Tris-HCI. pH-Wert 7,5,50mM MgCI₂) und 1 ,OuI ddNTP, 100μΜ (wobei ddNTP in den entsprechenden Röhrchen ddG, ddA, ddT oder ddC entspricht). Jede Prägereaktion wird bei 45⁰C (oder 30⁰C bis 50⁰C) für 10min inkubiert, dann werden jedem Röhrchen 6μΙ Stopplösung (90% Formamid, 1OmM EDTA, 0,1 % Xylenzyanol) zugesetzt, und das Röhrchen wird auf Eis gebracht. Die Prägezeiten können zwischen 1 und 30 Minuten liegen.

Die Folgebildungsreaktionen werden auf einem 6%igen Polyakrylamid-Standard-Folgebildungs-Gel in 7 M Harnstoff bei 30 W für die Dauer von 6 Stunden ausgeführt. Vordem Ablauf auf einem Gel werden die Reaktionen 2 min lang auf 75°C erhitzt. Das Gel wird in 10% Essigsäure, 10% Methanol fixiert, auf einem Geltrockner getrocknet und über Nacht einem Kodak-OM1-Hochkontrast-Autoradiografiefilm exponiert.

Beispiel 3: DNA-Folgebildung unter Verwendung von Grenzkonzentrationen von dNTPs

Bei diesem Beispiel wird die DNA-Folgeanalyse von mGP1-2-DNA unter Verwendung von Grenzpegeln aller vier Deoxyribonukleosidtriphosphate in der Impulsi eaktion ausgeführt. Diese Methode hat eine Reihe von Vorteilen gegenüber dem Protokoll im Beispiel 2. Erstens läuft die Impulsreaktion bis zum Abschluß, während es im vorangegangenen Protokoll notwendig war, einen Zeitablauf zu unterbrechen. Infolgedessen sind die Reaktionen leichter durchzuführen. Zweitens ist es bei dieser Methode leichter, den Umfang der Verlängerungen im Impuls zu kontrollieren und damit die Wirksamkeit der Markierung von Folgen in der Nähe des Primärs (den ersten 50 Basen) auf etwa das Zehnfache zu steigern.

Es wurden 7μΙ von 0,75mM-einsträngiger M13-DNA (mGP1-2) mit 1 μΙ des Komplement jren Folgebildungsprimärs (17-mer, 0,5pMol Primär/μΙΙ und 2 μΙ 5X Anlaßpuffer (20OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,50 mM MgCI₂,25OmM NaCI) gemischt, bei 65⁰C 2 min lang erhitzt und dber 30min langsam auf Zimmertemperatur abgekühlt. In der Impulsreaktion wurden 10μΙ des oben genannton angelassenen Gemischs mit 1 μΙ Dithiothreitol,0,1 M, 2μ· von 3dNTPs (dGTP, dCTP, dTTP), jeweils 1,5μΜ,0,5μΙ [a³⁵s]dATP, (α10μΜ) (etwa ΙΟμητι, 1500Ci/mMol, New England Nuclear) und 2μΙ modifizierter T7-DNA-Polymerase (0,1 mg/ml, 1000 Einheiten/ml, d. h., 0,2 μg, 2 Einheiten) gemischt und bei 37⁰C für 5 min inkubiert. (Inkubationstemperatur und -zeit können von 20⁰C bis 45°C und von 1 bis 60min variiert werden).

Es wurden Aliquote zu 3,5 μΙ der oben genannten Impulareaktion in jedes von vier Röhrchen gegeben, welch j die Prägemischungen enthielten, die auf 37⁰C vorgewärmt waren. Die vier Röhrchen, die mit G, A, T und C gekennzeichnet waren, enthielten jeweils Spurenmengen des Dideoxy-G, -A, -T, -C. Die speziellen Prägelösungen werden unten gegeben. Jedes Röhrchen enthält Ο,δμΙ 5X Anlaßpuffer (20OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,5OmM MgCI₂,25OmM NaCI), 1 μΙ der 4dNTPs (dTTP, dGTP, dCTP), jeweils 200μΜ, und 1,0μΙ ddNTP, 20μΜ. Jede Prägereaktion wird bei 37°C 5min lang inkubiert (oder 20°C-45°C bzw. 1 bis 60 min), und dann warden jedem Röhrchen 4 μΙ einer Stopplösung (95% Formamid, 20 mMEDTA, 0,05% Xylen-Zyanol) zugesetzt, und das Röhrchen wird vor dem Durchlauf auf einem Polyakrylamid-Folgebildungsstandard-Gel, wie das eben beschrieben wurde, auf Eis gebracht.

Beispiel 4: Ersatz von dGTP durch dlTP zur DNA-Folgebildung

Um eine Folgebildung durch Bereiche mit Kompression in der DNA hindurch durchführen zu können, d. h., Bereiche mit einer kompakten Sekundärstruktur, ist es üblich, dlTP (Mills u. a., 76 Proc. Natl. Acad. Sei. 2232,1979) oder Deazagunaosintriphosphat (Deaza-GTP, Mizusawa u. a., 14 Nuc. Acid Res. 1319,1986) zu verwenden. Es wurde festgestellt, daß beide Analoge bei Polymerasen des Typs T7 gut wirksam sind, insbesondere bei Vorhandensein von ssb, wenn es sich um dlTP handelt. Diese Reaktionen werden vorzugsweise mit der oben beschriebenen genetisch modifizierten T7-Polymerase ausgeführt, oder die Prägereaktion dauert 1 bh> 2 Minuten und/oder wird bei 2O⁰C ausgeführt, um den Exonukleaseabbau zu verringern. Modifizierte T7-DNA-Polymerase nutzt wirksam dlTP oder Deaza-GTP anstelle von dGTP. dlTP wird sowohl in der Impuls- als auch in der Prägemischung bei einer Konzentration für dGTP eingesetzt, die das Zwei- bis Fünffache der entspricht, bei der dGTP verwendet wird. In der ddG-Prägemischung wird weiterhin ddGTP (nicht ddlTP) verwendet.

Die Prägereaktionen unter Verwendung von dlTP reagieren empfindlich auf niedrige Restpegel (etwa 0,01 Einheiten) von Exonukleaseaktivität. Um dieses Problem zu vermeiden, sollten die Prägereaktionszeiten 5min nicht überschreiten, wenn mit dlTP gearbeitet wird. Es wird empfohlen, die vier dlTP-Reaktionen in Verbindung mit, nicht unter Ausschluß der vier Reaktionen unter Verwendung von dGTP auszuführen. Wenn sowohl dGTP als auch dlTP routinemäßig genutzt werden, kann die Anzahl der erforderlichen Mischungen dadurch reduziert werden, daß (1) dGTP und dlTP aus den Prägemischungen herausgelassen werden, was bedeutet, daß die vier Prägemischungen sowohl für dGTP- als auch für dlTP-Prägereaktionen verwendet werden können: (2) eine hohe Konzentration von dGTP oder dlTP (2μΙ bei 0,5mM bzw. 1-2,5mM) der entsprechenden Impulsmischung zugesetzt wird. Die Impulsmischungen enthalten dann jeweils eine niedrige Konzentration an dCTP, dTTP und Ia³⁵SIdATP und eine hohe Konzentration an dGTP oder dlTP. Diese Modifikation beeinflußt in der Regel die Qualität der Folgebildungsreaktionen nicht ungünstig und verringert die erforderliche Zahl der Impuls- und Prägemischungen, um Reaktionen unter Verwendung von dGTP und dlTP durchführen zu können, auf sechs.

Die Folgebildungsreaktion ist die gleiche wie im Beispiel 3, mit der Ausnahme, daß die Impulsmischungen in zwei Fällen a) 3dNTP-Mischung für dGTP:1,5pM dCTP, dTTP und 1 mM dGTP und b) 3 dNTP-Mischung für αΙΤΡ:1,5μΜ dCTP, dTTP und 2mM dlTP enthalten. Bei der Prägereaktien wird dGTP aus den Prägemischungen entfernt (d. h., die Prägemischungen enthalten 30 μΜ dATP, dTTP und dCTP und eines der vier Dideoxynukleotide bei 8μΜ) und die Prägezeit übersteigt bei der Verwendung von dlTP nicht 5 Minuten.

Deponierungen

Die Stränge K38/pGP5-5/pTrx-.?, K38/pTRx-2 und M13 mGP1-2 wurden beim ATCC deponiert und erhielten die Nummern 67287,67286 bzw. 40303. Diese Deponierungen erfolgten am 13. Januar 1987. Strang K38/pGP1-2/pGP5-6 wurde am 4. Dezember 1987 beim ATCC deponiert und erhielt die Nummer 67571.

Die Patentanmelder sind sich ihrer Verantwortung dafür bewußt, diese Kulturen ersetzen zu müssen, sollten sie vor Ablauf der Patentgewährung dafür, 5 Jahre nach der letzten Anforderungen einer Kultur oder 30 Jahren absterben, wobei der jeweils längste Zeitraum gilt, und sie sind sich auch ihrer Verantwortung dafür bewußt, das Depot über die Erteilung eines solchen Patentes zu informieren, zu welchem Zeitpunkt die Deponierungen der Öffentlichkeit unwiderruflich zugänglich gemacht werden. Bis zu diesem Zeitpunkt sind die Deponierungen nach den Bestimmungen von 37 CFR, Abschnitt 1-14, und 35 USC, Abschnitt 112, unwiderruflich dem Leiter des Patentamtes zugänglich.

Andere Ausführungsbeispiele

Zu anderen Anwendungen der modifizierten DNA-Polymerasen dieser Erfindung, bei denen ihre Prozessivität und das Fehlen der Exonukleaseaktivität genutzt werden, gehören die direkte enzymatische Erweiterung von genomischen DNA-Folgen. Das wurde für andere Polymerasen von Saiki u.a., 230 Science 1350,1985; und Scharf, 233 Science 1076,1986, beschrieben.

Es wird auf die Abb. 6 Bezug genommen. Die enzymatische Erweiterung eines speziellen DNA-Bereiches beinhaltet die Verwendung von zwei Primären, welche gegenüberliegende Stränge einer doppelsträngigen DNA-Folge im interessierenden Bereich anlassen, wobei die 3'-Enden gegeneinander gerichtet sind (siehe dunkle Pfeile). Das eigentliche Verfahren beinhaltet mehrere (10-40, vorzugsweise 16-20) Zyklen von Denaturierung, Anlassen und DNA-Synthese. Bei Anwendung dieses Verfahrens ist es möglich, einen speziellen Bereich der menschlichen genomischen DNA mehr als 20000Ofach zu verstärken. Als Folge davon stellt das spezielle Gen-Fragment etwa ein Teil von fünf, statt vorher ein Teil von einer Million dar. Das erleichtert sowohl das Klonen als auch die direkte Analyse der genomischen DNA sehr. Für Diagnosezwecke kann dadurch die Analyse von mehreren Wochen auch 1 bis 2 Tage verkürzt werden.

Im Gegensatz zum Klenow-Fragment, bei dem die Erweiterung oder Verstärkung auf Fragmente mit einer Länge von weniger als 200 Basen beschränkt ist, sollten modifizierte DNA-Po!ymeraspn den Typs T7 (vorzugsweise in Verbindung mit E. coli-DNA-Bindeprotein oder ssb zur Verhinderung einer „rückschnappenden" Bildung von einsträngiger DNA) die Erweiterung von DNA-Fragmenten mit einer Länge von Tausenden Basen ermöglichen.

Die modifizierten DNA-Polymerasen des Typs T7 sind auch in Standard-Reaktionsgemischen geeignet: zum a) Füllen der vorstehenden 5'-Termini von DNA-Fragmenten, die durch Restriktionsenzymspaltung erzeugt wurden; um beispielsweise stumpfendige doppelsträngige DNA aus einem linearen DNA-Molekül mit einem einsträngigen Bereich ohne vorstehende 3'-Termini herzustellen; b) Markieren der 3'-Termini von Restriktionsfragmenten, zum Mappieren von mRNA-Startstellen durch SI-Nukleaseanalyse oder DNA-Folgebilden unter Anwendung das chemischen Modifikstionsverfahrens von Maxam und Gilbert und c) zur In-vitro Mutagdenese von geklonten DNA-Fragmenten. Beispielsweise wird ein chemisch synthetisiertes Primär, welches spezielle fehlangepaßte Basen enthält, auf ein DNA-Templat hybridisiert und dann durch modifizierte T7-DNA-Polymerase erweitert. Auf diese Weise wird die Mutation permanent in den synthetisierten Strang einbezogen. Für die Polymerase ist es vorteilhaft, vom Primär über die gesamte Länge der DNA zu synthetisieren. Das geschieht am wirksamsten durch eine prozessive DNA-Polymerase. Alternativ dazu erfolgt die Mutagenese durch Fehleinbsziehung während der DNA-Synthese (siehe oben). Diese Anwendung dient dazu, spezielle Bereiche von geklonten DNA-Fragmenten zu mutagenisieren. Es ist wichtig, daß das verwendete Enzym keine Exonukleaseaktivität hat. Unter einem Standard-Reaktionsgemisch versteht man eine mit Puffer versehene Lösung, welche die Polymerase und alle notwendigen Deoxynukleoside oder anderen Verbindungen enthält.

Claims (31)

1. Verfahren zur Bestimmung der Nuklcotidbasenfolge eines DNA-Moleküls, gekennzeichnet durch Anlassen des DNA-Moleküls mit einem Primär-Molekül, das an das DNA-Molekül hybridisieren kann; Inkubation getrennter Abschnitte des angelassener. Gemischs in mindestens vier Behältern, wobei jeder Behälter vier verschiedene Deoxynukleosidtriphosphate, eine prozessive DNA-Polymerase, worin die Polymerase an das DNA-Molekül für wenigstens 500 Basen gebunden bleibt, bevor "ie Dissoziation in einer Umgebung erfolgt, wie sie normalerweise bei der Erweiterungsreaktion einer DNA-Folgebildunc-reaktion angewendet wird, und worin die Polymerase weniger als 500 Einheiten Exonukleaseaktivität je mg der Polymerase hat, und eines von vier die DNA-Synthese beendenden Agentien enthält, welche die DNA-Synthese an einer speziellen Nukleotidbase beendet, wobei jedes der Agentien die DNA-Synthese an einer unterschiedlichen Nukleotidbase beendet, und Trennung der DNA-Produkte aus jeder Inkubationsreaktion nach der Größe, wodurch wenigstens ein Teil der Nukleotidbasenfolge des DNA-Moleküls bestimmt werden kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase vor dem Dissoziieren für wenigstens 500 Basen an das DNA-Molekül gebunden bleibt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase vor dem Dissoziieren für wenigstens 1000 Basen an das DNA-Molekül gebunden bleibt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase in Zellen ist, die mit einem Phag vom Typ 7 infiziert sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Phag vom Typ 7 T7, T3, II, III, H, W31, gh-1, Y A1122 oder SP6 ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase nicht nach Dideoxynukleotidanalogen unterscheidet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase eine modifizierte Polymerase mit weniger als 50 Einheiten Exonukleaseaktivität je Milligramm Polymerase ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet., daß die modifizierte Polymerase weniger als eine Einheit Exonukleaseaktivität je Milligramm Polymerase hat.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierte Polymerase weniger &ls 0,1 Einheit Exonukieaseaktivität je Milligramm Polymerase hat.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase keine feststellbare Exonukleaseaktivität hat.

11. Verfahren nach Anspruch Ί, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase Primäre von 10 Basenpaaren oder mehr nutzen kann.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase Primäre von 4 Basenpaaren oder mehr nutzen kann.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Primär 4 bis 20 Basenpaare aufweist und die Polymerase Primäre von 4 bis 20 Basenpaaren nutzen kann.

14. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase nicht nach Nukleotidanalogen unterscheidet und eine modifizierte Polymerase mit weniger als 500 Einheiten Exonukleaseaktivität je Milligramm Polymerase ist, das Primär einsträngige RNA oder DNA mit 4 bis 10 Basen ist und die Polymerase Primäre von.4 bis 10 Basen nutzen kann und die Inkubation aus einem Impuls- und einem Prägeschritt besteht.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Primär einstrangige DNA oder RNA ist.

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Anlassen aus dem Erhitzen des DNA-Moleküls und des Primärs auf über 65°C und dem Abkühlenlassen des erhitzten Gemischs auf O⁰C bis 3O⁰C besteht.

17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation aus einem Impuls- und einem Prägeschritt besteht.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der !mpulsschritt besteht aus dem Mischen des angelassenen Gemisches mit allen vier Deoxynukleosidtriphosphaten und einer prozessiven DNA-Polymerase, wobei wenigstens eines der Deoxynukleosidtriphosphate gekennzeichnet und in einer Grenzkonzentration vorhanden ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation während des Impulsschrittes für die Dauer von 30 Sekunden bis zu 20 Minuten ausgeführt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Prägeschrif besteht aus dem Zusatz eine kettenbeendenden Ageno zu vier getrennten Aliquoten des Gemi chs, nachdem der Impulsschritt ausgeführt wurde.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation während des Prägeschrittes für die Dauer von einer bis zu 60 Minuten ausgeführt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeicnnet, daß das beendende Agens ein Dideoxynukleotid ist.

23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das beendende Agens ein Grenzpegel eines Deoxynukleosidtriphosphats ist.

24. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eines der Deoxynukletriphosphate zwischen dITP oder Deazaguanosin ausgewählt wird.

25. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Primär vor dem Anlaßschritt markiert wird.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkubieren einen Prägeschritt einschließt.

27. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Primär fluoreozent markiert wird.

28. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch T7-Gen 2,5 oder Gen 4 verschlüsselte Protein enthält.

29. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch T7-Gen 2,5 oder Gen 4 verschlüsselte Protein enthält.

30. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase ihre Prozessivität nicht unter einer zweiten Umweltbedingung entfalten kann, wie sie normalerweise bei der Impulsreaktion einer DNA-Folgebildungsreaktion angewendet wird.

31. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Phag vom Typ T7 T-7 ist.