DE69826458T2

DE69826458T2 - Verfahren zum sequenzierung von dna

Info

Publication number: DE69826458T2
Application number: DE69826458T
Authority: DE
Inventors: Yoshihide Tsukuba-shi Hayashizaki
Original assignee: Institute Of Physical & Chemical Research Wako; Nippon GeneTech Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Institute Of Physical & Chemical Research Wako; Nippon GeneTech Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1997-07-07
Filing date: 1998-07-06
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2018-07-07
Also published as: DE69826458D1; EP0978569B1; JPH1175898A; EP0978569A4; CA2264967C; WO1999002729A1; US6365350B1; KR100551344B1; JP3318579B2; KR20000068502A; EP0978569A1; CA2264967A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung von DNA-Sequenzen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Bestimmung von DNA-Sequenzen unter Verwendung mutanter RNA-Polymerasen. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Bestimmung von DNA-Sequenzen unter Verwendung neuartiger 3'-Desoxyribonucleotid-Derivate als fluoreszenzmarkierte Terminatoren. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Bestimmung von DNA-Sequenzen, wobei die Nucleinsäure-Transkriptionsreaktion in Gegenwart von anorganischer Pyrophosphatase durchgeführt wird.
Technischer Hintergrund
Das Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein ausgezeichnetes Verfahren, und seine Nutzung hat Jahr für Jahr zugenommen [Randall K. Saiki et al. (1988) Science 239, 487–491]. Mit dem PCR-Verfahren kann selbst ein einziges Molekül eines DNA-Fragments amplifiziert werden. Auch das Verfahren zur Sequenzierung PCR-amplifizierter Produkte ohne Klonierung derselben (direktes Sequenzierungsverfahren) ist ein brauchbares Verfahren [Corinne Wong et al. (1988) Nature, 330, 384–386]. Bei dieser Technik ist die Erstellung von Bibliotheken und ein Screening solcher Bibliotheken nicht erforderlich, und es ist ein schnelles Verfahren, mit dem Sequenz-Informationen vieler Proben gleichzeitig erhalten werden können.
Allerdings bestehen bei dem obigen direkten Sequenzierungsverfahren zwei größere Probleme.
Ein Problem ist, daß nicht eingebaute Primer und 2'-Desoxyribonucleosid-5'-triphosphate (2'-dNTPs) im Reaktionssystem verbleiben, und diese verbleibenden Substanzen hemmen die Sequenzierungsreaktionen. Bei herkömmlichen Verfahren müssen daher solche Primer und 2'-dNTPs vor der Sequenzierung von den PCR-Produkten abgetrennt werden. Es gibt viele Methoden zur Reinigung von PCR-Produkten, und zu den Beispielen dafür zählen die Reinigung durch Elektrophorese, Ethanol-Fällung, Gelfiltration und HPLC-Reinigung [siehe zum Beispiel Dorit R. L. et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 11, John Wiley and Sons, New York, 15.2.1–15.2.11]. Diese Verfahren sind jedoch ausnahmslos kompliziert.
Das zweite Problem ist die schnelle Renaturierung von PCR-Produkten. Werden die PCR-Produkte zu einer doppelsträngigen DNA renaturiert, sind sie keine einzelsträngigen Matrizen mehr, und das Annealing zwischen Primern und einzelsträngigen Matrizen ist gehemmt. Quenching nach der Denaturierung, Biotinylierung eines Primers und Absorption der PCR-Produkte auf Streptavidin-beschichteten Gegenständen, Einsatz von Exonuclease, asymmetrischer PCR und dergleichen wurden als Methoden zur Minimierung der Renaturierung berichtet. Siehe zum Beispiel Barbara Bachmann et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 1309 f. Die meisten dieser Methoden sind jedoch zeitraubend und sehr mühsam.
Zur Lösung dieser Probleme haben die bei der vorliegenden Erfindung tätigen Erfinder ein vollkommen neuartiges Verfahren zur Bestimmung von DNA-Nucleotidsequenzen vorgeschlagen, bei dem die im PCR-Reaktionssystem verbleibenden unumgesetzten Primer und 2'-Desoxyribonucleosid-5'-triphosphate (2'-dNTPs) nicht abgetrennt werden müssen und eine Denaturierung überhaupt nicht erforderlich ist. Mit diesem Verfahren läßt sich das Problem der schnellen Renaturierung von PCR-Reaktionsprodukten beseitigen [WO 96/14434]. Dieses Verfahren ist ein direktes Transkriptionssequenzierungsverfahren unter Verwendung einer RNA-Polymerase wie etwa T7-RNA-Polymerase und eines Terminators für die RNA-Transkriptionsreaktion (zum Beispiel 3'-Desoxyribonucleosid-5'- triphosphate, 3'-dNTPs). Gemäß diesem Verfahren können Nucleotidsequenzen von DNA-Produkten, die mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert wurden, so wie sie sind zur Sequenzierung verwendet werden, ohne die Primer und 2'-Desoxyribonucleosid-5'-triphosphate (2'-dNTPs) abzutrennen. Da es einer Denaturierung selbst überhaupt nicht bedarf, kann es zudem das Problem der schnellen Renaturierung von PCR-Produkten vermeiden und ist demnach ein ausgezeichnetes Verfahren.
Die bei der vorliegenden Erfindung tätigen Erfinder untersuchten jedoch das obige Verfahren und fanden heraus, daß ein Problem besteht, das noch zu lösen bleibt, um zu genaueren Nucleotidsequenzdaten zu kommen.
Bei dem obigen Verfahren zur Bestimmung von Nucleotidsequenzen wird eine RNA-Polymerase wie etwa T7-RNA-Polymerase für die Reaktion in einer Mischung eingesetzt, umfassend Ribonucleosid-5'-triphosphate, darunter ATP, GTP, CTP, UTP und Derivate derselben, und wenigstens ein 3'-Desoxyribonucleotid wie z. B. 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP, 3'-dUTP und Derivate derselben. Bei dieser Reaktion werden Polyribonucleotide synthetisiert durch aufeinanderfolgenden Einbau von Ribonucleotiden und Desoxyribonucleotiden in eine Ribonucleotid-Sequenz in einer Weise, die der Sequenz der Matrizen entspricht.
Es wurde jedoch gefunden, daß es unwahrscheinlich ist, daß 3'-Desoxyribonucleotide und Derivate derselben eher in die Sequenz eingebaut werden als die entsprechenden Ribonucleotide, und das Auftreten dieses Einbaus kann auch je nach der Basen-Gruppe, die das jeweilige Nucleotid aufweist, bei den Ribonucleotiden und 3'-Desoxyribonucleotiden variieren. Ein solcher beeinflußter Einbau zwischen Ribonucleotiden und 3'-Desoxyribonucleotiden sowie unter Ribonucleotiden mit verschiedenen Basen-Gruppen und unter Desoxyribonucleotiden mit verschiedenen Basen-Gruppen kann zu kurzen Transkriptionsprodukten und Schwankungen der Signale von markierten Ribonucleotiden führen. Daher ist es schwierig, präzise Sequenzdaten zu erhalten, obwohl Transkriptionsprodukte erhalten werden können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung von DNA-Sequenzen, bei dem eine RNA-Polymerase verwendet wird, die Einbaufähigkeit ohne oder mit nur geringer Beeinflussung durch die Unterschiede bei den Nucleotiden aufweist, und das ein Transkriptionsprodukt einer langen Kette erzeugen kann und genauere Sequenzdaten liefert, wobei die Schwankungen der Signale von markierten Desoxyribonucleotiden verringert werden.
Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die Aminosäurereste mit Hilfe der üblicherweise verwendeten Einbuchstabencodes dargestellt. Zur Klarheit seien diese im einzelnen nur für diejenigen in diesem Text erscheinenden Aminosäuren wie folgt erwähnt: Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Prolin (P), Leucin (L) und Histidin (H). Eine Ziffer bei den Codes ist eine Zahl, die vom N-terminalen Ende der Polymerase her gezählt wird. Zum Beispiel bedeutet "F667", daß der 667. Aminosäurerest dieser Polymerase F ist, und "F667Y" bedeutet, daß das F des 667. Rests durch Y ersetzt wurde.
Im übrigen ist auch von DNA-Polymerasen bekannt, daß sie beeinflußten Einbau aufgrund des Unterschieds bei einer Basen-Gruppe des jeweiligen Nucleotids zeigen, und es sind auch mutante DNA-Polymerasen bekannt, die keinen solchen beeinflußten Einbau aufweisen [japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. (Hei) 8-205874/1996; und Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6339–6345, (1995)].
In der obengenannten Literatur ist dies wie folgt beschrieben. Bei der Sequenzierungsreaktion unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase trägt die 526. Aminosäure in der Polymerase zu einem Ausgleich beim Nucleotid-Einbau bei, und aufgrund der Homologie zwischen T7-DNA-Polymerase und anderen DNA-Polymerasen kann die Beeinflussung des Einbaus der anderen DNA-Polymerasen verringert werden, indem ein Aminosäurerest ersetzt wird, der in ihrer Region vorhanden ist, die homolog ist zu der die 526. Aminosäure enthal tenden Region in der T7-DNA-Polymerase. Das heißt, Y (Tyrosin) 526 von T7-DNA-Polymerase führt zu einer verringerten Beeinflussung der Wirksamkeit beim Einbau von 2'-dNTPs und 2',3'-ddNTPs. F (Phenylalanin) 762 von E. coli-DNA-Polymerase I und F (Phenylalanin) 667 von Thermus aquaticus-DNA-Polymerase (normalerweise als Taq-DNA-Polymerase bezeichnet) sind die Aminosäurereste, die Y526 von T7-DNA-Polymerase entsprechen, und die Beeinflussung dieser Polymerasen läßt sich verringern, indem diese Reste durch F762Y (Tyrosin) bzw. F667Y (Tyrosin) ersetzt werden.
Des weiteren ist auch beschrieben, daß man daran dachte, daß durch Abwandlung einer Region von T7-RNA-Polymerase, die der bei den DNA-Polymerasen erörterten Region entspricht, d. h., die Reste 631–640, deren Spezifität für dNTPs verändert werden könnte.
Allerdings wurden RNA-Polymerasen bislang nicht für Sequenzierungsverfahren eingesetzt, und daher war die unterschiedliche Wirksamkeit des Ribonucleotid-Einbaus selbst nicht zu einem Problem geworden. Unter diesen Umständen waren etwaige mutante RNA-Polymerasen ohne den beeinflußten Einbau natürlich nicht bekannt. Tatsächlich sind in der obengenannten japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. (Hei) 8-205874/1996 auch keine speziellen Beispiele für eine Abwandlung von T7-RNA-Polymerase angeführt.
Man geht davon aus, daß die vorstehend erwähnte Region von T7-RNA-Polymerase der Region entspricht, die aus 9–10 Aminosäureresten zwischen den Aminosäuren K und YG in dem in Protein Engineering, 3, 461–467, 1990, erwähnten Motiv B besteht, die insbesondere in DNA-Polymerase α und I und DNA-abhängigen RNA-Polymerasen konserviert ist (T7-RNA-Polymerase wird zu diesen Polymerasen gerechnet). F (Phenylalanin), der Aminosäurerest 762 in E. coli-DNA-Polymerase und der Aminosäurerest 667 in Taq-DNA-Polymerase, die vorstehend für DNA-Polymerasen erörtert wurden, werden in vielen als Typ I eingestuften DNA-Polymerasen beobachtet. Es wurde jedoch überraschend gefunden, daß T7-RNA-Polymerase kein F (Phenylalanin) in den Resten 631–640 aufweist, die der obengenannten Region entsprechen, obwohl T7-RNA-Polymerase in hohem Maße zu DNA-Polymerasen homolog ist. Die Lehren der vorstehend erwähnten Literatur konnten daher nicht wie beschrieben verwirklicht werden.
Des weiteren versuchten die bei der vorliegenden Erfindung tätigen Erfinder eine Abwandlung der Aminosäuren von T7-RNA-Polymerase in der Region, die der Helix O-Finger-Subdomäne von E. coli-DNA-Polymerase I entspricht, in der F762 von E. coli-DNA-Polymerase I vorhanden ist. F (Phenylalanin) wurde jedoch auch nicht in der Helix Z in T7-RNA-Polymerase gefunden, wie aus der räumlichen Struktur hervorgeht, die von Sousa et al. in der Literatur angegeben ist (Nature, 364, 593–599, 1993) und die der Helix O von E. coli-DNA-Polymerase I entspricht.
Unter diesen Umständen suchten die bei der vorliegenden Erfindung tätigen Erfinder ursprünglich nach einer neuartigen RNA-Polymerase, um so eine RNA-Polymerase bereitzustellen, die wenig oder keine Beeinflussung der Einbaufähigkeit aufgrund der Art der Ribonucleotide und 3'-Desoxyribonucleotide zeigt. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von DNA-Sequenzen wurde daher auf der Grundlage des Befundes verwirklicht, daß eine RNA-Polymerase mit erhöhter Fähigkeit zum Einbau von 3'-Desoxyribonucleotiden und Derivaten derselben durch teilweises Abwandeln der Aminosäuren in einer Wildtyp-RNA-Polymerase erhalten werden kann.
Aus der folgenden Beschreibung wird ersichtlich, daß die RNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung oder insbesondere der Ort der Aminosäure-Abwandlung derselben in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. (Hei) 8-205874/1996 in keiner Weise vorgeschlagen noch gelehrt wird, und diese Befunde wurden erstmals von den bei der vorliegenden Erfindung tätigen Erfindern festgestellt.
Aufgrund der Untersuchungen der bei der vorliegenden Erfindung tätigen Erfinder wurde gefunden, daß die Beeinflussung des Einbaus von Ribonucleotiden durch Verwendung einer mutanten RNA-Polymerase zu einem gewissem Ausmaß beseitigt werden kann, doch bleibt die Beeinflussung des Einbaus zu einem gewissem Ausmaß bestehen, wenn ein fluoreszenzmarkiertes 3'-Desoxyribonucleotid als Terminator für eine Nucleinsäure-Verlängerungsreaktion verwendet wird.
Vom Gesichtspunkt, zu einem praktisch besser brauchbaren Verfahren zu kommen, ist daher eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem sich die Beeinflussung des Einbaus beseitigen läßt und Nucleotidsequenzen genauer bestimmt werden können, auch wenn ein fluoreszenzmarkiertes 3'-Desoxyribonucleotid verwendet wird.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von DNA-Nucleotidsequenzen, umfassend die Umsetzung von Ribonucleosid-5'-triphosphaten, darunter ATP, GTP, CTP und UTP oder Derivate derselben, mit einer oder mehreren Arten von 3'-Desoxyribonucleosid-5'-triphosphaten, darunter 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP, 3'-dUTP und Derivate derselben (im folgenden als 3'-dNTP-Derivate bezeichnet), in Gegenwart einer RNA-Polymerase und eines DNA-Fragments, das eine Promotorsequenz für die RNA-Polymerase enthält, um ein Nucleinsäure-Transkriptionsprodukt zu ergeben, Abtrennung des resultierenden Nucleinsäure-Transkriptionsprodukts und Bestimmung einer Nucleinsäuresequenz aus der resultierenden abgetrennten Fraktion, wobei die RNA-Polymerase eine mutante RNA-Polymerase ist, bei der wenigstens eine der Aminosäuren in der Wildtyp-RNA-Polymerase durch Tyrosin ersetzt ist, um so deren Fähigkeit zum Einbau der 3'-dNTP-Derivate im Vergleich zur entsprechenden Wildtyp-RNA-Polymerase zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren das vorstehend erwähnte Verfahren zur Bestimmung von DNA-Nucleotidsequenzen, wobei die 3'-dNTP-Derivate 3'-Desoxyribonucleotid-Derivate sind, dargestellt anhand der folgenden allgemeinen Formel [I]: Q-V-(CH₂)_n-NH-R [I].
In der Formel steht Q für einen 3'-Desoxyribonucleotid-Rest, n bedeutet eine ganze Zahl nicht kleiner als 1, vorzugsweise nicht kleiner als 4, V bedeutet -C≡C- oder -CH=CH-, und R bedeutet eine fluoreszierende Gruppe.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das vorstehend erwähnte Verfahren zur Bestimmung von DNA-Nucleotidsequenzen, wobei die Nucleinsäure-Transkriptionsreaktion in Gegenwart von anorganischer Pyrophosphatase durchgeführt wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das T7-RNA-Polymerase-Gen auf dem T7-Phagengenom und die Aminosäure-Sequenz der codierten T7-RNA-Polymerase (erste Hälfte). Die Nucleotidsequenz ist in den oberen Teilen gezeigt, und die entsprechende Aminosäure-Sequenz in den unteren Teilen. Die Ziffern für die Nucleotidsequenz am rechten Ende zeigen die Zahlen des T7-Phagengenoms, das in der GeneBank-DNA-Sequenzdatenbank registriert ist (Locus T7CG, 39 937 Basenpaare), und die Ziffern der Aminosäuren sind beginnend mit 1 vom ersten M (Methionin) von T7-RNA-Polymerase beigefügt und zeigen, daß die volle Länge 883 Aminosäuren umfaßt.
2 zeigt das T7-RNA-Polymerase-Gen auf dem T7-Phagengenom und die Aminosäure-Sequenz der codierten T7-RNA-Polymerase (letzte Hälfte). Die Nucleotidsequenz ist in den oberen Teilen gezeigt, und die entsprechende Aminosäure-Sequenz in den unteren Teilen. Die Ziffern für die Nucleotidsequenz am rechten Ende zeigen die Zahlen des T7-Phagengenoms, das in der GeneBank- DNA-Sequenzdatenbank registriert ist (Locus T7CG, 39 937 Basenpaare), und die Ziffern der Aminosäuren sind beginnend mit 1 vom ersten M (Methionin) von T7-RNA-Polymerase beigefügt und zeigen, daß die volle Länge 883 Aminosäuren umfaßt.
3 zeigt die Anordnung der Aminosäure-Sequenzen der aktuell berichteten, von Phagen stammenden RNA-Polymerasen (erste Hälfte). Die T7-RNA-Polymerase oben wird als Standard verwendet, und die Symbole. (Punkt) zeigen die gleichen Aminosäurereste wie bei T7-RNA-Polymerase, – zeigt Fehlen und * unten zeigt einen Aminosäurerest, der allen Polymerasen gemeinsam ist.
4 zeigt die Anordnung der Aminosäure-Sequenzen der aktuell berichteten, von Phagen stammenden RNA-Polymerasen (letzte Hälfte). Die T7-RNA-Polymerase oben wird als Standard verwendet, und die Symbole. (Punkt) zeigen die gleichen Aminosäurereste wie bei T7-RNA-Polymerase, – zeigt Fehlen und * unten zeigt einen Aminosäurerest, der allen Polymerasen gemeinsam ist.
5 zeigt die Einzelheiten der mutierten Stellen von T7-RNA-Polymerase. Die Umrißzeichen zeigen mutierte Aminosäuren.
6 zeigt die Anordnung der Aminosäure-Sequenzen von T7-RNA-Polymerase und T3-RNA-Polymerase (erste Hälfte). Die T7-RNA-Polymerase oben wird als Standard verwendet, und die Symbole. (Punkt) zeigen die gleichen Aminosäurereste wie bei T7-RNA-Polymerase, – zeigt Fehlen und * unten zeigt Aminosäurereste, die beiden Polymerasen gemeinsam sind.
7 zeigt die Anordnung der Aminosäure-Sequenzen von T7-RNA-Polymerase und T3-RNA-Polymerase (letzte Hälfte). Die T7-RNA-Polymerase oben wird als Standard verwendet, und die Symbole. (Punkt) zeigen die gleichen Aminosäurereste wie bei T7-RNA-Polymerase, – zeigt Fehlen und * unten zeigt Aminosäurereste, die beiden Polymerasen gemeinsam sind.
8 zeigt die Sequenzen um die Reste 641–667 von T7-RNA-Polymerase und die Aminosäure-Sequenzen der entsprechenden Regionen von T3-RNA-Polymerase, K11-RNA-Polymerase und SP6-RNA-Polymerase. Die Reste für T7-RNA-Polymerase sind alle gezeigt, und entsprechende Reste sind durch (Punkt) für T3, K11 und SP6 gezeigt, wenn sie die gleichen sind wie bei T7.
9 zeigt die Aufbaukarte von pT7R, ein Plasmid, das Wildtyp-RNA-Polymerase exprimiert.
10 zeigt die Aufbaukarte von pT7RF644Y, ein Plasmid, das die mutante T7-RNA-Polymerase F644Y exprimiert.
11 zeigt die Aufbaukarte einer verbesserten Variante von Plasmid pT7R, d. h., pT7R-Xho, das eine Schnittstelle für die Restriktionsendonuclease XhoI im T7-RNA-Polymerase-Gen aufweist.
12 zeigt die Aufbaukarte von pT7RL665P/F667Y, ein Plasmid, das die mutante T7-RNA-Polymerase L665P/F667Y exprimiert.
13 zeigt die Aufbaukarte von pT7RF644Y/L665P/F667Y, ein Plasmid, das die mutante T7RNA-Polymerase F644Y/L665P/F667Y exprimiert.
14 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxyrhodamin X-markiertem 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (eine Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 3), das in Synthesebeispiel 6 erhalten wurde.
15 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxyrhodamin X-markiertem 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (eine Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4), das in Synthesebeispiel 10 erhalten wurde.
16 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxyrhodamin X-markiertem 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (eine Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 6), das in Synthesebeispiel 14 erhalten wurde.
17 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxyrhodamin 6G-markiertem 7-Desaza-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (eine Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4), das in Synthesebeispiel 23 erhalten wurde.
18 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxyrhodamin 6G-markiertem 7-Desaza-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (eine Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 6), das in Synthesebeispiel 26 erhalten wurde.
19 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxytetramethylrhodamin-markiertem 3'-Desoxyuridin-5'-triphosphat (eine Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4), das in Synthesebeispiel 30 erhalten wurde.
20 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxyrhodamin 110-markiertem 7-Desaza-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat (eine Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4), das in Synthesebeispiel 39 erhalten wurde.
21 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxyrhodamin 110-markiertem 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (eine Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4), das in Synthesebeispiel 53 erhalten wurde.
22 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxyrhodamin 6G-markiertem 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (eine Ver bindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4), das in Synthesebeispiel 54 erhalten wurde.
23 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxyrhodamin X-markiertem 7-Desaza-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (eine Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4), das in Synthesebeispiel 55 erhalten wurde.
24 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxyrhodamin X-markiertem 7-Desaza-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat (eine Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4), das in Synthesebeispiel 56 erhalten wurde.
25 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxytetramethylrhodamin-markiertem 3'-Desoxyuridin-5'-triphosphat (eine Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -CH=CH- ist und n = 4), das in Synthesebeispiel 61 erhalten wurde.
26 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxyrhodamin X-markiertem 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (eine Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -CH=CH- ist und n = 4), das in Synthesebeispiel 64 erhalten wurde.
27 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxyrhodamin 6G-markiertem 3'-Desoxy-7-desazaadenosin-5'-triphosphat (eine Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -CH=CH- ist und n = 4), das in Synthesebeispiel 67 erhalten wurde.
28 zeigt das Ergebnis der Spektrophotometrie in der UV/sichtbaren Region von Carboxyrhodamin 110-markiertem 3'-Desoxy-7-desazaadenosin-5'-triphosphat (eine Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -CH=CH- ist und n = 4), das in Synthesebeispiel 70 erhalten wurde.
29 zeigt die Verbesserung der Einbaurate von Farbstoff-Terminator durch mutante T7-RNA-Polymerasen. Als Farbstoff-Terminator wurde Rox-3'-dCTP verwendet. WT: Wildtyp-T7-RNA-Polymerase, F644Y: mutante T7-RNA-Polymerase F644Y, und F667Y: mutante T7-RNA-Polymerase L665P/F667Y.
30 zeigt die Verbesserung der Einbaurate von Farbstoff-Terminator durch die mutante T7-RNA-Polymerase F644Y, die als Elektrogramm gezeigt ist. Als Farbstoff-Terminator wurde Rox-3'-dCTP verwendet. WT: Wildtyp-T7-RNA-Polymerase, und F644Y: mutante T7-RNA-Polymerase F644Y.
31 zeigt die Verbesserung der Einbaurate von Farbstoff-Terminator durch die mutante T7-RNA-Polymerase L665P/F667Y, die als Elektrogramm gezeigt ist. Als Farbstoff-Terminator wurde Rox-3'-dCTP verwendet. WT: Wildtyp-T7-RNA-Polymerase, F667Y: mutante T7-RNA-Polymerase L665P/F667Y.
32 zeigt die Ergebnisse von Beispielen einer Sequenzierungsreaktion unter Verwendung von Wildtyp-T7-RNA-Polymerase (WT), mutanter T7-RNA-Polymerase F644Y (F644Y) oder mutanter T7-RNA-Polymerase L665P/F667Y (F667Y). Bei allen handelte es sich um Sequenzmuster des gleichen Bereichs. Wie man sieht, funktionierte im Falle der Wildtyp-T7-RNA-Polymerase (WT, oberer Teil) die Basenzuordnung nicht ordnungsgemäß, die Basenabstände waren verengt (Darstellung von Basenüberlappung), und somit wurde die Sequenzierung nicht korrekt durchgeführt.
33 zeigt einen Vergleich der Ergebnisse der Sequenzierung mit T7-RNA-Polymerase bei Verwendung der mutanten T7-RNA-Polymerase L665P/F667Y und Farbstoff-Terminatoren unterschiedlicher Linker-Länge.
34(1) und (2) zeigen das Ergebnis der Sequenzierung unter Verwendung eines Vektors mit T7-Promotor als Matrize.
35 zeigt das Ergebnis der Sequenzierung unter Verwendung eines PCR-Produkts als Matrize.
In 36(1) und (2) sind die Ergebnisse der Sequenzierung dargestellt, die die Wirkung der Zugabe von anorganischer Pyrophosphatase auf die Sequenzierungsreaktion unter Verwendung einer mutanten T7-RNA-Polymerase zeigen (keine Zugabe und Zugabe von 0,425 Einheiten).
In 37(1) und (2) sind die Ergebnisse der Sequenzierung dargestellt, die die Wirkung der Zugabe von anorganischer Pyrophosphatase auf die Sequenzierungsreaktion unter Verwendung einer mutanten T7-RNA-Polymerase zeigen (Zugabe von 0,0425 Einheiten und 0,00425 Einheiten).
In 38 sind die Ergebnisse der Sequenzierung dargestellt, die die Wirkung der Zugabe von anorganischer Pyrophosphatase auf die Sequenzierungsreaktion unter Verwendung eines PCR-Produkts als Matrize zeigen.
39 zeigt die Ergebnisse der Sequenzierung von hTSH-β-cDNA ohne Zugabe von anorganischer Pyrophosphatase. Die bestimmte Nucleotidsequenz wird mit der bereits berichteten hTSH-β-cDNA verglichen.
40 zeigt die Ergebnisse der Sequenzierung von hTSH-β-cDNA mit Zugabe von anorganischer Pyrophosphatase. Die bestimmte Nucleotidsequenz wird mit der bereits berichteten hTSH-β-cDNA verglichen.
41(1) bis (4) zeigen die Ergebnisse der Verbesserung der Einbaurate von Farbstoff-Terminatoren durch die mutante T7-RNA-Polymerase F644Y/L665P/F667Y als Elektrogramm.
42 zeigt das Terminationsmuster, das bei Verwendung von TMR-3'-dUTP(n4) als Terminator erhalten wird (A), und das Terminationsmuster, das bei Verwendung des in Bezugsbeispiel 8 erhaltenen TMR-Allyl-3'-dUTP(n4) als Terminator erhalten wird (B).
Ausführungsformen zur Durchführung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von DNA-Sequenzen umfaßt die Umsetzung von Ribonucleotiden (NTPs) und 3'-Desoxyribonucleotid(3'-dNTP)-Derivaten, insbesondere 3'-dNTP-Derivaten, bei denen ein Linker zwischen einer fluoreszierenden Substanz und dem 3'-Desoxyribonucleotid eingefügt ist, in Gegenwart einer RNA-Polymerase und eines DNA-Fragments, das eine Promotor-Sequenz für die RNA-Polymerase enthält, und die Bestimmung einer Nucleinsäure-Sequenz aus den Mustern der resultierenden abgetrennten Fraktion des Transkriptionsprodukts, dadurch gekennzeichnet, daß eine mutante RNA-Polymerase als RNA-Polymerase eingesetzt wird.
Mutante RNA-Polymerase
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendete mutante RNA-Polymerase besteht aus einer Wildtyp-RNA-Polymerase, bei der wenigstens einer der Aminosäurereste der Polymerase durch Tyrosin ersetzt ist, so daß ihre Fähigkeit zum Einbau von 3'-dNTP-Derivaten im Vergleich zur entsprechenden Wildtyp-RNA-Polymerase verbessert sein sollte.
Gemäß vorliegender Erfindung zählen zu den "Wildtyp-RNA-Polymerasen" alle natürlich vorkommenden RNA-Polymerasen. Außerdem kann die "Wildtyp-RNA-Polymerase" eine Wildtyp-RNA-Polymerase mit Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen von Aminosäuren sein, bei denen es sich nicht um die Abwandlung handelt, mit der erhöhte Fähigkeit zum Einbau von 3'-Desoxyribonucleotiden und Derivaten derselben im Vergleich zur entsprechenden Wildtyp-RNA-Polymerase erhalten wird. Das heißt, zu den obigen "Wildtyp-RNA-Polymerasen" zählen auch Wildtyp-RNA-Polymerasen, die zu einem anderen als dem vorstehend beschriebenen Zweck künstlich verändert wurden. Es ist jedoch möglich, derartige Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen in einem Ausmaß vorzunehmen, daß die Aktivität der RNA-Polymerase beibehalten wird.
Zu den Beispielen für "Wildtyp-RNA-Polymerasen" gehören RNA-Polymerasen, die von T7-Phagen, T3-Phagen, SP6-Phagen, K11-Phagen und dergleichen abgeleitet sind. Sie sind jedoch nicht auf diese RNA-Polymerasen beschränkt.
Zu den "Wildtyp-RNA-Polymerasen" gemäß vorliegender Erfindung zählen natürlich vorkommende thermostabile RNA-Polymerasen sowie natürlich vorkommende RNA-Polymerasen, die künstlich verändert wurden (d. h., mit Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen von Aminosäuren), um ihnen Thermostabilität zu verleihen. Es ist jedoch möglich, die Abwandlung zur Verleihung der Thermostabilität in einem solchen Ausmaß vorzunehmen, daß die Aktivität der RNA-Polymerase beibehalten wird. Die unter Verwendung einer thermostabilen RNA-Polymerase als "Wildtyp-RNA-Polymerase" hergestellte mutante RNA- Polymerase der vorliegenden Erfindung soll thermostabil sein. Damit kann sie beispielsweise in einer PCR eingesetzt werden, um RNA-Fragmente für die in situ-Sequenzierung zu synthetisieren, d. h., während der PCR, indem das PCR-Produkt als Matrize verwendet wird.
T7-RNA-Polymerase ist als Promotor-spezifische RNA-Polymerase mit überaus hoher Spezifität bekannt. Nucleotidsequenz und Herstellungsverfahren von T7-RNA-Polymerase sind berichtet bei Davanloo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81, 2035–2039 (1984). Ihre Herstellung in großem Maßstab ist bereits beschrieben bei Zawadzki et al., Nucl. Acids Res. 19, 1948 (1991). Im Gegensatz zu RNA-Polymerasen von E. coli und höheren Organismen kann diese Phagen-abgeleitete RNA-Polymerase die Transkriptionsreaktion mit einem einzigen Polypeptid weiterführen (Chamberlin et al., Nature 228, 227–231, 1970). Sie ist daher ein besonders wertvolles Material für die Analyse des Transkriptionsmechanismus, und es wurden viele Mutanten isoliert und beschrieben. Die Ergebnisse ihrer kristallographischen Analyse sind zudem erwähnt bei Sousa et al., Nature 364, 593–599, 1993.
Bekannt als weitere Promotor-spezifische RNA-Polymerasen mit hoher Spezifität sind 3 Arten von RNA-Polymerasen, die abgeleitet sind vom T3-Phagen, der E. coli infiziert, vom SP6-Phagen, der Salmonella infiziert, und vom K11-Phagen, der Klebsiella pneumoniae infiziert.
Wie im folgenden beschrieben, sind sich die vorstehend erwähnten 4 Arten von RNA-Polymerasen ziemlich ähnlich in ihrer Primärstruktur der Aminosäuren, der Sequenz des Promotors und dergleichen.
Die RNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung besitzt eine erhöhte Fähigkeit zum Einbau von 3'-Desoxyribonucleotiden und Derivaten derselben im Vergleich zu der Fähigkeit einer entsprechenden Wildtyp-RNA-Polymerase. Wie vorstehend beschrieben, werden 3'-Desoxyribonucleotide im Vergleich zu Ribonucleotiden von Wildtyp-RNA-Polymerasen nur schlecht eingebaut, was für ihre Ver wendung bei der Nucleotid-Sequenzierung hinderlich war. Dagegen ist die RNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung in einer Weise modifiziert, daß sie eine Fähigkeit zum Einbau von 3'-Desoxyribonucleotiden und Derivaten derselben aufweist, die wenigstens zweimal höher ist als die des Wildtyps. Der Einbau von 3'-Desoxyribonucleotiden neigt insbesondere dann zur Abnahme, wenn 3'-Desoxyribonucleotid-Derivate mit einer Fluoreszenzmarkierung versehen sind. Die RNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung kann auch den Einbau solcher 3'-Desoxyribonucleotid-Derivate verbessern.
Der hierin verwendete Begriff Ribonucleotid steht für Ribonucleosid-5'-triphosphate, darunter ATP, GTP, CTP, UTP und Derivate derselben, und 3'-Desoxyribonucleotid steht für 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP und 3'-dUTP, und mit Derivaten derselben sind Verbindungen gemeint, die aus diesen 3'-Desoxyribonucleotiden zusammengesetzt sind, die eine fluoreszierende Markierung aufweisen.
Die RNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung ist so beschaffen, daß wenigstens eine der Aminosäuren in einer entsprechenden Wildtyp-RNA-Polymerase durch Tyrosin ersetzt ist. Dies soll im folgenden ausführlich erklärt werden.
Auf der Grundlage der vorstehend erwähnten verschiedenen Berichte über T7-RNA-Polymerase versuchten die bei der vorliegenden Erfindung tätigen Erfinder, eine mutante RNA-Polymerase aufzubauen, die nur wenig oder keine Beeinflussung der Wirksamkeit des Einbaus aufweist, was je nach Art der für T7-RNA-Polymerase beobachteten Ribonucleotide wertvoll ist. Tatsächlich wurden verschiedene Mutanten hergestellt, um insbesondere zu bestimmen, welche Aminosäuren bei der Wildtyp-RNA-Polymerase mutiert werden sollten, und welche Art von Aminosäuren bei Substitution verwendet werden sollte, wenn die Substitution als Mutation herangezogen wird. Dann wurde gefunden, daß die Fähigkeit zum Einbau von 3'-Desoxyribonucleotiden und Derivaten derselben verbessert werden kann durch Ersetzen wenigstens einer Aminosäure der Wildtyp-RNA-Polymerasen durch Tyrosin, womit die mutante RNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung verwirklicht war.
Die bei der vorliegenden Erfindung tätigen Erfinder konstruierten zunächst ein Expressionsplasmid pT7R mit dem eingefügten T7-RNA-Polymerase-Gen, und anschließend wurden Mutanten von T7-RNA-Polymerase auf der Grundlage des Expressionsplasmids pT7R konstruiert. Das heißt, es wurden die mutanten T7-RNA-Polymerasen F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y und F882Y konstruiert, bei denen der Rest F (Phenylalanin) von T7-RNA-Polymerase durch den Rest Y (Tyrosin) ersetzt wurde, und es wurde die Einbaufähigkeit dieser Mutanten verglichen. Die Eigenschaften der Y639F-Mutante von T7-RNA-Polymerase – eine Mutation an einer Stelle, die Y526 von T7-DNA-Polymerase entspricht – sind in der Literatur beschrieben (Sousa, EMBO J. 14, 4609–4621 (1995)). Auch die Y639F-Mutante wurde konstruiert, die eine Mutation innerhalb der Reste 631–640 aufweist – jenen, von denen in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. (Hei) 8-205874/1996 angenommen wird, daß sie ihre Spezifität für dNTP ändern.
Die in dieser Beschreibung erwähnte Aminosäure-Sequenz von Wildtyp-T7-RNA-Polymerase beruht auf der Sequenz, die codiert wird durch die Nucleotide 3171–5822 der RNA-T7-Phagensequenz aus der GeneBank-Gensequenz-Datenbank, Zugangs-Nr. V01148 J02518 X00411 (39 937 Basenpaare) (vgl. 1 und 2). Die in den 1 und 2 dargestellten oberen Sequenzen sind Nucleotidsequenzen, und die unteren Sequenzen sind die den Nucleotidsequenzen entsprechenden Aminosäure-Sequenzen. Bei den Nucleotidsequenzen sind die Ziffern am rechten Ende die Zahlen des T7-Phagengenoms, das in der GeneBank registriert ist (Locus T7CG, 39 937 Basenpaare), und die Ziffern für die Aminosäuren am rechten Ende sind beginnend mit 1 vom ersten M (Methionin) von T7-RNA-Polymerase beigefügt und zeigen, daß die volle Länge 883 Aminosäurereste umfaßt.
Diese Aminosäure-Sequenz ist identisch mit der Aminosäure-Sequenz, die angegeben ist bei Moffatt et al., J. Mol. Biol. 173(2), 265–269, 1984, wie vorstehend erwähnt.
Demgemäß handelt es sich bei der Aminosäure-Sequenz und den Ziffern, die in dieser Beschreibung den jeweiligen Aminosäuren des Wildtyp-T7-RNA-Polymerase-Gens beigefügt sind, im wesentlichen um die Sequenz und die Zahlen, die in den 1 und 2 dargestellt sind. Wie vorstehend beschrieben, kann jedoch die obengenannte Wildtyp-T7-RNA-Polymerase Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen enthalten, doch sind dies nicht die Abwandlungen, die mit der vorliegenden Erfindung beabsichtigt sind. Ist daher die Wildtyp-RNA-Polymerase, an der eine Mutation für den Zweck der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden soll, eine Wildtyp-T7-RNA-Polymerase mit anderer Mutation, und wenn insbesondere eine solche Mutation eine Insertion und/oder Deletion ist, so ändern sich die den Aminosäuren beigefügten Zahlen aufgrund der Insertion und Deletion. Eine Wildtyp-T7-RNA-Polymerase mit einer solchen Insertion und Deletion zählt zu den Wildtyp-T7-RNA-Polymerasen, in die eine mit der vorliegenden Erfindung beabsichtigte Mutation eingeführt werden sollte, solange sie die T7-RNA-Polymerase-Aktivität beibehält, auch wenn sich ihre Aminosäure-Zahlen von den in den Figuren in 1 und 2 dargestellten Zahlen unterscheiden.
Die Aminosäure-Zahlen bei den Sequenzen von anderen RNA-Polymerasen als T7-RNA-Polymerasen sind so festgelegt wie in den in den 3 und 4 protokollierten Sequenzen. Auch diese können andere Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen aufweisen als die mit der vorliegenden Erfindung beabsichtigte Abwandlung. Haben diese eine solche Mutation durch Insertion oder Deletion von Aminosäuren, so ändern sich demgemäß – wie bei der Aminosäure-Sequenz und den der T7-RNA-Polymerase beigefügten Zahlen – die Aminosäure-Zahlen aufgrund dieser Insertion und Deletion, und eine Wildtyp-T7-RNA-Polymerase mit einer solchen Insertion und Deletion zählt zu den Wildtyp-T7-RNA-Polymerasen, in die eine mit der vorliegenden Erfindung beabsichtigte Mutation eingeführt werden sollte.
Das T7-RNA-Polymerase-Gen wird wie folgt hergestellt: T7-Phagen-DNA wird gereinigt. Daneben wird ein Primer synthetisiert, der spezifisch ist für die strom aufwärts vom N-Terminus gelegene Aminosäure-Region des T7-RNA-Polymerase-Gens (T7Rpol-N: 5'-ATA TTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA ACA CGA TTA ACA TCG CTA AG-3'), sowie ein Primer, der spezifisch ist für die stromabwärts vom C-Terminus gelegene Aminosäure-Region desselben (T7Rpol-C: 5'-ATA TTT TAG CCA TGG TAT AGT GAG TCG TAT TGA TTT GGC G-3'). Die Phagen-DNA wird als Matrize für die PCR verwendet, und so läßt sich ein Expressionsvektor pT7R konstruieren (vgl. Bezugsbeispiel 1). Dieser Expressionsvektor kann in E. coli DH5α transformiert werden, und die transformierten Zellen exprimieren eine große Menge an T7-RNA-Polymerase-Protein bei Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG).
Wurde die Sequenz dieses wie vorstehend beschrieben hergestellten T7-RNA-Polymerase-Gens mit der in den 1 und 2 gezeigten Aminosäure-Sequenz verglichen, so stimmten beide Sequenzen völlig überein. Die in den 1 und 2 gezeigte Aminosäure-Sequenz und die bei Grachev et al., Bioorg. Kim. 10, 824–843, 1984, berichtete Sequenz unterscheiden sich insofern, als Y 623 und L 665 bei der in den 1 und 2 gezeigten Aminosäure-Sequenz durch H (623) bzw. P (665) in der von Grachev et al. berichteten Aminosäure-Sequenz ersetzt sind. Wie vorstehend beschrieben, können Wildtyp-RNA-Polymerasen – die Grundlage der mutanten RNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung – Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen bezüglich der in den 1 und 2 gezeigten Sequenz enthalten, was jedoch nicht die mit der vorliegenden Erfindung beabsichtigte Abwandlung ist, und die von Grachev et al. berichtete Aminosäure-Sequenz, bei der die Reste 623 und 665 N bzw. P sind, gehören zu den Wildtyp-RNA-Polymerasen, die die Grundlage der mutanten RNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung bilden.
Die aus E. coli gereinigte T7-RNA-Polymerase, die den Expressionsvektor pT7R beherbergt, zeigte in Gegenwart von T7-Promotor enthaltender DNA ausreichende RNA-Syntheseaktivität in vitro. Auf der Grundlage dieses Expressionsplasmids pT7R wurden die vorstehend erwähnten Y639F, F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y und F882Y als mutante T7-RNA-Polymerasen konstruiert, und die Einbaufähigkeit dieser Mutanten wurde verglichen.
Bei der mutanten T7-RNA-Polymerase mit der F644Y-Mutation wurde neben der Mutation F644 gemäß dem vorstehend erwähnten Bericht von Grachev et al. eine weitere Mutation zum Ersetzen von L665, das F664 benachbart ist, durch P eingeführt. Das heißt, die Mutationen F644Y/L665P wurden eingeführt, um den Einfluß von L665P zu untersuchen. Auch bei der mutanten T7-RNA-Polymerase mit der F667Y-Mutation wurde neben der Mutation F667 gemäß dem vorstehend erwähnten Bericht von Grachev et al. eine weitere Mutation zum Ersetzen von L665, das F667 benachbart ist, durch P eingeführt. Das heißt, es wurden die Mutationen F665P/F667Y eingeführt.
Es wurde auch eine mutante T7-RNA-Polymerase konstruiert, in die die Mutationen F644Y/L665P/F667Y eingeführt wurden. Auch bei diesen Mutanten wurde ein Vergleich der Einbaufähigkeit durchgeführt.
Die T7-RNA-Polymerasen mit den eingeführten Mutationen wurden gereinigt, und ihre Fähigkeit zur Promotorsequenz-spezifischen RNA-Synthese und zum Einbau von Ribonucleosid-5'-triphosphaten, darunter ATP, GTP, CTP, UTP und Derivate derselben sowie 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP, 3'-dUTP und Derivate derselben, wurde mit der von Wildtyp-T7-RNA-Polymerase verglichen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 gezeigt.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, behielten F644Y, F644Y/L665P, L665P/F667Y und F644Y/L665P/F667Y im Ergebnis ausreichende RNA-Syntheseaktivität und zeigten deutliche Verbesserung beim Einbau von 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP, 3'-dUTP und Derivaten derselben. Die Einbaufähigkeit der Mutante F644Y/L665P war vergleichbar mit der der Mutante F644Y. Aus diesen Ergebnissen wird ersichtlich, daß die Ersetzung von Leucin durch Prolin bei 665 keinen Einfluß auf den Einbau von 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP, 3'-dUTP und Derivaten derselben hat. Zwar sind die Ergebnisse in Tabelle 1 nur für die Mutante L665P/F667Y gezeigt, doch zeigte auch die Mutante F667Y eine Einbaufähigkeit, die mit der der Mutante L665P/F667Y vergleichbar war. Am höchsten war die Einbaufähigkeit der Mutante F644Y/L665P/F667Y. Es ist zwar nicht in Tabelle 1 gezeigt, doch war die Einbaufähigkeit der Mutante F644Y/F667Y nahezu gleich der der Mutante F644Y/L665P/F667Y.
Die F782Y-Mutante behielt die RNA-Syntheseaktivität bei und zeigte leicht verbesserte Fähigkeit zum Einbau von 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP, 3'-dUTP und Derivaten derselben. Die F733Y-Mutante zeigte leicht verringerte RNA-Syntheseaktivität, zeigte jedoch leicht verbesserte Fähigkeit zum Einbau von 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP, 3'-dUTP und Derivaten derselben. Die F646Y-Mutante behielt die RNA-Syntheseaktivität bei, zeigte jedoch keine Verbesserung bei der Fähigkeit zum Einbau von 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP, 3'-dUTP und Derivaten derselben. Die F882Y-Mutante ist in Tabelle 1 nicht erwähnt, da sie deutlich verringerte RNA-Syntheseaktivität zeigte.
Die Y639F-Mutante von T7-RNA-Polymerase, die die Mutation an einem Ort aufweist, der Y526 von T7-DNA-Polymerase entspricht, behielt die RNA-Syntheseaktivität bei, zeigte jedoch keine Verbesserung bei der Fähigkeit zum Einbau von 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP, 3'-dUTP und Derivaten derselben.
Die vorstehend genannten Ergebnisse weisen darauf hin, daß die RNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung insbesondere eine RNA-Polymerase ist, die eine Abwandlung wenigstens einer der in der "Nucleotid-Bindungsstelle" der Polymerase vorhandenen Aminosäuren aufweist, und daß eine solche Abwandlung die Fähigkeit zum Einbau von 3'-Desoxyribonucleotiden und anderen Ribonucleotid-Analoga im Vergleich zur Fähigkeit bei entsprechenden Ribonucleotiden verbessern kann.
Die in der obigen "Nucleotid-Bindungsstelle" vorhandenen Aminosäuren können zum Beispiel Aminosäuren in der Schleife zwischen Helix Y und Helix Z und/oder Aminosäuren in der Schleife zwischen Helix Z und Helix AA der Wildtyp-RNA-Polymerase sein.
Aufgrund der in der Literatur bei Sousa et al. (Nature 364, 593–599, 1993) gezeigten räumlichen Struktur geht man davon aus, daß die Schleife (entsprechend den Aminosäureresten 635 bis 647 der T7-RNA-Polymerase) zwischen der Helix Y (entsprechend den Aminosäureresten 625 bis 634 derselben) und der Helix Z (entsprechend den Aminosäureresten 649 bis 658 derselben) und/oder die Schleife (entsprechend den Aminosäureresten 659 bis 684 derselben) zwischen der Helix Z und der Helix AA (entsprechend den Aminosäureresten 685 bis 699 derselben), die der Innenseite der Wirkorte in dem die Matrizen-DNA einschließenden Polymerase-Molekül zugewandt sind, einen Teil der Ribonucleotid-Bindungsstelle bilden, die sich ganz in der Nähe der Nucleotide findet. Bei der vorliegenden Erfindung wurden die F-Reste, die bei 644, 646 und 667 in einer den Schleifen entsprechenden Region vorhanden sind, tatsächlich durch Y-Reste ersetzt (siehe 5).
Die F-Reste 733, 782 und 882 sind in einer anderen Region als der der Schleife entsprechenden vorhanden, und man nimmt an, daß sie der Innenseite der Wirkorte im Polymerase-Molekül zugewandt sind. Auch diese F-Reste wurden tatsächlich durch Y-Reste ersetzt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine RNA-Polymerase, die eine Modifikation bei einer Aminosäure aufweist, die ausgewählt ist aus denjenigen in einer Region, die den Aminosäureresten 641–667 der vom T7-Phagen abgeleiteten RNA-Polymerase entspricht. Die den Aminosäureresten 641–667 der vom T7-Phagen abgeleiteten RNA-Polymerase entsprechende Region entspricht der vorstehend erwähnten "Nucleotid-Bindungsstelle".
Die vorstehend erwähnten vier RNA-Polymerasen sind sich einander sehr ähnlich in ihrer Primärstruktur der Aminosäuren, der Sequenz des Promotors und dergleichen. In den 3 und 4 ist die Anordnung der Aminosäure-Sequenzen der obengenannten, von den Phagen abgeleiteten vier RNA-Polymerasen dargestellt. Aus dieser Anordnung ist ersichtlich, daß sich die von T7, T3, und K11 abgeleiteten RNA-Polymerasen einander sehr ähnlich sind.
Insbesondere zeigen die Aminosäure-Sequenzen der von den Phagen T7 und T3 abgeleiteten RNA-Polymerasen außerordentlich große Ähnlichkeit, wie in den 6 und 7 gezeigt ist. Dies steht in Einklang mit der Tatsache, daß die beiden Phagen T7 und T3 diejenigen sind, die E. coli infizieren, und sie gleichen sich auch in ihren Eigenschaften. Des weiteren gleichen sich auch die Promotor-Sequenzen, die diese beiden RNA-Polymerasen erkennen, und sie haben außerordentlich hohe Erkennungsspezifität. Somit können die bei T7-RNA-Polymerase erhaltenen Ergebnisse relativ problemlos auf andere RNA-Polymerasen mit ähnlichen Aminosäure-Sequenzen angewandt werden.
Aus diesen hohen Homologien kann geschlossen werden, daß eine Region, die den Aminosäureresten 644–667 der vom T7-Phagen abgeleiteten RNA-Polymerase entspricht, bei anderen RNA-Polymerasen als den vom T7-Phagen abgeleiteten RNA-Polymerasen die Aminosäurereste 642–668 für die vom T3-Phagen abgeleitete RNA-Polymerase, die Aminosäurereste 664–690 für die vom K11-Phagen abgeleitete RNA-Polymerase und die Aminosäurereste 633–670 für die vom SP6-Phagen abgeleitete RNA-Polymerase sind. Wie vorstehend beschrieben, sind sich die von den Phagen T7, T3 und K11 abgeleiteten RNA-Polymerasen außerordentlich ähnlich, und die für T7-RNA-Polymerase erhaltenen Ergebnisse können auf andere RNA-Polymerasen mit ähnlicher Aminosäure-Sequenz angewandt werden (siehe 8).
Als ein Beispiel für derartige andere RNA-Polymerasen sei eine vom K11-Phagen abgeleitete RNA-Polymerase erwähnt, die Tyrosin am Aminosäurerest 644 oder 667 aufweist. Beispielhaft erwähnt sei auch eine vom T3-Phagen abgeleitete RNA-Polymerase, die Tyrosin am Aminosäurerest 645 oder 668 aufweist. Des weiteren sei eine vom K11-Phagen abgeleitete RNA-Polymerase beispielhaft erwähnt, die Tyrosin an einem oder mehreren der Aminosäurereste 664–669 und 690 aufweist. Beispielhaft erwähnt sei des weiteren eine vom SP6-Phagen abgeleitete RNA-Polymerase, die Tyrosin an einem oder mehreren der Aminosäurereste 633–638 und 670 aufweist.
Die Mutation der Aminosäure ist eine Ersetzung wenigstens eines Aminosäurerests in einer natürlich vorkommenden Aminosäure-Sequenz durch Tyrosin. Die zu ersetzende Aminosäure kann zum Beispiel Phenylalanin sein. Allerdings ist die zu ersetzende Aminosäure nicht auf Phenylalanin beschränkt, und es kann jede Aminosäure ersetzt werden, solange dies die Fähigkeit zum Einbau von 3'-Desoxyribonucleotiden und anderen Ribonucleotid-Analoga gegenüber der Fähigkeit für entsprechende Ribonucleotide verbessert.
Von den mutanten RNA-Polymerasen der vorliegenden Erfindung behielten die mutanten T7-RNA-Polymerasen F644Y, L665P/F667Y und F644Y/L665P/F667Y hinreichende RNA-Syntheseaktivität bei, zeigten deutlich verbesserte Fähigkeit zum Einbau von 3'-dNTPs, und die beim Wildtyp beobachtete starke Beeinflussung ist bei diesen Polymerasen deutlich verringert. Die Verwendung der T7-RNA-Polymerasen F644Y, L665P/F667Y oder F644Y/L665P/F667Y mit diesen Eigenschaften ermöglicht ein Verfahren zur Bestimmung von Nucleotidsequenzen unter Einsatz von Transkriptionsprodukten, das gegenüber einem Verfahren zur Bestimmung von Nucleotidsequenzen unter Verwendung einer DNA-Polymerase erheblich bessere praktische Anwendbarkeit aufweist.
Die E. coli-Stämme pT7RF644Y (DH5α) und pT7RL665P/F667Y (DH5α), die die mutanten T7-RNA-Polymerasen F644Y bzw. L665P/F667Y produzieren, wurden bereits am 2. Juli 1997 beim National Institute of Bioscience and Human Technology (Higashi 1-1-3 Tsukuba-shi Ibaraki-ken, Japan, Nr. 305-0046) mit den internationalen Hinterlegungsnummern 5998 (FERM-BP-5998) bzw. 5999 (FERM-BP-5999) hinterlegt. Der E. coli-Stamm pT7RF644Y/L665P/F667Y (DH5α), der die mutante T7-RNA-Polymerase F644Y/L665P/F667Y produziert, wurde bereits am 20. Mai 1998 beim National Institute of Bioscience and Human Technology mit der internationalen Hinterlegungsnummer 6364 (FERM-BP-6364) hinterlegt.
Die obengenannten mutanten RNA-Polymerasen können erzeugt werden durch Herstellung eines Nucleinsäure-Moleküls, das für eine RNA-Polymerase codiert, Einführung einer Mutation in das Nucleinsäure-Molekül, so daß ein oder mehrere Nucleotide in einer oder mehreren Regionen mutiert werden sollten, und Gewinnung einer modifizierten RNA-Polymerase, die durch das mutierte Nucleinsäure-Molekül exprimiert wird. Die Herstellung des Nucleinsäure-Moleküls, das für die RNA-Polymerase codiert, die Einführung einer Mutation in das Nucleinsäure-Molekül und die Gewinnung der modifizierten RNA-Polymerase können unter Anwendung der üblichen Methoden erfolgen.
Zum Beispiel kann eine mutante T7-RNA-Polymerase mit Hilfe der folgenden Methode konstruiert werden. Durch Verwendung eines Expressionsvektors als Matrize, der ein T7-RNA-Polymerase-Gen inseriert enthält, wird ein Expressionsplasmid konstruiert, das eine Region zwischen den HpaI- und NcoI-Restriktionsstellen in der C-terminalen Seite des T7-RNA-Polymerase-Gens umfaßt, in das mittels PCR eine Mutation eingeführt wird. Anschließend kann dieses Expressionsplasmid in E. coli DH5α transformiert werden, die dann auf Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) große Menge eines mutanten T7-RNA-Polymerase-Proteins produzieren können.
Verfahren zur Bestimmung einer DNA-Nucleotidsequenz
Verfahren zur enzymatischen Synthese eines Nucleinsäure-Transkriptionsprodukts unter Verwendung einer RNA-Polymerase und eines DNA-Fragments als Matrize, das eine Promotor-Sequenz für die RNA-Polymerase enthält, Verfahren zur Trennung der Nucleinsäure-Transkriptionsprodukte und Verfahren zur Bestimmung von Nucleinsäure-Sequenzen aus getrennten Fraktionen sind bereits bekannt. Was diese Verfahren anbelangt, können daher alle bekannten Techniken, Bedingungen, Geräte und dergleichen in geeigneter Weise verwendet werden.
Das als Matrize dienende DNA-Fragment unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, doch sollte es eine Promotor-Sequenz für die RNA-Polymerase enthalten. Zum Beispiel kann das DNA-Fragment, das die Promotor-Sequenz enthält, ein mittels Polymerase-Kettenreaktion amplifiziertes DNA-Produkt sein. Des weiteren kann die Nucleinsäure-Transkriptionsreaktion bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung mit einem amplifizierten DNA-Produkt durchgeführt werden, ohne die für die Polymerase-Kettenreaktion eingesetzten Primer und/oder das 2'-Desoxyribonucleosid-5'-triphosphat und/oder die Derivate derselben zu entfernen. Als Polymerase-Kettenreaktion für die obige DNA-Amplifikation kann irgendeine der weitläufig als PCR angewandten Methoden unverändert übernommen werden. Das DNA-Fragment, das die Promotor-Sequenz enthält, kann ein DNA-Fragment sein, das erhalten wird durch Ligieren der Promotor-Sequenz mit dem zu amplifizierenden DNA-Fragment und Klonieren des ligierten Fragments unter Verwendung eines geeigneten Wirts. Das heißt, die zu amplifizierenden DNA-Sequenzen, die Primer, die Bedingungen für die Amplifikation und dergleichen unterliegen bei der vorliegenden Erfindung keinen speziellen Einschränkungen.
Die Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifikation des DNA-Fragments mit Promotor-Sequenz kann beispielsweise in einem Reaktionssystem mit einem Volumen von 20 μl, enthaltend 10–50 ng genomische DNA oder 1 pg klonierte DNA, 10 μM der jeweiligen Primer und 200 μM des jeweiligen 2'-Desoxyribonucleosid-5'-triphosphats (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), unter Verwendung von Taq-Polymerase als DNA-Polymerase durchgeführt werden.
Allerdings sollte entweder einer der Primer für die Polymerase-Kettenreaktion oder die amplifizierte inserierte DNA (Insert) eine Promotor-Sequenz für die RNA-Polymerase enthalten, was im folgenden erklärt werden soll. Beim direkten Transkriptionssequenzierungsverfahren unter Verwendung zweier Arten von Primern, von denen einer eine Phagen-Promotorsequenz enthält, oder einer amplifizierten inserierten DNA, die eine Promotor-Sequenz für die PCR enthält, kann das resultierende PCR-Produkt unter Verwendung einer RNA-Polymerase eine in vitro-Transkription eingehen, die durch den Promotor angetrieben wird.
Die Promotor-Sequenz für die RNA-Polymerase kann je nach Art der zu verwendenden RNA-Polymerase in geeigneter Weise ausgewählt werden.
Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung werden Nucleinsäure-Transkripte wie z. B. RNA-Transkripte aus einem DNA-Fragment synthetisiert, das eine Promotor-Sequenz enthält. Da das DNA-Fragment eine Promotor-Sequenz für die RNA-Polymerase enthält, wird die vorstehend erwähnte mutante RNA-Polymerase durch diese Promotor-Sequenz angeregt, und so werden Nucleinsäure-Transkripte wie z. B. RNA-Transkripte synthetisiert.
Bei der Synthese von Nucleinsäure-Transkripten wie z. B. RNA-Transkripten werden Ribonucleosid-5'-triphosphate (NTPs), darunter ATP, GTP, CTP und UTP oder Derivate derselben, und eine oder mehrere Arten von 3'-dNTP-Derivaten in Gegenwart der vorstehend erwähnten RNA-Polymerase umgesetzt. Der Begriff 3'-dNTP-Derivate wird in dieser Beschreibung als generischer Begriff zur kollektiven Bezeichnung der 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP, 3'-dUTP und Derivate derselben verwendet. Als Ribonucleosid-5'-triphosphate (NTPs) sind wenigstens vier Arten von Verbindungen, die sich in ihren Basen unterscheiden, zur Synthese der Transkripte erforderlich, darunter ein Fall, bei dem ein Teil von ih nen aus ihren Derivaten wie z. B. den ATP-Derivaten besteht. Es können jedoch auch zwei oder mehr Arten von Verbindungen verwendet werden, die die gleiche Base tragen.
Die 3'-Hydroxy-Gruppe am 3'-Ende des Transkriptionsprodukts – RNA oder Nucleinsäure – wird beim Einbringen eines 3'-dNTP-Derivats beseitigt, und somit wird die Synthese der RNA oder der Nucleinsäure gehemmt. Dadurch können RNA- oder Nucleinsäure-Fragmente mit einem 3'-dNTP-Derivat am 3'-Ende in verschiedenen Größen erhalten werden. Derartige Ribonucleosid-Analoga werden für jede der vier Arten von 3'-dNTP-Derivaten erhalten, die sich in ihren Basen unterscheiden. Diese bereitgestellten vier Arten von Ribonucleosid-Analoga können zur Bestimmung von RNA- oder Nucleinsäure-Sequenzen verwendet werden [Vladimir D. Axelred et al. (1985), Biochemistry Bd. 24, 5716–5723].
Was die 3'-dNTP-Derivate anbelangt, so kann eine oder es können mehrere Arten derselben für eine Transkriptionsreaktion verwendet werden. Wird eine Nucleinsäure-Transkriptionsreaktion unter Verwendung eines 3'-dNTP-Derivattyps durchgeführt, so können die vier Arten von Transkriptionsprodukten mit unterschiedlichen 3'-dNTP-Derivaten am 3'-Ende dadurch erhalten werden, daß die Nucleinsäure-Transkriptionsreaktion viermal durchgeführt wird. Die eine Nucleinsäure-Transkriptionsreaktion ergibt ein Transkriptionsprodukt, das eine Mischung aus verschiedenen RNA- oder Nucleinsäure-Fragmenten mit dem gleichen 3'-dNTP-Derivat am 3'-Ende mit verschiedenen Molekulargewichten darstellt. Die erhaltenen vier Arten von Transkriptionsprodukten können unabhängig voneinander einer im folgenden erklärten Trennung und Sequenz-Bestimmung unterzogen werden. Es können auch zwei oder mehr der vier Arten von Transkriptionsprodukten gemischt und einer Trennung und Sequenz-Bestimmung unterzogen werden.
Werden zwei oder mehr Arten von 3'-dNTP-Derivaten gleichzeitig für eine Nucleinsäure-Transkriptionsreaktion eingesetzt, so sind zwei oder mehr Arten von Transkriptionsprodukten, die unterschiedliche Basen der 3'-dNTP-Derivate am 3'-Ende aufweisen, im Reaktionsprodukt enthalten. Dieses kann der im folgenden erklärten Trennung und Sequenz-Bestimmung unterzogen werden. Vorzugsweise werden zwei oder mehr Arten der 3'-dNTP-Derivate gleichzeitig eingesetzt, da sich dadurch die Anzahl der Nucleinsäure-Transkriptionsreaktionen verringert.
Die Transkription einer Nucleinsäure wie z. B. RNA wird zudem mit Hilfe einer RNA-Polymerase in Gegenwart von vier Arten von Ribonucleosid-5'-triphosphaten erreicht, die sich in ihren Basen unterscheiden, und durch 3'-dNTP-Derivate beendet. Dadurch wird für jede Base eine RNA- oder Nucleinsäure-Leiter zur Sequenzierung gebildet. Gemäß vorliegender Erfindung wird die Nucleinsäure-Transkription vorzugsweise in Gegenwart von insbesondere vier verschiedenen Arten von Ribonucleosid-5'-triphosphaten durchgeführt, deren Produkte dann getrennt werden, um die Nucleotidsequenzen für die vier Arten von Basen auf einmal (gleichzeitig) zu bestimmen.
Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die RNA- oder Nucleinsäure-Transkriptionsprodukte getrennt. Diese Trennung kann in geeigneter Weise mit Hilfe eines Verfahrens durchgeführt werden, mit dem sich mehrere im Transkriptionsprodukt enthaltene Arten von Molekülen mit unterschiedlichen Molekulargewichten gemäß den Molekulargewichten trennen lassen. Als ein Beispiel für ein solches Trennungsverfahren sei die Elektrophorese erwähnt. Auch die HPLC kann eingesetzt werden.
Bei der Elektrophorese unterliegen die Bedingungen und dergleichen keinen speziellen Einschränkungen, und sie kann in der üblichen Weise durchgeführt werden. Aus den Banden (RNA- oder Nucleinsäure-Leitern), die bei Durchführung der Elektrophorese mit den Transkriptionsprodukten erhalten werden, können die Sequenzen der RNA oder Nucleinsäure bestimmt werden.
Das Ablesen der RNA- oder Nucleinsäure-Leiter kann durch Markieren der Terminatoren für die Transkriptionsreaktion, d. h., der Ribonucleosid-5'-triphosphate (NTPs), durchgeführt werden. Das Ablesen der RNA- oder Nucleinsäure-Leiter ist auch möglich durch Markieren der 3'-dNTP-Derivate, die für die Transkriptionsreaktion eingesetzt werden. Beispiele für solche Markierungen sind radioaktive oder stabile Isotope, Fluoreszenzmarkierungen und dergleichen. Die Sequenzen der Transkriptionsprodukte können auch bestimmt werden durch Messung der Masse des jeweiligen, mittels Elektrophorese getrennten Produkts der Transkriptionsreaktion mit Hilfe eines Massenspektrometers, ohne Verwendung einer der vorstehend beschriebenen Markierungen.
In einzelnen lassen sich die Sequenzen der Transkriptionsprodukte beispielsweise unter Verwendung von 3'-dNTP-Derivaten, insbesondere markierten 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP und 3'-dUTP, und Nachweisen der radioaktiven oder stabilen Isotope, Fluoreszenzmarkierungen und dergleichen aus den Banden bestimmen, die durch Elektrophorese der Transkriptionsprodukte erhalten werden. Somit verringert das Markieren der 3'-dNTP-Derivate die Schwankungen der Intensität der Radioaktivität oder Fluoreszenz bei den erhaltenen Banden und erleichtert die Messung. Der Nachweis von radioaktiven oder stabilen Isotopen oder Leitern, die Fluoreszenz emittieren, kann so durchgeführt werden, daß zum Beispiel ein Gerät zur DNA-Sequenzierung in geeigneter Weise verwendet wird.
Die Sequenzen der Transkriptionsprodukte können auch bestimmt durch Verwenden von ATP, GTP, CTP und UTP, die mit radioaktiven oder stabilen Isotopen oder mit Fluoreszenzmarkierungen markiert sind, und Nachweisen der radioaktiven oder stabilen Isotope oder Fluoreszenzmarkierungen in den Banden, die durch Elektrophorese der Produkte erhalten werden.
Die Sequenzen der RNA oder Nucleinsäure können auch bestimmt werden durch Verwenden unterschiedlich fluoreszenzmarkierter 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP und 3'-dUTP und Nachweisen der vier Arten von Fluoreszenz in den Banden, die erhalten werden durch Elektrophorese einer Mischung aus den verschiedenen, unterschiedlich markierten Transkriptionsproduktfragmenten mit 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP oder 3'-dUTP an ihren Enden.
Bei dem obigen Verfahren werden die vier Arten von 3'-dNTPs mit verschiedenen Fluoreszenztypen markiert. Durch Behandeln einer Mischung der vier Arten von Transkriptionsprodukten, die sich in ihren 3'-Enden unterscheiden, ergeben sich Banden, die entsprechend einer jeden der vier Arten von 3'-dNTPs mit ihren unterschiedlichen 3'-Enden Fluoreszenz emittieren, und dadurch wird es möglich, vier Arten von RNA- oder Nucleinsäure-Sequenzen durch Unterscheidung der verschiedenen Fluoreszenztypen gleichzeitig zu bestimmen.
Vorzugsweise werden die nachstehend angeführten 3'-Desoxyribonucleotid-Derivate als fluoreszenzmarkierte 3'-dNTPs eingesetzt.
3'-Desoxyribonucleotid-Derivat (Terminator)
Als 3'-dNTP-Derivate zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von DNA-Sequenzen werden vorzugsweise die durch die folgende allgemeine Formel [I] dargestellten 3'-Desoxyribonucleotid-Derivate eingesetzt, da die durch die allgemeine Formel [I] dargestellten 3'-Desoxyribonucleotid-Derivate in einer Polymerase-Kettenreaktion mittels RNA-Polymerase problemlos in eine Sequenz eingebaut werden. Q-V-(CH₂)_n-NH-R [I]
In der Formel steht Q für einen 3'-Desoxyribonucleotid-Rest, n bedeutet eine ganze Zahl nicht kleiner als 4, V bedeutet -C≡C- oder -CH=CH-, und R bedeutet eine fluoreszierende Gruppe. In der allgemeinen Formel [I] bedeutet n vorzugsweise eine ganze Zahl von 4 bis 10. R in der allgemeinen Formel [I] wird vorzugsweise dargestellt durch die folgende allgemeine Formel [VII]:
Die durch die allgemeine Formel [I] dargestellten 3'-Desoxyribonucleotid-Derivate der vorliegenden Erfindung sind aus drei strukturellen Komponenten zusammengesetzt:

(a) 3'-Desoxyribonucleotid-Rest: Q,
(b) Linker der allgemeinen Formel [VI]: -V-(CH₂)_n-NH- [VI],worin V und n die gleichen wie vorstehend definierten Bedeutungen haben, und
(c) fluoreszierende Gruppe.

Die durch die folgenden allgemeinen Formeln [II] und [III] dargestellten 7-Desazapurin-Nucleotidreste und die durch die folgenden allgemeinen Formeln [IV] und [V] dargestellten Pyrimidin-Nucleotidreste seien als 3'-Desoxyribonucleotid-Reste erwähnt, die durch Q dargestellt werden.
In den obigen allgemeinen Formeln [II]–[V] steht R₃ für -PO₃H₂, -P₂O₆H₃, -P₃O₈H₄ oder ein Salz derselben. Zu den bevorzugten Beispielen für dieses Salz zählen Alkalimetall-Salze wie etwa Natrium-Salze, Kalium-Salze und Lithium-Salze, Erdalkalimetall-Salze wie etwa Barium-Salze, Ammonium-Salze wie z. B. Triethylammonium-Salze, Salze organischer Amine wie etwa Pyridin-Salze und dergleichen.
Der durch die obige allgemeine Formel [VI] dargestellte Linker ist ein Linker zur Bindung des durch Q dargestellten 3'-Desoxyribonucleotid-Rests und der fluoreszierenden Gruppe.
Das heißt, eines der Kohlenstoff-Atome, die eine Doppelbindung oder Dreifachbindung im Linker bilden, ist an einen der durch Q dargestellten 3'-Desoxyribonucleotid-Reste in 5-Stellung im Falle von Pyrimidin-Nucleotidresten bzw. in 7-Stellung im Falle von 7-Desazapurin-Nucleotidresten gebunden, und die Gruppe -NH- des Linkers ist an eine Carboxyl-Gruppe der Fluoreszenzfarbstoff-Gruppe gebunden, so daß eine Verbindung gebildet wird, die den 3'-Desoxyribonucleotid-Rest und die Fluoreszenzfarbstoff-Gruppe aufweist.
Bei dem durch die allgemeine Formel [VI] dargestellten Linker zählen zu den Beispielen für die Methylen-Kette, worin n nicht kleiner als 4 ist, eine Methylen- Kette, worin n 4–15 ist, insbesondere eine Tetramethylen-Gruppe, eine Pentamethylen-Gruppe, eine Hexamethylen-Gruppe, eine Heptamethylen-Gruppe, eine Octamethylen-Gruppe, eine Nonamethylen-Gruppe, eine Decamethylen-Gruppe und dergleichen. Vom Gesichtspunkt der Verbesserung der Einbaurate durch RNA-Polymerasen sollte n eine ganze Zahl nicht kleiner als 4 sein, und vorzugsweise ist n eine ganze Zahl von 4–10, mehr bevorzugt ist n eine ganze Zahl von 4–8, und besonders bevorzugt ist n 4 oder 6.
Die durch R dargestellte fluoreszierende Gruppe kann direkt an die Gruppe -NH- oder über einen Linker an die Gruppe -NH- gebunden sein. Die fluoreszierende Gruppe unterliegt keinen speziellen Einschränkungen und kann in geeigneter Weise gemäß der Fluoreszenzintensität, der Wellenlänge der Fluoreszenz, der Leichtigkeit des Einbaus durch RNA-Polymerasen und dergleichen ausgewählt werden. Die fluoreszierende Gruppe ist jedoch vorzugsweise ein Fluoreszenzfarbstoff, der eine nachweisbare Lumineszenz-Emission nach Anregung durch Absorption von Energie aus einer geeigneten Energiequelle wie z. B. einem Argon-Laser erzeugt.
Zu den Beispielen für die fluoreszierende Gruppe R zählen Gruppen, die durch die folgende allgemeine Formel dargestellt sind. Die durch die allgemeine Formel [VII] dargestellten fluoreszierenden Gruppen sind Fluoreszenzfarbstoff-Gruppen, die nach Anregung durch Absorption von Energie aus einer geeigneten Energiequelle wie z. B. einem Argon-Laser eine nachweisbare Lumineszenz-Emission erzeugen.
In der Formel bedeutet W eine Carboxyl-Gruppe, X bedeutet -O-, -S-, -NR'-, worin R' ein Wasserstoff-Atom, eine Niederalkyl-Gruppe, eine Aralkyl-Gruppe oder eine Aryl-Gruppe oder -CH₂- bedeutet, einer der Ringe A und B bedeutet
und der andere
worin Z O oder =N⁺R₁R₂ bedeutet und Y OH oder -NR₁R₂ bedeutet, worin R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoff-Atom oder eine Niederalkyl-Gruppe bedeuten, oder R₁ und R₂ beide eine Trimethylen-Gruppe bedeuten (mit der Maßgabe, daß R₁ und R₂ zwei Trimethylen-Gruppen bedeuten, deren jeweils anderes Ende an eines der beiden Kohlenstoff-Atome neben dem Stickstoff-Atom gebunden ist, an das die Trimethylen-Gruppe gebunden ist),
die gestrichelte Linie ------ in Ring C:
bedeutet eine Bindung, die an einer Position vorhanden ist, die durch die Struktur von Ring A und Ring B festgelegt ist, und die Ringe A, B und C und der Benzol-Ring mit W können gegebenenfalls einen oder mehrere zusätzliche Substituenten aufweisen.
Die durch R' in -NR'- für X in der allgemeinen Formel [VII] dargestellte Niederalkyl-Gruppe kann linear, verzweigt oder cyclisch sein, und zu den Beispielen für diese gehören Alkyl-Gruppen mit 1–6 Kohlenstoff-Atomen wie insbesondere die Methyl-Gruppe, Ethyl-Gruppe, n-Propyl-Gruppe, Isopropyl-Gruppe, n-Butyl-Gruppe, Isobutyl-Gruppe, sec-Butyl-Gruppe, Pentyl-Gruppe, Isopentyl-Gruppe, tert-Pentyl-Gruppe, 1-Methylpentyl-Gruppe, n-Hexyl-Gruppe, Isohexyl-Gruppe, Cyclopropyl-Gruppe, Cyclopentyl-Gruppe, Cyclohexyl-Gruppe und dergleichen. Zu den Beispielen für die durch R' dargestellte Aralkyl-Gruppe zählen Aralkyl-Gruppen mit 7–20 Kohlenstoff-Atomen wie insbesondere die Benzyl-Gruppe, Phenethyl-Gruppe, Phenylpropyl-Gruppe, Methylbenzyl-Gruppe, Methylphenethyl-Gruppe, Ethylbenzyl-Gruppe, Naphthylmethyl-Gruppe, Naphthylethyl-Gruppe und dergleichen, und zu den Beispielen für die durch R' dargestellte Aryl-Gruppe zählen die Phenyl-Gruppe, Tolyl-Gruppe, Xylyl-Gruppe, Naphthyl-Gruppe und dergleichen.
Die durch R₁ oder R₂ in =N⁺R₁R₂, dargestellt durch Z, oder in -NR₁R₂, dargestellt durch Y, in der allgemeinen Formel [VII] dargestellte Niederalkyl-Gruppe kann linear, verzweigt oder cyclisch sein, und zu den Beispielen für diese gehören Alkyl-Gruppen mit 1–6 Kohlenstoff-Atomen wie insbesondere die Methyl-Gruppe, Ethyl-Gruppe, n-Propyl-Gruppe, Isopropyl-Gruppe, n-Butyl-Gruppe, Isobutyl-Gruppe, sec-Butyl-Gruppe, Pentyl-Gruppe, Isopentyl-Gruppe, tert-Pentyl-Gruppe, 1-Methylpentyl-Gruppe, n-Hexyl-Gruppe, Isohexyl-Gruppe, Cyclopropyl-Gruppe, Cyclopentyl-Gruppe, Cyclohexyl-Gruppe und dergleichen.
Ist in der obigen allgemein Formel [VII] die durch W dargestellte Carboxyl-Gruppe an einer Position gebunden wie in der folgenden allgemeinen Formel [VIII] dargestellt,
so kann der Teil der Fluoreszenzfarbstoff-Gruppe in den 3'-Desoxyribonucleotid-Derivaten der vorliegenden Erfindung eine der beiden folgenden Strukturen annehmen:
Die Carboxyl-Gruppe kann ein Salz bilden, beispielsweise ein Alkalimetall-Salz wie etwa ein Natrium-Salz, Kalium-Salz und Lithium-Salz, ein Erdalkalimetall-Salz wie etwa ein Barium-Salz, ein Ammonium-Salz wie z. B. ein Triethylammonium-Salz, ein Salz organischer Amine wie etwa ein Pyridin-Salz und dergleichen.
Als Beispiel für die Verbindungen der obigen allgemeinen Formel [VII], wobei Z in den Ringen A und B =N⁺R₁R₂ bedeutet und Y -NR₁R₂ bedeutet, wobei R₁ und R₂ beide eine Trimethylen-Gruppe bedeuten, deren jeweils anderes Ende an ei nes der beiden Kohlenstoff-Atome neben dem Stickstoff-Atom gebunden ist, an das die Trimethylen-Gruppe gebunden ist, sei eine Verbindung erwähnt, die durch die folgende Formel dargestellt ist:
In der obigen allgemeinen Formel [VII] bedeutet die gestrichelte Linie ------ in Ring C
eine Bindung, die an einer Position vorhanden ist, die durch die Strukturen von Ring A und Ring B festgelegt ist, Im einzelnen sei dies wie folgt beispielhaft dargestellt.
Das heißt, wenn der Ring A
ist, dann ist die Bindungskonfiguration von Ring C wie folgt:
Ist der Ring B
so ist die Bindungskonfiguration von Ring C wie folgt:
Ist X des weiteren -NH-, so können Ring A (oder Ring B) und Ring C eine der beiden folgenden Konfigurationen annehmen:
Die Ringe A, B und C und der Benzol-Ring mit W können gegebenenfalls einen oder mehrere zusätzliche Substituenten aufweisen, und zu den Beispielen für solche Substituenten zählen Alkyl-Gruppen, Alkoxy Gruppen, Halogen-Atome und dergleichen.
Die Alkyl-Gruppen können linear, verzweigt oder cyclisch sein und können eine Doppelbindung aufweisen; zu den Beispielen für diese gehören Alkyl-Gruppen mit 1–20 Kohlenstoff-Atomen, vorzugsweise Alkyl-Gruppen mit 1–6 Kohlenstoff-Atomen. Zu den speziellen Beispielen für diese zählen die Methyl-Gruppe, Ethyl-Gruppe, n-Propyl-Gruppe, Isopropyl-Gruppe, n-Butyl-Gruppe, Isobutyl-Gruppe, sec-Butyl-Gruppe, Pentyl-Gruppe, Isopentyl-Gruppe, tert-Pentyl-Gruppe, 1-Me thylpentyl-Gruppe, n-Hexyl-Gruppe, Isohexyl-Gruppe, Cyclopropyl-Gruppe, Cyclopentyl-Gruppe, Cyclohexyl-Gruppe und dergleichen. Die Alkoxy-Gruppen sind zum Beispiel vorzugsweise Niederalkoxy-Gruppen mit 1–6 Kohlenstoff-Atomen. Spezielle Beispiele dafür sind beispielsweise die Methoxy-Gruppe, Ethoxy-Gruppe, n-Propoxy-Gruppe, Isopropoxy-Gruppe, n-Butoxy-Gruppe, Pentyloxy-Gruppe, Isopentyloxy-Gruppe, tert-Pentyloxy-Gruppe, 1-Methylpentyloxy-Gruppe, n-Hexyloxy-Gruppe, Isohexyloxy-Gruppe und dergleichen. Zu den Beispielen für die Halogen-Atome zählen Fluor, Chlor, Brom, Iod und dergleichen.
Zu den bevorzugten speziellen Beispielen für die durch obige allgemeine Formel [VII] dargestellten Fluoreszenzfarbstoff-Gruppen gehören solche, die von fluoreszierenden Farbstoffen abgeleitet sind, etwa 5- oder 6-Carboxytetramethylrhodamin (im folgenden als TMR abgekürzt), 5- oder 6-Carboxyrhodamin X (im folgenden als XR abgekürzt), 5- oder 6-Carboxyrhodamin 6G (im folgenden als R6G abgekürzt), 5- oder 6-Carboxyrhodamin 110 (im folgenden als R110 abgekürzt), 5- oder 6-Carboxyfluorescein, 5- oder 6-Carboxy-2',7'-dichlorfluorescein, 5- oder 6-Carboxy-2',4',5',7'-tetrachlorfluorescein, 5- oder 6-Carboxy-4,7-dichlor-2',7'-dimethoxyfluorescein, 5- oder 6-Carboxy-4,7,4',5'-tetrachlor-2',7'-dimethoxyfluorescein, 5- oder 6-Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxyfluorescein, 5- oder 6-Carboxy-4,7-dichlor-1',2',7',8'-dibenzofluorescein, 5- oder 6-Carboxy-4,7-dichlor-1',2',7',8'-dibenzofluorescein und dergleichen.
Die durch die allgemeine Formel [I] dargestellten 3'-Desoxyribonucleotid-Derivate der vorliegenden Erfindung lassen sich problemlos synthetisieren, beispielsweise gemäß den folgenden Syntheseschemata.
In den folgenden Syntheseschemata bedeutet R₄ eine Fluoreszenzfarbstoff-Gruppe wie eine der vorstehend erwähnten. Die autorisierte Nomenklatur für die in den folgenden Syntheseschemata verwendeten Abkürzungen ist wie folgt.
CAN: Cer(IV)-diammoniumnitrat
AcOH: Essigsäure
NPETFA: 5-Trifluoracetamido-1-pentin
NHETFA: 6-Trifluoracetamido-1-hexin
NOTFA: 8-Trifluoracetamido-1-octin
Et₃N: Triethylamin
(Ph₃P)₄Pd: Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0)
DMF: N,N-Dimethylformamid
NHTfa: Trifluoracetamid
(EtO)₃PO: Triethylphosphat
Tris(TBA)PP: Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphat
TEAB: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer
TBDMSCI: tert-Butyldimethylsilylchlorid
THF: Tetrahydrofuran
TCDI: 1,1'-Thiocarbonyldiimidazol
n-Bu₃SnH: Tri-n-butylzinnhydrid
AIBN: 2,2'-Azobis(isobutyronitril)
pyr.: Pyridin
n-Bu₄NF: Tetrabutylammoniumfluorid
Ac₂O: Acetanhydrid
MeOH: Methanol
NIS: N-Iodsuccinimid
STC: 4-Thiocresol
HMPA: Hexamethylphosphoramid
MCPBA: m-Chlorperbenzoesäure
R₄-OSu: Succinimidylester der Fluoreszenzfarbstoff-Gruppe
(1) Synthese von fluoreszenzmarkierten 3'-Desoxyuridin-5'-triphosphaten (Verbindungen der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4)
(2) Synthese von fluoreszenzmarkierten 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphaten (Verbindungen der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4)
(3) Synthese von fluoreszenzmarkierten 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphaten (Verbindungen der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 6)
(4) Synthese von fluoreszenzmarkierten 7-Desaza-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphaten (Verbindungen der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4)
(5) Synthese von fluoreszenzmarkierten 7-Desaza-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphaten (Verbindungen der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 6)
(6) Synthese von fluoreszenzmarkierten 7-Desaza-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphaten (Verbindungen der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4)
(7) Synthese von fluoreszenzmarkierten 3'-Desoxyuridin-5'-triphosphaten (Verbindungen der allgemeinen Formel [I], worin V -C=C- ist und n = 4)
(8) Synthese von fluoreszenzmarkierten 3'-Desoxyuridin-5'-triphosphaten (Verbindungen der allgemeinen Formel [I], worin V -C=C- ist und n = 4)
(9) Synthese von fluoreszenzmarkierten 7-Desaza-3'-desoxycytidin-5'-triphosphaten (Verbindungen der allgemeinen Formel [I], worin V -C=C- ist und n = 4)
(10) Synthese von fluoreszenzmarkierten 7-Desaza-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphaten (Verbindungen der allgemeinen Formel [I], worin V -C=C-ist und n = 4)
(11) Synthese von fluoreszenzmarkierten 7-Desaza-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphaten (Verbindungen der allgemeinen Formel [I], worin V -C=C- ist und n = 4)
Die 3'-Desoxyribonucleotid-Derivate der vorliegenden Erfindung sind äußerst wirksame RNA-Verlängerungsterminatoren für DNA-Sequenzierungsverfahren unter Verwendung von RNA-Polymerase, und sie ermöglichen eine zuverlässigere Bestimmung von DNA-Nucleotidsequenzen.
Zum Beispiel kann eine zu sequenzierende Matrizen-DNA stromabwärts von einem Promotor einer RNA-Polymerase ligiert werden, es kann eine Extensions- und Terminationsreaktion mit der DNA in Gegenwart der vier Ribonucleotide Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Uracil (U) und von vier 3'-Desoxyribonucleotid-Derivaten durchgeführt werden, die mit Fluoreszenzfarbstoffen der vorliegenden Erfindung modifiziert sind und den Ribonucleotiden entsprechen, dann können die Reaktionsprodukte gemischt und einer Elektrophorese in einer Bahn unterzogen werden, und die mittels Laser angeregte Fluoreszenz-Wellenlänge kann spektrophotometrisch erfaßt werden, um die DNA-Sequenz Schritt für Schritt zu bestimmen.
Die Kombination aus dem Fluoreszenzfarbstoff und den vier Arten von 3'-Desoxyribonucleotiden sollte in geeigneter Weise ausgewählt werden, insbesondere wenn vier Sequenz-Arten parallel in einer Bahn bestimmt werden, indem man den Unterschied der Lumineszenzintensität der Fluoreszenzfarbstoffe und den Unterschied der Einbaurate durch eine RNA-Polymerase aufgrund der Unterschiede bei den Basentypen der 3'-Desoxyribonucleotides berücksichtigt. Das heißt, man wählt vorzugsweise eine solche Kombination aus, daß gleichmäßige Intensität der Fluoreszenzsignale aus dem jeweiligen Transkriptionsprodukt erhalten werden sollte, um stabiles Ablesen und präzise DNA-Sequenzierung zu ergeben.
Die Fluoreszenzintensitäten der in den Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendeten vier Arten von Fluoreszenzfarbstoffen, 5-Carboxyrhodamin X-succinimidester(XR), 5-Carboxyrhodamin 6G-succinimidester(R6G), 5-Carboxytetramethylrhodaminsuccinimidester (TMR), und 5-Carboxyrhodamin 110-bis-trifluoracetatsuccinimidester (R110), liegen bei Anregung mit einem Argon-Laser mit 488 nm und 514 nm in der Reihenfolge R110, R6G > TMR > XR. Die Nachweisempfindlichkeit beträgt etwa 40 amol für R110 und R6G, etwa 400 amol für TMR und etwa 800 amol für XR.
Zudem ist je nach Art der RNA-Polymerase die Einbaurate der 3'-Desoxyribonucleotide unterschiedlich, und dies sollte bei der Auswahl der Kombination berücksichtigt werden. Die Einbaurate von 3'-dNTP durch T7-RNA-Polymerase wurde gemessen unter Verwendung von radioaktiven [α-³²P]3'-dNTPs. Auf diese Weise ergibt sich die Reihenfolge 3'-dGTP > 3'-dATP, 3'-dUTP > 3'-dCTP.
Unter Berücksichtigung der Lumineszenzintensitäten der obigen Fluoreszenzfarbstoffe und der Einbaurate durch T7-RNA-Polymerase wurde bei den Beispielen der vorliegenden Erfindung die folgende Kombination aus fluoreszierenden Terminatoren in den folgenden Mengen verwendet:
R6G-3'-dATP 1 μM
R110-3'-dGTP 1 μM
XR-3'-dCTP 50 μM
TMR-3'-dUTP 12,5 μM
Des weiteren ergibt eine Kombination aus R6G-3'-dATP, R110-3'-dCTP, XR-3'-dGTP und TMR-3'-dUTP in den folgenden Mengen gleichmäßigen Peak-Output:
R6G-3'-dATP 1 μM
R110-3'-dCTP 10 μM
XR-3'-dGTP 5 μM
TMR-3'-dUTP 12,5 μM
Bevorzugte Beispiele für Kombinationen aus Fluoreszenzfarbstoffen und den vier Arten von 3'-Desoxyribonucleotiden zur Verwendung mit T7-RNA-Polymerase und Mutanten derselben sind nachstehend gezeigt. Diese sind jedoch lediglich beispielhaft, und bevorzugte Kombinationen können verändert werden, wenn der Fluoreszenzfarbstoff verändert wird.
Beispiele für Kombinationen aus Fluoreszenzfarbstoffen und Basen:
R6G-3'-dCTP, R110-3'-dATP, XR-3'-dUTP und TMR-3'-dGTP;
R6G-3'-dATP, R110-3'-dCTP, XR-3'-dUTP und TMR-3'-dGTP;
R6G-3'-dCTP, R110-3'-dUTP, XR-3'-dATP und TMR-3'-dGTP;
R6G-3'-dUTP, R110-3'-dCTP, XR-3'-dATP und TMR-3'-dGTP.
Nucleinsäure-Transkriptionsreaktion in Gegenwart von anorganischer Py rophosphatase
Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die Nucleinsäure-Transkriptionsreaktion vorzugsweise in Gegenwart von anorganischer Pyrophosphatase durchgeführt, weil dadurch der Unterschied in den Peak-Höhen (Intensitäten der Signale), die dem jeweiligen markierten Ribonucleotid entsprechen, verringert wird, wodurch die Genauigkeit der Sequenz-Bestimmung verbessert wird und genauere Sequenz-Daten erhalten werden können.
Die Pyrophosphorolyse tritt aufgrund der Zunahme von Pyrophosphat auf, das durch die DNA-Synthese erzeugt wird, und dieses wirkt so, daß es die Reaktion fördert, so daß sich das resultierende DNA-Produkt zersetzen sollte. Folglich hemmt die Pyrophosphorolyse die Sequenzierung beim Didesoxy-Sequenzierungsverfahren unter Verwendung einer DNA-Polymerase. Was diese Tatsache anbelangt, so ist bekannt, daß bei Verwendung einer anorganischen Pyrophosphatase beim Didesoxy-Sequenzierungsverfahren mit einer DNA-Polymerase diese die Pyrophosphorolyse hemmt und so stabile Sequenzierungsdaten ergibt [japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. Hei 4-506002/1992].
Es ist jedoch nicht bekannt, welche Art von Wirkung die Pyrophosphorolyse auf das Sequenzierungsverfahren mit einer RNA-Polymerase hat. Aufgrund der Untersuchungen der bei der vorliegenden Erfindung tätigen Erfinder wurde gefunden, daß stabilere Sequenz-Daten erhalten werden können, wenn die Nucleinsäure-Transkriptionsreaktion in Gegenwart von anorganischer Pyrophosphatase beim obengenannten Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird.
Anorganische Pyrophosphatase (EC.3.6.1.1) ist im Handel erhältlich und wird zum Beispiel von Sigma als ANORGANISCHE PYROPHOSPHATASE und von Boehringer als Pyrophosphatase vertrieben. Zwar richtet sich die Menge der zu verwendenden anorganischen Pyrophosphatase nach dem Aktivitätsgrad der anorganischen Pyrophosphatase und der RNA-Polymerase, doch liegt sie geeigneterweise im Bereich von 10^–6 bis 10^–2 Einheiten für 1 Einheit RNA-Polymerase.
Eine als Matrize für die Transkription verwendete DNA-Sequenz kann aus einer wie vorstehend beschrieben bestimmten RNA- oder Nucleinsäure-Sequenz bestimmt werden. Wird für jedes Nucleotid eine Leiter gebildet, so können die sich aus vier Arten von Leitern ergebenden Angaben zur RNA- oder Nucleinsäure-Sequenz integriert werden, um die als Matrize für die Transkription verwendete DNA-Sequenz zu bestimmen. Werden Leitern für zwei oder mehr Arten von Nucleotiden gleichzeitig gebildet (wenn Banden für zwei oder mehr Arten von Nucleotiden in der gleichen Leiter vorhanden sind), so können die sich aus den Leitern ergebenden Angaben zur RNA- oder Nucleinsäure-Sequenz integriert werden, um die als Matrize für die Transkription verwendete DNA-Sequenz zu bestimmen. Wird insbesondere eine Leiter für vier Arten von Nucleotiden gleichzeitig gebildet (wenn Banden für vier Arten von Nucleotiden in der gleichen Leiter vorhanden sind), so kann die als Matrize für die Transkription verwendete DNA-Sequenz aus den sich aus der einen Leiter ergebenden Angaben zur RNA- oder Nucleinsäure-Sequenz bestimmt werden.
Das Sequenzierungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann in verschiedenen Kits genutzt werden.
Gemäß vorliegender Erfindung kann die Beeinflussung der Fähigkeit zum Einbau von Ribonucleotiden und dergleichen – zum Beispiel die Tatsache, daß 3'-Desoxyribonucleotide mit geringerer Wahrscheinlichkeit in eine Polyribonucleotid-Sequenz eingebaut werden als die entsprechenden Ribonucleotide, sowie die Tatsache, daß der Einbau bei Ribonucleotiden und 3'-Desoxyribonucleotiden je nach Art der Basen-Gruppen Schwankungen unterliegt – beseitigt werden, wodurch es möglich wird, ein Verfahren zur Bestimmung von DNA-Nucleotidsequenzen bereitzustellen, das stabilere Sequenz-Daten liefern kann.
In Anbetracht der guten Verarbeitbarkeit von RNA-Polymerasen erlaubt das Sequenz-Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung eine Nucleotidsequenz-Bestimmung, die derjenigen überlegen ist, die mit Hilfe eines Nucleotidsequenz-Bestimmungsverfahrens unter Verwendung einer DNA-Polymerase erhalten wird.
Insbesondere kann gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eine DNA-Sequenz eines PCR-Produkts so wie es ist bestimmt werden, ohne das PCR-Produkt zu reinigen. Dies wird durch die Eigenschaft von RNA-Polymerasen erreicht, daß verbleibende 2'-dNTPs in einer Reaktionsmischung in Gegenwart von 3'-dNTP nicht als Reaktionspartner für die Sequenzierung verbraucht werden.
Da beim Verfahren der vorliegenden Erfindung zudem eine Transkriptionsreaktion von RNA genutzt wird, muß keine einzelsträngige Matrizen-DNA und auch kein Primer wie bei den üblichen DNA-Sequenzierungsverfahren verwendet werden, und es ist auch kein Denaturierungsschritt für die Hybridisierung der Sequenzierungsprimer erforderlich. Daher gibt es auch keine Beeinflussung durch die Renaturierung des PCR-Produkts, und DNA-Sequenzen können problemlos bestimmt werden.
Durch die Verwendung einer thermostabilen mutanten RNA-Polymerase als RNA-Polymerase kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von DNA-Sequenzen auch für einen Schritt mit PCR-Anwendung eingesetzt werden, wodurch es möglich wird, DNA-Sequenzen schneller zu bestimmen.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung soll nun anhand der folgenden Beispiele ausführlicher erklärt werden.
Bezugsbeispiel 1
Klonierung des Wildtyp-T7-RNA-Polymerase-Gens und Konstruktion eines Expressionsplasmids
Der in E. coli beherbergte T7-Phage wurde wie folgt hergestellt. Der E. coli-Stamm C600 wurde in 200 ml LB-Kulturmedium eingeimpft (das Kulturmedium wurde hergestellt durch Lösen von 10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt, und 5 g NaCl in 1 Liter Wasser, das auf pH 7,5 eingestellt worden war, und Sterilisieren in einem Autoklaven). Sobald die Zellendichte eine OD (600 nm) = 1,0 erreicht hatte, wurden die Zellen mit einer Multiplizität der Infektion von etwa 2 infiziert. Die OD wurde periodisch bestimmt, und sobald die OD abrupt abgenommen hatte, wurde der Zellrückstand durch Zentrifugieren entfernt. Das Medium wurde mit NaCl und Polyethylenglycol 6000 auf Endkonzentrationen von 0,5 M bzw. 10% versetzt, ausreichend gerührt und über Nacht stehengelassen, um Niederschläge zu bilden. Die Niederschläge wurden durch Zentrifugieren gewonnen und in SM-Puffer suspendiert (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgSO₄, 50 mM NaCl, 0,01% Gelatine). Dieses T7-Phagenkonzentrat wurde in einem Zentrifugenröhrchen über CsCl-Lösungsschichten geschichtet, die vorsichtig überschichtet wurden (CsCl-Lösungen mit Konzentrationen von 1,267 g/ml, 0,817 g/ml und 0,705 g/ml von der untersten Schicht), und 2 Stunden mit 22000 U/min zentrifugiert, um eine Phagenschicht zu bilden. Eine weiße Bande des Phagen wurde vorsichtig abgetrennt und gegen TE-Puffer dialysiert (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA), um das CsCl zu entfernen. Zur Reinigung der genomischen DNA des T7-Phagen wurde diese Phagen-Lösung mit Phenol behandelt, um das Phagenprotein zu denaturieren.
Das T7-RNA-Polymerase-Gen entspricht den Basenpaaren 3171 bis 5822 in den 39 937 Basenpaaren der genomischen DNA [die gesamte Nucleotidsequenz des genomischen T7-Gens wurde bereits von Dunn et al. berichtet (1983, J. Mol. Biol. 166(4), 477–535), wurde jedoch leicht korrigiert (siehe T7-Phagen-DNA-Sequenz von GeneBank, Zugangs-Nr. V01148 J02518 X00411)]. Diese genomische DNA wurde als Matrize für die PCR verwendet und wie folgt in einen Expressionsvektor kloniert (siehe 9). Das heißt, das für dieses Enzym codierende Gen wurde mittels PCR amplifiziert durch Verwendung eines Primers, der spezifisch ist für die stromaufwärts vom N-Terminus gelegene Aminosäure-Region des T7-RNA-Polymerase-Gens (T7RpoI-N: 5'-ATA TTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA ACA CGA TTA ACA TCG CTA AG-3'), sowie eines Primers, der spezifisch ist für die stromabwärts vom C-Terminus gelegene Aminosäure-Region des T7-RNA-Polymerase-Gens (T7Rpol-C: 5'-ATA TTT TAG CCA TGG TAT AGT GAG TCG TAT TGA TTT GCG-3'), die jeweils eine NcoI-Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende enthielten. Dieses DNA-Fragment wurde mit NcoI verdaut und durch Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel getrennt, die Bande des Ziel-DNA-Fragments wurde aus der Agarose ausgeschnitten und mit Hilfe des Gene Pure Kit (Nippon Gene) gereinigt. Das DNA-Fragment wurde an den pTrc99a-Expressionsvektor (Pharmacia Biotech) ligiert, der mit NcoI verdaut und dephosphoryliert worden war, um pT7R zu konstruieren, das T7-RNA-Polymerase hochgradig exprimierte. Das die Wildtyp-T7-RNA-Polymerase exprimierende Plasmid pT7R wurde in E. coli DH5α transformiert, und die gegen das Antibiotikum Ampicillin resistenten Zellen wurden kultiviert. Der im Expressionsvektor pT7R enthaltene Trc-Promotor wurde durch Zugabe von IPTG zum Kulturmedium aktiviert. Zwei Stunden nach der Zugabe von IPTG wurden die E. coli-Zellen gewonnen, und das Gesamtprotein wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Im Ergebnis wurde nur dann eine Protein-Bande an einer Stelle aufgefunden, die etwa 99 kDa entspricht, was das Molekulargewicht von T7-RNA-Polymerase ist, wenn IPTG zugesetzt wurde. Dieses Protein wurde mit Hilfe einer teilweise modifizierten Variante des früher beschriebenen Verfahrens von Zawadzki, V. et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19, 1948, weiter aufgereinigt (die Einzelheiten können im wesentlichen die gleichen wie die bei dem in Bezugsbeispiel 3 erläuterten Verfahren zur Reinigung mutanter T7-RNA-Polymerase sein), und es zeigte sich, daß es eine RNA-Polymerase-Aktivität aufweist, die in einer T7-Promotor-spezifischen Weise ausgeübt wird.
Bezugsbeispiel 2
Konstruktion von Expressionsplasmiden zur Erzeugung mutanter T7-RNA-Polymerasen
(1) Konstruktion eines Expressionsplasmids zur Erzeugung der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y (siehe 10)
Durch Verwendung von pT7R, in den das Wildtyp-T7-RNA-Polymerase-Gen als Matrize inseriert worden war, wurde mittels PCR eine Mutation in die Region zwischen den HpaI- und NcoI-Restriktionsstellen eingeführt, die der C-terminalen Seite des T7-RNA-Polymerase-Gens entspricht. Genauer gesagt wurde die Region in zwei Fragmente auf der linken und rechten Seite des zu mutierenden Nucleotids aufgeteilt, und diese DNA-Fragmente wurden mittels PCR amplifiziert, wobei die Primer F646Y(+) (5'-GTT GAC GGA AGC CGT ACT CTT TGG AC-3'), in den eine Mutation eingeführt worden war, und F646Y(–) (5'-GTC CAA AGA GTA CGG CTT CCG TCA AC-3') und die Primer T7RNAP-HpaI-N (5'-CGC GCG GTT AAC TTG CTT CCT AG-3') und pTrc99a-pstI-C (5'-GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AG-3') verwendet wurden, die jeweils eine Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende enthielten. Diese DNA-Fragmente hatten komplementäre Regionen, und die Denaturierungs-, Annealing- und Verlängerungsreaktionen dieser Regionen wurden wiederholt, um ein DNA-Fragment herzustellen, in das die gewünschte Mutation eingeführt worden war. Dieses DNA-Fragment wurde gereinigt, indem mittels Agarose-Gelelektrophorese nur das DNA-Fragment mit der gewünschten Größe gewonnen wurde, und dieses wurde wieder amplifiziert, indem es zusammen mit den Primern T7RNAP-HpaI-N und pTrc99a-PstI-C als Matrize verwendet und mit den Restriktionsendonucleasen HpaI und PstI gespalten wurde. Dieses DNA-Fragment wurde mittels 1% Agarose-Gelelektrophorese abgetrennt, und die Bande mit dem gewünschten DNA-Fragment wurde ausgeschnitten und gereinigt. Das HpaI-PstI-DNA-Fragment von pT7R wurde zur Einführung einer Mutation durch dieses DNA-Fragment ersetzt. Der resultie rende pT7R wurde in E. coli DH5α transformiert, und die das mit der Mutation versehene Plasmid tragenden Zellen wurden selektioniert. Schließlich wurde die Nucleotidsequenz bestimmt, um zu bestätigen, ob die Mutation in die gewünschte Stelle eingeführt worden war. So wurde das Expressionsplasmid pT7RF644Y zur Erzeugung der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y erhalten. Zur Herstellung der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y aus diesem Plasmid kann die Expression – wie bei der Herstellung von Wildtyp-T7-RNA-Polymerase – induziert werden durch Zugabe von IPTG zu den kultivierten E. coli-Zellen, die das Plasmid tragen.
(2) Konstruktion des Expressionsplasmids zur Herstellung der mutanten T7-RNA-Polymerase L665P/F677Y (siehe 11 und 12)
Auf der Grundlage der PCR-Technik wie bei der vorstehend angeführten Konstruktion von F644Y wurde die Konstruktion der mutanten T7-RNA-Polymerase L665P/F667Y durchgeführt.
Um die Einführung der Mutation zu erleichtern, wurde zunächst eine XhoI-Restriktionsstelle (CTCGAG) in die T7-RNA-Polymerase-Genregion des Expressionsvektors pT7R mit dem Wildtyp-T7-RNA-Polymerase-Gen eingeführt. Im einzelnen wurde der als Matrize verwendete Expressionsvektor pT7R amplifiziert unter Verwendung eines Primer-Paars aus Primer ApaF1 (5'-CAT CTG GTC GCA TTG GGT CAC-3') und Primer Xho-R (5'-CCA AGT GTT CTC GAG TGG AGA-3') und eines Primer-Paars aus Primer Xho-F (5'-CTA AGT CTC CAC TCG AGA ACA CTT GG-3') und Primer AfIII-R (5'-CAG CCA GCA GCT TAG CAG CAG-3'). Das erstere amplifizierte DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsendonucleasen ApaI und XhoI verdaut, und das letztere DNA-Fragment mit den Restriktionsendonucleasen AfIII und XhoI, und sie wurden mit T4-DNA-Ligase an den Expressionsvektor pT7R ligiert, der vorher mit ApaI und AfIII behandelt worden war. Dieses Reaktionsprodukt wurde in E. coli DH5α transformiert, und es wurden mehrere Kolonien erhalten, die auf einer das Antibiotikum Ampicillin enthaltenden Agar-Platte gezogen wurden. Einige dieser Kolonien wurden selektio niert und kultiviert, und die Plasmid-DNA wurde aus den kultivierten Zellen extrahiert, um das Plasmid pT7R-Xho zu ergeben, in das eine XhoI-Restriktionsstelle in der T7-RNA-Polymerase-Genregion eingeführt worden war (siehe 11). Das Vorhandensein dieser XhoI-Stelle läßt sich belegen anhand der Spaltung durch Behandlung mit der XhoI-Restriktionsendonuclease und Nucleotid-Sequenzierung der DNA. Unter Verwendung dieses Plasmids pT7R-Xho als Matrize wurde eine PCR mit einem Primer-Paar aus Primer Xho-R und Primer 667R (5'-GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT-3') und einem Primer-Paar aus Primer 667F (5'-GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT-3') und Primer AfIIIR durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden direkt als Matrizen für die Nucleotid-Sequenzierung der DNA verwendet, um die Sequenzen der Primer 667R und 667F zu bestimmen. Dann wurde mit ihnen eine Elektrophorese auf 2% Agarose-Gel durchgeführt (wobei Agarose X von Nippon Gene als Agarose verwendet wurde), und die den DNA-Fragmenten der gewünschten Größe entsprechenden Banden wurden ausgeschnitten, um die DNA-Fragmente mit Hilfe des Gene Pure Kit zu reinigen. Die gereinigten beiden Arten von DNA-Fragmenten wurden gemischt und als Matrizen für eine PCR mit den Primern XhoF und AfIIIR eingesetzt. Nach Bestätigung mittels Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung, daß das amplifizierte DNA-Fragment das gewünschte Fragment war, wurde das Fragment mit den Restriktionsendonucleasen XhoI und AfIII verdaut, und das resultierende Fragment wurde mit T4-DNA-Ligase an das Plasmid pT7R-Xho ligiert, das vorher mit den Restriktionsendonucleasen XhoI und AfIII behandelt worden war. Dieses Reaktionsprodukt wurde in E. coli DH5α transformiert, und es wurden mehrere Kolonien der Zellen erhalten, die auf einer das Antibiotikum Ampicillin enthaltenden Agar-Platte gezogen wurden. Einige dieser Kolonien wurden selektioniert und kultiviert, und die Plasmid-DNA wurde aus den kultivierten Zellen extrahiert. Mittels DNA-Sequenzierung wurde bestätigt, ob in die Plasmid-DNA die gewünschte Mutation eingeführt worden war, um schließlich das Expressionsplasmid pT7RL665P/F667Y zur Herstellung der mutanten T7-RNA-Polymerase L665P/F667Y zu konstruieren (siehe 12). Zur Herstellung der mutanten T7-RNA-Polymerase L665P/F667Y aus diesem Plasmid kann die Expression – wie bei der Herstellung von Wildtyp-T7-RNA-Polymerase – in duziert werden durch Zugabe von IPTG zu den kultivierten E. coli-Zellen, die das Plasmid tragen.
Bezugsbeispiel 3
Reinigung der mutanten T7-RNA-Polymerasen
Es wurden die in E. coli eingeführten mutanten T7-RNA-Polymerase-Proteine gereinigt.
Die Wildtypen dieses Proteins sind bereits beschrieben bei Chamberlin, M. et al., Nature, 228, 227–231 (1970); Davanloo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81, 2035–2039 (1984). Von Zawadzki, V. et al., Nucl. Acids Res. 19, 1948 (1991), ist auch dessen Herstellung in großem Maßstab berichtet.
Alle mutanten T7-RNA-Polymerasen können im Prinzip mit der gleichen Methode gereinigt werden. Der Unterschied des Mutationsorts kann zu einigen Unterschieden beim Expressionsgrad und beim Verhalten bei der Säulenchromatographie führen. Das Reinigungsverfahren für die mutante T7-RNA-Polymerase F644Y ist nachstehend beispielhaft dargestellt. Der Expressionsvektor pT7RF644Y für F644Y wurde in E. coli DH5α eingeführt, und die Zellen wurden in einem Reagensglas kultiviert, das ein Kulturmedium mit dem Antibiotikum Ampicillin enthielt. Sobald die OD (600 nm) des Mediums 0,4–0,6 erreicht hatte, wurde Isopropyl-β-thiogalactopyranosid (IPTG) auf eine Endkonzentration von 0,4 mM zur Kultur gegeben, und die Kultivierung wurde weitere 8 Stunden fortgesetzt. Dann wurden die E. coli-Zellen durch Zentrifugieren gewonnen. Typischerweise ergeben 2 Liter Kulturmedium 10 g E. coli-Zellen als Naßgewicht. Werden die E. coli-Zellen nicht sofort verwendet, können sie in einem Kühlschrank bei –20°C oder darunter gelagert werden.
Die nachfolgenden Schritte zur Reinigung des Enzyms sollten bei einer Temperatur durchgeführt werden, die niedriger als Raumtemperatur, vorzugsweise bei 0–5°C, sofern nichts anderes angegeben ist. Die E. coli-Zellen wurden mit dem 10fachen – bezogen auf das Zellengewicht – eines Waschpuffers gewaschen (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 130 mM NaCl, 2 mM EDTANa₂ bei 25°C), nochmals zentrifugiert (5000 × g, 4°C, 10 Minuten), im 10fachen Volumen eines Beschallungspuffers suspendiert [50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTANa₂, 5 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1 mM Benzamidin, 30 μg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 10 μg/ml Bacitracin] und mit einem Sonifier 450 (Branson) bei 80 W über mehr als 15 Minuten beschallt, um die Zellen zu zerstören und die Viskosität der Zellen zu verringern. Dann wurde die Zellsuspension zehn Minuten bei 4°C mit 12000 × g zentrifugiert, um die Zellentrümmer zu entfernen. Der resultierende Überstand wurde unter Rühren langsam und tropfenweise mit 10% Streptomycinsulfat auf eine Endkonzentration von 2,0% versetzt, und das Rühren wurde 30 Minuten fortgesetzt. Der Überstand wurde zehn Minuten bei 4°C mit 12000 × g zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen, und unter Rühren langsam mit Ammoniumsulfat-Pulver versetzt, um einen Niederschlag zu bilden. In diesem Falle wurden die Niederschläge zunächst durch 30% Sättigung mit Ammoniumsulfat gewonnen (30% Ammoniumsulfat-Fällung), und der resultierende Überstand wurde unter Rühren mit weiterem Ammoniumsulfat bis auf 60% Sättigung versetzt, um abermals einen Niederschlag zu bilden (30–60% Ammoniumsulfat-Fällung). Der Überstand wurde wieder mit Ammoniumsulfat-Pulver bis auf 90% Ammoniumsulfat-Sättigung versetzt und 1 Stunde bei 4°C gerührt, und der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen. Aliquote dieser drei Ammoniumsulfat-Fraktionen wurden mittels SDS-Acrylamid-Gelelektrophorese auf Proteine analysiert, und es wurde gefunden, daß der größte Teil der betreffenden mutanten T7-RNA-Polymerase in der 30–60% Ammoniumsulfat-Fraktion vorhanden war. Daher wurde die Reinigung im folgenden unter Verwendung dieser Fraktion durchgeführt. Die 30–60% Ammoniumsulfat-Fraktion wurde in einer kleinen Menge Säulenpuffer suspendiert (20 mM KPO₄, pH 7,7, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 30 μg/ml PMSF) und durch 16stündige Dialyse gegen 500 ml des gleichen Puffers entsalzt. Das Dialysat wurde auf eine Heparin-Sepharose-Säule mit einem Volumen von 5 ml aufgegeben (Pharmacia Biotech). Anschließend wurde die Säule mit dem gleichen Puffer solange gewaschen, bis alles Material, das Ultraviolettstrahlen mit 280 nm absorbierte, verschwunden war und mit einem linearen Gradienten von 0,1 M bis 0,64 M NaCl im gleichen Puffer von etwa dem 40fachen Volumen des Säulenvolumens eluiert. Der Ablauf wurde in Form von Fraktionen eines geeigneten Volumens in Reagensgläsern aufgefangen und zur Protein-Analyse unmittelbar einer SDS-Acrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, um die Fraktionen zu identifizieren, die Proteine mit etwa dem Molekulargewicht enthalten, von dem angenommen wird, daß es der Ziel-T7-RNA-Polymerase entspricht. Bei typischen Beispielen sollte dieses um 0,4 M NaCl aufgefunden werden. Die das Protein enthaltenden Fraktionen wurden aufgefangen und durch 16stündige Dialyse gegen etwa 1 Liter Säulenpuffer (20 mM KPO₄, pH 7,7, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 30 μg/ml PMSF) entsalzt. Die mittels Dialyse entsalzten Fraktionen wurden auf eine Q-Sepharose-Säule (Pharmacia Biotech) von 5 ml Volumen aufgegeben, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, und die Säule wurde mit dem gleichen Puffer solange gewaschen, bis alles Material verschwunden war, das Ultraviolettstrahlen mit 280 nm absorbierte, und mit einem linearen Gradienten von 0,1 M bis 0,64 M NaCl im gleichen Puffer von etwa dem 40fachen Volumen des Säulenvolumens eluiert. Der Ablauf wurde in Form von Fraktionen eines geeigneten Volumens in Reagensgläsern aufgefangen und zur Protein-Analyse unmittelbar einer SDS-Acrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, um die Fraktionen zu identifizieren, die Proteine mit etwa dem Molekulargewicht enthalten, von dem angenommen wird, daß es der Ziel-T7-RNA-Polymerase entspricht. Bei typischen Beispielen sollte dieses um 0,24 M NaCl aufgefunden werden. Die das Protein enthaltenden Fraktionen wurden aufgefangen, 16 Stunden gegen 500 ml Aufbewahrungspuffer (50% Glycerin, 20 mM KPO₄, pH 7,7, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 30 μg/ml PMSF) dialysiert und bis zum Gebrauch bei –20°C aufbewahrt. Die in vitro-RNA-Syntheseaktivität und die Aktivität der verunreinigten Ribonuclease dieser Probe wurden untersucht. Die in vitro-RNA-Syntheseaktivität wurde beispielsweise so untersucht, daß eine RNA-Synthesereaktion gemäß der Enzym-Verdünnungsmethode durchgeführt wurde unter Verwendung des den T7-Promotor enthaltenden Plasmids als Matrize und einer im Handel erhältlichen Wildtyp-T7-RNA-Polymerase (BRL, Gibco) als Standard und mit der synthetisierten RNA eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt wurde, um den ungefähren Titer abzuschätzen. Da hierbei auch der Grad der Zersetzung der RNA bestimmt wird, kann gleichzeitig ein einfacher Assay auf verunreinigte Ribonuclease durchgeführt werden. Als typisches Beispiel wurden 2500000 Einheiten des mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y-Proteins aus 1 Liter Kulturmedium unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Schritte gereinigt, und dieses Präparat war im wesentlichen frei von RNase-Verunreinigung.
Bezugsbeispiel 4
Konstruktion des Expressionsplasmids zur Herstellung der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y/L665P/F667Y (siehe 13)
Auf der Grundlage einer PCR wie bei der Konstruktionsmethode des vorher konstruierten Expressionsplasmids zur Herstellung der mutanten T7-RNA-Polymerase L665P/F667Y (siehe Bezugsbeispiel 2) wurde die Konstruktion der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y/L665P/F667Y wie folgt durchgeführt.
Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung des die mutante T7-RNA-Polymerase L665P/F667Y erzeugenden Expressionsplasmids als Matrize, zusammen mit einem Primer-Paar aus Primer Xho-F und Primer T7-DOUBLE-R (21mer: 5'-CTCTTTGGACCCGTAAGCCAG-3') oder einem Primer-Paar aus Primer T7-DOUBLE-F (29mer: 5'-TTACGGGTCCAAAGAGTACGGCTTCCGTC-3') und Primer AfIII-R. Die PCR-Produkte wurden direkt als Matrizen verwendet und die DNA-Sequenzen bestimmt, um die Sequenzen der Primer T7-DOUBLE-R und T7-DOUBLE-F zu bestätigen. Mit jedem der Produkte wurde eine Elektrophorese auf 2% Agarose-Gel durchgeführt, um das DNA-Fragment mit der beabsichtigten Größe zu reinigen. Die gereinigten beiden Arten von DNA-Fragmenten wurden gemischt und als Matrizen für eine PCR mit den Primern XhoF und AfIIIR eingesetzt. Nach Bestätigung mittels Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung, daß das amplifizierte DNA-Fragment das gewünschte Fragment war, wurde das Fragment mit den Restriktionsendonucleasen XhoI und AfIII verdaut, und das resultierende Fragment wurde mit T4-DNA-Ligase an das Plasmid pT7RL665P/F667Y ligiert, das vorher mit den Restriktionsendonucleasen XhoI und AfIII behandelt worden war. Dieses Reaktionsprodukt wurde in E. coli DH5α transformiert, und es wurden mehrere Kolonien der Zellen erhalten, die auf einer das Antibiotikum Ampicillin enthaltenden Agar-Platte gezogen wurden. Einige dieser Kolonien wurden selektioniert und kultiviert, und die Plasmid-DNA wurde aus den kultivierten Zellen extrahiert. Die Nucleotidsequenz der Plasmid-DNA wurde sequenziert, um zu bestätigen, daß die gewünschte Mutation eingeführt worden war, und so wurde schließlich das Expressionsplasmid pT7RF644Y/L665P/F667Y zur Herstellung der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y/L665P/F667Y konstruiert (siehe 13). Zur Herstellung der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y/L665P/F667Y aus diesem Plasmid kann die Expression – wie bei der Herstellung von Wildtyp-T7-RNA-Polymerase – induziert werden durch Zugabe von IPTG zu den kultivierten E. coli-Zellen, die das Plasmid tragen.
Bezugsbeispiel 5
Reinigung der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y/L665P/F667Y
Die mutante T7-RNA-Polymerase F644Y/L665P/F667Y kann mit der gleichen Methode wie in Bezugsbeispiel 3 gereinigt werden. In einem typischen Beispiel wurden 1000000 Einheiten des mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y/L665P/F667Y-Proteins aus 1 Liter Kulturmedium gereinigt. Die erhaltene RNA-Polymerase wurde im wesentlichen als einzelne Bande nachgewiesen, und es wurde keine RNase in dieser Probe durch SDS-Acrylamid-Gelelektrophorese nachgewiesen.
Synthesebeispiel 1
Synthese von 3'-Desoxy-5-iodcytidin (eine Verbindung entsprechend Verbindung 6 in obigem Syntheseschema, im folgenden als Verbindung 6 bezeichnet; auch die im folgenden verwendeten Verbindungsnummern entsprechen denen in den Syntheseschemata)
3'-Desoxycytidin (Verbindung 5, 3,0 g, 13,2 mmol) wurde in einer gemischten Lösung aus 1,4-Dioxan (300 ml) und Ethanol (30 ml) suspendiert, auf 10°C abgekühlt, mit Silbertrifluoracetat (7,0 g, 31,7 mmol) und Iod (8,04 g, 31,7 mmol) versetzt und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der Niederschlag durch Filtration durch Celite abgetrennt und mit 1,4-Dioxan gewaschen, und das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und eingeengt, um 3,84 g 3'-Desoxy-5-iodcytidin zu ergeben (Verbindung 6, Ausbeute: 82,4%).
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,64–1,70 (m, 1H, 3'-Ha), 1,88–1,99 (m, 1H, 3'-Hb), 3,60–3,89 (m, 2H, 5'-Ha,b), 4,20–4,21 (m, 1H, 4'-H), 4,37–4,39 (m, 1H, 2'-H), 5,59 (s, 1H, 1'-H), 7,58 (brs, 1H, NH₂a), 8,41 (brs, 1H, NH₂b), 8,79 (brs, 1H, 6-H).
Synthesebeispiel 2
Synthese von 5-Trifluoracetamido-1-pentin
Eine Lösung von Natriumhydrid (60% Öl, 5,99 g, 0,15 mol) in DMF (340 ml) wurde unter Eiskühlung portionsweise mit Trifluoracetamid (19,2 g, 0,17 mol) in 10 Portionen versetzt. Dann wurde die Lösung mit Natriumiodid versetzt (20,4 g, 0,136 mol), dann mit einer Lösung von 5-Chlor-1-pentin (13,97 g, 0,136 mol) in Dimethylformamid (DMF, 50 ml) und 4,5 Stunden bei Raumtemperatur und 21 Stunden bei 60°C unter Rühren reagierenlassen. Nachdem die Reaktionsmischung abgekühlt war, wurde sie mit einer wäßrigen Lösung (500 ml) von Kaliumdihydrogenphosphat (59,2 g) versetzt und mit Ether extrahiert (500 ml). Die Ether-Schicht wurde mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Hexan/Ethylacetat-Mischlösungsmittel), um 17,6 g 5-Trifluoracetamido-1-pentin zu ergeben (Ausbeute: 67%).
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 1,83 (m, 2H, -CH₂ CH ₂CH₂-), 2,04 (t, 1H, J = 2,7 Hz, H-CC-), 2,31 (dt, 2H, J = 2,7, 6,6 Hz, -CCCH₂-), 3,52 (q, 2H, J = 6,7 Hz, CH₂N), 6,88 (brs, 1H, NHTfa).
Synthesebeispiel 3
Synthese von 3'-Desoxy-5-(5''-trifluoracetamido-1''-pentinyl)cytidin
Zu einer Lösung von 3'-Desoxy-5-iodcytidin (Verbindung 6, 777 mg, 2,20 mmol) in DMF (11 ml) wurden das in Synthesebeispiel 2 erhaltene 5-Trifluoracetamido-1-pentin (1,18 g, 6,60 mmol), Kupfer(I)-iodid (83,8 mg, 0,44 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (254 mg, 0,22 mmol) und Triethylamin (0,613 ml, 4,4 mmol) unter einem Strom aus Stickstoff-Gas zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde mit einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (20 ml) verdünnt, mit Ionenaus tauscherharz AG1X8 (BIO-RAD, HCO₃ ^–-Typ, 2,02 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt und der Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/Methanol-Mischlösungsmittel) und aus einer Methanol/Ether-Mischung kristallisiert, um 409 mg einer neuen Substanz, 3'-Desoxy-5-(5''-trifluoracetamido-1''-pentinyl)cytidin, zu ergeben (Ausbeute: 46,0%).
Schmelzpunkt: 191–193°C.
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,63–1,78 (m, 3H, 3'-Ha und CH₂ CH ₂CH₂N), 1,86–1,96 (m, 1H, 3'-Hb), 2,39–2,44 (m, 2H, CH ₂CH₂CH₂N), 3,27–3,31 (m, 2H, CH₂N), 3,51–3,82 (m, 2H, 5'-Ha,b), 4,12–4,31 (m, 2H, 2'-H und 4'-H), 5,15 (t, 1H, J = 5,1 Hz, 5'-OH), 5,51 (d, 1H, J = 4,1 Hz, 2'-OH), 5,62 (s, 1H, 1'-H), 6,69 (brs, 1H, 4-NHa), 7,64 (brs, 1H, 4-NHb), 8,30 (s, 1H, 6-H), 9,50 (brs, 1H, NHTfa).
Synthesebeispiel 4
Synthese von Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphat
Tetranatriumpyrophosphat-decahydrat (2,23 g) wurde in Wasser gelöst (50 ml), und auf eine Säule mit Ionenaustauscherharz Dowex 50WX8 (Dowex, H⁺-Typ, 45 ml) gegeben. Die Säule wurde mit Wasser eluiert, und der Ablauf wurde aufgefangen, bis der pH im wesentlichen neutral war. Der Ablauf wurde mit Tri-n-butylamin versetzt (3,55 ml) und ausreichend gerührt. Die Mischung wurde unter vermindertem Druck eingeengt, und der Rückstand wurde durch azeotrope Destillation mit Ethanol, Pyridin und DMF weiter zur Trockene eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde in trockenem DMF auf ein Gesamtvolumen von 10 ml gelöst, um eine 0,5 M-Konzentration von Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphat zu ergeben.
Synthesebeispiel 5
Synthese von 5-(5''-Amino-1''-pentinyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat
3'-Desoxy-5-(5''-trifluoracetamido-1''-pentinyl)cytidin (121 mg, 0,3 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,21 ml), auf –20°C abgekühlt, dann mit Phosphoroxychlorid versetzt (25 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (22 μl) versetzt und weitere 5 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M-Lösung des in Synthesebeispiel 4 erhaltenen Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphats in DMF (3,6 ml) gegeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (5 ml), über Nacht stehengelassen, dann mit 25% wäßrigem Ammoniak versetzt (20 ml) und 4 Stunden stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether gewaschen und zur Trockene eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (Tosoh Corporation, 1,7 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 105 mg einer neuen Substanz, 5-(5''-Amino-1''-pentinyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat, zu ergeben (Ausbeute: 36,6%).
Synthesebeispiel 6
Synthese von XR-markiertem 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 3)
5-(5''-Amino-1''-pentinyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat (8 μmol), gelöst in einer Mischung aus DMF (300 μl) und Wasser (300 μl), wurde mit Triethylamin (10 μl) und 5-Carboxyrhodamin X-succinimidester (Molecular Probe, 26,9 μmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wur de mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 15 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,1 M → 0,7 M (Gesamtvolumen: 2 l)), um 6,28 μmol (Ausbeute: 78,5%) XR-markiertes 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dargestellt ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 3; im folgenden abgekürzt als XR-3'dCTP(n3)].
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen XR-3'dCTP(n3) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellenlänge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 14 gezeigt.
Synthesebeispiel 7
Synthese von 6-Trifluoracetamido-1-hexin
1) Synthese von 5-Hexinyl-p-toluolsulfonat
Eine eisgekühlte Lösung von p-Toluolsulfonylchlorid (20,11 g, 105,5 mmol) in Pyridin (30 ml) wurde tropfenweise mit 5-Hexin-1-ol (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.; 10 ml, 91,7 mmol) versetzt und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser versetzt (15 ml), gerührt und dann in Wasser gegossen (500 ml). Diese Lösung wurde mit Ether extrahiert (300 ml), und die Ether-Schicht wurde mit kalter 1 N Salzsäure, gesättigtem wäß rigem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, um 7,33 g 5-Hexinyl-p-toluolsulfonat zu ergeben (Ausbeute: 32%).
2) Synthese von 6-Iod-1-hexin
Eine Mischung aus 5-Hexinyl-p-toluolsulfonat (7,33 g, 33,3 mmol), Natriumiodid (4,99 g, 33,3 mmol) und Aceton (37 ml) wurde eine Stunde am Rückfluß reagierenlassen. Nach Abkühlen wurde der Niederschlag durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Hexan), um 3,31 g 6-Iod-1-hexin zu ergeben (Ausbeute: 54,8%).
3) Synthese von 6-Trifluoracetamido-1-hexin
Eine Lösung von Natriumhydrid (60% Öl, 2,55 g, 63,6 mol) in DMF (50 ml), wurde unter Eiskühlung portionsweise mit Trifluoracetamid (8,99 g, 79,6 mmol) in etwa 10 Portionen versetzt. Anschließend wurde eine Lösung von 6-Iod-1-hexin (3,31 g, 15,9 mmol) in DMF (15 ml) zur Reaktionsmischung gegeben. Die Reaktionsmischung wurde vier Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit gesättigtem wäßrigem Ammoniumchlorid (100 ml) und Ether (100 ml) zur Extraktion versetzt. Die Ether-Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Hexan/Ethylacetat-Mischlösungsmittel), um 2,0 g 6-Trifluoracetamido-1-hexin zu ergeben (Ausbeute: 65,4%).
Schmelzpunkt: 41,0–42,5°C.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 1,53–1,80 (m, 4H, -CH₂ CH ₂-), 1,98 (t, 1H, J = 2,7 Hz, H-CC-), 2,26 (dt, 2H, J = 2,5, 6,7 Hz, CC-CH₂-), 3,41 (q, 2H, J = 6,8 Hz, CH₂-N), 6,48 (brs, 1H, NHTfa).
Synthesebeispiel 8
Synthese von 3'-Desoxy-5-(6''-trifluoracetamido-1''-hexinyl)cytidin (Verbindung 7)
Zu einer Lösung von 3'-Desoxy-5-iodcytidin (Verbindung 6, 800 mg, 2,27 mmol) in DMF (11,4 ml) wurden das in Synthesebeispiel 7 erhaltene 6-Trifluoracetamido-1-hexin (1,31 g, 6,80 mmol), Kupfer(I)-iodid (86,3 mg, 0,453 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (262 mg, 0,227 mmol) und Triethylamin (0,632 ml, 4,53 mmol) unter einem Strom aus Stickstoff-Gas zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde mit einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (20 ml) verdünnt, mit Ionenaustauscherharz AG1X8 (HCO₃ ^–-Typ, 2,02 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/Methanol-Mischlösungsmittel) und aus einer Methanol/Ether-Mischung kristallisiert, um 399 mg einer neuen Substanz, 3'-Desoxy-5-(6''-trifluoracetamido-1''-hexinyl)cytidin, zu ergeben (Verbindung 7, Ausbeute: 42,1%).
Schmelzpunkt: 195–197°C.
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,52–1,69 (m, 5H, 3'-Ha und CH₂ CH ₂ CH ₂CH₂N), 1,86–1,96 (m, 1H, 3'-Hb), 2,39–2,50 (m, 2H, CCH₂-), 3,18–3,28 (m, 2H, CH₂N), 3,50–3,83 (m, 2H, 5'-Ha,b), 4,11–4,33 (m, 2H, 2'-H und 4'-H), 5,14 (t, 1H, J = 4,9 Hz, 5'-OH), 5,50 (d, 1H, J = 4,0 Hz, 2'-OH), 5,62 (s, 1H, 1'-H), 6,65 (brs, 1H, 4-NHa), 7,59 (brs, 1H, 4-NHb), 8,29 (s, 1H, 6-H), 9,41 (brs, 1H, NHTfa).
Synthesebeispiel 9
Synthese von 5-(6''-Amino-1''-hexinyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung 8)
3'-Desoxy-5-(6''-trifluoracetamido-1''-hexinyl)cytidin (Verbindung 7, 125,5 mg, 0,3 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,26 ml), auf –20°C abgekühlt, mit Phosphoroxychlorid versetzt (25,11 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (22,32 μl) versetzt und weitere 5 Stunden gerührt. Diese Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M-Lösung von Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphat in DMF (3,6 ml) gegeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (4 ml), über Nacht stehengelassen, mit 25% wäßrigem Ammoniak versetzt (20 ml) und 4 Stunden stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether gewaschen und zur Trockene eingeengt, und der erhaltene Rückstand wurde durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 200 mg einer neuen Substanz, 5-(6''-Amino-1''-hexinyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat, zu ergeben (Verbindung 8, Ausbeute: 69,0%).
Synthesebeispiel 10
Synthese von XR-markiertem 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4)
5-(6''-Amino-1''-hexinyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphate (Verbindung 8, 10 μmol), gelöst in einer Mischung aus DMF (300 μl) und Wasser (300 μl), wurde mit Triethylamin (10 μl) und 5-Carboxyrhodamin X-succinimidester (Molecular Probe, 15 μmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Re aktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 15 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,1 → 0,7 M (Gesamtvolumen: 2 l)), um 8,02 μmol (Ausbeute: 80,2%) XR-markiertes 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dargestellt ist und worin n der Methylen-Kette im Linker-Abschnitt 4 ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4; im folgenden abgekürzt als XR-3'dCTP(n4)].
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen XR-3'dCTP(n4) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellenlänge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 15 gezeigt.
Synthesebeispiel 11
Synthese von 8-Trifluoracetamido-1-octin
1) Synthese von 7-Octin-1-ol
Eine Suspension von Lithiumacetylid-Ethylendiamin-Komplex (Aldrich, 11,3 g, 122,5 mmol) und Dimethylsulfoxid (50 ml) wurde auf 5–10°C abgekühlt und über zwei Stunden tropfenweise mit 1-Brom-6-tetrahydropyranyloxyhexan (Sigma, 25 g, 94,3 mmol) versetzt. Dann wurde die Reaktionsmischung zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser versetzt (10 ml), zehn Minuten gerührt, dann in Wasser gegossen (150 ml) und mit Ether extrahiert (300 ml). Die Ether-Schicht wurde mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, um 18,1 g 8-(Tetrahydropyranyloxy)-1-octin als Öl zu ergeben (Ausbeute: 91,2%). Dowex 50WX8 (H⁺-Typ, 18 g) wurde zu einer Mischung aus 8-(Tetrahydropyranyloxy)-1-octin (18 g, 85,6 mmol), Chloroform (40 ml) und Methanol (140 ml) gegeben, und es wurde 1 Stunde am Rückfluß erhitzt. Nach Abtrennung des Harzes durch Filtration wurde das Filtrat eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Hexan/Ethylacetat-Mischlösungsmittel), um 9,6 g 7-Octin-1-ol zu ergeben (Ausbeute: 88,6%).
2) Synthese von 7-Octinyl-p-toluolsulfonat
Eine eisgekühlte Lösung von p-Toluolsulfonylchlorid (17,4 g, 91,3 mmol) in Pyridin (30 ml) wurde tropfenweise mit 7-Octin-1-ol (9,6 g, 76,1 mmol) versetzt und 20 Stunden bei 5–10°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser versetzt (15 ml), gerührt, dann in Wasser gegossen (500 ml) und mit Ether extrahiert (500 ml). Die Ether-Schicht wurde mit kalter 1 N Salzsäure, gesättigtem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, um 18,3 g 7-Octinyl-p-toluolsulfonat zu ergeben (Ausbeute; 85,7%).
3) Synthese von 8-Iod-1-octin
Eine Mischung aus 7-Octinyl-p-toluolsulfonat (18,3 g, 65,2 mmol), Natriumiodid (9,77 g, 65,2 mmol) und Aceton (91 ml) wurde vier Stunden am Rückfluß reagierenlassen. Nach Abkühlen wurde der Niederschlag durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Hexan), um 14,5 g 8-Iod-1-octin zu ergeben (Ausbeute: 94,2%).
4) Synthese von 8-Trifluoracetamido-1-octin
Eine Lösung von Natriumhydrid (60% Öl, 9,82 g, 245 mmol) in DMF (200 ml) wurde unter Eiskühlung portionsweise mit Trifluoracetamid (34,7 g, 307 mmol) in 10 Portionen versetzt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit einer Lösung von 8-Iod-1-octin (14,5 g, 61,4 mmol) in DMF (60 ml) versetzt und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit gesättigtem wäßrigem Ammoniumchlorid (400 ml) und Ether (400 ml) zur Extraktion versetzt. Die Ether-Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Hexan/Ethylacetat-Mischlösungsmittel) und aus Hexan kristallisiert, um 10,8 g 8-Trifluoracetamido-1-octin zu ergeben (Ausbeute: 79,3%).
Schmelzpunkt: 29,5–30,0°C.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 1,36–1,63 (m, 8H, -CH₂(CH ₂)₄-), 1,94 (t, 1H, J = 2,7 Hz, H-CC-), 2,20 (dt, 2H, J = 2,5, 6,7 Hz, CC-CH₂-), 3,37 (q, 2H, J = 6,8 Hz, CH₂-N), 6,28 (brs, 1H, NHTfa).
Synthesebeispiel 12
Synthese von 3'-Desoxy-5-(8''-trifluoracetamido-1''-octinyl)cytidin (Verbindung 9)
Zu einer Lösung von 3'-Desoxy-5-iodcytidin (Verbindung 6, 450 mg, 1,27 mmol) in DMF (6,4 ml) wurden das in Synthesebeispiel 11 erhaltene 8-Trifluoracetamido-1-octin (846 mg, 3,82 mmol), Kupfer(I)-iodid (48,5 mg, 0,25 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (147 mg, 0,127 mmol) und Triethylamin (0,355 ml, 2,55 mmol) unter einem Strom aus Stickstoff-Gas zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde mit einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (12 ml) verdünnt, mit Ionenaustauscherharz AG1X8 (HCO₃ ^–-Typ, 1,17 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt, und der Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/Methanol-Mischlösungsmittel) und aus einer Methanol/Ether- Mischung kristallisiert, um 219 mg einer neuen Substanz, 3'-Desoxy-5-(8''-trifluoracetamido-1''-octinyl)cytidin, zu ergeben (Verbindung 9, Ausbeute: 38,5%).
Schmelzpunkt: 165–167°C.
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,27–1,54 (m, 8H, -(CH ₂)₄-), 1,63–1,69 (m, 1H, 3'-Ha), 1,86–1,97 (m, 1H, 3'-Hb), 2,37 (t, 2H, J = 7,0 Hz, CCCH₂), 3,14–3,21 (m, 2H, CH₂N), 3,49–3,56 (m, 1H, 5'-Ha), 3,75–3,81 (m, 1H, 5'-Hb), 4,08–4,31 (m, 2H, 2'-H und 4'-H), 5,13 (t, 1H, J = 5,0 Hz, 5'-OH), 5,49 (d, 1H, J = 4,1 Hz, 2'-OH), 5,62 (d, 1H, J = 1,4 Hz, 1'-H), 6,62 (brs, 1H, 4-NHa), 7,58 (brs, 1H, 4-NHb), 8,28 (s, 1H, 6-H), 9,41 (brs, 1H, NHTfa).
Synthesebeispiel 13
Synthese von 5-(8''-Amino-1''-octinyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung 10)
3'-Desoxy-5-(8''-trifluoracetamido-1''-octinyl)cytidin (Verbindung 9, 134 mg, 0,3 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,34 ml), auf –20°C abgekühlt, mit Phosphoroxychlorid versetzt (25,11 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (22,32 μl) versetzt und weitere 3,5 Stunden gerührt. Diese Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M-Lösung von Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphat in DMF (3,6 ml) gegeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (5 ml), über Nacht stehengelassen, dann mit 25% wäßrigem Ammoniak versetzt (20 ml) und 4 Stunden stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether gewaschen und zur Trockene eingeengt, und der erhaltene Rückstand wurde durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamt volumen: 1 l)), um 262 mg einer neuen Substanz, 5-(8''-Amino-1''-octinyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat, zu ergeben (Verbindung 10, Ausbeute: 50,0%).
Synthesebeispiel 14
Synthese von XR-markiertem 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 6)
5-(8''-Amino-1''-octinyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung 10, 8 μmol), gelöst in einer Mischung aus DMF (300 μl) und Wasser (300 μl), wurde mit Triethylamin (10 μl) und 5-Carboxyrhodamin X-succinimidester (Molecular Probe, 12 μmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 15 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,1 M → 0,7 M (Gesamtvolumen: 2 l)), um 5,34 μmol (Ausbeute: 66,7%) XR-markiertes 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dargestellt ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 6; im folgenden abgekürzt als XR-3'dCTP(n6)].
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen XR-3'dCTP(n6) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellenlänge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 16 gezeigt.
Synthesebeispiel 15
Synthese von 6-Chlor-9-{2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-O-[(imidazol-1''-yl)-thiocarbonyl]-β-D-ribofuranosyl}-7-desazapurin (Verbindung 13)
6-Chlor-9-(β-D-ribofuranosyl)-7-desazapurin (Verbindung 11, 3,58 g, 12,5 mmol) wurde in THF gelöst (160 ml), mit Pyridin (5,1 ml, 62,7 mmol), Silbernitrat (4,16 g, 27,6 mmol) und tert-Butyldimethylsilylchlorid (4,16 g, 27,6 mmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der Niederschlag durch Filtration durch Celite abgetrennt, das Filtrat wurde eingeengt, in Chloroform gelöst und mit 0,2 N Salzsäure und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die Chloroform-Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und das Chloroform wurde abgedampft, um 6,42 g einer neuen Substanz, 6-Chlor-9-[2,5-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-β-D-ribofuranosyl]-7-desazapurin (Verbindung 12), quantitativ zu ergeben. Diese Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in DMF gelöst (120 ml), mit 1,1'-Thiocarbonyldiimidazol versetzt (13,36 g, 75,0 mmol) und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat und Wasser versetzt, und die organische Schicht wurde mit gesättigter Salzlösung gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Ethylacetat/n-Hexan-Mischlösungsmittel), um 4,03 g einer neuen Substanz, 6-Chlor-9-{2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-O-[(imidazol-1-yl)thiocarbonyl]-β-D-ribofuranosyl}-7-desazapurin (Verbindung 13), zu ergeben (Ausbeute: 51,5%).
Synthesebeispiel 16
Synthese von 6-Chlor-9-[2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl]-7-desazapurin (Verbindung 14)
6-Chlor-9-{2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-O-[(imidazol-1-yl)thiocarbonyl]-β-D-ribofuranosyl}-7-desazapurin (Verbindung 13, 4,0 g, 6,41 mmol) wurde in Toluol gelöst (200 ml), mit 2,2'-Azobis(isobutyronitril) (0,21 g, 1,3 mmol) und Tri-n-butylzinnhydrid (3,45 ml, 13 mmol) versetzt und unter einem Strom aus Stickstoff-Gas 30 Minuten bei 80°C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Toluol verdampft, und der Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Ethylacetat/n-Hexan-Mischlösungsmittel), um 2,60 g einer neuen Substanz, 6-Chlor-9-[2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl]-7-desazapurin (Verbindung 14), zu ergeben (Ausbeute: 81,5%).
Synthesebeispiel 17
Synthese von 6-Chlor-9-(3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl)-7-desazapurin (Verbindung 15)
6-Chlor-9-[2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl]-7-desazapurin (Verbindung 14, 2,6 g, 5,2 mmol) wurde in THF gelöst (30 ml), mit 1 M Tetrabutylammoniumfluorid versetzt (12,5 ml, 12,5 mmol) und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt und mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/Methanol-Mischlösungsmittel), um quantitativ 1,47 g einer neuen Substanz, 6-Chlor-9-(3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl)-7-desazapurin (Verbindung 15), zu ergeben.
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,93, 2,23 (m, 2H, 3'-Ha, b), 3,55, 3,71 (2dd, 2H, J = 4,1, 11,9; 3,2, 11,6 Hz, 5'-Ha, b), 4,36 (m, 1H, 2'-H), 4,45 (m, 1H, 4'-H), 5,02 (brs, 1H, 5'-OH), 5,66 (brs, 1H, 2'-OH), 6,19 (d, 1H, J = 2,4 Hz, 1'-H), 6,70 (d, 1H, J = 3,8 Hz, 7-H), 8,02 (d, 1H, J = 4,1 Hz, 8-H), 8,66 (s, 1H, 2-H).
Synthesebeispiel 18
Synthese von 6-Chlor-9-(3'-desoxy-2',5'-di-O-acetyl-β-D-ribofuranosyl)-7-desazapurin (Verbindung 16)
6-Chlor-9-(3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl)-7-desazapurin (Verbindung 15, 1,47 g, 5,45 mmol) wurde in Pyridin gelöst (15 ml), mit Acetanhydrid versetzt (5 ml) und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung auf 0°C abgekühlt, mit Methanol versetzt (5 ml) und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in Chloroform gelöst und mit 0,5 N Salzsäure und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die Chloroform-Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und das Chloroform wurde quantitativ verdampft, um 2,00 g einer neuen Substanz, 6-Chlor-9-(3'-desoxy-2',5'-di-O-acetyl-β-D-ribofuranosyl)-7-desazapurin (Verbindung 16), zu ergeben.
Synthesebeispiel 19
Synthese von 6-Chlor-7-iod-9-(3'-desoxy-2',5'-di-O-acetyl-β-D-ribofuranosyl)-7-desazapurin (Verbindung 17)
6-Chlor-9-(3'-desoxy-2',5'-di-O-acetyl-β-D-ribofuranosyl)-7-desazapurin (Verbindung 16, 1,44 g, 4,07 mmol) wurde in Acetonitril gelöst (67 ml), mit Cer(IV)-diammoniumnitrat (0,62 g, 2,44 mmol) und Iod (1,12 g, 2,03 mmol) versetzt und 30 Minuten bei 80°C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Acetonitril unter vermindertem Druck eingeengt, der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und mit 5% Natriumhydrogensulfit-Lösung, gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft, und der Rückstand wurde aus Methylenchlorid/Ether kristallisiert, um 1,46 g einer neuen Substanz, 6-Chlor-7-iod-9-(3'-desoxy-2',5'-di-O-acetyl-β-D-ribofuranosyl)-7-desazapurin (Verbindung 17), zu ergeben (Ausbeute: 75,0%).
Schmelzpunkt: 149–150°C.
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 2,14, 2,17 (2s, 6H, 2Ac), 2,23–2,49 (m, 2H, 3'-Ha, b), 4,25–4,48 (m, 2H, 5'-Ha, b), 4,58–4,68 (m, 1H, 4'-H), 5,52–5,54 (m, 1H, 2'-H), 6,33 (d, 1H, J = 1,4 Hz, 1'-H), 7,64 (s, 1H, 8-H), 8,63 (s, 1H, 2-H).
Synthesebeispiel 20
Synthese von 7-Iod-3'-desoxy-7-desazaadenosin (Verbindung 18)
6-Chlor-7-iod-9-(3'-desoxy-2',5'-di-O-acetyl-β-D-ribofuranosyl)-7-desazapurin (Verbindung 17, 1,63 g, 3,40 mmol) und Ammoniak/Methanol (70 ml) wurden 20 Stunden bei 110°C reagierenlassen. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt, und es wurde aus Methanol kristallisiert, um 1,00 g einer neuen Substanz, 7-Iod-3'-desoxy-7-desazaadenosin (Verbindung 18), zu ergeben (Ausbeute: 78,8%).
Schmelzpunkt: 223–225°C (Zersetzung).
Synthesebeispiel 21
Synthese von 7-Desaza-7-(6''-trifluoracetamido-1''-hexinyl)-3'-desoxyadenosin (Verbindung 19)
Zu einer Lösung von 7-Iod-3'-desoxy-7-desazaadenosin (Verbindung 18, 220 mg, 0,585 mmol) in DMF (3 ml) wurden das in Synthesebeispiel 7 erhaltene 6-Trifluoracetamido-1-hexin (339 mg, 1,75 mmol), Kupfer(I)-iodid (22,3 mg, 0,117 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (67,5 mg, 0,058 mmol) und Triethylamin (0,163 ml, 1,17 mmol) unter einem Strom aus Stickstoff-Gas zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur reagierenlassen. Die Reakti onsmischung wurde mit einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (6 ml) verdünnt, mit Ionenaustauscherharz AG1X8 (HCO₃ ^–-Typ, 0,55 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/Methanol-Mischlösungsmittel) und aus einer Methanol/Ether-Mischung kristallisiert, um 210 mg einer neuen Substanz, 7-Desaza-7-(6''-trifluoracetamido-1''-hexinyl)-3'-desoxyadenosin (Verbindung 19), zu ergeben (Ausbeute: 81,6%).
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,55–1,63 (m, 4H, -(CH₂)₂-), 1,83–1,92 (m, 1H, 3'-Ha), 2,13–2,24 (m, 1H, 3'-Hb), 2,47–2,52 (m, 2H, CCCH₂-), 3,16–3,24 (m, 2H, CH₂N), 3,46–3,54 (m, 1H, 5'-Ha), 3,62–3,68 (m, 1H, 5'-Hb), 4,23–4,38 (m, 2H, 2'-H und 4'-H), 5,03 (t, 1H, J = 5,5 Hz, 5'-OH), 5,56 (d, 1H, J = 4,3 Hz, 2'-OH), 6,01 (d, 1H, J = 2,2 Hz, 1'-H), 6,60 (brs, 2H, 6-NH₂), 7,65 (s, 1H, 8-H), 8,11 (s, 1H, 2-H), 9,44 (brs, 1H, NHTfa).
Synthesebeispiel 22
Synthese von 7-Desaza-7-(6''-amino-1''-hexinyl)-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (Verbindung 20)
7-Desaza-7-(6''-trifluoracetamido-1''-hexinyl)-3'-desoxyadenosin (Verbindung 19, 181 mg, 0,41 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,81 ml), auf –20°C abgekühlt, dann mit Phosphoroxychlorid versetzt (34,32 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (30,5 μl) versetzt und weitere vier Stunden gerührt.
Diese Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M-Lösung von Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphat in DMF (4,9 ml) gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (5 ml), über Nacht stehengelassen, mit 25% wäßrigem Ammoniak versetzt (20 ml) und 4 Stunden stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether gewaschen und zur Trockene eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,2 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 283 mg einer neuen Substanz, 7-Desaza-7-(6''-amino-1''-hexinyl)-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (Verbindung 20), zu ergeben (Ausbeute: 69,6%).
Synthesebeispiel 23
Synthese von R6G-markiertem 7-Desaza-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4)
7-Desaza-7-(6''-amino-1''-hexinyl)-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (Verbindung 20, 8 μmol), gelöst in einer Mischung aus DMF (0,6 ml) und Wasser (0,3 ml), wurde mit Triethylamin (10 μl) und einer Lösung von 5-Carboxyrhodamin 6G-succinimidester (Molecular Probe, 16 μmol) in DMF (1,3 ml) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,2 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,1 M → 0,6 M (Gesamtvolumen: 2 l)), um 5,33 μmol (Ausbeute: 66,7%) R6G-markiertes 7-Desaza-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dargestellt ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4; im folgenden abgekürzt als R6G-3'dATP(n4)].
In der Formel bedeutet Et eine Ethyl-Gruppe, und Me bedeutet eine Methyl-Gruppe.
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen R6G-3'dATP(n4) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellenlänge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 17 gezeigt.
Synthesebeispiel 24
Synthese von 7-Desaza-7-(8''-trifluoracetamido-1''-octinyl)-3'-desoxyadenosin (Verbindung 21)
Zu einer Lösung von 7-Iod-3'-desoxy-7-desazaadenosin (Verbindung 18, 220 mg, 0,585 mmol) in DMF (3 ml) wurden das in Synthesebeispiel 11 erhaltene 8-Trifluoracetamido-1-octin (388 mg, 1,75 mmol), Kupfer(I)-iodid (22,3 mg, 0,117 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (67,5 mg, 0,058 mmol) und Triethylamin (0,163 ml, 1,17 mmol) unter einem Strom aus Stickstoff-Gas zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde mit einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (6 ml) verdünnt, mit Ionenaustauscherharz AG1X8 (HCO₃ ^–-Typ, 0,55 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/Methanol-Mischlösungs mittel) und aus einer Methanol/Ether-Mischung kristallisiert, um 216 mg einer neuen Substanz, 7-Desaza-7-(8''-trifluoracetamido-1''-octinyl)-3'-desoxyadenosin (Verbindung 21), zu ergeben (Ausbeute: 78,7%).
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,29–1,58 (m, 8H, (m, 8H, -(CH₂)₄-), 1,83–1,91 (m, 1H, 3'-Ha), 2,14–2,24 (m, 1H, 3'-Hb), 2,44–2,51 (m, 2H, CCCH₂), 3,15–3,22 (m, 2H, CH₂N), 3,46–3,54 (m, 1H, 5'-Ha), 3,62–3,70 (m, 1H, 5'-Hb), 4,26–4,36 (m, 2H, 2'-H und 4'-H), 5,04 (t, 1H, J = 5,4 Hz, 5'-OH), 5,56 (d, 1H, J = 4,6 Hz, 2'-OH), 6,01 (d, 1H, J = 2,4 Hz, 1'-H), 6,60 (brs, 2H, 6-NH₂), 7,65 (s, 1H, 8-H), 8,11 (s, 1H, 2-H), 9,38 (brs, 1H, NHTfa).
Synthesebeispiel 25
Synthese von 7-Desaza-7-(8''-amino-1''-octinyl)-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (Verbindung 22)
7-Desaza-7-(8''-trifluoracetamido-1''-octinyl)-3'-desoxyadenosin (Verbindung 21, 189 mg, 0,403 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,89 ml), auf –20°C abgekühlt, dann mit Phosphoroxychlorid versetzt (33,7 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (30,0 μl) versetzt und weitere vier Stunden gerührt.
Diese Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M-Lösung von Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphat in DMF (4,8 ml) gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (15 ml), über Nacht stehengelassen, mit 25% wäßrigem Ammoniak versetzt (20 ml) und 4 Stunden stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether gewaschen und zur Trockene eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,2 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,6 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 143 mg einer neuen Substanz, 7-Desaza-7-(8''-amino-1''-octinyl)-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (Verbindung 22), zu ergeben (Ausbeute: 35%).
Synthesebeispiel 26
Synthese von R6G-markiertem 7-Desaza-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 6)
7-Desaza-7-(8''-amino-1''-octinyl)-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (Verbindung 22, 8 μmol), gelöst in einer Mischung aus DMF (0,6 ml) und Wasser (0,3 ml), wurde mit Triethylamin (10 μl) und einer Lösung von 5-Carboxyrhodamin 6G-succinimidester (Molecular Probe, 16 μmol) in DMF (1,3 ml) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,2 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,1 M → 0,6 M (Gesamtvolumen: 2 l)), um 4,3 μmol (Ausbeute: 53,8%) R6G-markiertes 7-Desaza-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dargestellt ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 6; im folgenden abgekürzt als R6G-3'dATP(n6)].
In der Formel bedeutet Et eine Ethyl-Gruppe, und Me bedeutet eine Methyl-Gruppe.
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen R6G-3'dATP(n6) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellenlänge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 18 gezeigt.
Synthesebeispiel 27
Synthese von 3'-Desoxy-5-ioduridin (Verbindung 2)
3'-Desoxyuridin (Verbindung 1, 2,08 g, 9,11 mmol) wurde in Essigsäure gelöst (75 ml), mit Cer(IV)-diammoniumnitrat (2,50 g, 4,56 mmol) und Iod (1,39 g, 2,73 mmol) versetzt und 30 Minuten bei 80°C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt und dann weiter eingeengt durch dreimalige azeotrope Destillation mit einer Ethanol/Toluol-Mischung (1 : 2 Vol./Vol.; 30 ml) und dreimalige azeotrope Destillation mit einer Wasser/Ethanol-Mischung (1 : 2 Vol./Vol.; 30 ml), um ein öliges Produkt zu ergeben. Der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Methylenchlorid/Methanol-Mischlösungsmittel), um 1,78 g 3'-Desoxy-5-ioduridin zu ergeben (Verbindung 2, Ausbeute: 55,08%).
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,89–1,92 (m, 1H, 3'-Ha), 2,17–2,26 (m, 1H, 3'-Hb), 3,51–3,56 (m, 1H, 5'-Ha), 3,74–3,79 (m, 1H, 5'-Hb), 4,22–4,30 (m, 2H, 2'-H und 4'-H), 5,59 (s, 1H, 1'-H), 8,31 (s, 1H, 6-H), 11,72 (s, 1H, NH).
Synthesebeispiel 28
Synthese von 3'-Desoxy-5-(6''-trifluoracetamido-1''-hexinyl)uridin (Verbindung 3)
Zu einer Lösung von 3'-Desoxy-5-ioduridin (Verbindung 2, 805 mg, 2,27 mmol) in DMF (12 ml), wurden das in Synthesebeispiel 7 erhaltene 5-Trifluoracetamido-1-hexin (1,31 g, 6,80 mmol), Kupfer(I)-iodid (86,3 mg, 0,453 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (262 mg, 0,227 mmol) und Triethylamin (0,63 ml, 4,53 mmol) unter einem Strom aus Stickstoff-Gas zugesetzt und vier Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde in einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (20 ml) gelöst, mit Ionenaustauscherharz AG1X8 (BIO-RAD, HCO₃ ^–-Typ, 2 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt und der Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Methylenchlorid/Methanol-Mischlösungsmittel), um 419 mg einer neuen Substanz, 3'-Desoxy-5-(6''-trifluoracetamido-1''-hexinyl)uridin (Verbindung 3), zu ergeben (Ausbeute: 45,5%).
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,49–1,64 (m, 4H, -(CH₂)₂-), 1,92–1,97 (m, 1H, 3'-Ha), 2,17–2,28 (m, 1H, 3'-Hb), 2,39 (t, 2H, J = 6,9 Hz, -CCCH₂), 3,21 (q, 2H, J = 6,3 Hz, CH₂N), 3,49–3,54 (m, 1H, 5'-Ha), 3,72–3,75 (m, 1H, 5'-Hb), 4,24–4,35 (m, 2H, 2'-H und 4'H), 5,20 (t, 1H, J = 4,9 Hz, 5'-OH), 5,52 (d, 1H, J 3,8 Hz, 2'-OH), 5,75 (s, 1H, J = 2,2 Hz, 1'-H), 8,23 (s, 1H, 6-H), 9,42 (brs, 1H, NHTfa), 11,57 (s, 1H, 3-NH).
Synthesebeispiel 29
Synthese von 5-(6''-Amino-1''-hexinyl)-3'-desoxyuridin-5'-triphosphat (Verbindung 4)
3'-Desoxy-5-(6''-trifluoracetamido-1''-hexinyl)uridin (Verbindung 3, 122,5 mg, 0,3 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,23 ml), auf –20°C abgekühlt, mit Phosphoroxychlorid versetzt (25 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (22 μl) versetzt und weitere 5 Stunden gerührt. Diese Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M-Lösung von Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphat in DMF (3,6 ml) gegeben und vier Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (5 ml), über Nacht stehengelassen, mit 25% wäßrigem Ammoniak versetzt (20 ml) und 4 Stunden stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether gewaschen und zur Trockene eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (Tosoh Corporation, 1,2 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 172 mg einer neuen Substanz, 5-(6''-Amino-1''-hexinyl)-3'-desoxyuridin-5'-triphosphat (Verbindung 4), zu ergeben (Ausbeute: 60,0%).
Synthesebeispiel 30
Synthese von TMR-markiertem 3'-Desoxyuridin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4)
5-(6''-Amino-1''-hexinyl)-3'-desoxyuridin-5'-triphosphat (Verbindung 4, 8 μmol), gelöst in einer Mischung aus DMF (300 μl) und Wasser (300 μl), wurde mit Triethylamin (10 μl) und 5-Carboxytetramethylrhodaminsuccinimidester (Mole cular Probe, 13 μmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,05 M → 0,7 M (Gesamtvolumen: 2 l)), um 5,9 μmol (Ausbeute: 73,8%) TMR-markiertes 3'-Desoxyuridin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dargestellt ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4; im folgenden abgekürzt als TMR-3'dUTP(n4)].
In der Formel bedeutet Me eine Methyl-Gruppe.
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen TMR-3'dUTP(n4) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellenlänge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 19 gezeigt.
Synthesebeispiel 31
Synthese von 6-Methoxy-2-methylthio-9-{2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-O-[(imidazol-1-yl)thiocarbonyl]-β-D-ribofuranosyl}-7-desazapurin (Verbindung 25)
6-Methoxy-2-methylthio-9-(β-D-ribofuranosyl)-7-desazapurin (Verbindung 23, 12,86 g, 39,28 mmol) wurde in THF gelöst (580 ml), mit Pyridin (16,8 ml, 208 mmol), Silbernitrat (15,55 g, 91,5 mmol) und tert-Butyldimethylsilylchlorid (13,80 g, 91,5 mmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Nach Beendigung der Reaktion wurde der Niederschlag durch Filtration durch Celite abgetrennt, das Filtrat wurde eingeengt, in Chloroform gelöst und mit 0,2 N Salzsäure und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die Chloroform-Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und das Chloroform wurde abgedampft, um 24,0 g rohes 6-Methoxy-2-methylthio-9-[2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-β-D-ribofuranosyl]-7-desazapurin (Verbindung 24) zu ergeben. Die resultierende Verbindung 24 (24,0 g) wurde in DMF gelöst (400 ml), mit 1,1'-Thiocarbonyldiimidazol versetzt (35,0 g, 196,5 mmol) und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat und Wasser versetzt, und die organische Schicht wurde mit gesättigter Salzlösung gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Ethylacetat/Chloroform-Mischlösungsmittel), um 20,45 g einer neuen Substanz, 6-Methoxy-2-methylthio-9-{2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-O-[(imidazol-1-yl)thiocarbonyl]-β-D-ribofuranosyl}-7-desazapurin (Verbindung 25), zu ergeben (Ausbeute: 78,2%).
Synthesebeispiel 32
Synthese von 6-Methoxy-2-methylthio-9-[2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl]-7-desazapurin (Verbindung 26)
6-Methoxy-2-methylthio-9-{2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-O-[(imidazol-1-yl)thiocarbonyl]-β-D-ribofuranosyl}-7-desazapurin (Verbindung 25, 20,45 g, 30,7 mmol) wurde in Toluol gelöst (1 l), mit 2,2'-Azobis(isobutyronitril) (1,01 g, 6,1 mmol) und Tri-n-butylzinnhydrid (16,5 ml, 61,4 mmol) versetzt und unter einem Strom aus Stickstoff-Gas 30 Minuten bei 80°C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Toluol verdampft, und der Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Ethylacetat/n-Hexan-Mischlösungsmittel), um 14,57 g einer neuen Substanz, 6-Methoxy-2-methylthio- 9-[2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl]-7-desazapurin (Verbindung 26), zu ergeben (Ausbeute: 87,9%).
Synthesebeispiel 33
Synthese von 7-Iod-6-methoxy-2-methylthio-9-[2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl]-7-desazapurin (Verbindung 27)
6-Methoxy-2-methylthio-9-[2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl]-7-desazapurin (Verbindung 26, 15,57 g, 28,84 mmol) wurde in DMF gelöst, mit N-Iodsuccinimid versetzt (7,79 g, 34,61 mmol) und fünf Stunden unter einem Strom aus Stickstoff-Gas bei Raumtemperatur unter Lichtabschirmung gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung auf 0°C abgekühlt, mit Ethylacetat und Wasser versetzt, und die organische Schicht wurde mit 5% Natriumthiosulfat-Lösung, gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und das Ethylacetat wurde verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/n-Hexan-Mischlösungsmittel), um 19,06 g einer neuen Substanz, 7-Iod-6-methoxy-2-methylthio-9-[2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl]-7-desazapurin (Verbindung 27), zu ergeben (Ausbeute: 99,3%).
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): –0,10, –0,06, 0,12, 0,13 (4s, 12H, 4MeSi), 0,80, 0,93 (2s, 18H, 2t-Bu), 1,90–2,10 (m, 1H, 3'-Ha), 2,18–2,28 (m, 1H, 3'-Hb), 2,54 (s, 3H, SMe), 3,72 (dd, 1H, J = 2,7, 11,6 Hz, 5'-Ha), 3,94 (dd, 1H, J = 2,2, 11,6 Hz, 5'-Hb), 4,03 (s, 3H, OMe), 4,32–4,48 (m, 2H, 2'-H, 4'-H), 6,07 (d, 1H, J = 3,0 Hz, 1'-H), 7,59 (s, 1H, 8-H).
Synthesebeispiel 34
Synthese von 7-Iod-2-methylthio-9-[2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl]-7-desazapurin-6-on (Verbindung 28)
4-Thiocresol (3,36 g, 27,0 mmol) wurde in Methanol gelöst und mit Natriummethoxid versetzt (1,61 g, 29,7 mmol), und das Methanol wurde nach fünf Minuten Rühren verdampft. Der Rückstand wurde mit 7-Iod-6-methoxy-2-methylthio-9-[2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl]-7-desazapurin (Verbindung 27, 4,00 g, 6 mmol), gelöst in Toluol (150 ml) und Hexamethylphosphoramid (10 ml, 57,1 mmol), versetzt und unter einem Strom aus Stickstoff-Gas 4,5 Stunden am Rückfluß erhitzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat und Wasser versetzt, und die organische Schicht wurde mit gesättigter Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Methylenchlorid/Methanol-Mischlösungsmittel), um 2,35 g einer neuen Substanz, 7-Iod-2-methylthio-9-[2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl]-7-desazapurin-6-on (Verbindung 28), zu ergeben (Ausbeute: 59,9%).
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 0,06, 0,08, 0,20, 0,24 (4s, 12H, 4MeSi), 0,92, 1,03 (2s, 18H, 2t-Bu), 2,07–2,13 (m, 1H, 3'-Ha), 2,34–2,38 (m, 1H, 3'-Hb), 2,63 (s, 3H, SMe), 3,81–4,05 (m, 2H, 5'-Ha,b), 4,46–4,57 (m, 2H, 2'-H, 4'-H), 6,12 (d, 1H, J = 3,0 Hz, 1'-H), 7,47 (s, 1H, 8-H), 12,44 (s, 1H, 1-H).
Synthesebeispiel 35
Synthese von 7-Iod-2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-7-desazaguanosin (Verbindung 29)
7-Iod-2-methylthio-9-[2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-β-D-ribofuranosyl]-7-desazapurin-6-on (Verbindung 28, 2,30 g, 3,53 mmol) wurde in Methylenchlorid gelöst (90 ml), auf 0°C abgekühlt, mit m-Chlorperbenzoesäure versetzt (0,96 g, 3,88 mmol) und 15 Minuten bei 0°C und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gesättigter Salzlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und das Methylenchlorid wurde abgedampft. Der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/Methanol-Mischlösungsmittel), um 2,02 g einer Sulfoxid-Verbindung zu ergeben (Ausbeute: 83,9%). Diese Verbindung wurde in 1,4-Dioxan gelöst (20 ml), auf –78°C abgekühlt, mit wäßrigem Ammoniak versetzt (60 ml) und sechs Stunden auf 110°C erhitzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Methylenchlorid/Methanol-Mischlösungsmittel), um 1,60 g einer neuen Substanz, 7-Iod-2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-7-desazaguanosin (Verbindung 29), zu ergeben (Ausbeute: 73,1%).
Synthesebeispiel 36
Synthese von 3'-Desoxy-7-iod-7-desazaguanosin (Verbindung 30)
7-Iod-2',5'-bis(O-tert-butyldimethylsilyl)-3'-desoxy-7-desazaguanosin (Verbindung 29, 1,6 g, 2,58 mmol) wurde in THF gelöst (50 ml), mit 1 M Tetrabutylammoniumfluorid versetzt (6,2 ml, 6,17 mmol) und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt, und der Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/Methanol-Mischlösungsmittel) und aus Methanol kristallisiert, um 0,80 g einer neuen Substanz, 3'-Desoxy-7-iod-7-desazaguanosin (Verbindung 30), zu ergeben (Ausbeute: 79,1%).
Schmelzpunkt: 176–178°C (Zersetzung).
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,81–1,89 (m, 1H, 3'-Ha), 2,10–2,20 (m, 1H, 3'-Hb), 3,43–3,64 (m, 2H, 5'-Ha,b), 4,18–4,29 (m, 2H, 2'-H, 4'-H), 4,91 (t, 1H, J = 5,5 Hz, 5'-OH), 5,46 (d, 1H, J = 4,3 Hz, 2'-OH), 5,80 (d, 1H, J = 2,4 Hz, 1'-H), 6,30 (brs, 2H, 2-NH₂), 7,10 (s, 1H, 8-H), 10,45 (brs, 1H, 1-H).
Synthesebeispiel 37
Synthese von 3'-Desoxy-7-(6''-trifluoracetamido-1''-hexinyl)-7-desazaguanosin (Verbindung 31)
Zu einer Lösung von 3'-Desoxy-7-iod-7-desazaguanosin (Verbindung 30, 765 mg, 2,0 mmol) in DMF (10 ml) wurden das in Synthesebeispiel 7 erhaltene 5-Trifluoracetamido-1-hexin (1,16 g, 6,0 mmol), Kupfer(I)-iodid (76,4 mg, 0,40 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (226 mg, 0,20 mmol) und Triethylamin (0,56 ml, 4,0 mmol) unter einem Strom aus Stickstoff-Gas zugesetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde mit einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (20 ml) verdünnt, mit Ionenaustauscherharz AG1X8 (HCO₃ ^–-Typ, 2,0 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/Methanol-Mischlösungsmittel), um 616 mg einer neuen Substanz, 3'-Desoxy-7-(6''-trifluoracetamido-1''-hexinyl)-7-desazaguanosin (Verbindung 31), zu ergeben (Ausbeute: 69,5%).
Schmelzpunkt: 185–187°C.
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,47–1,68 (m, 4H, -(CH₂)₂-), 1,80–1,88 (m, 1H, 3'-Ha), 2,09–2,19 (m, 1H, 3'-Hb), 2,38 (t, 2H, J = 6,9 Hz, CCCH₂), 3,25 (q, 2H, J = 6,8 Hz, CH₂N), 3,42–3,62 (m, 2H, 5'-Ha,b), 4,17–4,30 (m, 2H, 2'-H, 4'-H), 4,90 (t, 1H, J = 5,5 Hz, 5'-OH), 5,45 (d, 1H, J = 4,3 Hz, 2'-OH), 5,80 (d, 1H, J = 2,7 Hz, 1'-H), 6,28 (brs, 2H, 2-NH₂), 7,11 (s, 1H, 8-H), 9,42 (brs, 1H, NHTfa), 10,39 (s, 1H, 1-H).
Synthesebeispiel 38
Synthese von 7-Desaza-7-(6''-amino-1''-hexinyl)-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat (Verbindung 32)
3'-Desoxy-7-(6''-trifluoracetamido-1''-hexinyl)-7-desazaguanosin (Verbindung 31, 133 mg, 0,3 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,33 ml), auf –20°C abgekühlt, mit Phosphoroxychlorid versetzt (25 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (22 μl) versetzt und über Nacht weitergerührt. Diese Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M-Lösung von Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphat in DMF (3,6 ml) gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (4 ml), mit Ether gewaschen und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,6 M (Gesamtvolumen: 2 l)). Das gereinigte Produkt wurde mit 25% wäßrigem Ammoniak versetzt (20 ml), eine Stunde stehengelassen, dann unter vermindertem Druck eingeengt, und der erhaltene Rückstand wurde nochmals durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 108 mg einer neuen Substanz, 7-Desaza-7-(6''-amino-1''-hexinyl)-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat (Verbindung 32), zu ergeben (Ausbeute: 36,4%).
Synthesebeispiel 39
Synthese von R110-markiertem 7-Desaza-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4)
7-Desaza-7-(6''-amino-1''-hexinyl)-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat (Verbindung 32, 8 μmol) und 5-Carboxyrhodamin 110-bis-trifluoracetatsuccinimidester (Molecular Probe, 15 μmol) wurden in DMF (500 μl) und Wasser (250 μl) gelöst, mit Triethylamin (0,16 ml) und Pyridin (0,29 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,1 M → 0,8 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 3,38 μmol (Ausbeute: 42,3%) R110-markiertes 7-Desaza-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dargestellt ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4; im folgenden abgekürzt als R110-3'dGTP(n4)].
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen R110-3'dGTP(n4) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellenlänge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 20 gezeigt.
Synthesebeispiel 40
Synthese von n-Propargyltrifluoracetamid
Propargylamin (Aldrich, 25 g, 0,45 mol) wurde tropfenweise zu Methyltrifluoracetat (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 69,2 g, 0,54 mol) gegeben, das auf 0°C gekühlt worden war. Diese wurden zwei Stunden bei 0°C reagierenlassen, um nach Reinigung durch Vakuumdestillation (23 mmHg, Siedepunkt: 77°C) 43,8 g (86,0%) n-Propargyltrifluoracetamid zu ergeben.
Synthesebeispiel 41
Synthese von 3'-Desoxy-5-(3''-trifluoracetamido-1''-propinyl)uridin
Zu einer Lösung von 3'-Desoxy-5-ioduridin (Verbindung 2, 1,56 g, 4,4 mmol) in DMF (22 ml) wurden das in Synthesebeispiel 40 erhaltene n-Propargyltrifluoracetamid (1,54 ml, 13,2 mmol), Kupfer(I)-iodid (168 mg, 0,88 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (508 mg, 0,44 mmol) und Triethylamin (1,23 ml, 8,8 mmol) unter einem Strom aus Stickstoff-Gas zugesetzt und vier Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde in einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (40 ml) gelöst, mit Ionenaustauscherharz AG1X8 (BIO-RAD, HCO₃ ^–-Typ, 4 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt und der Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Methylenchlorid/Methanol-Mischlösungsmittel), um 918 mg 3'-Desoxy-5-(3''-trifluoracetamido-1''-propinyl)uridin zu ergeben (Ausbeute: 55,3%).
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,89–1,92 (m, 1H, 3'-Ha), 2,17–2,26 (m, 1H, 3'-Hb), 3,53, 3,76 (2dd, 2H, J = 3,1, 11,9; 2,7, 12,1 Hz, 5'-Ha,b), 4,22–4,30 (m, 4H, 2'-H, 4'-H, -CH₂-), 5,20 (brs, 1H, 5'-OH), 5,52 (d, 1H, J = 4,0 Hz, 2'-OH), 5,75 (d, 1H, J = 1,9 Hz, 1'-H), 8,34 (s, 1H, 6-H), 10,06 (t, 1H, J = 5,4 Hz, NHTfa), 11,67 (s, 1H, NH).
Synthesebeispiel 42
Synthese von 5-(3''-Amino-1''-propinyl)-3'-desoxyuridin-5'-triphosphat
3'-Desoxy-5-(3''-trifluoracetamido-1''-propinyl)uridin (42 mg, 0,11 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,13 ml), auf –20°C abgekühlt, dann mit Phosphoroxychlorid versetzt (25 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (22 μl) versetzt und weitere 5 Stunden gerührt. Diese Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M-Lösung des in Synthesebeispiel 4 erhaltenen Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphats in DMF (3,6 ml) gegeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (4 ml), über Nacht stehengelassen, dann mit 25% wäßrigem Ammoniak versetzt (20 ml) und 4 Stunden stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether gewaschen und zur Trockene eingeengt, und der erhaltene Rückstand wurde durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (Tosoh Corporation, 1,2 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 115 mg 5-(3''-Amino-1''-propinyl)-3'-desoxyuridin-5'-triphosphat zu ergeben (Ausbeute: 41,3%).
Synthesebeispiel 43
Synthese von TMR-markiertem 3'-Desoxyuridin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 1)
Eine Lösung von 5-Carboxytetramethylrhodaminsuccinimidester (Molecular Probe, 15 mg) in DMF (0,9 ml) wurde zu 5-(3''-Amino-1''-propinyl)-3'-desoxyuridin-5'-triphosphat (10,5 μmol) in 1 M Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 9,05, 1,2 ml) gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustausch säulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,2 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,05 M → 0,7 M (Gesamtvolumen: 2 l)), um 7,38 μmol (Ausbeute: 70,2%) TMR-markiertes 3'-Desoxyuridin-5'-triphosphat zu ergeben [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin n = 1; im folgenden abgekürzt als TMR-3'dUTP(n1)].
Synthesebeispiel 44
Synthese von 3'-Desoxy-5-(3''-trifluoracetamido-1''-propinyl)cytidin
Zu einer Lösung von 3'-Desoxy-5-iodcytidin (Verbindung 6, 1,0 g, 2,83 mmol) in DMF (14 ml), wurden das in Synthesebeispiel 2 erhaltene n-Propargyltrifluoracetamid (0,99 ml, 8,50 mmol), Kupfer(I)-iodid (108 mg, 0,566 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (327 mg, 0,283 mmol) und Triethylamin (0,8 ml, 5,66 mmol) unter einem Strom aus Stickstoff-Gas zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde mit einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (25 ml) verdünnt, mit Ionenaustauscherharz AG1X8 (HCO₃ ^–-Typ, 2,6 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Methylenchlorid/Methanol-Mischlösungsmittel), um 879 mg 3'-Desoxy-5-(3''-trifluoracetamido-1''-propinyl)cytidin zu ergeben (Ausbeute: 82,5%).
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,64–1,71 (m, 1H, 3'-Ha), 1,86–1,96 (m, 1H, 3'-Hb), 3,52–3,57 (m, 1H, 5'-Ha), 3,79–3,83 (m, 1H, 5'-Hb), 4,14–4,28 (m, 4H, 2'-H, 4'-H, -CH₂-), 5,18 (t, 1H, J = 5,0 Hz, 5'-OH), 5,53 (d, 1H, J = 3,8 Hz, 2'-OH), 5,63 (s, 1H, 1'-H), 6,76 (brs, 1H, NH₂a), 7,74 (brs, 1H, NH₂b), 8,38 (s, 1H, 6-H), 9,93 (brs, 1H, NHTfa).
Synthesebeispiel 45
Synthese von 5-(3''-Amino-1''-propinyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat 3'-Desoxy-5-(3''-trifluoracetamido-1''-propinyl)cytidin (113 mg, 0,3 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,13 ml), auf –20°C abgekühlt, mit Phosphoroxychlorid versetzt (25 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (22 μl) versetzt und weitere 5 Stunden gerührt. Diese Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M-Lösung des in Synthesebeispiel 4 erhaltenen Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphats in DMF (3,6 ml) gegeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (4 ml), über Nacht stehengelassen, dann mit 25% wäßrigem Ammoniak versetzt (20 ml) und 4 Stunden stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether gewaschen und zur Trockene eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,2 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 115 mg 5-(3''-Amino-1''-propinyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat zu ergeben (Ausbeute: 41,3%).
Synthesebeispiel 46
Synthese von XR-markiertem 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 1)
5-(3''-Amino-1''-propinyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat (8 μmol), gelöst in 1 M Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 9,05, 0,4 ml), wurde mit einer Lösung von 5-Carboxyrhodamin X-succinimidester (Molecular Probe, 15 mg) in DMF (0,9 ml) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,2 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,1 M → 0,7 M (Gesamtvolumen: 2 l)), um 2,93 μmol (Ausbeute: 36,6%) XR-markiertes 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat zu ergeben [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 1; im folgenden abgekürzt als XR-3'dCTP(n1)].
Synthesebeispiel 47
Synthese von 7-Desaza-7-(3''-trifluoracetamido-1''-propinyl)-3'-desoxyadenosin
Zu einer Lösung von 7-Iod-3'-desoxy-7-desazaadenosin (Verbindung 18, 0,5 g, 1,33 mmol) in DMF (6,7 ml) wurden das in Synthesebeispiel 40 erhaltene n-Propargyltrifluoracetamid (0,47 ml, 3,99 mmol), Kupfer(I)-iodid (51 mg, 0,266 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (154 mg, 0,133 mmol) und Triethylamin (0,37 ml, 2,66 mmol) unter einem Strom aus Stickstoff-Gas zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde mit einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (12 ml) verdünnt, mit Ionenaustauscherharz AG1X8 (HCO₃ ^–-Typ, 1,22 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Methylenchlorid/Methanol-Mischlösungsmittel), um 436 mg 7-Desaza-7-(3''-trifluoracetamido-1''-propinyl)-3'-desoxyadenosin zu ergeben (Ausbeute: 82,3%).
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,83–1,91 (m, 1H, 3'-Ha), 2,14–2,24 (m, 1H, 3'-Hb), 3,48–3,56 (m, 1H, 5'-Ha), 3,66–3,73 (m, 1H, 5'-Hb), 4,30–4,35 (m, 4H, 2'-H, 4'-H, -CH₂-), 5,08 (t, 1H, J = 5,5 Hz, 5'-OH), 5,59 (d, 1H, J = 3,8 Hz, 2'-OH), 6,02 (d, 1H, J = 2,2 Hz, 1'-H), 6,80 (brs, 2H, NH₂), 7,79 (s, 1H, 8-H), 8,12 (s, 1H, 2-H), 10,08 (brs, 1H, NHTfa).
Synthesebeispiel 48
Synthese von 7-Desaza-7-(3''-amino-1''-propinyl)-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat
7-Desaza-7-(3''-trifluoracetamido-1''-propinyl)-3'-desoxyadenosin (120 mg, 0,3 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,2 ml), auf –20°C abgekühlt, mit Phosphoroxychlorid versetzt (25 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (22 μl) versetzt und weitere vier Stunden gerührt. Diese Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M-Lösung des in Synthesebeispiel 4 erhaltenen Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphats in DMF (3,6 ml) gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (4 ml), über Nacht stehengelassen, mit 25% wäßrigem Ammoniak versetzt (20 ml) und 4 Stunden stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether gewaschen und zur Trockene eingeengt, und der erhaltene Rückstand wurde durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,2 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 114 mg 7-Desaza-7-(3''-amino-1''-propinyl)-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat zu ergeben (Ausbeute: 39,9%).
Synthesebeispiel 49
Synthese von R6G-markiertem 7-Desaza-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 1)
7-Desaza-7-(3''-amino-1''-propinyl)-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (8 μmol), gelöst in 1 M Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 9,05, 0,4 ml), wurde mit einer Lösung von 5-Carboxyrhodamin 6G-succinimidester (Molecular Probe, 14,5 mg) in DMF (0,8 ml) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,2 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,1 M → 0,6 M (Gesamtvolumen: 2 l)), um 2,54 μmol (Ausbeute: 31,7%) R6G-markiertes 7-Desaza-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat zu ergeben [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 1; im folgenden abgekürzt als R6G-3'dATP(n1)].
Synthesebeispiel 50
Synthese von 3'-Desoxy-7-(3''-trifluoracetamido-1''-propinyl)-7-desazaguanosin
Zu einer Lösung von 3'-Desoxy-7-iod-7-desazaguanosin (Verbindung 30, 0,65 g, 1,7 mmol) in DMF (8,5 ml) wurden das in Synthesebeispiel 40 erhaltene n-Propargyltrifluoracetamid (0,58 ml, 5,0 mmol), Kupfer(I)-iodid (63 mg, 0,33 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (192 mg, 0,17 mmol) und Triethylamin (0,46 ml, 3,31 mmol) unter einem Strom aus Stickstoff-Gas zugesetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde mit einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (16 ml) verdünnt, mit Ionenaustauscherharz AG1X8 (HCO₃ ^–-Typ, 1,6 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/Methanol-Mischlösungsmittel), um 485 mg 3'-Desoxy-7-(3''-trifluoracetamido-1''-propinyl)-7-desazaguanosin zu ergeben (Ausbeute: 70,5%).
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,81–1,91 (m, 1H, 3'-Ha), 2,10–2,21 (m, 1H, 3'-Hb), 3,42–3,68 (m, 2H, 5'-Ha,b), 4,22–4,30 (m, 4H, 2'-H, 4'-H, -CH₂-), 4,94 (t, 1H, J = 5,5 Hz, 5'-OH), 5,49 (d, 1H, J = 4,3 Hz, 2'-OH), 5,81 (d, 1H, J = 2,4 Hz, 1'-H), 6,32 (brs, 2H, 2-NH₂), 7,27 (s, 1H, a-H), 10,05 (brs, 1H, NHTfa), 10,50 (br5, 1H, 1-H).
Synthesebeispiel 51
Synthese von 7-Desaza-7-(3''-amino-1''-propinyl)-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat
3'-Desoxy-7-(3''-trifluoracetamido-1''-propinyl)-7-desazaguanosin (125 mg, 0,3 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,25 ml), auf –20°C abgekühlt, mit Phosphoroxychlorid versetzt (25 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (22 μl) versetzt und über Nacht weitergerührt. Diese Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M-Lösung des in Synthesebeispiel 4 erhaltenen Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphats in DMF (3,6 ml) gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (4 ml), mit Ether gewaschen und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,2 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,6 M (Gesamtvolumen: 2 l)). Das gereinigte Produkt wurde mit 25% wäßrigem Ammoniak versetzt (15 ml), eine Stunde stehengelassen, dann unter vermindertem Druck eingeengt, und der erhaltene Rückstand wurde nochmals durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,2 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 75 mg 7-Desaza-7-(3''-amino-1''-propinyl)-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat zu ergeben (Ausbeute: 25,9%).
Synthesebeispiel 52
Synthese von R110-markiertem 7-Desaza-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 1)
7-Desaza-7-(3''-amino-1''-propinyl)-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat (10,5 μmol) und 5-Carboxyrhodamin 110-bis-trifluoracetatsuccinimidester (Molecular Probe, 31,5 mg) wurden in DMF (0,49 ml) und Wasser (0,23 ml) gelöst, mit Triethylamin (0,16 ml) und Pyridin (0,29 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,2 × 30 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,1 M → 0,8 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 3,67 μmol (Ausbeute: 34,9%) R110-markiertes 7-Desaza-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat zu ergeben [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 1; im folgenden abgekürzt als R110-3'dGTP(n1)].
Synthesebeispiel 53
Synthese von R110-markiertem 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4)
5-(6''-Amino-1''-hexinyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung 8, 8 μmol), gelöst in einer Mischung aus DMF (400 μl) und Wasser (200 μl), wurde mit Triethylamin (20 μl) und 5-Carboxyrhodamin 110-bis-trifluoracetatsuccinimidester (Molecular Probe, 21 μmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 15 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,1 M → 0,8 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 5,83 μmol (Ausbeute: 72,9%) R110-markiertes 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dargestellt ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4; im folgenden abgekürzt als R110-3'dCTP(n4)].
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen R110-3'dCTP(n4) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellenlänge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 21 gezeigt.
Synthesebeispiel 54
Synthese von R6G-markiertem 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4)
5-(6''-Amino-1''-hexinyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung 8, 8 μmol), gelöst in einer Mischung aus DMF (2,9 μl) und Wasser (0,9 μl), wurde mit Triethylamin (20 μl) und 5-Carboxyrhodamin 6G-succinimidester (Molecular Probe, 16 μmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 15 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,1 M → 0,7 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 5,83 μmol (Ausbeute: 43,1%) R6G-markiertes 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dar gestellt ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin n = 4; im folgenden abgekürzt als R6G-3'dCTP(n4)].
In der Formel bedeutet Et eine Ethyl-Gruppe, und Me bedeutet eine Methyl-Gruppe.
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen R6G-3'dCTP(n4) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellenlänge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 22 gezeigt.
Synthesebeispiel 55
Synthese von XR-markiertem 7-Desaza-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4)
7-Desaza-7-(6''-amino-1''-hexinyl)-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (Verbindung 20, 8 μmol), gelöst in einer Mischung aus DMF (400 μl) und Wasser (400 μl), wurde mit Triethylamin (20 μl) und 6-Carboxyrhodamin X-succinimidester (Molecular Probe, 22 μmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 15 cm; Eluti onsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,1 M → 0,6 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 4,39 μmol (Ausbeute: 54,8%) XR-markiertes 7-Desaza-3'-desoxyadenosin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dargestellt ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4; im folgenden abgekürzt als XR-3'dATP(n4)].
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen XR-3'dATP(n4) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellenlänge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 23 gezeigt.
Synthesebeispiel 56
Synthese von XR-markiertem 7-Desaza-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C=C- ist und n = 4)
7-Desaza-7-(6''-amino-1''-hexinyl)-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat (Verbindung 32, 8 μmol) und 5-Carboxyrhodamin X-succinimidester (Molecular Probe, 19 μmol) wurden in DMF (400 μl) und Wasser (200 μl) gelöst, mit Triethylamin (20 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 15 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,1 M → 0,8 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 2,68 μmol (Ausbeute: 33,5%) XR-markiertes 7-Desaza-3'-desoxyguanosin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dargestellt ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C≡C- ist und n = 4; im folgenden abgekürzt als XR-3'dGTP(n4)].
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen XR-3'dGTP(n4) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellenlänge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 24 gezeigt.
Synthesebeispiel 57
Synthese von 6-Trifluoracetamido-1-hexen
1) Synthese von 5-Hexenyl-p-toluolsulfonat
Eine eisgekühlte Lösung von p-Toluolsulfonylchlorid (54,78 g, 287 mmol) in Pyridin (100 ml) wurde tropfenweise mit 5-Hexen-1-ol (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.; 20 ml, 239 mmol) versetzt und 16 Stunden bei 5°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in Eiswasser gegossen (500 ml) und mit Ether extrahiert (500 ml). Die Ether-Schicht wurde mit kalter 1 N Salzsäure, gesättigtem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und gesättigter Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, um 44,37 g 5-Hexenyl-p-toluolsulfonat zu ergeben (Ausbeute: 72,9%).
2) Synthese von 6-Iod-1-hexen
Eine Mischung aus 5-Hexenyl-p-toluolsulfonat (44,3 g, 174 mmol), Natriumiodid (31,3 g, 209 mmol) und Aceton (250 ml) wurde drei Stunden am Rückfluß reagierenlassen. Nach Abkühlen wurde der Niederschlag durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde in Ether gelöst (500 ml), mit gesättigtem wäßrigem Natriumhydrogensulfit, gesättigtem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und gesättigter Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, um 31,27 g 6-Iod-1-hexen zu ergeben (Ausbeute: 85,5%).
3) Synthese von 6-Trifluoracetamido-1-hexen
Eine Lösung von Natriumhydrid (60% Öl, 14,89 g, 372 mmol) in DMF (370 ml) wurde unter Eiskühlung portionsweise mit Trifluoracetamid (50,39 g, 446 mmol) in etwa 10 Portionen versetzt. Anschließend wurde eine Lösung von 6-Iod-1-hexen (31,27 g, 149 mmol) in DMF (130 ml) zur Reaktionsmischung gegeben, und es wurde drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit gesättigtem wäßrigem Ammoniumchlorid (300 ml) und Ether (300 ml) zur Extraktion versetzt. Die Ether-Schicht wurde zweimal mit gesättigter Salzlösung (300 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Hexan/Ethylacetat-Mischlösungsmittel), um 24,36 g 6-Trifluoracetamido-1-hexen zu ergeben (Ausbeute: 83,8%).
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 1,39–1,69 (m, 4H, -CH₂(CH ₂)₂CH₂-), 2,04–2,14 (m, 2H, H₂C=C-), 3,37 (dd, 2H, J = 7,0, 13,8 Hz, CH₂N), 4,96–5,06 (m, 2H, =CHCH ₂), 5,71–5,86 (m, 1H, H₂C=CH), 6,45 (brs, 1H, NHTfa).
Synthesebeispiel 58
Synthese von 3'-Desoxy-5-(6''-trifluoracetamido-1''-hexenyl)uridin (Verbindung 33)
Eine Lösung von Palladiumchlorid (1,77 g, 10 mmol) und Lithiumchlorid (0,85 g, 20 mmol) in Methanol (100 ml) wurde über Nacht gerührt, um eine 0,1 M Lösung von Lithiumtetrachloropalladat zu ergeben. 3'-Desoxyuridin (Verbindung 1, 1,14 g, 5 mmol) und Quecksilber(II)-acetat (1,60 g, 5 mmol) wurden in Wasser gelöst (50 ml) und fünf Stunden bei 60°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck eingeengt, und der Rückstand wurde in wasserfreiem Methanol suspendiert (55 ml), mit der oben hergestellten 0,1 M Lösung von Lithiumtetrachloropalladat (55 ml) und dem in Synthesebeispiel 57 erhaltenen 6-Trifluoracetamido-1-hexen (3,42 g, 17,5 mmol) versetzt und 16 Stunden am Rückfluß reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Schwefelwasserstoff-Gas gesättigt, dann wurde der Niederschlag durch Filtration durch Celite abgetrennt, und das Filtrat wurde eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol-Mischlösungsmittel) und HPLC (Säule: Wakosil II 5C18 RS Prep, 20,0 × 250 mm, (Elutionsmittel: Acetonitril/Wasser-Mischlösungsmittel) gereinigt, um 454 mg einer neuen Substanz, 3'-Desoxy-5-(6''-trifluoracetamido-1''-hexenyl)uridin (Verbindung 33), zu ergeben (Ausbeute: 21,6%).
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,25–1,55 (m, 4H, -(CH₂)₂-), 1,68–1,80 (m, 1H, 3'-Ha), 1,95–2,18 (m, 3H, 3'-Hb und =CHCH ₂), 3,05–3,25 (m, 2H, CH₂N), 3,50–3,60 (m, 1H, 5'-Ha), 3,70–3,85 (m, 1H, 5'-Hb), 4,15–4,36 (m, 2H, 2'-H und 4'-H), 5,22 (t, 1H, J = 5,1 Hz, 5'-OH), 5,54 (d, 1H, J = 4,3 Hz, 2'-OH), 5,66 (d, 1H, J = 1,6 Hz, 1'-H), 6,03 (d, 1H, J = 15,7 Hz, -CH=CHCH₂-), 6,38 (dt, 1H, J = 7,0, 16,2 Hz, -CH=CHCH₂-), 8,18 (s, 1H, 6-H), 9,39 (brs, 1H, NHTfa), 11,32 (s, 1H, 3-NH).
Synthesebeispiel 59
Synthese von 3'-Desoxy-5-(6''-trifluoracetamido-1''-hexenyl)uridin (Verbindung 33)
Zu einer Lösung von 3'-Desoxy-5-ioduridin (Verbindung 2, 300 mg, 0,85 mmol) in DMF (4,25 ml) wurden das in Synthesebeispiel 57 erhaltene 6-Trifluoracetamido-1-hexen (496 mg, 2,54 mmol), Kupfer(I)-iodid (32,3 mg, 0,17 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)paliadium(0) (97,9 mg, 0,085 mmol) und Triethylamin (0,24 ml, 1,69 mmol) gegeben und unter einem Strom aus Stickstoff-Gas 18 Stunden bei 60°C reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde mit einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (9,3 ml) verdünnt, mit Ionenaustauscherharz AG1X8 (BIO-RAD, HCO₃ ^–-Typ, 0,68 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Elutionsmittel: Methylenchlorid/Methanol-Mischlösungsmittel) und HPLC (Säule: Wakosil II 5C18 RS Prep, 20,0 × 250 mm, (Elutionsmittel: Acetonitril/Wasser-Mischlösungsmittel) gereinigt, um 127 mg einer neuen Substanz, 3'-Desoxy-5-(6''-trifluoracetamido-1''-hexenyl)uridin (Verbindung 33), zu ergeben (Ausbeute: 35,5%).
¹H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,25–1,55 (m, 4H, -(CH₂)₂-), 1,68–1,80 (m, 1H, 3'-Ha), 1,95–2,18 (m, 3H, 3'-Hb und =CHCH ₂), 3,05–3,25 (m, 2H, CH₂N), 3,50–3,60 (m, 1H, 5'-Ha), 3,70–3,85 (m, 1H, 5'-Hb), 4,15–4,36 (m, 2H, 2'-H und 4'-H), 5,22 (t, 1H, J = 5,1 Hz, 5'-OH), 5,54 (d, 1H, J = 4,3 Hz, 2'-OH), 5,66 (d, 1H, J = 1,6 Hz, 1'-H), 6,03 (d, 1H, J = 15,7 Hz, -CH=CHCH₂-), 6,38 (dt, 1H, J = 7,0, 16,2 Hz, -CH=CHCH₂-), 8,18 (s, 1H, 6-H), 9,39 (brs, 1H, NHTfa), 11,32 (s, 1H, 3-NH).
Synthesebeispiel 60
Synthese von 5-(6''-Amino-1''-hexenyl)-3'-desoxyuridin-5'-triphosphat (Verbindung 34)
3'-Desoxy-5-(6''-trifluoracetamido-1''-hexenyl)uridin (Verbindung 33, 126,4 mg, 0,3 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,26 ml), auf –20°C abgekühlt, mit Phosphoroxychlorid versetzt (41,9 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (55,9 μl) versetzt und weitere 23 Stunden gerührt. Diese Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M Lösung von Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphat in DMF (3,6 ml) gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (15 ml) und über Nacht stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether gewaschen und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 40 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)). Das gereinigte Produkt wurde mit 17% wäßrigem Ammoniak versetzt (60 ml), 17 Stunden bei 5°C stehengelassen, dann unter vermindertem Druck eingeengt, und der erhaltene Rückstand wurde nochmals durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 40 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 65,3 mg einer neuen Substanz, 5-(6''-Amino-1''-hexenyl)-3'-desoxyuridin-5'-triphosphat (Verbindung 34), zu ergeben (Ausbeute: 22,4%).
Synthesebeispiel 61
Synthese von TMR-markiertem 3'-Desoxyuridin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C=C- ist und n = 4)
5-(6''-Amino-1''-hexenyl)-3'-desoxyuridin-5'-triphosphat (Verbindung 34, 14,8 μmol), gelöst in einer Mischung aus DMF (300 μl) und Wasser (300 μl), wurde mit Triethylamin (10 μl) und 6-Carboxytetramethylrhodaminsuccinimidester (Molecular Probe, 15,9 μmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 15 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,05 M → 0,65 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 7,62 μmol (Ausbeute: 51,4%) TMR-markiertes 3'-Desoxyuridin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dargestellt ist, worin der Linker-Abschnitt eine Doppelbindung aufweist und die Zahl n in der Methylen-Kette 4 ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C=C- ist und n = 4; im folgenden abgekürzt als TMR-Allyl-3'dUTP(n4)].
In der Formel bedeutet Me eine Methyl-Gruppe.
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen TMR-Allyl-3'dUTP(n4) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellenlänge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 25 gezeigt.
Synthesebeispiel 62
Synthese von 3'-Desoxy-5-(6''-trifluoracetamido-1''-hexenyl)cytidin (Verbindung 35)
Zu einer Lösung von 3'-Desoxy-5-iodcytidin (Verbindung 6, 600 mg, 1,70 mmol) in DMF (8,5 ml) wurden das in Synthesebeispiel 57 erhaltene 6-Trifluoracetamido-1-hexen (995 mg, 5,1 mmol), Kupfer(I)-iodid (64,7 mg, 0,34 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (196 mg, 0,17 mmol) und Triethylamin (0,47 ml, 3,4 mmol) gegeben und unter einem Strom aus Stickstoff-Gas 18 Stunden bei 60°C reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde mit einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (20 ml) verdünnt, mit Ionenaustauscherharz AG1X8 (BIO-RAD, HCO₃ ^–-Typ, 1,36 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Elutionsmittel: Methylenchlorid/Methanol-Mischlösungsmittel) und HPLC (Säule: Wakosil II 5C18 RS Prep, 20,0 × 250 mm, (Elutionsmittel: Acetonitril/Wasser-Mischlösungsmittel) gereinigt, um 187 mg einer neuen Substanz, 3'-Desoxy-5-(6''-trifluoracetamido-1''-hexenyl)cytidin (Verbindung 35), zu ergeben (Ausbeute: 26,2%).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,37–1,52 (m, 4H, -(CH₂)₂-), 1,64–1,68 (m, 1H, 3'-Ha), 1,90–1,97 (m, 1H, 3'-Hb), 2,07–2,12 (m, 2H, =CHCH ₂), 3,18 (dd, 2H, J = 6,8, 12,8 Hz, CH₂N), 3,53–3,56 (m, 1H, 5'-Ha), 3,80–3,82 (m, 1H, 5'-Hb), 4,10–4,30 (m, 2H, 2'-H und 4'-H), 5,15 (t, 1H, J = 5,0 Hz, 5'-OR), 5,48 (d, 1H, J = 4,0 Hz, 2'-OH), 5,65 (s, 1H, 1'-H), 5,87 (dt, 1H, J = 6,8, 15,6 Hz, -CH=CHCH₂-), 6,18 (d, 1H, J = 15,6 Hz, -CH=CHCH₂-), 6,91, 7,10 (2 brs, 2H, 4-NH₂), 8,26 (s, 1H, 6-H), 9,38 (brs, 1H, NHTfa).
Synthesebeispiel 63
Synthese von 5-(6''-Amino-1''-hexenyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung 36)
3'-Desoxy-5-(6''-trifluoracetamido-1''-hexenyl)cytidin (Verbindung 35, 126,1 mg, 0,3 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,26 ml), auf –20°C abgekühlt, mit Phosphoroxychlorid versetzt (25,1 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (22,3 μl) versetzt und weitere vier Stunden gerührt. Diese Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M Lösung von Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphat in DMF (3,6 ml) gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (5 ml) und über Nacht stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether gewaschen und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 40 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)). Das gereinigte Produkt wurde mit 17% wäßrigem Ammoniak versetzt (60 ml), 15 Stunden bei 5°C stehengelassen, dann unter vermindertem Druck eingeengt, und der erhaltene Rückstand wurde nochmals durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 40 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 175 mg einer neuen Substanz, 5-(6''-Amino-1''-hexenyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung 36), zu ergeben (Ausbeute: 60,2%).
Synthesebeispiel 64
Synthese von XR-markiertem 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C=C- ist und n = 4)
5-(6''-Amino-1''-hexenyl)-3'-desoxycytidin-5'-triphosphat (Verbindung 36, 10 μmol), gelöst in einer Mischung aus DMF (300 μl) und Wasser (300 μl), wurde mit Triethylamin (10 μl) und 6-Carboxyrhodamin X-succinimidester (Molecular Probe, 25 μmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 15 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,05 M → 0,65 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 6,55 μmol (Ausbeute: 65,5%) XR-markiertes 3'-Desoxycytidin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dargestellt ist, worin der Linker-Abschnitt eine Doppelbindung aufweist und die Zahl n in der Methylen-Kette 4 ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C=C- ist und n = 4; im folgenden abgekürzt als XR-Allyl-3'dCTP(n4)].
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen XR-Allyl-3'dCTP(n4) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellenlänge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 26 gezeigt.
Synthesebeispiel 65
Synthese von 7-(6''-Trifluoracetamido-1''-hexenyl)-3'-desoxy-7-desazaadenosin (Verbindung 37)
Zu einer Lösung von 7-Iod-3'-desoxy-7-desazaadenosin (Verbindung 18, 600 mg, 1,60 mmol) in DMF (8,0 ml) wurden das in Synthesebeispiel 57 erhaltene 6-Trifluoracetamido-1-hexen (912 mg, 4,80 mmol), Kupfer(I)-iodid (62 mg, 0,32 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (184 mg, 0,16 mmol) und Triethylamin (0,44 ml, 3,2 mmol) gegeben und unter einem Strom aus Stickstoff-Gas 18 Stunden bei 60°C reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde mit einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (16 ml) verdünnt, mit Ionenaustauscherharz AG1X8 (BIO-RAD, HCO₃ ^–-Typ, 1,50 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Elutionsmittel: Methylenchlorid/Methanol-Mischlösungsmittel) und HPLC (Säule: Wakosil II 5C18 RS Prep, 20,0 × 250 mm, (Elutionsmittel: Acetonitril/Wasser-Mischlösungsmittel) gereinigt, um 175 mg einer neuen Substanz, 7-(6''-Trifluoracetamido-1''-hexenyl)-3'-desoxy-7-desazaadenosin (Verbindung 37), zu ergeben (Ausbeute: 24,8%).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,23–1,54 (m, 4H, -(CH₂)₂-), 1,87–1,90 (m, 1H, 3'-Ha), 2,19–2,20 (m, 3H, 3'-Hb und =CHCH ₂), 3,20 (dd, 2H, J = 6,6, 13,0 Hz, CH₂N), 3,46–3,62 (m, 2H, 5'-Ha und 5'-Hb), 4,25–4,38 (m, 2H, 2'-H und 4'-H), 5,01 (t, 1H, J = 5,6 Hz, 5'-OH), 5,50 (d, 1H, J = 4,8 Hz, 2'-OH), 5,95 (dt, 1H, J = 7,2, 15,2 Hz, -CH=CHCH₂-), 6,01 (d, 1H, J = 2,4 Hz, 1'-H), 6,62 (br s, 2H, 6-NH₂), 6,74 (d, 1H, J = 15,2 Hz, -CH=CHCH₂-), 7,48 (s, 1H, 8-H), 8,03 (s, 1H, 2-H), 9,40 (brs, 1H, NHTfa).
Synthesebeispiel 66
Synthese von 7-(6''-Amino-1''-hexenyl)-3'-desoxy-7-desazaadenosin-5'-triphosphat (Verbindung 38)
7-(6''-Trifluoracetamido-1''-hexenyl)-3'-desoxy-7-desazaadenosin (Verbindung 37, 133 mg, 0,3 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,26 ml), auf –20°C abgekühlt, mit Phosphoroxychlorid versetzt (25,1 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (22,3 μl) versetzt und weitere sechs Stunden gerührt. Diese Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M Lösung von Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphat in DMF (3,6 ml) gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (5 ml) und über Nacht stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether gewaschen und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 40 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)). Das gereinigte Produkt wurde mit 17% wäßrigem Ammoniak versetzt (60 ml), 15 Stunden bei 5°C stehengelassen, dann unter vermindertem Druck eingeengt, und der erhaltene Rückstand wurde nochmals durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 40 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 126 mg einer neuen Substanz, 7-(6''-Amino-1''-hexenyl)-3'-desoxy-7-desazaadenosin-5'-triphosphat (Verbindung 38), zu ergeben (Ausbeute: 42,2%).
Synthesebeispiel 67
Synthese von R6G-markiertem 3'-Desoxy-7-desazaadenosin-5'-triphosphat (Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C=C- ist und n = 4)
7-(6''-Amino-1''-hexenyl)-3'-desoxy-7-desazaadenosin-5'-triphosphat (Verbindung 38, 8 μmol), gelöst in einer Mischung aus DMF (2 ml) und Wasser (1 ml), wurde mit Triethylamin (10 μl) und 5-Carboxyrhodamin 6G-succinimidester (Molecular Probe, 16 μmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 15 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,05 M → 0,65 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 3,90 μmol (Ausbeute: 48,7%) R6G-markiertes 3'-Desoxy-7-desazaadenosin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dargestellt ist, worin der Linker-Abschnitt eine Doppelbindung aufweist und die Zahl n in der Methylen-Kette 4 ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C=C- ist und n = 4; im folgenden abgekürzt als R6G-Allyl-3'-dATP(n4)].
In der Formel bedeutet Et eine Ethyl-Gruppe, und Me bedeutet eine Methyl-Gruppe.
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen R6G-Allyl-3'-dATP(n4) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellenlänge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 27 gezeigt.
Synthesebeispiel 68
Synthese von 7-(6''-Trifluoracetamido-1''-hexenyl)-3'-desoxy-7-desazaguanosin (Verbindung 39)
Zu einer Lösung von 7-Iod-3'-desoxy-7-desazaguanosin (Verbindung 30, 1,31 g, 3,33 mmol) in DMF (16,67 ml) wurden das in Synthesebeispiel 57 erhaltene 6-Trifluoracetamido-1-hexen (1,90 g, 9,99 mmol), Kupfer(I)-iodid (130 mg, 0,66 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (385 mg, 0,33 mmol) und Triethylamin (0,93 ml, 6,66 mmol) gegeben und unter einem Strom aus Stickstoff-Gas 18 Stunden bei 60°C reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde mit einer Methylenchlorid/Methanol-Mischung (40 ml) verdünnt, mit Ionenaustauscherharz AG1X8 (BIO-RAD, HCO₃ ^–-Typ, 2,96 g) versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurde das Filtrat eingeengt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Elutionsmittel: Methylenchlorid/Methanol-Mischlösungsmittel) und HPLC (Säule: Wakosil II 5C18 RS Prep, 20,0 × 250 mm, (Elutionsmittel: Acetonitril/Wasser-Mischlösungsmittel) gereinigt, um 439 mg einer neuen Substanz, 7-(6''-Trifluoracetamido-1''-hexenyl)-3'-desoxy-7-desazaguanosin (Verbindung 39), zu ergeben (Ausbeute: 28,7%).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 1,35–1,53 (m, 4H, -(CH₂)₂-), 1,85–1,89 (m, 1H, 3'-Ha), 2,09–2,15 (m, 3H, 3'-Hb und =CHCH ₂), 3,19 (dd, 2H, J = 6,8, 12,8 Hz, CH₂N), 3,43–3,56 (m, 2H, 5'-Ha und 5'-Hb), 4,10–4,30 (m, 2H, 2'-H und 4'-H), 4,84 (t, 1H, J = 5,6 Hz, 5'-OH), 5,42 (d, 1H, J = 4,4 Hz, 2'-OH), 5,81 (d, 1H, J = 2,8 Hz, 1'-H), 6,21 (brs, 2H, 2-NH₂), 6,37 (d, 1H, J = 15,6 Hz, -CH=CHCH₂-), 6,57 (dt, 1H, J = 7,1, 15,6 Hz, -CH=CHCH₂-), 6,93 (s, 1H, 8-H), 9,39 (brs, 1H, NHTfa), 10,29 (s, 1H, 1-H).
Synthesebeispiel 69
Synthese von 7-(6''-Amino-1''-hexenyl)-3'-desoxy-7-desazaguanosin-5'-triphosphat (Verbindung 40)
7-(6''-Trifluoracetamido-1''-hexenyl)-3'-desoxy-7-desazaguanosin (Verbindung 39, 138 mg, 0,3 mmol) wurde in Triethylphosphat gelöst (1,26 ml), auf –20°C abgekühlt, mit Phosphoroxychlorid versetzt (25,1 μl) und bei –20°C gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit weiterem Phosphoroxychlorid (22,3 μl) versetzt und 8 Stunden weitergerührt. Diese Reaktionsmischung wurde zu einer auf –20°C gekühlten 0,5 M Lösung von Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphat in DMF (3,6 ml) gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Triethylamin/Wasser-Mischung versetzt (5 ml) und über Nacht stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether gewaschen und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 40 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)). Das gereinigte Produkt wurde mit 17% wäßrigem Ammoniak versetzt (60 ml), 16 Stunden bei 5°C stehengelassen, dann unter vermindertem Druck eingeengt, und der erhaltene Rückstand wurde nochmals durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 40 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0 M → 0,3 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 122 mg einer neuen Substanz, 7-(6''-Amino-1''-hexenyl)-3'-desoxy-7-desazaguanosin-5'-triphosphat (Verbindung 40), zu ergeben (Ausbeute: 40,4%).
Synthesebeispiel 70
Synthese von R110-markiertem 3'-Desoxy-7-desazaguanosin-5'-triphosphat
(Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C=C- ist und n = 4) 7-(6''-Amino-1''-hexenyl)-3'-desoxy-7-desazaguanosin-5'-triphosphat (Verbindung 40, 10 μmol), gelöst in einer Mischung aus DMF (500 μl) und Wasser (375 μl), wurde mit Triethylamin (25 μl) und 5-Carboxyrhodamin 110-bis(trifluoracetat)succinimidester (Molecular Probe, 25 μmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt (30 ml) und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie an DEAE-Toyopearl gereinigt (1,7 × 15 cm; Elutionsmittel: Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 7,5), linearer Gradient 0,05 M → 0,65 M (Gesamtvolumen: 1 l)), um 5,1 μmol (Ausbeute: 51,0%) R110-markiertes 3'-Desoxy-7-desazaguanosin-5'-triphosphat zu ergeben, das durch die folgende Formel dargestellt ist, worin der Linker-Abschnitt eine Doppelbindung aufweist und die Zahl n in der Methylen-Kette 4 ist [Verbindung der allgemeinen Formel [I], worin V -C=C- ist und n = 4; im folgenden abgekürzt als R110-Allyl-3'-dGTP(n4)].
Das aus der Spektroskopie des erhaltenen R110-Allyl-3'-dGTP(n4) resultierende Absorptionsspektrum für die UV/sichtbare Region, durchgeführt mit einem DU640-Spektrophotometer für die UV/sichtbare Region [Beckman] (Meßwellen länge: 700 nm bis 200 nm, Referenz: destilliertes Wasser), ist in 28 gezeigt.
Beispiel 1
Die 3'-dNTP-Einbauwirksamkeit der gereinigten mutanten T7-RNA-Polymerasen F644Y und L665P/F667Y wurde wie folgt mit der von Wildtyp-T7-RNA-Polymerase verglichen. Die in vitro-Transkriptionsreaktion wurde zum Beispiel mit Hilfe einer modifizierten Variante der Methode von Melton, D. A. [Nucleic Acids Res. 12, 7035–7056 (1984)] durchgeführt. im einzelnen wurde die Reaktion 1 Stunde bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 10 μl durchgeführt, enthaltend einen durch Reaktion mit der Restriktionsendonuclease PvuII oder ScaI linearisierten Plasmidvektor pBluescriptKS(+) als Matrize, der einen T7-Promotor enthält (Stratagene), 150 μM des in Synthesebeispiel 46 als Derivat von 3'-dNTP synthetisierten Farbstoffterminators XR-3'dCTP (n = 1), 500 μM GTP und UTP, 250 μM ATP und CTP, 8 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin-(HCl)₃, 5 mM DTT, 40 mM Tris/HCl pH 8,0 (BRL, Gibco) und 25 Einheiten Wildtyp-T7-RNA-Polymerase (BRL, Gibco oder Nippon Gene) oder mutante T7-RNA-Polymerase F644Y oder L665P/F667Y. Zur Entfernung des unumgesetzten, im Reaktionsprodukt verbliebenen Farbstoffterminators wurde das Transkriptionsprodukt anschließend durch Gelfiltration mit einer Sephadex G-50-Säule (Pharmacia Biotech) gereinigt, und das gereinigte Produkt wurde mit einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft.
Das getrocknete Reaktionsprodukt wurde gelöst in 6 μl Formamid/EDTA/Dextranblau-Beschickungspuffer gemäß dem Handbuch Ver. 1.0 des von Perkin-Elmer, Japan, erhältlichen ABI PRISM 377 DNA Sequencing System, und 2 μl der Lösung wurden mittels ABI 377 DNA Sequencer und Analysenprogramm analysiert unter Verwendung eines denaturierten Gels zur Sequenzierungsanalyse, das 6 M Harnstoff/4% Long Ranger^TM Acrylamid-Lösung (FMC) enthielt. Die Ergebnisse sind in 29 als Gel-Bild gezeigt. Es wurde gefunden, daß die mutante T7-RNA-Polymerase F644Y eine Sequenz-Leiter zu ergeben imstande war, die 3mal länger war als die durch die Wildtyp-T7-RNA-Polymerase resultierende, und es wurde auch ein Transkriptionsprodukt von etwa 700 Basen bestätigt.
Zum Vergleich sind die Peak-Intensitäten der mit der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y erhaltenen Sequenz-Leiter in 30 mit den Peak-Intensitäten gezeigt, die unter Verwendung der Wildtyp-T7-RNA-Polymerase erhalten wurden. Zum Vergleich sind die Peak-Intensitäten der mit der mutanten T7-RNA-Polymerase L665P/F667Y erhaltenen Sequenz-Leiter in 31 mit den Peak-Intensitäten gezeigt, die unter Verwendung der Wildtyp-T7-RNA-Polymerase erhalten wurden. Aus diesen Vergleichen wurde bestätigt, daß die Höhe der Peaks bei den mutanten Enzymen weniger Schwankungen im Vergleich zum Wildtyp zeigte, und die Peaks zeigten stärkere Signale. Daraus ergibt sich, daß die Mutation F644Y oder L665P/F667Y die Einbauwirksamkeit für 3'-dCTP-Derivate für diesen Fall verbessert, und daß die Transkriptionsreaktion durch diese mutanten T7-RNA-Polymerasen Leiterverlängerungseigenschaften aufweist, die vergleichbar sind mit den Produktivitätsdaten herkömmlicher Methoden zur Bestimmung von Nucleotidsequenzen unter Verwendung einer DNA-Polymerase.
Beispiel 2
Beispiel einer Sequenzierungsreaktion mit dem Farbstoffterminatorverfahren unter Verwendung mutanter T7-RNA-Polymerase
Die Sequenzierungsreaktion mit Hilfe der Farbstoffterminatormethode wurde wie folgt durchgeführt, wobei die gereinigten mutanten T7-RNA-Polymerasen F644Y und L665P/F667Y und die Wildtyp-T7-RNA-Polymerase zum Vergleich verwendet wurden.
Für die in vitro-Transkriptionsreaktion wurde das Verfahren von Melton, D. A. (1984, Nucleic Acids Res. 12, 7035–7056) eingesetzt, das in Beispiel 1 erläutert ist. Im einzelnen wurde die Reaktion 1 Stunde bei 37°C in einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 μl durchgeführt, enthaltend einen durch Reaktion mit der Restriktionsendonuclease PvuII oder ScaI linearisierten Plasmidvektor pBluescriptKS(+) als Matrize, der einen T7-Promotor enthält, 250 μM R6G-3'-dATP (n = 1), 25 μM R110-3'-dGTP (n = 1), 150 μM XR-3'-dCTP (n = 1), 50 μM TMR-3'-dUTP (n = 1), d. h., die in den obigen Synthesebeispielen 49, 52, 46 bzw. 43 synthetisierten Farbstoffterminatoren, als Derivate von 3'-dNTP, 500 μM GTP und UTP, 250 μM ATP und CTP, 8 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin-(HCl)₃, 5 mM DTT, 40 mM Tris/HCl pH 8,0 (BRL, Gibco) und 25 Einheiten Wildtyp-T7-RNA-Polymerase (BRL, Gibco oder Nippon Gene) oder mutante T7-RNA-Polymerase F644Y. Zur Entfernung des unumgesetzten, im Reaktionsprodukt verbliebenen Farbstoffterminators wurde das Transkriptionsprodukt anschließend durch Gelfiltration mit einer Sephadex G-50-Säule (Pharmacia Biotech) gereinigt, und das gereinigte Produkt wurde mit einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft.
Das getrocknete Reaktionsprodukt wurde gelöst in 6 μl Formamid/EDTA/Dextranblau-Beschickungspuffer gemäß dem Handbuch Ver. 1.0 des von Perkin-Elmer, Japan, erhältlichen ABI PRISM 377 DNA Sequencing System, und 2 μl der Lösung wurden mittels ABI 377 DNA Sequencer und Analysenprogramm analysiert unter Verwendung eines denaturierten Gels zur Sequenzierungsanalyse, das 6 M Harnstoff/4% Long Ranger^TM Acrylamid-Lösung (FMC) enthielt. Im Ergebnis wurde gefunden, daß die mutanten T7-RNA-Polymerasen F644Y und L665P/F667Y höhere Peak-Intensitäten mit weniger Schwankungen im Vergleich zur Wildtyp-T7-RNA-Polymerase zu ergeben imstande waren, und Sequenz-Ablesung war möglich. Bei Verwendung der Wildtyp-T7-RNA-Polymerase war die Sequenz-Ablesung nahezu unmöglich.
Beispiel 3
Wie in den Beispielen 1 und 2 wurde für die in vitro-Transkriptionsreaktion das Verfahren von Melton, D. A. (1984, Nucleic Acids Res. 12, 7035–7056) herangezogen.
Im einzelnen wurden pro Reaktion 0,25 μg eines durch Reaktion mit der Restriktionsendonuclease PvuII linearisierten Plasmidvektors pBluescriptKS(+) als Matrize verwendet, der einen T7-Promotor enthielt (Stratagene).
Die Reaktion wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 10 μl durchgeführt, enthaltend 4 μM R6G-3'dATP (n = 4), 4 μM R110-3'dGTP (n = 4), 80 μM XR-3'dCTP (n = 4) und 20 μM TMR-3'dUTP (n = 4) als Farbstoffterminatoren (4 × Linker-Farbstoffterminatoren), 500 μM GTP und UTP, 250 μM ATP und CTP, 8 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin-(HCl)₃, 5 mM DTT, 40 mM Tris/HCl pH 8,0 (BRL, Gibco) und 25 Einheiten der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y. Zur Entfernung des unumgesetzten, im Reaktionsprodukt verbliebenen Farbstoffterminators wurde das Transkriptionsprodukt anschließend durch Gelfiltration mit einer Sephadex G-50-Säule (Pharmacia Biotech) gereinigt, und das gereinigte Produkt wurde mit einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft. Das getrocknete Reaktionsprodukt wurde gelöst in 6 μl Formamid/EDTA/Dextranblau-Beschickungspuffer gemäß dem Handbuch Ver. 1.0 des von Perkin-Elmer, Japan, erhältlichen ABI PRISM 377 DNA Sequencing System, und 2 μl der Lösung wurden mittels ABI 377 DNA Sequencer und Analysenprogramm analysiert unter Verwendung eines denaturierten Gels zur Sequenzierungsanalyse, das 6 M Harnstoff/4% Long Ranger^TM Acrylamid-Lösung (FMC) enthielt.
Die Ergebnisse sind in 33 gezeigt. In 33 zeigt der obere Abschnitt das Ergebnis, das erhalten wird durch Verwendung des in Beispiel 2 verwendeten Farbstoffterminators, und der untere Abschnitt zeigt das Ergebnis, das er halten wird durch Verwendung des Farbstoffterminators mit größerer Linker-Länge. Es ist ersichtlich, daß die Kombination aus Farbstoffterminator mit größerer Linker-Länge und mutanter T7-RNA-Polymerase im Vergleich zu den Bedingungen von Beispiel 2, wo ein Farbstoffterminator mit geringerer Linker-Länge verwendet wurde, gleichmäßigere Einbauwirksamkeit aufweist. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Nucleotid-Sequenzanalyse unter Anwendung einer in vitro-Transkriptionsreaktion in der Praxis durchgeführt werden kann.
Beispiel 4
Beispiel für eine Sequenzierungsreaktion unter Verwendung eines Vektors mit T7-Promotor als Matrize
Wie in den Beispielen 1 bis 3 wurde für die in vitro-Transkriptionsreaktion das Verfahren von Melton, D. A. (1984, Nucleic Acids Res. 12, 7035–7056) herangezogen.
Im einzelnen wurde ein durch Reaktion mit der Restriktionsendonuclease PvuII linearisierter Plasmidvektor pBluescriptKS(+) als Matrize verwendet, der einen T7-Promotor enthielt (Stratagene). Die Reaktion wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 10 μl durchgeführt, enthaltend 4 μM R6G-3'dATP(n = 4), 4 μM R110-3'dGTP (n = 4), 80 μM XR-3'dCTP (n = 4) und 20 μM TMR-3'dUTP(n = 4), 500 μM GTP und UTP, 250 μM ATP und CTP, 8 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin-(HCl)₃, 5 mM DTT, 40 mM Tris/HCl pH 8,0 (BRL, Gibco) und 25 Einheiten der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y (oder L665P/F667Y). Zur Entfernung des unumgesetzten, im Reaktionsprodukt verbliebenen Farbstoffterminators wurde das Transkriptionsprodukt anschließend durch Gelfiltration mit einer Sephadex G-50-Säule (Pharmacia Biotech) gereinigt, und das gereinigte Produkt wurde mit einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft.
Das getrocknete Reaktionsprodukt wurde gelöst in 6 μl Formamid/EDTA/Dextranblau-Beschickungspuffer gemäß dem Handbuch Ver. 1.0 des von Perkin- Elmer, Japan, erhältlichen ABI PRISM 377 DNA Sequencing System, und 2 μl der Lösung wurden mittels ABI 377 DNA Sequencer und Analysenprogramm (Sequencing Analysis Ver. 3.0) analysiert unter Verwendung eines denaturierten Gels zur Sequenzierungsanalyse, das 6 M Harnstoff/4% Long Ranger^TM Acrylamid-Lösung (FMC) enthielt. Die Ergebnisse sind in 34 gezeigt. Im Ergebnis wurde ein Sequenz-Elektrogramm erhalten, das hinreichende praktische Anwendbarkeit aufweist, wenn auch einige schwer zu bestimmende Abschnitte verblieben.
Beispiel 5
Beispiel einer Sequenzierungsreaktion mit PCR-Produkt als Matrize
Bei diesem Beispiel wurde eine in die EcoRI-Stelle von pBluescriptKS(+) (Stratagene) subklonierte cDNA für human thyroid-stimulating hormone (hTSH-β) als Matrize für die PCR-Reaktion verwendet, doch ist die Matrize nicht auf die hTSH-β-cDNA beschränkt, und es kann ein beliebiges Gen verwendet werden. Ein wichtiger Punkt bei der Erklärung für dieses Beispiel ist, daß, wenn ein T7-Promotor, der von der T7-RNA-Polymerase erkannt wird, im PCR-Produkt bereitgestellt werden kann, das Gegenstand der Nucleotid-Sequenzierung ist, so wird die Sequenzierung wie in diesem Beispiel möglich. Ein Mittel zur Bereitstellung des T7-Promotors im PCR-Produkt, der die Sequenzierung erlaubt, ist das Anfügen einer T7-Promotorsequenz und eines Transkriptionsausgangspunkts – erforderlich für die Transkription – am 5'-Ende von einem der beiden Primer bei Durchführung der PCR, und dies kann bei jeder DNA erreicht werden. Ein weiteres Mittel, das in diesem Beispiel erklärt wird, ist die Verwendung eines Plasmids, das bereits den T7-Promotor sowie Primer aufweist, die zumindest an beiden Seiten des T7-Promotors vorhanden sein sollten, und dies macht es möglich, ein PCR-Produkt mit dem T7-Promotor zu erhalten. Die zur Durchführung einer PCR nach der letzteren Methode brauchbaren Vektoren sind im Handel erhältlich, darunter die Vektoren der pBluescript-Reihe, pBC-Phagemid-Vektoren (von Stratagene) und die Vektoren der pGEM-Reihe (Promega). Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt unter Verwendung von 100 fg eines Plasmids mit der hTSH-β-cDNA und Primern, die an beiden Seiten der Klonierungsstelle vorhanden waren, Primer L220 (5'-TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC A-3') und Primer 1211 (5'-ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG T-3') in einem Reaktionsvolumen von 20 μl mit dem folgenden Profil: 2 Minuten 94°C über einen Zyklus, 1 Minute 94°C, 1 Minute 55°C, 1,5 Minuten 72°C über 30 Zyklen und 5 Minuten 72°C. Bei dem in der obigen PCR-Reaktion erhaltenen PCR-Produkt lag der T7-Promotor stromabwärts von Primer 1211 vor.
1 μl (etwa 10 ng) des obigen PCR-Produkts wurde für die Sequenzierungsreaktion eingesetzt. Die Reaktion wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 10 μl durchgeführt, enthaltend 4 μM R6G-3'dATP (n = 4), 4 μM R110-3'dGTP (n = 4), 80 μM XR-3'dCTP (n = 4), 20 μM TMR-3'dUTP (n = 4), 500 μM GTP und UTP, 250 μM ATP und CTP, 8 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin-(HCl)₃, 5 mM DTT, 40 mM Tris/HCl pH 8,0 (BRL, Gibco) und 25 Einheiten der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y. Zur Entfernung des unumgesetzten, im Reaktionsprodukt verbliebenen Farbstoffterminators wurde das Transkriptionsprodukt anschließend durch Gelfiltration mit einer Sephadex G-50-Säule (Pharmacia Biotech) gereinigt, und das gereinigte Produkt wurde mit einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft.
Das getrocknete Reaktionsprodukt wurde gelöst in 6 μl Formamid/EDTA/Dextranblau-Beschickungspuffer gemäß dem Handbuch Ver. 1.0 des von Perkin-Elmer, Japan, erhältlichen ABI PRISM 377 DNA Sequencing System, und 2 μl der Lösung wurden mittels ABI 377 DNA Sequencer und Analysenprogramm (Sequencing Analysis Ver. 3.0) analysiert unter Verwendung eines denaturierten Gels zur Sequenzierungsanalyse, das 6 M Harnstoff/4% Long Ranger^TM Acrylamid-Lösung (FMC) enthielt. Die Ergebnisse sind in 35 gezeigt. Aus diesen Ergebnissen wurde ein Sequenz-Elektrogramm erhalten, das hinreichende praktische Anwendbarkeit aufweist, wenn auch einige schwer zu bestimmende Abschnitte verblieben.
Bezugsbeispiel 6
Reinigung von RNase-Aktivität freier anorganischer Pyrophosphatase
Von RNase freie anorganische Pyrophosphatase (PPase) wurde wie folgt hergestellt, doch ist das Herstellungsverfahren nicht auf die nachstehend beschriebene Methode beschränkt.
Als Ausgangsmaterial für die der Reinigung der anorganischen Pyrophosphatase wurde ein grob gereinigtes, aus Hefe stammendes Produkt verwendet, das von Sigma erhältlich ist (Sigma I-1643, EC.3.6.1.1), und 4 mg (680 Einheiten) des Produkts wurden in einem Puffer suspendiert (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,9, 1 ml), zum Entsalzen zwei Stunden gegen den gleichen Puffer dialysiert, und das dialysierte Produkt wurde einer Säulenchromatographie in einer SP Sepharose-Säule mit einem Säulevolumen von 1 ml (Pharmacia Biotech) unterzogen. Im einzelnen wurde die Säule mit dem gleichen Puffer solange gewaschen, bis alles Material verschwunden war, das Ultraviolettstrahlen mit 280 nm absorbierte, und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,1 M NaCl im gleichen Puffer von etwa dem 20fachen Volumen des Säulenvolumens eluiert. Der Ablauf wurde in Form von Fraktionen eines geeigneten Volumens in Reagensgläsern aufgefangen und zur Protein-Analyse unmittelbar einer SDS-12,5%-Acrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, um die Fraktionen zu identifizieren, die ein Protein mit etwa 32 kDa enthielten. In typischen Beispielen sollten die PPase-Fraktionen im nichtabsorbierten Teil aufgefunden werden. Die das Protein enthaltenden Fraktionen wurden aufgefangen, an einer Q-Sepharose-Säule (Pharmacia Biotech) mit einem Säulenvolumen von 1 ml absorbiert, und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,1 M NaCl im gleichen Puffer von etwa dem 20fachen Volumen des Säulenvolumens eluiert. Der Ablauf wurde in Form von Fraktionen eines geeigneten Volumens in Reagensgläsern aufgefangen und unmittelbar einer SDS-12,5%-Acrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, um die Fraktionen zu identifizieren, die ein Protein mit etwa 32 kDa enthielten. Bei typi schen Beispielen sollte dieses um 0,35 M NaCl aufgefunden werden. Die das Protein mit 32 kDa enthaltenden Fraktionen wurden aufgefangen, 16 Stunden gegen 500 ml Aufbewahrungspuffer (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 50% Glycerin, pH 7,9) dialysiert und bis zum Gebrauch bei –20°C aufbewahrt. Bei typischen Beispielen konnte eine 425 Einheiten PPase-Protein, d. h., 0,425 Einheiten/μl, enthaltende Probe mit einer Ausbeute von 62,5% erhalten werden.
Der Grad der RNase-Verunreinigung der obigen Probe wurde untersucht unter Verwendung von 8 μg E. coli-rRNA (16S und 235) als Substrat. Im einzelnen wurde die PPase in einer 0,17 Einheiten entsprechenden Menge zu E. coli-rRNA in einem Puffer gegeben, enthaltend 8 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin-(HCl)₃, 5 mM DTT, 40 mM Tris/HCl pH 8,0, und vier Stunden bei 37°C reagierenlassen. Mit der RNA wurde eine 1,0% Agarose-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen in Gegenwart von Formamid durchgeführt, und die Elektrophorese wurde beendet, wenn gleichzeitig zugesetzter Xylolcyanol-Farbstoff die Höhe von etwa 1/3 des Agarose-Gels erreicht hatte. Das Gel wurde mit ultraviolettem Licht bestrahlt (Wellenlänge: 254 nm) und photographiert, um den Grad des RNA-Abbaus zu untersuchen. PPase im grob gereinigten Produkt und PPase nach Reinigung wurden verglichen, und es wurde Abbau von RNA im grob gereinigten Produkt beobachtet, während im gereinigten Produkt keine signifikante RNA-Abbauaktivität zu beobachten war.
Beispiel 6
Wirkung der Zugabe von Farbstoffterminator mit Linker und anorganischer Pyrophosphatase auf die Sequenzierungsreaktion unter Verwendung mutanter T7-RNA-Polymerase
Die Wirkung der in Bezugsbeispiel 6 gereinigten PPase auf die in vitro-Sequenzierungstranskriptionsreaktion wurde untersucht. Zur Untersuchung der Wirkung der zugesetzten Menge wurde die Reaktion zunächst mit verschiedenen zugegebenen Mengen PPase durchgeführt. Für die Sequenzierungsreaktion wurde die Methode von Melton, D. A. (1984, Nucleic Acids Res. 12, 7035–7056), herangezogen. Im einzelnen wurde ein durch Reaktion mit der Restriktionsendonuclease PvuII linearisierter Plasmidvektor pBluescriptKS(+) als Matrize verwendet, der einen T7-Promotor enthielt (Stratagene). Die Reaktion wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C in einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 μl durchgeführt, enthaltend 4 μM R6G-3'dATP (n = 4), 4 μM R110-3'dGTP (n = 4), 80 μM XR-3'dCTP (n = 4) und 20 μM TMR-3'dUTP (n = 4), 500 μM GTP und UTP, 250 μM ATP und CTP, 8 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin-(HCl)₃, 5 mM DTT, 40 mM Tris/HCl pH 8,0 (BRL, Gibco) und 25 Einheiten der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y. Zur Untersuchung der Wirkung von PPase wurde die obige Reaktion ohne Zugabe von Enzym oder mit Zugabe von Enzym in einer Menge entsprechend 0,425 Einheiten, 0,0425 Einheiten bzw. 0,00425 Einheiten durchgeführt. Zur Entfernung des unumgesetzten, im Reaktionsprodukt verbliebenen Farbstoffterminators wurde das Transkriptionsprodukt anschließend durch Gelfiltration mit einer Sephadex G-50-Säule (Pharmacia Biotech) gereinigt, und das gereinigte Produkt wurde mit einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft.
Das getrocknete Reaktionsprodukt wurde gelöst in 6 μl Formamid/EDTA/Dextranblau-Beschickungspuffer gemäß dem Handbuch Ver. 1.0 des von Perkin-Elmer, Japan, erhältlichen ABI PRISM 377 DNA Sequencing System, und 2 μl der Lösung wurden mittels ABI 377 DNA Sequencer und Analysenprogramm (Sequencing Analysis Ver. 3.0) analysiert unter Verwendung eines denaturierten Gels zur Sequenzierungsanalyse, das 6 M Harnstoff/4% Long Ranger^TM Acrylamid-Lösung (FMC) enthielt. Die Ergebnisse sind in den 36 und 37 gezeigt. Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich, war die Trennung der Peaks verbessert, und die Gleichmäßigkeit der Peak-Höhen war auch in all den Fällen erhöht, wo PPase zugesetzt worden war. Da die gleiche Wirkung selbst bei Zugabe von 0,00425 Einheiten PPase erhalten wurde, wurde die Zugabemenge der PPase im folgenden auf 0,00425 Einheiten festgesetzt.
Anschließend wurde die Wirkung auf die Sequenzierungsreaktion unter Verwendung des PCR-Produkts als Matrize untersucht. Die Sequenzierungsreaktion wurde wie folgt durchgeführt. Bei diesem Beispiel wurde eine in die EcoRI-Stelle von pBluescriptKS(+) (Stratagene) subklonierte cDNA für human thyroid-stimulating hormone (hTSH-β) als Matrize für die PCR-Reaktion verwendet, doch ist die Matrize nicht auf die hTSH-β-cDNA beschränkt, und es kann ein beliebiges Gen verwendet werden. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt unter Verwendung von 100 fg eines Plasmids mit der hTSH-β-cDNA und Primern, die an beiden Seiten der Klonierungsstelle vorhanden waren, Primer L220 (5'-TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC A-3') und Primer 1211 (5'-ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG T-3'), in einem Reaktionsvolumen von 20 μl mit dem folgenden Profil: 2 Minuten 94°C über einen Zyklus, 1 Minute 94°C, 1 Minute 55°C, 1,5 Minuten 72°C über 30 Zyklen und 5 Minuten 72°C. 1 μl (etwa 10 ng) des obigen PCR-Produkts wurde für die Sequenzierungsreaktion eingesetzt. Die Reaktion wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 10 μl durchgeführt, enthaltend 4 μM R6G-3'dATP (n = 4), 4 μM R110-3'dGTP (n = 4), 80 μM XR-3'dCTP (n = 4), 20 μM TMR-3'dUTP (n = 4), 500 μM GTP und UTP, 250 μM ATP und CTP, 8 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin-(HCl)₃, 5 mM DTT, 40 mM Tris/HCl pH 8,0 (BRL, Gibco) und 25 Einheiten der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y. Bei Zugabe von PPase wurde diese in einer Menge entsprechend 0,00425 Einheiten zugesetzt. Zur Entfernung des unumgesetzten, im Reaktionsprodukt verbliebenen Farbstoffterminators wurde das Transkriptionsprodukt an schließend durch Gelfiltration mit einer Sephadex G-50-Säule (Pharmacia Biotech) gereinigt, und das gereinigte Produkt wurde mit einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft.
Das getrocknete Reaktionsprodukt wurde gelöst in 6 μl Formamid/EDTA/Dextranblau-Beschickungspuffer gemäß dem Handbuch Ver. 1.0 des von Perkin-Elmer, Japan, erhältlichen ABI PRISM 377 DNA Sequencing System, und 2 μl der Lösung wurden mittels ABI 377 DNA Sequencer und Analysenprogramm (Sequencing Analysis Ver. 3.0) analysiert unter Verwendung eines denaturierten Gels zur Sequenzierungsanalyse, das 6 M Harnstoff/4% Long Ranger^TM Acrylamid-Lösung (FMC) enthielt. Ein Teil der Ergebnisse ist in 38 gezeigt. Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich, wurde durch Zugabe von PPase die Trennung der Peaks verbessert, und auch die Gleichmäßigkeit der Peak-Höhen wurde erhöht. Somit wurden die gleichen Ergebnisse erhalten wie in dem Fall, wo das obige Plasmid als Matrize zur Sequenzierung verwendet wurde. Dies ist ein Hinweis darauf, daß die Sequenz-Ablesegenauigkeit durch Verwendung von PPase zunimmt.
Beispiel 7
Spezielles Beispiel einer Sequenzierungsreaktion mit Zugabe anorganischer Pyrophosphatase
Die Sequenzierungsreaktion wurde unter den gleichen Bedingungen wie im Fall von Beispiel 6 durchgeführt, wo das PCR-Produkt mit Zugabe anorganischer Pyrophosphatase als Matrize verwendet wurde, und die erhaltene Sequenzierungsgenauigkeit wurde zum Vergleich herangezogen.
39 zeigt die Ergebnisse, die ohne Zugabe anorganischer Pyrophosphatase erhalten wurden, und 40 zeigt die Ergebnisse, die aus der Reaktion mit Zugabe anorganischer Pyrophosphatase erhalten wurden. Durch einen Vergleich mit der hTSH-β-cDNA, deren bestimmte Nucleotidsequenz bereits be richtet ist, wurde gefunden, daß – was die 510 bestimmten Basenpaare anbetrifft – eine Genauigkeit von 90% für den Fall ohne Zugabe anorganischer Pyrophosphatase erhalten wurde, wohingegen eine Genauigkeit von 98% für den Fall mit Zugabe anorganischer Pyrophosphatase erhalten wurde. Die in Beispiel 6 erwähnte 38 wurde erhalten durch Verarbeiten eines Teils der Ergebnisse dieses Experiments, um einen Vergleich mit der Wirkung der Zugabe der anorganischen Pyrophosphatase zu erhalten.
Aus dem obigen zeigt sich, daß es durch Verwendung von mutanter T7-RNA-Polymerase, Farbstoffterminator und anorganischer Pyrophosphatase möglich ist, Nucleotidsequenzen mit einer Genauigkeit zu bestimmen, die gleichwertig der oder höher als die ist, die mit Hilfe der gegenwärtig vorherrschenden Verfahren zur Bestimmung von Nucleotidsequenzen, d. h., mit den Verfahren unter Verwendung von DNA-Polymerasen erreicht werden kann.
Bezugsbeispiel 7
Verbesserung der Einbaurate von 3'-dNTP-Derivaten
Die Einbauraten von Ribonucleotiden (NTP) und 3'-Desoxynucleotiden (3'-dNTP) mit der in Bezugsbeispiel 5 gereinigten mutanten T7-RNA-Polymerase wurden wie folgt gemessen.
Als Matrize für die Transkriptionsreaktion wurde ein durch Reaktion mit der Restriktionsendonuclease PvuII linearisiertes pBluescriptKS(+)-Plasmid (Stratagene) verwendet, und des weiteren wurden jeweils 250 μM ATP, CTP, GTP und UTP, 2 mM Spermidin-(HCl)₃, 5 mM DTT, 40 mM Tris/HCl pH 8,0, 0,1 μl [α³²-P]UTP (3000 Ci/mmol) und 25 Einheiten der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y/L665P/F667Y für die Reaktion eingesetzt. Für die beiden Arten von Reaktionsmischungen (mit oder ohne 3'-dATP, Endkonzentration 100 μM) wurde die Reaktion 60 Minuten bei 37°C durchgeführt. Die gesamte Reaktionsmischung wurde auf DE81-Papier (Whatman) aufgetüpfelt, dreimal mit Phosphat- Puffer gewaschen und getrocknet. Das DE81-Papier wurde in eine Szintillationsphiole gegeben, und die Radioaktivität für die jeweilige Reaktion wurde mit eines Szintillationszähler (Beckman) gemessen. Der Grad der Hemmung des [α³²P]UTP-Einbaus wurde auf der Grundlage der gemessenen Radioaktivität durch Vergleichen der mit und ohne 3'-dATP erhaltenen Werte berechnet. Die relative Aktivität, die aus dem berechneten Hemmungsgrad erhalten und als relativer Wert zu dem auf 1,000 normierten Hemmungsgrad der Wildtyp-T7-RNA-Polymerase definiert wurde, ist in Tabelle 1 gezeigt.
Der Hemmungsgrad wurde berechnet, indem die Wildtyp-T7-RNA-Polymerase, die in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen T7-RNA-Polymerasen F644Y, L665P/F667Y, die in der gleichen Weise wie die in den Beispielen 2 und 3 konstruierten und gereinigten mutanten T7-RNA-Polymerasen F644Y/L665P, F782Y, F733Y, F646Y oder Y639F an Stelle der obigen Mutante F644Y/L665P/F667Y für die Reaktion eingesetzt wurden, und es wurden Ergebnisse erhalten, die die Hemmung betreffen. Die relativen Aktivitäten sind in Tabelle 1 gezeigt.

Bei den Ergebnissen in Tabelle 1 bedeutet ein größerer Wert, daß das entsprechende mutante Enzym eine Mutation aufweist, die den 3'-dATP-Einbau in stärkerem Maße erleichtert. Dies bedeutet zum Beispiel, daß die mutante T7-RNA-Polymerase F644Y/L665P/F667Y im Vergleich zum Wildtyp-Enzym mit einer 5,58mal höheren Wahrscheinlichkeit 3'-dATP einbaut. Es wurde gezeigt, daß von den hergestellten mutanten Enzymen die Mutante F644Y/L665P/F667Y dasjenige mutante Enzym ist, das die geringste Beeinflussung beim 3'-dATP Einbau aufweist. Tabelle 1

Mutationsstelle	Relative Aktivität der RNA-Polymerase für 3'-dATP
F644Y	5,130
F644Y/L665P	5,130
L665P/F667Y	4,711
F644Y/L665P/F667Y	5,580
F782Y	1,173
F733Y	1,075
F646Y	0,459
Y639F	0,930
Wildtyp	1,000

Beispiel 8
Beispiel einer Sequenzierungsreaktion mit der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y/L665P/F667Y
Die als Matrize für die Sequenzierungsreaktion verwendete Matrize wurde mittels PCR wie folgt hergestellt.
Als Matrize für die PCR wurde eine in ein von BS750 abgeleitetes Plasmid subklonierte cDNA für human thyroid-stimulating hormone (hTSH-β) mit T7-Promotor verwendet. Unter Verwendung dieses Plasmids, 100 fg, das hTSH-β mit Primer L220 (5'-TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC A-3') und Primer 1211 (5'-ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG T-3') an beiden Seiten der Klonierungsstelle aufweist, wurde die PCR in einem Reaktionsvolumen von 20 μl durchgeführt (1 Zyklus 94°C, 2 Minuten, 30 Zyklen 94°C, 1 Minute, 55°C über 1 Minute und 72°C über 1,5 Minuten, gefolgt von 72°C über 5 Minuten). Bei dem in der obigen PCR-Reaktion erhaltenen PCR-Produkt lag der T7-Promotor stromabwärts von Primer 1211 vor.
Die Transkriptionssequenzierungsreaktion wurde durchgeführt nach dem Verfahren von Melton, D. A. [Nucleic Acids Res. 12, 7035–7056 (1984)].
1 μl (etwa 10 ng) des obigen PCR-Produkts wurde für die Sequenzierungsreaktion eingesetzt. Die Reaktion wurde 1 Stunde bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 10 μl, enthaltend die gleichen wie in Beispiel 2 verwendeten Farbstoffterminatoren, 4 μM R6G-3'dATP [5-Carboxyrhodamin 6G-markiertes 3'-Desoxyadenosin-5-triphosphat (n = 4)], 4 μM R110-3'dGTP [5-Carboxyrhodamin 110-markiertes 3'-Desoxyguanosin-5-triphosphat (n = 4)], 80 μM XR-3'dCTP [5-Carboxyrhodamin X-markiertes 3'-Desoxycytidin-5-triphosphat (n = 4)], 20 μM TMR-3'-dUTP [5-Carboxytetramethylrhodamin-markiertes 3'-Desoxyuridin-5-triphosphat (n = 4)], 500 μM UTP, 250 μM ATP, 200 μM CTP, 500 μM GTP, 2 mM Spermidin-(HCl)₃, 5 mM DTT, 40 mM Tris/HCl pH 8,0 (BRL, Gibco) und 25 Einheiten der mutanten T7-RNA-Polymerase F644Y/L665P/F667Y.
Zur Entfernung des unumgesetzten, im Reaktionsprodukt verbliebenen Farbstoffterminators wurde das Transkriptionsprodukt anschließend durch Gelfiltration mit einer Sephadex G-50-Säule (Pharmacia Biotech) gereinigt, und das gereinigte Produkt wurde mit einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft.
Das getrocknete Reaktionsprodukt wurde gelöst in 6 μl Formamid/EDTA/Dextranblau-Beschickungspuffer gemäß dem Handbuch Ver. 1.0 des von Perkin-Elmer, Japan, erhältlichen ABI PRISM 377 DNA Sequencing System, und 2 μl der Lösung wurden mittels ABI 377 DNA Sequencer und Analysenprogramm (Sequencing Analysis Ver. 3.0) analysiert unter Verwendung eines denaturierten Gels zur Sequenzierungsanalyse, das 6 M Harnstoff/4% Long Ranger^TM Acryla mid-Lösung (FMC), um ein Elektropherogramm zu ergeben. Die Ergebnisse sind in 41 gezeigt. Wie gezeigt, war ausgezeichnete Sequenzierungsanalyse möglich.
Bezugsbeispiel 8
Untersuchung von 3'-Desoxy-Terminatoren mit unterschiedlichen Methylen-Ketten als Linker-Teil
Matrizen-DNA
Die PCR wurde unter Verwendung der folgenden Materialien durchgeführt (eine Minute 96°C, 30 Sekunden 55°C, eine Minute 72°C über einen Zyklus, 30 Sekunden 96°C, 30 Sekunden 55°C, eine Minute 72°C über 24 Zyklen), und das resultierende PCR-Produkt (amplifiziertes DNA-Fragment der β-Subunit von human thyroid-stimulating hormone (TSH)) wurde als Matrizen-DNA verwendet.

Das jeweilige Material wurde in einer vorbestimmten Menge in ein Probenröhrchen gegeben, mit EXTaq-Puffer (Takara Shuzo) auf ein Gesamtvolumen von 10 μl aufgefüllt und als PCR-Mischung eingesetzt. Materialien

Bluescript II (Stratagene) mit eingeführter TSH-β-Subunit-DNA (Zugangs-Nr. S70586)	1 pg
Forward Primer (5'-ACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3')	0,1 M
Reverse Primer (5'-TAACAATTTCACAGGAAACA-3')	0,1 M
2'-dGTP	200 μM
2'-dTTP	200 μM
2'-dATP	200 μM
2'-dCTP	200 μM
EXTaq-Polymerase (Takara Shuzo)	0,5 Einheiten

Terminator

TMR-3'-dUTP(n4) (Verbindung von Synthesebeispiel 30).
TMR-Allyl-3'dUTP(n4) (Verbindung von Synthesebeispiel 61)

Experimentelles Verfahren

Die Matrizen-DNA (10 ng) wurde in ein Probenröhrchen gegeben, enthaltend die jeweiligen Terminatoren Guanosin-5'-triphosphat (rGTP), Uridin-5'-triphosphat (rUTP), Adenosin-5'-triphosphat (rATP) und Cytidin-5'-triphosphat (rCTP), MgCl₂, Spermidin-(HCl)₃, Dithiothreitol (DTT), Tris/HCl (pH 7,5), anorganische Pyrophosphatase aus Hefe (PPase) und T7-RNA-Polymerase in solchen Mengen, daß ihre Endkonzentrationen wie folgt sein sollten, mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf eine Gesamtmenge von 10 μl und als Probe verwendet. Konzentration

Terminator	10 μM
rGTP	500 μM
rUTP	500 μM
rATP	250 μM
rCTP	250 μM
MgCl₂	8 mM
Spermidin-(HCl)₃	2 mM
DTT	5 mM
Tris/HCl (pH 7,5)	40 mM
Hefe-PPase	10 Einheiten
T7-RNA-Polymerase (Gibco BRL)	25 Einheiten

Nach 30minütiger Inkubation der Probe bei 37°C wurden die nichteingebauten Terminatoren durch Gelfiltration mit einer Sephadex G-25-Säule (Pharmacia) abgetrennt, und die Niederschläge wurden mittels Zentrifugationstrennung gewonnen. Anschließend wurden die Niederschläge in 4 μl Formamid-Farbstoff gelöst (10 mM EDTA enthaltend 95% Formamid) und zwei Minuten auf 90°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden 2 μl der Lösung auf 4% Sequenzierungsgel aufgetragen und auf einem automatischen Fluoreszenzsequencer AB1377 (ABI) einer Elektrophorese unterzogen. Das mit dem Sequencer mit TMR-3'dUTP(n4) erhaltene matrixkonvertierte Gelbild (Terminationsmuster) ist in 42A gezeigt, und das in ähnlicher Weise mit dem Sequencer mit TMR-Allyl-3'dUTP(n4) erhaltene matrixkonvertierte Gelbild (Terminationsmuster) ist in 42B gezeigt.
Ergebnisse
Wie aus den 42A und 42B klar ersichtlich, ist kein Unterschied zwischen den mit TMR-3'dUTP(n4) und TMR-Allyl-3'dUTP(n4) erhaltenen Terminationsmustern erkennbar, und somit wurde gezeigt, daß TMR-Allyl-3'dUTP(n4) genauso wirksam wie TMR-3'dUTP(n4) eingebaut wird.
Bei Durchführung des Experiments unter den gleichen Bedingungen, außer Veränderung der Menge des eingesetzten Terminators von 10 μM zu 0,5 μM, wurden ähnliche Ergebnisse erhalten.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von DNA-Nucleotidsequenzen, umfassend die Umsetzung von Ribonucleosid-5'-triphosphaten, darunter ATP, GTP, CTP und UTP oder Derivate derselben, mit einer oder mehreren Arten von 3'-Desoxyribonucleosid-5'-triphosphaten, darunter 3'-dATP, 3'-dGTP, 3'-dCTP, 3'-dUTP und Derivate derselben (im folgenden als 3'-dNTP-Derivate bezeichnet), in Gegenwart einer RNA-Polymerase und eines DNA-Fragments, das eine Promotorsequenz für die RNA-Polymerase enthält, um ein Nucleinsäure-Transkriptionsprodukt zu ergeben, Abtrennung des resultierenden Nucleinsäure-Transkriptionsprodukts und Bestimmung einer Nucleinsäuresequenz aus der resultierenden abgetrennten Fraktion, wobei die RNA-Polymerase eine mutante RNA-Polymerase ist, bei der wenigstens eine der Aminosäuren in der Wildtyp-RNA-Polymerase durch Tyrosin ersetzt ist, um so deren Fähigkeit zum Einbau der 3'-dNTP-Derivate im Vergleich zur entsprechenden Wildtyp-RNA-Polymerase zu verbessern.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mutante RNA-Polymerase eine RNA-Polymerase ist, bei der wenigstens eine in einer Nucleotid-Bindungsstelle der Wildtyp-RNA-Polymerase vorhandene Aminosäure verändert wurde.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mutante RNA-Polymerase eine RNA-Polymerase ist, bei der wenigstens eine in der Nucleotid-Bindungsstelle der Wildtyp-RNA-Polymerase vorhandene Aminosäure durch Tyrosin ersetzt ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die ersetzte Aminosäure Phenylalanin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die in der Nucleotid-Bindungsstelle vorhandene Aminosäure eine Aminosäure in einer Schleife zwischen der Y-Helix und der Z-Helix und/oder eine Aminosäure in einer Schleife zwischen der Z-Helix und der AA-Helix ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die mutante RNA-Polymerase eine RNA-Polymerase ist, die so verändert wurde, daß die Fähigkeit zum Einbau der 3'-dNTP-Derivate im Vergleich zum Wildtyp um das Doppelte erhöht sein sollte.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die mutante RNA-Polymerase abgeleitet ist vom T7-Phagen, T3-Phagen, SP6-Phagen oder K11-Phagen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mutante RNA-Polymerase eine Wildtyp-RNA-Polymerase ist, mit der Maßgabe, daß wenigstens eine der Aminosäuren verändert wurde, die in einem Bereich der Wildtyp-RNA-Polymerase vorhanden sind, der den Aminosäureresten 641–667 der vom T7-Phagen abgeleiteten RNA-Polymerase entspricht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mutante RNA-Polymerase eine vom T7-Phagen abgeleitete RNA-Polymerase ist und der Aminosäurerest 644 oder 667 Tyrosin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mutante RNA-Polymerase eine RNA-Polymerase ist, die aus einer Wildtyp-T7-RNA-Polymerase besteht, mit der Maßgabe, daß der 644. Aminosäurerest der Wildtyp-T7-RNA-Polymerase, Phenylalanin, durch Tyrosin ersetzt wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mutante RNA-Polymerase eine RNA-Polymerase ist, die aus einer Wildtyp-T7-RNA-Polymerase besteht, mit der Maßgabe, daß der 667. Aminosäurerest der Wildtyp-T7-RNA-Polymerase, Phenylalanin, durch Tyrosin ersetzt wurde.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die mutante RNA-Polymerase eine RNA-Polymerase ist, die aus einer Wildtyp-T7-RNA-Polymerase besteht, mit der Maßgabe, daß der 665. Aminosäurerest der Wildtyp-T7-RNA-Polymerase, Leucin, durch Prolin ersetzt wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mutante RNA-Polymerase eine RNA-Polymerase ist, die aus einer Wildtyp-T7-RNA-Polymerase besteht, mit der Maßgabe, daß der 644. Aminosäurerest der Wildtyp-T7-RNA-Polymerase, Phenylalanin, durch Tyrosin ersetzt wurde, und der 667. Aminosäurerest der Wildtyp-T7-RNA-Polymerase, Phenylalanin, durch Tyrosin ersetzt wurde.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die mutante RNA-Polymerase eine RNA-Polymerase ist, die aus einer Wildtyp-T7-RNA-Polymerase besteht, mit der Maßgabe, daß zudem der 665. Aminosäurerest der Wildtyp-T7-RNA-Polymerase, Leucin, durch Prolin ersetzt wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mutante RNA-Polymerase eine vom T3-Phagen abgeleitete RNA-Polymerase ist und an den Aminosäureresten 645 oder 668 Tyrosin aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mutante RNA-Polymerase eine vom K11-Phagen abgeleitete RNA-Polymerase ist und an einem oder mehreren der Aminosäurereste 663–668 und 690 Tyrosin aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mutante RNA-Polymerase eine vom SP6-Phagen abgeleitete RNA-Polymerase ist und an einem oder mehreren der Aminosäurereste 633–638 und 670 Tyrosin aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die 3'-dNTP-Derivate 3'-Desoxynucleotid-Derivate sind, dargestellt anhand der folgenden allgemeinen Formel [I]: Q-V-(CH₂)_n-NH-R [I]worin Q für einen 3'-Desoxynucleotid-Rest steht, n eine ganze Zahl nicht kleiner als 1 bedeutet, V -C≡C- oder -C=C- bedeutet, und R für eine fluoreszierende Gruppe steht.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei n in der allgemeinen Formel [I] eine ganze Zahl von 4–10 bedeutet.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei R in der allgemeinen Formel [I] dargestellt wird durch die folgende allgemeine Formel [VII]:
worin W eine Carboxyl-Gruppe bedeutet, X -O-, -S-, -NR'- bedeutet, worin R' ein Wasserstoff-Atom, eine Niederalkyl-Gruppe, eine Aralkyl-Gruppe oder eine Aryl-Gruppe oder -CH₂- bedeutet, einer der Ringe A und B
bedeutet und der andere
bedeutet, worin Z O oder =N⁺R₁R₂ bedeutet und Y OH oder -NR₁R₂ bedeutet, worin R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoff-Atom oder eine Niederalkyl-Gruppe bedeuten, oder R₁ und R₂ beide eine Trimethylen-Gruppe bedeuten (mit der Maßgabe, daß R₁ und R₂ zwei Trimethylen-Gruppen bedeuten, deren jeweils anderes Ende an eines der beiden Kohlenstoff-Atome neben dem Stickstoff-Atom gebunden ist, an das die Trimethylen-Gruppe gebunden ist), die gestrichelte Linie ------ in Ring C:
eine Bindung bedeutet, die an einer Position vorhanden ist, die durch die Struktur von Ring A und Ring B festgelegt ist, und die Ringe A, B und C und der Benzol-Ring mit W gegebenenfalls einen oder mehrere zusätzliche Substituenten aufweisen können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei das eine Promotorsequenz enthaltende DNA-Fragment ein mittels Polymerase-Kettenreaktion amplifiziertes DNA-Produkt ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Nucleinsäure-Transkriptionsreaktion mit dem amplifizierten Produkt durchgeführt wird, ohne die für die Polymerase-Kettenreaktion verwendeten Primer und/oder 2'-Desoxyribonucleosid-5'-triphosphate und/oder Derivate derselben zu entfernen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Nucleinsäure-Transkriptionsreaktion in Gegenwart von anorganischer Pyrophosphatase durchgeführt wird.