KR20000068502A - Ｄｎａ의 염기서열의 결정방법 - Google Patents

Abstract

3'dNTP 유도체를 채택하는 능력을 증가시키도록 변형된 변이형 RNA 폴리머라아제 및 상기 RNA 폴리머라아제를 위한 프로모터 서열을 포함하는 DNA 단편의 존재하에서, 리보누클레오시드 5'-트리포스페이트 및 3'dNTP 유도체를 반응시켜서 핵산 전사 생성물을 얻고, 얻은 핵산 전사 생성물을 분리하고, 얻어진 분리분획에서 핵산의 서열을 알아내는 DNA의 염기서열 결정방법을 개시한다. 이 방법에 따르면, 긴고리의 전사 생성물의 생성이 가능하고, 표식된 디옥시리보누클레오티드로부터의 시그널에 변화가 적은, 보다 정확한 서열 데이터를 얻을 수 있다.

Description

ＤＮＡ의 염기서열의 결정방법{Method of DNA sequencing}

폴리머라아제 연쇄반응(PCR)법은 우수한 방법이고, 매년 그 이용범위가 넓어지고 있다[Randall K. Saiki et al.(1988) Science 239, 487-491]. PCR법으로는, 1분자의 DNA 단편을 증폭시키는 것도 가능하다. PCR법으로 증폭시킨 생성물을 크로닝(croning)하는 일없이 시퀀스하는 방법(다이렉트·시퀀스(direct·sequence)법)도 유용한 방법이다[Corinne Wong et al.(1988) Nature, 330, 384-386]. 이 방법은 라이브러리 제작이나 그 라이브러리의 스크리닝이 불필요하고, 많은 샘플의 서열정보를 동시에 얻을 수 있는 신속한 방법이다.

그러나, 상기 다이렉트·시퀀스법에는 2개의 큰 문제점이 있다.

하나는, 채택할 수 없었던 프라이머(primer) 및 2'디옥시리보누클레오시드 5'-트리포스페이트(2'dNTPs)가 반응계 중에 잔존하고, 이것들이 시퀀스 반응을 방해하는 것이다. 따라서, 종래법에서는, 이러한 잔존하는 프라이머와 2'dNTPs는 시퀀스전에 PCR 생성물로부터 제거할 필요가 있었다. PCR생성물의 정제방법에는 여러방법이 있는데, 예를 들면 전기영동에 의한 정제법, 에탄올 침전법, 겔여과법, HPLC 정제법이 있다[예를 들어, Dorit R. L et al.(1991) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 11, John Wiley and Sons, New York, 15.2.1-15.2.11 참조]. 그러나, 상기 방법 모두 번잡하다.

두번째 문제는, PCR생성물의 신속한 재생(renaturation)이다. PCR생성물이 2중가닥의 DNA로 재생되어 버리면, 1중가닥의 템플레이트(주형)가 아니게 되고, 프라이머와 1중가닥 템플레이트 사이의 어닐링(annealing)을 방해한다. 재생을 최소한으로 하기 위한 방법으로서, 예를 들면 변성후의 급냉, 한 개의 프라이머의 비오틸레이션(biotilation)과 스트랩트애비딘(streptavidin) 피복물로의 PCR 생성물의 흡착, 엑소누클레아제(exonuclease)의 사용, 비대칭성 PCR(asymmetric PCR)등이 보고되어 있다. 예를 들면, Barbara Bachmann 등, 1990, Nucleic Acid Res., 18, 1309에 개시되어 있다. 그러나, 이러한 방법의 대부분은 긴 시간을 필요로 하고, 상당히 번거롭다.

그래서 이것을 해결하기 위한 새로운 방법으로서, 본 발명자들은 PCR 반응계중에 잔존하는 미반응의 프라이머 및 2'디옥시리보누클레오시드 5'-트리포스페이트 (2'dNTPs)를 제거하는 일없이, 또한 PCR 반응 생성물이 신속하게 재생하는 문제를 피하기 위해, 변성자체를 완전히 실시하지 않아서 바람직한, 전혀 새로운 DNA의 염기서열 결정방법을 제안하였다[WO96/14434]. 이 방법은 T7 RNA 폴리머라아제 등의 RNA 폴리머라아제와 RNA 전사반응의 터미네이터(예를 들어, 3'디옥시리보누클레오시드 5'-트리포스페이트, 3'dNTPs)를 이용하는 다이렉트 전사 시퀀스법이다. 이 방법에 따르면, 폴리머라아제 연쇄반응에 의해 증폭된 DNA 생성물의 염기서열을 프라이머 및 2'디옥시리보누클레오시드 5'-트리포스페이트(2'dNTPs)를 제거할 필요없이 그대로 시퀀스에 사용할 수 있다. 또한 변성자체를 전혀 실시하지 않기 때문에 PCR 생성물이 신속하게 재생하는 문제도 피할 수 있으며, 상당히 우수한 방법이다.

그러나, 상기 방법에 대하여 본 발명자들이 더욱 연구를 진행한 결과, 보다 정확한 염기서열 데이터를 얻기 위해서는 더욱 해결해야 할 과제가 있음을 발견하였다.

상기 염기서열 결정법에 있어서, T7 RNA 폴리머라아제 등의 RNA 폴리머라아제는 ATP, GTP, CTP 및 UTP 또는 이들의 유도체로 이루어진 리보누클레오시드 5'-트리포스페이트 및, 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 3'dUTP 또는 이들의 유도체로 이루어진 적어도 1종의 3'디옥시리보누클레오티드의 혼합물중에서 반응시킨다. 이 반응에 있어서, 주형의 서열에 상응한 염기를 갖는 리보누클레오티드 및 디옥시리보누클레오티드가 리보누클레오티드 서열중에서 차례차례로 채택되는 것으로, 폴리리보누클레오티드가 합성된다.

그런데, 리보누클레오티드와 비교하여, 대응하는 3'디옥시리보누클레오티드나 그 유도체는 상기 서열에서 채택되기 어려우며, 더욱이 리보누클레오티드 및 3'디옥시리보누클레오티드 중에서도 각각 염기의 종류에 의해, 서열로의 채택방법에 차이가 있는 것으로 판명되었다. 이 같이 리보누클레오티드와 3'디옥시리보누클레오티드 사이, 및 다른 염기를 갖는 리보누클레오티드 사이 및 다른 염기를 갖는 디옥시리보누클레오티드 사이에서의 바이어스(bias)가 존재하기 때문에 전사생성물은 얻어지지만, 얻은 전사 생성물은 짧은 사슬이기도 하고, 표식된 리보누클레오티드로부터의 시그널(signal)에 변화가 있기도 하여, 정확한 서열 데이터를 얻는 것이 어려웠다.

그래서, 본 발명의 목적은 이 채택능력에 대해서 누클레오티드의 종류에 따른 바이어스가 적거나 또는 전혀 없는 RNA 폴리머라아제를 이용하여, 긴 사슬의 전사 생성물의 생성이 가능하고, 표식된 디옥시리보누클레오티드로부터의 시그널에 변화가 적은, 보다 정확한 서열 데이터를 얻을 수 있는 DNA의 염기서열 결정방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 명세서에 있어서, 아미노산 잔기는, 통상적으로 사용되고 있는 일문자 표기법을 이용한다. 이해를 돕기 위해, 본문중에 나오는 아미노산만을 기술해 보면, 페닐알라닌(phenylalanine)(F), 티로신(tyrosine)(Y), 프롤린(proline) (P), 로이신(leucine)(L), 히스티딘(histidine)(H)이다. 또한, 폴리머라아제 단백질의 N말단으로부터의 번호를 기재하고, 예를 들면 F667과 같이 표기한다. 이것은 이 폴리머라아제의 667번째의 아미노산 잔기가 F인 것을 나타내고, F667Y는 667번째의 아미노산 잔기 F를 Y로 치환시키는 것을 의미한다.

그런데, DNA 폴리머라아제에 대해서도, 누클레오티드의 종류에 따라 채택에 차이가 있는 것으로 알려져 있고, 더욱이 이와 같은 채택의 차이를 해소한 변이형 DNA 폴리머라아제가 알려져 있다[일본국 특개평 제 8-205874호, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 92:6339-6345, (1995)].

거기에는, T7 DNA 폴리머라아제를 이용한 시퀀스 반응에 있어서의 균일성은 이 폴리머라아제 중의 526번째의 아미노산이 가져온 결과라는 것이 기재되어 있다. 더욱이, 이 효소와 그 밖의 DNA 폴리머라아제의 아미노산 서열의 상동성에 기초하여, 다른 DNA 폴리머라아제의 상동부위의 아미노산을 변화시킴으로써, 채택에 따른 바이어스가 저하된다고 기재되어 있다. 즉, T7 DNA 폴리머라아제의 Y(티로신)526이 2'-dNTP와 2'3'-ddNTP 채택효율의 바이어스가 적은 원인이다. 또한, 대장균 DNA 폴리머라아제 Ⅰ의 F(페닐알라닌)762, 및 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) DNA 폴리머라아제(Taq DNA 폴리머라아제라고 일반적으로 불림)의 F(페닐알라닌)667이 T7 DNA 폴리머라아제의 Y526의 상동한 아미노산 잔기이고, 이 아미노산 잔기를 각각 F762Y(티로신) 및 F667Y(티로신)으로 변화시키는 것으로 채택바이어스가 저하된다고 기재되어 있다.

또한, 이와 같은 DNA 폴리머라아제에 관한 데이터에 기초하여, T7 RNA 폴리머라아제에 대해서도, DNA 폴리머라아제에서 의논되어 있는 영역과 상동한 영역, 즉 잔기 631-640에 대한 변형은 dNTP에 대한 그 특이성을 변화시킬 것임을 시사한다고 기재하고 있다.

또한, RNA 폴리머라아제에 대해서는 지금까지 시퀀스법에서 사용된 일은 없고, 리보누클레오티드의 채택에 차이가 있는 것자체가 문제되지 않았다. 더욱이, 이와 같은 상황하에서, 당연하게 채택의 차이를 해소하는 변이형 RNA 폴리머라아제는 알려져 있지 않았다. 사실상, 상기 일본국 특개평 제 8-205874호 공보에는, T7 RNA 폴리머라아제를 변형한 실례는 기재되어 있지 않다.

더욱이, T7 RNA 폴리머라아제의 이 영역은 Protein Engineering, 3:461-467, 1990에 나타나 있는 모티프 B 중의, DNA 폴리머라아제의 α형, Ⅰ형 및 DNA 의존성 RNA 폴리머라아제(T7 RNA 폴리머라아제는 이 안으로 분류된다)에서 특히 보존된 아미노산 K와 YG 사이의 9∼10 아미노산 잔기로 이루어진 영역에 상당한다고 생각된다. 앞서 DNA 폴리머라아제에서 의논되었던 대장균 DNA 폴리머라아제의 아미노산 잔기 762 또는 Taq DNA 폴리머라아제의 아미노산 잔기 667의 F(페닐알라닌)는 Ⅰ형으로 분류되어 있는 DNA 폴리머라아제의 다수에서 관찰된다. 또한 놀라운 것으로, DNA 폴리머라아제와 상당히 상동성이 높음에도 불구하고, T7 RNA 폴리머라아제에서는, 상기 영역에 상당하는 잔기 631-640에서는 F(페닐알라닌)는 존재하지 않고, 상기 공보의 시사를 그대로 실현할 수 없음이 판명되었다.

더하여, 본 발명자들은 대장균 DNA 폴리머라아제 Ⅰ의 F762의 위치는 핑거·서브도메인(finger·subdomain)의 나사선(helix) O에 존재하고, T7 RNA 폴리머라아제에 있어서, 이 영역에 상당하는 영역에 있어서의 아미노산의 변형을 검토하였다. 그런데, Sousa et al.의 문헌(Nature, 364:593-599, 1993)에 나타난 입체구조상으로부터의 대장균 DNA 폴리머라아제 Ⅰ의 나사선 O에 상당하는 T7 RNA 폴리머라아제 중의 나사선 Z에도 F(페닐알라닌)는 없었다.

이와 같은 상황하에서, 본 발명자들은 이 채택능력에 대해 리보누클레오티드 및 3'-디옥시누클레오티드의 종류에 따른 바이어스가 적거나 또는 전혀 없는 RNA 폴리머라아제를 제공하는 것으로 목적으로 하여, 새로운 RNA 폴리머라아제를 독자적으로 찾아내었다. 그 결과, 야성형(野性型) RNA 폴리머라아제의 아미노산의 일부를 변형하는 것이고, 3'디옥시리보누클레오티드 또는 그 유도체를 채택하는 능력을 증가시킨 RNA 폴리머라아제를 발견하였고, 본 발명의 DNA 염기서열 결정방법을 완성하였다.

또한, 후술의 설명에서 명백해지지만, 본 발명에서 사용하는 변이형 RNA 폴리머라아제, 특히 그 아미노산 변형 위치는 상기 일본국 특개평 제 8-205874호에서는 전혀 시사도 교시도 되어 있지 않은 부위이고, 이번에 전혀 새롭게 발견한 것이다.

더욱이, 본 발명자들이 검토한 바로는, 리보누클레오티드의 채택에 관한 바이어스는 변이형 RNA 폴리머라아제를 이용하는 것으로 어느 정도 해소되지만, 핵산 신장반응에 있어서의 터미네이터로서 형광표식된 3'디옥시리보누클레오티드를 사용한 경우 채택에 관한 바이어스가 그대로 어느 정도 남겨짐이 판명되었다.

그래서 본 발명의 또 다른 목적은 보다 실용적인 관점에서, 형광표식된 3'디옥시리보누클레오티드를 사용한 경우에도 채택에 관한 바이어스를 해소하여 보다 정확한 염기서열을 알아내는 방법을 제공하는데 있다.

발명의 요약

본 발명은 RNA 폴리머라아제 및 상기 RNA 폴리머라아제를 위한 프로모터 서열을 포함하는 DNA 단편의 존재하에서, ATP, GTP, CTP 및 UTP 또는 이들의 유도체로 이루어지는 리보누클레오시드 5'-트리포스페이트 및, 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 3'dUTP 및 이들의 유도체로 이루어지는 1종 또는 2종 이상의 3'디옥시리보누클레오시드 5'-트리포스페이트(이하, 3'dNTP 유도체)를 반응시켜 핵산 전사 생성물을 얻고, 얻은 핵산 전사 생성물을 분리하고, 얻어진 분리분획에서 핵산의 서열을 알아내는 DNA의 염기서열 결정방법에 있어서, 상기 RNA 폴리머라아제가, 대응하는 야성형 RNA 폴리머라아제의 능력과 비교하여, 상기 3'dNTP 유도체를 채택하는 능력을 증가시키도록, 적어도 하나의 아미노산이 변형된 야성형 RNA 폴리머라아제로 이루어진 변이형 RNA 폴리머라아제임을 특징으로 하는 DNA의 염기서열 결정방법에 관한 것이다.

더욱이 본 발명은 상기 DNA의 염기서열 결정방법에 있어서, 3'dNTP 유도체가 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 3'디옥시리보누클레오티드 유도체인 방법에 관한 것이다.

[식중, Q는 3'디옥시리보누클레오티드 잔기를 나타내고, n은 1이상, 바람직하게는 4이상의 정수를 나타내며, V는 -C≡C- 또는 -CH=CH-를 나타내고, R은 형광성을 갖는 기를 나타낸다.

또한 본 발명은 상기 DNA의 염기서열 결정방법에 있어서, 핵산 전사 생성반응을 무기 피로포스파타아제의 존재하에서 실시하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 DNA의 염기서열 결정방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 변이형 RNA 폴리머라아제(mutated RNA polymerase)를 이용하는 DNA의 염기서열 결정방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 형광표식된 터미네이터(terminator)로서 신규한 3'디옥시리보누클레오티드 유도체(3'deoxyribonucleotide derivative)를 이용하는 DNA의 염기서열의 결정방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 핵산 전사 생성반응에 무기 피로포스파타아제(pyrophosphatase)를 병용하는 DNA의 염기서열 결정방법에 관한 것이다.

도 1은 T7 파아지 게놈(phage genome)상의 T7 RNA 폴리머라아제 유전자와 코드화 되어 있는 T7 RNA 폴리머라아제의 아미노산 서열(전반)이다. 상단은, 염기서열, 하단은 그 서열에 대응하는 아미노산 서열을 나타낸다. 오른쪽단의 숫자는 염기서열의 경우, DNA 서열 데이터베이스 GeneBank에 등록되어 있는 T7 파아지 게놈(Locus T7CG, 39, 937 염기대)의 번호를 나타내고, 아미노산의 번호는 T7 RNA 폴리머라아제 최초의 M(메티오닌(methionine))을 1로 하여, 전체 길이 883 아미노산 잔기로 되어 있는 것을 나타낸다.

도 2는 T7 파아지 게놈상의 T7 RNA 폴리머라아제 유전자와 코드화 되어 있는 T7 RNA 폴리머라아제의 아미노산 서열(후반)이다. 상단은, 염기서열, 하단은 그 서열에 대응하는 아미노산 서열을 나타낸다. 오른쪽단의 숫자는 염기서열의 경우, DNA 서열 데이터베이스 GeneBank에 등록되어 있는 T7 파아지 게놈(Locus T7CG, 39, 937 염기대)의 번호를 나타내고, 아미노산의 번호는 T7 RNA 폴리머라아제 최초의 M(메티오닌)을 1로 하여, 전체 길이 883 아미노산 잔기로 되어 있는 것을 나타낸다.

도 3은 현재 보고되어 있는 파아지 유래 RNA 폴리머라아제의 아미노산 서열의 비교(전반)이다. 최상단의 T7 RNA 폴리머라아제를 기준으로 하여 ·는 T7 RNA 폴리머라아제와 동일한 아미노산, -는 결손, 최하단의 *는 모든 폴리머라아제에서 공통하여 있는 아미노산임을 나타낸다.

도 4는 현재 보고되어 있는 파아지 유래 RNA 폴리머라아제의 아미노산 서열의 비교(후반)이다. 최상단의 T7 RNA 폴리머라아제를 기준으로 하여 ·는 T7 RNA 폴리머라아제와 동일한 아미노산, -는 결손, 최하단의 *는 모든 폴리머라아제에서 공통하여 있는 아미노산임을 나타낸다.

도 5는 T7 RNA 폴리머라아제의 변이부위 도입부위의 상세도이다. 흰색문자는 변이도입된 아미노산을 나타내고 있다.

도 6은 T7 RNA 폴리머라아제와 T3 RNA 폴리머라아제의 아미노산 서열의 비교(전반)이다. 최상단의 T7 RNA 폴리머라아제를 기준으로 하여 ·는 동일한 아미노산, -는 결손, 최하단의 *는 2개의 폴리머라아제에서 공통하여 있는 아미노산임을 나타낸다.

도 7은 T7 RNA 폴리머라아제와 T3 RNA 폴리머라아제의 아미노산 서열의 비교(후반)이다. 최상단의 T7 RNA 폴리머라아제를 기준으로 하여 ·는 동일한 아미노산, -는 결손, 최하단의 *는 2개의 폴리머라아제에서 공통하여 있는 아미노산임을 나타낸다.

도 8은 T7 RNA 폴리머라아제의 잔기 641-667 전후의 서열과, 그에 대응하는 영역의 T3 RNA 폴리머라아제, K11 RNA 폴리머라아제, 및 SP6 RNA 폴리머라아제 아미노산 서열을 나타낸다. T7 RNA 폴리머라아제에 대해서는, 잔기를 모두 나타내었지만, 대응하는 T3, K11, SP6에 대해서는 T7로, 같은 잔기에 대해서는 ·(dot)로 표시하였다.

도 9는 야생형(野生型) T7 RNA 폴리머라아제를 발현하는 플라스미드, pT7R의 구축도이다.

도 10은 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y를 발현하는 플라스미드, pT7R F644Y의 구축도이다.

도 11은 T7 RNA 폴리머라아제 유전자 중에 제한효소 XhoI 부위를 갖는 pT7R의 개량형 플라스미드, pT7R-Xho의 구축도이다.

도 12는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 L665P/F667Y를 발현하는 플라스미드, pT7R L665P/F667Y의 구축도이다.

도 13은 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y/L665P/F667Y를 발현하는 플라스미드, pT7R F644Y/L665P/F667Y의 구축도이다.

도 14는 합성예 6에서 얻어진, 카르복시로다민(carboxyrhodamine) X 표식 3'-디옥시시티딘(cytidine)-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=3인 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 15는 합성예 10에서 얻어진, 카르복시로다민 X 표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 16은 합성예 14에서 얻어진, 카르복시로다민 X 표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=6인 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 17은 합성예 23에서 얻어진, 카르복시로다민 6G 표식 7-데아자-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4의 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 18은 합성예 26에서 얻어진, 카르복시로다민 6G 표식 7-데아자-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=6의 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 19는 합성예 30에서 얻어진, 카르복시테트라메틸로다민 표식 3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4의 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 20은 합성예 39에서 얻어진, 카르복시로다민 110 표식 7-데아자-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4의 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 21은 합성예 53에서 얻어진, 카르복시로다민 110 표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4의 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 22는 합성예 54에서 얻어진, 카르복시로다민 6G 표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4의 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 23은 합성예 55에서 얻어진, 카르복시로다민 X 표식 7-데아자-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 24는 합성예 56에서 얻어진, 카르복시로다민 X 표식 7-데아자-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 25는 합성예 61에서 얻어진, 카르복시테트라메틸로다민 표식 3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4인 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 26은 합성예 64에서 얻어진, 카르복시로다민 X 표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4인 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 27은 합성예 67에서 얻어진, 카르복시로다민 6G 표식 3'-디옥시-7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4인 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 28은 합성예 70에서 얻어진, 카르복시로다민 110 표식 3'-디옥시-7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4인 화합물)의 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸다.

도 29는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제에 따른 다이·터미네이터의 채택율의 개선을 나타낸다. 다이·터미네이터로서, Rox-3'dCTP를 사용하였다. 야생형 T7 RNA 폴리머라아제(WT), 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y(F644Y), 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 L665P/F667Y(F667Y).

도 30은 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y에 따른 다이·터미네이터의 채택율의 개선을 나타낸다. 다이·터미네이터로서, Rox-3'dCTP를 사용하였고, 일렉트로그램으로써 표시하였다. 야생형 T7 RNA 폴리머라아제(WT), 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y(F644Y).

도 31은 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 L665P/F667Y에 따른 다이·터미네이터의 채택율의 개선을 나타낸다. 다이·터미네이터로서, Rox-3'dCTP를 사용하였고, 일렉트로그램으로써 표시하였다. 야생형 T7 RNA 폴리머라아제(WT), 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 L665P/F6667Y(F667Y).

도 32는 시퀀스 반응예로서, 야생형 T7 RNA 폴리머라아제(WT), 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y(F644Y), 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 L665P/F667Y(F667Y)를 이용하여 반응시킨 결과를 나타낸다. 모두 동일한 영역의 시퀀스 패턴이지만, 야생형 T7 RNA 폴리머라아제(WT)(최상단)에서는, 베이스콜이 정확히 기능하지 않고, 염기의 간격이 좁고(염기의 표시가 겹쳐버림), 정확하게 시퀀스할 수 없음을 알 수 있다.

도 33은 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 L665P/F667Y를 사용하고, 연결자 길이가 다른 다이·터미네이터(dye·terminator)를 사용하며, T7 RNA 폴리머라아제를 사용한 시퀀스 결과의 비교이다.

도 34-1 및 도 34-2는 T7 프로모터를 갖는 벡터를 주형으로서 이용했을 때의 시퀀스 결과를 나타낸다.

도 35는 PCR 산물을 주형으로 이용했을 때의 시퀀스 결과를 나타낸다.

도 36-1 및 도 36-2는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제를 이용한 시켄신스반응에 대한 무기 피로포스파타아제의 첨가효과를 나타내는 시퀀스 결과(무첨가 및 0.425단위첨가)를 나타낸다.

도 37-1 및 도 37-2는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제를 이용한 시켄신스반응에 대한 무기 피로포스파타아제의 첨가효과를 나타내는 시퀀스 결과(0.0425단위첨가 및 0.00425단위첨가)를 나타낸다.

도 38은 PCR 산물을 주형으로서 사용한 시퀀스 반응에 대한 무기 피로포스파타아제의 첨가효과를 나타낸 시퀀스 결과를 나타낸다.

도 39는 hTSH-βcDNA에 대해 무기 피로포스파타아제 무첨가로 실시한 시퀀스 결과를 나타낸다. 알아낸 염기서열을 이미 보고되어 있는 hTSH-βcDNA와 비교하였다.

도 40은 hTSH-βcDNA에 대해 무기 피로포스파타아제를 첨가하여 실시한 시퀀스 결과를 나타낸다. 알아낸 염기서열을 이미 보고되어 있는 hTSH-βcDNA와 비교하였다.

도 41-1∼도 41-4는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y/L665P/F667Y에 따른 다이·터미네이터의 채택율의 개선결과를 일렉트로그램으로 표시하였다.

도 42는 참고예 8에 있어서 터미네이터로서 TMR-3'dUTP(n4)를 이용하여 얻은 터미네이션·패턴(A) 및 터미네이터로서 TMR-Allyl-3'dUTP(n4)를 이용하여 얻은 터미네이션·패턴(B)를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 설명

본 발명의 DNA 염기서열 결정방법은 RNA 폴리머라아제 및 상기 RNA 폴리머라아제를 위한 프로모터 서열을 포함하는 DNA 단편의 존재하에서, 리보누클레오티드 (NTP)와 3'디옥시리보누클레오티드(3'dNTP) 유도체, 특히 형광물질과 3'디옥시리보누클레오티드 사이에 연결자(linker)를 삽입한 3'dNTP 유도체를 반응시켜, 얻은 핵산 전사 생성물의 분리분획의 패턴으로부터 핵산의 서열을 알아내는 것으로 이루어지며, RNA 폴리머라아제로서 변이형 RNA 폴리머라아제를 이용하는데 특징이 있다.

변이형 RNA 폴리머라아제

본 발명에서 사용하는 변이형 RNA 폴리머라아제는, 대응하는 야성형 RNA 폴리머라아제의 능력과 비교하여, 3'dNTP 유도체를 채택하는 능력을 증가시키도록, 야성형 RNA 폴리머라아제의 적어도 하나의 아미노산이 변형된 것이다.

본 발명에 있어서, 「야성형 RNA 폴리머라아제」라는 것은 천연에 존재하는 모든 RNA 폴리머라아제를 의미한다. 또한 「야성형 RNA 폴리머라아제」는 야성형 RNA 폴리머라아제로서, 대응하는 야성형 RNA 폴리머라아제의 능력과 비교하여, 3'디옥시리보누클레오티드 또는 이들의 유도체를 채택하는 능력을 증가시키는 것을 목적으로 하는 변형 이외의 아미노산의 치환, 삽입 또는 누락을 더욱 갖는 것도 가능하다. 즉, 야성형 RNA 폴리머라아제를 인위적으로 상기 이외의 목적으로 변형한 RNA 폴리머라아제도, 상기 「야성형 RNA 폴리머라아제」에 포함된다. 단, 이와 같은 아미노산의 치환, 삽입 또는 누락은 RNA 폴리머라아제로서의 활성을 유지하는 범위에서 실시된 것임이 적당하다.

「야성형 RNA 폴리머라아제」로서는, 예를 들어 T7 파아지, T3 파아지, SP6 파아지, K11 파아지에서 유래된 RNA 폴리머라아제를 들 수 있다. 단, 이러한 RNA 폴리머라아제에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 있어서 「야성형 RNA 폴리머라아제」는 천연에 존재하는 내열성의 RNA 폴리머라아제, 및 천연에 존재하는 RNA 폴리머라아제를 내열성을 갖도록 인위적으로 변형한 (즉, 아미노산의 치환, 삽입 또는 누락을 실시한) 것도 포함한다. 단, 내열성을 부여하기 위한 변형은, RNA 폴리머라아제로서의 활성을 유지하는 범위에서 실시되는 것이 적당하다. 「야성형 RNA 폴리머라아제」로서 내열성의 RNA 폴리머라아제를 이용한 본 발명의 변이형 RNA 폴리머라아제도 내열성을 갖는다. 그 결과, 예를 들면, PCR법과 병용하여, PCR산물을 주형으로 하여 그 곳에서 즉, PCR과 병행하여 시퀀스용 RNA 단편을 합성할 수도 있다.

T7 RNA 폴리머라아제는 대단히 특이성이 높은 프로모터 특이적 RNA 폴리머라아제로서 알려져 있다. T7 RNA 폴리머라아제의 염기서열과 생산법에 관해서는 Davanloo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81:2035-2039(1984)에 기재되어 있다. 또한 대량생산에 관해서는, Zawadzki et al., Nucl. Acids Res., 19:1948 (1991)에 이미 기재되어 있다. 이 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제는 대장균이나 고등한 생물의 RNA 폴리머라아제와 달리, 단일의 폴리펩티드만으로 전사반응을 실시할 수 있다(Chamberlin et al., Nature, 228:227-231,1970). 이 때문에, 전사 메카니즘을 해석하는 형태의 재료가 되고, 많은 돌연변이체가 분리된다고 보고되어 있다. 또한 Sousa et al., Nature, 364:593-599, 1993에 결정해석결과가 기재되어 있다.

또한, 그 밖에 가장 특이성이 높은 프로모터 특이적 RNA 폴리머라아제로서 대장균에 감염되는 T3 파아지, 살모넬라균(salmonella)에 감염되는 SP6 파아지 및 Klebsiella pneumoniae에 감염되는 K11 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제의 3개가 잘 알려져 있다.

또한, 상기 4종의 RNA 폴리머라아제는 후술하는 바와 같이, 아미노산의 일차구조, 프로모터의 서열등, 가장 유사하다.

본 발명에서 사용하는 변이형 RNA 폴리머라아제는, 대응하는 야성형 RNA 폴리머라아제의 능력과 비교하여, 3'디옥시리보누클레오티드 또는 이들의 유도체를 채택하는 능력을 증가시킨 것이다. 전술한 바와 같이, 야성형 RNA 폴리머라아제에서는, 리보누클레오티드에 비해 3'디옥시리보누클레오티드의 채택이 나쁘고, 염기서열 결정법에 이용하는데 방해가 되고 있다. 그에 비해, 상기 변이형 RNA 폴리머라아제는, 3'디옥시리보누클레오티드 또는 이들의 유도체에 대한 채택능력을 바람직하게는 야성형의 적어도 2배로 증가시키도록 변형되어 있다. 3'디옥시리보누클레오티드의 채택은, 3'디옥시리보누클레오티드에서 형광표식을 갖는 3'디옥시리보누클레오티드 유도체를 이용한 경우에 특히 저하되는 경향이 있지만, 상기 변이형 RNA 폴리머라아제는 이 같은 3'디옥시리보누클레오티드 유도체의 채택도 개선할 수 있다.

또한, 여기서 리보누클레오티드라는 것은, ATP, GTP, CTP, 및 UTP 또는 이들의 유도체로 이루어진 리보누클레오시드 5'-트리포스페이트를 의미하고, 3'디옥시리보누클레오티드는 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 및 3'dUTP를 의미하고, 그 유도체는 이러한 3'디옥시리보누클레오티드에 예를 들면 형광표식을 한 화합물을 의미한다.

본 발명의 RNA 폴리머라아제는 대응하는 야성형 RNA 폴리머라아제의 적어도 하나의 아미노산이 변형되어 있는 것이다. 이점에 대해서 이하 상세히 설명한다.

본 발명자는 전술한 바와 같이 T7 RNA 폴리머라아제에 관한 여러가지 보고를 검토한 후에, T7 RNA 폴리머라아제에 있어서의 리보누클레오티드 등의 종류에 의해 채택효율에 바이어스가 적거나 또는 전혀 없는 RNA 폴리머라아제 변이체를 구축하는 것을 검토하였다. 특히, 야성형 RNA 폴리머라아제 상의 어떤 아미노산을 변이시키는 것인지, 또한 변이로서 치환을 실시하는 경우, 어떤 아미노산으로 치환되면 좋은지에 대해서 실질적으로 여러 변이체를 작성하여 검토하고, 야성형 RNA 폴리머라아제의 적어도 하나의 아미노산을 변형하는 것으로 3'디옥시리보누클레오티드 또는 이들의 유도체를 채택능력을 개선할 수 있음을 발견하였고, 상기 변이형 RNA 폴리머라아제를 완성하였다.

본 발명자는 우선 T7 RNA 폴리머라아제 유전자를 삽입한 발현 플라스미드 pT7R을 구축하고, 이어서 이 발현 플라스미드 pT7R을 베이스로 하여 T7 RNA 폴리머라아제의 변이체를 구축하였다. 즉, T7 RNA 폴리머라아제의 F(페닐알라닌) 잔기를 Y(티로신) 잔기로 변화시킨 변이형 T7 RNA 폴리머라아제인 F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y, F882Y를 구축하고, 이러한 변이체에 대해서 채택능력의 비교를 실시하였다. 또한, 문헌(Sousa., EMBO J., 14:4609-4621(1995))에서는, T7 DNA 폴리머라아제의 Y526에 상당하는 위치인 T7 RNA 폴리머라아제의 Y639F 변이체의 성질을 기술하고 있다. 특히, 일본국 특개평 제 8-205874호에서 기재된 dNTP에 대한 그 특이성을 변화시킬 것임을 시사한 잔기 631-640에 포함된 Y639F 변이체도 구축하였다.

본 명세서에 있어서, 야성형 T7 RNA 폴리머라아제의 아미노산 서열은 유전자 서열 데이터베이스인 GeneBank로부터 accession No. V01148 J02518 X00411의 T7 파아지 DNA 서열(39,937염기대)의 염기번호 3171-5822에 코드화되어 있는 서열(도 1 및 도 2 참조)을 기초로 하고 있다. 도 1 및 도 2에 나타난 서열의 상단은 염기서열, 하단은 그 서열에 대응하는 아미노산 서열이다. 오른쪽단의 숫자는 염기서열의 경우 GeneBank에 등록되어 있는 T7 파아지 게놈(Locus T7CG, 39,937염기대)의 번호를 나타내고, 아미노산의 번호는 T7 RNA 폴리머라아제 최초의 M(메티오닌)을 1로 하여, 전체길이 883 아미노산 잔기로 이루어져 있음을 나타낸다.

또한, 이 아미노산 서열은 상기 Moffatt et al., J. Mol. Biol., 173(2): 265-269, 1984에 보고되어 있는 아미노산 서열과 동일하다.

따라서, 본 명세서에 있어서의 야성형 T7 RNA 폴리머라아제 유전자의 아미노산 서열 및 각 아미노산에 매겨진 번호는 이 도 1 및 도 2에 나타난 서열 및 번호이다. 더욱이, 전술한 바와 같이, 상기 야성형 T7 RNA 폴리머라아제는 본 발명에서 목적으로 하는 변형이외의 아미노산의 치환, 삽입 또는 누락을 더욱 갖는 것일 수도 있다. 따라서, 3'디옥시리보누클레오티드 또는 이들의 유도체를 채택하는 능력을 증가시키는 목적으로 변이를 도입해야 하는 야성형 RNA 폴리머라아제가 야성형 T7 RNA 폴리머라아제에 다른 변이를 도입한 것인 경우, 특히 그와 같은 변이가 아미노산의 삽입 또는 누락인 경우, 그와 같은 삽입 또는 누락에 대해, 상기 아미노산 번호는 변동하고, 아미노산 번호가 도 1 및 도 2에 나타난 번호와 다르다해도, T7 RNA 폴리머라아제 활성을 유지하고 있는 한, 그와 같이 삽입 또는 누락을 갖는 T7 RNA 폴리머라아제도, 3'디옥시리보누클레오티드 또는 이들의 유도체를 채택하는 능력을 증가시키는 목적으로 변이를 도입하는 야생형 T7 RNA 폴리머라아제의 범주에 포함된다.

T7 RNA 폴리머라아제 이외의 RNA 폴리머라아제에 대해서의 아미노산 서열의 번호는 도 3 및 도 4에 나타난 서열표에 기초하여 결정된다. 또한, 본 발명에서 목적으로 하는 변형 이외의 아미노산 치환, 삽입 또는 누락을 더욱 갖는 것임도 가능하다. 따라서, 이런 아미노산 서열 및 그 번호에 붙어도, T7 RNA 폴리머라아제의 경우와 동일하고, 아미노산의 삽입 또는 누락에 따른 변이가 있는 경우, 그와 같은 삽입 또는 누락에 대해서, 상기 아미노산 번호는 변동하지만, 그와 같은 일부에 변이를 갖는 야성형 RNA 폴리머라아제도 본 발명에 있어서 3'디옥시리보누클레오티드 또는 이들의 유도체를 채택하는 능력을 증가시키는 목적으로 변이를 도입하는 야생형 T7 RNA 폴리머라아제의 범주에 포함된다.

T7 RNA 폴리머라아제 유전자는 T7 파아지 DNA를 정제후, T7 RNA 폴리머라아제 유전자의 N말단 아미노산 영역 상류에 특이적인 프라이머(T7Rpol-N: 5'-ATA TTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA ACA CGA TTA ACA TCG CTA AG -3'), 및 C말단 아미노산 영역 하류에 특이적인 프라이머(T7Rpol-C: 5'-ATA TTT TAG CCA TGG TAT AGT GAG TCG TAT TGA TTT GGC G-3')을 합성하고, PCR을 이용하여 증폭, 발현벡터 pT7R을 구축할 수 있다(참고예 1 참조). 이 발현벡터를 이용하고, 대장균 DH5α로 형질전환하고, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가하면, T7 RNA 폴리머라아제 단백질을 대량으로 발현한다.

이 T7 RNA 폴리머라아제 유전자의 아미노산 서열을, 도 1 및 도 2에 나타난 아미노산 서열과 비교한 결과, 둘다 완전히 일치하였다. 또한 도 1 및 도 2에 나타난 아미노산 서열과 Grachev et al., Bioorg., Kim., 10:824-843, 1984에 보고되어 있는 아미노산 서열은 도 1 및 도 2에 나타난 아미노산 서열에 있어서의 623번째의 Y 및 665번째의 L이, Grachev et al.의 보고에 있어서의 아미노산 서열에서는 각각 H(623번째) 및 P(665번째)인 점에서 다르다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 변이형 RNA 폴리머라아제의 베이스가 되는 야성형 RNA 폴리머라아제는 도 1 및 도 2에 나타난 서열에 대하여, 본 발명에서 목적으로 하는 변형 이외의 아미노산의 치환, 삽입 또는 누락을 더욱 갖는 것임도 가능하고, 상기 Grachev et al.이 보고하는 623번째 및 665번째의 잔기가 각각 H 및 P인 아미노산 배열도, 본 발명의 변이형 RNA 폴리머라아제의 베이스가 되는 야성형 RNA 폴리머라아제에 포함된다.

발현벡터 pT7R을 갖는 대장균으로 정제한 T7 RNA 폴리머라아제는 인·비트로로 T7 프로모터를 포함한 DNA 존재하에서 충분한 RNA 합성 활성을 갖고 있었다. 이 발현 플라스미드 pT7R을 베이스로 하여 변이형 T7 RNA 폴리머라아제로서, 전술한 Y639F, F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y, F882Y를 구축하고, 이러한 변이체에 대해서 채택능력의 비교를 실시하였다.

또한, F644Y 변이를 갖는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제에 대해서는, F644에 대한 변이 이외에, F644 근처의 L665를 전술한 Grachev et al.의 보고에 따라서 P로 하는 변이도 도입하였다. 즉, F644Y/L665P로 하여 변이를 도입하고, L665P의 영향을 조사하였다. 또한, F667Y 변이를 갖는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제도, F667에 대한 변이이외에, F667 근처의 L665를 전술한 Grachev et al.의 보고에 따라서 P로 하는 변이도 도입하였다. 즉, L665P/F667Y로 하여 변이를 도입하였다.

더욱이 F644Y/L665P/F667Y 변이를 도입한 변이형 T7 RNA 폴리머라아제도 구축하였다. 이러한 변이체의 채택능력의 비교도 실시하였다.

변이를 도입한 T7 RNA 폴리머라아제를 정제하고, 프로모더 서열 특이적인 RNA합성과 ATP, GTP, CTP 및 UTP 또는 이들의 유도체로 이루어진 리보누클레오시드 5'-트리포스페이트 및, 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 3'dUTP 또는 이들의 유도체의 채택능력을 야생형 T7 RNA 폴리머라아제와 비교하였다. 결과는 후술한 표 1에 나타내었다.

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, F644Y, F644Y/L665P, L665P/F667Y 및 F644Y/L665P/F667Y는 RNA 합성활성을 충분히 유지하고, 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 3'dUTP 또는 이들의 유도체의 채택의 큰 폭의 개선이 발견되었다. 또한 F644Y/L665P 변이체의 채택능력은 F644Y 변이체와 동일하였다. 이 결과로부터, 665의 로이신이 프롤린으로 치환되는 것은 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 3'dUTP 또는 이들의 유도체의 채택에 영향이 없음을 알 수 있다. 또한, 표 1에는, L665P/F667Y 변이체의 결과만을 나타내지만, F667Y 변이체도 L665P/F667Y 변이체의 채택능력과 동일하였다. 또한 F644Y/L665P/F667Y 변이체의 채택능력이 가장 높았다. 또한 표 1에는 나타내지 않았지만, F644Y/F667Y 변이체의 채택능력은 F644Y/L665P/F667Y 변이체의 채택능력과 거의 동일하였다.

F782Y변이체는 RNA 합성활성을 보지하고 있고, 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 3'dUTP 또는 이들의 유도체의 채택능력도 약간 개선하였다. F733Y 변이체는 RNA 합성활성이 약간 저하된 반면, 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 3'dUTP 또는 이들의 유도체의 채택은 약간의 개선이 발견되었다. F646Y 변이체는 RNA 합성활성을 보지하는 반면, 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 3'dUTP 또는 이들의 유도체의 채택능력의 개선은 보이지 않았다. F882Y는 RNA 합성활성이 현저히 저하되었기 때문에, 표 1에는 결과를 나타내지 않았다.

더욱이 T7 DNA 폴리머라아제의 Y526에 상당하는 위치인 T7 RNA 폴리머라아제의 Y639F 변이체는 RNA 합성활성을 보지하기는 하였지만, 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 3'dUTP 또는 이들의 유도체의 채택능력의 개선은 보이지 않았다.

이상의 결과에 기초하여, 상기 변이형 RNA 폴리머라아제는 특히 폴리머라아제의 「누클레오티드 결합부위」중에 존재하는 적어도 하나의 아미노산이 변형된 RNA 폴리머라아제이고, 이같은 변형에 의해, 대응하는 리보누클레오티드에 비해 3'디옥시리보누클레오티드 또는 다른 리보누클레오티드 유사체를 채택하는 능력을 증가시킬 수 있다.

또한, 상기 「누클레오티드 결합부위」에 존재하는 아미노산은, 예를 들면 야성형 RNA 폴리머라아제의 나사선 Y와 나사선 Z 사이의 루프 중의 아미노산 및/또는 나사선 Z와 나사선 AA 사이의 루프 중의 아미노산일 수 있다.

Sousa et al.의 문헌(Nature, 364:593-599, 1993)에 나타나 있는 입체구조로부터, 주형 DNA를 감싸는 폴리머라아제 분자중의 크래프트의 안쪽에 접하는, 나사선 Y(T7 RNA 폴리머라아제의 아미노산 잔기 625부터 634에 상당)와 나사선 Z(같은 아미노산 잔기 649부터 658에 상당) 사이의 루프(같은 아미노산 잔기 635부터 647에 상당) 및 나사선 Z와 나사선 AA(같은 아미노산 잔기 685부터 699에 상당) 사이의 루프(같은 아미노산 잔기 659부터 684에 상당)는 가장 누클레오티드에 가까운 곳에 위치하는 리보누클레오티드 결합부위의 일부라고 생각된다. 본 발명에서는 실질적으로 이 루프에 상당하는 영역의 644, 646, 667에 존재하는 F잔기를 Y잔기로 치환하였다(도 5참조).

또한 733, 782 및 882의 F잔기는, 루프에 상당하는 영역 이외의 영역에 존재하고, 폴리머라아제 분자중의 크래프트의 안쪽에 접한다고 생각된다. 이러한 F 잔기에 대해서도 실질적으로 Y로 치환하였다.

더욱이 본 발명은 T7 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제의 아미노산 잔기 641-667에 대응하는 영역으로부터 선택된 영역중의 아미노산에 있어서 변형되어 있는 RNA 폴리머라아제에 관한 것이다. T7 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제의 아미노산 잔기 641-667에 대응하는 영역은 전술한 「누클레오티드 결합부위」에 상당한다.

상기 4종의 RNA 폴리머라아제는 아미노산의 일차구조, 프로모터의 서열 등이 가장 유사하다. 도 3 및 도 4에서, 상기 4개의 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제의 아미노산 서열을 비교하여 나타내었다. 이 비교에 의해, T7, T3, K11 유래의 RNA 폴리머라아제가 가장 유사함을 알 수 있다. 특히, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, T7 및 T3 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제의 아미노산 서열이 가장 유사성이 높다. T7 및 T3 파아지는 모두 대장균에 감염된 파아지이고, 그 성질도 가장 유사한 것으로 부합한다. 더욱이 이 2개의 RNA 폴리머라아제가 인식하는 프로모터 서열도 유사하지만, 그 인식 특이성은 가장 높은 것이 알려져 있다. 이와 같이 T7 RNA 폴리머라아제에 있어서 얻어진 결과를, 아미노산 서열이 유사한 다른 RNA 폴리머라아제에 적응하는 것이 비교적 용이할 수 있다.

이와 같은 높은 상동성으로부터, T7 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제 이외의 RNA 폴리머라아제에 있어서의 T7 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제의 아미노산 잔기 641-667에 대응하는 영역은 T3 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제에 대해서는, 아미노산 잔기 642-668이고, K11 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제에 대해서는 아미노산 잔기 664-690이며, SP6 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제에 대해서는 아미노산 잔기 633-670이라고 말할 수 있다. 전술한 바와 같이, T7, T3, K11 유래의 RNA 폴리머라아제는 가장 유사하고, T7 RNA 폴리머라아제에 대해서의 결과를, 아미노산 서열이 유사한 다른 유래의 RNA 폴리머라아제에 적응할 수 있다(도 8 참조).

상기 RNA 폴리머라아제로서는, 예를 들어 T7 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제로서, 아미노산 잔기 644 또는 667에 있어서 티로신을 갖는 RNA 폴리머라아제를 들 수 있다. 또한 T3 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제로서, 아미노산 잔기 645 또는 668에 있어서 티로신을 갖는 RNA 폴리머라아제를 예시할 수 있다. 또한 K11 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제로서 아미노산 잔기 664∼669 사이 또는 690에 있어서 티로신을 갖는 RNA 폴리머라아제를 예시할 수 있다. 또한, SP6 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제로서 아미노산 잔기 633∼638 사이 또는 670에 있어서 티로신을 갖는 RNA 폴리머라아제를 예시할 수도 있다.

이 같은 아미노산의 변형은 아미노산의 변이 뿐만아니라, 삽입 또는 누락일 수 있다. 또한 아미노산 변이는 예를 들어 천연에 존재하는 아미노산의 적어도 하나를 티로신으로 치환하는 것이다. 게다가 치환되어야 하는 천연에 존재하는 아미노산은 예를 들어 페닐알라닌일 수 있다. 단, 페닐알라닌으로 한정되는 것은 아니고 대응하는 리보누클레오티드에 비해 3'디옥시리보누클레오티드 또는 다른 리보누클레오티드 유사체를 채택하는 능력을 증가시킬 수 있는 아미노산의 치환이어도 좋다.

본 발명의 변이체 RNA 폴리머라아제에 있어서, 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y, L665P/F667Y 및 F644Y/L665P/F667Y는, RNA 합성활성을 충분히 보지하고, 게다가 3'dNTPs의 채택능력이 대폭 개선되며, 야생형에서 관찰되었던 강한 바이어스가 현저히 저하되어 있었다. 이 같은 우수한 특성을 갖는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y, L665P/F667Y 또는 F644Y/L665P/F667Y를 이용한 것에 의해, DNA 폴리머라아제를 이용하는 염기서열 결정방법을 초월하는 실용수준에서, 전사생성물에 의한 염기서열 결정법이 가능하게 된다.

변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y, L665P/F667Y를 생산하는 대장균 pT7R F644Y(DH5α) 및 pT7R L665P/F667Y(DH5α)는 생명연 국제기탁번호가 각각 5998호 (FERM-BP-5998) 및 5999호(FERM-BP-5999)로서 1997년 7월 2일에, 또한 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y/L665P/F667Y를 생산하는 대장균 pT7R F644Y/L665P/F667Y (DH5α)는 생명연 국제기탁번호가 6364호(FERM-BP-6364)로서 1998년 5월 20일에 공업기술원생명공학 공업기술연구소(일본국 305-0046 이바라키켄 쯔크바시 히까리 1-1-3)에 기탁완료하였다.

상기 변이형 RNA 폴리머라아제는, RNA 폴리머라아제를 코드화하는 핵산분자를 준비하고 누클레오티드 염기 서열내의 하나 또는 그 이상의 부위에 있어서의 하나 또는 그 이상의 염기를 변이시키도록 상기 핵산분자에 돌연변이를 일으키고, 이어 변이시킨 핵산분자에 의해 발현되는 변형되었던 RNA 폴리머라아제를 회수함으로써 제조할 수 있다. RNA 폴리머라아제를 코드화하는 핵산분자의 준비, 핵산분자로의 돌연변이의 도입, 변형된 RNA 폴리머라아제의 회수는 모두 공지의 방법을 이용하여 실시할 수 있다.

변이형 T7 RNA 폴리머라아제는 예를 들어 이하의 방법에 의해 구축될 수 있다. T7 RNA 폴리머라아제 유전자를 삽입하여 어떤 발현백터를 주형으로 하여 T7 RNA 폴리머라아제 유전자의 C말단쪽에 상당하는 제한효소 Hpa I, Nco I 부위 사이에 끼는 영역을 PCR법을 이용하여 변이를 도입한 발현 플라스미드를 구축한다. 이어, 이 발현 플라스미드를 이용하고, 대장균 DH5α으로 형질전환하고 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가하면, 변이형 RNA 폴리머라아제 단백질을 대량으로 발현시킬 수 있다.

DNA 염기서열의 결정방법

RNA 폴리머라아제를 위한 프로모터 서열을 포함하는 DNA 단편을 주형으로서, RNA 폴리머라아제를 이용하여 핵산 전사 생성물을 효소적으로 합성하는 방법, 핵산전사 생성물의 분리방법, 또한 분리된 분획으로부터 핵산 서열을 알아내는 방법은 원리적으로는 모두 공지의 방법이다. 따라서, 이러한 점과 관련하여, 모든 공지의 방법 및 조건, 장치등을 적절히 이용할 수 있다.

또한 주형이 되는 DNA 단편에서도, RNA 폴리머라아제를 위한 프로모터 서열을 포함하는 것이외, 제한은 없다. 예를 들어, 프로모터 서열을 포함하는 DNA 단편이 폴리머라아제 연쇄반응에 의해 증폭한 DNA 생성물일 수 있다. 더욱이, 증폭된 DNA 생성물로부터, 폴리머라아제 연쇄반응에 이용한 프라이머 및/또는 2'디옥시리보누클레오시드 5'-트리포스페이트 및/또는 이의 유도체를 제거하는 일없이, 본 발명의 방법에 있어서의 핵산 전사 생성반응을 실시할 수 있다. 상기 DNA 증폭을 위한 폴리머라아제 연쇄반응은 PCR법으로 널리 이용되고 있는 방법을 그대로 이용할 수 있다. 또한 프로모터 서열을 포함하는 DNA 단편은, 프로모터 서열과 증폭대상의 DNA 단편을 라이게이션한 후, 적당한 숙주를 이용하여 크로닝된 DNA 단편일 수도 있다. 즉, 본 발명에 있어서, 증폭의 대상인 DNA 서열, 프라이머, 증폭을 위한 조건등에는 특히 제한은 없다.

예를 들어, 프로모터 서열을 포함하는 DNA 단편의 증폭을 위한 폴리머라아제 연쇄반응계로서, 10∼50ng의 게노믹 DNA 또는 1pg의 크로닝된 DNA, 10μM의 각 프라이머, 200μM의 각 2'디옥시리보누클레오시드 5'-트리포스페이트(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)를 포함하는 20μl 용량중에서 DNA 폴리머라아제로서, 예를 들면 Taq 폴리머라아제 등을 이용하여 실시할 수 있다.

단, 폴리머라아제 연쇄반응을 위한 프라이머의 어느 한쪽 또는 증폭된 삽입(insert) DNA가 후술하는 RNA 폴리머라아제를 위한 프로모터 서열을 포함할 필요가 있다. 다이렉트 전사 시퀀스법에서는, PCR법에 있어서, 2종류의 프라이머의 어느 한쪽에 파아지 프로모터 서열을 갖고 있는 프라이머를 이용하거나, 또는 증폭되었던 삽입 DNA내에 파아지 프로모터 서열을 갖게 하는 것이고, 얻은 PCR 생성물은 그 프로모터에 의해 움직이는 RNA 폴리머라아제를 이용하는 인비트로(in vitro) 전사로 교부할 수 있다.

RNA 폴리머라아제를 위한 프로모터 서열은 이용하는 RNA 폴리머라아제의 종류에 맞게 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 방법에서는 프로모터 서열을 포함하는 DNA 단편으로부터 RNA 전사물등의 핵산 전사물을 합성한다. DNA 단편은 RNA 폴리머라아제를 위한 프로모터 서열을 포함하기 때문에, 이 프로모터 서열이 전술한 변이형 RNA 폴리머라아제를 기동시켜 RNA 전사물 등의 핵산 전사물을 합성한다.

RNA 전사물 등의 핵산 전사물의 합성은 상기 변이형 RNA 폴리머라아제의 존재하에서, ATP, GTP, CTP 및 UTP 또는 이들의 유도체로 이루어진 리보누클레오시드 5'-트리포스페이트(NTP)류, 및 1종 또는 2종 이상의 3'dNTP 유도체를 반응시킨다. 또한, 3'dNTP 유도체는 본 명세서에 있어서는, 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 3'dUTP 및 이들의 유도체의 총칭으로서 이용한다. 리보누클레오시드 5'-트리포스페이트(NTP)류로서는, 그 일부가 ATP등의 유도체인 경우도 포함하여, 염기가 다른 적어도 4종류의 화합물이 전사물의 합성에 필요하다. 단, 동일한 염기를 포함하는 2종이상의 화합물을 이용할 수 있다.

전사 생성물인 RNA 또는 핵산의 3'말단에서는, 3'dNTP 유도체가 채택되는 것에 의해, 3'히드록시기가 누락되고, RNA 또는 핵산의 합성이 저해된다. 그 결과, 3'말단이 3'dNTP 유도체인 여러 길이의 RNA 또는 핵산 단편이 얻어진다. 염기가 다른 4종류의 3'dNTP 유도체에 대해서, 각각 이와 같은 리보누클레오시드·아날로그체를 얻는다. 이 리보누클레오시드·아날로그체를 4종류 준비하고, RNA 또는 핵산서열의 결정에 이용할 수 있다[Vladimir D. Axelred et al. (1985) Biochemistry Vol. 24, 5716-5723].

또한, 3'dNTP 유도체는 하나의 핵산전사반응에 1종류 또는 2종류 이상을 이용할 수 있다. 한종류만의 3'dNTP 유도체를 이용하여 하나의 핵산 전사 반응을 실시하는 경우, 핵산 전사반응을 4회 실시하는 것이고, 3'말단의 3'dNTP 유도체의 염기가 다른 4종류의 전사생성물을 얻는다. 1회의 핵산전사반응에서, 3'말단의 3'dNTP 유도체는 동일하고, 분자량이 다른 여러 RNA 또는 핵산단편의 혼합물인 전사생성물이 얻어진다. 얻은 4종류의 전사생성물에 대해서, 독립적으로 후술하는 분리 및 서열의 파악에 제공할 수 있다. 또한 4종류의 전사 생성물의 2종류 이상을 혼합하고, 이 혼합물을 분리 및 서열의 파악에 제공할 수도 있다.

1회의 핵산전사반응에 2종 이상의 3'dNTP 유도체를 동시에 사용하면, 하나의 반응생성물중에, 3'말단의 3'dNTP 유도체의 염기가 다른 2종류 이상의 전사생성물이 포함되게 된다. 이것을 후술할 분리 및 서열의 파악에 제공할 수 있다. 핵산전사반응에 2종류이상의 3'dNTP 유도체를 동시에 사용하면, 핵산전사 반응조작의 횟수를 감소시킬 수 있기 때문에 바람직하다.

또한, RNA 등의 핵산전사가 염기가, 다른 4종류의 리보누클레오시드 5'-트리포스페이트의 존재하에서, RNA 폴리머라아제에 의해 실행되고, 또한 3'dNTP 유도체에 의해 터미네이트된다. 그 결과, 각 염기에 대하여, RNA 또는 핵산 래더 (ladder)가 시퀀스를 위해 생성된다. 본 발명에서는, 특히 핵산전사를 염기가 다른 4종류의 리보누클레오시드 5'-트리포스페이트의 존재하에서 실시하고, 이것을 분리하여, 4종류의 염기 서열을 한번에(동시에) 알아내는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서는, RNA 또는 핵산 전사생성물을 분리한다. 이 분리는 전사생성물에 포함되는 분자량이 다른 복수의 생성물 분자를 분자량에 따라 분리할 수 있는 방법으로 적절히 실시할 수 있다. 이와 같은 분리방법으로서는, 예를 들면 전기영동법을 들 수 있다. 이 외에 HPLC등도 이용할 수 있다.

전기영동법의 조건등에는 특히 제한은 없고, 통상적인 방법으로 실시할 수 있다. 전사생성물을 전기영동법으로 처리하여 얻어지는 밴드(RNA 또는 핵산 래더)로부터 RNA 또는 핵산의 서열을 알아낼 수 있다.

RNA 또는 핵산 래더의 파악은, 전사물 반응에 이용하는 터미네이터인 리보누클레오시드 5'-트리포스페이트(NTP)류를 표식하는 것에 의해 실시할 수 있다. 또한 RNA 또는 핵산래더의 파악은, 전사물 반응에 이용하는 3'dNTP 유도체를 표식하는 것에 의해 실시할 수도 있다. 표식으로서는, 예를 들어 방사성 또는 안정동위원소 또는 형광표식 등을 들 수 있다. 또한, 상기와 같은 표식을 이용하지 않고, 전기영동법 등에 의해 분리한 각 전사 반응생성물의 질량을 질량분석계로 측정하여, 전사생성물의 서열을 파악할 수도 있다.

구체적으로는, 예를 들면 표식된 3'dNTP 유도체, 보다 구체적으로는, 표식된 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 및 3'dUTP를 이용하고, 전사생성물을 전기영동법으로 실시하여 얻어지는 밴드의 방사성 또는 안정동위원소 또는 형광을 검출하고, 전사생성물의 서열을 파악할 수 있다. 이와 같이, 3'dNTP 유도체를 표식하는 것이고, 모든 밴드간의 방사성 강도 또는 형광성 강도에 변화가 없고, 측정이 용이하게 된다. 더욱이 방사성 또는 안정동위원소 또는 형광을 발생하는 래더의 검출은, 예를 들어 DNA 시켄싱에 이용하고 있는 장치를 적당히 이용하여 실시할 수 있다.

또한 방사성 또는 안정동위원소 또는 형광표식된 ATP, GTP, CTP, 및 UTP를 이용하고, 전기영동법으로 실시하여 얻어진 밴드의 방사성 또는 안정동위원소 또는 형광을 검출하는 것으로도 전사생성물의 서열을 알아낼 수 있다.

더욱이, 다른 형광으로 표식된 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 및 3'dUTP를 이용하고, 말단이 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 또는 3'dUTP이고, 다른 표식이 된 여러 전사생성물 단편의 혼합물을 전기영동법으로 실시하여 얻은 밴드의 4종류의 형광을 검출하는 것으로 RNA 또는 핵산의 서열을 파악할 수도 있다.

이 방법에서는, 4종류의 3'dNTP를 각각 다른 형광으로 표식한다. 이와 같이 하고, 3'말단이 다른 4종류의 전사생성물의 혼합물을 전기영동법으로 실시하여, 3'말단의 4종류가 다른 3'dNTP에 맞는 형광을 발산하는 밴드를 얻을 수 있고, 이 형광의 차이를 식별하면서, 1도에 4종류의 RNA 또는 핵산의 서열을 알아낼 수 있다.

형광표식한 3'dNTP로서는, 이하에 나타난 3'디옥시리보누클레오티드 유도체를 이용하는 것이 바람직하다.

3'디옥시리보누클레오티드 유도체(터미네이터)

본 발명의 염기서열 결정방법에서 사용하는 3'dNTP 유도체로서는, 하기 화학식 I로 표시되는 3'디옥시리보누클레오티드 유도체를 이용하는 것이 바람직하다. 하기 화학식 I에 표시된 3'디옥시리보누클레오티드 유도체는, RNA 폴리머라아제에 의한 폴리머라아제 연쇄반응에 있어서 서열에 쉽게 채택되는 것이다.

화학식 I

식중, Q는 3'디옥시리보누클레오티드 잔기를 나타내고, n은 4이상의 정수를 나타내며, V는 -C≡C- 또는 -CH=CH-를 나타내고, R은 형광성을 갖는 기를 나타낸다. 바람직하게는, 상기 화학식 I에 있어서의 n은 4∼10의 정수를 나타낸다. 또한, 상기 화학식 I에 있어서의 R은 하기 화학식 Ⅶ으로 표시되는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 화학식 I에서 표시되는 3'-디옥시리보누클레오티드 유도체는

(a) 3'-디옥시리보누클레오티드 잔기: Q,

(b) 연결자: 화학식 Ⅵ

[식중, V 및 n은 상기와 같음.]

및 (c) 형광성을 갖는 기

의 세개의 구성부분으로 나뉠 수 있다.

Q로 표시되는 3'-디옥시리보누클레오티드 잔기로서는, 하기 화학식 Ⅱ 및 화학식 Ⅲ으로 표시되는 7-데아자푸린누클레오티드 잔기, 하기 화학식 Ⅳ 및 Ⅴ로 표시되는 피로미딘누클레오티드 잔기를 들 수 있다.

또한, 상기 화학식 Ⅱ∼Ⅴ에 있어서, R₃는 -PO₃H₂: -P₂O₆H₃: -P₃O₉H₄또는 그의 염을 나타내고, 상기 염의 구체예로서는, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리 금속염, 예를 들면 바륨염 등의 알칼리토류 금속염, 암모늄염, 예를 들어 트리에틸암모늄염, 피리딘염 등의 유기아민염등을 바람직하게 들 수 있다.

상기 화학식 Ⅵ으로 표시되는 연결자는 Q로 표시되는 3'-디옥시리보누클레오티드 잔기와 형광성을 갖는 기와 결합하기 위한 연결자(linker)이다.

즉, 상기 연결자의 이중결합 또는 삼중결합을 형성하는 탄소원자의 한 말단이, 전술한 바와 같이 3'디옥시리보누클레오티드 잔기 Q 중에서, 피리미딘누클레오티드 잔기에 대해서는 그의 5자리에, 또한 7-데아자푸린누클레오티드 잔기에 대해서는 그의 7자리에 각각 결합하고, 게다가 상기 연결자의 아미노산기는 형광색소기상의 카르복실기와 결합하여 3'-디옥시리보누클레오티드 잔기와, 형광색소기를 갖는 화합물을 형성한다.

화학식 Ⅵ로 표시되는 연결자에 있어서, n이 4이상인 메틸렌고리로서는, 예를 들면 n이 4∼15의 메틸렌 고리를 들 수 있고, 구체적으로는, 테트라메틸렌기, 펩타메틸렌기, 헥사메틸렌기, 헵타메틸렌기, 옥타메틸렌기, 노나메틸렌기, 데카메틸렌기등을 들 수 있다. RNA 폴리머라아제에 의한 채택율의 개선이란 관점에서, n이 4이상인 정수이지만, 바람직하게는 n은 4∼10의 정수이고, 보다 바람직하게는 n은 4∼8의 정수를 나타내고, 더욱 바람직하게는 n은 4 또는 6이다.

R로 표시되는 형광성을 갖는 기는, 형광성을 갖는 기가 직접 -NH-기에 결합해 있어도 좋고, 사이에 어떤 연결자를 끼워 -NH-기에 결합해도 좋다. 형광성을 갖는 기로서는, 특히 한정은 없지만, 형광강도 또는 형광의 파장, RNA 폴리머라아제에 의한 채택의 용이함 등을 고려하여 적절히 선택할 수 있다. 단, 형광성을 갖는 기는 아르곤 레이저와 같은 적절한 공급원으로부터의 에너지 흡수에 따른 자극으로 계속되어, 검지가능한 발광방사를 일으키는 형광색소 기인 것이 바람직하다.

형광성을 갖는 기 R로서는, 예를 들어, 하기 화학식 Ⅶ로 표시되는 기를 들 수 있다. 화학식 Ⅶ에서 나타내는 형광성을 갖는 기는 특히, 아르곤 레이저와 같은 적절한 공급원으로부터의 에너지 흡수에 따른 자극으로 계속되어, 검지가능한 발광방사를 일으키는 형광색소기이다.

화학식 Ⅶ

[식중, W는 카르복실기를 나타내고, X는 -O-, -S-, -NR'-(단, R'는 수소원자, 저급 알킬기, 아랄킬기 또는 아릴기를 나타냄) 또는 -CH₂-를 나타내고, 고리 A 및 고리 B는 어느 한쪽이

이고, 다른 쪽이

이며(단, Z는 O 또는 =N⁺R₁R₂를 나타내며,

Y는 OH 또는 -NR₁R₂를 나타내고, (단, R₁및 R₂는 각각 독립하여 수소원자 또는 저급 알킬기를 나타내거나, 또는 R₁및 R₂가 모두 트리메틸렌기를 나타낸다 (단, 상기 2개의 트리메틸렌기의 각각 다른 말단은 상기 2개의 트리메틸렌기를 갖는 질소원자가 결합한 고리상의, 상기 질소원자와 결합한 탄소원자의 서로 이웃하는 탄소원자의 어느 한쪽과 각각 결합하여 있다))),

고리 C

에 있어서, 점선 ------은 고리 A 및 고리 B의 구조에 대응한 위치의 결합방향을 의미하고,

상기 고리 A, B, C 및 W를 갖는 벤젠고리는 또한 치환기를 갖고 있어도 좋다.]

상기 화학식 Ⅶ에 있어서, X로서 표현되는 -NR'-에 있어서의 R'로 표시되는 저급알킬기로서는, 직쇄상, 분지상 또는 환상의 어느 것이어도 좋으며, 예를 들면, 탄소수 1∼6의 알킬기를 들 수 있고, 구체적으로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, tert-펜틸기, 1-메틸펜틸기, n-헥실기, 이소헥실기, 시클로프로필기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기 등을 들 수 있다. R'로 표시되는 아랄킬기로서는, 예를 들면 탄소수 7∼20의 아랄킬기를 들 수 있고, 구체적으로는 벤질기, 페네틸기, 페닐프로필, 메틸벤질기, 메틸페네틸기, 에틸벤질기, 나프틸메틸기, 나프틸에틸기 등을 들 수 있고, 또한, 아릴기로서는, 예를 들어 페닐기, 토릴기(tolyl), 크시릴(xylyl)기, 나프틸기 등을 들 수 있다.

상기 화학식 Ⅶ에 있어서, Z로서 표시되는 =N⁺R₁R₂또는 Y로서 표시되는 -NR₁R₂에 있어서의 R₁및 R₂로 표시되는 저급알킬기로서는, 직쇄상, 분지상 또는 환상의 어느 것이어도 상관없고, 예를 들어 탄소수 1∼6의 알킬기를 들 수 있고, 구체적으로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, tert-펜틸기, 1-메틸펜틸기, n-헥실기, 이소헥실기, 시클로프로필기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기 등을 들 수 있다.

상기 화학식 Ⅶ에 있어서, W로 표시되는 카르복실기가 하기 화학식 Ⅷ에 나타난 바와 같이 위치에 결합하여 있는 경우,

본 발명의 3'디옥시리보누클레오티드 유도체에 있어서의 형광색소기의 부분은 하기 식의 어느 상태나 얻을 수 있다.

또한, 상기 카르복실기는 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리 금속염, 예를 들어 바륨염등의 알칼리토류 금속염, 암모늄염, 예를 들면 트리에틸암모늄염, 피리딘염 등의 유기아민염 등의 염을 형성하여도 좋다.

상기 화학식 Ⅶ에 있어서, 고리 A 또는 고리 B에 있어서의 치환기 Z가 =N⁺R₁R₂이고, Y가 -NR₁R₂인 경우에서, R₁및 R₂가 모두 트리메틸렌기를 나타내고, 상기 2개의 트리메틸렌기의 각각의 다른 말단이 상기 2개의 트리메틸렌기를 갖는 질소원자가 결합하여 있는 고리상의, 상기 질소원자와 결합하여 있는 탄소원자의 서로 이웃하는 탄소원자의 어느 한쪽과 각각 결합하여 있는 경우로서는, 예를 들어 하기 식으로 표시되는 것을 들 수 있다.

상기 화학식 Ⅶ에 있어서, 고리 C

에 있어서 점선 -----은, 고리 A 및 고리 B의 구조에 대응하는 위치의 결합방향을 의미하는 것이지만, 이것을 구체적으로 나타내면 예를 들어 아래와 같게 된다.

즉, 고리 A가

인 경우는, 고리 C에 있어서의 결합방향의 위치는 이하와 같다.

또한, 고리 B가

인 경우는, 고리 C에 있어서의 결합방향의 위치는 이하와 같다.

또한, X가 -NH-인 경우, 고리 A(또는 고리 B)와 고리 C는 하기에 나타난 모든 상태를 얻을 수 있다.

상기 화학식 Ⅶ에 있어서의 고리 A, B 및 C 및 W를 갖는 벤젠고리는 또한 치환기를 가져도 좋지만, 이와 같은 치환기로서는 알킬기, 알콕시기, 할로겐 원자등을 들 수 있다.

알킬기로서는, 직쇄상, 분지상 또는 환상의 어느 것이어도 좋고, 또한 이중결합을 갖는 것도 좋으며, 예를 들면 탄소수 1∼20의 알킬기를 들 수 있고, 바람직하게는 탄소수 1∼6의 저급알킬기를 들 수 있다. 구체적으로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, tert-펜틸기, 1-메틸펜틸기, n-헥실기, 이소헥실기, 시클로프로필기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기 등을 바람직하게 들 수 있다. 알콕시기로서는, 저급알콕시기, 예를 들어 탄소수 1∼6의 알콕시기가 바람직하며, 구체적으로는 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, 이소프로폭시기, n-부톡시기, 펜틸옥시기, 이소펜틸옥시기, tert-펜틸옥시기, 1-메틸펜틸옥시기, n-헥실옥시기, 이소헥실옥시기 등을 들 수 있다. 또한, 할로겐 원자로서는 불소, 염소, 브롬, 요오드 등을 들 수 있다.

상기 화학식 Ⅶ로 표시되는 형광색소기로서는, 보다 구체적으로는 예를 들어 5(또는 6) 카르복시테트라메틸로다민(이하, TMP이라 함), 5(또는 6) 카르복시로다민 X(이하, XR이라 함), 5(또는 6) 카르복시로다민 6G(이하, R6G이라 함), 5(또는 6) 카르복시로다민 110(이하, R110이라 함), 5(또는 6) 카르복시플루오레세인, 5(또는 6) 카르복시-2', 7'-디클로로플루오레세인, 5(또는 6) 카르복시-2', 4', 5', 7'-테트라클로로플루오레세인, 5(또는 6) 카르복시 4,7-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인, 5(또는 6) 카르복시-4, 7, 4', 5'-테트라클로로-2', 7'-디메톡시플루오레세인, 5(또는 6) 카르복시-4', 5'-디클로로-2', 7'-디메톡시플루오레세인, 5(또는 6) 카르복시-4, A7-디클로로-1', 2', 7', 8'-디벤조플루오레세인, 5(또는 6) 카르복시-4, 7-디클로로-1', 2', 7', 8'-디벤조플루오레세인 등의 형광색소로부터 유도된 것을 바람직하게 들 수 있다.

상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 3'디옥시리보누클레오티드 유도체는 예를 들면 아래와 같이 합성 스킴에 따라 용이하게 합성할 수 있다.

또한, 상기 합성 스킴중, R4는 상술한 바와 같이 형광색소기를 나타낸다. 또한 하기 합성스킴에 있어서 사용되는 약칭의 정식명은 하기와 같다.

CAN: 질산이암모늄세륨(IV),

AcOH: 초산,

NPETFA: 5-트리플루오로아세타미드-1-펜틴,

NHETFA: 6-트리플루오로아세타미드-1-헥신,

NOTFA: 8-트리플루오로아세타미드-1-옥틴,

Et₃N: 트리에틸아민,

(Ph₃P)₄Pd: 테트라키스(트리페틸포스핀)팔라듐(0),

DMF: N, N-디메틸포름아미드,

NHTfa: 트리플루오로아세타미드,

(EtO)₃PO: 인산 트리에틸,

Tris(TBA) PP: 트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트,

TEAB: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액,

TBDMSC1: tert-부틸디메틸시릴클로라이드,

THF: 테트라히드로퓨란,

TCDI: 1,1'-티오카보닐디이미다졸,

n-Bu₃SnH: 수소화-트리-n-부틸주석,

AIBN: 2,2'-아조비스(이소부틸로니트릴),

pyr.:피리딘,

n-Bu₄NF: 테트라부틸암모늄플루오라이드,

Ac₂O: 무수초산,

MeOH: 메탄올,

NIS: N-요오드 숙신산 이미드,

STC: 4-티오크레졸,

HMPA: 헥사메틸포스포르아미드,

MCPBA: m-클로로과안취향산,

R⁴-OSu: 형광색소기의 숙신산이미딜에스테르체.

(1)형광표식 3'-디옥시우리딘 5'-트리포스페이트(화학식 Ⅰ에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 합성

(2)형광표식 3'-디옥시시티딘 5'-트리포스페이트(화학식 Ⅰ에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 합성.

(3)형광표식 3'-디옥시시티딘 5'-트리포스페이트(화학식 Ⅰ에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=6인 화합물)의 합성.

(4)형광표식 7-데아자-3'디옥시아데노신 5'-트리포스페이트(화학식 Ⅰ에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 합성.

(5)형광표식 7-데아자-3'디옥시아데노신 5'-트리포스페이트(화학식 Ⅰ에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=6인 화합물)의 합성.

(6)형광표식 7-데아자-3'디옥시구아노신 5'-트리포스페이트(화학식 Ⅰ에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 합성.

(7)형광표식 3'-디옥시우리딘 5'-트리포스페이트(화학식 Ⅰ에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4인 화합물)의 합성.

(8)형광표식 3'-디옥시우리딘 5'-트리포스페이트(화학식 Ⅰ에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4인 화합물)의 합성.

(9)형광표식 7-데아자-3'-디옥시시티딘 5'-트리포스페이트(화학식 Ⅰ에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4인 화합물)의 합성.

(10)형광표식 7-데아자-3'-디옥시아데노신 5'-트리포스페이트(화학식 Ⅰ에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4인 화합물)의 합성.

(11)형광표식 7-데아자-3'-디옥시구아노신 5'-트리포스페이트(화학식 Ⅰ에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4인 화합물)의 합성.

상기 화학식 Ⅰ에서 표시되는 3'-디옥시리보누클레오티드 유도체는 본 발명의 변이형 RNA 폴리머라아제를 이용하는 연쇄정지법에 따른 DNA 염기서열 결정법에 있어서의 RNA 신장반응 정지제로서 상당히 유효하고, 이것들을 이용하는 것에 의해 DNA 염기서열을 보다 정확하게 결정할 수 있다.

예를 들어, 염기서열을 결정해야 하는 주형 DNA를 각 RNA 폴리머라아제의 프로모터의 하류에 연결하고, 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 우라실(U)의 4종류의 리보누클레오티드와 상기 리보누클레오티드에 대응하는 화학식 Ⅰ에서 표시된 다른 형광색소로 변형된 4종의 3'-디옥시리보누클레오티드 유도체의 존재하에서 각 염기의 부위에서 RNA 폴리머라아제의 신장 정지반응을 실시하고, 이들의 산물을 혼합하여 하나의 라인에 전기영동한 후, 레이저의 여기에 의한 형광파장을 분광하는 것에 의해 DNA 염기서열을 차례차례 결정할 수 있다.

또한, 형광색소와 4종류의 3'-디옥시리보누클레오티드와의 조합은, 특히 하나의 라인에서 4종류의 서열을 동시에 결정하는 경우, 형광색소의 발광강도 및 RNA 폴리머라아제에 의한 3'-디옥시누클레오티드의 염기 종류의 차이에 의한 채택율의 고저를 감안하여, 적절히 결정한다. 즉, 각 전사생성물로부터의 형광시그널의 강도가 균일해지도록 조합하는 것이지만, 파악을 안정하게 실시하고, 높은 정밀도로 DNA 염기서열 결정을 실시하는 것으로 바람직하다.

본 발명의 실시예에서 사용한 4종류의 형광색소 5-카르복시-X-로다민숙신산이미드에스테르(XR), 5-카르복시로다민 6G 숙신산이미드에스테르(R6G), 5-카르복시테트라메틸로다민숙신산이미드에스테르(TMP), 5-카르복시로다민 110-비스-트리플루오로아세테이트 숙신산이미드에스테르(R110)를 488nm 및 514nm의 아르곤 레이저로 여기시키는 경우의 형광강도는, R110, R6G〉TMR〉XR이다. 또한, 검출감도는 R110, R6G는 약 40amol이고, TMR은 약 400amol이며, XR은 약 800amol이다.

또한, 3'-디옥시리보누클레오티드의 채택율은 RNA 폴리머라아제의 종류에 의해서도 달라지기 때문에, 조합시에는, 그점도 고려해야 한다. T7 RNA 폴리머라아제에 의한 3'dNTP의 채택율을 방사성[α^-32P] 3'dNTP를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 3'dGTP〉3'dATP, 3'dUTP〉3'dCTP이었다.

상기 형광색소의 발광강도 및 T7 RNA 폴리머라아제에 의한 채택율을 고려하여, 본 발명의 실시예에서는 아래 조합 및 양의 형광 터미네이터를 사용하고 있다.

R6G-3'dATP 1μM

R110-3'dGTP 1μM

XR-3'dCTP 50μM

TMR-3'dUTP 12.5μM

더욱, R6G-3'dATP, R110-3'dCTP, XR-3'dGTP, TMR-3'dUTP의 조합을 이용하면 이하 양에서, 균일한 피크의 출력이 얻어진다.

R6G-3'dATP 1μM

R110-3'dCTP 10μM

XR-3'dGTP 5μM

TMR-3'dUTP 12.5μM

T7 RNA 폴리머라아제 및 그 변이체를 이용하는 경우의, 형광색소와 4종류의 3'-디옥시리보누클레오티드의 바람직한 조합예를 이하 나타낸다. 단, 이것들은 단순한 예시에 지나지 않고, 형광색소가 변화하면 바람직한 조합도 변화한다.

형광색소와 염기와의 조합예

R6G-3'dCTP, R110-3'dATP, XR-3'dUTP, TMR-3'dGTP

R6G-3'dATP, R110-3'dCTP, XR-3'dUTP, TMR-3'dGTP

R6G-3'dCTP, R110-3'dUTP, XR-3'dATP, TMR-3'dGTP

R6G-3'dUTP, R110-3'dCTP, XR-3'dATP, TMR-3'dGTP

무기피로포스파타아제 존재하에서의 핵산전사생성반응

본 발명의 방법에 있어서, 핵산전사생성반응은 무기피로포스파타아제 존재하에서 실시하는 것이, 각 표식된 리보누클레오티드에 대응하여 얻어지는 피크 높이(시그널의 강약)의 차를 작게 하여 시퀀스의 파악의 정밀도를 향상시켜, 보다 정확한 서열 데이터를 얻을 수 있다는 관점에서 바람직하다.

피로포스포로리시스는, DNA 합성에 의해 생기는 피로린 염기가 증가하는 것에 의해 생기고, 결과적으로 합성된 DNA 생성물이 분해하는 방향으로 반응을 촉진시키는 작용을 한다. 그 결과, 피로포스포로리시스는, DNA 폴리머라아제를 이용한 디디옥시시퀀스법에 있어서 시퀀스를 저해하게 된다. 그에 비해, 무기 피로포스파타아제를 DNA 폴리머라아제를 이용한 디디옥시시퀀스법에 있어서 사용하면, 피로포스포로리시스를 저해하여 안정한 서열 데이터를 얻을 수 있다고 알려져 있다[일본국 특개평 제 4-506002호].

또한, 피로포스포로리시스가 RNA 폴리머라아제를 이용한 시퀀스법에 있어서, 어떤 작용을 하는지는 알려져 있지 않았다. 그래서, 본 발명자들의 검토 결과, 상기 본 발명의 방법에 있어서, 핵산전사 생성반응을 무기피로포스파타아제 존재하에서 실시하는 것으로, 보다 안정한 서열 데이터를 얻을 수 있음이 판명되었다.

무기피로포스파타아제(EC. 3.63.1.1)는 시판품으로서 입수가능하고, 예를 들면 시그마사의 INORGANIC PYROPHOSPHATASE, 또는 베링거사의 피로포스파타아제가 시판되고 있다. 또한 무기 피로포스파타아제의 사용량은 무기피로포스파타아제 및 RNA 폴리머라아제의 활성의 정도에 따르지만, 예를 들면 RNA 폴리머라아제 1단위에 대해 10^-6∼10^-2단위의 범위로 하는 것이 적당하다.

상기와 같이 파악된 RNA 또는 핵산서열로부터, 전사의 주형으로서 이용된 DNA 서열을 결정할 수 있다. 각 염기에 대하여, 각각 래더를 형성한 경우에는, 4종류의 래더로부터 얻어진 RNA 또는 핵산서열정보를 종합하여, 전사의 주형으로서 이용되었던 DNA 서열을 결정할 수 있다. 또한, 2종류 이상의 염기에 대해서 동시에 래더를 형성한 경우(동일 래더내에 2종 이상의 염기의 밴드가 공존하는 경우)에는, 각 래더로부터 얻어진 RNA 또는 핵산서열정보를 종합하여, 전사의 주형으로서 사용되는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 특히 4종류의 염기에 대해 동시에 래더를 형성한 경우(동일 래더내에 4종의 염기의 밴드가 공존하는 경우)에는, 하나의 래더로부터 얻어진 RNA 또는 핵산서열정보로부터, 전사의 주형으로서 이용되는 DNA 서열을 결정할 수 있다.

또한 본 발명의 시퀀스 방법은 각종 키트(kit)로서 이용할 수 있다.

본 발명에 따르면 리보누클레오티드와 비교하여, 대응하는 3'-디옥시리보누클레오티드 및 그 유도체가 폴리리보누클레오티드 서열에서 파악되기 어렵기도 하고, 리보누클레오티드 및 3'-디옥시리보누클레오티드 중에서도 각각 염기의 종류에 의해, 서열로의 채택방법에 차이가 있다고 하였던, 리보누클레오티드 등의 채택능력에 대한 바이어스를 해소하여, 보다 안정한 서열 데이터를 얻을 수 있는 DNA의 염기서열 결정방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 염기서열 결정방법은, RNA 폴리머라아제의 높은 프로세서빌리티를 고려하면, DNA 폴리머라아제를 이용하는 염기서열 결정방법 이상의 염기서열 결정을 가능하게 한다.

특히, 본 발명의 방법에 따르면, PCR생성물을 정제하는 일없이, 그대로 PCR생성물의 DNA 염기서열을 결정할 수도 있다. 이것은 반응 혼합물에 잔존하는 2'dNTP가 시퀀싱을 위한 3'dNTP의 존재하에서는 RNA 전사반응에 있어서 시약으로서 소비되는 일이 없다는, RNA 폴리머라아제의 특징에 의한 것이다.

더욱, 본 발명의 방법에서는, RNA 전사반응을 이용하기 때문에, 통상의 DNA시퀀스법과 같이 1중 고리 템플레이트 DNA를 사용할 필요도 없고, 프라이머도 필요없어, 더욱 시퀀싱 프라이머의 하이브리다이즈(hybridize)를 위한 변성공정도 필요로 하지 않는다. 그 때문에, PCR 생성물의 재생 영향도 받지 않고, 용이하게 DNA의 염기서열을 결정할 수 있다.

또한, 본 발명의 DNA 염기서열 결정방법에 있어서, RNA 폴리머라아제로서 내열성을 갖는 변이형 RNA 폴리머라아제를 이용할 경우, PCR법을 실시하는 단계와 병용할 수 있고, 그 결과, 보다 신속하게 DNA의 염기서열의 결정을 실시할 수 있게 된다.

이하 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

참고예 1

야생형 T7 RNA 폴리머라아제 유전자의 크로닝과 발현 플라스미드의 구축

대장균을 숙주로 하는 T7 파아지는, 아래와 같이 구축하였다. 대장균 C600을 LB배지(Bacto trypton 10g, Bacto yeast extract 5g, NaCl 5g을 1리터의 물에 용해시키고, pH 7.5로 조절한 후, 오토크래이브(autoclave)에서 멸균한 배지) 200㎖에서 식균하고, 균체농도가 OD(600nm)=1.0이 달성되는 시점에서, 다중감염도 약 2로 감염시키고, 그 후 OD를 시간의 지남에 따라 측정하고, OD가 급격하게 떨어진 시점에서 원심작업하여, 균체잔사를 조사하고, NaCl 및 폴리에틸렌글리콜 6000을 각각 최종농도, 0.5M, 및 10%가 되도록 첨가하고, 잘 교반한 후, 4℃에서 하룻밤 정치시키고, 침전을 형성시켰다. 이 침전을 원심작업으로 모으고, SM 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM MgSO₄, 50mM NaCl, 0.01% 젤라틴(gelatin))에서 현탁하였다. 다음으로 이 T7 파아지의 농축액을 원심관에 조심스럽게 적층한 밀도가 다른 CsCl 용액상(하층부터, CsCl 농도가 1.267g/ml, 0.817g/ml, 0.705g/ml인 용액)에 적층하고, 22,000rpm에서 2시간, 원심하여 파아지층을 형성시키고, 이 파아지의 하얀 밴드를 조심스럽게 분취하고, TE 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA)으로 투석하고, CsCl성분을 제거하였다. 다시 이 파아지용액을 페놀처리에 의해 파아지 단백질을 변성시키고, T7 파아지의 게놈 DNA를 정제하였다.

T7 RNA 폴리머라아제 유전자는 이 게놈 DNA, 39,937 염기대의 내, 3171로부터 5822번째에 코드화되어 있다[T7 게놈 유전자의 전체 염기서열에 대해서는, Dunn들에 의해 이미 보고 되어 있는(1983, J. Mol. Biol., 166(4):477-535). 단, 약간의 정정이 있다(Genebank, accession No. V01148 J02518 X00411의 T7 파아지 DNA 서열참조).] 이 게놈 DNA를 주형으로서 PCR을 이용하여 증폭하고, 아래와 같이 발현벡터에서 크로닝(도 9참조)하였다. 즉, 5'말단에 제한효소 NcoI 절단부위를 각각 포함하고, T7 RNA 폴리머라아제 유전자의 N 말단 아미노산 영역 상류에 특이적인 프라이머(T7Rpol-N 5'-ATA TTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA ACA CGA TTA ACA TOG CTA AG-3'), 및 C말단 아미노산 영역하류에 특이적인 프라이머(T7Rpol-C 5'-ATA TTT TAG CCA TGG TAT AGT GAG TCG TAT TGA TTT GCG-3')을 이용하여, 이 효소 유전자를 PCR법에 의해 증폭하였다. 이 DNA 단편을 NcoI에서 소화하고, 1% 아가로스 전기영동법을 실시하고, 목적의 DNA 단편을 아가로스로부터 잘라내고, Gene Pure Kit(니폰징)를 사용하여 정제하였다. 이것을 NcoI에서 소화하고 탈인산화한 발현벡터 pTrc99a(팔마시아·바이오텍)와 연결하는 것으로 T7 RNA 폴리머라아제를 고발현하는 pT7R를 구축하였다. 야생형 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하는 플라스미드 pT7R은 대장균 DH5α로 형질전환하고, 항생물질 안피시린 내성을 나타내는 대장균을 배양하고, 배양액중에 IPTG를 첨가하고, 발현벡터 pT7R에 포함되는 Trc 프로모터를 이동시켰다. IPTG 첨가 2시간후, 대장균을 회수하고, 전체 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 해석한 결과, T7 RNA 폴리머라아제의 분자량인 99kDa 근처에서, IPTG를 첨가했을 때에만 단백질의 밴드가 검출되었다. 이 단백질을 다시 Zawadzki, V등, 1991, Nucl. Acids Res., 19:1948에 이미 기재되어 있는 방법을 일부 개량한 방법(상세한 방법은 참고예 3에서 예시되어 있는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제의 정제법과 거의 동일한 방법으로 실시할 수 있다)으로 정제한 결과, T7 프로모터에 특이적으로 작용하는 RNA 폴리머라아제의 활성을 갖고 있었다.

참고예 2

변이형 T7 RNA 폴리머라아제를 생산하기 위한 발현 플라스미드의 구축

(1) 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y를 생산하기 위한 발현 플라스미드의 구축(도 10 참조)

야생형 T7 RNA 폴리머라아제 유전자가 삽입되어 있는 pT7R을 주형으로 하고, T7 RNA 폴리머라아제 유전자의 C말단쪽에 상당하는 제한효소 Hpa I, Nco I 부위의 사이에 있는 영역을 PCR법을 이용하여 변이를 도입하였다. 다시 상세히 예시하면, 변이를 도입하고 싶은 염기를 경계로 하여, 좌우로 나누어, 변이가 도입되어 있는 프라이머 F646Y(+)(5'-GTT GAC GGA AGC CGT ACT CTT TGG AC-3'), F646Y(-)(5'-GTC CAA AGA GTA CGG CTT CCG TCA AC-3')와 각각의 제한효소절단부위를 5'말단에 갖는 프라이머 T7RNAP-HpaI-N(5'-CGC GCG GTT AAC TTG CTT AG-3'), pTrc99a-PstI-C(5'-GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AG-3')를 이용하여 PCR에 의해 각각의 DNA 단편을 증폭하였다. 이들의 DNA 단편에는 상호보완하는 부분이 있고, 이들을 변성, 어닐, 신장반응을 반복하는 것으로 목적의 변이가 도입된 DNA 단편을 제작하였다. 이 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동에 의해, 목적하는 큰 DNA 단편만을 잘라내어 정제하고, 이것을 주형으로 하여 프라이머 T7RNAP-HapI-N과 pTrc99a-PstI-C를 이용하여 재증폭하고, 제한효소 Hpa I, Pst I로 절단하였다. 이 DNA는 1% 아가로스 전기영동을 실시하고, 분리한 후, 목적하는 DNA 단편을 잘라내고, 정제하였다. 이 DNA 단편을 pT7R의 Hpa I, Pst I DNA 단편과 치환시키는 것으로 변이를 도입하고, 대장균 DH5α로 형질전환하고, 변이가 도입된 플라스미드를 선택하고, 최종적으로는 염기서열을 확인하는 것으로 목적하는 위치에 변이가 도입되었는지 아닌지를 확인하였다. 그리고, 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y를 생산하기 위한 발현 플라스미드 pT7R F644Y를 얻었다. 이 플라스미드로부터의 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y의 생산은 야생형 T7 RNA 폴리머라아제의 생산과 같이, 본 플라스미드를 함유하는 대장균을 배양하고, IPTG를 첨가하여 발현유도를 가능하게 하였다.

(2)변이형 T7 RNA 폴리머라아제 L665P/F667Y를 생산하기 위한 발현 플라스미드의 구축(도 11 및 도 12 참조)

변이형 T7 RNA 폴리머라아제 L665P/F667Y의 구축은 앞의 F644Y의 구축과 같이 PCR법을 베이스로 하여 아래와 같이 실시하였다.

먼저, 야생형 T7 RNA 폴리머라아제 유전자를 갖는 발현벡터 pT7R중의 T7 RNA 폴리머라아제 유전자 영역내에서, 변이도입조작을 용이하게 하기 위해 제한효소 XhoI(CTC GAG)를 도입하였다. 다시 구체적으로 진술하면 프라이머 ApaF1(5'-CAT CTG GTC GCA TTG GGT CAC-3')와 프라이머 Xho-R(5'-CCA AGT GTT CTC GAG TGG AGA-3')의 조합, 또는 Xho-F(5'-CTA AGT CTC CAC TCG AGA ACA CTT GG-3')와 프라이머-Af1II-R(5'-CAG CCA GCA GCT TAG CAG CAG-3')의 조합에서, 각각 주형으로서 발현벡터 pT7R을 이용하여, PCR을 실시하였다. 증폭한 전자의 DNA 단편은 제한효소 ApaI와 XhoI로, 후자의 증폭한 DNA 단편은 제한효소 Af1II와 XhoI에서 각각 반응하고, 더욱 발현벡터 pT7R을 미리 ApaI와 AF1II로 처리하여, 모두를 T4 DNA 라이게이스를 이용하여 결합시켰다. 이 반응물을 대장균 DH5α로 형질전환하고, 항생물질 안피시린을 포함한 한천평판(agar plate)상에서 생육하는 코로니를 다수 얻었다. 이 코로니를 몇개 선택하고, 배양, 플라스미드 DNA의 추출을 실시하고, T7 RNA 폴리머라아제 유전자 영역내에서 제한효소 XhoI부위가 생기는 플라스미드 pT7R-Xho를 얻었다(도 11 참조). 이 XhoI 부위는 제한효소 XhoI에서 처리한 것에 의해, 절단을 실시하고 DNA 염기서열의 결정을 실시하고, 그 존재를 확인할 수 있다. 이 플라스미드 pT7R-Xho를 주형으로서, 프라이머 Xho-R과 프라이머 667R(5'-GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT-3')의 조합과 프라이머 667F(5'-GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT-3')와 프라이머 Af1IIR의 조합에서 각각 PCR을 실시하였다. 이 PCR산물을 직접 주형으로 하여, DNA의 염기서열을 결정하고, 프라이머 667R 및 667F의 서열을 확인한 후, 각각을 2% 아가로스 전기영동(아가로스는 니폰징제의 아가로스 X를 사용)을 실시하고, 목적하는 큰 DNA 단편을 잘라내고, Gene Pure Kit를 이용하여, 이 DNA 단편을 정제하였다. 이 정제한 2개의 DNA를 혼합하고, 주형으로서 프라이머 XhoF 및 Af1IIR을 이용하여 PCR을 실시하고, 증폭한 DNA 단편을 제한효소 맵핑(mapping)하고, DNA 염기서열을 해석하여 목적하는 단편인 것을 확인한 후, 제한효소 XhoI와 Af1II을 이용하여 효소반응을 실시하고, 이것을 미리 제한효소 XhoI 및 Af1II로 처리한 플라스미드 pT7R-Xho에서 T4 DNA 라이게이스를 이용하여 결합시켰다. 이 반응물을 대장균 DH5α로 형질전환하고, 항생물질 안피시린을 포함한 한천평판상에서 생육하는 코로니를 다수 얻었다. 이 코로니를 몇개 선택하고, 배양, 플라스미드 DNA의 추출을 실시하고, 목적하는 변이가 도입되어 있는지를 DNA 염기서열의 결정을 실시하여 확인하고, 최종적으로 목적하는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 L665P/F667Y를 생산하기 위한 발현 플라스미드 pT7RL665P/F667Y를 구축하였다(도 12 참조). 이 플라스미드로부터의 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 L665P/F667Y의 생산은 야생형 T7 RNA 폴리머라아제의 생산과 같이, 본 플라스미드를 포함한 대장균을 배양하고, IPTG를 첨가하여 발현유도할 수 있었다.

참고예 3

변이형 T7 RNA 폴리머라아제의 정제

대장균에 도입한 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 단백질을 정제하였다.

또한, 본 단백질의 야생형에 대해서는 이미 Chamberlin, M et al. Nature, 228:227-231(1970), Davanloo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81:2035-2039(1984)에 기재되어 있다. 더욱 대량생산에 대해서는 Zawadzki, V et al., Nucl. Acids Res., 19:1948(1991)에 보고되어 있다.

변이형 T7 RNA 폴리머라아제는 기본적으로 모두 동일한 방법으로 정제할 수 있다. 변이부위의 차이로 인해, 그 발현량, 컬럼 크로마토그래피의 거동이 약간 다른 것도 있다. 이하, 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y의 정제법을 예시한다. F644Y의 발현벡터 pT7RF644Y를 대장균 DH5α에 도입, 항생물질 안피시린을 포함한 LB배지에서, 먼저 실험관배양으로 OD(600nm)=0.4∼0.6이 될 때, 이소프로필-β-티오갈락토피라노시드를 최종농도 0.4mM가 되도록 첨가하고, 다시 8시간 배양한다. 이 때 원심분리에 의해, 대장균 균체를 모으고, 전형적으로는 2리터의 배양액으로부터 10g의 습중량의 대장균을 얻는다. 이 대장균 균체를 바로 사용하지 않을 때는 -20℃이하의 냉동고에서 보존할 수 있다.

이 단계 이후, 효소 정제의 모든 공정은 특별히 기재하지 않는한, 실온이하의 온도, 바람직하게는 0∼5℃에서 실시한다. 이 대장균은 이 때 균체중량의 10배의 세정 완충액(20mM Tris-HCl, pH 8.1, 130mM NaCl, 2mM EDTANa2 at 25℃)으로 세정하고, 다시 원심분리(5,000xg, 4℃에서 10분간)하고, 10배량의 소니케이션 완충액[50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 100mM NaCl, 0.1mM EDTANa₂, 5mM 디티오슬레이톨(DTT), 0.1mM 벤자미딘, 30㎍/ml 페닐메틸술포닐플루오리드(PMSF), 10㎍/ml, 바시트라신 (bacitracin)]에서 현탁하고, 소니파이어 450(브랜손사)을 이용하고, 80W, 15분간 초음파 처리를 실시하고 균체를 파쇄, 점도를 저하시킨다. 계속하여, 12,000xg, 4℃에서 10분간 원심분리하고, 세포잔사를 제거하였다. 얻어진 상청을 교반하면서, 10% 황산 스트랩토마이신(streptomycin)을 천천히 적하하고, 최종농도 2.0%로 한 후, 다시 30분간 교반을 계속하였다. 12,000xg, 4℃에서 10분간 원심분리하고, 침전을 제거하고, 분말 황산암모늄을 서서히 첨가하면서 교반하고, 침전을 형성시킨다. 이 때, 최초에 30% 포화 황산암모늄으로 침전을 모으고(30% 황산암모늄), 상청은 다시 60% 포화 황산암모늄이 되도록 황산암모늄을 교반하면서 첨가하고, 다시 침전을 형성시키고(30∼60% 황산암모늄), 다시 상청을 90% 포화 황산암모늄이 되도록 분말 황산암모늄을 첨가하고, 4℃에서 1시간 교반하고, 원심하여 회수하였다. 이 3개의 황산암모늄 분획의 일부를 SDS-아크릴아미드겔 전기영동을 실시하고, 단백질을 분석한 결과, 목적하는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제의 대부분은 30∼60% 황산암모늄 분획에 존재하고, 이후 이 분획을 이용하여 정제를 모았다. 30∼60% 황산암모늄 분획은 소량의 컬럼 완충액(20mM KPO₄, pH 7.7, 100mM NaCl, 1mM DTT, 30㎍/ml PMSF)에서 현탁하고, 동일한 완충액 500ml에서, 16시간 투석하고, 탈염하였다. 이 투석액을 컬럼체적 5ml의 헤파린-세파로스(팔마시아·바이오텍)에 첨가한다. 다음으로, 이 컬럼을 동일한 완충액에서 280nm의 자외선흡수물질이 검출되지 않을 때까지 세정하고, 컬럼체적의 약 40배의 체적의 동일 완충액중의 0.1M∼0.64M NaCl의직선농도구배로 용출한다. 용출액은 적당량을 시험관에서 분획하여 모으고, 바로 SDS-아크릴아미드겔 전기영동을 실시하고, 단백질을 분석하며, 목적하는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제라고 생각되는 분자량 부근에 단백질이 존재하는 분획을 검사한다. 전형적인 예에서는, 0.4M의 NaCl 부근에서 발견될 것이다. 이 단백질을 포함하는 분획을 모으고, 약 1리터의 컬럼 완충액(20mM KPO₄, pH 7.7, 100mM NaCl, 1mM DTT, 30㎍/ml PMSF)에 대해 16시간 투석하고, 탈염조작을 실시하였다. 이 투석탈염한 분획을 동일한 완충액에서 미리 평형화한 5ml의 컬럼체적의 Q-세파로스(Q-sepharose, 팔마시아·바이오텍)에 부가하고, 동일한 완충액에서 280nm의 자외선 흡수물질이 검출되지 않을 때까지 세정하고, 컬럼체적의 약 40배의 체적과 동일한 완충액중의 0.1M∼0.64M NaCl의 직선농도구배에서 용출한다. 용출액은 적당량을 시험관에서 분획하여 모으고, 바로 SDS-아크릴아미드겔 전기영동을 실시하고, 단백질을 분석하고, 목적하는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제라고 생각되는 분자량 부근에서 단백질이 존재하는 분획을 검사한다. 전형적인 예에서는, 0.24M의 NaCl 부근에서 발견될 것이다. 이 단백질을 포함하는 분획을 모으고, 500ml의 보존용 완충액(50% glycerol, 20mM KPO₄, pH 7.7, 100mM NaCl, 1mM DTT, 30㎍/ml PMSF)에 대해 16시간 투석하고, 사용할 때까지 -20℃에서 보존한다. 이 상태에서, 인·비트로의 RNA 합성활성, 또는 혼입해 있는 리보누클레아제 활성에 대해서 실험한다. 여기서 이 방법을 예시하면, 인·비트로 RNA 합성활성에 대해서는, T7 프로모터를 포함하는 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 야생형 T7 RNA 폴리머라아제의 시판품(BRL·기부코사)을 표준품으로서 효소 희석법을 이용하여 RNA 합성반응을 실시하고, 합성한 RNA을 아가로스 전기영동하여 대략적인 값을 추정하였다. 이 때, 합성된 RNA의 분해의 정도도 관찰되기 때문에, 동시에 혼입 리보누클레아제에 관해서의, 간단한 검정도 가능하다. 전형적인 예로서, 이상과 같은 공정을 진행시킨 정제법에서, 1리터의 배양액에서 2,500,000단위의 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y 단백질이 정제되고, 이 표준품에서는 거의 RNase의 혼입은 확인할 수 없다.

참고예 4

변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y/L665P/F667Y를 생산하기 위한 발현 플라스미드의 구축(도 13 참조)

변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y/L665P/F667Y의 구축은 먼저 구축한 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 L665P/F667Y를 생산하는 발현 플라스미드 구축방법(참고예 2 참조)과 같이, PCR을 베이스로 하여 아래와 같이 실시하였다.

변이형 T7 RNA 폴리머라아제 L665P/F667Y를 생산하는 발현 플라스미드를 주형으로서, 프라이머 Xho-F와 프라이머 T7-DOUBLE-R (21mer:5'-CTCTTTGGACCCGTAAGCCAG-3')의 조합과 프라이머 T7-DOUBLE-F (29mer:5'-TTACGGGTCCAAAGAGTACGGCTTCCGTC-3')와 프라이머 Af1II-R의 조합에서 각각 PCR을 실시하였다. 이 PCR산물을 직접 주형으로 하여, DNA 염기서열을 결정하고, 프라이머 T7-DOUBLE-R 및 T7-DOUBLE-F의 서열을 확인한 후, 각각을 2% 아가로스 전기영동을 실시하고, 목적하는 큰 DNA 단편을 정제하였다. 이 정제한 2개의 DNA를 혼합하고, 주형으로서 프라이머 Xho-F 및 Af1II-R을 이용하여 PCR을 실시하고, 증폭한 DNA 단편을 제한효소 맵핑, DNA 염기서열의 해석에 의해 목적하는 단편임을 확인한 후, 제한효소 XhoI 및 Af1II를 이용하여 효소반응을 실시하고, 이것을 미리 제한 효소 XhoI 및 Af1II에서 처리한 플라스미드 pT7RL665P/F667Y에서 T4 DNA 라이게이스를 이용하여 결합시켰다. 이 반응물을 대장균 DH5α로 형질전환하고, 항생물질 안피시린을 포함한 한천평판상에서 생육하는 코로니를 다수 얻었다. 이 코로니를 몇개 선택하고, 배양, 플라스미드 DNA의 추출을 실시하고, 목적하는 변이가 도입되어 있는지를 DNA 염기서열의 결정을 실시하여 확인하고, 최종적으로 목적하는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F664Y/L665P/F667Y를 생산하기 위한 발현 플라스미드 pT7RF644Y/L665P/F667Y를 구축하였다(도 13 참조). 이 플라스미드로부터의 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y/L665P/F667Y의 생산은 야생형 T7 RNA 폴리머라아제의 생산과 같이, 본 플라스미드를 포함하는 대장균을 배양하고, IPTG를 첨가하여 발현유도할 수 있었다.

참고예 5

변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y/L665P/F667Y의 정제

변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y/L665P/F667Y는 참고예 3에 기재한 방법과 같은 방법으로 정제가능하였다. 전형적인 예로서, 1리터의 배양액으로부터 1,000,000단위의 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y/L665P/F667Y 단백질이 정제되었다. 얻어진 RNA 폴리머라아제는 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에서, 거의 단일밴드이고, 이 표준품으로부터 RNase은 검출되지 않았다.

합성예 1

3'-디옥시-5-요오드시티딘(전술한 합성 스킴중의 화합물 6에 상당. 이하, 화합물 6이라 한다. 또한, 이하의 화합물에 대해서도 동일하게 합성 스킴중의 화합물을 각각 나타낸다.)의 합성

3'-디옥시시티딘(화합물 5: 3.0g, 13.2mmol)을 1, 4-디옥산(300ml)과 에탄올(30ml)의 혼합용액에서 현탁시키고, 10℃까지 냉각시킨 후, 트리플루오르초산은(7.0g, 31.7mmol) 및 요소(8.04g, 31.7mmol)를 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응종료후, 침전물을 셀라이트를 통과시켜 여과분별하고, 1, 4-디옥산으로 세정하고, 여액과 세액을 합하여 농축하여, 3'-디옥시-5-요오드시티딘(화합물 6)을 3.84g 얻었다(수율 82.4%).

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6) δppm: 1.64-1.70 (m, 1H, 3'-Ha), 1.88-1.99(m, 1H, 3'-Hb), 3.60-3.89(m, 2H, 5'-Ha,b), 4.20-4.21(m, 1H, 4'-H), 4.37-4.39(m, 1H, 2'-H), 5.59(s, 1H, 1'-H), 7.58(brs, 1H, NH 2a), 8.41(brs, 1H, NH 2b), 8.79(brs, 1H, 6-H)

합성예 2

5-트리플루오로아세타미드-1-펜틴의 합성

수소화나트륨(60% 유성; 5.99g, 0.15mol)의 DMF(340ml)용액에 트리플루오로아세타미드(19.2g, 0.17mmol)를 빙냉하에서, 10회에 걸쳐서 첨가하였다. 이어, 요오드화나트륨(20.4g, 0.136mol)을 첨가하고, 그 후 5-클로로-1-펜틴(13.97g, 0.136mol)의 디메틸포름아미드(DMF)(50ml) 용액을 가하여, 실온에서 4.5시간, 계속하여 60℃에서 21시간 교반반응시켰다. 반응액을 냉각후, 인산이수소칼륨(59.2g) 수용액(500ml)을 가하고, 이 용액을 에테르(500ml)에서 추출하였다. 에테르 층을 물로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조한 후 감압하에서 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 헥산-초산에틸 혼합용매)로 정제하여, 5-트리플루오로아세타미드-1-펜틴 17.6g을 얻었다(수율 67%).

1H-NMR(270MHz, CDCl₃) δppm: 1.83 (m, 2H, -CH₂CH₂CH₂-), 2.04(t, 1H, J=2.7Hz, H-CC-), 2.31(dt, 2H, J=2.7, 6.6Hz, -CCCH₂-), 3.52(q, 2H, J=6.7Hz, CH₂N), 6.88(brs, 1H, NHTfa)

합성예 3

3'-디옥시-5-(5˝-트리플루오로아세타미드-1˝-펜티닐)시티딘의 합성

3'-디옥시-5-요오드시티딘(화합물 6: 777mg, 2.20mmol)의 DMF(11ml) 용액에 질소기류하에서, 합성예 2에서 얻어진 5-트리플루오로아세타미드-1-펜틴(1.18g, 6.60mmol), 요오드화구리(I)(83.8mg, 0.44mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)(254mg, 0.22mmol) 및 트리에틸아민(0.613ml, 4.4mmol)을 가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응액을 염화메틸렌-메탄올 혼합액(20ml)으로 희석하고 이온교환수지 AG1X8(바이올라드사제; HCO₃ ^-형; 2.02g)를 가하고 30분간 교반하였다. 여과분별한 후, 여액을 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름-메탄올 혼합용액)로 정제하고, 메탄올-에테르 혼합액으로부터 결정화하여, 신규물질 3'-디옥시-5-(5˝-트리플루오로아세타미드-1˝-펜티닐)시티딘 409mg을 얻었다(수율 40.6%).

융점 191-193℃

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6) δppm: 1.63-1.78 (m, 3H, 3'-Ha 및 CH₂CH₂CH₂N), 1.86-1.96(m, 1H, 3'-Hb), 2.39-2.44(m, 2H, CH₂CH₂CH₂N), 3.27-3.31(m, 2H, CH₂N), 3.51-3.82(m, 2H, 5'-Ha, b), 4.12-4.31(m, 2H, 2'-H 및 4'-H), 5.15(t, 1H, J=5.1Hz, 5'-OH), 5.51(d, 1H, J=4.1Hz, 2'-OH), 5.62(s, 1H, 1'-H), 6.69(brs, 1H, 4-NHa), 7.64(brs, 1H, 4-NHb), 8.30(s, 1H, 6-H), 9.50(brs, 1H, NHTfa)

합성예 4

트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트의 합성

피로린산 테트라 나트륨 십수화물(2.23g)을 물(50ml)에 용해하고, 이온교환수지 다우엑스 50WX8(다우엑스사제; H⁺형, 45ml)의 컬럼으로 통과시켰다. 컬럼은 다시 물로 용출하고, 용출액의 pH가 거의 중성이 될 때까지 모았다. 트리-n-부틸아민(3.55ml)을 용출액에 가하고 잘 교반하였다. 혼합액을 감압농축하고 잔사는 에탄올, 피리딘, DMF에서 다시 공비농축건고시켰다. 얻어진 잔사를 건조 DMF에서 용출하고 10ml로 메스업하여 0.5M 농도의 트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트를 얻었다.

합성예 5

5-(5˝-아미노-1˝-펜티닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트의 합성

3'-디옥시-5-(5˝-트리플루오로아세타미드-1˝-펜티닐)시티딘(121mg, 0.3mmol)을 인산트리에틸(1.21ml)에 용해하고, -20℃까지 냉각한 후 옥시염화인(25㎕)을 첨가하고 -20℃에서 교반하였다. 30분 경과후, 옥시염화인(22㎕)을 추가하고, 5시간 더 교반하였다. 이 반응액을 -20℃로 냉각한 합성예 4에서 얻어진 트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트를 0.5M 함유하는 DMF 용액(3.6ml)에 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응종료후, 트리에틸아민-물 혼합액(5ml)을 첨가하고, 하룻밤 정치한 후, 25% 암모니아수(20ml)를 가하여 4시간 정치하였다. 반응액을 에테르로 세정후, 농축건고하여 얻은 잔사를 DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(히카리소사제: 1.7×30cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 신규물질 5-(5″-아미노-1″-펜티닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트 105mg을 얻었다(수율 36.6%).

합성예 6

XR-표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=3인 화합물)의 합성

5-(5″-아미노-1″-펜티닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(8μmol)를 용해한 DMF(300㎕)-물(300㎕) 혼합액에, 트리에틸아민(10㎕)과 카르복시-X-로다민숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(26.9μmol)을 가하고, 실온에서 하룻밤 정치시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석한 후, DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×15cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.1M→0.7M 직선농도구배(전량 2L))로 정제하여, 하기 식으로 표시되는 XR-표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서 V가 -C≡C-이고, n=3인 화합물. 이하, XR-3'dCTP(n3)이라 함.] 6.28μmol을 얻었다(수율 78.5%).

또한, 얻어진 XR-3'dCTP(n3)를 DU640 자외가시분광해석 시스템[베크만(주)제]를 이용하여 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700∼200nm, 대조: 증류수)를 도 14에 나타낸다.

합성예 7

6-트리플루오로아세타미드-1-헥신의 합성

1) 5-헥시닐-p-톨루엔술포네이트의 합성

빙냉한 염화 p-톨루엔술포닐(20.11g, 105.5mmol)의 피리딘(30ml) 용액에 5-헥신-1-올(동경화성(주)제; 10ml, 91.7mmol)을 적하하고, 그 후 실온에서 20시간 교반하였다. 반응액에 물(15ml)을 가하여 교반한 후 물(500ml)에 투입하였다. 이 용액을 에테르(300ml)에서 추출하고, 에테르 층을 차가운 1N-염산, 포화탄산수소나트륨수용액 및 물로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조후 감압하에서 농축하여 5-헥시닐-p-톨루엔술포네이트 7.33g을 얻었다(수율 32%).

2) 6-요오드-1-헥신의 합성

5-헥시닐-p-톨루엔술포네이트(7.33g, 33.3mmol), 요오드화나트륨(4.99g, 33.3mmol) 및 아세톤(37ml)의 혼합액을 1시간 환류반응시켰다. 냉각후, 침전물을 여과분별하고 여액을 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 헥산)로 정제하고, 6-요오드-1-헥신 3.31g을 얻었다(수율 54.8%).

3) 6-트리플루오로아세타미드-1-헥신의 합성

수소화나트륨(60% 유성; 2.55g, 63.6mol)의 DMF(50ml)용액에 트리플루오로아세타이드(8.99g, 79.6mmol)를 빙냉하에서, 약 10부분으로 나누어 첨가하였다. 계속하여, 6-요오드-1-헥신(3.31g, 15.9mmol)의 DMF(15ml) 용액을 첨가하였다. 반응액을 실온에서 4시간 교반하였다. 반응액에 포화염화 암모늄수(100ml) 및 에테르 (100ml)를 가하여 추출하였다. 에테르층을 황산마그네슘으로 건조후 감압하에서 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 헥산-초산에틸 혼합용매)로 정제하여, 6-트리플루오로아세타미드-1-헥신 2.0g을 얻었다(수율 65.4%).

융점 41.0-42.5℃

1H-NMR(270MHz, CDCl₃) δppm: 1.53-1.80 (m, 4H, -CH₂(CH₂)₂-), 1.98(t, 1H, J=2.7Hz, H-CC-), 2.26(dt, 2H, J=2.5, 6.7Hz, CC-CH₂-), 3.41(q, 2H, J=6.8Hz, CH₂-N), 6.48(brs, 1H, NHTfa)

합성예 8

3'-디옥시-5-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥시닐)시티딘(화합물 7)의 합성

3'-디옥시-5-요오드시티딘(화합물 6: 800mg, 2.27mmol)의 DMF(11.4ml) 용액에 질소기류하에서, 합성예 7에서 얻어진 6-트리플루오로아세타미드-1-헥신(1.31g, 6.80mmol), 요오드화구리(I)(86.3mg, 0.453mmol), 테트라키스(트리페틸포스핀)팔라듐(O)(262mg, 0.227mmol) 및 트리에틸아민(0.632ml, 4.53mmol)을 가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응액을 염화메틸렌-메탄올 혼합액(20ml)으로 희석하고 이온교환수지 AG1X8(HCO₃ ^-형; 2.02g)를 가하여 30분간 교반하였다. 여과분별한 후, 여액을 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름-메탄올 혼합용액)로 정제하고, 메탄올-에테르 혼합액으로부터 결정화하여, 신규물질 3'-디옥시-5-(6˝-트리플루오로아세타미드-1˝-헥시닐)시티딘(화합물 7) 399mg을 얻었다(수율 42.1%).

융점 195-197℃

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6) δppm: 1.52-1.69 (m, 5H, 3'-Ha 및 CH₂CH₂CH₂CH₂N), 1.86-1.96(m, 1H, 3'-Hb), 2.39-2.50(m, 2H, C CH₂-), 3.18-3.28(m, 2H, CH₂N), 3.50-3.83(m, 2H, 5'-Ha, b), 4.11-4.33(m, 2H, 2'-H 및 4'-H), 5.14(t, 1H, J=4.9Hz, 5'-OH), 5.50(d, 1H, J=4.0Hz, 2'-OH), 5.62(s, 1H, 1'-H), 6.65(brs, 1H, 4-NHa), 7.59(brs, 1H, 4-NHb), 8.29(s, 1H, 6-H), 9.41(brs, 1H, NHTfa)

합성예 9

5-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화합물 8)의 합성

3'-디옥시-5-(6˝-트리플루오로아세타미드-1˝-헥시닐)시티딘(화합물 7; 125.5mg, 0.3mmol)을 인산트리에틸(1.26ml)에 용해하고, -20℃까지 냉각한 후 옥시염화인(25.11㎕)을 첨가하여 -20℃에서 교반하였다. 30분 경과후, 옥시염화인 (22.32㎕)을 추가하고, 5시간 더 교반하였다. 이 반응액을 -20℃로 냉각한 트리스 (트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트를 0.5M 함유하는 DMF 용액(3.6ml)에 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응종료후, 트리에틸아민-물 혼합액(4ml)을 첨가하고, 하룻밤 정치한 후, 25% 암모니아수(20ml)를 가하여 4시간 정치하였다. 반응액을 에테르로 세정후, 농축건고하여 얻은 잔사를 DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×30cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 신규물질 5-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화합물 8) 200mg을 얻었다(수율 69.0%).

합성예 10

XR-표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 합성

5-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화합물 8: 10μmol)을 용해한 DMF(30㎕)-물(300㎕) 혼합액에, 트리에틸아민(10㎕), 5-카르복시-X-로다민숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(15μmol)을 첨가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석한 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×15cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.1M→0.7M 직선농도구배(전량 2L))로 정제하여, 하기 식으로 표시되는 연결자부의 메틸렌 고리의 n의 수가 4개인 XR-표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서 V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물. 이하, XR-3'dCTP(n4)이라 함.] 8.02μmol을 얻었다(수율 80.2%).

또한, 얻어진 XR-3'dCTP(n4)를 DU640 자외가시분광해석 시스템[베크만(주)제]을 이용하여 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700∼200nm, 대조: 증류수)를 도 15에 나타낸다.

합성예 11

8-트리플루오로아세타미드-1-옥틴의 합성

1) 7-옥틴-1-올의 합성

리튬아세티리드에틸렌디아민착체(알드리치사제; 11.3g, 122.5mmol)와 디메틸술폭시드(50ml)의 현탁액을 5∼10℃에서 냉각하고, 1-브로모-6-테트라히드로피라닐옥시헥산(시그마사제; 25g, 94.3mmol)을 2시간에 걸쳐서 적하하였다. 그 후 실온에서 2시간 교반시켰다. 반응액에 물(10ml)을 가하여 10분간 교반한 후 물(150ml)에 투입하고 에테르(300ml)에서 추출하였다. 에테르층을 물로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조후 감압하에서 농축하고, 유상물로서 8-(테트라히드로피라닐옥시)-1-옥틴 18.1g을 얻었다(수율 91.2%). 8-(테트라히드로피라닐옥시)-1-옥틴(18g, 85.6mmol)과 클로로포름(40ml)과 메탄올(140ml)의 혼합액에 다우엑스 50WX8(H⁺형, 18g)를 첨가하고 환류하에서 1시간 가열하였다. 수지를 여과분별한 후, 여액을 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 헥산-초산에틸 혼합액)로 정제하고, 7-옥틴-1-올 9.6g을 얻었다(수율 88.6%).

2) 7-옥티닐-p-톨루엔술포네이트의 합성

빙냉한 염화 p-톨루엔술포닐(17.4g, 91.3mmol)의 피리딘(30ml) 용액에 7-옥틴-1-올(9.6ml, 76.1mmol)을 적하하고, 그 후 5∼10℃에서 20시간 교반하였다. 반응액에 물(15ml)을 가하여 교반한 후 물(500ml)에 투입하고, 에테르(500ml)에서 추출하였다. 에테르 층을 차가운 1N-염산, 포화탄산수소나트륨 수용액 및 물로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조한 후 감압하에서 농축하여, 7-옥티닐-p-톨루엔술포네이트 18.3g을 얻었다(수율 85.7%).

3) 8-요오드-1-옥틴의 합성

7-옥티닐-p-톨루엔술포네이트(18.3g, 65.2mmol), 요오드화나트륨(9.77g, 65.2mmol) 및 아세톤(91ml)의 혼합액을 4시간 환류반응시켰다. 냉각후, 침전물을 여과분별하고 여액을 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 헥산)로 정제하고, 8-요오드-1-옥틴 14.5g을 얻었다(수율 94.2%).

4) 8-트리플루오로아세타미드-1-옥틴의 합성

수소화나트륨(60% 유성; 9.82g, 245mmol)의 DMF(200ml) 용액에 트리플루오로아세타미드(34.7g, 307mmol)를 빙냉하에서, 10회에 걸쳐서 첨가하였다. 계속하여, 8-요오드-1-옥틴(14.5g, 61.4mmol)의 DMF(60ml) 용액을 첨가하여, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응액에 포화염화암모늄 수용액(400ml) 및 에테르(400ml)를 가하여 추출하였다. 에테르층을 황산마그네슘으로 건조한 후 감압하에서 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 헥산-초산에틸 혼합용매)로 정제하고, 헥산으로 결정화하여 8-트리플루오로아세타미드-1-옥틴 10.8g을 얻었다(수율 79.3%).

융점 29.5-30.0℃

1H-NMR(270MHz, CDCl₃) δppm: 1.36-1.63 (m, 8H, -CH₂(CH₂)₄-), 1.94(t, 1H, J=2.7Hz, H-CC-), 2.20(dt, 2H, J=2.5, 6.7Hz, CC-CH₂-), 3.37(q, 2H, J=6.8Hz, CH₂-N), 6.28(brs, 1H, NHTfa)

합성예 12

3'-디옥시-5-(8″-트리플루오로아세타미드-1″-옥티닐)시티딘(화합물 9)의 합성

3'-디옥시-5-요오드시티딘(화합물 6: 450mg, 1.27mmol)의 DMF(6.4ml) 용액에 질소기류하에서, 합성예 11에서 얻은 8-트리플루오로아세타미드-1-옥틴(846mg, 3.82mmol), 요오드화구리(I)(48.5mg, 0.25mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)(147mg, 0.127mmol) 및 트리에틸아민(0.355ml, 2.55mmol)을 가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응액을 염화메틸렌-메탄올 혼합액(12ml)으로 희석하고 이온교환수지 AG1X8(HCO₃ ^-형; 1.17g)를 가하고 30분간 교반하였다. 여과분별한 후, 여액을 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름-메탄올 혼합용액)로 정제하고, 메탄올-에테르 혼합액으로 결정화하여, 신규물질 3'-디옥시-5-(8˝-트리플루오로아세타미드-1˝-옥티닐)시티딘(화합물 9) 219mg을 얻었다(수율 38.5%).

융점 165-167℃

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6) δppm: 1.27-1.54 (m, 8H, -(CH₂)₄-), 1.63-1.69 (m, 1H, 3'-Ha), 1.86-1.97(m, 1H, 3'-Hb), 2.37(t, 2H, J=7.0Hz, CCCH₂-), 3.14-3.21(m, 2H, CH₂N), 3.49-3.56(m, 1H, 5'-Ha), 3.75-3.81(m, 1H, 5'-Hb), 4.08-4.31(m, 2H, 2'-H 및 4'-H), 5.13(t, 1H, J=5.0Hz, 5'-OH), 5.49(d, 1H, J=4.1Hz, 2'-OH), 5.62(s, 1H, J=1.4Hz, 1'-H), 6.62(brs, 1H, 4-NHa), 7.58(brs, 1H, 4-NHb), 8.28(s, 1H, 6-H), 9.41(brs, 1H, NHTfa)

합성예 13

5-(8″-아미노-1″-옥티닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화합물 10)의 합성

3'-디옥시-5-(8˝-트리플루오로아세타미드-1˝-옥티닐)시티딘(화합물 9; 134mg, 0.3mmol)을 인산트리에틸(1.34ml)에 용해하고, -20℃까지 냉각한 후 옥시염화인(25.11㎕)을 첨가하여 -20℃에서 교반하였다. 30분 경과후, 옥시염화인(22.32㎕)을 추가하여 3.5시간 더 교반하였다. 이 반응액을 -20℃로 냉각한 트리스(트리 -n-부틸암모늄)피로포스페이트를 0.5M 함유하는 DMF 용액(3.6ml)에 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응종료후, 트리에틸아민-물 혼합액(5ml)을 첨가하고, 하룻밤 정치한 후, 25% 암모니아수(20ml)를 가하여 4시간 정치하였다. 반응액을 에테르로 세정후, 농축건고하여 얻은 잔사를 DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×30cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 신규물질 5-(8″-아미노-1″-옥티닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화합물 10) 262mg을 얻었다(수율 50.0%).

합성예 14

XR-표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=6인 화합물)의 합성

5-(8″-아미노-1″-옥티닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화합물 10: 8μmol)을 용해한 DMF(30㎕)-물(300㎕) 혼합액에, 트리에틸아민(10㎕)과 5-카르복시-X-로다민숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(12μmol)을 가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석한 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×15cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.1M→0.7M 직선농도구배(전량 2L))로 정제하여, 하기 식으로 표시되는 XR-표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서 V가 -C≡C-이고, n=6인 화합물. 이하, XR-3'dCTP(n6)이라 함.] 5.34μmol을 얻었다(수율 66.7%).

또한, 얻어진 XR-3'dCTP(n6)을 DU640 자외가시분광해석 시스템[베크만(주)제]를 이용하여 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700∼200nm, 대조: 증류수)를 도 16에 나타낸다.

합성예 15

6-클로로-9-{2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-O-[(이미다졸-1″-일)티오카르보닐]-β-D-리보푸라노실}-7-데아자푸린(화합물 13)의 합성

6-클로로-9-(β-D-리보푸라노실)-7-데아자푸린(화합물 11:3.58g, 12.5mmmol)을 THF(160ml)에 용해후, 피리딘(5.1ml, 62.7mmol), 질산은(4.68g, 27.6mmol) 및 tert-부틸디메틸시릴클로라이드(4.16g, 27.6mmol)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응종료후, 침전물을 셀라이트를 통해 여과분별하고, 여액을 농축, 클로로포름에 용해후, 0.2N 염산 및 포화식염수로 세정하였다. 클로로포름층을 무수황산 마그네슘으로 건조후, 클로로포름을 제거하고, 신규물질 6-클로로-9-[2, 5-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-β-D-리보푸라노실]-7-데아자푸린(화합물 12) 6.42g를 정량적으로 얻었다. 이것을 다시 정제하지 않고 DMF(120ml)에서 용해 후, 1,1'-티오카르보닐디이미다졸(13.36g, 75.0mmol)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응종료후, 초산에틸 및 물을 첨가한 후, 유기층을 포화식염수로 세정하였다. 초산에틸층을 무수질산마그네슘으로 건조후, 감압농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 초산에틸-n-헥산 혼합용매)로 정제하여, 신규물질 6-클로로-9-{2', 5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-O-[(이미다졸-1-일)티오카르보닐]-β-D-리보푸라노실}-7-데아자푸린(화합물 13) 4.03g을 얻었다(수율 51.5%).

합성예 16

6-클로로-9-{2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-디옥시-β-D-리보푸라노실}-7-데아자푸린(화합물 14)의 합성

6-클로로-9-{2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-O-[(이미다졸-1-일)티오카르보닐]-β-D-리보푸라노실}-7-데아자푸린(화합물 13: 4.0g, 6.41mmmol)을 톨루엔(200ml)에 용해후, 2,2'-아조비스(이소부티로니트릴)(0.21g, 1.3mmol) 및 수소화 -트리-n-부틸주석(3.45ml, 13mmol)을 첨가하고, 질소기류하에서, 80℃에서 30분간 교반하였다. 반응종료후, 톨루엔을 제거하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 초산에틸-n-헥산 혼합용매)로 정제하여, 신규물질 6-클로로-9-{2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-디옥시-β-D-리보푸라노실}-7-데아자푸린(화합물 14) 2.60g을 얻었다(수율 81.5%).

합성예 17

6-클로로-9-{3'-디옥시-β-D-리보푸라노실}-7-데아자푸린(화합물 15)의 합성

6-클로로-9-{2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-디옥시-β-D-리보푸라노실}-7-데아자푸린(화합물 14: 2.6g, 5.2mmmol)을 THF(30ml)에 용해후, 1M 테트라부틸암모늄플루오라이드(12.5ml, 12.5mmol)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응종료후, 반응액을 감압농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름-메탄올 혼합용매)로 정제하여, 신규물질 6-클로로-9-{3'-디옥시-β-D-리보푸라노실} -7-데아자푸린(화합물 15) 1.47g을 정량적으로 얻었다.

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6) δppm: 1.93, 2.23(m, 2H, 3'-Ha, b), 3.55, 3.71(2dd, 2H, J=4.1, 11.9; 3.2, 11.6Hz, 5'-Ha, b), 4.36(m, 1H, 2'-H), 4.45(m, 1H, 4'-H), 5.02(brs, 1H, 5'-OH), 5.66(brs, 1H, 2'-OH), 6.19(d, 1H, J=2.4Hz, 1'-H), 6.70(d, 1H, J=3.8Hz, 7-H), 8.02(d, 1H, J=4.1Hz, 8-H), 8.66(s, 1H, 2-H)

합성예 18

6-클로로-9-{3'-디옥시-2',5'-디-O-아세틸-β-D-리보푸라노실}-7-데아자푸린(화합물 16)의 합성

6-클로로-9-(3'-디옥시-β-D-리보푸라노실)-7-데아자푸린(화합물 15: 1.47g, 5.45mmmol)을 피리딘(15ml)에 용해후, 무수초산(5ml)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응종료후, 0℃에서 냉각하고 메탄올(5ml)을 가하고 감압농축하고, 클로로포름에 용해후 0.5N 염산 및 포화식염수로 세정하였다. 클로로포름층을 무수황산마그네슘으로 건조후, 클로로포름을 제거하고, 신규물질 6-클로로-9-(3'-디옥시-2',5'-디-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-7-데아자푸린(화합물 16) 2.00g을 정량적으로 얻었다.

합성예 19

6-클로로-7-요오드-9-(3'-디옥시-2',5'-디-O-아세틸-β-D-리보푸라노실}-7-데아자푸린(화합물 17)의 합성

6-클로로-9-(3'-디옥시-2',5'-디-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-7-데아자푸린(화합물 16: 1.44g, 4.07mmmol)을 아세토니트릴(67ml)에 용해후, 질산이암모늄세륨 (Ⅳ)(0.62g, 2.44mmol) 및 요소(1.12g, 2.03mmol)을 첨가하고, 80℃에서 30분간 교반하였다. 반응종료후, 아세트니트릴을 감압농축하고 초산에틸에 용해 후, 5% 아황산수소나트륨용액, 포화탄산수소나트륨 용액 및 포화식염수로 세정하였다. 초산에틸층을 무수황산마그네슘으로 건조한 후 초산에틸을 제거하고, 염화메틸렌에테르로 결정화시켜, 신규물질 6-클로로-7-요오드-9-(3'-디옥시-2',5'-디-O-아세틸-β-D-리보푸라노실}-7-데아자푸린(화합물 17) 1.46g을 얻었다(수율 75.0%).

융점: 149-150℃

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6) δppm: 2.14, 2.17(2s, 6H, 2Ac), 2.23-2.49(m, 2H, 3'-Ha,b), 4.25-4.48(m, 2H, 5'-Ha, b), 4.58-4.68(m, 1H, 4'-H), 5.52-5.54(m, 1H, 2'-H), 6.33(d, 1H, J=1.4Hz, 1'-H), 7.64(s, 1H, 8-H), 8.63(s, 1H, 2-H)

합성예 20

7-요오드-3'-디옥시-7-데아자아데노신(화합물 18)의 합성

6-클로로-7-요오드-9-(3'-디옥시-2',5'-디-O-아세틸-β-D-리보푸라노실}-7-데아자푸린(화합물 17: 1.63g, 3.40mmol)과 암모니아-메탄올(70ml)을 110℃에서 20시간 반응시켰다. 반응종료후 반응액을 감압농축하고, 메탄올로 결정화시켜, 신규물질 7-요오드-3'-디옥시-7-데아자아데노신(화합물 18) 1.00g을 얻었다(수율 78.8%).

융점: 223-225℃(분해)

합성예 21

7-데아자-7-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥시닐)-3'-디옥시아데노신(화합물 19)의 합성

7-요오드-3'-디옥시-7-데아자아데노신(화합물 18: 220mg, 0.585mmol)의 DMF (3ml) 용액에 질소기류하에서, 합성예 7에서 얻은 6-트리플루오로아세타미드-1-헥신(339mg, 1.75mmol), 요오드화구리(I) (22.3mg, 0.117mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)(67.5mg, 0.058mmol) 및 트리에틸아민(0.163ml, 1.17mmol)을 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응액을 염화메틸렌-메탄올 혼합액(6ml)로 희석하고 이온교환수지 AG1X8(HCO₃ ^-형, 0.55g)를 가하여 30분간 교반시켰다. 여과분별한 후, 여액을 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름-메탄올 혼합용액)로 정제하여, 신규물질 7-데아자-7-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥시닐)-3'-디옥시아데노신(화합물 19) 210mg을 얻었다(수율 81.6%).

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6) δppm: 1.55-1.63(m, 4H, -(CH₂)₂-), 1.83-1.92(m, 1H, 3'-Ha), 2.13-2.24(m, 1H, 3'-Hb), 2.47-2.52(m, 2H, CC CH₂-), 3.16-3.24(m, 2H, CH₂N), 3.46-3.54(m, 1H, 5'-Ha), 3.62-3.68(m, 1H, 5'-Hb), 4.23-4.38(m, 2H, 2'-H 및 4'-H), 5.03(t, 1H, J=5.5Hz, 5'-OH), 5.56(d, 1H, J=4.3Hz, 2'-OH), 6.01(d, 1H, J=2.2Hz, 1'-H), 6.60(brs, 2H, 6-NH₂), 7.65(s, 1H, 8-H), 8.11(s, 1H, 2-H), 9.44(brs, 1H, NHTfa)

합성예 22

7-데아자-7-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(화합물 20)의 합성

7-데아자-7-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥시닐)-3'-디옥시아데노신(화합물 19: 181mg, 0.41mmol)을 인산트리에틸(1.81ml)에 용해시키고, -20℃까지 냉각시킨 후 옥시염화인(34.32㎕)을 첨가하여 -20℃에서 교반시켰다. 30분 경과후, 옥시염화인(30.5㎕)을 추가하고, 4시간 더 교반시켰다.

이 반응액을 -20℃에서 냉각시킨 트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트를 0.5M 포함한 DMF 용액(4.9ml)에 첨가하고, 실온에서 3시간 교반시켰다. 반응종료후, 트리에틸아민 물 혼합액(5ml)을 첨가, 하룻밤 정치후, 25% 암모니아수(20ml)를 가하여 4시간 정치하였다. 반응액을 에테르로 세정후, 농축건고하여 얻어진 잔사를 DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(1.2×30cm; 용출액:탄산수소트리에틸암모늄 완충액 (pH 7.5) OM→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 신규물질 7-데아자-7-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(화합물 20) 283mg을 얻었다(수율 69.6%).

합성예 23

R6G 표식 7-데아자-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 합성

7-데아자-7-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(화합물 20: 8μmol)을 용해한 DMF(0.6ml)-물(0.3ml)의 혼합액에, 트리에틸아민(10㎕)과 5-카르복시로다민 6G 숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(16μmol)의 DMF(1.3ml)용액을 가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석시킨 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.2×30cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.1M→0.6M 직선농도구배(전량 2L))로 정제하여, 하기 식에서 나타나는 R6G 표식 7-데아자-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4의 화합물. 이하, R6G-3'dATP(n4)라고 약기함] 5.55μmol을 얻었다(수율 66.7%).

[식중, Et는 에틸기를 또한 Me는 메틸기를 각각 나타낸다.]

또한, 얻어진 R6G-3'dATP(n4)를 DU640 자외가시분광해석 시스템[베크만(주)제]을 이용하여, 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700nm∼200nm, 대조: 증류수)를 도 17에 나타내었다.

합성예 24

7-데아자-7-(8″-트리플루오로아세타미드-1″-옥티닐)-3'-디옥시아데노신(화합물 21)의 합성

7-요오드-3'-디옥시-7-데아자아데노신(화합물 18: 220mg, 0.585mmol)의 DMF (3ml) 용액에 질소기류하에서, 합성예 11에서 얻은 8-트리플루오로아세타미드-1-옥틴(388mg, 1.75mmol), 요오드화 구리(I)(22.3mg, 0.117mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)(67.5mg, 0.058mmol) 및 트리에틸아민(0.163ml, 1.17mmol)을 가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응액을 염화메틸렌-메탄올 혼합액(6ml)으로 희석하고 이온교환수지 AG1×8(HCO₃ ^-; 0.55g)을 가하여 30분간 교반시켰다. 여과분별한 후, 여액을 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름-메탄올 혼합용액)로 정제하여, 신규물질 7-데아자-7-(8″-트리플루오로아세타미드-1″-옥티닐)-3'-디옥시아데노신(화합물 21) 216mg을 얻었다(수율 78.7%).

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6) δppm: 1.29-1.58(m, 8H, -(CH₂)₄-), 1.83-1.91(m, 1H, 3'-Ha), 2.14-2.24(m, 1H, 3'-Hb), 2.44-2.51(m, 2H, CC CH₂), 3.15-3.22(m, 2H, CH₂N), 3.46-3.54(m, 1H, 5'-Ha), 3.62-3.70(m, 1H, 5'-Hb), 4.26-4.36(m, 2H, 2'-H 및 4'-H), 5.04(t, 1H, J=5.4Hz, 5'-OH), 5.56(d, 1H, J=4.6Hz, 2'-OH), 6.01(d, 1H, J=2.4Hz, 1'-H), 6.60(brs, 2H, 6-NH₂), 7.65(s, 1H, 8-H), 8.11(s, 1H, 2-H), 9.44(brs, 1H, NHTfa)

합성예 25

7-데아자-7-(8″-아미노-1″-옥티닐)-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(화합물 22)의 합성

7-데아자-7-(8″-트리플루오로아세타미드-1″-옥티닐)-3'-디옥시아데노신(화합물 21: 189mg, 0.403mmol)을 인산트리에틸(1.89ml)에 용해시키고, -20℃까지 냉각시킨 후 옥시염화인(33.7㎕)을 첨가하고 -20℃에서 교반시켰다. 30분 경과후, 옥시염화인(30.0㎕)을 추가하고, 4시간 더 교반시켰다.

이 반응액을 -20℃에서 냉각시킨 0.5M-트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트의 DMF 용액(4.8ml)에 첨가하고, 실온에서 3시간 교반시켰다. 반응종료후, 트리에틸아민-물 혼합액(15ml)을 첨가, 하룻밤 정치후, 25% 암모니아수(20ml)를 가하여 4시간 정치하였다. 반응액을 에테르로 세정후, 농축건고하여 얻어진 잔사를 DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(1.2×30cm; 용출액:탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) OM→0.6M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 신규물질 7-데아자-7-(8″-아미노-1″-옥티닐)-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(화합물 22) 143mg을 얻었다(수율 35%).

합성예 26

R6G 표식 7-데아자-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=6인 화합물)의 합성

7-데아자-7-(8″-아미노-1″-옥티닐)-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(화합물 22: 8μmol)을 용해한 DMF(0.6ml)-물(0.3ml)의 혼합액에, 트리에틸아민(10㎕)과 5-카르복시로다민 6G 숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(16μmol)의 DMF(1.3ml)용액을 가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석시킨 후, DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(1.2×30cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.1M→0.6M 직선농도구배(전량 2L))로 정제하여, 하기 식에서 나타나는 R6G 표식 7-데아자-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=6의 화합물. 이하, R6G-3'dATP(n6)라고 약기함] 4.3μmol을 얻었다(수율 53.8%).

[식중, Et는 에틸기를, 또한 Me는 메틸기를 각각 나타낸다.]

또한, 얻어진 R6G-3'dATP(n6)를 DU640 자외가시분광해석 시스템[베크만(주)제]을 이용하여, 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700nm∼200nm, 대조: 증류수)를 도 18에 나타내었다.

합성예 27

3'-디옥시-5-요오드우리딘(화합물 2)의 합성

3'-디옥시우리딘(화합물 1: 2.08g, 9.11mmmol)을 초산(75ml)에 용해후, 질산이암모늄세륨(Ⅳ)(2.50g, 4.56mmol) 및 요소(1.39g, 2.73mmol)을 첨가하고, 80℃에서 30분간 교반하였다. 반응종료후, 초산을 감압농축하고 이어서 에탄올-톨루엔 혼합액(1:2 v/v; 30ml)에서 3회, 물-에탄올 혼액(1:2 v/v; 30ml)에서 3회 공비농축하여 유상물을 얻었다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 염화메틸렌-메탄올 혼합용매)로 정제하여, 3'-디옥시-5-요오드우리딘(화합물 2) 1.78g을 얻었다(수율 55.08%).

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6) δppm: 1.89-1.92(m, 1H, 3'-Ha), 2.17-2.26(m, 1H, 3'-Hb), 3.51-3.56(m, 1H, 5'-Ha), 3.74-3.79(m, 1H, 5'-Hb), 4.22-4.30(m, 2H, 2'-H 및 4'-H), 5.59(s, 1H, 1'-H), 8.31(s, 1H, 6-H), 11.72(s, 1H, NH)

합성예 28

3'-디옥시-5-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥시닐)우리딘(화합물 3)의 합성

3'-디옥시-5-요오드우리딘(화합물 2: 805mg, 2.27mmol)의 DMF(12ml)용액에 질소기류하에서, 합성예 7에서 얻은 6-트리플루오로아세타미드-1-헥신(1.31g, 6.80mmol), 요오드화구리(I)(86.3mg, 0.453mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)(262mg, 0.227mmol) 및 트리에틸아민(0.63ml, 4.53mmol)을 첨가하고, 실온에서 4시간 반응시켰다. 반응액을 감압농축하여 얻은 잔사를 염화메틸렌-메탄올 혼합액(20ml)에 용해하고 이온교환수지 AG1X8(바이올라드사제, HCO₃ ^-형; 2g)를 가하고 30분간 교반시켰다. 여과분별한 후, 여액을 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 염화메틸렌-메탄올 혼합용액)로 정제하여, 신규물질 3'-디옥시-5-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥시닐)우리딘(화합물 3) 419mg을 얻었다(수율 45.5%).

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6) δppm: 1.49-1.64(m, 4H, -(CH₂)₂-), 1.92-1.97(m, 1H, 3'-Ha), 2.17-2.28(m, 1H, 3'-Hb), 2.39(t, 2H, J=6.9Hz, -CCCH₂), 3.21(q, 2H, J=6.3Hz, CH₂N), 3.49-3.54(m, 1H, 5'-Ha), 3.72-3.75(m, 1H, 5'-Hb), 4.24-4.35(m, 2H, 2'-H 및 4'-H), 5.20(t, 1H, J=4.9Hz, 5'-OH), 5.52(d, 1H, J=3.8Hz, 2'-OH), 5.75(s, 1H, J=2.2Hz, 1'-H), 8.23(s, 1H, 6-H), 9.42(brs, 1H, NHTfa), 11.57(s, 1H, 3-NH)

합성예 29

5-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트(화합물 4)의 합성

3'-디옥시-5-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥시닐)우리딘(화합물 3: 122.5mg, 0.3mmol)을 인산트리에틸(1.23ml)에 용해시키고, -20℃까지 냉각시킨 후 옥시염화인(25㎕)을 첨가하고 -20℃에서 교반시켰다. 30분 경과후, 옥시염화인(22㎕)을 추가하고, 5시간 더 교반시켰다. 이 반응액을 -20℃에서 냉각시킨 트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트를 0.5M 포함한 DMF 용액(3.6ml)에 첨가하고, 실온에서 4시간 교반시켰다. 반응종료후, 트리에틸아민-물 혼합액(5ml)을 첨가, 하룻밤 정치후, 25% 암모니아수(20ml)를 가하여 4시간 정치하였다. 반응액을 에테르로 세정후, 농축건고하여 얻어진 잔사를 DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(히카리소사제; 1.2×30cm; 용출액:탄산수소트리에틸암모늄 완충액 (pH 7.5) OM→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 신규물질 5-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트(화합물 4) 172mg을 얻었다(수율 60.0%).

합성예 30

TMR 표식 3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 합성

5-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트(화합물 4: 8μmol)을 용해한 DMF(300㎕)-물(300㎕)의 혼합액에 트리에틸아민(10㎕)과 5-카르복시로다민숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(13μmol)를 가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석시킨 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×30cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.05M→0.7M 직선농도구배(전량 2L))로 정제하여, 하기 식에서 나타나는 TMR -표식 3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4의 화합물. 이하,TMR-3'dUTP(n4)라고 약기함] 5.9μmol을 얻었다(수율 73.8%).

[식중, Me는 메틸기를 나타낸다.]

또한, 얻어진 TMR-3'dUTP(n4)를 DU640 자외가시분광해석 시스템[베크만(주)제]을 이용하여, 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700nm∼200nm, 대조: 증류수)를 도 19에 나타내었다.

합성예 31

6-메톡시-2-메틸티오-9-{2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴-3'-O-[(이미다졸-1-일)티오카르보닐]-β-D-리보푸라노실}-7-데아자푸린(화합물 25)의 합성

6-메톡시-2-메틸티오-9-(β-D-리보푸라노실)-7-데아자푸린(화합물 23: 12.86g, 39.28mmol)을 THF(580ml)에 용해한 후, 피리딘(16.8ml, 208mmol), 질산은(15.55g, 91.5mmol) 및 tert-부틸디메틸시릴클로라이드(13.80g, 91.5mmol)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응종료후, 침전물을 셀라이트를 통과시켜 여과분별하고, 여액을 농축, 클로로포름에 용해후, 0.2N 염산 및 포화식염수로 세정하였다. 클로로포름층을 무수황산마그네슘으로 건조후, 클로로포름을 제거하고, 거친 6-메톡시-2-메틸티오-9-[2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-β-D-리보푸라노실]-7-데아자푸린(화합물 24) 24.0g을 얻었다. 얻어진 화합물 24(24.0g)을 DMF(400ml)에 용해후, 1,1'-티오카르보닐이미다졸(35.0g, 196.5mmol)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응종료후, 초산에틸 및 물을 가한 후, 유기층을 포화식염수로 세정하였다. 초산에틸층을 무수황산 마그네슘으로 건조후, 감압농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 초산에틸-클로로포름 혼합용매)로 정제하여, 신규물질 6-메톡시-2-메틸티오-9-{2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-O-[(이미다졸-1-일)티오카르보닐]-β-D-리보푸라노실}-7-데아자푸린(화합물 25) 20.45g을 얻었다(수율 78.2%).

합성예 32

6-메톡시-2-메틸티오-9-[2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴-3'-디옥시-β-D-리보푸라노실]-7-데아자푸린(화합물 26)의 합성

6-메톡시-2-메틸티오-9-{2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-O-[(이미다졸-1-일)티오카르보닐]-β-D-리보푸라노실)-7-데아자푸린(화합물 25: 20.45g, 30.7mmol)을 톨루엔(1L)에 용해한 후, 2,2'-아조비스(이소부티로니트릴)(1.01g, 6.1mmol) 및 수소화-n-트리부틸 주석(16.5ml, 61.4mmol)를 첨가하고, 질소기류하, 80℃에서 30분간 교반시켰다. 반응종료후, 톨루엔을 제거하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 초산에틸-n-헥산 혼합용매)로 정제하여, 신규물질 6-메톡시-2-메틸티오-9-[2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-디옥시-β-D-리보푸라노실]-7-데아자푸린(화합물 26) 14.57g을 얻었다(수율 87.9%).

합성예 33

7-요오드-6-메톡시-2-메틸티오-9-[2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-디옥시-β-D-리보푸라노실]-7-데아자푸린(화합물 27의 합성)

6-메톡시-2-메틸티오-9-[2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-디옥시-β-D-리보푸라노실]-7-데아자푸린(화합물 26: 15.57g, 28.84mmol)을 DMF에 용해하고, N-요오드숙신산이미드(7.79g, 34.61mmol)을 가하여, 질소기류하에서 차광하고, 실온에서 5시간 교반하였다. 반응종료후, 반응액을 0℃에서 냉각하고 초산에틸 및 물을 가한후 유기층을 5% 티오황산나트륨 용액, 포화탄산수소나트륨 용액, 포화식염수로 세정하였다. 초산에틸층을 무수황산마그네슘으로 건조후, 초산에틸을 제거하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름-n-헥산 용매)로 정제하여, 신규물질 7-요오드-6-메톡시-2-메틸티오-9-[2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-디옥시-β-D-리보푸라노실]-7-데아자푸린(화합물 27) 19.06g을 얻었다(수율 99.3%).

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6)δppm: -0.10, -0.06, 0.12, 0.13(4s, 12H, 4MeSi), 0.80, 0.93(2s, 18H, 2t-Bu), 1.90-2.10(m, 1H, 3'-Ha), 2.18-2.28(m, 1H, 3'-Hb), 2.54(s, 3H, SMe), 3.72(dd, 1H, J=2.7, 11.6Hz, 5'-Ha), 3.94(dd, 1H, J=2.2, 11.6Hz, 5'-Hb), 4.03(s, 3H, OMe), 4.32-4.48(m, 2H, 2'-H, 4'-H), 6.07(d, 1H, J=3.0Hz, 1'-H), 7.59(s, 1H, 8-H)

합성예 34

7-요오드-2-메틸티오-9-[2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-디옥시-β-D-리보푸라노실]-7-데아자푸린-6-온(화합물 28)의 합성

4-티오크레졸(3.36g, 27.0mmol)을 메탄올에 용해후, 나트륨메톡시드(1.61g, 29.7mmol)을 첨가하고, 5분간 교반한 후 메탄올을 제거하였다. 이것에, 톨루엔(150ml)에 용해한 7-요오드-6-메톡시-2-메틸티오-9-[2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-디옥시-β-D-리보푸라노실]-7-데아자푸린(화합물 27: 4.00g, 6mmol) 및 헥사메틸포스포르아미드(10ml, 57.1mmol)을 첨가하고, 질소기류하에서 4.5시간 환류하였다. 반응종료후, 초산에틸과 물을 가하고, 유기층을 포화식염수로 세정하였다. 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조후 감압농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 염화메틸렌-메탄올 혼합용매)로 정제하여, 신규물질 7-요오드-2-메틸티오-9-[2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-디옥시-β-D-리보푸라노실]-7-데아자푸린-6-온(화합물 28) 2.35g을 얻었다(수율 59.9%).

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6)δppm: 0.06, 0.08, 0.20, 0.24(4s, 12H, 4MeSi), 0.92, 1.03(2s, 18H, 2t-Bu), 2.07-2.13(m, 1H, 3'-Ha), 2.34-2.38(m, 1H, 3'-Hb), 2.63(s, 3H, SMe), 3.81-4.05(m, 2H, 5'-Ha, b), 4.46-4.57(m, 2H, 2'-H, 4'-H), 6.12(d, 1H, J=3.0Hz, 1'-H), 7.47(s, 1H, 8-H), 12.44(s, 1H, 1-H)

합성예 35

7-요오드-2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-디옥시-7-데아자구아노신(화합물 29)의 합성

7-요오드-2-메틸티오-9-[2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-디옥시-β-D-리보푸라노실]-7-데아자푸린-6-온(화합물 28: 2.30g, 3.53mmol)을 염화메틸렌 (90ml)에 용해하고, 0℃에서 냉각 후, m-클로로 과안식향산(0.96g, 3.83mmol)을 첨가하여 0℃에서 15분간 교반하고, 실온에서 1시간동안 더 교반시켰다. 반응종료후, 반응액을 포화탄산수소나트륨 용액 및 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조후 염화메틸렌을 제거하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름-메탄올 혼합용매)로 정제하여 술폭시드체 2.02g(수율 83.9%)를 얻었다. 이것을 1,4-디옥산(20ml)에 용해하고, -78℃에서 냉각후, 액체암모니아(60ml)를 가하고, 110℃에서 6시간 가열하였다. 반응종료후, 반응액을 감압농축하고, 얻어진 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 염화메틸렌-메탄올 혼합용매)로 정제하여, 신규물질 7-요오드-2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-디옥시-7-데아자구아노신(화합물 29) 1.60g을 얻었다(수율 73.1%).

합성예 36

3'-디옥시-7-요오드-7-데아자구아노신(화합물 30)의 합성

7-요오드-2',5'-비스(O-tert-부틸디메틸시릴)-3'-디옥시-7-데아자구아노신(화합물 29: 1.6g, 2.58mmol)을 THF(50ml)에 용해하고, 1M-테트라부틸암모늄플루오라이드(6.2ml, 6.17mmol)를 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응종료후, 반응액을 감압농축하고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름-메탄올 혼합용매)로 정제후, 메탄올로 결정화시켜, 신규물질 3'-디옥시-7-요오드-7-데아자구아노신(화합물 30) 0.80g을 얻었다(수율 79.1%).

융점: 176-178℃(분해)

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6)δppm: 1.81-1.89(m, 1H, 3'-Ha), 2.10-2.20(m, 1H, 3'-Hb), 3.43-3.64(m, 2H, 5'-Ha, b), 4.18-4.29(m, 2H, 2'-H, 4'-H), 4.91(t, 1H, J=5.5Hz, 5'-OH), 5.46(d, 1H, J=4.3Hz, 2'-OH), 5.80(d, 1H, J=2.4Hz, 1'-H), 6.30(brs, 2H, 2-NH₂), 7.10(s, 1H, 8-H), 10.45(brs, 1H, 1-H)

합성예 37

3'-디옥시-7-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥시닐)-7-데아자구아노신(화합물 31)의 합성

3'-디옥시-7-요오드-7-데아자구아노신(화합물 30; 765mg, 2.0mmol)의 DMF (10ml)용액에 질소기류하에서, 합성예 7에서 얻은 6-트리플루오로아세타미드-1-헥신(1.16g, 6.0mmol), 요오드화 구리(I)(76.4mg, 0.40mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)(226mg, 0.20mmol) 및 트리에틸아민(0.56ml, 4.0mmol)을 가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응액을 염화메틸렌-메탄올 혼합액(20ml)으로 희석하고 이온교환 수지 AG1X8(HCO₃ ^-형; 2.0g)을 가하고, 30분간 교반하였다. 여과분별한 후, 여액을 농축하여 얻은 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름-메탄올 혼합용액)로 정제하여, 신규물질 3'-디옥시-7-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥시닐)-7-데아자구아노신(화합물 31) 616mg을 얻었다(수율 69.5%).

mp 185-187

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6)δppm: 1.47-1.68(m, 4H, -(CH₂)₂-), 1.80-1.88(m, 1H, 3'-Ha), 2.09-2.19(m, 1H, 3'-Hb), 2.38(t, 2H, J=6.9Hz, CCCH₂), 3.25(q, 2H, J=6.8Hz, CH₂N), 3.42-3.62(m, 2H, 5'-Ha, b), 4.17-4.30(m, 2H, 2'-H, 4'-H), 4.90(t, 1H, J=5.5Hz, 5'-OH), 5.45(d, 1H, J=4.3Hz, 2'-OH), 5.80(d, 1H, J=2.7Hz, 1'-H), 6.28(brs, 2H, 2-NH₂), 7.11(s, 1H, 8-H), 9.42(brs, 1H, NHTfa), 10.39(s, 1H, 1-H)

합성예 38

7-데아자-7-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트(화합물 32)의 합성

3'-디옥시-7-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥시닐)-7-데아자구아노신(화합물 31: 133mg, 0.3mmol)을 인산트리에틸(1.33ml)에 용해하고, -20℃까지 냉각한 후 옥시염화인(25㎕)을 첨가하여 -20℃에서 교반하였다. 30분 경과후, 옥시염화인 (22㎕)를 추가하여, 하룻밤 더 교반하였다. 이 반응액을 -20℃에서 냉각한 트리스 (트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트를 0.5M 포함한 DMF용액(3.6ml)에 첨가하고, 실온에서 3시간 교반시켰다. 반응종료후, 트리에틸아민-물 혼합액(4ml)을 첨가하고, 반응액을 에테르로 세정후, DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 (1.7×30cm; 용출액:탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0M→0.6M 직선농도구배(전량 2L))로 정제하였다. 이것에 25% 암모니아수(20ml)를 가하여 1시간 정치하고, 감압농축한 후, 얻은 잔사를 다시 DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 (1.7×30cm; 용출액:탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH7.5) 0M→0.3M 직선농도구배 (전량 1L))로 정제하여, 신규물질 7-데아자-7-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트(화합물 32) 108mg을 얻었다(수율 36.4%).

합성예 39

R110 표식 7-데아자-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 합성

7-데아자-7-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트(화합물 32: 8μmol)과 5-카르복시로다민 110-비스-트리플루오로아세타미드숙신산 이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(15μmol)을 DMF(500㎕)-물(250㎕)에 용해하고, 트리에틸아민(0.16ml) 및 피리딘(0.29ml)를 가하고, 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석시킨 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피 (1.7×30cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.1M→0.8M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 하기 식에서 나타나는 R110 표식 7-데아자-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4의 화합물. 이하,R110-3'dGTP(n4)라고 약기함]. 3.38μmol을 얻었다(수율 42.3%).

또한, 얻어진 R110-3'dGTP(n4)를 DU640 자외가시분광해석 시스템[베크만(주)제]을 이용하여, 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700nm∼200nm, 대조: 증류수)를 도 20에 나타내었다.

합성예 40

N-프로팔길(propargyl)트리플루오로아세타미드의 합성

0℃에서 냉각한 트리플루오로초산메틸(동경화성제; 69.2g, 0.54mol)에 프로팔길아민(알드리치사제; 25g, 0.45mol)을 적하하였다. 0℃에서 2시간 반응한 후, 감압증류(23mmHg; 비점 77℃)에 의해 정제하여, N-프로팔길트리플루오로아세타미드 43.8g(86.0%)을 얻었다.

합성예 41

3'-디옥시-5-(3″-트리플루오로아세타미드-1″-프로피닐)우리딘의 합성

3'-디옥시-5-요오드우리딘(화합물 2; 1.56g, 4.4mmol)의 DMF(22ml)용액에 질소기류하에서, 합성예 40에서 얻은 N-프로팔길트리플루오로아세타미드(1.54ml, 13.2mmol), 요오드화 구리(I)(168mg, 0.88mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)(508mg, 0.44mmol) 및 트리에틸아민(1.23ml, 8.8mmol)을 가하여 실온에서 4시간 반응시켰다. 반응액을 감압농축하여 얻은 잔사를 염화메틸렌-메탄올 혼합액 (40ml)에 용해하고 이온교환 수지 AG1X8(바이올라드사제, HCO₃ ^-형; 4g)을 가하여, 30분간 교반하였다. 여과분별한 후, 여액을 농축하여 얻은 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 염화메틸렌-메탄올 혼합용액)로 정제하여, 3'-디옥시-5-(3″-트리플루오로아세타미드-1″-프로피닐)우리딘 918mg을 얻었다(수율 55.3%).

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6)δppm: 1.89-1.92(m, 1H, 3'-Ha), 2.17-2.26(m, 1H, 3'-Hb), 3.53, 3.76(2dd, 2H, J=3.1, 11.9; 2.7, 12.1Hz, 5'-Ha, b), 4.22-4.30(m, 4H, 2'-H, 4'-H, -CH₂-), 5.20(brs, 1H, 5'-OH), 5.52(d, 1H, J=4.0Hz, 2'-OH), 5.75(d, 1H, J=1.9Hz, 1'-H), 8.34(s, 1H, 6-H), 10.06(t, 1H, J=5.4Hz, NHTfa), 11.67(s, 1H, NH)

합성예 42

5-(3″-아미노-1″-프로피닐)-3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트의 합성

3'-디옥시-5-(3″-트리플루오로아세타미드-1″-프로피닐)우리딘(42mg, 0.11mmol)을 인산트리에틸(1.13ml)에 용해하고, -20℃까지 냉각한 후 옥시염화인 (25㎕)을 첨가하여, -20℃에서 교반하였다. 30분 경과후, 옥시염화인(22㎕)를 추가하고, 5시간 더 교반하였다. 이 반응액을, -20℃에서 냉각한 합성예 4에서 얻은트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트를 0.5M 포함한 DMF 용액(3.6ml)에 첨가하고, 실온에서 2시간 교반시켰다. 반응종료후, 트리에틸아민-물 혼합액(4ml)을 첨가하고, 하룻밤 정치하였다. 반응액을 에테르로 세정후, 농축건고하여 얻은 잔사를 DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(히가리소사제; 1.2×30cm; 용출액:탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 5'-(3″-아미노-1″-프로피닐)-3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트 115mg을 얻었다(수율 41.3%).

합성예 43

TMR-표식 3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=1인 화합물)의 합성

5-(3″-아미노-1″-프로피닐)-3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트(10.5μmol)의 1M-탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 9.05; 1.2ml)에 5-카르복시테트라메틸로다민숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(15mg)의 DMF용액(0.9ml)를 가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석시킨 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.2×30cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.05M→0.7M 직선농도구배(전량 2L))로 정제하여, TMR-표식 3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, n=1의 화합물. 이하, TMR-3'dUTP(n1)라고 약기함] 7.38μmol을 얻었다(수율 70.2%).

합성예 44

3'-디옥시-5-(3″-트리플루오로아세타미드-1″-프로피닐)시티딘의 합성

3'-디옥시-5-요오드시티딘(화합물 6; 1.0g, 2.83mmol)의 DMF(14ml)용액에 질소기류하에서, 합성예 2에서 얻은 N-프로팔길트리플루오로아세타미드(0.99ml, 8.50mmol), 요오드화 구리(I)(108mg, 0.566mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)(327mg, 0.283mmol) 및 트리에틸아민(0.8ml, 5.66mmol)을 가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응액을 염화메틸렌-메탄올 혼합액(25ml)으로 희석하고 이온교환수지 AG1X8(HCO₃ ^-형; 2.6g)을 가하여 30분간 교반하였다. 여과분별한 후, 여액을 농축하여 얻은 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 염화메틸렌-메탄올 혼합용액)로 정제하여, 3'-디옥시-5-(3″-트리플루오로아세타미드-1″-프로피닐)시티딘 879mg을 얻었다(수율 82.5%).

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6)δppm: 1.64-1.71(m, 1H, 3'-Ha), 1.86-1.96(m, 1H, 3'-Hb), 3.52-3.57(m, 1H, 5'-Ha), 3.79-3.83(m, 1H, 5'-Hb), 4.14-4.28(m, 4H, 2'-H, 4'-H, -CH₂-), 5.18(t, 1H, J=5.0Hz, 5'-OH), 5.53(d, 1H, J=3.8Hz, 2'-OH), 5.63(s, 1H, 1'-H), 6.76(brs, 1H, NH2a), 7.74(brs, 1H, NH2b), 8.38(s, 1H, 6-H), 9.93(brs, 1H, NHTfa)

합성예 45

5-(3″-아미노-1″-프로피닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트의 합성

3'-디옥시-5-(3″-트리플루오로아세타미드-1″-프로피닐)시티딘(113mg, 0.3mmol)을 인산트리에틸(1.13ml)에 용해하고, -20℃까지 냉각한 후 옥시염화인(25㎕)을 첨가하고, -20℃에서 교반하였다. 30분 경과후, 옥시염화인(22㎕)를 추가하고, 5시간 더 교반하였다. 이 반응액을 -20℃에서 냉각한 합성예 4에서 얻은 트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트를 0.5M 포함한 DMF 용액(3.6ml)에 첨가하고, 실온에서 2시간 교반시켰다. 반응종료후, 트리에틸아민-물 혼합액(4ml)을 첨가하고, 하룻밤 정치한 후, 25% 암모니아수(20ml)를 가하여 4시간 정치하였다. 반응액을 에테르로 세정후, 농축건고하여 얻은 잔사를 DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(1.2×30cm; 용출액:탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 5-(3″-아미노-1″-프로피닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트 115mg을 얻었다(수율 41.3%).

합성예 46

XR-표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=1인 화합물)의 합성

5-(3″-아미노-1″-프로피닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(8μmol)를 용해한 1M-탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 9.05; 0.4ml)에 5-카르복시-X-로다민 숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(15mg)의 DMF용액(0.9ml)를 가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하고 희석한 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.2×30cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액 (pH 7.5) 0.1M→0.7M 직선농도구배(전량 2L))로 정제하여, XR-표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=1의 화합물. 이하, XR-3'dCTP(n1)라고 약기함] 2.93μmol을 얻었다(수율 36.6%).

합성예 47

7-데아자-7-{3″-트리플루오로아세타미드-1″-프로피닐)-3'-디옥시아데노신의 합성

7-요오드-3'-디옥시-7-데아자아데노신(화합물 18; 0.5g, 1.33mmol)의 DMF (6.7ml)용액에 질소기류하에서, 합성예 40에서 얻은 N-프로팔길트리플루오로아세타미드(0.47ml, 3.99mmol), 요오드화 구리(I)(51mg, 0.266mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)(154mg, 0.133mmol) 및 트리에틸아민(0.37ml, 2.66mmol)을 가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응액을 염화메틸렌-메탄올 혼합액(12ml)으로 희석하고 이온교환 수지 AG1X8(HCO₃ ^-형; 1.22g)을 가하여 30분간 교반하였다. 여과분별한 후, 여액을 농축하고 얻어진 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 염화메틸렌-메탄올 혼합용액)로 정제하여, 7-데아자-7-(3″-트리플루오로아세타미드-1″-프로피닐)-3'-디옥시아데노신 436mg을 얻었다(수율 82.3%).

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6)δppm: 1.83-1.91(m, 1H, 3'-Ha), 2.14-2.24(m, 1H, 3'-Hb), 3.48-3.56(m, 1H, 5'-Ha), 3.66-3.73(m, 1H, 5'-Hb), 4.30-4.35(m, 4H, 2'-H, 4'-H, -CH₂-), 5.08(t, 1H, J=5.5Hz, 5'-OH), 5.59(d, 1H, J=3.8Hz, 2'-OH), 6.02(d, 1H, J=2.2Hz, 1'-H), 6.80(brs, 2H, NH₂), 7.79(s, 1H, 8-H), 8.12(s, 1H, 2-H), 10.08(brs, 1H, NHTfa)

합성예 48

7-데아자-7-(3″-아미노-1″-프로피닐)-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트의 합성

7-데아자-7-(3″-트리플루오로아세타미드-1″-프로피닐)-3'-디옥시아데노신(120mg, 0.3mmol)을 인산트리에틸(1.2ml)에 용해하고, -20℃까지 냉각한 후 옥시염화인(25㎕)을 첨가하여, -20℃에서 교반하였다. 30분 경과후, 옥시염화인(22㎕)를 추가하고, 4시간 더 교반하였다. 이 반응액을 -20℃에서 냉각한 합성예 4에서 얻은 트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트를 0.5M 포함한 DMF 용액(3.6ml)에 첨가하고, 실온에서 3시간 교반시켰다. 반응종료후, 트리에틸아민-물 혼합액(4ml)을 첨가하고, 하룻밤 정치한 후, 25% 암모니아수(20ml)를 가하여 4시간 정치하였다. 반응액을 에테르로 세정후, 농축건고하여 얻은 잔사를 DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(1.2×30cm; 용출액:탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 7-데아자-7-(3″-아미노-1″-프로피닐)-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트 114mg을 얻었다(수율 39.9%).

합성예 49

R6G 표식 7-데아자-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=1인 화합물)의 합성

7-데아자-7-(3″-아미노-1″-프로피닐)-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(8μmol)를 용해한 1M-탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 9.05; 0.4ml)에 5-카르복시로다민 6G 숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(14.5mg)의 DMF용액 (0.8ml)를 가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석시킨 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.2×30cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.1M→0.6M 직선농도구배(전량 2L))로 정제하여, R6G 표식 7-데아자-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=1의 화합물. 이하, R6G-3'dATP(n1)라고 약기함] 2.54μmol을 얻었다(수율 31.7%).

합성예 50

3'-디옥시-7-{3″-트리플루오로아세타미드-1″-프로피닐)-7-데아자구아노신의 합성

3'-디옥시-7-요오드-7-데아자구아노신(화합물 30; 0.65g, 1.7mmol)의 DMF (8.5ml)용액에 질소기류하에서, 합성예 40에서 얻은 N-프로팔길트리플루오로아세타미드(0.58ml, 5.0mmol), 요오드화 구리(I)(63mg, 0.33mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)(192mg, 0.17mmol) 및 트리에틸아민(0.46ml, 3.31mmol)을 가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응액을 염화메틸렌-메탄올 혼합액(16ml)으로 희석하고 이온교환 수지 AG1X8(HCO₃ ^-형; 1.6g)을 가하여 30분간 교반하였다. 여과분별한 후, 여액을 농축하여 얻은 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름-메탄올 혼합용액)로 정제하여, 3'-디옥시-7-(3″-트리플루오로아세타미드-1″-프로피닐)-7-데아자구아노신 485mg을 얻었다(수율 70.5%).

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6)δppm: 1.81-1.91(m, 1H, 3'-Ha), 2.10-2.21(m, 1H, 3'-Hb), 3.42-3.68(m, 2H, 5'-Ha, b), 4.22-4.30(m, 4H, 2'-H, 4'-H, -CH₂-), 4.94(t, 1H, J=5.5Hz, 5'-OH), 5.49(d, 1H, J=4.3Hz, 2'-OH), 5.81(d, 1H, J=2.4Hz, 1'-H), 6.32(brs, 2H, 2-NH₂), 7.27(s, 1H, 8-H), 10.05(brs, 1H, NHTfa), 10.50(brs, 1H, 1-H)

합성예 51

7-데아자-7-(3″-아미노-1″-프로피닐)-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트의 합성

3'-디옥시-7-(3″-트리플루오로아세타미드-1″-프로피닐)-7-데아자구아노신(125mg, 0.3mmol)을 인산트리에틸(1.25ml)에 용해하고, -20℃까지 냉각한 후 옥시염화인(25㎕)을 첨가하고, -20℃에서 교반하였다. 30분 경과후, 옥시염화인(22㎕)을 추가하여, 하룻밤 더 교반하였다. 이 반응액을 -20℃에서 냉각한 합성예 4에서 얻은 트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트를 0.5M 포함한 DMF 용액(3.6ml)에 첨가하고, 실온에서 3시간 교반시켰다. 반응종료후, 트리에틸아민-물 혼합액(4ml)을 첨가하고, 반응액을 에테르로 세정후, DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 (1.2×30cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0M→0.6M 직선농도구배(전량 2L))로 정제하였다. 이것에 25% 암모니아수(15ml)를 가하고 1시간 정치하고, 감압농축후, 얻은 잔사를 다시 DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.2×30cm; 용출액:탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 7-데아자-7-(3″-아미노-1″-프로피닐)-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트 75mg을 얻었다(수율 25.9%).

합성예 52

R110 표식 7-데아자-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=1인 화합물)의 합성

7-데아자-7-(3″-아미노-1″-프로피닐)-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트(10.5μmol)와 5-카르복시로다민 110-비스-트리플루오로아세타미드숙신산이미드 에스테르(몰레큘러 프루브사제)(31.5mg)를 DMF(0.49ml)-물(0.23ml)에 용해하고, 트리에틸아민(0.16ml) 및 피리딘(0.29ml)을 가하여, 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석한 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피 (1.2×30cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.1M→0.8M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, R110 표식 7-데아자-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=1의 화합물. 이하, R110-3'dGTP(n1)라고 약기함] 3.67μmol을 얻었다(수율 34.9%).

합성예 53

R110 표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 합성

5-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화합물 8: 8μmol)을 용해한 DMF(400㎕)-물(200㎕) 혼합액에 트리에틸아민(20㎕)과 5-카르복시로다민 110-비스-트리플루오로아세테이트숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(21μmol)을 가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석시킨 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×15cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.1M→0.8M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 하기 식에서 나타나는 R110 표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4의 화합물. 이하, R110-3'dCTP(n4)라고 약기함] 5.83μmol을 얻었다(수율 72.9%).

또한, 얻어진 R110-3'dCTP(n4)를 DU640 자외가시분광해석 시스템[베크만(주)제]을 이용하여, 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700nm∼200nm, 대조: 증류수)를 도 21에 나타내었다.

합성예 54

R6G 표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 합성

5-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화합물 8: 8μmol)을 용해한 DMF(2.9ml)-물(0.9ml) 혼합액에 트리에틸아민(20㎕), 6-카르복시로다민 6G 숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(16μmol)을 가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석시킨 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×15cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액 (pH 7.5) 0.1M→0.7M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 하기 식에서 나타나는 R6G 표식-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, n=4의 화합물. 이하,R6G-3'dCTP(n4)라고 약기함] 5.83μmol을 얻었다(수율 43.1%).

[식중, Et는 에틸기를, 또한 Me는 메틸기를 각각 나타낸다.]

또한, 얻어진 R6G-3'dCTP(n4)를 DU640 자외가시분광해석 시스템[베크만(주)제]을 이용하여, 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700nm∼200nm, 대조: 증류수)를 도 22에 나타내었다.

합성예 55

XR 표식 7-데아자-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 합성

7-데아자-7-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트(화합물 20: 8μmol)을 용해한 DMF(400㎕)-물(400㎕) 혼합액에, 트리에틸아민(20㎕)과 6-카르복시-X-로다민숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(22μmol)을 가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석한 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×15cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.1M→0.6M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 하기 식에서 나타나는 XR 표식 7-데아자-3'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4의 화합물. 이하, XR-3'dATP(n4)라고 약기함] 4.39μmol을 얻었다(수율 54.8%).

또한, 얻어진 XR-3'dATP(n4)를 DU640 자외가시분광해석 시스템[베크만(주)제]을 이용하여, 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700nm∼200nm, 대조: 증류수)를 도 23에 나타내었다.

합성예 56

XR 표식 7-데아자-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4인 화합물)의 합성

7-데아자-7-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트(화합물 32: 8μmol)와 5-카르복시-X-로다민숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(19μmol)을 DMF(400㎕)-물(200㎕) 혼합액에 용해하고, 트리에틸아민(20㎕)을 가하여 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석한 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×15cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액 (pH 7.5) 0.1M→0.8M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 하기 식에서 나타나는 XR-표식-7-데아자-3'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, V가 -C≡C-이고, n=4의 화합물. 이하, XR-3'dGTP(n4)라고 약기함] 2.68μmol을 얻었다(수율 33.5%).

또한, 얻어진 XR-3'dGTP(n4)를 DU640 자외가시분광해석 시스템[베크만(주)제]을 이용하여, 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700nm∼200nm, 대조: 증류수)를 도 24에 나타내었다.

합성예 57

6-트리플루오로아세타미드-1-헥센의 합성.

1)5-헥세닐-p-톨루엔 술포네이트의 합성.

빙냉한 염화 p-톨루엔 술포닐(54.78g, 287mmol)의 피리딘(100ml)용액에 5-헥센-1-올[동경화성(주)제; 20ml, 239mmol]을 적하하고, 그 후 5℃에서 16시간 교반하였다. 반응액을 빙수(500ml)에 투입한 후, 에테르(500ml)로 추출하고, 에테르층을 차가운 1N-염산, 포화탄산수소나트륨 수용액 및 포화식염수로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조후 감압하에서 농축하여, 5-헥세닐-p-톨루엔술포네이트 44.37g을 얻었다(수율 72.9%).

2)6-요오드-1-헥센의 합성.

5-헥세닐-p-톨루엔술포네이트(44.3g, 174mmol), 요오드화나트륨(31.3g, 209mmol) 및 아세톤(250ml)의 혼합액을 3시간 환류반응시켰다. 냉각후, 침전물을 여과분별하고 여액을 농축하였다. 얻어진 잔사를 에테르(500ml)에 용해후, 포화아황산수소나트륨 수용액, 포화탄산수소나트륨 수용액 및 포화식염수로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조후 감압하에서 농축하여, 6-요오드-1-헥센 31.27g을 얻었다(수율 85.5%).

3)6-트리플루오로아세타미드-1-헥센의 합성.

수소화나트륨(60% 유성; 14.89g, 372mmol)의 DMF(370ml)용액에 트리플루오로아세타미드(50.39g, 446mmol)을 빙냉하에서, 약 10부분에 걸쳐 첨가하였다. 이어 6-요오드-1-헥센(31.27g, 149mmol)의 DMF(130ml)용액을 가하여, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응액에 포화염화암모늄수(300ml) 및 에테르(300ml)를 가하여 추출하였다. 에테르층을 포화식염수(300ml)로 2회 세정후, 황산마그네슘으로 건조하여 감압하에서 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 헥산-초산 에틸 혼합용매)로 정제하여, 6-트리플루오로아세타미드-1-헥센 24.36g을 얻었다(수율 83.8%).

1H-NMR(270MHz, CDCl₃) δppm: 1.39-1.69(m, 4H, -CH₂(CH₂)₂CH₂-), 2.04-2.14(m, 2H, H₂C=C-), 3.37(dd, 2H, J=7.0, 13.8Hz, CH₂N), 4.96-5.06(m, 2H, =CHCH₂), 5.71-5.86(m, 1H, H₂C=CH), 6.45(brs, 1H, NHTfa)

합성예 58

3'-디옥시-5-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥세닐)우리딘(화합물 33)의 합성.

염화팔라듐(1.77g, 10mmol)과 염화리튬(0.85g, 20mmol)의 메탄올(100ml)용액을 하룻밤 교반하고, 리튬테트라클로로팔라데이트의 0.1M 용액을 조제하였다. 3'-디옥시우리딘(화합물 1:1.14g, 5mmol)과 초산수은(II)(1.60g, 5mmol)을 물(50ml)에 용해하고, 60℃에서 5시간동안 교반하였다. 반응액을 감압하에서 농축후, 잔사를 무수 메탄올(55ml)에서 현탁시키고, 앞서 조제한 리튬테트라클로로팔라데이트의 0.1M용액(55ml)과 합성예 57에서 얻은 6-트리플루오로아세타미드-1-헥센(3.42g, 17.5mmol)를 가하여, 16시간 환류반응시켰다. 반응액을 황화수소가스로 포화시킨 후, 침전을 셀라이트를 통과하여 여과분별하고, 여액을 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 디클로로메탄-메탄올 혼합용액) 및 HPLC(컬럼; Wakosil II 5C18 RS Prep 20.0×250mm, 용출액; 아세토니트릴-물 혼합용액)로 정제하여, 신규물질 3'-디옥시-5-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥세닐)우리딘(화합물 33) 454mg을 얻었다(수율 21.6%).

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6) δppm: 1.25-1.55(m, 4H, -(CH₂)₂-), 1.68-1.80(m, 1H, 3'-Ha), 1.95-2.18(m, 3H, 3'-Hb, 및 =CHCH₂), 3.05-3.25(m, 2H, CH₂N), 3.50-3.60(m, 1H, 5'-Ha), 3.70-3.85(m, 1H, 5'-Hb), 4.15-4.36(m, 2H, 2'-H 및 4'-H), 5.22(t, 1H, J=5.1Hz, 5'-OH), 5.54(d, 1H, J=4.3Hz, 2'-OH), 5.66(d, 1H, J=1.6Hz, 1'-H), 6.03(d, 1H, J=15.7Hz, -CH=CHCH₂-), 6.38(dt, 1H, J=7.0, 16.2Hz, -CH=CHCH₂-), 8.18(s, 1H, 6-H), 9.39(brs, 1H, NHTfa), 11.31(s, 1H, 3-NH)

합성예 59

3'-디옥시-5-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥세닐)우리딘(화합물 33)의 합성.

3'-디옥시-5-요오드우리딘(화합물 2; 300mg, 0.85mmol)의 DMF (4.25ml)용액에 질소기류하에서, 합성예 57에서 얻은 6-트리플루오로아세타미드-1-헥센 (496mg, 2.54mmol), 요오드화 구리(I)(32.3mg, 0.17mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)(97.9mg, 0.085mmol) 및 트리에틸아민(0.24ml, 1.69mmol)을 가하고 60℃에서 18시간 반응시켰다. 반응액을 염화메틸렌-메탄올 혼합액(9.3ml)으로 희석하고 이온교환 수지 AG1X8(바이오라드사제, HCO₃ ^-형; 0.68g)을 가하고 30분간 교반하였다. 여과분별한 후, 여액을 농축하고 얻어진 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 염화메틸렌-메탄올 혼합용액) 및 HPLC(컬럼; Wakosil II 5C18 RS Prep 20.0×250mm, 용출액; 아세토니트릴-물 혼합용액)로 정제하여, 신규물질 3'-디옥시-5-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥세닐)우리딘(화합물 33) 127mg을 얻었다(수율 35.5%).

1H-NMR(270MHz, DMSO-d6) δppm: 1.25-1.55(m, 4H, -(CH₂)₂-), 1.68-1.80(m, 1H, 3'-Ha), 1.95-2.18(m, 3H, 3'-Hb, 및 =CHCH₂), 3.05-3.25(m, 2H, CH₂N), 3.50-3.60(m, 1H, 5'-Ha), 3.70-3.85(m, 1H, 5'-Hb), 4.15-4.36(m, 2H, 2'-H 및 4'-H), 5.22(t, 1H, J=5.1Hz, 5'-OH), 5.54(d, 1H, J=4.3Hz, 2'-OH), 5.66(d, 1H, J=1.6Hz, 1'-H), 6.03(d, 1H, J=15.7Hz, -CH=CHCH₂-), 6.38(dt, 1H, J=7.0, 16.2Hz, -CH=CHCH₂-), 8.18(s, 1H, 6-H), 9.39(brs, 1H, NHTfa), 11.32(s, 1H, 3-NH)

합성예 60

5-(6″-아미노-1″-헥세닐)-3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트(화합물 34)의 합성.

3'-디옥시-5-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥세닐)우리딘(화합물 33: 126.4mg, 0.3mmol)을 인산트리에틸(1.26ml)에 용해하고, -20℃까지 냉각한 후 옥시염화인(41.9㎕)을 첨가하고, -20℃에서 교반하였다. 30분 경과후, 옥시염화인 (55.9㎕)를 추가하고, 23시간 더 교반하였다. 이 반응액을 -20℃에서 냉각한 트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트를 0.5M 포함한 DMF 용액(3.6ml)에 첨가하고, 실온에서 3시간 교반시켰다. 반응종료후, 트리에틸아민-물 혼합액(15ml)을 첨가하고, 하룻밤 정치시켰다. 반응액을 에테르로 세정후, DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×40cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액 (pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하였다. 이것에 17% 암모니아수 (60ml)를 가하고 5℃에서 17시간 정치하고, 감압농축후, 얻어진 잔사를 다시 DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×40cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액 (pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 신규물질 5-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트(화합물 34) 65.3mg을 얻었다(수율 22.4%).

합성예 61

TMR 표식 3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4인 화합물)의 합성

5-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트(화합물 34: 14.8μmol)을 용해한 DMF(300㎕)-물(300㎕)의 혼합액에 트리에틸아민(10㎕) 및 6-카르복시테트라메틸로다민숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제) (15.9μmol)를 가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석한 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×15cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.05M→0.65M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 하기 식에서 나타나는 연결자부가 2중결합이고, 그 메틸렌고리의 n의 수가 4개인 TMR 표식 3'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서 V가 -CH=CH-이고, n=4의 화합물. 이하, TMR-Allyl-3'dUTP(n4)라고 약기함] 7.62μmol을 얻었다(수율 51.4%).

[식중, Me는 메틸기를 나타낸다.]

또한, 얻어진 TMR-Allyl-3'dUTP(n4)를 DU640 자외가시분광해석 시스템[베크만(주)제]을 이용하여, 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700nm∼200nm, 대조: 증류수)를 도 25에 나타내었다.

합성예 62

3'-디옥시-5-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥세닐)시티딘(화합물 35)의 합성.

3'-디옥시-5-요오드시티딘(화합물 6; 600mg, 1.70mmol)의 DMF (8.5ml)용액에 질소기류하에서, 합성예 57에서 얻은 6-트리플루오로아세타미드-1-헥센 (995mg, 5.1mmol), 요오드화 구리(I)(64.7mg, 0.34mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)(196mg, 0.17mmol) 및 트리에틸아민(0.47ml, 3.40mmol)을 가하여 60℃에서 18시간 반응시켰다. 반응액을 염화메틸렌-메탄올 혼합액(20ml)으로 희석하고 이온교환 수지 AG1X8(바이오라드사제, HCO₃ ^-형; 1.36g)을 가하여 30분간 교반하였다. 여과분별한 후, 여액을 농축하여 얻은 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 염화메틸렌-메탄올 혼합용액) 및 HPLC(컬럼; Wakosil II 5C18 RS Prep 20.0×250mm, 용출액; 아세토니트릴-물 혼합용액)로 정제하여, 신규물질 3'-디옥시-5-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥세닐)시티딘(화합물 35) 187mg을 얻었다(수율 26.2%).

1H-NMR(400MHz, DMSO-d6) δppm: 1.37-1.52(m, 4H, -(CH₂)₂-), 1.64-1.68(m, 1H, 3'-Ha), 1.90-1.97(m, 3H, 3'-Hb), 2.07-2.12(m, 2H, =CHCH₂), 3.18(dd, 2H, J=6.8, 12.8Hz, CH₂N), 3.53-3.56(m, 1H, 5'-Ha), 3.80-3.82(m, 1H, 5'-Hb), 4.10-4.30(m, 2H, 2'-H 및 4'-H), 5.15(t, 1H, J=5.0Hz, 5'-OH), 5.48(d, 1H, J=4.0Hz, 2'-OH), 5.65(s, 1H, 1'-H), 5.87(dt, 1H, J=6.8, 15.6Hz, -CH=CHCH₂-), 6.18(d, 1H, J=15.6Hz, -CH=CHCH₂-), 6.91, 7.10(2br s, 2H, 4-NH₂), 8.26(s, 1H, 6-H), 9.38(brs, 1H, NHTfa)

합성예 63

5-(6″-아미노-1″-헥세닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화합물 36)의 합성.

3'-디옥시-5-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥세닐)시티딘(화합물 35: 126.1mg, 0.3mmol)을 인산트리에틸(1.26ml)에 용해하고, -20℃까지 냉각한 후, 옥시염화인(25.1㎕)을 첨가하여 -20℃에서 교반하였다. 30분 경과후, 옥시염화인 (22.3㎕)를 추가하고, 4시간 더 교반하였다. 이 반응액을 -20℃에서 냉각한 트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트를 0.5M 포함한 DMF 용액(3.6ml)에 첨가하고, 실온에서 3시간 교반시켰다. 반응종료후, 트리에틸아민-물 혼합액(5ml)을 첨가하고, 하룻밤 정치시켰다. 반응액을 에테르로 세정후, DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×40cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액 (pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하였다. 이것에 17% 암모니아수 (60ml)를 가하여 5℃에서 15시간 정치하고, 감압농축후, 얻어진 잔사를 다시 DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×40cm; 용출액:탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 신규물질 5-(6″-아미노-1″-헥시닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화합물 36) 175mg을 얻었다(수율 60.2%).

합성예 64

XR 표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4인 화합물)의 합성

5-(6″-아미노-1″-헥세닐)-3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트(화합물 36: 10μmol)을 용해한 DMF(300㎕)-물(300㎕)의 혼합액에 트리에틸아민(10㎕), 6-카르복시-X-로다민숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(25μmol)를 가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석시킨 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×15cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액 (pH 7.5) 0.05M→0.65M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 하기 식에서 나타나는 연결자부가 2중결합이고, 그 메틸렌고리의 n의 수가 4개인 XR 표식 3'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4의 화합물. 이하, XR-Allyl-3'dCTP(n4)라고 약기함] 6.55μmol을 얻었다(수율 65.5%).

또한, 얻어진 XR-Allyl-3'dCTP(n4)를 DU640 자외가시분광해석 시스템 [베크만(주)제]을 이용하여, 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700nm∼200nm, 대조: 증류수)를 도 26에 나타내었다.

합성예 65

7-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥세닐)-3'-디옥시-7-데아자아데노신(화합물 37)의 합성.

7-요오드-3'-디옥시-7-데아자아데노신(화합물 18; 600mg, 1.60mmol)의 DMF (8.0ml)용액에 질소기류하에서, 합성예 57에서 얻은 6-트리플루오로아세타미드-1-헥센 (912mg, 4.80mmol), 요오드화 구리(I)(62mg, 0.32mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)(184mg, 0.16mmol) 및 트리에틸아민(0.44ml, 3.2mmol)을 가하고 60℃에서 18시간 반응시켰다. 반응액을 염화메틸렌-메탄올 혼합액(16ml)으로 희석하고 이온교환 수지 AG1X8(바이오라드사제, HCO₃ ^-형; 1.50g)을 가하여 30분간 교반하였다. 여과분별한 후, 여액을 농축하여 얻은 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 염화메틸렌-메탄올 혼합용액) 및 HPLC(컬럼; Wakosil II 5C18 RS Prep 20.0×250mm, 용출액; 아세토니트릴-물 혼합용액)로 정제하여, 신규물질 7-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥세닐)-3'-디옥시-7-데아자아데노신(화합물 37) 175mg을 얻었다(수율 24.8%).

1H-NMR(400MHz, DMSO-d6) δppm: 1.23-1.54(m, 4H, -(CH₂)₂-), 1.87-1.90(m, 1H, 3'-Ha), 2.19-2.20(m, 3H, 3'-Hb 및 =CHCH₂), 3.20(dd, 2H, J=6.6, 13.0Hz, CH₂N), 3.46-3.62(m, 2H, 5'-Ha 및 5'-Hb), 4.25-4.38(m, 2H, 2'-H 및 4'-H), 5.01(t, 1H, J=5.6Hz, 5'-OH), 5.50(d, 1H, J=4.8Hz, 2'-OH), 5.95(dt, 1H, J=7.2, 15.2Hz, -CH=CHCH₂-), 6.01(d, 1H, J=2.4Hz, 1'-H), 6.62(br s, 2H, 6-NH₂), 6.74(d, 1H, J=15.2Hz, -CH=CHCH₂-), 7.48(s, 1H, 8-H), 8.03(s, 1H, 2-H), 9.40(brs, 1H, NHTfa)

합성예 66

7-(6″-아미노-1″-헥세닐)-3'-디옥시-7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트(화합물 38)의 합성.

7-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥세닐)-3'-디옥시-7-데아자아데노신(화합물 37: 133mg, 0.3mmol)을 인산트리에틸(1.26ml)에 용해하고, -20℃까지 냉각한 후 옥시염화인(25.1㎕)을 첨가하고, -20℃에서 교반하였다. 30분 경과후, 옥시염화인(22.3㎕)를 추가하고, 6시간 더 교반하였다. 이 반응액을 -20℃에서 냉각한 트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트를 0.5M 포함한 DMF 용액(3.6ml)에 첨가하고, 실온에서 3시간 교반시켰다. 반응종료후, 트리에틸아민-물 혼합액(5ml)을 첨가하고, 하룻밤 정치시켰다. 반응액을 에테르로 세정후, DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×40cm; 용출액:탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하였다. 이것에 17% 암모니아수 (60ml)를 가하고 5℃에서 15시간 정치하고, 감압농축후, 얻어진 잔사를 다시 DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×40cm; 용출액:탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 신규물질 7-(6″-아미노-1″-헥세닐)-3'-디옥시-7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트(화합물 38) 126mg을 얻었다(수율 42.2%).

합성예 67

R6G 표식 3'-디옥시-7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4인 화합물)의 합성

7-(6″-아미노-1″-헥세닐)-3'-디옥시-7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트(화합물 38: 8μmol)을 용해한 DMF(2ml)-물(1ml)의 혼합액에, 트리에틸아민(10㎕), 5-카르복시로다민 6G 숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(16μmol)를 가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석시킨 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×15cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.05M→0.65M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 하기 식에서 나타나는 연결자부가 2중결합이고, 그 메틸렌고리의 n의 수가 4개인 R6G 표식 3'-디옥시-7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4의 화합물. 이하, R6G-Allyl-3'dATP(n4)라고 약기함] 3.90μmol을 얻었다(수율 48.7%).

[식중, Et는 에틸기를, 또한 Me는 메틸기를 각각 나타낸다.]

또한, 얻어진 R6G-Allyl-3'dATP(n4)를 DU640 자외가시분광해석 시스템[베크만(주)제]을 이용하여, 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700nm∼200nm, 대조: 증류수)를 도 27에 나타내었다.

합성예 68

7-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥세닐)-3'-디옥시-7-데아자구아노신(화합물 39)의 합성.

7-요오드-3'-디옥시-7-데아자구아노신(화합물 30; 1.31g, 3.33mmol)의 DMF (16.67ml)용액에 질소기류하에서, 합성예 57에서 얻은 6-트리플루오로아세타미드-1-헥센(1.90g, 9.99mmol), 요오드화 구리(I)(130mg, 0.66mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)(385mg, 0.33mmol) 및 트리에틸아민(0.93ml, 6.66mmol)을 가하고 60℃에서 18시간 반응시켰다. 반응액을 염화메틸렌-메탄올 혼합액(40ml)으로 희석하고 이온교환 수지 AG1X8(바이오라드사제, HCO₃ ^-형; 2.96g)을 가하고 30분간 교반하였다. 여과분별한 후, 여액을 농축하여 얻은 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 염화메틸렌-메탄올 혼합용액) 및 HPLC(컬럼; Wakosil II 5C18 RS Prep 20.0×250mm, 용출액; 아세토니트릴-물 혼합용액)로 정제하고, 신규물질 3'-디옥시-7-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥세닐)-7-데아자구아노신(화합물 39) 439mg을 얻었다(수율 28.7%).

1H-NMR(400MHz, DMSO-d6) δppm: 1.35-1.53(m, 4H, -(CH₂)₂-), 1.85-1.89(m, 1H, 3'-Ha), 2.09-2.15(m, 3H, 3'-Hb 및 =CHCH₂), 3.19(dd, 2H, J=6.8, 12.8Hz, CH₂N), 3.43-3.56(m, 2H, 5'-Ha 및 5'-Hb), 4.10-4.30(m, 2H, 2'-H 및 4'-H), 4.84(t, 1H, J=5.6Hz, 5'-OH), 5.42(d, 1H, J=4.4Hz, 2'-OH), 5.81(d, 1H, J=2.8Hz, 1'-H), 6.21(br s, 2H, 6-NH₂), 6.37(d, 1H, J=15.6Hz, -CH=CHCH₂-), 6.57(dt, 1H, J=7.1, 15.6Hz, -CH=CHCH₂-), 6.93(s, 1H, 8-H), 9.39(brs, 1H, NHTfa), 10.29(s, 1H, 1-H)

합성예 69

7-(6″-아미노-1″-헥세닐)-3'-디옥시-7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트(화합물 40)의 합성.

7-(6″-트리플루오로아세타미드-1″-헥세닐)-3'-디옥시-7-데아자구아노신(화합물 39: 138mg, 0.3mmol)을 인산트리에틸(1.26ml)에 용해하고, -20℃까지 냉각한 후 옥시염화인(25.1㎕)을 첨가하고, -20℃에서 교반하였다. 30분 경과후, 옥시염화인(22.3㎕)를 추가하고, 8시간 더 교반하였다. 이 반응액을 -20℃에서 냉각한 트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트를 0.5M 포함한 DMF 용액(3.6ml)에 첨가하고, 실온에서 3시간 교반시켰다. 반응종료후, 트리에틸아민-물 혼합액(5ml)을 첨가하고, 하룻밤 정치시켰다. 반응액을 에테르로 세정후, DEAE-토요팔 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×40cm; 용출액:탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하였다. 이것에 17% 암모니아수 (60ml)를 가하고 5℃에서 16시간 정치하고, 감압농축후, 얻어진 잔사를 다시 DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피(1.7×40cm; 용출액:탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0M→0.3M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 신규물질 7-(6″-아미노-1″-헥세닐)-3'-디옥시-7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트(화합물 40) 122mg을 얻었다(수율 40.4%).

합성예 70

R110 표식 3'-디옥시-7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트(화학식 I에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4인 화합물)의 합성.

7-(6″-아미노-1″-헥세닐)-3'-디옥시-7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트(화합물 40: 10μmol)을 용해한 DMF(500㎕)-물(375㎕)의 혼합액에, 트리에틸아민(25㎕), 5-카르복시로다민 110-비스-트리플루오르아세테이트숙신산이미드에스테르(몰레큘러 프루브사제)(25μmol)를 가하여 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응액에 물(30ml)을 가하여 희석한 후, DEAE-토요팔 이온교환 컬럼 크로마토그래피 (1.7×15cm; 용출액: 탄산수소트리에틸암모늄 완충액(pH 7.5) 0.05M→0.65M 직선농도구배(전량 1L))로 정제하여, 하기 식에서 나타나는 연결자부가 2중결합이고, 그 메틸렌고리의 n의 수가 4개인 R110 표식 3'-디옥시-7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트[화학식 I에 있어서, V가 -CH=CH-이고, n=4의 화합물. 이하, R110-Allyl-3'dATP(n4)라고 약기함] 5.1μmol을 얻었다(수율 51.0%).

또한, 얻어진 R110-Allyl-3'dATP(n4)를 DU640 자외가시분광해석 시스템[베크만(주)제]을 이용하여, 자외가시흡수 스펙트럼을 측정한 결과 (측정파장: 700nm∼200nm, 대조: 증류수)를 도 28에 나타내었다.

실시예 1

정제된 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y 및 L665P/F667Y를 이용하여 3'dNTP의 채택효율을 야생형 T7 RNA 폴리머라아제와 아래와 같이 비교하였다.

인·비트로로의 전사반응은, 예를 들면 Melton, D. A, [Nucleic Acids Res., 12:7035-7056(1984)]에 나타난 방법을 일부 개량하여 실시하였다. 구체적으로는, T7 프로모터를 갖는 플라스미드 벡터 pBluescriptKS(+)(스트라타딘사)를 제한효소 PvuII 또는 ScaI에서 반응하고, 선상으로 한 것을 주형으로서 사용하고, 3'dNTP의 유도체로서, 합성예 46에서 합성한 다이·터미네이터 XR-3'dCTP(n=1)을 150μM, 더욱 500μM GTP, UTP 및 250μM ATP, CTP, 8mM MgCl₂, 2mM 스페르미딘(spermidine)-(HCl)₃, 5mM DTT, 40mM Tris/HCl pH 8.0(BRL, 기부코사)의 조건하에서, 야생형 T7 RNA 폴리머라아제(BRL, 기부코사 또는 니폰징제), 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y 또는 L665P/F667Y 25단위를 가하여, 합계 반응체적 10㎕로서, 37℃에서 1시간 반응을 실시하였다. 이어 반응산물중에 잔존하고 있는 미반응의 다이·터미네이터를 제거하기 위해, 세파덱스 G-50 컬럼(팔마시아·바이오텍)을 이용한 겔여과법에 의해 전사산물을 정제하고, 정제산물은 원심식 에바포레이터를 이용하여 증발건고하였다.

이 건조시킨 반응물을 주식회사 퍼킨엘머 재팬의 ABI PRISM 377 DNA Sequencing System 취급설명서 Ver. 1.0에 따라, 포름아미드/EDTA/Blue dextran loading buffer 6㎕에 용해하고, 그 중 2㎕를 6M 요소/4% 롱그렌져-^TM아크릴아미드 용액(FMC)을 포함하는 시퀀스 해석용 변성 겔을 이용하고, ABI 377 DNA Sequencer 및 해석 프로그램(주식회사 퍼킨엘머 재팬)에 의해 해석하였다. 이 결과를 도 29에 겔·이미지로서 나타낸다. 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y 및 L665P/F667Y를 이용한 어느 경우에도, 야생형 T7 RNA 폴리머라아제(WT)에 비교하여, 약 3배의 시퀀스래더가 얻어짐을 알 수 있다. 더욱이 약 700염기의 전사산물도 확인되었다.

도 30에, 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y를 이용하여 얻어진 시퀀스래더의 피크강도를 야생형 T7 RNA 폴리머라아제를 이용하여 얻은 피크 강도와 대비하여 나타낸다. 또한 도 31에 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 L665P/F667Y를 이용하여 얻은 시퀀스래더의 피크강도를 야생형 T7 RNA 폴리머라아제를 이용하여 얻은 피크강도와 대비하여 나타낸다. 이러한 대비로부터, 변이형 효소의 피크 높이는 야생형과 비교하여 변화가 적고, 더욱이 강한 시그널을 갖는 피크가 얻어짐을 알 수 있다. 이것은 F644Y 또는 L665P/F667Y의 변이에 의해, 이 경우, 3'dCTP 유도체의 채택율이 개선되었음을 나타내며, 또한 이 변이형 T7 RNA 폴리머라아제에 의한 전사반응이 이미 존재하는 DNA 폴리머라아제에 의한 염기서열법의 데이터 생산력에 필적하는 래더 신장반응특성을 갖고 있음을 나타내고 있다.

실시예 2

변이형 T7 RNA 폴리머라아제를 이용한 다이·터미네이터법에 따른 시퀀스 반응예

다이·터미네이터법에 따른 시퀀스 반응을, 정제된 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y 및 L665P/F667Y와 야생형 T7 RNA 폴리머라아제에 대해서 아래와 같이 비교하였다.

인·비트로로의 전사반응은, 실시예 1에서 예시한, Melton, D. A, (1984, Nucleic Acids Res., 12:7035-7056)에 의해 나타난 방법을 이용하였다. 더욱 구체적으로 진술하면, T7 프로모터를 갖는 플라스미드 벡터 pBluescriptKS(+)를 제한효소 PvuII 또는 ScaI에서 반응하고, 선상으로 한 것을 주형으로서 사용하고, 3'dNTP의 유도체로서, 상기 합성예 49, 52, 46 및 43에서 각각 합성한 다이·터미네이터, 250μM R6G-3'dATP(n=1), 25μM R110-3'dGTP(n=1), 150μM XR-3'dCTP(n=1), 50μM TMR-3'dUTP(n=1), 더욱 500μM GTP, UTP 및 250μM ATP, CTP, 8mM MgCl₂, 2mM 스페르미딘-(HCl)₃, 5mM DTT, 40mM Tris/HCl pH 8.0(BRL, 기부코사)의 조건하에서, 야생형 T7 RNA 폴리머라아제(BRL, 기부코사 또는 니폰징제), 또는 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y 25단위를 가하여, 합계 반응체적 10㎕로서, 37℃에서 1시간 반응을 실시하였다. 이어 반응산물중에 잔존하고 있는 미반응의 다이·터미네이터를 제거하기 위해, 세파덱스 G-50 컬럼(팔마시아·바이오텍)을 이용한 겔여과법에 의해 전사산물을 정제하고, 정제산물을 원심식 에바포레이터를 이용하여 증발건고하였다.

이 건조시킨 반응물을 주식회사 퍼킨엘머 재팬의 ABI PRISM 377 DNA Sequencing System 취급설명서 Ver. 1.0에 따라, 포름아미드/EDTA/Blue dextran loading buffer 6㎕에서 용해하고, 그 중 2㎕를 6M 요소/4% 롱그렌져-^TM아크릴아미드 용액(FMC)을 포함하는 시퀀스 해석용 변성 겔을 이용하여, ABI 377 DNA Sequencer 및 해석 프로그램에 의해 해석하였다. 이 결과를 도 32에 나타내지만, 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y 또는 L665P/F667Y는 야생형 T7 RNA 폴리머라아제와 비교하여, 피크강도가 높고, 더욱이 변화가 적게, 시퀀스를 알아낼 수 있음을 알 수 있다. 여기서 야생형 T7 RNA 폴리머라아제를 이용한 경우, 거의 시퀀스는 불가능하였다.

실시예 3

인·비트로로의 전사반응은, 실시예 1 및 2와 같이, Melton, D. A, (1984, Nucleic Acids Res., 12:7035-7056)에 의해 나타난 방법을 이용하였다.

구체적으로는, T7 프로모터를 갖는 플라스미드 벡터 pBluescriptKS(+)(스트라타딘사)를 제한효소 PvuII에서 반응하고, 선상으로 한 것을 주형으로서 반응당 0.25㎍을 사용하였다.

다이.터미네이터(4x linker rdye terminator)로서, 4μM R6G-3'dATP(n=4), 4μM R110-3'dGTP(n=4), 80μM XR-3'dCTP(n=4), 20μM TMR-3'dUTP(n=4), 더욱 500μM GTP, UTP 및 250μM ATP, CTP, 8mM MgCl₂, 2mM 스페르미딘-(HCl)₃, 5mM DTT, 40mM Tris/HCl pH 8.0(BRL, 기부코사)의 조건하에서, 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y 25단위를 가하여, 합계 반응체적 10㎕로서, 동일하게 37℃에서 1시간 반응을 실시하였다. 이어 반응산물중에 잔존하고 있는 미반응의 다이·터미네이터를 제거하기 위해, 세파덱스 G-50 컬럼(팔마시아·바이오텍)을 이용한 겔여과법에 의해 전사산물을 정제하고, 정제산물을 원심식 에바포레이터를 이용하여 증발건고하였다. 이 건조시킨 반응물을 주식회사 퍼킨엘머 재팬의 ABI PRISM 377 DNA Sequencing System 취급설명서 Ver. 1.0에 따라, 포름아미드/EDTA/Blue dextran loading buffer 6㎕에 용해하고, 그 중 2㎕를 6M 요소/4% 롱그렌져-^TM아크릴아미드 용액(FMC사)을 포함하는 시퀀스 해석용 변성 겔을 이용하여, ABI 377 DNA Sequencer 및 해석 프로그램에 의해 해석하였다.

이 결과를 도 33에 나타내었다. 도 33에 있어서, 상단은 실시예 2에서 이용한 터미네이터를 이용한 결과이고, 하단은 연결자 길이가 긴 다이·터미네이터를 이용한 본 실시예의 결과이다. 연결자 길이가 긴 디아·터미네이터와 변이형 T7 RNA 폴리머라아제의 조합은 연결자의 길이가 짧은 다이·터미네이터를 이용한 실시예 2의 조건과 비교하여, 채택효율의 균일성이 보다 높아짐을 알 수 있다. 이러한 결과는 인·비트로의 전사반응을 이용한 염기서열의 해석이 실용적인 수준에서 가능함을 나타내고 있다.

실시예 4

T7 프로모터를 갖는 벡터를 주형으로서 이용했을 때의 시퀀스 반응

인·비트로로의 전사반응은, 실시예 1∼3과 같이, Melton, D. A, (1984, Nucleic Acids Res., 12:7035-7056)에 의해 나타난 방법을 이용하였다.

구체적으로는, T7 프로모터를 갖는 플라스미드 벡터 pBluescriptKS(+)(스트라타딘사)를 제한효소 PvuII에서 반응하고, 선상으로 한 것을 주형으로서 사용하였다. 반응은 4μM R6G-3'dATP(n=4), 4μM R110-3'dGTP(n=4), 80μM XR-3'dCTP(n=4), 20μM TMR-3'dUTP(n=4), 더욱 500μM GTP, UTP 및 250μM ATP, CTP, 8mM MgCl₂, 2mM 스페르미딘-(HCl)₃, 5mM DTT, 40mM Tris/HCl pH 8.0(BRL, 기부코사)의 조건하에서, 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y(또는 L665P/F667Y) 25단위를 가하여, 합계 반응체적 10㎕로서, 동일하게 37℃에서 1시간 반응을 실시하였다. 이어 반응산물중에 잔존하고 있는 미반응의 다이·터미네이터를 제거하기 위해, 세파덱스 G-50 컬럼(팔마시아·바이오텍)을 이용한 겔여과법에 의해 전사산물을 정제하고, 정제산물을 원심식 에바포레이터를 이용하여 증발건고하였다.

이 건조시킨 반응물을 주식회사 퍼킨엘머 재팬의 ABI PRISM 377 DNA Sequencing System 취급설명서 Ver. 1.0에 따라, 포름아미드/EDTA/Blue dextran loading buffer 6㎕에 용해하고, 그 중 2㎕를 6M 요소/4% 롱그렌져-^TM아크릴아미드 용액(FMC사)을 포함하는 시퀀스 해석용 변성 겔을 이용하여, ABI 377 DNA Sequencer 및 해석 프로그램(Sequencing Analysis Ver. 3.0)에 의해 해석하였다. 그 결과를 도 34에 나타내었다. 이 결과로부터, 아직 판별이 다소 곤란한 곳이 간간히 보이지만, 실용적인 수준에서 충분한 사용을 할 수 있는 시퀀스 일렉트로그램을 얻었다.

실시예 5

PCR 산물을 주형으로 이용했을 때의 시퀀스 반응예

본 실시예에서는, PCR 반응의 주형으로서 human thyroid-stimulating hormone(hTSH-β)cDNA를 pBluescriptKS(+)(스트라타딘사)의 EcoRI부위에 서브크로닝한 것을 이용하였지만, hTSH-βcDNA에 한정되는 것은 아니고, 유전자라면 무엇이어도 좋다. 또한 본 실시예에서 설명한 것에서 중요한 것은, 염기서열을 결정하고자 하는 PCR산물중에서 T7 RNA 폴리머라아제가 인식하는 T7 프로모터를 공급할 수 있으면 본 실시예와 같이, 시퀀스가 가능해진다는 것이다. 시퀀스를 가능하게 하도록 PCR 산물중에서 T7 프로모터를 공급하는 하나의 방법은 PCR을 실시할 때, 어던 프라이머의 5'-말단에 T7 프로모터의 서열 및 전사에 필요한 전사 개시점을 부가시켜, 어떠한 DNA에 있어서도, 이 목적을 달성할 수 있다. 또한 다른 방법으로는, 이하 본 실시예에서 나타난 방법이지만, 미리 T7 프로모터를 보지하고 있는 플라스미드를 이용하고, 이 T7 프로모터를 적어도 사이에 두도록 프라이머를 이용하여, T7 프로모터를 갖는 PCR산물을 얻는 것이 가능해진다. 후자의 PCR을 실시하는데 있어, 유용한 벡터로서, pBluescript시리즈, pBC Phagemid 벡터(이하, 스트라타딘사) 및 pGEM벡터시리즈(프로메가사)가 시판되고 있다. 이 hTSH-βcDNA를 갖는 플라스미드, 100fg을 이용하여, 크로닝 부위를 사이에 두는 형태로 존재하는 L220 프라이머(5'-TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC A-3') 및 1211 프라이머(5'-ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG T-3')에서 반응액량 20㎕로 PCR반응[(94℃ 2분) 1회, (94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1.5분) 30회, 72℃ 5분]을 실시하였다. 이 PCR반응에서 생긴 PCR산물의 1211 프라이머의 하류에 T7 프로모터가 존재한다.

이 PCR산물 내의 1㎕(약 10ng)를 시퀀스 반응에 이용하였다. 반응은 4μM R6G-3'dATP(n=4), 4μM R110-3'dGTP(n=4), 80μM XR-3'dCTP(n=4), 20μM TMR-3'dUTP(n=4), 더욱 500μM GTP, UTP 및 250μM ATP, CTP, 8mM MgCl₂, 2mM 스페르미딘-(HCl)₃, 5mM DTT, 40mM Tris/HCl pH 8.0(BRL, 기부코사)의 조건하에서, 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y 25단위를 가하여, 합계 반응체적 10㎕로서, 동일하게 37℃에서 1시간 반응을 실시하였다. 이어 반응산물중에 잔존하고 있는 미반응의 다이·터미네이터를 제거하기 위해, 세파덱스 G-50 컬럼(팔마시아·바이오텍)을 이용한 겔여과법에 의해 전사산물을 정제하고, 정제산물을 원심식 에바포레이터를 이용하여 증발건고하였다.

이 건조시킨 반응물을 주식회사 퍼킨엘머 재팬의 ABI PRISM 377 DNA Sequencing System 취급설명서 Ver. 1.0에 따라, 포름아미드/EDTA/Blue dextran loading buffer 6㎕에 용해하고, 그 중 2㎕를 6M 요소/4% 롱그렌져-^TM아크릴아미드 용액(FMC사)을 포함하는 시퀀스 해석용 변성 겔을 이용하여, ABI 377 DNA Sequencer 및 해석 프로그램(Sequencing Analysis Ver. 3.0)에 의해 해석하였다. 이 결과를 도 35에 나타내었다. 이 결과로부터, 아직 판별이 다소 곤란한 곳이 간간히 보이지만, 실용적인 수준에서 충분한 사용을 할 수 있는 시퀀스 일렉트로그램을 얻었다.

참고예 6

RNase활성의 혼입이 없는 무기피로포스파아제의 정제

RNase의 혼입이 없는 무기피로포스파아제(PPase)는 아래와 같이 정제하였지만 아래방법에 한정되는 것은 아니다.

무기피로포스파아제의 출발재료로서는, 시그마사제의 효모유래의 조정제품(시그마 I-1643, EC. 3.6.1.1), 4mg(680단위)을 완충액(20mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.9) 1ml에서 현탁하고, 같은 완충액에 대해 2시간 투석하고, 탈염조작을 실시하고, 이 투석액을 컬럼체적 1ml의 SP Sepharose 컬럼 크로마토그램(팔마시아·바이오텍제)을 실시하였다. 구체적으로는 약 20배의 체적의 같은 컬럼 완충액에서 280nm의 자외선흡수물질이 검출되지 않기 까지 충분히 세정하고, 컬럼 체적의 약 20배의 체적의 같은 완충액을 사용하여 0∼0.1M의 NaCl 직선농도구배로 용출한다. 용출액은 적당량으로 분획하여 모으고, 바로 SDS-12.5% 폴리아크릴아미드 전기영동을 실시하고, 분자량 약 32kDa의 단백질을 포함하는 획분을 검사하였다. 전형적인 예로는, PPase획분은 미흡착부분에서 발견될 것이다. 이 단백질을 포함하는 획분을 모으고, 컬럼 체적 1ml의 Q-Sepharose(팔마시아·바이오텍제)에 흡착시키고, 컬럼 체적의 약 20배의 체적의 같은 완충액중을 이용하여 0∼0.1M의 NaCl 직선농도구배로 용출한다. 용출액은 적당량으로 분획하여 얻고, 바로 SDS-12.5% 폴리아크릴아미드 전기영동을 실시하고, 분자량 약 32kDa의 단백질을 포함하는 획분을 검사하였다. 전형적인 예로는, 0.35M의 NaCl 부근에서 발견될 것이다. 분자량 32kDa의 단백질을 포함하는 분획을 모으고, 500ml의 보존 완충액(20mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 50% glycerol, pH 7.9)에 대해 16시간 투석하고, 사용하기 까지 -20℃에서 보존한다. 전형적인 예로는, 회수율 62.5%에서 PPase 단백질 425단위, 0.425단위/㎕의 표품을 얻을 수 있다.

이 상태에서 RNase 혼입정도를, 대장균의 rRNA(16S와 23S) 8㎍을 기준으로서 검사하였다. 구체적으로는, 대장균 rRNA을 8mM MgCl₂, 2mM 스페르미딘-(HCl)₃, 5mM DTT, 40mM Tris/HCl pH 8.0의 완충액 중에서 PPase, 0.17U상당을 가하고, 37℃, 4시간 반응시켰다. 이 RNA를 포름아미드가 존재하는 변성조건하에서의 1.0% 아가로스 전기영동을 실시하고, 동시에 첨가한 색소인 크시렌시아놀이 아가로스 겔의 약 1/3에 달할 때에 영동을 멈추고, 자외선(파장 254nm)을 조사하여, 사진촬영을 실시하여, RNA의 분해정도를 검사하였다. 이 때, 조정제품과 정제후의 PPase를 비교한 결과, 조정제품에서는 RNA 분해가 관찰되었지만, 정제품에 대해서는 유망한 RNA 분해활성이 검출되지 않았다.

실시예 6

변이형 T7 RNA 폴리머라아제를 이용한 시퀀스 반응에 대한 연결자부착 다이터미네이터 및 무기 피로포스파타아제의 첨가효과

참고예 6에서 정제된 PPase의 인·비트로에 있어서의 시퀀스 전사반응시의 효과를 검토하였다. 우선, 첨가량을 조사하기 위해, 정제된 PPase의 첨가량을 변화시켜 반응하였다. 시퀀스 반응은, Melton, D. A, (1984, Nucleic Acids Res., 12:7035-7056)에 의해 나타난 방법을 이용하였다. 더욱 구체적으로 설명하면, T7 프로모터를 갖는 플라스미드 벡터 pBluescriptKS(+)(스트라타딘사)를 제한효소 PvuII에서 반응하고, 선상으로 한 것을 주형으로서 사용하였다. 반응은 4μM R6G-3'dATP(n=4), 4μM R110-3'dGTP(n=4), 80μM XR-3'dCTP(n=4), 20μM TMR-3'dUTP(n=4), 더욱 500μM GTP, UTP 및 250μM ATP, CTP, 8mM MgCl₂, 2mM 스페르미딘-(HCl)₃, 5mM DTT, 40mM Tris/HCl pH 8.0(BRL, 기부코사)의 조건하에서, 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y 25단위를 가하여, 합계 반응체적 10㎕로서, 동일하게 37℃에서 1시간 반응을 실시하였다. 이 반응시에, PPase의 효과를 조사하기 위해 효소를 무첨가, 0.425단위, 0.0425단위, 0.00425단위상당을 첨가하였다. 이어 반응산물중에 잔존하고 있는 미반응의 다이·터미네이터를 제거하기 위해, 세파덱스 G-50 컬럼(팔마시아·바이오텍)을 이용한 겔여과법에 의해 전사산물을 정제하고, 정제산물을 원심식 에바포레이터를 이용하여 증발건고하였다.

이 건조시킨 반응물을 주식회사 퍼킨엘머 재팬의 ABI PRISM 377 DNA Sequencing System 취급설명서 Ver. 1.0에 따라, 포름아미드/EDTA/Blue dextran loading buffer 6㎕에서 용해하고, 그 중 2㎕를 6M 요소/4% 롱그렌져-^TM아크릴아미드 용액(FMC사)을 포함하는 시퀀스 해석용 변성 겔을 이용하여, ABI 377 DNA Sequencer 및 해석 프로그램(Sequencing Analysis Ver. 3.0)에 의해 해석하였다. 이 결과를 도 36 및 도 37에 나타내었다. 이 결과로부터, PPase를 첨가한 것은 어느 것이나 각 피크의 분리가 개선되고, 더욱이 피크높이의 균일성이 높아졌다. 또한 0.00425단위의 PPase의 첨가에도 그 효과는 변하지 않고, 이후, PPase의 첨가량은 0.00425단위로 하였다.

이어, PCR산물을 주형으로서 이용한 시퀀스 반응에 대한 효과를 검사하였다. 시퀀스 반응은 아래와 같이 실시하였다. 이하의 예에서, PCR반응의 주형으로서 human thyroid-stimulating hormone(hTSH-β)cDNA를 pBluescriptKS(+)(스트라타딘사)의 EcoRI부위에서 서브크로닝한 것을 이용하였지만, hTSH-βcDNA에 한정되는 것은 아니고, 유전자라면 무엇이어도 좋다. 이 hTSH-βcDNA를 갖는 플라스미드, 100fg을 이용하여, 크로닝부위를 사이에 두는 형태로 존재하는 L220 프라이머(5'-TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC A-3') 및 1211 프라이머(5'-ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG T-3')에서 반응액량 20㎕에서 PCR반응[(94℃ 2분) 1회, (94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1.5분) 30회, 72℃ 5분]을 실시하였다. 그 안의 1㎕(약 10ng)을 시퀀스 반응에 이용하였다. 반응은 4μM R6G-3'dATP(n=4), 4μM R110-3'dGTP(n=4), 80μM XR-3'dCTP(n=4), 20μM TMR-3'dUTP(n=4), 더욱 500μM GTP, UTP 및 250μM ATP, CTP, 8mM MgCl₂, 2mM 스페르미딘-(HCl)₃, 5mM DTT, 40mM Tris/HCl pH 8.0(BRL, 기부코사)의 조건하에서, 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y 25단위를 가하여, 합계 반응체적 10㎕로서, 동일하게 37℃에서 1시간 반응을 실시하였다. PPase을 가하는 경우에는, 0.00425단위상당을 첨가하였다. 이어 반응산물중에 잔존하고 있는 미반응의 다이·터미네이터를 제거하기 위해, 세파덱스 G-50 컬럼(팔마시아·바이오텍)을 이용한 겔여과법에 의해 전사산물을 정제하고, 정제산물을 원심식 에바포레이터를 이용하여 증발건고하였다.

이 건조시킨 반응물을 주식회사 퍼킨엘머 재팬의 ABI PRISM 377 DNA Sequencing System 취급설명서 Ver. 1.0에 따라, 포름아미드/EDTA/Blue dextran loading buffer 6㎕에서 용해하고, 그 중 2㎕를 6M 요소/4% 롱그렌져-^TM아크릴아미드 용액(FMC사)을 포함하는 시퀀스 해석용 변성 겔을 이용하여, ABI 377 DNA Sequencer 및 해석 프로그램(Sequencing Analysis Ver. 3.0)에 의해 해석하였다. 그 결과의 일부는 도 38에 나타내었다. 이 결과, PPase를 첨가하면 피크의 분리가 개선되고, 또한 각 피크의 높이가 균일하게 되며, 앞의 플라스미드를 시퀀스의 주형으로서 이용한 경우와 동일한 결과를 얻었다. 이 것은 PPase의 병용에 의해 시퀀스의 파악정밀도가 높아짐을 시사한다.

실시예 7

무기피로포스파타아제를 첨가한 구체적인 시퀀스 반응

무기 피로포스파타아제를 첨가한 시퀀스 반응예를 실시예 6의 PCR산물을 주형으로서 이용한 경우와 동일한 조건에서 실시하고, 얻어진 시퀀스의 정밀도를 비교하였다.

도 39는, 무기피로포스파타아제를 첨가하지 않은 것이고, 도 40은 무기피로포스파타아제를 첨가하여 반응한 것이다. 이 결과, 파악된 염기서열을 이미 보고되어 있는 hTSH-βcDNA와 비교한 결과, 파악된 510염기대에 관해서, 무기피로포스파타아제를 첨가하지 않은 반응에서는 90%, 무기피로포스파타아제를 첨가한 경우는, 98%의 정밀도임을 알았다. 또한, 실시예 6에서 나타난 도 38은 이 실험의 결과의 일부에 대해서, 무기피로포스파타아제의 첨가효과를 비교하기 위해 가공한 것이다.

이상의 것으로부터, 변이형 T7 RNA 폴리머라아제, 다이·터미네이터 및 무기피로포스파타아제를 이용하는 것에 의해, 현재 주류를 이루고 있는 DNA 폴리머라아제를 이용한 염기서열 결정법과 거의 동등하고, 또는 그 이상의 정밀도로 염기서열을 결정할 수 있음을 알았다.

참고예 7

3'dNTP 유도체의 채택율의 개선

참고예 5에서 정제한 변이형 T7 RNA 폴리머라아제의 리보누클레오티드(NTP)와 3'디옥시누클레오티드(3'dNTP)의 채택율을 아래와 같이 측정하였다.

전사반응의 주형은, 플라스미드 pBluescript(KS+)(스트라타딘사)를 제한효소, PvuII에서 반응하고, 선상으로 한 것을 이용하고, ATP, CTP, GTP, UTP를 각각 250μM, 2mM 스페르미딘-(HCl)₃, 5mM DTT, 40mM Tris/HCl pH 8.0, 0.1㎕의 [alpha-32P]UTP(3000Ci/mmole)의 조건하에서, 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y/L665P/F667Y를 25단위로 반응에 이용하였다. 그리고, 2종류의 반응액 (3'dATP의 무첨가 또는 첨가(최종농도 100μM))를 준비하여, 37℃, 60분 반응시켰다. 그리고, 이 반응물 전량을 DE81 paper(와트만사)에서 스팟하고, 인산 완충액에서 3회 세정하고, 건조시키고, DE 81 paper를 신티레이션 바이알에 넣어, 신티레이션 카운더(벡크만)를 이용하여, 각각의 방사활성을 측정하였다. 이것에 의해 얻어진 방사활성으로부터, 3'-dATP의 첨가, 무첨가시의 값과 비교하여, 어느 정도 [alpha-32P]UTP의 채택이 방해되는지를 산출하였다. 산출값을 야성형 T7 RNA 폴리머아라에의 방해도 1.000과 비교하여 얻어진 상대활성을 표 1에 나타낸다.

상기 F644Y/L665P/F667Y 변이체 대신에, 야성형 T7 RNA 폴리머라아제, 참고예 3에서 얻은 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y 또는 L665P/F667Y, 또는 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 구축정제한 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y/L665P, F782Y, F733Y, F646Y 또는 Y639F를 반응에 이용하여, 방해결과를 얻었다. 상대활성을 표 1에 나타낸다.

표 1의 결과는 수치가 클수록, 그 변이형 효소가 3'-dATP를 채택하기 쉬어지는 변이임을 나타내고 있다. 예를 들어, 이 경우, 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y/L665P/F667Y는 야성형 효소보다 5.58배, 3'-dATP를 쉽게 채택하는 효소임을 의미한다. F644Y/L665P/F667Y 변이체는 이번에 제작한 변이형 효소중에서, 가장 3'-dNTP를 채택하는 바이어스가 적은 변이형 효소임을 나타내고 있다.

변이부위	3'dATP에 따른 RNA 폴리머라아제의 상대활성
F644Y	5.130
F644Y/L665P	5.130
L665P/F667Y	4.711
F644Y/L665P/F667Y	5.580
F782Y	1.173
F733Y	1.075
F646Y	0.459
Y639F	0.930
야생형	1.000

실시예 8

변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y/L665P/F667Y를 이용한 시퀀스 반응예

시퀀스 반응의 주형으로서 이용한 주형은 아래와 같이 PCR에 의해 제작되었다.

PCR의 주형으로서 human thyroid-stimulating hormone(hTSH-β) cDNA를 T7 프로모터를 갖는 BS750 유래의 플라스미드에서 서브크로닝한 것을 이용하였다. 이 hTSH-βcDNA를 갖는 플라스미드, 100fg을 이용하고, 크로닝부위를 사이에 두는 형태로 존재하는 L220 프라이머(5'-TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC A-3') 및 1211 프라이머(5'-ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG T-3')에서 반응액량 20㎕에서 PCR반응[(94℃ 2분) 1회, (94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1.5분) 30회, 72℃ 5분]을 실시하였다. 이 PCR에서 생긴 PCR산물의 1211 프라이머의 하류에 T7 프로모터가 존재한다.

시퀀스 전사반응은 Melton, D. A, (1984, Nucleic Acids Res., 12:7035-7056)에 의해 나타난 방법을 이용하였다.

상기 PCR산물내의 1㎕(약 10ng)를 시퀀스 반응에 이용하였다. 반응은 3'dNTP 유도체로서, 실시예 2에서 이용한 것과 같은 다이·터미네이터 4μM R6G-3'dATP[5-카르복시로다민 6G 표식 3'-디옥시아데노신-5-트리포스페이트(n=4)], 4μM R110-3'dGTP[5-카르복시로다민 110 표식 3'-디옥시구아노신-5-트리포스페이트 (n=4)], 80μM XR-3'dCTP[5-카르복시-X-로다민 표식 3'-디옥시시티딘-5-트리포스페이트(n=4)], 20μM TMR-3'dUTP[5-카르복시테트라메틸로다민 표식 3'-디옥시우리딘-5-트리포스페이트(n=4)]를 이용하였다. 더욱, 500μM UTP 및 250μM ATP, 250μM CTP, 500μM GTP, 2mM 스페르미딘-(HCl)₃, 5mM DTT, 40mM Tris/HCl pH 8.0(BRL, 기부코사)의 조건하에서, 변이형 T7 RNA 폴리머라아제 F644Y/L665P/F667Y 25단위를 가하여, 합계 반응체적 10㎕로서, 동일하게 37℃에서 1시간 반응을 실시하였다.

이어 반응산물중에 잔존하고 있는 미반응의 다이·터미네이터를 제거하기 위해, 세파덱스 G-50 컬럼(팔마시아·바이오텍)을 이용한 겔여과법에 의해 전사산물을 정제하고, 정제산물을 원심식 에바포레이터를 이용하여 증발건고하였다.

이 건조시킨 반응물을 주식회사 퍼킨엘머 재팬의 ABI PRISM 377 DNA Sequencing System 취급설명서 Ver. 1.0에 따라, 포름아미드/EDTA/Blue dextran loading buffer 6㎕에서 용해하고, 그 중 2㎕를 6M 요소/4% 롱그렌져-^TM아크릴아미드 용액(FMC사)을 포함하는 시퀀스 해석용 변성 겔을 이용하여, ABI 377 DNA Sequencer 및 해석 프로그램(Sequencing Analysis Ver. 3.0)에 의해 해석하고, 일렉트로그램을 얻었다. 도 41에 그 결과를 나타낸다. 이와 같이 양호한 시퀀스 해석이 가능하다.

참고예 8

연결자부의 메틸렌고리가 다른 3'-디옥시터미네이터의 검토

[주형 DNA]

하기 시료를 이용하여 PCR법을 실시하고(96℃ 1분, 55℃ 30초, 72℃ 1분: 1회, 96℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분: 24회), 얻어진 PCR 산물(히트갑상선자극 호르몬(TSH) β서브유니트 DNA 증폭단편)을 주형 DNA로 한다.

또한, 각각의 시료를 소정량의 샘플튜브에 첨가한 후, EXTaq 완충액(보주조(주))에 의해 전체량을 10㎕로 한 것을 PCR용 시료로 하였다.

〈시료〉

·히트 TSH β 서브유니트 DNA(accession No. S70586)를 도입한

BluescriptII(스트라타딘사제) : 1pg

·포워드·프라이머(5'-ACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3') : 0.1M

·리버스·프라이머(5'-TAACAATTTCACAGGAAACA-3') : 0.1M

·2'dGTP : 200μM

·2'dTTP : 200μM

·2'dATP : 200μM

·2'dCTP : 200μM

·EXTaq 폴리머라아제(보주조(주)제) : 0.5유니트(units)

[터미네이터]

·TMR 3'dUTP(n4)(합성예 30의 화합물)

·TMR-Allyl-3'dUTP(n4)(합성예 61의 화합물)

[조작방법]

주형 DNA 10ng을 각 터미네이터, 구아노신-5'-트로포스페이트(rGTP), 우리딘-5'-트리포스페이트(rUTP), 아데노신-5'-트리포스페이트(rATP), 시티딘-5'-트리포스페이트(rCTP), MgCl₂, 스페르미딘-(HCl)₃, 디티오술레이톨(DTT), 트리스 /HCl(pH 7.5), 효모 무기피로포스파타아제(PPase) 및 T7 RNA 폴리머라아제를 하기 조건이 되도록 샘플튜브에 첨가한 후, 증류수에 의해 전체량을 10㎕로 하여, 이것을 시료로 하였다.

〈조건〉

·터미네이터 : 10μM

·rGTP : 500μM

·rUTP : 500μM

·rATP : 250μM

·rCTP : 250μM

·MgCl₂: 8mM

·스페르미딘-(HCl)₃: 2mM

·DTT : 5mM

·트리스/HCl(pH 7.5) : 40mM

·효모 PPase : 10유니트

·T7 RNA 폴리머라아제(기부코BRL사제) : 25유니트

시료를 37℃에서 30분간 가온한 후, 세파덱스 G25 컬럼(팔마시아사제)을 이용한 겔 여과법에 의해 얻을 수 없었던 터미네이터를 제거하고, 원심분리에 의해 침전을 채취하였다. 계속하여, 상기 침전물을 4㎕ 포름아미드다이(10mM EDTA 함유, 95% 포름아미드)에 용해한 후, 90℃에서 2분간 가온하였다. 이것을 냉각한 후, 4% 시퀀스 겔에 2㎕ 어플라이하고, ABI 377 형광자동 시퀀서(ABI사제)에 따른 영동을 실시하였다. 터미네이터로서 TMR-3'dUTP(n4)를 이용하여 얻어진 시퀀서의 겔이미지를 매트릭스 변환한 결과(터미네이션·패턴)을 도 42 A에, 또한 터미네이터로서 TMR-Allyl-3'dUTP(n4)를 이용하여 얻어진 시퀀서의 겔이미지를 동일하게 매트릭스 변환한 결과(터미네이션·패턴)을 도 42 B에 각각 나타낸다.

[결과]

도 42 A 및 도 42 B에서 명백해 알 수 있듯이, TMR-3'dUTP(n4)와 TMR-Allyl-3'dUTP(n4)와의 터미네이션·패턴의 차이는 밝혀지지 않고, TNR-Allyl-3'dUTP(n4)는 TMR-3'dUTP(n4)와 동일하게 좋은 효율로 얻을 수 있음이 판별된다.

또한, 터미네이터의 사용량을 10μM로부터 0.5μM로 한 이외 상기와 동일하게 실시한 경우도 상기와 같은 동일한 결과가 있었다.

Claims (24)

1. RNA 폴리머라아제 및 상기 RNA 폴리머라아제를 위한 프로모터 서열을 포함하는 DNA 단편의 존재하에서, ATP, GTP, CTP 및 UTP 또는 이들의 유도체로 이루어지는 리보누클레오시드 5'-트리포스페이트, 및 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 3'dUTP 및 이들의 유도체로 이루어지는 1종 또는 2종 이상의 3'디옥시누클레오시드 5'-트리포스페이트(이하, 3'dNTP 유도체)를 반응시켜 핵산 전사 생성물을 얻고, 얻은 핵산 전사 생성물을 분리하고, 얻어진 분리분획에서 핵산의 서열을 알아내는 DNA의 염기 서열 결정방법에 있어서,

   상기 RNA 폴리머라아제가, 대응하는 야성형 RNA 폴리머라아제의 능력과 비교하여, 상기 3'dNTP 유도체를 채택하는 능력을 증가시키도록, 적어도 하나의 아미노산이 변형된 야성형 RNA 폴리머라아제로 이루어진 변이형 RNA 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 DNA의 염기서열 결정방법.
2. 제 1항에 있어서, 변이형 RNA 폴리머라아제가, 야성형 RNA 폴리머라아제의 누클레오티드 결합부위 중에 존재하는 적어도 하나의 아미노산이 변형되어 있는 RNA 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 아미노산의 변형이 아미노산의 치환, 삽입 또는 누락인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1∼3항의 어느 한 항에 있어서, 변이형 RNA 폴리머라아제가, 야성형 RNA 폴리머라아제의 누클레오티드 결합부위 중에 존재하는 적어도 하나의 아미노산이 티로신으로 치환되어 있는 RNA 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 치환된 아미노산이 페닐알라닌인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 2∼5항의 어느 한 항에 있어서, 누클레오티드 결합부위에 존재하는 아미노산이, 나사선 Y와 나사선 Z 사이의 루프중의 아미노산 및/또는 나사선 Z와 나사선 AA 사이의 루프중의 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1∼6항의 어느 한 항에 있어서, 변이형 RNA 폴리머라아제가, 3'dNTP 유도체에 대한 채택능력을 야성형의 적어도 2배로 증가시키도록 변형되어 있는 RNA 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1∼7항의 어느 한 항에 있어서, 변이형 RNA 폴리머라아제가, T7 파아지, T3 파아지, SP6 파아지. K11 파아지에서 유래됨을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항에 있어서, 변이형 RNA 폴리머라아제가, T7 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제의 아미노산 잔기 641-667에 대응하는 영역에서 선택된 영역중의 적어도 하나의 아미노산이 변형되어 있는 야성형 RNA 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항에 있어서, 변이형 RNA 폴리머라아제가, T7 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제로서, 아미노산 잔기 644 또는 667에 있어서 티로신을 갖는 RNA 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항에 있어서, 변이형 RNA 폴리머라아제가, 야성형 T7 RNA 폴리머라아제의 644번째의 아미노산 잔기 페닐알라닌이 티로신으로 치환된 RNA 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1항에 있어서, 변이형 RNA 폴리머라아제가, 야성형 T7 RNA 폴리머라아제의 667번째의 아미노산 잔기 페닐알라닌이 티로신으로 치환된 RNA 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 변이형 RNA 폴리머라아제가, 야성형 T7 RNA 폴리머라아제의 665번째의 아미노산 잔기 로이신이 프롤린으로 더욱 치환되어 있는 RNA 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1항에 있어서, 변이형 RNA 폴리머라아제가, 야성형 T7 RNA 폴리머라아제의 644번째의 아미노산 잔기 페닐알라닌이 티로신으로 치환되고, 또한 667번째의 아미노산 잔기 페닐알라닌이 티로신으로 치환되어 있는 RNA 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14항에 있어서, 변이형 RNA 폴리머라아제가, 야성형 T7 RNA 폴리머라아제의 665번째의 아미노산 잔기 로이신이 프롤린으로 더욱 치환되어 있는 RNA 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1항에 있어서, 변이형 RNA 폴리머라아제가, T3 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제로서, 아미노산 잔기 645 또는 668에 있어서 티로신을 갖는 RNA 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 1항에 있어서, 변이형 RNA 폴리머라아제가, K11 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제로서, 아미노산 잔기 663∼668 사이 또는 690에 있어서 티로신을 갖는 RNA 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 1항에 있어서, 변이형 RNA 폴리머라아제가, SP6 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제로서, 아미노산 잔기 633∼638 사이 또는 670에 있어서 티로신을 갖는 RNA 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 1∼18항의 어느 한 항에 있어서, 3'dNTP 유도체가 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 3'디옥시리보누클레오티드 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.

    화학식 Ⅰ

    [식중, Q는 3'-디옥시리보누클레오티드 잔기를 나타내고, n은 1이상의 정수를 나타내며, V는 -C≡C- 또는 -CH=CH-를 나타내고, R은 형광성을 갖는 기를 나타낸다.]
20. 제 19항에 있어서, 화학식 Ⅰ에 있어서의 n이 4∼10의 정수임을 특징으로 하는 방법.
21. 제 19항 또는 제 20항에 있어서, 화학식 Ⅰ에 있어서의 R이 하기 화학식 Ⅶ으로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.

    화학식 Ⅶ

    [식중, W는 카르복실기를 나타내고,

    X는 -O-, -S-, -NR'-(단, R'는 수소원자, 저급 알킬기, 아랄킬기 또는 아릴기를 나타냄) 또는 -CH₂-를 나타내고,

    고리 A 및 고리 B는 어느 한쪽이

    이고, 다른 쪽이

    이며(단, Z는 O 또는 =N⁺R₁R₂를 나타내며,

    Y는 OH 또는 -NR₁R₂를 나타내고, (단, R₁및 R₂는 각각 독립적으로 수소원자 또는 저급 알킬기를 나타내거나, 또는 R₁및 R₂가 모두 트리메틸렌기를 나타낸다 (단, 상기 2개의 트리메틸렌기의 각각 다른 말단은 상기 2개의 트리메틸렌기를 갖는 질소원자가 결합하여 있는 고리상의, 상기 질소원자와 결합하여 있는 탄소원자의 서로 이웃하는 탄소원자의 어느 한쪽과 각각 결합하여 있다))),

    고리 C

    에 있어서, 점선 ------은 고리 A 및 고리 B의 구조에 대응한 위치의 결합방향을 의미하고,

    상기 고리 A, B, C 및 W를 갖는 벤젠고리는 또한 치환기를 갖고 있어도 된다.]
22. 제 1∼21항의 어느 한 항에 있어서, 프로모터 서열을 포함하는 DNA 단편이 폴리머라아제 연쇄반응에 의해 증폭된 DNA 생성물임을 특징으로 하는 방법.
23. 제 22항에 있어서, 증폭된 DNA 생성물로부터, 폴리머라아제 연쇄반응에 이용한 프라이머 및/또는 2'디옥시리보누클레오시드 5'-트리포스페이트 및/또는 이의 유도체를 제거하는 일없이, 핵산 전사 생성반응을 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 1∼23항의 어느 한 항에 있어서, 핵산 전사 생성반응을 무기 피로포스파타아제의 존재하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.