DE212017000061U1 - Zusammensetzung zum Nachweis einer einzelsträngigen Target-RNA - Google Patents

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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Zusammensetzung zum Nachweis einer einzelsträngigen Target-RNA in einer azellulären Probe umfassend eine Vielzahl von RNAs, umfassend:(i) eine C2c2-guideRNA, die mit der einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert;(ii) eine markierte Nachweis-RNA; und(iii) ein C2c2-Protein, das in der Probe vorhandene RNAs spaltet, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von 80% oder mehr mit der in einer der SEQ ID Nrn.: 1, 2 und 4-6 angegebenen Aminosäuresequenzen umfasst, und wobei das C2c2-Protein innerhalb von 60 Minuten nach dem Inkontaktbringen mit einer Probe, die eine C2c2-guideRNA und eine Target-RNA umfasst, mindestens 50% der markierten Nachweis-RNAs spaltet.

Description

  • QUERVERWEIS
  • Die vorliegende Anmeldung beansprucht den Vorteil der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 62/351,172 , eingereicht am 16. Juni 2016, der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 62/378,156 , eingereicht am 22. August 2016, und der US-Patentanmeldung Nr. 15/467,922 , eingereicht am 23. März 2017, wobei diese Anmeldungen hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind.
  • ERKLÄRUNG BEZÜGLICH DER BUNDESGEFÖRDERTEN FORSCHUNG
  • Die vorliegende Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung unter Nr. 1244557 durch die National Science Foundation ausgeführt. Die Regierung besitzt bestimmte Rechte an der Erfindung.
  • AUFNAHME DURCH VERWEIS AUF DIE SEQUENZLISTE, DIE ALS TEXTDATEI ZUR VERFÜGUNG GESTELLT WIRD
  • Ein Sequenzprotokoll wird hiermit als die am 21. März 2017 erstellte und 67 kB große Textdatei „BERK-337WO_SeqList_ST25.txt“ zur Verfügung gestellt. Der Inhalt der Textdatei ist hierin durch Bezugnahme vollständig aufgenommen.
  • EINFÜHRUNG
  • Bakterielle adaptive Immunsysteme verwenden CRISPRs (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) und CRISPR-assoziierte (Cas) Proteine für die RNA-guided Nukleinsäurespaltung. Obwohl CRISPR-Systeme vom Typ III und Typ VI im Allgemeinen DNA-Substrate als Target haben, sind Interferenzkomplexe gegen einzelsträngige RNA (ssRNA)-Substrate gerichtet. In Typ-VI-CRISPR-Systemen wirkt das aus einer Untereinheit bestehende Protein C2c2 als RNA-guided RNA-Endonuklease.
  • CRISPR-Cas-Systeme verleihen adaptive Immunität in Bakterien und Archaeen über RNA-guided Nukleinsäure-Interferenz. Von den verschiedenen CRISPR-Typen wird angenommen, dass nur die relativ seltenen CRISPR-Systeme vom Typ VI ausschließlich einzelsträngige RNA-Substrate als Target haben, eine Aktivität, die durch das große Effektorprotein C2c2 vermittelt wird. Die Typ-VI-Operons weisen gemeinsame Merkmale anderer genomischer CRISPR-Cas-Loci auf, einschließlich solcher CRISPR-Sequenz-Arrays, die als Speicher für kurze virale DNA-Segmente dienen. Um anti-virale Immunität bereitzustellen, assemblieren prozessierte CRISPR-Array-Transkripte (crRNAs) mit Cas-Protein-haltigen Überwachungskomplexen, welche Nukleinsäuren mit Sequenzkomplementarität zu dem Virus-abgeleiteten Segment der crRNAs, bekannt als Spacer, erkennen.
  • Der erste Schritt der Immunüberwachung erfordert die Verarbeitung von VorläufercrRNAs (prä-crRNAs), bestehend aus Repeat-Sequenzen, die virale Spacer-Sequenzen flankieren, zu einzelnen funktionellen crRNAs, die jeweils ein einziges viral abgeleitetes Sequenzsegment enthalten. CRISPR-Systeme verwenden verschiedene Mechanismen, um reife crRNAs zu produzieren, einschließlich der Verwendung bestimmter Endonukleasen (z.B. Cas6 oder Cas5d in Systemen vom Typ I und III), Kopplung einer Wirtsendonuklease (z.B. RNase III) mit einer transaktivierenden crRNA (tracrRNA, Typ-II-Systeme) oder eine Ribonukleaseaktivität, die endogen zum Effektorenzym selbst ist (z.B. Cpf1, von Typ V-Systemen).
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Nachweisen einer einzelsträngigen Target-RNA bereit. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Spalten eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays in zwei oder mehr C2c2-guideRNAs bereit. Die vorliegende Erfindung stellt einen Kit zum Nachweisen einer Target-RNA in einer Probe bereit.
  • Es werden Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweisen einer einzelsträngigen Target-RNA bereitgestellt, wobei die Verfahren umfassen: (i) Inkontaktbringen einer Probe mit einer Vielzahl von RNAs mit (a) einer C2c2-guideRNA, die mit der einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert, und (b) einem C2c2-Protein, das RNAs der Probe spaltet; und (ii) Messen eines durch die Spaltung erzeugten nachweisbaren Signals. Sobald ein betreffendes C2c2-Protein durch eine C2c2-guideRNA aktiviert wird, was auftritt, wenn die Probe eine einzelsträngige Target-RNA enthält, mit welcher die guideRNA hybridisiert (d.h., die Probe schließt die einzelsträngige Target-RNA ein), wird das C2c2-Protein eine Endoribonuklease, welche RNAs der Probe spaltet. Wenn also die einzelsträngige Target-RNA in der Probe vorliegt (z.B. in einigen Fällen oberhalb einer Grenzwert-Menge), ist das Ergebnis die Spaltung von RNA in der Probe, die unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Nachweisverfahrens nachgewiesen werden kann (z.B. unter Verwendung von markierter Nachweis-RNA).
  • In einigen Fällen können zwei oder mehr C2c2-guideRNAs unter Verwendung eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays bereitgestellt werden, die durch das C2c2-Protein in individuelle guideRNAs gespalten werden können, und dies unabhängig davon, ob das C2c2-Protein intakte HEPN1 und/oder HEPN2-Domänen aufweist. Somit werden auch Verfahren zum Spalten eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays in zwei oder mehr C2c2-guideRNAs bereitgestellt. In einigen Fällen fehlt dem C2c2-Protein eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne und/oder eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne.
  • Figurenliste
    • Die 1A-1E zeigen schematische Darstellungen, die sich auf einen endogenen C2c2-Locus und auf Experimente beziehen, welche die heterologe Expression und Reinigung von rekombinantem C2c2-Protein verdeutlichen.
    • Die 2 zeigt Ergebnisse von Spaltungsassays, die unter Verwendung des C2c2-Proteins durchgeführt wurden.
    • Die 3 zeigt Ergebnisse, die zeigen, dass C2c2 eine einzelsträngige RNA deutlich spaltete.
    • Die 4A-4B zeigen ein Diagramm und Ergebnisse von verschiedenen Spaltungsassays unter Verwendung des C2c2-Proteins.
    • Die 5 zeigt Ergebnisse von Experimenten, die unter Verwendung einer markierten Nachweis-RNA (unter Verwendung von einem Quencher/Fluor-Paar), um RNA-Spaltung durch das C2c2-Protein nachzuweisen.
    • Die 6 zeigt Ergebnisse von Experimenten, die eine prä-crRNA-Prozessierung durch C2c2 Protein zeigen.
    • Die 7A-7B zeigen eine schematische Darstellung und Sequenzen von beispielhaften C2c2-guideRNAs.
    • Die 8A-8F zeigen Aminosäuresequenzen verschiedener C2c2-Polypeptide.
    • Die 9A-9C zeigen die Prozessierung von Vorläufer-crRNA-Transkripten der C2c2-Familie, um reife crRNAs zu erzeugen.
    • Die 10A-10C zeigen den Effekt der Struktur und Sequenz von CRISPR-Repeats auf die LbuC2c2-vermittelte crRNA-Biogenese.
    • Die 11A-11C zeigen den guide-abhängigen ssRNA-Abbau von cis- und trans-Targets durch LbuC2c2.
    • Die 12A-12D zeigen zwei verschiedene Ribonukleaseaktivitäten von LbuC2c2.
    • Die 13A-13D zeigen den C2c2-vermittelten sensitiven visuellen Nachweis von Transkripten in komplexen Mischungen.
    • Die 14 stellt die Tabelle 2 bereit: verschiedene DNA-Substrate, die in den in den Beispielen 8 bis 12 beschriebenen Studien verwendet wurden und in 12A-12D gezeigt sind.
    • Die 15 zeigt Tabelle 3: verschiedene RNA-Substrate, die in den in den Beispielen 8 bis 12 beschriebenen Studien verwendet wurden.
    • Die 16A-16F zeigen Daten, die zeigen, dass die prä-crRNA-Prozessierung durch C2c2 Spacer-sequenzunabhängig ist, auf Tandem-crRNA-Arrays auftreten kann, durch Mutationen in der 5'- und/oder 3'-flankierenden Region der prä-cRNA beeinflusst wird und metallunabhängig ist.
    • Die 17 zeigt eine Zusammenfassung der Wirkung von prä-crRNA-Doppelmutationen auf prä-crRNA-Prozessierungsaktivität.
    • Die 18A-18B zeigen eine Kartierung der LbuC2c2-ssRNA-Target-Spaltungsstellen.
    • Die 19A-19C zeigen die Abhängigkeit der Spaltungseffizienz der Target-RNA von der crRNA-Spacer-Länge, der Reaktionstemperatur und der 5'-Ende-Sequenz der crRNA.
    • Die 20A-20C zeigen Bindungsdaten für LbuC2c2 an reife crRNA und Target-ssRNA.
    • Die 21 zeigt einen RNase-Nachweis-Assay von λ2-ssRNA im Zeitverlauf.
    • Die 22A-22B zeigen einen phylogenetischen Baum der C2c2-Familie und C2c2-Alignment.
    • Die 23A-23D zeigen die Reinigung und Produktion von C2c2.
    • Die 24A-24C zeigen Daten, aus denen hervorgeht, dass C2c2-Proteine Vorläufer-crRNA-Transkripte prozessieren, um reife crRNAs zu erzeugen. a, phylogenetischer Baum nach Maximum-Likelihood-Methode der C2c2-Proteine. Die in dieser Studie verwendeten Homologe sind gelb markiert, b, Diagramm der drei CRISPR-Loci vom Typ VI, die in dieser Studie verwendet wurden. Schwarze Rechtecke bezeichnen Repeat-Elemente, gelbe Rauten bezeichnen Spacer-Sequenzen. Cas1 und Cas2 werden nur in der genomischen Umgebung von LshC2c2 gefunden. c, C2c2-vermittelte Spaltung von prä-crRNA, die von den LbuC2c2-, LseC2c2- und LshC2c2-CRISPR-Repeat-Loci abgeleitet ist. OH: alkalische Hydrolyse-Leiter; T1: RNase T1-Hydrolyse-Leiter; Prozssierungsreaktionen wurden mit 100 nM C2c2 und <1 nM prä-crRNA durchgeführt. Das Schema der Spaltung ist rechts dargestellt, und die vorhergesagten prä-crRNA-Sekundärstrukturen sind unten schematisch dargestellt, wobei Pfeile die kartierten C2c2-Spaltungsstellen angeben.
    • Die 25A-25C zeigen Daten, die zeigen, dass die LbuC2c2-vermittelte crRNA-Biogenese sowohl von der Struktur als auch von der Sequenz der CRISPR-Repeats abhängt, a, Repräsentativer Spaltungsassay durch LbuC2c2 auf prä-crRNAs, die strukturelle Mutationen innerhalb der Stamm- und Schleifenregionen der Haarnadel enthalten. Die nachstehend angegebenen Prozessierungs-Prozentsätze sind nach 60 min quantifiziert (Mittelwert ± SD, n = 3). b, Balkendiagramm, das die Abhängigkeit der prä-crRNA-Prozessierung von der CRISPR-Repeat-Sequenz zeigt. Die Wildtyp-Repeat-Sequenz ist nachstehend gezeigt, wobei einzelne Balken Tandemnukleotidmutationen darstellen, wie in rot angegeben. Die Spaltungsstelle ist mit einer Schere gekennzeichnet. Der prozessierte Prozentsatz wurde nach 60 min gemessen (Mittelwert ± SD, n = 3). Graphisch dargestellte Haarnadeln von getesteten Mutanten finden sich in den erweiterten Daten der 3-4. c Die Abhängigkeit der crRNA-Prozssierungsreaktion von zweiwertigen Metallionen wurde durch Zugabe von 10-50 mM EDTA und EGTA bei Standardreaktionsbedingungen getestet.
    • Die 26A-26D zeigen Daten, die zeigen, dass das LbuC2c2 zwei verschiedene Ribonukleaseaktivitäten enthält, a, Quantifizierte Zeitverlaufsdaten von cis-ssRNA-Target (schwarz)- und prä-crRNA (Blaugrün)-Spaltung durch LbuC2c2, durchgeführt bei 37 °C. Exponentielle Anpassungen sind als durchgezogene Linien dargestellt (n = 3), und die berechneten Geschwindigkeitskonstanten pseudo-erster Ordnung (kobs) (Mittelwert ± SD) betragen 9,74 ± 1,15 min-1 und 0,12 ± 0,02 min-1 für cis-ssRNA-Target- und prä-crRNA-Spaltung, b, LbuC2c2-Architektur, die die Position von HEPN-Motiven und Prozessierungsdefizienten Punktmutanten zeigt. c, d Ribonukleaseaktivität von LbuC2c2-Mutanten für prä-crRNA-Prozessierung in c und ssRNA-Targeting in d und erweiterte Daten 6d.
    • Die 27A-27E zeigen, dass C2c2 einen sensitiven Nachweis von Transkripten in komplexen Gemischen bereitstellt. a, Darstellung des LbuC2c2-RNA-Nachweisverfahrens unter Verwendung eines gequenchten Fluoreszenz-RNA-Reporters. b, Quantifizierung des Fluoreszenzsignals, das durch LbuC2c2 nach 30 min für variierende Konzentrationen der Target-RNA in Anwesenheit von Gesamt-Human-RNA erzeugt wurde. RNase A wird als positive RNA-Degradationskontrolle gezeigt (Mittelwert ± SD, n = 3).c, Quantifizierung des Fluoreszenzsignals, das durch LbuC2c2 erzeugt wird, beladen mit einer crRNA mit β-Actin-Target, nach 3 Stunden für unterschiedliche Mengen an Gesamt-Human-RNA oder bakterieller Gesamt-RNA (als β-Actin-Null-Negativ-Kontrolle) (Mittelwert ± SD, n = 3), d, Die Tandem-prä-crRNA-Prozessierung ermöglicht auch den RNA-Nachweis (Mittelwert ± SD, n = 3), e, Modell des Typ VI-CRISPR-Syntheseweges, der beide C2c2-Ribonukleaseaktivitäten hervorhebt.
    • Die 28A-28B zeigen einen vollständigen phylogenetischen Baum der C2c2-Familie und das C2c2-Alignment, a, Phylogenetische Maximum-Likelihood-Rekonstruktion von C2c2-Proteinen. Zu den Blättern gehören die GI-Proteinzahlen und der Herkunftsorganismus; Bootstrap-Unterstützungswerte von 100 Resamplings werden für den inneren Split dargestellt. Die Skala ist in Substitutionen pro Stelle, b, Mehrfachsequenz-Alignment der drei analysierten Homologen von C2c2; Koordinaten basieren auf LbuC2c2.
    • Die 29A-29D zeigen Daten in Bezug auf die Reinigung und Produktion von C2c2. Alle C2c2-Homologe wurden in E. coli als His-MBP-Fusionen exprimiert und durch eine Kombination von Affinitäts-, lonenaustausch- und Größenausschlusschromatographie gereinigt. Die Ni2+-Affinitätsmarkierung wurde durch Inkubation mit TEV-Protease entfernt. Repräsentative SDS-PAGE von Chromatographiefraktionen sind in (a, b) gezeigt. c Das Chromatogramm einer Superdex 200 (16/60)-Säule zeigt, dass C2c2 als einzelner Peak ohne Nukleinsäure eluiert, d, SDS-PAGE-Analyse von gereinigten Proteinen, die in diesem Manuskript verwendet wurden.
    • Die 30A-30I zeigen die Kartierung der prä-crRNA-Prozessierung durch C2c2 in vitro und in vivo, a, Spaltstellen-Kartierung von LseC2c2- und LshCc2c2-Spaltung eines einzelnen kognaten prä-crRNA-Arrays. OH: alkalische Hydrolyse-Leiter; T1: T1-RNase-Hydrolyse-Leiter. Spaltungsreaktionen wurden mit 100 nM C2c2 und <1 nM prä-crRNA durchgeführt. b-i, Re-Analyse von LshC2c2 (b-f)-und LseC2c2 (g-i) CRISPR-Array-RNA-Sequenzierungsexperimenten von Shmakov et al.10 (Figur S7 bzw. 5). Alle Lesetiefen (b, g) und gefilterten Lesetiefen (55 nt oder weniger; gemäß der ursprünglichen Analyse von Shmakov et al .; c, h) wurden unter Verwendung von Bowtie2 einem stringenten Alignment mit jedem CRISPR-Array unterzogen (siehe Verfahren). Detaillierte Ansichten einzelner CRISPR-Repeat-Spacer sind für Lsh (d-f) und Lse (i) gezeigt. Unterschiede in der 5'-Endeprä-crRNA-Prozessierung sind durch Pfeile unter jeder Sequenz angegeben. BAM-Alignment-Dateien der Analyse sind verfügbar. Diese Kartierung zeigt deutlich, dass die 5'-Enden von kleinen RNA-Sequenzierungsstücken, die von Lsh-prä-crRNAs erzeugt wurden, zu einer Position 2 nts von der Basis der vorhergesagten Haarnadel in Übereinstimmung mit den in vitro-Prozessierungsdaten (a) abbilden. Dieses Muster gilt für alle reifen crRNAs, die sowohl aus der nativen Expression in L. shahii als auch der heterologen Expression in E. coli nachgewiesen wurden. Unglücklicherweise sind die LseC2c2-crRNA-Sequenzierungsdaten (in g-i verwendet) aufgrund der geringen Lesetiefe weniger aussagekräftig, und jedes crRNA-Alignment zeigt ein leicht unterschiedliches 5'-Ende mit wenig offensichtlicher Gleichförmigkeit. Die Kartierung für eine der prozessierten Repeats (Repeat-Spacer 2; i) stimmt mit den Daten überein, jedoch nur mit geringer Konfidenz aufgrund der unzureichenden Lesetiefe.
    • Die 31A-31D zeigen, dass die prä-crRNA-Prozessierung durch C2c2 Spacer-Sequenz-unabhängig ist, auf Tandem-crRNA-Arrays auftreten kann, durch Mutationen in der 5'-flankierenden Region der prä-cRNA beeinflusst wird und ein 3'-Phosphatprodukt erzeugt, a, Spaltungsstellen-Kartierung der LbuCc2c2-Spaltung eines Tandem-prä-crRNA-Arrays. OH: alkalische Hydrolyse-Leiter; T1: T1-RNase-Hydrolyse-Leiter. Spaltungsreaktionen wurden mit 100 nM LbuC2c2 und <1 nM prä-crRNA durchgeführt. Ein Schema der Spaltprodukte ist rechts dargestellt, wobei Pfeile die kartierten C2c2-Spaltprodukte angeben, b, LbuC2c2 4-mer-Mutanten-prä-crRNA-Prozessierungsdaten, die die Bedeutung der einzelsträngigen 5'-Flankierungsregion für eine effiziente prä-crRNA-Prozessierung zeigen. Der Prozentsatz der prä-crRNA-Prozessierung wurde nach 60 min gemessen (Mittelwert ± SD, n = 3). c, Repräsentativer Zeitverlauf einer LbuC2c2-prä-crRNA-Spaltung, der zeigt, dass ähnliche Raten der prä-crRNA-Prozessierung unabhängig von den Geschwindigkeitskonstanten pseudo-erster Ordnung (kobs) der crRNA-Spacer-Sequenz (Mittelwert ± SD) 0,07 ± 0,04 min-1 0,08 ± 0,04 min-1 für Spacer A bzw. Spacer λ2, sind, d, Endgruppenanalyse gespaltener RNA durch T4-Polynukleotidkinase (PNK)-Behandlung. Standard-Prozessierungs-Testbedingungen wurden verwendet, um ein Spaltprodukt zu erzeugen, das dann mit PNK für 1 Stunde inkubiert wurde, um alle cyclischen 2',3'-Phosphate/3'-Monophosphate zu entfernen. Die verzögerte Wanderung der Bande zeigt die Entfernung des geladenen Monophosphats vom 3'-Ende des radiomarkierten 5'-Produkts an.
    • Die 32A-32C zeigen, dass LbuC2c2 den guide-abhängigen ssRNA-Abbau an cis- und trans-Targets katalysiert, a) Schema der beiden Modi des C2c2, guide-abhängigen ssRNA-Abbaus, b, Spaltung von zwei verschiedenen radiomarkierten ssRNA-Substraten, A und B, durch LbuC2c2. Komplexe von 100 nM C2c2 und 50 nM crRNA wurden bei 37 °C vorgeformt und die Reaktion wurde nach Zugabe von < 1 nM 5'-markierter Target-RNA bei 25 °C gestartet. trans-Spaltungsreaktionen enthielten äquimolare (<1 nM) Konzentrationen von radiomarkiertem, nicht-guide-komplementärem Substrat und nicht markierte On-Target-ssRNA. Für mehrere ssRNA-Substrate wurde beobachtet, dass LbuC2c2 nur bei Bindung an die komplementäre crRNA eine effiziente Spaltung katalysierte, was darauf hinweist, dass LbuC2c2:crRNA ssRNA auf eine RNA-guided Weise spaltet. Diese Aktivität wird im Folgenden als On-Target- oder cis-Target-Spaltung bezeichnet. Die durch LbuC2c2 vermittelte cis-Spaltung führte zu einer Leiterbildung von mehreren Produkten, wobei die Spaltung bevorzugt vor Uracil-Resten stattfand, analog zu LshC2c29. Non-Target-Spaltungsreaktionen wurden in Gegenwart von nicht markierter, On-Target (crRNA-komplementärer) ssRNA wiederholt. Im Gegensatz zu Non-Target-Spaltungs-Experimenten, die in cis durchgeführt wurden, wurde ein schneller Abbau von Non-Target-RNA in trans beobachtet. Die ähnlichen RNA-Spaltungsraten und nahezu identischen Spaltprodukte, die sowohl für die cis-On-Target-Spaltung als auch für die trans-Non-Target-Spaltung beobachtet wurden, implizieren das gleiche Nuklease-Zentrum in beiden Aktivitäten. c LbuC2c2, beladen mit crRNA mit Spacer A-Target, wurde auf Spaltungsaktivität unter cis (Target A-markiert)- und trans (Target B-markiert in Gegenwart von nicht markiertem Target A)-Spaltungsbedingungen in Gegenwart von 25 mM EDTA getestet.
    • Die 33A-33B zeigen eine LbuC2c2-ssRNA-Target-Spaltungsstellenkartierung a ssRNA-Target-Spaltungsassay, der mittels LbuC2c2-vermittelter „cis“-Spaltung von mehreren radiomarkierten ssRNA-Substraten mit identischen Spacer-komplementären Sequenzen, aber verschiedenen 5'-flankierenden Sequenzen variabler Länge und Nukleotidzusammensetzung durchgeführt wurde. Sequenzen von ssRNA-Substraten sind rechts mit Spacer-komplementären Sequenzen für crRNA-A, gelb markiert gezeigt. Pfeile zeigen nachgewiesene Spaltungsstellen an. Das Gel wurde zur Klarheit abgeschnitten. Es sollte angemerkt werden, dass das Muster von Spaltungsprodukten, die auf verschiedenen Substraten produziert sind (z.B. A.1 vs A.2 vs. A.3) zeigt, dass die Wahl der Spaltungsstelle hauptsächlich durch eine Uracil-Präferenz bestimmt wird und ein offensichtliches Fehlen eines exklusiven Spaltungsmechanismus innerhalb der crRNA-komplementären Target-Sequenz zeigt, was im Gegensatz zu dem steht, was für andere CRISPR-Einzeleffektorkomplexe der Klasse II beobachtet wird, wie Cas9 und Cpfl11,21. Interessanterweise deutet das für Substrat A.0 beobachtete Spaltungsmuster auf eine sekundäre Präferenz für polyG-Sequenzen, b, LbuC2c2-ssRNA-Target-Spaltungsassay gemäß den Verfahren, unter Verwendung einer Reihe von crRNAs, die die Länge des ssRNA-Targets umfassen. Die Sequenz der ssRNA-Substrate, die in diesem Experiment verwendet wurden, ist unter dem Gel mit Spacer-komplementären Sequenzen für jede crRNA gezeigt, die gelb hervorgehoben ist. Pfeile zeigen vorhergesagte Spaltungsstellen an. Über jedem Satz von Spuren zeigt ein kleines Diagramm die Position der Spacer-Sequenz entlang des Target (gelbe Box) und die beobachteten Spaltungsprodukte (rote Pfeile) oder nicht vorhanden (schwarze Pfeile). Gleichermaßen sollte beachtet werden, dass für jede crRNA die Spaltproduktlängenverteilung sehr ähnlich ist, was wiederum ein offensichtliches Fehlen einer ausschließlichen Spaltung innerhalb der crRNA-gebundenen Sequenz anzeigt. Das Fehlen mehrerer Spaltungsprodukte in einer Teilmenge der Reaktionen könnte durch die Anwesenheit von gebundener C2c2:crRNA auf dem ssRNA-Target erklärt werden, die den Zugang zu Uracilen durch beliebige cis (intramolekulare)- oder trans (intermolekulare)-aktive LbuC2c2-Stellen sterisch verschließen könnte. Während eine geeignete Analyse der Protospacer-flankierenden Stelle (PFS) für LbuC2c2 über den Rahmen dieser Studie hinausgeht, wurde eine minimale Auswirkung des 3'-flankierenden Nukleotids beobachtet. Die erwartete PFS-Basis wird in Diagramm neben jedem rot getesteten guide-Element notiert.
    • Die 34A-34D zeigen die Abhängigkeit des RNA-Targeting von crRNA-Varianten, Temperatur- und Punktmutationen, a LbuC2c2-ssRNA-Target-Spaltungsassay, durchgeführt gemäß Verfahren mit crRNAs, die 16-nt-, 20-nt- oder 24-nt-Spacer enthalten, b, LbuC2c2 ssRNA-Target-Spaltungszeitverlauf bei entweder 25 °C und 37 °C gemäß Verfahren durchgeführt, c, LbuC2c2 ssRNA-Target-Spaltungszeitverlauf durchgeführt nach Verfahren mit crRNAs, die verschiedene 5'-flankierende Nukleotid-Mutationen besitzen. Mutationen sind rot markiert. 1-2 5'-Nukleotid-Verlängerungen beeinflussten die Spaltungseffizienzen vernachlässigbar. Im Gegensatz dazu verlangsamte die Verkürzung der flankierenden Region auf 3 nts die Spaltungsraten, d Einfluss von Punktmutationen auf die Ribonukleaseaktivität von C2c2 bei Mutanten in konservierten Resten innerhalb von HEPN-Motiven für ssRNA-Targeting.
    • Die 35A-35D zeigen Bindungsdaten für LbuC2c2 an reife crRNA und Target-ssRNA. a, Filterbindungsassays wurden, wie in den Verfahren beschrieben, zur Bestimmung der Bindungsaffinität von reifer crRNA-A_GG an LbuC2c2-WT, LbuC2c2-dHEPN1, LbuC2c2-dHEPN2 oder LbuC2c2-dHEPN1/dHEPN2 durchgeführt. Die quantifizierten Daten wurden an Standard-Bindungsisothermen angepasst. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Versuchen. Die gemessenen Dissoziationskonstanten aus drei unabhängigen Versuchen (Mittelwert ± SD) betrugen 27,1 ± 7,5 nM (LbuC2c2-WT), 15,2 ± 3,2 nM (LbuC2c2-dHEPN1), 11,5 ± 2,5 nM (LbuC2c2-dHEPN2) und 43,3 ± 11,5 nM (LbuC2c2-dHEPN1/dHEPN2). b, Repräsentativer Electrophoretic Mobility Shift Assay für Bindungsreaktionen zwischen LbuC2c2-dHEPN1/dHEPN2:crRNA-A_GG und entweder „On-Target“-A ssRNA" oder „Off-Target“-B ssRNA, wie angegeben. Drei unabhängige Experimente wurden wie in den Verfahren beschrieben durchgeführt. Das Gel wurde zur Klarheit abgeschnitten, c, Quantifizierte Bindungsdaten von (b) wurden an Standard-Bindungsisoformen angepasst. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. Die gemessenen Dissoziationskonstanten aus drei unabhängigen Experimenten (Mittelwert ± SD) betrugen 1.62 ± 0.43 nM für ssRNA A und ND (»10 nM) für ssRNA B. d. Filterbindungsassays wurden, wie in den Verfahren beschrieben, zur Bestimmung der Bindungsaffinität von reifer crRNA-A_GA an LbuC2c2-WT und LbuC2c2-R1079A durchgeführt. Die quantifizierten Daten wurden an Standard-Bindungsisothermen angepasst. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. Die gemessenen Dissoziationskonstanten aus drei unabhängigen Experimenten (Mittelwert ± SD) betrugen 4,65 ± 0,6 nM (LbuC2c2-WT) und 2,52 ± 0,5 nM (LbuC2c2-R1079A). Es ist anzumerken, dass diese Bindungsaffinitäten von Feld a abweichen. Dieser Unterschied ist mit einem leichten Unterschied in der 5-Sequenz der guide mit Feld a-guides berücksichtigt, wobei die Feld a-guides mit einem 5'-GGCCA ... und Feld d-guides mit 5'-GACCA... beginnen. Während der native Sequenz-Guide (5-GACCA) fester an LbuC2c2 bindet, ist kein Unterschied in den RNA-Targeting-Effizienzen dieser Guide-Varianten zu sehen (erweiterte Daten 6c).
    • Die 36A-36B zeigen einen RNase-Nachweisassay λ2-ssRNA-Zeitverlauf, a, LbuC2c2:crRNA-2 wurde mit RNase-Alert-Substrat (Thermo-Fisher) und 100 ng HeLa-Gesamt-RNA in Gegenwart von zunehmenden Mengen an λ2-ssRNA (0-1 nM) für 120 min bei 37 °C inkubiert. Fluoreszenzmessungen wurden alle 5 min durchgeführt. Die 1 nM λ2-ssRNA-Reaktion erreichte eine Sättigung, bevor der erste Zeitpunkt gemessen werden konnte. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten dar, b, LbuC2c2:crRNA-λ4 oder Apo-LbuC2c2 wurde in HeLa Gesamt-RNA für 2 h in Gegenwart oder Abwesenheit von aktivierender On-Target-λ4 ssRNA inkubiert. Der Abbau von kleiner Hintergrund RNA wurde auf einem kleinen RNA-Chip in einem Bioanalyzer 2100 gemäß den Verfahren aufgetrennt. Kleine Unterschiede zeigen sich im Fragmentprofil zwischen Apo LbuC2c2 und LbuC2c2:crRNA-λ4. Im Gegensatz dazu zeigt eine drastische Verbreiterung und Verschiebung des tRNA-Peaks bei Zugabe der On-Target-ssRNA zur Reaktion einen extensiven Abbau von anderen strukturierten und nicht-strukturierten RNAs, die bei der Aktivierung der LbuC2c2-trans-Aktivität in der Reaktion vorhanden sind.
    • Die 37 zeigt Spaltungsexperimente, die eine stark reduzierte Spaltung der Vorläufer-guideRNA (guideRNA-Prozessierung) durch LbuC2c2 zeigen, wenn das Protein eine Mutation an irgendeiner Aminosäurestelle einschließt, ausgewählt aus R1079 (z.B. R1079A), R1072 (z.B. R1072A) und K1082 (z.B. K1082A).
    • Die 38A-38C zeigen die Konservierung der prä-crRNA-Prozessierung innerhalb der Cas13a-Familie.
    • Die 39A-39C zeigen die CRISPR-Loci und crRNA-Repeat-Architektur für Cas13a-Homologe.
    • Die 40A-40F zeigen Reste, die für die prä-crRNA-Spaltung durch LbuCas13a wichtig sind.
    • Die 41A-41B zeigen Alignements von Helical 1- und HEPN-Domänen von Cas13a-Familienmitgliedern.
    • Die 42A-42D zeigen Effizienzen von ssRNA durch Mitglieder der Cas13a-Familie.
    • Die 43A-43D zeigen trans-ssRNA-Spaltung durch Cas13a-Homologe.
    • Die 44A-44F zeigen die crRNA-Austauschbarkeit innerhalb der Cas13a-Familie.
    • Die 45A-45C zeigen die funktionelle Validierung orthogonaler Cas13a-Unterfamilien für den RNA-Nachweis.
    • Die 46A-46D zeigen die Verarbeitung von crRNA-Arrays durch Wildtyp (WT) LbuCas13a und LbuCas13a R1079A/K1080A-Doppelmutante.
    • Die 47A-47C zeigen die trans-Spaltung durch LbuCas13a-Punktmutanten in Regionen, die an der prä-crRNA-Prozessierung beteiligt sind.
    • Die 48A-48B zeigen Merkmale der Doppelmutante LbuCas13a R1079A/K1080A relativ zum Wildtyp LbuCas13a.
    • Die 49 zeigt Tabelle 4.
    • Die 50 zeigt Tabelle 5.
    • Die 51 zeigt Tabelle 6.
    • Die 52 zeigt Tabelle 7.
    • Die 53 zeigt Tabelle 8.
    • Die 54 zeigt Tabelle 9.
    • Die 55A-55B zeigen ein Modell für die CRISPR-Systemfunktion vom Typ VIA.
    • Die 56A-56K zeigen Aminosäuresequenzen verschiedener Cas13a-Polypeptide.
    • Die 57 zeigt ein Alignment von Aminosäuresequenzen von verschiedenen Cas13a-Polypeptiden.
  • DEFINITIONEN
  • Die Ausdrücke „Polynukleotid“ und „Nukleinsäure“, die hierin austauschbar verwendet werden, beziehen sich auf eine polymere Form von Nukleotiden beliebiger Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide. Somit umfassen die Begriffe „Polynukleotid“ und „Nukleinsäure“ einzelsträngige DNA; doppelsträngige DNA; mehrsträngige DNA; einzelsträngige RNA; doppelsträngige RNA; mehrsträngige RNA; genomische DNA; cDNA; DNA-RNA-Hybride; und ein Polymer, das Purin- und Pyrimidinbasen oder andere natürliche, chemisch oder biochemisch modifizierte, nicht natürliche oder derivatisierte Nukleotidbasen umfasst.
  • Der Ausdruck „Oligonukleotid“ bezieht sich auf ein Polynukleotid von zwischen 3 und 100 Nukleotiden von einzel- oder doppelsträngiger Nukleinsäure (z.B. DNA, RNA oder eine modifizierte Nukleinsäure). Für die Zwecke dieser Erfindung gibt es jedoch keine obere Grenze für die Länge eines Oligonukleotids. Oligonukleotide sind auch als „Oligomere“ oder „Oligos“ bekannt und können aus Genen isoliert, transkribiert (in vitro und/oder in vivo) oder chemisch synthetisiert werden. Die Begriffe „Polynukleotid“ und „Nukleinsäure“ sollten so verstanden werden, dass sie, falls sie für die beschriebenen Ausführungsformen anwendbar sind, einzelsträngige (wie Sense oder Antisense) und doppelsträngige Polynukleotide einschließen.
  • Mit „hybridisierbar“ oder „komplementär“ oder „im wesentlichen komplementär“ ist gemeint, dass eine Nukleinsäure (z.B. RNA, DNA) eine Nukleotidsequenz, die es ermöglicht, dass sie nicht-kovalent bindet, insbesondere Watson-Crick-Basenpaare und/oder G/U-Basenpaare bildet, mit einer anderen Nukleinsäure auf eine sequenzspezifische, antiparallele Weise (insbesondere eine Nukleinsäure bindet spezifisch an eine komplementäre Nukleinsäure) unter den geeigneten in vitro- und/oder in vivo-Bedingungen der Temperatur- und lonenstärke der Lösung „annealiert“ oder „hybridisiert“. Die Standard-Watson-Crick-Basenpaarung umfasst: Adenin/Adenosin (A)-Paarung mit Thymin/Thymidin (T), A-Paarung mit Uracil/Uridin (U) und Guanin/Guanosin (G)-Paarung mit Cytosin/Cytidin (C). Zusätzlich kann zur Hybridisierung zwischen zwei RNA-Molekülen (z.B. dsRNA) und zur Hybridisierung eines DNA-Moleküls mit einem RNA-Molekül (z.B., wenn eine DNA-Target-Nukleinsäurebase mit einer C2c2-guideRNA basenpaart usw.) G auch mit U basenpaaren. Zum Beispiel ist die G/U-Basenpaarung teilweise für die Degeneriertheit (d.h. Redundanz) des genetischen Codes im Zusammenhang mit der tRNA-Anti-Codon-Basenpaarung mit Codons in mRNA verantwortlich. Somit wird im Kontext dieser Erfindung ein G (z.B. eines Protein-bindenden Segments (dsRNA-Duplex) eines C2c2-guideRNA-Moleküls; einer Target-Nukleinsäurebasenpaarung mit einer C2c2-guideRNA) als komplementär zu U und C betrachtet. Wenn beispielsweise ein G/U-Basenpaar an einer bestimmten Nukleotidposition eines Protein-bindenden Segments (z.B. dsRNA-Duplex) eines C2c2-guideRNA-Moleküls hergestellt werden kann, wird die Position nicht als nicht-komplementär angesehen, sondern als komplementär.
  • Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind wohlbekannt und beispielhaft in Sambrook, J., Fritsch, EF und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), insbesondere Kapitel 11 und Tabelle 11.1 darin; und Sambrook, J. und Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, dritte Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). Die Bedingungen der Temperatur und der lonenstärke bestimmen die „Stringenz“ der Hybridisierung.
  • Die Hybridisierung erfordert, dass die zwei Nukleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, obwohl Fehlpaarungen zwischen Basen möglich sind. Die Bedingungen, die für die Hybridisierung zwischen zwei Nukleinsäuren geeignet sind, hängen von der Länge der Nukleinsäuren und dem Grad der Komplementarität ab, Variablen, die in der Technik gut bekannt sind. Je größer der Komplementaritätsgrad zwischen zwei Nukleotidsequenzen ist, desto größer ist der Wert der Schmelztemperatur (Tm) für Hybride von Nukleinsäuren mit diesen Sequenzen. Für Hybridisierungen zwischen Nukleinsäuren mit kurzen Komplementaritätsabschnitten (z.B. Komplementarität über maximal 35, maximal 30, maximal 25, maximal 22, maximal 20 oder maximal 18 Nukleotide) kann die Position von Fehlpaarungen wichtig werden (siehe Sambrook et al., oben, 11.7-11.8). Typischerweise beträgt die Länge für eine hybridisierbare Nukleinsäure 8 Nukleotide oder mehr (z.B. mindestens 10 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide oder mindestens 30 Nukleotide). Temperatur und Salzkonzentration der Waschlösung sind nach Bedarf einstellbar und sind abhängig von Faktoren wie der Länge des Komplementaritätsbereichs und dem Komplementaritätsgrad.
  • Es versteht sich, dass die Sequenz eines Polynukleotids nicht 100% komplementär zu derjenigen seiner Target-Nukleinsäure sein muss, um spezifisch hybridisierbar oder hybridisierbar zu sein. Darüber hinaus kann ein Polynukleotid über ein oder mehrere Segmente hybridisieren, so dass dazwischenliegende oder benachbarte Segmente nicht am Hybridisierungsereignis beteiligt sind (z.B. eine Schleifenstruktur oder Haarnadelstruktur). Ein Polynukleotid kann mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99%, mindestens 99,5% oder 100% Sequenzkomplementarität zu einer Target-Region innerhalb der Target-Nukleinsäuresequenz umfassen, mit der es hybridisieren wird. Zum Beispiel würde eine Antisense-Nukleinsäure, in der 18 von 20 Nukleotiden der Antisense-Verbindung zu einer Target-Region komplementär sind und daher spezifisch hybridisieren würden, 90% Komplementarität darstellen.
    In diesem Beispiel können die verbleibenden nichtkomplementären Nukleotide gruppiert oder mit komplementären Nukleotiden durchsetzt sein und brauchen nicht aneinander oder an komplementäre Nukleotide angrenzend zu sein. Die prozentuale Komplementarität zwischen bestimmten Abschnitten von Nukleinsäuresequenzen innerhalb von Nukleinsäuren kann unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens bestimmt werden. Beispielhafte Verfahren umfassen BLAST-Programme (grundlegende lokale Alignment-Suchtools) und PowerBLAST-Programme (Altschul et al., J. Mol. Soc.Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang und Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656) oder unter Verwendung des Gap-Programms (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), unter Verwendung von Standardeinstellungen, welches den Algorithmus von Smith und Waterman verwenden (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).
  • Die Begriffe „Peptid“, „Polypeptid“ und „Protein“ werden hier austauschbar verwendet und beziehen sich auf eine polymere Form von Aminosäuren beliebiger Länge, die codierte und nicht codierte Aminosäuren, chemisch oder biochemisch modifizierte oder derivatisierte Aminosäuren und Polypeptide mit modifizierten Peptidrückgraten umfassen können.
  • „Bindung‟, wie hier verwendet (z.B. in Bezug auf eine RNA-Bindungsdomäne eines Polypeptids, Bindung an eine Target-Nukleinsäure und dergleichen), bezieht sich auf eine nicht-kovalente Wechselwirkung zwischen Makromolekülen (z.B. zwischen einem Protein und einer Nukleinsäure; zwischen einem C2c2-guideRNA-Komplex und einer Target-Nukleinsäure und dergleichen). Während in einem Zustand nicht-kovalenter Wechselwirkung die Makromoleküle als „zugeordnet“ oder „wechselwirkend“ oder „bindend“ bezeichnet werden (wenn beispielsweise ein Molekül X mit einem Molekül Y wechselwirken soll, bedeutet dies, dass das Molekül X an das Y Molekül auf nichtkovalente Weise bindet). Nicht alle Komponenten einer Bindungswechselwirkung müssen sequenzspezifisch sein (z.B. Kontakte mit Phosphatresten in einem DNA-Rückgrat), aber einige Teile einer Bindungswechselwirkung können sequenzspezifisch sein. Bindungswechselwirkungen sind im allgemeinen durch eine Dissoziationskonstante (Kd ) von weniger als 10-6 M, weniger als 10-7 M, weniger als 10-8 M, weniger als 10-9 M, weniger als 10-10 M, weniger als 10-11 M, weniger als 10-12 M, weniger als 10-13 M, weniger als 10-14 M oder weniger als 10-15 M gekennzeichnet. „Affinität“ bezieht sich auf die Stärke der Bindung, wobei eine erhöhte Bindungsaffinität mit einem niedrigeren Kd korreliert ist.
  • Mit „Bindungsdomäne“ ist eine Proteindomäne gemeint, die in der Lage ist, nicht-kovalent an ein anderes Molekül zu binden. Eine Bindungsdomäne kann beispielsweise an ein RNA-Molekül (eine RNA-Bindungsdomäne) und/oder ein Proteinmolekül (eine Proteinbindungsdomäne) binden. Im Falle eines Proteins mit einer Proteinbindungsdomäne kann es in einigen Fällen an sich selbst binden (um Homodimere, Homotrimere usw. zu bilden) und/oder es kann an eine oder mehrere Regionen eines anderen Proteins oder anderer Proteine binden.
  • Der Ausdruck „konservative Aminosäuresubstitution“ bezieht sich auf die Austauschbarkeit von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten in Proteinen. Zum Beispiel besteht eine Gruppe von Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten aus Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin; eine Gruppe von Aminosäuren mit aliphatisch-Hydroxyl-Seitenketten besteht aus Serin und Threonin; eine Gruppe von Aminosäuren mit Amidhaltigen Seitenketten besteht aus Asparagin und Glutamin; eine Gruppe von Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten besteht aus Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan; eine Gruppe von Aminosäuren mit basischen Seitenketten besteht aus Lysin, Arginin und Histidin; eine Gruppe von Aminosäuren mit sauren Seitenketten besteht aus Glutamat und Aspartat; und eine Gruppe von Aminosäuren mit Schwefel-enthaltenden Seitenketten besteht aus Cystein und Methionin. Beispielhafte konservative Aminosäuresubstitutionsgruppen sind: Valin-Leucin-Isoleucin, Phenylalanin-Tyrosin, Lysin-Arginin, Alanin-Valin-Glycin und Asparagin-Glutamin.
  • Ein Polynukleotid oder Polypeptid hat eine gewisse „Sequenzidentität“ zu einem anderen Polynukleotid oder Polypeptid, was bedeutet, dass, wenn sie ausgerichtet sind, der Prozentsatz an Basen oder Aminosäuren der gleiche und in derselben relativen Position ist, wenn die zwei Sequenzen verglichen werden. Die Sequenzidentität kann auf verschiedene Arten bestimmt werden. Zur Bestimmung der Sequenzidentität können Sequenzen unter Verwendung verschiedener Verfahren und Computerprogramme (z.B. BLAST, T-COFFEE, MUSCLE, MAFFT, Phyre2 usw.) ausgerichtet werden, die über das World Wide Web auf Websites einschließlich ncbi.nlm.nili.gov/BLAST, ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/, ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/, mafft.cbrc.jp/alignment/software/, http://www.sbg.bio. ic.ac.uk/~phyre2/ verfügbar sind. Siehe z.B. Altschul et al. (1990), J. Mol. Bio. 215:403-10.
  • Eine DNA-Sequenz, die eine bestimmte RNA „codiert“, ist eine DNA-Nukleinsäuresequenz, die in RNA transkribiert wird. Ein DNA-Polynukleotid kann eine RNA (mRNA) kodieren, die in Protein translatiert wird, oder ein DNA-Polynukleotid kann eine RNA kodieren, die nicht in Protein translatiert wird (z.B. tRNA, rRNA, microRNA (miRNA), eine „nicht kodierende“ RNA (ncRNA), eine C2c2-guideRNA, usw.).
  • Die Begriffe „regulatorische DNA-Sequenzen“, „Kontrollelemente“ und „regulatorische Elemente“, die hierin austauschbar verwendet werden, beziehen sich auf Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen, wie Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale, Terminatoren, Proteindegradationssignale und dergleichen, welche die Transkription einer nicht-kodierenden Sequenz (z.B. Cas9-guideRNA) oder einer kodierenden Sequenz (z.B. Cas9-Protein) bereitstellen und/oder die Translation eines kodierten Polypeptids regulieren.
  • Wie hierin verwendet, ist eine „Promotorsequenz“ eine DNA-regulatorische Region, die in der Lage ist, RNA-Polymerase zu binden und die Transkription einer stromabwärtigen (3'-Richtung) codierenden oder nicht-codierenden Sequenz zu initiieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus durch die Transkriptionsinitiationsstelle begrenzt und erstreckt sich stromaufwärts (5'-Richtung), um die minimale Anzahl von Basen oder Elementen zu umfassen, die notwendig sind, um die Transkription in über dem Hintergrund nachweisbaren Niveaus zu initiieren. Innerhalb der Promotorsequenz wird eine Transkriptionsinitiationsstelle gefunden, ebenso wie Proteinbindungsdomänen, die für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren enthalten oft, aber nicht immer, „TATA“-Boxen und „CAT“-Boxen. Verschiedene Promotoren, einschließlich induzierbarer Promotoren, können verwendet werden, um die verschiedenen Vektoren der vorliegenden Erfindung zu steuern.
  • Der Ausdruck „natürlich vorkommend“ oder „unmodifiziert“ oder „Wildtyp“, wie er hierin für eine Nukleinsäure, ein Polypeptid, eine Zelle oder einen Organismus verwendet wird, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, ein Polypeptid, eine Zelle oder einen Organismus, welche in der Natur gefunden werden. Zum Beispiel ist eine Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz, die in einem Organismus (einschließlich Viren) vorhanden ist, die aus einer Quelle in der Natur isoliert werden kann und die nicht absichtlich von Menschen im Labor modifiziert wurde, ein Wildtyp (und kommt natürlich vor).
  • „Rekombinant‟, wie hier verwendet, bedeutet, dass eine bestimmte Nukleinsäure (DNA oder RNA) Produkt verschiedener Kombinationen von Klonierungs-, Restriktions-, Polymerasekettenreaktions- (PCR) und/oder Ligationsschritten, die zu einem Konstrukt mit einer strukturellen codierenden oder nichtcodierenden Sequenz führen, die von endogenen Nukleinsäuren, die in natürlichen Systemen gefunden werden, unterscheidbar ist. DNA-Sequenzen, die Polypeptide codieren, können aus cDNA-Fragmenten oder aus einer Reihe synthetischer Oligonukleotide zusammengesetzt werden, um eine synthetische Nukleinsäure bereitzustellen, die aus einer in einer Zelle oder in einem zellfreien Transkriptions- und Translationssystem enthaltenen rekombinanten Transkriptionseinheit exprimiert werden kann. Genomische DNA, die die relevanten Sequenzen umfasst, kann auch bei der Bildung eines rekombinanten Gens oder einer Transkriptionseinheit verwendet werden. Sequenzen von nicht-translatierter DNA können 5' oder 3' von dem offenen Leserahmen vorhanden sein, wobei solche Sequenzen die Manipulation oder Expression der codierenden Regionen nicht stören und tatsächlich die Produktion eines gewünschten Produkts durch verschiedene Mechanismen modulieren können (siehe „DNA-regulatorische Sequenzen“, unten). Alternativ können DNA-Sequenzen, die RNA (z.B. C2c2-guideRNA) codieren, die nicht translatiert wird, auch als rekombinant betrachtet werden. Somit bezieht sich der Ausdruck „rekombinante“ Nukleinsäure beispielsweise auf eine solche, die nicht natürlich vorkommt, welche z.B. durch die künstliche Kombination von zwei ansonsten getrennten Sequenzsegmenten durch menschliche Intervention hergestellt wird. Diese künstliche Kombination wird oft entweder durch chemische Synthese oder durch künstliche Manipulation von isolierten Segmenten von Nukleinsäuren, z.B. durch Gentechnik, erreicht. Dies wird üblicherweise durchgeführt, um ein Codon durch ein Codon zu ersetzen, das dieselbe Aminosäure, eine konservative Aminosäure oder eine nicht-konservative Aminosäure codiert. Alternativ wird es durchgeführt, um Nukleinsäuresegmente mit gewünschten Funktionen zusammenzufügen, um eine gewünschte Kombination von Funktionen zu erzeugen. Diese künstliche Kombination wird oft entweder durch chemische Synthese oder durch künstliche Manipulation von isolierten Segmenten von Nukleinsäuren, z.B. durch Gentechnologie, erreicht. Wenn ein rekombinantes Polynukleotid ein Polypeptid codiert, kann die Sequenz des codierten Polypeptids natürlich vorkommen („Wildtyp“) oder kann eine Variante (z.B. eine Mutante) der natürlich vorkommenden Sequenz sein. So bezieht sich der Begriff „rekombinantes“ Polypeptid nicht notwendigerweise auf ein Polypeptid, dessen Sequenz nicht natürlich auftritt. Stattdessen wird ein „rekombinantes“ Polypeptid durch eine rekombinante DNA-Sequenz codiert, aber die Sequenz des Polypeptids kann natürlich vorkommen („Wildtyp“) oder nicht natürlich vorkommend sein (z.B. eine Variante, eine Mutante usw.). Somit ist ein „rekombinantes“ Polypeptid das Ergebnis einer menschlichen Intervention, kann jedoch eine natürlich vorkommende Aminosäuresequenz sein.
  • Ein „Vektor“ oder „Expressionsvektor“ ist ein Replikon, wie ein Plasmid, Phage, Virus oder Cosmid, an das ein anderes DNA-Segment, d.h. „Insert“, eingesetzt werden kann, um die Replikation des angehängten Segments in einer Zelle zu bewirken.
  • Eine „Expressionskassette“ umfasst eine DNA-codierende Sequenz, die funktionell mit einem Promotor verbunden ist. „Funktionsfähig verbunden“ bezieht sich auf eine Gegenüberstellung, bei der die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die es ihnen ermöglicht, in ihrer beabsichtigten Weise zu funktionieren. Zum Beispiel ist ein Promotor funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz verbunden, wenn der Promotor ihre Transkription oder Expression beeinflusst.
  • Die Begriffe „rekombinanter Expressionsvektor“ oder „DNA-Konstrukt“ werden hierin austauschbar verwendet, um sich auf ein DNA-Molekül zu beziehen, das einen Vektor und ein Insert umfasst. Rekombinante Expressionsvektoren werden üblicherweise zum Zweck der Expression und/oder Ausbreitung der Insertion(en) oder zur Konstruktion anderer rekombinanter Nukleotidsequenzen erzeugt. Das eine oder die mehreren Inserts können mit einer Promotorsequenz funktionell oder nicht funktionell und mit DNA-Regulationssequenzen funktionell oder nicht funktionell verbunden sein.
  • Jede gegebene Komponente oder Kombination von Komponenten kann nicht markiert sein oder kann nachweisbar mit einer Markierungseinheit markiert sein. In einigen Fällen, wenn zwei oder mehr Komponenten markiert sind, können sie mit Markierungselementen markiert werden, die voneinander unterscheidbar sind.
  • Allgemeine Verfahren in der molekularen und zellulären Biochemie können in solchen Standard-Lehrbüchern wie die Folgenden gefunden werden: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3. Ausgabe (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4. Ausgabe (Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al., Hrsg., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy, Hrsg., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits Hrsg., Academic Press 1997); und Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Handleiths, John Wiley & Sons, 1998), deren Offenbarungen hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Bevor die vorliegende Erfindung weiter beschrieben wird, ist anzumerken, dass diese Erfindung nicht auf bestimmte beschriebene Ausführungsformen beschränkt ist, da diese offensichtlich variieren können. Es versteht sich auch, dass die hierin verwendete Terminologie nur zum Zwecke der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht einschränkend sein soll, da der Umfang der vorliegenden Erfindung nur durch die beigefügten Ansprüche begrenzt wird.
  • Wenn ein Bereich von Werten angegeben wird, ist es so zu verstehen, dass jeder dazwischenliegende Wert bis zum Zehntel der Einheit der unteren Grenze eingeschlossen ist, außer wenn der Kontext eindeutig etwas anderes vorschreibt, zwischen der oberen und unteren Grenze dieses Bereichs und dass jeder andere angegebene oder dazwischenliegende Wert im in der Erfindung angegebenen Bereich eingeschlossen ist. Die oberen und unteren Grenzen dieser kleineren Bereiche können unabhängig in diesen kleineren Bereichen enthalten sein und sind ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen, vorbehaltlich einer spezifisch ausgeschlossenen Grenze in dem angegebenen Bereich. Wenn der angegebene Bereich eine oder beide Grenzen enthält, sind Bereiche, die eine oder beide der eingeschlossenen Grenzen ausschließen, ebenfalls in der Erfindung enthalten.
  • Sofern nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise von dem Fachmann verstanden werden. Obwohl beliebige Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, auch bei der Durchführung oder dem Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden nun die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Alle hier erwähnten Veröffentlichungen sind hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, um die Verfahren und/oder Materialien zu offenbaren und zu beschreiben, in Verbindung mit denen die Veröffentlichungen zitiert werden.
  • Es ist zu beachten, dass, wie hierin und in den anliegenden Ansprüchen verwendet, die Singularformen „ein“, „eine“ und „der“, „die“, „das“ Pluralbezüge enthalten, sofern der Zusammenhang nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt. So umfasst z.B. die Bezugnahme auf „ein Protein“ eine Mehrzahl solcher Proteine und der Bezug auf „die guideRNA“ schließt die Bezugnahme auf eine oder mehrere solcher guideRNAs und Äquivalente davon ein, die dem Fachmann bekannt sind, und so weiter. Es wird ferner darauf hingewiesen, dass die Ansprüche so formuliert werden können, dass sie jedes optionale Element ausschließen. Als solche soll diese Aussage als eine Vorlage für die Verwendung einer solchen ausschließenden Terminologie wie „ausschließlich“, „nur“ und dergleichen in Verbindung mit der Aufzählung von Anspruchselementen oder der Verwendung einer „negativen“ Beschränkung dienen.
  • Es ist zu beachten, dass bestimmte Merkmale der Erfindung, die der Klarheit halber im Zusammenhang mit getrennten Ausführungsformen beschrieben sind, auch in Kombination in einer einzigen Ausführungsform bereitgestellt werden können. Umgekehrt können verschiedene Merkmale der Erfindung, die der Kürze halber im Zusammenhang mit einer einzelnen Ausführungsform beschrieben werden, auch separat oder in irgendeiner geeigneten Unterkombination bereitgestellt werden. Alle Kombinationen der Ausführungsformen, die zu der Erfindung gehören, werden von der vorliegenden Erfindung insbesondere umfasst und hierin offenbart, als ob jede Kombination individuell und explizit offenbart wäre. Zusätzlich werden alle Unterkombinationen der verschiedenen Ausführungsformen und Elemente davon auch spezifisch von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen und hierin offenbart, so als ob jede einzelne Unterkombination hier einzeln und explizit offenbart wäre.
  • Die hierin besprochenen Veröffentlichungen werden nur für ihre Erfindung vor dem Anmeldedatum der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. Nichts hierin soll als ein Eingeständnis aufgefasst werden, dass die vorliegende Erfindung nicht berechtigt ist, einer solchen Veröffentlichung aufgrund einer früheren Erfindung vorauszugehen. Ferner können die angegebenen Veröffentlichungsdaten von den tatsächlichen Veröffentlichungsterminen abweichen, die unabhängig voneinander bestätigt werden müssen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Nachweisen einer einzelsträngigen Target-RNA bereit. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Spalten eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays in zwei oder mehr C2c2-guideRNAs bereit. Die vorliegende Erfindung stellt einen Kit zum Nachweisen einer Target-RNA in einer Probe bereit. Der Ausdruck „C2c2-guideRNA“ wird hierin austauschbar mit „Cas13a-guideRNA“ verwendet, und in einigen Fällen wird eine guideRNA als eine crRNA (z.B. „Cas13a-crRNA“) bezeichnet; der Begriff „C2c2-Protein“ (oder „C2c2-Polypeptid“) wird hier austauschbar mit „Cas1 3a-Protein“ (oder „Cas13a-Polypeptid“) verwendet.
  • VERFAHREN ZUM NACHWEISEN EINER EINZELSTRÄNGIGEN RNA
  • Es werden Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweisen einer einzelsträngigen Target-RNA bereitgestellt, wobei die Verfahren umfassen: (i) Inkontaktbringen einer Probe mit einer Mehrzahl von RNAs mit (a) einer C2c2-guideRNA, die mit der einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert, und (b) einem C2c2-Protein, das in der Probe vorhandene RNAs spaltet; und (ii) Messen eines durch die Spaltung erzeugten nachweisbaren Signals. Sobald ein spezifisches C2c2-Protein durch eine C2c2-guideRNA aktiviert wird, was auftritt, wenn die Probe eine einzelsträngige Target-RNA enthält, an die die guideRNA hybridisiert (d.h., die Probe schließt die einzelsträngige Target-RNA ein), wird das C2c2-Protein aktiviert und es wirkt als eine Endoribonuklease, die RNAs (einschließlich Non-Target-RNAs), die in der Probe vorhanden sind, nicht spezifisch spaltet. Wenn daher die einzelsträngige Target-RNA in der Probe vorliegt (z.B. in einigen Fällen oberhalb einer Grenzwert-Menge), ist das Ergebnis die Spaltung von RNA (einschließlich Non-Target-RNA) in der Probe, die unter Verwendung irgendeines geeigneten Verfahrens nachgewiesen werden (z.B. unter Verwendung einer markierten Nachweis-RNA). Der Kontaktierungsschritt wird im Allgemeinen in einer Zusammensetzung durchgeführt, die zweiwertige Metallionen umfasst. Der Kontaktierungsschritt kann in einer zellfreien Umgebung, z.B. außerhalb einer Zelle, durchgeführt werden. Der Kontaktierungsschritt kann innerhalb einer Zelle durchgeführt werden. Der Kontaktierungsschritt kann in einer Zelle in vitro durchgeführt werden. Der Kontaktierungsschritt kann in einer Zelle ex vivo durchgeführt werden. Der Kontaktierungsschritt kann in vivo in einer Zelle durchgeführt werden. In einigen Fällen wird die C2c2-guideRNA als RNA bereitgestellt; und das C2c2-Protein wird als Protein an sich bereitgestellt. In einigen Fällen wird die C2c2-guideRNA als DNA bereitgestellt, die für die guideRNA kodiert; und das C2c2-Protein wird als Protein an sich bereitgestellt. In einigen Fällen wird die C2c2-guideRNA als RNA bereitgestellt; und das C2c2-Protein wird als RNA bereitgestellt, die das C2c2-Protein codiert. In einigen Fällen wird die C2c2-guideRNA als DNA bereitgestellt, die für die guideRNA kodiert; und C2c2-Protein wird als RNA bereitgestellt, die das C2c2-Protein codiert. In einigen Fällen wird die C2c2-guideRNA als RNA bereitgestellt; und das C2c2-Protein wird als DNA bereitgestellt, die eine Nukleotidsequenz, die das C2c2-Protein codiert. In einigen Fällen wird die C2c2-guideRNA als DNA bereitgestellt, die für die guideRNA kodiert; und das C2c2-Protein wird als DNA bereitgestellt, die eine Nukleotidsequenz, die das C2c2-Protein codiert. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung einen im Wesentlichen gleichzeitigen Nachweis von zwei unterschiedlichen Target-RNAs (einer ersten einzelsträngigen Target-RNA und einer zweiten einzelsträngigen Target-RNA) in einer Probe.
  • In einigen Fällen können mindestens zwei (z.B. mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5 oder mindestens 6) C2c2 RNAs bereitgestellt werden, indem ein Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array verwendet wird, die durch das C2c2-Protein in einzelne („reife“) guideRNAs gespalten werden kann; die Spaltung einer Vorläufer-C2c2-guideRNA ist unabhängig davon, ob das C2c2-Protein intakte HEPN1- und/oder HEPN2-Domänen aufweist. Somit werden auch Verfahren zum Spalten eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays in zwei oder mehr C2c2-guideRNAs bereitgestellt. Somit kann ein C2c2-guideRNA-Array mehr als eine Guide-Sequenz enthalten. In einigen Fällen kann eine hier gegenständliche C2c2-guideRNA einen Handle aus einer Vorläufer-crRNA umfassen, muss jedoch nicht notwendigerweise mehrere Guide-Sequenzen enthalten. In einigen Fällen fehlt dem C2c2-Protein eine katalytisch aktive HEPN1 -Domäne und/oder es fehlt eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne. Der Kontaktierungsschritt kann in einer zellfreien Umgebung, z.B. außerhalb einer Zelle, durchgeführt werden. Der Kontaktierungsschritt kann innerhalb einer Zelle durchgeführt werden. Der Kontaktierungsschritt kann in einer Zelle in vitro durchgeführt werden. Der Kontaktierungsschritt kann in einer Zelle ex vivo durchgeführt werden. Der Kontaktierungsschritt kann in vivo in einer Zelle durchgeführt werden.
  • In einigen Fällen (z.B. beim Inkontaktbringen mit einer C2c2-guideRNA und einem C2c2-Protein, beim Inkontaktbringen mit einem Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array und einem C2c2-Protein und dergleichen) wird die Probe für maximal 2 h (z.B. maximal 1,5 h, maximal 1 h, maximal 40 min, maximal 30 min, maximal 20 min, maximal 10 min, maximal 5 min oder maximal 1 min) vor dem Messschritt kontaktiert. Zum Beispiel wird die Probe in einigen Fällen vor dem Messschritt für maximal 40 min kontaktiert. In einigen Fällen wird die Probe vor dem Messschritt für maximal 20 min kontaktiert. In einigen Fällen wird die Probe vor dem Messschritt für maximal 10 min kontaktiert. In einigen Fällen wird die Probe vor dem Messschritt für maximal 5 min kontaktiert. In einigen Fällen wird die Probe vor dem Messschritt für maximal 1 min kontaktiert. In einigen Fällen wird die Probe 50 s bis 60 s vor dem Messschritt kontaktiert. In einigen Fällen wird die Probe 40 s bis 50 s vor dem Messschritt kontaktiert. In einigen Fällen wird die Probe 30 s bis 40 s vor dem Messschritt kontaktiert. In einigen Fällen wird die Probe 20 s bis 30 s vor dem Messschritt kontaktiert. In einigen Fällen wird die Probe 10 s bis 20 s vor dem Messschritt kontaktiert.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zum Nachweisen einer einzelsträngigen RNA in einer Probe bereit, welche eine Mehrzahl von RNAs (z.B. umfassend eine Target-RNA und eine Mehrzahl von Non-Target-RNAs) umfasst. In einigen Fällen umfassen die Verfahren: a) Inkontaktbringen der Probe mit: (i) einer C2c2-guideRNA, die mit der einzelsträngigen Target-RNA hybridiert, und (ii) einem C2c2-Protein, das die in der Probe vorhandene RNAs spaltet; und b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch C2c2-Protein-vermittelte RNA-Spaltung erzeugt wird. In einigen Fällen umfassen die Verfahren: a) Inkontaktbringen der Probe mit: i) einem Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array, umfassend zwei oder mehr C2c2-guideRNAs, von denen jede eine andere Guide-Sequenz aufweist; und (ii) ein C2c2-Protein, das den Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array in einzelne C2c2-guideRNAs spaltet und auch RNAs der Probe spaltet; und b) Messen eines erfassbaren Signals, das durch C2c2-Protein-vermittelte RNA-Spaltung erzeugt wird. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung einen im Wesentlichen gleichzeitigen Nachweis von zwei unterschiedlichen Target-RNAs (einer ersten einzelsträngigen Target-RNA und einer zweiten einzelsträngigen Target-RNA) in einer Probe.
  • Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen einer einzelsträngigen RNA (einer einzelsträngigen Target-RNA) in einer Probe, die eine Mehrzahl von RNAs (einschließlich der einzelsträngigen Target-RNA und einer Mehrzahl von Non-Target-RNAs) umfasst, kann einzelsträngige Target-RNA mit einem hohen Grad an Empfindlichkeit nachweisen. In einigen Fällen kann ein Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine einzelsträngige Target-RNA nachzuweisen, die in einer Probe vorliegt, die eine Mehrzahl von RNAs (einschließlich der einzelsträngigen Target-RNA und einer Mehrzahl von Non-Target-RNAs) umfasst, wobei die einzelsträngige Target-RNA in einer oder mehreren Kopien pro 107 Non-Target-RNAs vorliegt (z.B. eine oder mehrere Kopien pro 106 Non-Target-RNAs, eine oder mehrere Kopien pro 105 Non-Target-RNAs, eine oder mehrere Kopien pro 104 Non-Target-RNAs, eine oder mehrere Kopien pro 103 Non-Target-RNAs, eine oder mehrere Kopien pro 102 Non-Target-RNAs, eine oder mehrere Kopien pro 50 Non-Target-RNAs, eine oder mehrere Kopien pro 20 Non-Target-RNAs, eine oder mehrere Kopien pro 10 Non-Target-RNAs oder eine oder mehrere Kopien pro 5 Non-Target-RNAs).
  • In einigen Fällen kann ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine einzelsträngige Target-RNA in einer Probe nachweisen, die eine Mehrzahl von RNAs umfasst (einschließlich der einzelsträngigen Target-RNA und einer Mehrzahl von Non-Target-RNAs), wobei die einzelsträngige Target-RNA in einer Kopie pro 107 Non-Target-RNAs bis zu einer Kopie pro 10 Non-Target-RNAs vorhanden ist (z.B. von 1 Kopie pro 107 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 102 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 107 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 103 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 107 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 104 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 107 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 105 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 107 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 106 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 106 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 10 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 106 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 102 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 106 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 103 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 106 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 104 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 106 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 105 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 105 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 10 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 105 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 102 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 105 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 103 Non-Target-RNAs oder von 1 Kopie pro 105 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 104 Non-Target-RNAs).
  • In einigen Fällen kann ein Verfahren der vorliegenden Erfindung eine einzelsträngige Target-RNA in einer Probe nachweisen, die eine Mehrzahl von RNAs umfasst (einschließlich der einzelsträngigen Target-RNA und einer Mehrzahl von Non-Target-RNAs), wobei die einzelsträngige Target-RNA von einer Kopie pro 107 Non-Target-RNAs bis einer Kopie pro 100 Non-Target-RNAs vorhanden ist (z.B. von 1 Kopie pro 107 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 102 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 107 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 103 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 107 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 104 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 107 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 105 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 107 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 106 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 106 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 102 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 106 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 102 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 106 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 103 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 106 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 104 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 106 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 105 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 105 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 102 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 105 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 102 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 105 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 103 Non-Target-RNAs oder von 1 Kopie pro 105 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 104 Non-Target-RNAs).
  • In einigen Fällen beträgt die Nachweisgrenze für ein Verfahren zum Nachweisen einer einzelsträngigen Target-RNA in einer Probe 10 nM oder weniger. Der Ausdruck „Nachweisgrenze“ wird hierin verwendet, um die minimale Menge an Target-RNA zu beschreiben, die in einer Probe vorhanden sein muss, damit der Nachweis stattfindet. Wenn als ein veranschaulichendes Beispiel ein Nachweisgrenzwert 10 nM ist, dann kann ein Signal detektiert werden, wenn eine Target-RNA in der Probe in einer Konzentration von 10 nM oder mehr vorhanden ist. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 5 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 1 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 0,5 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 0,1 nM oder weniger auf. In einigen Fällen hat ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 0,05 nM oder weniger. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 0,01 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 0,005 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 0,001 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 0,0005 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 0,0001 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 0,00005 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 0,00001 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 10 pM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 1 pM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 500 fM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 250 fM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 100 fM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert von 50 fM oder weniger auf.
  • In einigen Fällen liegt die Nachweisgrenze (zum Nachweisen der einzelsträngigen Target-RNA in einem vorliegenden Verfahren) in einem Bereich von 500 fM bis 1 nM (z.B. von 500 fM bis 500 pM, von 500 fM bis 200 pM, von 500 fM bis 100 pM, von 500 fM bis 10 pM, von 500 fM bis 1 pM, von 800 fM bis 1 nM, von 800 fM bis 500 pM, von 800 fM bis 200 pM, von 800 fM bis 100 pM, von 800 fM bis 10 pM, von 800 fM bis 1 pM, von 1 pM bis 1 nM, von 1 pM bis 500 pM, von 1 pM bis 200 pM, von 1 pM bis 100 pM oder von 1 pM bis 10 pM) (wobei sich die Konzentration auf die Grenzkonzentration der Target-RNA bezieht, bei der die Target-RNA nachgewiesen werden kann). In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert in einem Bereich von 800 fM bis 100 pM auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert in einem Bereich von 1 pM bis 10 pM auf. In einigen Fällen hat ein Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Nachweisgrenzwert in einem Bereich von 10 fM bis 500 fM, z.B. von 10 fM bis 50 fM, von 50 fM bis 100 fM, von 100 fM bis 250 fM oder von 250 fM bis 500 fM.
  • In einigen Fällen liegt die minimale Konzentration, bei der eine einzelsträngige Target-RNA in einer Probe nachgewiesen werden kann, in einem Bereich von 500 fM bis 1 nM (z.B. 500 fM bis 500 pM, 500 fM bis 200 pM, 500) fM bis 100 pM, von 500 fM bis 10 pM, von 500 fM bis 1 pM, von 800 fM bis 1 nM, von 800 fM bis 500 pM, von 800 fM bis 200 pM, von 800 fM bis 100 pM, von 800 fM bis 10 pM, von 800 fM bis 1 pM, von 1 pM bis 1 nM, von 1 pM bis 500 pM, von 1 pM bis 200 pM, von 1 pM bis 100 pM oder von 1 pM bis 10 pM). In einigen Fällen liegt die minimale Konzentration, bei der eine einzelsträngige Target-RNA in einer Probe nachgewiesen werden kann, in einem Bereich von 800 fM bis 100 pM. In einigen Fällen liegt die minimale Konzentration, bei der eine einzelsträngige Target-RNA in einer Probe nachgewiesen werden kann, in einem Bereich von 1 pM bis 10 pM.
  • In einigen Fällen kann ein Verfahren der vorliegenden Erfindung eine einzelsträngige Target-RNA nachweisen, die in einer Probe vorliegt, die eine Mehrzahl von RNAs umfasst (einschließlich der einzelsträngigen Target-RNA und einer Mehrzahl von Non-Target-RNAs), wobei die einzelsträngige Target-RNA in einer Konzentration von nur 500 fM (z.B. 800 fM, bis 1 pM, 10 pM oder 100 pM). In einigen Fällen kann ein Verfahren der vorliegenden Erfindung eine einzelsträngige Target-RNA nachweisen, die in einer Probe vorliegt, die eine Mehrzahl von RNAs umfasst (einschließlich der einzelsträngigen Target-RNA und einer Mehrzahl von Non-Target-RNAs), wobei die einzelsträngige Target-RNA in einer Konzentration von nur 1 pM vorliegt.
  • In einigen Fällen kann ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eine einzelsträngige Target-RNA nachweisen, die in einer Probe vorliegt, die eine Mehrzahl von RNAs umfasst (einschließlich der einzelsträngigen Target-RNA und einer Mehrzahl von Non-Target-RNAs), wobei die einzelsträngige Target-RNA in einer Konzentration von nur 500 fM (z.B. 800 fM, bis 1 pM, bis 10 pM oder bis 100 pM), und wobei die Probe vor dem Messschritt 60 Minuten oder weniger kontaktiert wird (z.B. in einigen Fällen 40 Minuten oder weniger). In einigen Fällen kann ein Verfahren der vorliegenden Erfindung eine einzelsträngige Target-RNA nachweisen, die in einer Probe vorliegt, die eine Mehrzahl von RNAs umfasst (einschließlich der einzelsträngigen Target-RNA und einer Mehrzahl von Non-Target-RNAs), wobei die einzelsträngige Target-RNA in einer Konzentration von nur 1 pM vorliegt und die Probe vor dem Messschritt 60 Minuten oder weniger kontaktiert wird (z.B. in einigen Fällen 40 Minuten oder weniger).
  • Zum Beispiel ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung in einigen Fällen den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 500 fM oder mehr vorhanden ist (z.B. 800 fM oder mehr, 1 pM oder mehr, 5 pM oder mehr, 10 pM oder mehr). In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 1 pM oder mehr vorhanden ist (z.B. 2 pM oder mehr, 5 pM oder mehr oder 8 pM oder mehr). In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 500 fM oder mehr (z.B. 1 pM oder mehr, 5 pM oder mehr, 10 pM oder mehr) vorhanden ist, wobei die Probe für 60 Minuten oder weniger vor dem Messschritt (z.B. in einigen Fällen 40 Minuten oder weniger) kontaktiert wird. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 1 pM oder mehr (z.B. 2 pM oder mehr 5 pM oder mehr oder 8 pM oder mehr) vorhanden ist, wobei die Probe 60 Minuten oder weniger vor dem Messschritt kontaktiert wird (z.B. in einigen Fällen 40 Minuten oder weniger).
  • In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 10 nM oder weniger vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 5 nM oder weniger vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 1 nM oder weniger vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 0,5 nM oder weniger vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 0,1 nM oder weniger vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 0,05 nM oder weniger vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 0,01 nM oder weniger vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 0,005 nM oder weniger vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 0,001 nM oder weniger vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 0,0005 nM oder weniger vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 0,0001 nM oder weniger vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 0,00005 nM oder weniger vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 0,00001 nM oder weniger vorhanden ist.
  • In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von 106 nM bis 1 nM, z.B. von 106 nM bis 5 × 106 nM, von 5 × 106 nM bis 10 nM, von 10 nM bis 5 × 10 nM, von 5 × 10 nM bis 10 nM, von 104 nM bis 5 × 10 nM, von 5 × 104 nM bis 103 nM, von 103 nM bis 5 × 103 nM, von 5 × 103 nM bis 102 nM, von 102 nM bis 5 × 10 nM, von 5 × 10 nM bis 0,1 nM, von 0,1 nM bis 0,5 nM, von 0,5 nM bis 1 nM, von 1 nM bis 5 nM oder von 5 nM bis 10 nM vorliegt.
  • In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von weniger als 10 nM vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von weniger als 5 nM vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von weniger als 1 nM vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von weniger als 0,5 nM vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von weniger als 0,1 nM vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von weniger als 0,05 nM vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von weniger als 0,01 nM vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von weniger als 0,005 nM vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von weniger als 0,001 nM vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von weniger als 0,0005 nM vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von weniger als 0,0001 nM vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von weniger als 0,00005 nM vorhanden ist. In einigen Fällen ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis einer Target-RNA, die in einer Probe in einer Konzentration von weniger als 0,00001 nM vorhanden ist.
  • In einigen Fällen kann ein Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Menge einer Target-RNA in einer Probe zu bestimmen (z.B. eine Probe, die die Target-RNA und eine Mehrzahl von Non-Target-RNAs umfasst). Das Bestimmen der Menge einer Target-RNA in einer Probe kann das Vergleichen der Höhe des nachweisbaren Signals, das von einer Testprobe erzeugt wird, mit der Höhe des nachweisbaren Signals, das von einer Referenzprobe erzeugt wird, umfassen. Das Bestimmen der Menge einer Target-RNA in einer Probe kann umfassen: Messen des nachweisbaren Signals, um eine Testmessung zu erzeugen; Messen eines nachweisbaren Signals, das von einer Referenzprobe erzeugt wird, um eine Referenzmessung zu erzeugen; und Vergleichen der Testmessung mit der Referenzmessung, um eine Menge an Target-RNA zu bestimmen, die in der Probe vorhanden ist.
  • Zum Beispiel umfasst in einigen Fällen ein Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Bestimmen der Menge einer Target-RNA in einer Probe: a) Inkontaktbringen der Probe (z.B. einer Probe, die die Target-RNA und eine Mehrzahl von Non-Target-RNAs umfasst) mit (i) einer C2c2-guideRNA, die mit der einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert, und (ii) einem C2c2-Protein, das in der Probe vorhandene RNAs spaltet; b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch C2c2-Protein-vermittelte RNA-Spaltung erzeugt wird, Erzeugen einer Testmessung; c) Messen eines nachweisbaren Signals, das von einer Referenzprobe erzeugt wird, um eine Referenzmessung zu erzeugen; und d) Vergleichen der Testmessung mit der Referenzmessung, um eine Menge an Target-RNA zu bestimmen, die in der Probe vorhanden ist.
  • Als ein anderes Beispiel umfasst in einigen Fällen ein Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Bestimmen der Menge einer Target-RNA in einer Probe: a) Inkontaktbringen der Probe (z.B. einer Probe, die die Target-RNA und eine Mehrzahl von Non-Target-RNAs umfasst) mit: i) einem Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array, die zwei oder mehr C2c2-guideRNAs umfasst, welche jeweils eine unterschiedliche Guide-Sequenz aufweisen; und (ii) ein C2c2-Protein, das den Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array in einzelne C2c2-guideRNAs spaltet und auch RNAs der Probe spaltet; b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch C2c2-Protein-vermittelte RNA-Spaltung erzeugt wird, Erzeugen einer Testmessung; c) Messen eines nachweisbaren Signals, das von jeder von zwei oder mehr Referenzproben erzeugt wird, um zwei oder mehr Referenzmessungen zu erzeugen; und d) Vergleichen der Testmessung mit den Referenzmessungen, um eine Menge an Target-RNA zu bestimmen, die in der Probe vorhanden ist.
  • Proben
  • Eine Probe umfasst eine Mehrzahl von Target-RNAs. Der Begriff „Mehrzahl“ wird hier so verwendet, dass er zwei oder mehr bedeutet. Somit enthält eine Probe in einigen Fällen zwei oder mehr (z.B. 3 oder mehr, 5 oder mehr, 10 oder mehr, 20 oder mehr, 50 oder mehr, 100 oder mehr, 500 oder mehr, 1.000 oder mehr oder 5.000 oder mehr) RNAs. Ein vorliegendes Verfahren kann als ein sehr empfindliches Verfahren zum Nachweisen einer einzelsträngigen Target-RNA verwendet werden, die in einer komplexen Mischung von RNA vorhanden ist. Daher enthält die Probe in einigen Fällen 5 oder mehr RNAs (z.B. 10 oder mehr, 20 oder mehr, 50 oder mehr, 100 oder mehr, 500 oder mehr, 1.000 oder mehr oder 5.000 oder mehr RNAs), die sich voneinander in der Sequenz unterscheiden. In einigen Fällen umfasst die Probe 10 oder mehr, 20 oder mehr, 50 oder mehr, 100 oder mehr, 500 oder mehr, 103 oder mehr, 5 × 103 oder mehr, 104 oder mehr, 5 × 104 oder mehr, 105 oder mehr, 5 × 105 oder mehr, 106 oder mehr, 5 × 106 oder mehr oder 107 oder mehr RNAs, die sich in der Sequenz voneinander unterscheiden. In einigen Fällen umfasst die Probe 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 500, 500 bis 103, 103 bis 5 × 103, 5 × 103 bis 104, 104 bis 5 × 104, 5 × 104 bis 105, 105 bis 5 × 105, 5 × 105 bis 106, 106 bis 5 × 106 oder 5 × 106 bis 107 oder mehr als 107 RNAs, die sich in der Sequenz voneinander unterscheiden. In einigen Fällen umfasst die Probe 5 bis 107 RNAs, die sich in der Sequenz voneinander unterscheiden (z.B. 5 bis 106, 5 bis 105, 5 bis 50.000, 5 bis 30.000, 10 bis 106, 10 bis 105, 10 bis 50.000, 10 bis 30.000, 20 bis 106, 20 bis 105, 20 bis 50.000 oder 20 bis 30.000 RNAs, die sich in der Sequenz voneinander unterscheiden). In einigen Fällen umfasst die Probe 5 bis 50.000 RNAs, die sich voneinander in der Sequenz unterscheiden (z.B. 5 bis 30.000, 10 bis 50.000 oder 10 bis 30.000 RNAs, die sich in der Sequenz voneinander unterscheiden). In einigen Fällen enthält die Probe 20 oder mehr RNAs, die sich in der Sequenz voneinander unterscheiden. In einigen Fällen umfasst die Probe RNAs aus einem Zelllysat (z.B. ein eukaryotisches Zelllysat, ein Säugerzelllysat, ein menschliches Zelllysat, ein prokaryotisches Zelllysat, ein Pflanzenzelllysat und dergleichen). Zum Beispiel enthält die Probe in einigen Fällen exprimierte RNAs aus einer Zelle, wie einer eukaryotischen Zelle, z.B. einer Säugerzelle, wie einer menschlichen Zelle.
  • Der Begriff „Probe“ wird hier verwendet, um jede Probe zu bezeichnen, die einzelsträngige Target-RNA enthält. Die Probe kann von irgendeiner Quelle stammen, z.B. kann die Probe eine synthetische Kombination von gereinigten RNAs sein; die Probe kann ein Zelllysat, ein RNA-angereichertes Zelllysat oder RNAs sein, die aus einem Zelllysat isoliert und/oder gereinigt wurden. Die Probe kann von einem Patienten stammen (z.B. zur Diagnostik). Die Probe kann aus permeabilisierten Zellen bestehen. Die Probe kann aus vernetzten Zellen stammen. Die Probe kann in Gewebeschnitten vorliegen. Die Probe kann aus Geweben bestehen, die durch Vernetzung hergestellt wurden, gefolgt von Delipidierung und Einstellung, um einen einheitlichen Brechungsindex zu erhalten. Beispiele der Gewebepräparation durch Vernetzung, gefolgt von Delipidierung und Einstellung, um einen gleichmäßigen Brechungsindex zu erzeugen, wurden z.B. in Shah et al., Development (2016) 143, 2862-2867, doi: 10.1242/dev.138560, beschrieben.
  • Eine „Probe“ kann eine einzelsträngige Target-RNA und eine Mehrzahl von Non-Target-RNAs einschließen. In einigen Fällen liegt die einzelsträngige Target-RNA in der Probe bei einer Kopie pro 10 Non-Target-RNAs, einer Kopie pro 20 Non-Target-RNAs, einer Kopie pro 25 Non-Target-RNAs, einer Kopie pro 50 Non-Target RNAs, einer Kopie pro 100 Non-Target-RNAs, einer Kopie pro 500 Non-Target-RNAs, einer Kopie pro 103 Non-Target-RNAs, einer Kopie pro 5 × 103 Non-Target-RNAs, einer Kopie pro 104 Non-Target-RNAs, einer Kopie pro 5 × 104 Non-Target-RNAs, einer Kopie pro 105 Non-Target-RNAs, einer Kopie pro 5 × 10 Non-Target-RNAs, einer Kopie pro 106 Non-Target-RNAs oder weniger als einer Kopie pro 106 Non-Target-RNAs vor. In einigen Fällen ist die einzelsträngige Target-RNA in der Probe von einer Kopie pro 10 Non-Target-RNAs bis zu einer Kopie pro 20 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 20 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 50 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 50 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 100 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 100 Non-Target-RNAs bis 1 Kopie pro 500 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 500 Non-Target-RNAs bis zu 1 Kopie pro 103 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 103 Non-Target-RNAs zu 1 Kopie pro 5 × 103 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 5 × 103 Non-Target-RNAs zu 1 Kopie pro 104 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 104 Non-Target-RNAs zu 1 Kopie pro 105 Non-Target-RNAs, von 1 Kopie pro 105 Non-Target-RNAs zu 1 Kopie pro 106 Non-Target-RNAs oder von 1 Kopie pro 106 Non-Target-RNAs zu 1 Kopie pro 107 Non-Target-RNAs vorhanden.
  • Geeignete Proben umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Blut, Serum, Plasma, Urin, Aspirat und Biopsieproben. Somit umfasst der Ausdruck „Probe“ in Bezug auf einen Patienten Blut und andere flüssige Proben biologischen Ursprungs, feste Gewebeproben wie eine Biopsieprobe oder Gewebekulturen oder davon abgeleitete Zellen und deren Nachkommenschaft. Die Definition umfasst auch Proben, die nach ihrer Beschaffung in irgendeiner Weise manipuliert wurden, z.B. durch Behandlung mit Reagenzien; gewaschen; oder Anreicherung für bestimmte Zellpopulationen, wie Krebszellen. Die Definition umfasst auch Proben, die für bestimmte Arten von Molekülen, z.B. RNAs. Der Begriff „Probe“ umfasst biologische Proben, wie eine klinische Probe, wie Blut, Plasma, Serum, Aspirat, Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), und umfasst auch durch chirurgische Resektion erhaltenes Gewebe, durch Biopsie gewonnenes Gewebe, Zellen in Kultur, Zellüberstände, Zelllysate, Gewebeproben, Organe, Knochenmark und dergleichen. Eine „biologische Probe“ umfasst biologische Flüssigkeiten, die davon abgeleitet sind (z.B. Krebszellen, infizierte Zellen usw.), z.B. eine Probe, die RNAs umfasst, die aus solchen Zellen erhalten werden (z.B. ein Zelllysat oder ein anderer Zellextrakt, der RNAs umfasst).
  • Eine Probe kann aus einer Mehrzahl von Zellen, Geweben Organe oder zellfreien Flüssigkeiten bestehen. Geeignete Probenquellen umfassen eukaryotische Zellen, Bakterienzellen und Archaeenzellen. Geeignete Probenquellen umfassen einzellige Organismen und mehrzellige Organismen. Geeignete Probenquellen umfassen einzellige eukaryotische Organismen; eine Pflanze oder eine Pflanzenzelle; eine Algenzelle, z.B. Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens, C. agardas und dergleichen; eine Pilzzelle (z.B. eine Hefezelle); eine Tierzelle, ein Gewebe oder ein Organ; eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organ von einem wirbellosen Tier (z.B. Fruchtfliege, Nesseltier, Stachelhäuter, Nematode, ein Insekt, eine Arachnide usw.); eine Zelle, ein Gewebe, eine Flüssigkeit oder ein Organ von einem Wirbeltier (z.B. Fisch, Amphibie, Reptil, Vogel, Säugetier); eine Zelle, ein Gewebe, eine Flüssigkeit oder ein Organ von einem Säugetier (z.B. ein Mensch; ein nichtmenschlicher Primat; ein Huftier; eine Katze; ein Rind; ein Schaf; eine Ziege; usw.). Geeignete Probenquellen umfassen Nematoden, Protozoen und dergleichen. Geeignete Probenquellen umfassen Parasiten wie Helminthen, Malaria-Parasiten usw.
  • Geeignete Probenquellen umfassen eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus von irgendeinem der sechs Reiche, z.B. Bacteria (z.B. Eubakterien); Archaebacteria; Protista; Fungi; Plantae; und Animalia. Geeignete Probenquellen umfassen pflanzenähnliche Mitglieder der Gruppe der Protisten, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Algen (z.B. Grünalgen, Rotalgen, Glaukophyten, Cyanobakterien); pilzartige Mitglieder der Protisten, z.B. Schleimpilze, Wasserschimmel, usw.; tierische Mitglieder der Protisten, wie z.B. Flagellaten (z.B. Euglena), Amöboiden (z.B. Amöben), Sporozoen (z.B. Apicomplexa, Myxozoa, Mikrosporidien) und Ciliaten (z.B. Paramecium). Geeignete Probenquellen umfassen Mitglieder des Reichs der Pilze, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Mitglieder von irgendeinem der Stämme: Basidiomycota (Keulenpilze; z.B. Mitglieder von Agaricus, Amanita, Boletus, Cantherellus usw.); Ascomycota (Sac-Pilze, einschließlich z.B. Saccharomyces); Mycophycophyta (Flechten); Zygomycota (Konjugationspilz); und Deuteromycota. Zu geeigneten Probenquellen gehören Mitglieder des Reichs der Pflanzen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Mitglieder einer der folgenden Abteilungen: Bryophyta (z.B. Moose), Anthocerotophyta (z.B. Hornmoose), Hepatiophyta (z.B. Lebermoose), Lycophyta (z.B. Moosbüschel), Sphenophyta (z.B. Schachtelhalme), Psilophyta (z.B. Schneebesenfarne), Ophioglossophyta, Pterophyta (z.B. Farne), Cycadophyta, Gingkophyta, Pinophyta, Gnetophyta und Magnoliophyta (z.B. Blütenpflanzen). Geeignete Probenquellen umfassen Mitglieder des Reichs der Tiere, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Mitglieder eines der folgenden Stämme: Porifera (Schwämme); Placozoa; Orthonectida (Parasiten der Meerinvertebraten); Rhombozoa; Cnidaria (Korallen, Anemonen, Quallen, Meerfedern, Renilla Reniformis, Meereswespen); Ctenophora (Kammgelees); Platyhelminthes (Plattwürmer); Nemertina (Bandwürmer); Ngathostomulida (Kieferwürmer); Gastrotricha; Rotifera; Priapulida; Kinorhyncha; Loricifera; Acanthocephala; Entoprocta; Nemotoda; Nematomorpha; Cycliophora; Mollusca (Mollusken); Sipuncula (Erdnusswürmer); Annelida (segmentierte Würmer); Tardigrada (Wasserbären); Onychophora (Samtwürmer); Arthropoda (einschließlich der Subphyla: Chelicerata, Myriapoda, Hexapoda und Crustacea, wo die Chelicerata z.B. Arachniden, Merostomata und Pycnogonida, wo die Myriapoda z.B. Chilopoda (Tausendfüßer), Diplopoda (Tausendfüßer), Paropoda und Symphyla umfassen, wo die Hexapoda Insekten enthalten, und wo die Crustacea Garnelen, Krill, Seepocken usw. enthalten; Phoronida; Ektoprocta (Moostiere); Brachiopoda; Echinodermata (z.B. Seestern, Margeriten, Federsterne, Seeigel, Seegurken, Schlangensterne, Krokuskörbe usw.); Chaetognatha (Pfeilwürmer); Hemichordata (Eichelwürmer); und Chordata. Geeignete Mitglieder von Chordata schließen jedes Mitglied der folgenden Unterstämme ein: Urochordata (Seescheiden; einschließlich Ascidiacea, Thaliacea und Larvacea); Cephalochordata (Lanzetten); Myxini (Schleimaale); und Vertebrata, wobei Mitglieder von Vertebrata beispielsweise Mitglieder von Petromyzontida (Neunaugen), Chondrichthyces (Knorpelfische), Actinopterygii (Strahlenflosserfisch), Actinista (Coelocanth), Dipnoi (Lungenfisch), Reptilia (Reptilien, z.B. Schlangen, Alligatoren, Krokodile, Eidechsen usw.), Aves (Vögel) und Mammalia (Säugetiere) umfassen. Zu geeigneten Pflanzen gehören beliebige Monokotyledonen und beliebige Dikotyledonen.
  • Geeignete Quellen einer Probe umfassen Zellen, Flüssigkeit, Gewebe oder Organe, die aus einem Organismus entnommen werden; aus einer bestimmten Zelle oder Gruppe von Zellen, die aus einem Organismus isoliert sind; usw. Zum Beispiel, wenn der Organismus eine Pflanze ist, sind geeignete Quellen Xylem, das Phloem, die Knochenhaut, Blätter, Wurzeln usw. Wenn der Organismus ein Tier ist, umfassen geeignete Quellen bestimmte Gewebe (z.B. Lunge, Leber, Herz, Niere, Gehirn, Milz, Haut, fetales Gewebe usw.) oder einen bestimmten Zelltyp (z.B. neuronale Zellen, Epithelzellen, Endothelzellen, Astrozyten, Makrophagen, Gliazellen, Inselzellen, T-Lymphozyten, B-Lymphozyten usw.). In einigen Fällen ist die Quelle der Probe eine kranke Zelle, Flüssigkeit, Gewebe oder Organ. In einigen Fällen ist die Quelle der Probe eine normale (nicht-krankhafte) Zelle, Flüssigkeit, Gewebe oder Organ. In einigen Fällen ist die Quelle der Probe eine pathogen-infizierte Zelle, ein Gewebe oder ein Organ. Pathogene umfassen Viren, Pilze, Helminthen, Protozoen, Malaria-Parasiten, Plasmodium-Parasiten, Toxoplasma-Parasiten, Schistosoma-Parasiten und dergleichen. „Helminthen“ umfassen Spulwürmer, Herzwürmer und phytophage Nematoden (Nematoden), Saugwürmer (Trematoda), Acanthocephala und Bandwürmer (Cestoda). Protozoeninfektionen umfassen Infektionen von Giardia spp., Trichomonas spp., Afrikanische Trypanosomiasis, amöbische Dysenterie, Babesiose, balantidale Dysenterie, Chagas-Krankheit, Kokzidiose, Malaria und Toxoplasmose. Beispiele für Krankheitserreger wie Parasiten/Protozoen-Pathogene umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Trypanosoma cruzi und Toxoplasma gondii. Pilzpathogene umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis und Candida albicans. Pathogene Viren umfassen z.B. Immunschwächevirus (z.B. HIV); Influenza-Virus; Dengue; West-Nil-Virus; Herpes-Virus; Gelbfieber-Virus; Hepatitis-Virus C; Hepatitis-Virus A; Hepatitis-Virus B; Papillomavirus; und dergleichen. Zu Krankheitserregern gehören z.B. HIV, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus agalactiae, Methicillin-resistente Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pneumococcus, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Hemophilus influenzae B, Treponema pallidum, Lyme-Borreliose-Spirochäten, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium leprae, Brucella abortus, Tollwutvirus, Influenzavirus, Cytomegalovirus, Herpes simplex-Virus I, Herpes-simplex-Virus II, Humanserum parvo-like-Virus, Respiratory-Syncytial-Virus, Varicella-Zoster-Virus, Hepatitis-B-Virus Hepatitis-C-Virus, Masernvirus, Adenovirus, menschliche T-Zellleukämieviren, Epstein-Barr-Virus, Maus-Leukämie-Virus, Mumps-Virus, vesikuläres Stomatitis-Virus, Sindbis-Virus, lymphozytäres Choriomeningitis-Virus, Warzenvirus, Blauzungenvirus, Sendai-Virus, Katzenleukämievirus, Reovirus, Poliovirus, Simian-Virus 40, Maus-Mammatumorvirus, Dengue-Virus, Rötelnvirus, West-Nil-Virus, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Toxoplasma gondii, Trypanosoma raceli, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rhodesiense, Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum, Babesia bovis, Eimeria tenella, Onchocerca volvulus, Leishmania tropica, Mycobacterium tuberculosis, Trichinella spiralis, Theileria parva, Taenia hydatigena, Taenia ovis, Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Mesocestoides corti, Mycoplasma arthritidis, M. hyorhinis, M. orale, M. arginini, Acholeplasma laidlawii, M. salivarium und M. pneumoniae.
  • Target-RNA
  • Eine Target-RNA kann jede einzelsträngige RNA (ssRNA) sein. Beispiele umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, mRNA, rRNA, tRNA, nicht-kodierende RNA (ncRNA), lange nicht-kodierende RNA (IncRNA) und microRNA (miRNA). In einigen Fällen ist die Target-ssRNA mRNA. In einigen Fällen ist die einzelsträngige Target-Nukleinsäure ssRNA aus einem Virus (z.B. Zika-Virus, menschliches Immunschwächevirus, Influenzavirus und dergleichen). In einigen Fällen ist die einzelsträngige Target-Nukleinsäure ssRNA eines Parasiten. In einigen Fällen ist die einzelsträngige Target-Nukleinsäure ssRNA eines Bakteriums, z.B. eines pathogenen Bakteriums. Die Quelle der Target-RNA kann dieselbe sein wie die Quelle der RNA-Probe, wie oben beschrieben.
  • Messung eines nachweisbaren Signals
  • In einigen Fällen umfasst ein Verfahren der Erfindung einen Schritt des Messens (z.B. Messen eines nachweisbaren Signals, das durch C2c2-Protein-vermittelte RNA-Spaltung erzeugt wird). Da ein C2c2-Protein nach der Aktivierung Non-Target-RNA spaltet, was auftritt, wenn eine C2c2-guideRNA mit einer Target-RNA in Gegenwart eines C2c2-Proteins hybridisiert, kann ein nachweisbares Signal irgendein Signal sein, das erzeugt wird, wenn RNA gespalten wird. Zum Beispiel kann der Schritt des Messens in einigen Fällen einen oder mehrere der Folgenden einschließen: Nachweis auf der Basis von Goldnanopartikeln (siehe beispielsweise Xu et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2007; 46 (19): 3468-70; und Xia et Proc Natl Acad Sci US A. 15 Juni 2010; 107 (24): 10837-41), Fluoreszenzpolarisation, Kolloidphasenübergang/Dispersion (z.B. Baksh et al., Nature. 2004 Jan. 8; 427 (6970): 139-41), elektrochemische Detektion, halbleiterbasierte Detektion (z.B. Rothberg et al., Nature. 20 Juli 2011; 475 (7356): 348-52; z.B. könnte man eine Phosphatase verwenden, um eine pH-Änderung nach RNA-Spaltungsreaktionen, durch Öffnen von 2'-3'-cyclischen Phosphaten und durch Freisetzung von anorganischem Phosphat in Lösung zu erzeugen) und Nachweis einer markierten Nachweis-RNA (siehe unten für weitere Details) . Die Ausgabe solcher Erfassungsverfahren kann eine beliebige geeignete Ausgabe sein. Beispiele möglicher Ausgaben umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, ein gemessener Wert eines nachweisbaren Fluoreszenzsignals; eine visuelle Analyse von Banden auf einem Gel (z.B. Banden, die gespaltenes Produkt gegenüber ungespaltenem Substrat darstellen), ein visueller oder sensorischer Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Farbe (insbesondere Farbnachweisverfahren) und die Anwesenheit oder Abwesenheit (oder eine bestimmte Höhe) eines elektrischen Signals.
  • Die Messung kann in einigen Fällen quantitativ sein, z.B. in dem Sinne, dass die Höhe des detektierten Signals verwendet werden kann, um die Menge an Target-RNA zu bestimmen, die in der Probe vorhanden ist. Die Messung kann in einigen Fällen qualitativ qualitativ sein, z.B. in dem Sinne, dass die Anwesenheit oder Abwesenheit von nachweisbarem Signal die Anwesenheit oder Abwesenheit von Target-RNA anzeigen kann. In einigen Fällen ist ein nachweisbares Signal nicht vorhanden (z.B. über einem gegebenen Grenzwert), es sei denn, die Target-RNA(s) sind oberhalb einer bestimmten Grenzkonzentration vorhanden (siehe z.B. 5). In einigen Fällen kann die Nachweisgrenze durch Modifizieren der Menge an C2c2-Protein, guideRNA, Probenvolumen und/oder Nachweis-RNA (falls verwendet) titriert werden. Als solche kann z.B., wie für den Fachmann verständlich, eine Anzahl von Kontrollen verwendet werden, falls dies gewünscht wird, um eine oder mehrere Reaktionen einzurichten, die jeweils eingerichtet sind, um einen unterschiedlichen Grenzwert der Target-RNA nachzuweisen und somit könnte eine solche Reihe von Reaktionen verwendet werden, um die Menge an Target-RNA, die in einer Probe vorhanden ist, zu bestimmen (z.B. könnte man eine solche Reihe von Reaktionen verwenden, um zu bestimmen, dass eine Target-RNA in der Probe „in einer Konzentration von mindestens X“ vorhanden ist).
  • Markierte Nachweis-RNA
  • In einigen Fällen umfasst ein erfindungsgemäßes Verfahren das Inkontaktbringen einer Probe (z.B. einer Probe, die eine Target-RNA und eine Mehrzahl von Non-Target-RNAs umfasst) mit: i) einer markierten Nachweis-RNA; ii) einem C2c2-Protein; und iii) einer C2c2-guideRNA (oder Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array). Zum Beispiel umfasst ein Verfahren in einigen Fällen das Inkontaktbringen einer Probe mit einer markierten Nachweis-RNA, die ein Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar umfasst; das C2c2-Protein spaltet die markierte Nachweis-RNA, nachdem sie aktiviert wurde (durch Bindung an die C2c2-guideRNA im Zusammenhang mit der guideRNA, die an eine Target-RNA hybridisiert); und das nachweisbare Signal, das gemessen wird, wird durch das Fluoreszenz-emittierende Farbstoffpaar erzeugt. Zum Beispiel umfasst ein Verfahren in einigen Fällen das Inkontaktbringen einer Probe mit einer markierten Nachweis-RNA, die ein Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)-Paar oder ein Quencher/Fluor-Paar oder beide umfasst. In einigen Fällen umfasst ein erfindungsgemäßes Verfahren das Inkontaktbringen einer Probe mit einer markierten Nachweis-RNA, die ein FRET-Paar umfasst. In einigen Fällen umfasst ein Verfahren das Inkontaktbringen einer Probe mit einer markierten Nachweis-RNA, die ein Fluor/Quencher-Paar umfasst. Fluoreszenz emittierende Farbstoffpaare umfassen ein FRET-Paar oder ein Quencher/Fluor-Paar. In beiden Fällen eines FRET-Paars und eines Quencher/Fluor-Paars überlappt das Emissionsspektrum eines der Farbstoffe einen Bereich des Absorptionsspektrums des anderen Farbstoffs in dem Paar. Wie hierin verwendet, ist „Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar“ ein generischer Ausdruck, der verwendet wird, um sowohl ein „Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)-Paar“ als auch ein „Quencher/Fluor-Paar“ zu umfassen, wobei beide Begriffe unten detaillierter diskutiert werden. Der Ausdruck „Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar“ wird austauschbar mit dem Ausdruck „ein FRET-Paar und/oder ein Quencher/Fluor-Paar“ verwendet.
  • In einigen Fällen (z.B., wenn die Nachweis-RNA ein FRET-Paar enthält) erzeugt der markierte Nachweis-RNA vor ihrer Spaltung einen Wert des nachweisbaren Signals, und die Höhe des gemessenem nachweisbaren Signals wird reduziert, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird. In einigen Fällen erzeugt die markierte Nachweis-RNA ein erstes nachweisbares Signal vor der Spaltung (z.B. von einem FRET-Paar) und ein zweites nachweisbares Signal, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird (z.B. von einem Quencher/Fluor-Paar). Als solche umfasst die markierte Nachweis-RNA in einigen Fällen ein FRET-Paar und ein Quencher/Fluor-Paar.
  • In einigen Fällen umfasst die markierte Nachweis-RNA ein FRET-Paar. FRET ist ein Prozess, bei dem ein strahlungsloser Energietransfer von einem angeregten Fluorophor zu einem zweiten Chromophor in unmittelbarer Nähe stattfindet. Der Bereich, in dem die Energieübertragung stattfinden kann, ist auf ungefähr 10 Nanometer (100 Angström) begrenzt, und die Effizienz des Transfers ist extrem empfindlich gegenüber dem Trennungsabstand zwischen Fluorophoren. Der hier verwendete Ausdruck „FRET“ („Fluoreszenzresonanzenergietransfer“; auch als „Forster-Resonanz-Energietransfer“ bezeichnet) bezieht sich auf ein physikalisches Phänomen, bei dem ein Donorfluorophor und ein passender Akzeptorfluorophor so ausgewählt sind, dass das Emissionsspektrum des Donors das Anregungsspektrum des Akzeptors überlappt und ferner so ausgewählt wird, dass, wenn Donor und Akzeptor nahe beieinander liegen (normalerweise 10 nm oder weniger), die Anregung des Donors eine Anregung und Emission von dem Akzeptor verursacht, wobei ein Teil der Energie vom Donor zum Akzeptor über einen Quantenkopplungseffekt übergeht. Somit dient ein FRET-Signal als ein Näherungsmaß zwischen Donor und Akzeptor; nur wenn sie nahe beieinander sind, wird ein Signal erzeugt. Die FRET-Donoreinheit (z.B. Donorfluorophor) und die FRET-Akzeptoreinheit (z.B. Akzeptorfluorophor) werden hierin kollektiv als „FRET-Paar“ bezeichnet.
  • Das Donor-Akzeptor-Paar (eine FRET-Donoreinheit und eine FRET-Akzeptoreinheit) wird hierin als ein „FRET-Paar“ oder ein „Signal-FRET-Paar“ bezeichnet. In einigen Fällen enthält eine hier gegenständliche markierte Nachweis-RNA zwei Signalpartner (ein Signalpaar), wenn ein Signalpartner eine FRET-Donoreinheit und der andere Signalpartner eine FRET-Akzeptoreinheit ist. Ein Subjekt, das als Nachweis-RNA bezeichnet wird und ein solches FRET-Paar (eine FRET-Donoreinheit und eine FRET-Akzeptoreinheit) enthält, wird somit ein nachweisbares Signal (ein FRET-Signal) zeigen, wenn sich die Signalpartner in unmittelbarer Nähe befinden (z.B. wenn sie sich auf demselben RNA-Molekül befinden), während das Signal reduziert wird (oder fehlt), wenn die Partner getrennt sind (z.B. nach der Spaltung des RNA-Moleküls durch ein C2c2-Protein).
  • FRET-Donor- und -Akzeptoreinheiten (FRET-Paare) sind dem Fachmann bekannt und jedes geeignete FRET-Paar (z.B. jedes geeignete Donor- und Akzeptoreinheitspaar) kann verwendet werden. Beispiele für geeignete FRET-Paare schließen die in Tabelle 1 dargestellten ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Siehe auch: Bajar et al. Sensors (Basel). 14. September 2016; 16 (9); und Abraham et al. Plus eins. 3. August 2015; 10 (8):e0134436.
  • Tabelle 1. Beispiele für FRET-Paare (Donor- und Akzeptor-FRET-Einheiten)
    Donor Akzeptor
    Tryptophan Dansyl
    IAEDANS (1) DDPM (2)
    BFP DsRFP
    Dansyl Fluoreszin Isothiozyanat (FITC)
    Dansyl Octadecylrhodamin
    Zyan fluoreszierendes Protein (CFP) Grünes fluoreszierendes Protein (GFP)
    CF (3) Texas Red
    Fluoreszin Tetramethylrhodamine
    Cy3 Cy5
    GFP Gelbes fluoreszierendes Protein (YFP)
    BODIPY FL (4) BODIPY FL (4)
    Rhodamin 110 Cy3
    Rhodamin 6G Malachit Grün
    FITC Eosin Thiosemikarbazid
    B-Phycoerythrin Cy5
    Cy5 Cy5.5
    (1) 5-(2-Iodacetylaminoethyl)aminonaphthalin-1-sulfonsäure
    (2) N-(4-Dimethylamino-3,5-dinitrophenyl)maleinimid
    (3) Carboxyfluoreszin-Succinimidylester
    (4) 4,4-Difluor-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacen
  • In einigen Fällen wird ein nachweisbares Signal erzeugt, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird (z.B. enthält die markierte Nachweis-RNA in einigen Fällen ein Quencher/Fluor-Paar). Ein Signalpartner eines Signalquenching-Paares erzeugt ein nachweisbares Signal und der andere Signalpartner ist eine Quencher-Gruppe, die das nachweisbare Signal des ersten Signalpartners quencht (d.h. die Quencher-Gruppe quencht das Signal der Signal- Gruppe, so dass das Signal von der Signal- Gruppe reduziert (gequencht) wird, wenn die Signalpartner in der Nähe zueinander sind, z.B. wenn die Signalpartner des Signalpaares in nächster Nähe sind).
  • Zum Beispiel nimmt in einigen Fällen eine Höhe des nachweisbaren Signals zu, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird. Zum Beispiel wird in einigen Fällen das von einem Signalpartner (einer Signale-Gruppe) gezeigte Signal durch den anderen Signalpartner (eine Quencher-Signal-Gruppe) gequencht, z.B. wenn beide vor der Spaltung durch ein C2c2-Protein auf dem gleichen RNA-Molekül vorhanden sind. Ein solches Signalpaar wird hier als „Quencher/Fluor-Paar“, „Quencherpaar“ oder „Signalquencherpaar“ bezeichnet. Zum Beispiel ist in einigen Fällen ein Signalpartner (z.B. der erste Signalpartner) eine Signal-Gruppe, die ein nachweisbares Signal erzeugt, das durch den zweiten Signalpartner (z.B. eine Quencher-Gruppe) gequencht wird. Die Signalpartner eines solchen Quencher/Fluor-Paares erzeugen somit ein nachweisbares Signal, wenn die Partner getrennt werden (z.B. nach Spaltung der Nachweis-RNA durch ein C2c2-Protein), aber das Signal wird gequencht, wenn die Partner in enger Nachbarschaft sind (z.B. vor der Spaltung der Nachweis-RNA durch ein C2c2-Protein).
  • Eine Quencher-Gruppe kann ein Signal von der Signal-Gruppe (z.B. vor Abspaltung der Nachweis-RNA durch ein C2c2-Protein) in unterschiedlichem Ausmaß quenchen. In einigen Fällen quencht eine Quencher-Gruppe das Signal von der Signal-Gruppe, bei dem das Signal, das in Gegenwart der Quencher-Gruppe detektiert wird (wenn die Signalpartner nahe beieinander liegen) 95% oder weniger des in Abwesenheit der Quencher-Gruppe detektierten Signals beträgt (wenn die Signalpartner getrennt sind). Zum Beispiel kann in einigen Fällen das Signal, das in Gegenwart der Quencher-Gruppe detektiert wird, 90% oder weniger, 80% oder weniger, 70% oder weniger, 60% oder weniger, 50% oder weniger, 40% oder weniger, 30% oder weniger, 20% oder weniger, 15% oder weniger, 10% oder weniger oder 5% oder weniger des Signals betragen, das in Abwesenheit der Quencher-Gruppe nachgewiesen wurde. In einigen Fällen wird kein Signal (z.B. über dem Hintergrund) in Gegenwart der Quencher-Gruppe nachgewiesen.
  • In einigen Fällen ist das Signal, das in Abwesenheit der Quencher-Gruppe detektiert wird (wenn die Signalpartner getrennt sind) mindestens 1,2-fach größer (z.B. mindestens 1,3-fach, mindestens 1,5-fach, mindestens 1,7-fach, mindestens 2-fach) mindestens 2,5-fach, mindestens 3-fach, mindestens 3,5-fach, mindestens 4-fach, mindestens 5-fach, mindestens 7-fach, mindestens 10-fach, mindestens 20-fach oder mindestens 50-fach größer) als das in Gegenwart der Quencher-Gruppe detektierte Signal (wenn die Signalpartner nahe beieinander liegen.
  • In einigen Fällen ist die Signal-Gruppe eine Fluoreszenzmarkierung. In einigen solcher Fälle quencht die Quencher-Gruppe das Signal (das Lichtsignal) von der Fluoreszenzmarkierung (z.B. durch Absorbieren von Energie in den Emissionsspektren der Markierung). Wenn die Quencher-Gruppe nicht in der Nähe der Signal-Gruppe ist, ist somit die Emission (das Signal) von der Fluoreszenzmarkierung nachweisbar, da das Signal nicht durch die Quencher-Gruppe absorbiert wird. Jedes geeignete Donor-Akzeptor-Paar (Signal-Gruppe/Quencher-Gruppe-Paar) kann verwendet werden und viele geeignete Paare sind Stand der Technik.
  • In einigen Fällen absorbiert die Quencher-Gruppe Energie von der Signal-Gruppe (hierin auch als „nachweisbare Markierung“ bezeichnet) und emittiert dann ein Signal (z.B. Licht bei einer verschiedenen Wellenlänge). Somit ist in einigen Fällen die Quencher-Gruppe selbst eine Signal-Gruppe (z.B. kann eine Signal-Gruppe 6-Carboxyfluorescein sein, während die Quencher-Gruppe 6-Carboxytetramethylrhodamin sein kann), und in einigen solchen Fällen könnte das Paar auch ein FRET-Paar sein. In einigen Fällen ist eine Quencher-Gruppe ein dunkler Quencher. Ein dunkler Quencher kann Anregungsenergie absorbieren und die Energie auf andere Weise (z.B. als Wärme) abführen. Daher hat ein dunkler Quencher eine minimale bis keine eigene Fluoreszenz (emittiert keine Fluoreszenz). Beispiele für dunkle Quencher sind in den US-Patenten Nr. 8,822,673 und 8,586,718 ; US-Patentveröffentlichungen 20140378330, 20140349295 und 20140194611 ; und in den internationalen Patentanmeldungen WO200142505 und WO200186001 weiter beschrieben, die alle hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind.
  • Beispiele für fluoreszierende Markierungen umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, ein Alexa FluorⓇ-Farbstoff, ein ATTO-Farbstoff (z.B. ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12 ATTO Thio12, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxa12, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740), ein DyLight-Farbstoff, ein Cyaninfarbstoff (z.B. Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3b, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5), ein FluoProbes-Farbstoff, ein Sulfo-Cy-Farbstoff, ein Seta-Farbstoff, ein IRIS-Farbstoff, ein SeTau-Farbstozifikff, ein SRfluor-Farbstoff, ein Square Farbstoff, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Tetramethylrhodamin (TRITC), Texas Red, Oregon Green, Pacific Blue, Pacific Green, Pacific Orange, Quantum Dots und ein verankertes fluoreszierendes Protein.
  • In einigen Fällen ist eine nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung, ausgewählt aus: einem Alexa FluorⓇ-Farbstoff, einem ATTO-Farbstoff (z.B. ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Thio12, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxa12, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740), ein DyLight-Farbstoff, ein Cyaninfarbstoff (z.B. Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3b, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5), ein FluoProbes-Farbstoff, ein Sulfo-Cy-Farbstoff, ein Seta-Farbstoff, ein IRIS-Farbstoff, ein SeTau-Farbstoff, ein SRfluor-Farbstoff, ein Square-Farbstoff, Fluorescein (FITC), Tetramethylrhodamin (TRITC), Texas Red, Oregon-Green, Pacific Blue, Pacific Green und Pacific Orange.
  • In einigen Fällen ist eine nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung, ausgewählt aus: einem Alexa Fluor® -Farbstoff, einem ATTO-Farbstoff (z.B. ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Thio12, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxa12, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740), ein DyLight-Farbstoff, ein Cyaninfarbstoff (z.B. Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3b, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5), ein FluoProbes-Farbstoff, ein Sulfo-Cy-Farbstoff, ein Seta-Farbstoff, ein IRIS-Farbstoff, ein SeTau-Farbstoff, ein SRfluor-Farbstoff, ein Square-Farbstoff, Fluorescein (FITC), Tetramethylrhodamin (TRITC), Texas Red, Oregon-Grün, Pacific Blue, Pacific Green und Pacific Orange, ein Quantum Dot und ein gebundenes fluoreszierendes Protein.
  • Beispiele für ATTO-Farbstoffe umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Thio12, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxa12, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725 und ATTO 740.
  • Beispiele für AlexaFluor-Farbstoffe umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 530, Alexa Fluor® 525, Alexa Fluor® 525, Alexa Fluor® 525, Alexa Fluor® 525, Alexa Fluor® Alexa Fluor® 610, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 635, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750, Alexa Fluor® 790 und dergleichen.
  • Beispiele für Quencher-Gruppen umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, einen dunklen Quencher, einen Black-Hole Quencher® (BHQ®) (z.B. BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3), einen Qxl-Quencher, einen ATTO-Quencher (z.B. ATTO 540Q, ATTO 580Q und ATTO 612Q), Dimethylaminoazobenzolsulfonsäure (Dabsyl), Iowa Black RQ, Iowa Black FQ, IRDye QC-1, ein QSY-Farbstoff (z.B. QSY 7, QSY 9, QSY 21), AbsoluteQuencher, Eclipse und Metallcluster wie Goldnanopartikel und dergleichen.
  • In einigen Fällen wird eine Quencher-Gruppe ausgewählt aus: einem dunklen Quencher, einem Black Hole Quencher® (BHQ®) (z.B. BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3), einem Qxl-Quencher, einem ATTO-Quencher (z.B. ATTO 540Q, ATTO 580Q und ATTO 612Q), Dimethylaminoazobenzolsulfonsäure (Dabsyl), Iowa Black RQ, Iowa Black FQ, IRDye QC-1, einem QSY-Farbstoff (z.B. QSY 7, QSY 9, QSY 21), AbsoluteQuencher, Eclipse und einem Metallcluster.
  • Beispiele für einen ATTO-Quencher umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, ATTO 540Q, ATTO 580Q und ATTO 612Q. Beispiele für einen Black Hole Quencher® (BHQ®) umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, BHQ-0 (493 nm), BHQ-1 (534 nm), BHQ-2 (579 nm) und BHQ-3 (672 nm).
  • Beispiele für einige nachweisbare Markierungen (z.B. Fluoreszenzfarbstoffe) und/oder Quencher-Gruppeen finden sich z.B. unter: B. Bao et al., Annu Rev. Biomed Eng. 2009; 11: 25-47; sowie die US-Patente Nr. 8,822,673 und 8,586,718 ; US-Patentveröffentlichungen 20140378330, 20140349295, 20140194611, 20130323851, 20130224871, 20110223677, 20110190486, 20110172420, 20060179585 und 20030003486 ; und die internationale Patentanmeldungen: WO200142505 und WO200186001 , auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
  • In einigen Fällen kann die Spaltung einer markierten Nachweis-RNA nachgewiesen werden, indem eine kolorimetrische Ausgabe gemessen wird. Zum Beispiel kann die Freisetzung eines Fluorophors (z.B. Freisetzung aus einem FRET-Paar, Freisetzung aus einem Quencher/Fluor-Paar und dergleichen) zu einer Wellenlängenverschiebung (und somit Farbverschiebung) eines nachweisbaren Signals führen. Somit kann in einigen Fällen die Spaltung einer hier gegenständlichen markierten Nachweis-RNA durch eine Farbverschiebung nachgewiesen werden. Solch eine Verschiebung kann als ein Verlust eines Signalwertes einer Farbe (Wellenlänge), eine Verstärkung einer anderen Farbe, eine Änderung des Verhältnisses von einer Farbe zu einer anderen und dergleichen, ausgedrückt werden.
  • Nukleinsäure-Modifikationen
  • In einigen Fällen umfasst eine markierte Nachweis-RNA eine oder mehrere Modifikationen, z.B. eine Basenmodifikation, eine Rückgratmodifikation, eine Zuckermodifikation usw., um die Nukleinsäure mit einem neuen oder verbesserten Merkmal (z.B. eine verbesserte Stabilität) zu versehen. Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, ist ein Nukleosid eine Bas-Zucker-Kombination. Der Base-Anteil des Nucleosids ist normalerweise eine heterocyclische Base. Die zwei häufigsten Klassen solcher heterocyclischen Basen sind die Purine und die Pyrimidine. Nukleotide sind Nukleoside, die ferner eine Phosphatgruppe umfassen, die kovalent an den Zucker-Anteil des Nukleosids gebunden ist. Für diejenigen Nukleoside, die einen Pentofuranosylzucker enthalten, kann die Phosphatgruppe mit der 2'-, der 3'- oder der 5'-Hydroxylgruppe des Zuckers verbunden sein. Bei der Bildung von Oligonukleotiden verknüpfen die Phosphatgruppen benachbarte Nukleoside miteinander kovalent unter Bildung einer linearen polymeren Verbindung. Die entsprechenden Enden dieser linearen polymeren Verbindung können wiederum miteinander verbunden werden, um eine kreisförmige Verbindung zu bilden, lineare Verbindungen sind jedoch im Allgemeinen geeignet. Darüber hinaus können lineare Verbindungen eine interne Nukleotidbasen-Komplementarität aufweisen und können daher so gefaltet werden, dass eine vollständig oder teilweise doppelsträngige Verbindung hergestellt wird. Innerhalb von Oligonukleotiden werden die Phosphatgruppen üblicherweise als das Internukleosid-Rückgrat des Oligonukleotids bildend bezeichnet. Die normale Bindung oder das Rückgrat von RNA und DNA ist eine 3' zu 5' Phosphodiesterbindung.
  • Modifizierte Rückgrate und modifizierte Internukleosid-Bindungen
  • Beispiele für geeignete Modifikationen umfassen modifizierte Nukleinsäuregruppen und nicht natürliche Internukleosidbindungen. Nukleinsäuren mit modifizierten Rückgraten umfassen solche, die ein Phosphoratom in dem Rückgrat beibehalten und solche, die kein Phosphoratom in dem Rückgrat aufweisen.
  • Geeignete modifizierte Oligonukleotidrückgrate, die ein Phosphoratom enthalten, umfassen beispielsweise Phosphorothioate, chirale Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Phosphotriester, Aminoalkylphosphotriester, Methyl- und andere Alkylphosphonate, einschließlich 3'-Alkylenphosphonate, 5'-Alkylenphosphonate und chirale Phosphonate, Phosphinate, Phosphoramidate einschließlich 3'-Aminophosphoramidat und Aminoalkylphosphoramidate, Phosphordiamidate, Thionophosphoramidate, Thionoalkylphosphonate, Thionoalkylphosphotriester, Selenophosphate und Boranophosphate mit normalen 3'-5'-Bindungen, 2'-5'-gebundene Analoga von diesen und solche mit invertierter Polarität, wobei eine oder mehrere Internukleotidbindungen eine 3' zu 3'-, 5' zu 5'- oder 2 zu 2'-Bindung ist. Geeignete Oligonukleotide mit invertierter Polarität umfassen eine einzelne 3' zu 3'-Bindung an der am weitesten 3'-gelegenen Internukleotidbindung, insbesondere einen einzelnen invertierten Nukleosidrest, der basisch sein kann (die Nukleobase fehlt oder weist eine Hydroxylgruppe an ihrer Stelle auf). Verschiedene Salze (wie z.B. Kalium oder Natrium), gemischte Salze und freie Säureformen sind ebenfalls enthalten.
  • In einigen Fällen umfasst eine markierte Nachweis-RNA eine oder mehrere Phosphorothioat- und/oder Heteroatom-Internukleosid-Bindungen, insbesondere -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- (bekannt als Methylen (Methylimino) oder MMI-Rückgrat), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-(CH3)-CH2- und -O-N(CH3)-CH2-CH2- (worin die native Phosphodiester-Internukleotidbindung als -O-P(=O) (OH)-O-CH2- dargestellt wird. Internukleosid-Bindungen vom MMI-Typ sind in dem oben genannten US-Patent Nr. 5,489,677 veröffentlicht. Geeignete Amid-Internukleosid-Bindungen sind im US-Patent Nr. 5 602 240 veröffentlicht.
  • Geeignet sind auch Nukleinsäuren mit Morpholino-Rückgratstrukturen, wie z.B. in US-Patent Nr. 5,034,506 beschrieben. Zum Beispiel umfasst eine markierte Nachweis-RNA in einigen Fällen einen 6-gliedrigen Morpholino-Ring anstelle eines Riboserings. In einigen Fällen ersetzt eine Phosphordiamidat- oder andere Nicht-Phosphodiester-Internukleosidbindung eine Phosphodiesterbindung.
  • Geeignete modifizierte Polynukleotidrückgrate, die kein Phosphoratom darin enthalten, haben Rückgrate, die durch kurzkettige Alkyl- oder Cycloalkyl-Internukleosidbindungen, gemischte Heteroatome und Alkyl- oder Cycloalkyl-Internukleosidbindungen oder eine oder mehrere kurzkettige heteroatomare oder heterocyclische Internukleosidbindungen gebildet werden. Dazu gehören solche mit Morpholino-Bindungen (die zum Teil aus dem Zuckerteil eines Nucleosids gebildet werden); Siloxan-Rückgrate; Sulfid-, Sulfoxid- und Sulfon-Rückgrate; Formacetyl- und Thioformacetyl-Rückgrate; Methylenformacetyl- und Thioformacetyl-Rückgrate; Riboacetyl-Rückgrate; Alken-haltige Rückgrate; Sulfamat-Rückgrate; Methylenimino- und Methylenhydrazino-Rückgrate; Sulfonat- und Sulfonamid-Rückgrate; Amid-Rückgrate; und andere mit gemischten N-, O-, S- und CH2-Komponententeilen.
  • Mimetika
  • Eine markierte Nachweis-RNA kann ein Nukleinsäure-Mimetikum sein. Der Ausdruck „mimetisch“, wie er auf Polynukleotide angewendet wird, soll Polynukleotide einschließen, in denen nur der Furanose-Ring oder sowohl der Furanose-Ring als auch die InternukleotidBindung durch Nicht-Furanose-Gruppen ersetzt sind, wobei im Stand der Technik der auch der alleinige Ersatz des Furanose-Rings als Zuckersurrogat bezeichnet wird. Die heterocyclische Basengruppe oder eine modifizierte heterocyclische Basengruppe wird zur Hybridisierung mit einer geeigneten Target-Nukleinsäure aufrechterhalten. Eine solche Nukleinsäure, ein Polynukleotid-Mimetikum, von dem gezeigt wurde, dass es ausgezeichnete Hybridisierungseigenschaften aufweist, wird als eine Peptid-Nukleinsäure (PNA) bezeichnet. In PNA ist das Zuckerrückgrat eines Polynukleotids durch ein Amid-haltiges Rückgrat, insbesondere ein Aminoethylglycin-Rückgrat, ersetzt. Die Nukleotide bleiben erhalten und sind direkt oder indirekt an Aza-Stickstoffatome des Amidteils des Rückgrats gebunden.
  • Ein Polynukleotid-Mimetikum, von dem berichtet wurde, dass es hervorragende Hybridisierungseigenschaften aufweist, ist eine Peptid-Nukleinsäure (PNA). Das Rückgrat in PNA-Verbindungen sind zwei oder mehr verbundene Aminoethylglycin-Einheiten, die der PNA ein Amid-haltiges Rückgrat verleihen. Die heterocyclischen Basenreste sind direkt oder indirekt an Aza-Stickstoffatome des Amidteils des Rückgrats gebunden. Repräsentative US-Patente, die die Herstellung von PNA-Verbindungen beschreiben, umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, US-Patent Nr. 5,539,082; 5,714,331; und 5,719,262 .
  • Eine andere Klasse von Polynukleotid-Mimetika, die untersucht wurde, basiert auf der Bindung Morpholinoeinheiten (Morpholino-Nukleinsäure) mit heterocyclischen Basen, die an den Morpholinoring gebunden sind. Eine Anzahl von Verbindungsgruppen wurde beschrieben, die die Morpholino-Monomereinheiten in einer Morpholino-Nukleinsäure verbinden. Eine Klasse von Verbindungsgruppen wurde ausgewählt, um eine nichtionische oligomere Verbindung zu ergeben. Die nicht-ionischen Morpholino-basierten oligomeren Verbindungen haben weniger wahrscheinlich unerwünschte Wechselwirkungen mit zellulären Proteinen. Morpholino-basierte Polynukleotide sind nicht-ionische Mimetika von Oligonukleotiden, die weniger wahrscheinlich unerwünschte Wechselwirkungen mit zellulären Proteinen bilden (Dwaine A. Braasch und David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41 (14), 4503-4510). Morpholino-basierte Polynukleotide sind in US-Patent Nr. 5,034,506 . Eine Mehrzahl von Verbindungen innerhalb der Morpholinklasse von Polynukleotiden wurde hergestellt, wobei eine Mehrzahl von verschiedenen Verbindungsgruppen die monomeren Untereinheiten verbindet.
  • Eine weitere Klasse von Polynukleotid-Mimetika wird als Cyclohexenyl-Nukleinsäuren (CeNA) bezeichnet. Der Furanose-Ring, der normalerweise in einem DNA/RNA-Molekül vorhanden ist, wird durch einen Cyclohexenylring ersetzt. CeNA-DMTgeschützte Phosphoramidit-Monomere wurden hergestellt und für die Synthese von oligomeren Verbindungen nach der klassischen Phosphoramidit-Chemie verwendet. Vollständig modifizierte oligomere CeNA-Verbindungen und Oligonukleotide mit spezifischen Positionen, die mit CeNA modifiziert wurden, wurden hergestellt und untersucht (siehe Wang et al., J. Am. Soc, 2000, 122, 8595-8602). Im Allgemeinen erhöht der Einbau von CeNA-Monomeren in eine DNA-Kette die Stabilität eines DNA/RNA-Hybrids. CeNA-Oligoadenylate bildeten Komplexe mit RNA- und DNA-Komplementen mit ähnlicher Stabilität wie die nativen Komplexe. Die Untersuchung des Einbaus von CeNA-Strukturen in natürliche Nukleinsäurestrukturen wurde durch NMR und Circulardichroismus bewiesen, um mit einer einfachen Konformationsanpassung fortzufahren.
  • Eine weitere Modifikation umfasst Locked Nucleic Acids (LNAs), in denen die 2'-Hydroxylgruppe mit dem 4'-Kohlenstoffatom des Zuckerrings verbunden ist, wodurch eine 2'-C,4'-C-Oxymethylenbindung gebildet wird, wodurch eine bicyclische Zuckereinheit gebildet wird. Die Bindung kann eine Methylengruppe (-CH2-) sein, die das 2'-Sauerstoffatom und das 4'-Kohlenstoffatom verbrückt, wobei n 1 oder 2 ist (Singh et al., Chem. Soc. Commun., 1998, 4, 455-456). LNA und LNA-Analoga weisen sehr hohe Duplex-Thermostabilitäten mit komplementärer DNA und RNA (Tm = + 3 bis + 10 °C), Stabilität gegenüber 3'-exonukleolytischem Abbau und gute Löslichkeitseigenschaften auf. Potente und nichttoxische Antisense-Oligonukleotide, die LNAs enthalten, wurden bereits beschrieben (Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638).
  • Die Synthese und Herstellung der LNA-Monomere Adenin, Cytosin, Guanin, 5-Methyl-Cytosin, Thymin und Uracil, zusammen mit ihrer Oligomerisierung und die Erkennungseigenschaften von Nukleinsäuren wurden beschrieben (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). LNAs und ihre Herstellung sind auch in WO 98/39352 und WO 99/14226 beschrieben.
  • Modifizierte Zuckereinheiten
  • Eine markierte Nachweis-RNA kann auch eine oder mehrere substituierte Zuckereinheiten enthalten. Geeignete Polynukleotide umfassen eine Zuckersubstituentengruppe, ausgewählt aus: OH; F; O-, S- oder N-Alkyl; O-, S- oder N-Alkenyl; O-, S- oder N-Alkinyl; oder O-Alkyl-O-Alkyl, wobei das Alkyl, Alkenyl und Alkinyl substituiertes oder unsubstituiertes C1 bis C10-Alkyl oder C2 bis C10-Alkenyl und Alkinyl sein können. Besonders geeignet sind O((CH2)nO)mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 und O(CH2)nON((CH2)nCH3)2, wobei n und m 1 bis etwa 10 sind. Andere geeignete Polynukleotide umfassen eine Zuckersubstituentengruppe, ausgewählt aus: C1 bis C10-Niederalkyl, substituiertes Niederalkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkaryl, Aralkyl, O-Alkaryl oder O-Aralkyl, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkaryl, Aminoalkylamino, Polyalkylamino, substituiertes Silyl, eine RNA-spaltende Gruppe, eine Reportergruppe, ein Interkalator, eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonukleotids, oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaften von einem Oligonukleotid und andere Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften. Eine geeignete Modifikation umfasst 2'-Methoxyethoxy (2'-O-CH2 CH2OCH3, auch bekannt als 2'-O-(2-Methoxyethyl) oder 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), d.h. eine Alkoxyalkoxygruppe. Eine weitere geeignete Modifikation umfasst 2'-Dimethylaminooxyethoxy, d.h. eine O(CH2)2ON(CH3)2-Gruppe, die auch als 2'-DMAOE bekannt ist, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, und 2'-Dimethylaminoethoxyethoxy (in der Technik auch als 2'-O-Dimethyl-amino-ethoxy-ethyl oder 2'-DMAEOE) bekannt, d.h. 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2.
  • Andere geeignete Zucker-Substituentengruppen umfassen Methoxy (-O-CH3), Aminopropoxy (-OCH2CH2CH2NH2), Allyl (-CH2-CH=CH2), -O-Allyl (-O-CH2-CH=CH2) und Fluor (F). 2'-Zucker-Substituentengruppen können sich in Arabino- (oben) Position oder Ribo- (unten) Position befinden. Eine geeignete 2'-Arabino-Modifikation ist 2'-F. Ähnliche Modifikationen können auch an anderen Positionen der oligomeren Verbindung vorgenommen werden, insbesondere der 3'-Position des Zuckers am 3'-terminalen Nukleosid oder in 2'-5'-verknüpften Oligonukleotiden und der 5'-Position des 5'-terminalen Nukleotids. Oligomere Verbindungen können anstelle des Pentofuranosylzuckers auch Zuckermimetika wie Cyclobutylreste aufweisen.
  • Basen-Modifikationen und -Substitutionen
  • Eine markierte Nachweis-RNA kann auch Nukleobasenmodifikationen oder - substitutionen (oft in der Technik einfach als „Base“ bezeichnet) umfassen. Wie hierin verwendet, umfassen „unmodifizierte“ oder „natürliche“ Nukleobasen die Purinbasen Adenin (A) und Guanin (G) und die Pyrimidinbasen Thymin (T), Cytosin (C) und Uracil (U). Modifizierte Nucleobasen umfassen andere synthetische und natürliche Nucleobasen, wie 5-Methylcytosin (5-me-C), 5-Hydroxymethylcytosin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Thiouracil, 2-Thiothymin und 2-Thiocytosin, 5-Halouracil und Cytosin, 5-Propinyl (-C=C-CH3) uracil und Cytosin und andere Alkinylderivate von Pyrimidinbasen, 6-Azouracil, Cytosin und Thymin, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halo, 8-Amino, 8-Thiol, 8-Thioalkyl, 8-Hydroxyl und andere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Halo, insbesondere 5-Brom, 5-Trifluormethyl und andere 5-substituierte Uracile und Cytosine, 7-Methylguanin und 7-Methyladenin, 2-F-Adenin, 2-Aminoadenin, 8-Azaguanin und 8-Azaadenin, 7-Deazaguanin und 7-Deazaadenin und 3-Deazaguanin und 3-Deazaadenin. Weitere modifizierte Nucleobasen umfassen tricyclische Pyrimidine, wie Phenoxazincytidin (1H-Pyrimino (5,4-b) (1,4) benzoxazin-2 (3H)-on), Phenothiazincytidin (1H-Pyrimido (5,4-b) (1, 4) Benzothiazin-2 (3H)-on), G-Clamps, wie ein substituiertes Phenoxazin-Cytidin (z.B. 9-(2-Aminoethoxy)-H-pyrimido(5,4-(b)(1,4)benzoxazin)-2(3H)-on), Carbazolcytidin (2H-Pyrimido (4,5-b) indol-2-on), Pyridoindolcytidin (H-Pyrido (3',2':4,5) pyrrolo (2,3-d) Pyrimidin-2-on).
  • Heterocyclische Basengruppen können auch solche einschließen, in denen die Purin- oder Pyrimidinbase durch andere Heterocyclen ersetzt ist, beispielsweise 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanosin, 2-Aminopyridin und 2-Pyridon. Zu weiteren Nukleobasen gehören jene, die in US-Patent Nr. 3 687 808 veröffentlicht sind, diejenigen, die in der Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, Seiten 858-859, Kroschwitz, J. I., Ed. John Wiley & Sons, 1990, die von Englisch et al., Angewandte Chemie, Internationale Ausgabe, 1991, 30, 613, und diejenigen, die von Sanghvi, YS, Kapitel 15, Antisense Research and Applications, Seiten 289-302, Crooke, ST und Lebleu, B., Hrsg., CRC Press, 1993 offenbart sind. Bestimmte dieser Nucleobasen sind nützlich zur Erhöhung der Bindungsaffinität einer oligomeren Verbindung. Diese umfassen 5-substituierte Pyrimidine, 6-Azapyrimidine und N-2-, N-6- und O-6-substituierte Purine, einschließlich 2-Aminopropyladenin, 5- Propynyluracil und 5-Propynylcytosin. Es wurde gezeigt, dass 5-Methylcytosin-Substitutionen die Nukleinsäureduplexstabilität um 0,6-1,2 °C erhöhen (Sanghvi et al., Hrsg., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, Seiten 276-278) und sind geeignete Basensubstitutionen, z.B. in Kombination mit 2'-O-Methoxyethylzucker-Modifikationen.
  • Nachweis von zwei verschiedenen Target-RNAs
  • Wie oben erwähnt, stellt in einigen Fällen ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung einen im Wesentlichen gleichzeitigen Nachweis von zwei unterschiedlichen Target-RNAs (einer ersten einzelsträngigen Target-RNA und einer zweiten einzelsträngigen Target-RNA) in einer Probe bereit. In einigen Fällen umfasst das Verfahren: a) Inkontaktbringen einer Probe (z.B. einer Probe, die die zwei verschiedenen Target-RNAs und eine Mehrzahl von Non-Target-RNAs umfasst) mit: (i) einem ersten C2c2-Protein, das Adenin+-RNAs spaltet (d.h., RNAs, die A enthalten, aber nicht RNAs, denen A fehlt, wie eine polyU-RNA), die in der Probe vorhanden sind; (ii); einem zweiten C2c2-Protein, das Uracil+-RNAs spaltet (d.h. RNAs, die U einschließen, aber keine RNAs, denen U fehlt, wie eine Poly-A-RNA); (iii) einer ersten C2c2-guideRNA, umfassend eine erste Nukleotidsequenz, die mit der ersten einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert, und eine zweite Nukleotidsequenz, die an das erste C2c2-Protein bindet; und (iv) einer zweiten C2c2-guideRNA, umfassend eine erste Nukleotidsequenz, die mit der zweiten einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert, und eine zweite Nukleotidsequenz, die an das zweite C2c2-Protein bindet; und b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch RNA-Spaltung durch das erste und das zweite C2c2-Protein vermittelt wird, wobei ein erstes nachweisbares Signal durch das erste C2c2-Protein und ein zweites nachweisbares Signal durch das zweite C2c2-Protein erzeugt wird, wobei das erste nachweisbare Signal und das zweite nachweisbare Signal voneinander unterscheidbar sind. In einigen Fällen wird das erste C2c2-Protein nicht durch die zweite C2c2-guideRNA aktiviert, und das erste C2c2-Protein spaltet ssRNA, die A einschließt (z.B. nicht die ssRNA, denen A fehlt); und das zweite C2c2-Protein wird nicht durch die erste C2c2-guideRNA aktiviert, und das zweite C2c2-Protein spaltet ssRNA, die U enthält (z.B. keine ssRNA, denen U fehlt). In einigen Fällen wird das erste C2c2-Protein nicht durch die zweite C2c2-guideRNA aktiviert, und das erste C2c2-Protein spaltet ssRNA, die U enthält (z.B. keine ssRNA, denen U fehlt); und das zweite C2c2-Protein wird nicht durch die erste C2c2-guideRNA aktiviert, und das zweite C2c2-Protein spaltet ssRNA, die A einschließt (z.B. keine ssRNA, denen A fehlt).
  • In einigen Fällen umfasst das Verfahren auch das Inkontaktbringen der Probe mit: i) einer ersten markierten Nachweis-RNA, die ein erstes FRET-Paar und/oder ein erstes Quencher/Fluor-Paar umfasst (beispielhafte FRET-Paare und Quencher/Fluor-Paare sind oben beschrieben); und ii) eine zweite markierte Nachweis-RNA, die ein zweites FRET-Paar und/oder ein zweites Quencher/Fluor-Paar umfasst (beispielhafte FRET-Paare und Quencher/Fluor-Paare sind oben beschrieben). In einigen Fällen umfasst die erste markierte Nachweis-RNA mindestens ein A und kein U; während die zweite markierte Nachweis-RNA mindestens ein U und kein A umfasst. In einigen Fällen umfasst die erste markierte Nachweis-RNA mindestens ein U und nicht A; während die zweite markierte Nachweis-RNA mindestens ein A umfasst und kein U umfasst. Das erste C2c2-Protein spaltet die erste markierte Nachweis-RNA und das erste nachweisbare Signal wird durch das erste FRET-Paar und/oder das erste Quencher/Fluor-Paar erzeugt und das zweite C2c2-Protein spaltet die zweite markierte Nachweis-RNA und das zweite nachweisbare Signal wird durch das zweite FRET-Paar und/oder das zweite Quencher/Fluor-Paar erzeugt. Der Nachweis des ersten nachweisbaren Signals gibt das Vorhandensein der ersten Target-RNA in der Probe an; und der Nachweis des zweiten nachweisbaren Signals gibt das Vorhandensein der zweiten Target-RNA in der Probe an. In einigen Fällen zeigen die relativen Höhen des detektierten ersten und zweiten Signals das Verhältnis der ersten Target-RNA zu der zweiten Target-RNA in der Probe an.
  • In einigen Fällen umfasst die erste markierte Nachweis-RNA eine Markierung, die von der Markierung der zweiten markierten Nachweis-RNA unterscheidbar ist. Zum Beispiel kann die erste markierte Nachweis-RNA ein erstes FRET-Paar und/oder ein erstes Quencher/Fluor-Paar umfassen; und die zweite markierte Nachweis-RNA kann ein zweites FRET-Paar und/oder ein zweites Quencher/Fluor-Paar umfassen. Als ein nicht einschränkendes Beispiel kann die erste markierte Nachweis-RNA einen Donor umfassen, der Tryptophan umfasst, und einen Akzeptor, der Dansyl umfasst; und die zweite markierte Nachweis-RNA kann einen Donor umfassen, der IAEDANS und einen Akzeptor umfasst, der DDPM umfasst. Als ein weiteres nicht einschränkendes Beispiel umfasst die erste markierte Nachweis-RNA einen Donor, der Dansyl umfasst, und einen Akzeptor, der FITC umfasst; und die zweite markierte Nachweis-RNA umfasst einen Donor, der Cy3 umfasst, und einen Akzeptor, der Cy5 umfasst. In einigen Fällen umfasst die erste markierte Nachweis-RNA ein 5'-FAM (Fluorescein)-3'-IBFQ (Iowa Black ® FQ) Quencher/Fluor-Paar, und in einigen Fällen umfasst die zweite markierte Nachweis-RNA ein 5'-FAM (Fluorescein)-3'-IBFQ (Iowa Black ® FQ) Quencher/Fluor-Paar.
  • In einigen Fällen werden die ersten und zweiten markierten Nachweis-RNAs gleichzeitig zu der Probe hinzugefügt (mit im Wesentlichen gleichzeitigen Kontakt). In einigen solcher Fällen werden die Signale, die von der ersten und der zweiten markierten Nachweis-RNA erzeugt werden, zur gleichen Zeit (im Wesentlichen gleichzeitiger Kontakt) detektiert, z.B. weil in solchen Fällen die ersten und zweiten markierten Nachweis-RNAs unterscheidbar markiert sein können.
  • „Im wesentlichen gleichzeitig“ bedeutet innerhalb von etwa 5 Minuten, innerhalb von etwa 3 Minuten, innerhalb von etwa 2 Minuten, innerhalb von etwa 1 Minute, innerhalb von etwa 30 Sekunden, innerhalb von etwa 15 Sekunden, innerhalb von etwa 10 Sekunden, innerhalb von etwa 5 Sekunden oder innerhalb von etwa 1 Sekunde.
  • In einigen Fällen jedoch werden die Signale, die von dem ersten und zweiten markierten Nachweis-RNAs erzeugt werden, nicht gleichzeitig detektiert sondern sequentiell (nacheinander) detektiert. Zum Beispiel werden in einigen Fällen die ersten und zweiten markierten Nachweis-RNAs nicht gleichzeitig zu der Probe hinzugefügt und stattdessen sequenziell zugegeben (z.B. kann die zweite markierte Nachweis-RNA hinzugefügt werden, nachdem die erste markierte Nachweis-RNA hinzugefügt worden ist), und in einigen solchen Fällen wird die zweite markierte Nachweis-RNA nicht zugegeben, bis das von der ersten markierten Nachweis-RNA erzeugte Signal detektiert wurde. Somit müssen in einigen Fällen die ersten und zweiten markierten Nachweis-RNAs nicht unterscheidbar markiert sein (z.B. können sie in einigen Fällen das gleiche nachweisbare Signal erzeugen, z.B. können sie bei der gleichen Wellenlänge fluoreszieren), weil die Signale der Reihe nach detektiert werden sollen.
  • Als ein veranschaulichendes Beispiel gilt in einigen Fällen: (i) die erste und zweite markierte Nachweis-RNA sind nicht unterscheidbar markiert; (ii) die Probe wird mit einer markierten Nachweis-RNA in Kontakt gebracht und das von dieser markierten Nachweis-RNA erzeugte Signal wird nachgewiesen (z.B. gemessen); und (iii) die Probe wird dann mit der anderen markierten Nachweis-RNA in Kontakt gebracht und das Signal, das durch die zugesetzte markierte Nachweis-RNA erzeugt wird, wird nachgewiesen-wenn also beide Target-ssRNAs in der Probe vorliegen, kann die Zugabe der zweiten markierten Nachweis-RNA zu einem Boost des Signals (z.B. wenn das Signal mit erhöhter Spaltung ansteigt, z.B. Fluor/Quencher-Paar) oder kann zu einer nachweisbaren Abnahme des Signals nach Zugabe der zweiten markierten Nachweis-RNA führen (z.B. wenn das Signal abnimmt mit erhöhter Spaltung abnimmt, z.B. beim FRET-Paar).
  • Das erste und das zweite C2c2-Protein können zueinander in Bezug auf die C2c2-guideRNA-Bindung orthogonal sein. In solchen Fällen bindet das erste C2c2-Protein nicht an die zweite C2c2-guideRNA; und das zweite C2c2-Protein bindet nicht an die erste guideRNA. Das erste C2c2-Protein und das zweite C2c2-Protein können sich auch in ihrer ssRNA-Spaltungspräferenz voneinander unterscheiden, so dass eines der C2c2-Proteine die ssRNA bei As und das andere C2c2-Protein die ssRNA bei Us spaltet.
  • Eine Anleitung in Bezug auf orthogonale Paare von C2c2-Proteinen findet sich in 44E.
  • Nicht beschränkende Beispiele für orthogonale Paare von C2c2-Proteinen, die zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet sind, umfassen die nachstehend in Tabelle 10 dargestellten Paare. Die Spaltungspräferenz wird in Klammern nach dem Namen des Cas13a-Proteins dargestellt. Zum Beispiel bezieht sich „Lba (A)“ auf ein Lba Cas13a Protein, das ssRNA bei A spaltet; und „Lbu (U)“ bezieht sich auf ein Lbu Cas13a Protein, welches ssRNA bei U spaltet.
  • Tabelle 10
    C2c2 Protein Nr. 1 C2c2 Protein Nr. 2
    Lba (A) Hhe (U)
    Lba (A) Rca (U)
    Lba (A) Ppr (U)
    Lba (A) Lne (U)
    Lba (A) Lbu (U)
    Lba (A) Lwa (U)
    Lba (A) Lsh (U)
    Ere (A) Hhe (U)
    Ere (A) Rca (U)
    Ere (A) Ppr (U)
    Ere (A) Lne (U)
    Ere (A) Lbu (U)
    Ere (A) Lwa (U)
    Ere (A) Lsh (U)
    Ere (A) Lse (U)
    Cam (A) Hhe (U)
    Cam (A) Rca (U)
    Cam (A) Ppr (U)
    Cam (A) Lne (U)
    Cam (A) Lbu (U)
    Cam (A) Lwa (U)
    Cam (A) Lsh (U)
    Cam (A) Lse (U)
  • Die erste und die zweite markierte Nachweis-RNA können jeweils unabhängig voneinander eine Länge von 2 bis 100 Ribonukleotiden aufweisen (z.B. 2 bis 80, 2 bis 60, 2 bis 50, 2 bis 40, 2 bis 30, 2 bis 20, 2 bis 15 oder 2 bis 10 Ribonukleotide). Die erste und die zweite markierte Nachweis-RNA können jeweils unabhängig voneinander eine Länge von 2 Ribonukleotiden bis 100 Ribonukleotiden aufweisen, z.B. von 2 Ribonukleotiden bis 5 Ribonukleotiden, von 5 Ribonukleotiden bis 7 Ribonukleotiden, von 7 Ribonukleotiden bis 10 Ribonukleotiden, von 10 Ribonukleotiden bis 15 Ribonukleotiden, von 15 Ribonukleotiden bis 20 Ribonukleotiden, von 20 Ribonukleotiden bis 25 Ribonukleotiden, von 25 Ribonukleotiden bis 30 Ribonukleotiden, von 30 Ribonukleotiden bis 35 Ribonukleotiden, von 35 Ribonukleotiden bis 40 Ribonukleotiden, von 40 Ribonukleotiden bis 45 Ribonukleotiden oder von 45 Ribonukleotiden bis 50 Ribonukleotiden.
  • In einigen Fällen umfasst die erste markierte Nachweis-RNA mindestens ein A (z.B. mindestens 2, mindestens 3 oder mindestens 4 As) und kein U; und die zweite markierte Nachweis-RNA umfasst mindestens ein U (z.B. mindestens 2, mindestens 3 oder mindestens 4 Us) und kein A.
  • In einigen Fällen fehlt der ersten markierten Nachweis-RNA U und diese umfasst einen Abschnitt von 2 bis 15 aufeinanderfolgende As (z.B. 2 bis 12, 2 bis 10, 2 bis 8, 2 bis 6, 2 bis 4, 3 bis 15, 3 bis 12, 3 bis 10, 3 bis 8, 3 bis 6, 3 bis 5, 4 bis 15, 4 bis 12, 4 bis 10, 4 bis 8 oder 4 bis 6 aufeinanderfolgende As). In einigen Fällen fehlt der ersten markierten Nachweis-RNA U und sie umfasst einen Abschnitt von mindestens 2 aufeinanderfolgenden As (z.B. mindestens 3, mindestens 4 oder mindestens 5 aufeinanderfolgende As). In einigen Fällen fehlt der zweiten markierten Nachweis-RNA A und sie umfasst einen Abschnitt von 2 bis 15 aufeinanderfolgenden Us (z.B. 2 bis 12, 2 bis 10, 2 bis 8, 2 bis 6, 2 bis 4, 3 bis 15, 3 bis 12, 3 bis 10, 3 bis 8, 3 bis 6, 3 bis 5, 4 bis 15, 4 bis 12, 4 bis 10, 4 bis 8 oder 4 bis 6 aufeinanderfolgende Us). In einigen Fällen fehlt der zweiten markierten Nachweis-RNA A und sie umfasst einen Abschnitt von mindestens 2 aufeinanderfolgenden Us (z.B. mindestens 3, mindestens 4 oder mindestens 5 aufeinanderfolgende Us).
  • In einigen Fällen fehlt der ersten markierten Nachweis-RNA A und sie umfasst einen Abschnitt von 2 bis 15 aufeinanderfolgende Us (z.B. 2 bis 12, 2 bis 10, 2 bis 8, 2 bis 6, 2 bis 4, 3 bis 15, 3 bis 12, 3 bis 10, 3 bis 8, 3 bis 6, 3 bis 5, 4 bis 15, 4 bis 12, 4 bis 10, 4 bis 8 oder 4 bis 6 aufeinanderfolgende Us). In einigen Fällen fehlt der ersten markierten Nachweis-RNA A und sie umfasst einen Abschnitt von mindestens 2 aufeinanderfolgenden Us (z.B. mindestens 3, mindestens 4 oder mindestens 5 aufeinanderfolgende Us). In einigen Fällen fehlt der zweiten markierten Nachweis-RNA U und sie umfasst einen Abschnitt von 2 bis 15 aufeinanderfolgenden As (z.B. 2 bis 12, 2 bis 10, 2 bis 8, 2 bis 6, 2 bis 4, 3 bis 15, 3 bis 12, 3 bis 10, 3 bis 8, 3 bis 6, 3 bis 5, 4 bis 15, 4 bis 12, 4 bis 10, 4 bis 8 oder 4 bis 6 aufeinanderfolgende As). In einigen Fällen fehlt der zweiten markierten Nachweis-RNA U und sie umfasst einen Abschnitt von mindestens 2 aufeinanderfolgenden As (z.B. mindestens 3, mindestens 4 oder mindestens 5 aufeinanderfolgende As).
  • In einigen Fällen umfasst die erste markierte Nachweis-RNA mindestens ein U und kein A; und die zweite markierte Nachweis-RNA umfasst mindestens ein A und kein U.
  • In einigen Fällen umfasst die erste markierte Nachweis-RNA mindestens ein A und kein U. Z.B. ist in einigen Fällen die erste markierte Nachweis-RNA ein Homoadenosin-Polymer (eine PolyA-RNA). Als ein weiteres Beispiel umfasst die erste markierte Nachweis-RNA: i) mindestens ein A; ii) kein U; und iii) ein oder mehrere Cs und/oder Gs. In einigen Fällen umfasst die zweite markierte Nachweis-RNA mindestens ein U und kein A. Zum Beispiel ist in einigen Fällen die zweite markierte Nachweis-RNA ein Homouridin-Polymer (eine polyU-RNA). Als ein weiteres Beispiel umfasst die zweite markierte Nachweis-RNA: i) mindestens ein U; ii) kein A; und iii) ein oder mehrere Cs und/oder Gs.
  • In einigen Fällen umfasst die erste markierte Nachweis-RNA mindestens ein U und kein A. Zum Beispiel ist in einigen Fällen die erste markierte Nachweis-RNA ein Homouridin-Polymer (polyU-RNA). Als ein weiteres Beispiel umfasst die zweite markierte Nachweis-RNA: i) mindestens ein U; ii) kein A; und iii) ein oder mehrere Cs und/oder Gs. In einigen Fällen umfasst die zweite markierte Nachweis-RNA mindestens ein A und kein U. Zum Beispiel ist in einigen Fällen die zweite markierte Nachweis-RNA ein Homoadenosin-Polymer (polyA-RNA). Als ein weiteres Beispiel umfasst die zweite markierte Nachweis-RNA: i) mindestens ein A; ii) kein U; und iii) ein oder mehrere Cs und/oder Gs.
  • Wie oben erwähnt, kann ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung das Inkontaktbringen einer Probe mit Folgendem umfassen: einem ersten C2c2-Protein; einem zweiten C2c2-Protein; einer ersten C2c2-guideRNA, umfassend eine erste Nukleotidsequenz, die mit der ersten einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert, und eine zweite Nukleotidsequenz, die hier auch als „konstante Region“ oder „Handle“ bezeichnet wird und an das erste C2c2-Protein bindet; und einer zweiten C2c2-guideRNA, umfassend eine erste Nukleotidsequenz, die mit der zweiten einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert, und eine zweite Nukleotidsequenz (einen Handle), die an das zweite C2c2-Protein bindet.
  • Zum Beispiel ist in einigen Fällen das erste C2c2-Protein ein Cas13a-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56F dargestellt ist; und die erste C2c2-guideRNA umfasst eine konstante Region (ein „Handle“ - ein Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet), umfassend eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt-Unterschiede von der Nukleotidsequenz AGAUAGCCAAGAAAGAGGGCAAUAAC (SEQ ID NR.: 16) umfasst, wobei die crRNA eine Länge von etwa 25 nt, 26 nt, 27 nt, 28 nt, 29 nt oder 30 nt aufweist. In einigen Fällen hat die crRNA die Nukleotidsequenz AGAUAGCCCAAGAAAGAGGGCAAUAAC (SEQ ID NR.: 16); und eine Länge von 27 nt. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der in 56K dargestellten Hhe-Cas13a-Aminosäuresequenz; und die zweite C2c2-guideRNA umfasst einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet), der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4nt oder nicht mehr als 5 nt-Unterschiede von der Nukleotidsequenz GUAACAAUCCCCGUAGACAGGGGAACUGCAAC (SEQ ID NR.: 17) umfasst. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Rca Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56G dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA umfasst einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet), der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz CAUCACCGCCAAGACGACGGCGGACUGAACC (SEQ ID NR.: 18) umfasst. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ppr Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56B dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA umfasst einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet), der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz AAUUAUCCCAAAAUUUGAAGGGAACUACAAC (SEQ ID NR.: 19) umfasst; wobei der Handle eine Länge von etwa 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt oder 32 nt hat. In einigen Fällen umfasst die zweite C2c2-guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz AAUUAUCCCAAAAUUUGAAGGGAACUACAAC (SEQ ID NR.: 19) umfasst; und der Handle hat eine Länge von 30 nt. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lne Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56I dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA umfasst einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet), der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz GAGUACCUCAAAACAAAAGAGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 20) umfasst (z.B. umfassend eine Nukleotidsequenz mit nur 1 nt, 2 nt, 3 nt, 4 nt oder 5 nt, Unterschiede von der Nukleotidsequenz GAGUACCUCAAAACAAAAGAGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 20)); wobei der Handle eine Länge von etwa 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt oder 32 nt hat. In einigen Fällen umfasst die zweite guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz GAGUACCUCAAAACAAAAGAGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 20) umfasst; wobei der Handle eine Länge von 30 nt hat. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lbu Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56C dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA umfasst einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet), der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAAACA (SEQ ID NR.: 9) umfasst (z.B. umfassend eine Nukleotidsequenz mit nur 1 nt, 2 nt, 3 nt, 4 nt oder 5 nt, Unterschiede von der Nukleotidsequenz GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACA (SEQ ID NR.: 9)); wobei der Handle eine Länge von etwa 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt oder 32 nt hat. In einigen Fällen umfasst die zweite guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACA (SEQ ID NR.: 9) umfasst; wobei der Handle eine Länge von 31 nt hat. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lwa Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56E dargestellt ist.; und die zweite C2c2-guideRNA umfasst einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet), der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz GACCACCCCAAUUAUCGAAGGGGACUAAAACUU (SEQ ID NR.: 21) umfasst (z.B. umfassend eine Nukleotidsequenz mit nur 1 nt, 2 nt, 3 nt, 4 nt oder 5 nt, Unterschiede zur Nukleotidsequenz GACCACCCCAAAUAUCGAAGGGGACUAAAACUU (SEQ ID NR.: 21)); hat eine Länge von etwa 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt oder 32 nt. In einigen Fällen umfasst die zweite guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz GACCACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAACUU (SEQ ID NR.: 21) umfasst; wobei der Handle eine Länge von 32 nt hat. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der in 56D dargestellten Lsh Cas13a-Aminosäuresequenz.; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz CACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 22) umfasst (z.B. umfassend eine Nukleotidsequenz mit nur 1 nt, 2 nt, 3 nt, 4 nt oder 5 nt Unterschiede zu Nukleotidsequenz CACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 22)), wobei der Handle eine Länge von 25 nt, 26 nt, 27 nt, 28 nt oder 29 nt aufweist. In einigen Fällen umfasst die zweite guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz CACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 22) umfasst wobei der Handle eine Länge von 27 nt hat.
  • Als ein weiteres Beispiel ist in einigen Fällen das erste C2c2-Protein ein Cas13a-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98 %, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist.; und die erste C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz AAGUAGCCCGAUAUAGAGGGCAAUAAC (SEQ ID NR.: 23) umfasst, wobei der Handle eine Länge von etwa 25 nt, 26 nt, 27 nt, 28 nt, 29 nt oder 30 nt aufweist. In einigen Fällen hat der Handle die Nukleotidsequenz AAGUAGCCCGAUAUAGAGGGCAAUAAC (SEQ ID NR.: 23); und mit einer Länge von 27 nt. In einigen Fällen ist das erste C2c2-Protein ein Cas13a-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist; und die erste C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz AUACAGCUCGAUAUAGUGAGCAAUAAG (SEQ ID NR.: 24) umfasst, wobei der Handle eine Länge von etwa 25 nt, 26 nt, 27 nt, 28 nt, 29 nt oder 30 nt aufweist. In einigen Fällen hat der Handle die Nukleotidsequenz AUACAGCUCGAUAUAGAGAGCAAUAAG (SEQ ID NR.: 24); und mit einer Länge von 27 nt. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der in 56K dargestellten Hhe-Cas13a-Aminosäuresequenz; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz GUAACAAUCCCCGUAGACAGGGGAACUGCAAC (SEQ ID NR.: 17) umfasst; wobei der Handle eine Länge von etwa 30 nt, 31 nt, 32 nt, 33 nt, 34 nt oder 35 nt nt aufweist. In einigen Fällen umfasst die zweite C2c2-guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz GUAACAAUCCCCGUAGACAGGGGAACUGCAAC (SEQ ID NR.: 17) umfasst; und der Handle hat eine Länge von 32 nt. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Rca Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56G dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz UCACAUCACCGCCAAGACGACGGCGGACUGAACC (SEQ ID NR.: 25) umfasst; wobei der Handle eine Länge von etwa 32 nt, 33 nt, 34 nt, 35 nt, 36 nt oder 37 nt aufweist. In einigen Fällen umfasst die zweite C2c2-guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz UCACAUCACCGCCAAGACGACGGCGGACUGAACC (SEQ ID NR.: 25) umfasst; und der Handle hat eine Länge von 34 nt. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ppr Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56B dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz AAUUAUCCCAAAAUUUGAAGGGAACUACAAC (SEQ ID NR.: 19) umfasst; wobei der Handle eine Länge von etwa 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt oder 32 nt hat. In einigen Fällen umfasst die zweite C2c2-guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz AAUUAUCCCAAAAUUUGAAGGGAACUACAAC (SEQ ID NR.: 19) umfasst; und der Handle hat eine Länge von 30 nt. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lne Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56I dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz GAGUACCUCAAAACAAAAGAGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 20) umfasst (z.B. umfassend eine Nukleotidsequenz mit nur 1 nt, 2 nt, 3 nt, 4 nt oder 5 nt, Unterschiede von der Nukleotidsequenz GAGUACCUCAAAACAAAAGAGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 20)); wobei der Handle eine Länge von etwa 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt oder 32 nt hat. In einigen Fällen umfasst die zweite guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz GAGUACCUCAAAACAAAAGAGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 20) umfasst; wobei der Handle eine Länge von 30 nt hat. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lbu Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56C dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAAACA (SEQ ID NR.: 9) (z.B. umfassend eine Nukleotidsequenz mit nur 1 nt, 2 nt, 3 nt, 4 nt oder 5 nt, Unterschiede von der Nukleotidsequenz GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACA (SEQ ID NR.: 9)); wobei der Handle eine Länge von etwa 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt oder 32 nt hat. In einigen Fällen umfasst die zweite guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACA (SEQ ID NR.: 9) umfasst; wobei der Handle eine Länge von 31 nt hat. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lwa Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56E dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz GACCACCCCAAUUAUCGAAGGGGACUAAAACUU (SEQ ID NR.: 21) umfasst (z.B. umfassend eine Nukleotidsequenz mit nur 1 nt, 2 nt, 3 nt, 4 nt oder 5 nt, Unterschiede zur Nukleotidsequenz GACCACCCCAAAUAUCGAAGGGGACUAAAACUU (SEQ ID NR.: 21)); und eine Länge von etwa 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt oder 32 nt aufweist. In einigen Fällen umfasst die zweite guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz GACCACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAACUU (SEQ ID NR.: 21) umfasst; wobei der Handle eine Länge von 32 nt hat. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der in 56D dargestellten Lsh Cas13a-Aminosäuresequenz.; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz CACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 22) umfasst (z.B. umfassend eine Nukleotidsequenz mit nur 1 nt, 2 nt, 3 nt, 4 nt oder 5 nt), Unterschiede zu Nukleotidsequenz CACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 22), wobei der Handle eine Länge von 25 nt, 26 nt, 27 nt, 28 nt oder 29 nt aufweist. In einigen Fällen umfasst die zweite guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz CACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 22) umfasst; wobei der Handle eine Länge von 27 nt hat. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lse-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56A dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz GACUACCUCUAUAUGAAAGAGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 7); wobei der Handle eine Länge von etwa 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt oder 32 nt hat. In einigen Fällen umfasst die zweite C2c2-guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz GACUACCUCUAUAUGAAAGAGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 7) umfasst; und der Handle hat eine Länge von 30 nt.
  • Als ein weiteres Beispiel ist in einigen Fällen das erste C2c2-Protein ein Cas13a-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98 %, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der in 56H dargestellten Cam Cas13a-Aminosäuresequenz; und die erste C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz GAACAGCCCGAUAUAGAGGGCAAUAGAC (SEQ ID NR.: 26) umfasst, wobei der Handle eine Länge von etwa 26 nt, 27 nt, 28 nt, 29 nt oder 30 nt aufweist. In einigen Fällen hat der Handle die Nukleotidsequenz GAACAGCCCGAUAUAGAGGGCAAUAGAC (SEQ ID NR.: 26); und eine Länge von 28 nt. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der in 56K dargestellten Hhe-Cas13a-Aminosäuresequenz.; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz GUAACAAUCCCCGUAGACAGGGGAACUGCAAC (SEQ ID NR.: 17) umfasst; wobei der Handle eine Länge von etwa 30 nt, 31 nt, 32 nt, 33 nt, 34 nt oder 35 nt aufweist. In einigen Fällen umfasst die zweite C2c2-guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz GUAACAAUCCCCGUAGACAGGGGAACUGCAAC (SEQ ID NR.: 17) umfasst; und der Handle hat eine Länge von 32 nt. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Rca Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56G dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz UCACAUCACCGCCAAGACGACGGCGGACUGAACC (SEQ ID NR.: 25) umfasst; wobei der Handle eine Länge von etwa 32 nt, 33 nt, 34 nt, 35 nt, 36 nt oder 37 nt aufweist. In einigen Fällen umfasst die zweite C2c2-guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz UCACAUCACCGCCAAGACGACGGCGGACUGAACC (SEQ ID NR.: 25) umfasst; und der Handle hat eine Länge von 34 nt. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ppr Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56B dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz AAUUAUCCCAAAAUUUGAAGGGAACUACAAC (SEQ ID NR.: 19) umfasst; wobei der Handle eine Länge von etwa 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt oder 32 nt hat. In einigen Fällen umfasst die zweite C2c2-guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz AAUUAUCCCAAAAUUUGAAGGGAACUACAAC (SEQ ID NR.: 19) umfasst; und der Handle hat eine Länge von 30 nt. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lne Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56I dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz GAGUACCUCAAAACAAAAGAGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 20) umfasst (z.B. umfassend eine Nukleotidsequenz mit nur 1 nt, 2 nt, 3 nt, 4 nt oder 5 nt, Unterschiede von der Nukleotidsequenz GAGUACCUCAAAACAAAAGAGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 20)); wobei der Handle eine Länge von etwa 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt oder 32 nt hat. In einigen Fällen umfasst die zweite guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz GAGUACCUCAAAACAAAAGAGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 20) umfasst; wobei der Handle eine Länge von 30 nt hat. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lbu Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56C dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAAACA (SEQ ID NR.: 9) (z.B. umfassend eine Nukleotidsequenz mit nur 1 nt, 2 nt, 3 nt, 4 nt oder 5 nt, Unterschiede von der Nukleotidsequenz GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACA (SEQ ID NR.: 9)); wobei der Handle eine Länge von etwa 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt oder 32 nt hat. In einigen Fällen umfasst die zweite guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACA (SEQ ID NR.: 9) umfasst; wobei der Handle eine Länge von 31 nt hat. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lwa Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56E dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz GACCACCCCAAUUAUCGAAGGGGACUAAAACUU (SEQ ID NR.: 21) umfasst (z.B. umfassend eine Nukleotidsequenz mit nur 1 nt, 2 nt, 3 nt, 4 nt oder 5 nt, Unterschiede zur Nukleotidsequenz GACCACCCCAAAUAUCGAAGGGGACUAAAACUU (SEQ ID NR.: 21)); hat eine Länge von etwa 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt oder 32 nt. In einigen Fällen umfasst die zweite guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz GACCACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAACUU (SEQ ID NR.: 21) umfasst; wobei der Handle eine Länge von 32 nt hat. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der in 56D dargestellten Lsh Cas13a-Aminosäuresequenz; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz CACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 22) umfasst (z.B. umfassend eine Nukleotidsequenz mit nur 1 nt, 2 nt, 3 nt, 4 nt oder 5 nt Unterschiede zur Nukleotidsequenz CACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 22), wobei der Handle eine Länge von 25 nt, 26 nt, 27 nt, 28 nt oder 29 nt aufweist. In einigen Fällen umfasst die zweite guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz CACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 22) umfasst; wobei der Handle eine Länge von 27 nt hat. In manchen Fällen umfasst das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lse-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56A dargestellt ist; und die zweite C2c2-guideRNA einen Handle (einen Abschnitt von Nukleotiden, der an das Cas13a-Polypeptid bindet) umfasst, der eine Nukleotidsequenz mit nicht mehr als 1 Nukleotid (nt), nicht mehr als 2 nt, nicht mehr als 3 nt, nicht mehr als 4 nt oder nicht mehr als 5 nt Unterschiede von der Nukleotidsequenz GACUACCUCUAUAUGAAAGAGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 7) umfasst; wobei der Handle eine Länge von etwa 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt oder 32 nt hat. In einigen Fällen umfasst die zweite C2c2-guideRNA einen Handle, der die Nukleotidsequenz GACUACCUCUAUAUGAAAGAGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 7) umfasst; und der Handle eine Länge von 30 nt aufweist.
  • Multiplexing
  • Wie oben erwähnt, umfasst in einigen Fällen ein Verfahren der vorliegenden Erfindung: a) Inkontaktbringen einer Probe (z.B. einer Probe, die eine Target-RNA und eine Mehrzahl von Non-Target-RNAs umfasst) mit: i) einem Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array, umfassend zwei oder mehr C2c2-guideRNAs, welche jeweils eine andere Guide-Sequenz aufweisen; und (ii) einem C2c2-Protein, das den Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array in einzelne C2c2-guideRNAs spaltet und auch RNAs der Probe spaltet; und b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch C2c2-Protein-vermittelte RNA-Spaltung erzeugt wird.
  • In einigen Fällen können zwei oder mehr C2c2-guideRNAs auf einem Array (einem Vorläufer-C2c2 guideRNA-Array) vorhanden sein. Ein C2c2-Protein kann den Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array in einzelne C2c2-guideRNAs spalten (siehe z.B. 4 und 6).
  • In einigen Fällen enthält ein C2c2-guideRNA-Array 2 oder mehr C2c2-guideRNAs (z.B. 3 oder mehr, 4 oder mehr, 5 oder mehr, 6 oder mehr oder 7 oder mehr C2c2-guideRNAs). Die C2c2-guideRNAs eines gegebenen Arrays können auf verschiedene Target-Stellen der gleichen Target-RNA als Target haben (d.h. Guide-Sequenzen umfassen, die mit diesen hybridisieren) (z.B. welche die Nachweisempfindlichkeit erhöhen können) und/oder verschiedene Target-RNA-Moleküle als Target haben können (z.B. eine Familie von Transkripten, z.B. basierend auf Variationen wie Einzel-Nukleotid-Polymorphismen, Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) usw., und solche könnten z.B. verwendet werden, um Mehrfachstämme eines Virus wie etwa Influenzavirus-Varianten, Zika-Virus Varianten, HIV-Varianten und dergleichen nachzuweisen).
  • C2c2-Protein
  • Ein C2c2-Protein bindet an eine C2c2-guideRNA, wird durch die guideRNA (die mit der Target-RNA hybridisiert) zu einer einzelsträngigen Target-RNA geführt und wird dadurch „aktiviert“. Wenn die HEPN1- und HEPN2-Domänen des C2c2-Proteins intakt sind, spaltet das C2c2-Protein nach Aktivierung die Target-RNA, spaltet aber auch Non-Target-RNAs.
  • Beispiele natürlich vorkommender C2c2-Proteine sind in 8 dargestellt und sind als SEQ ID NR.: 1-6 bezeichnet. In einigen Fällen umfasst ein hier gegenständliches C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80% oder mehr (z.B. 85% oder mehr, 90% oder mehr, 95% oder mehr, 98% oder mehr, 99% oder mehr, 99,5% oder mehr oder 100%) Aminosäuresequenzidentität zur Aminosäuresequenz, die in einer der SEQ ID NR.: 1-6 angegeben ist. In einigen Fällen umfasst ein geeignetes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Listeria seeligeri C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein geeignetes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Leptotrichia buccalis C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein geeignetes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Rhodobacter capsulatus C2c2 Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 4 angegeben ist. In einigen Fällen umfasst ein geeignetes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Carnobacterium gallinarum C2c2 Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 5 angegeben ist. In einigen Fällen umfasst ein geeignetes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zum Herbinix hemicellulosilytica C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 angegeben ist. In einigen Fällen umfasst das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von 80% oder mehr mit der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Leptotrichia buccalis (Lbu) C2c2-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen ist das C2c2-Protein ein Leptotrichia buccalis (Lbu) C2c2-Protein (z.B. siehe SEQ ID NR.: 2). In einigen Fällen umfasst das C2c2-Protein die Aminosäuresequenz, die in einer der SEQ ID NR.: 1-2 und 4-6 angegeben ist.
  • In einigen Fällen ist ein C2c2-Protein, das in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung verwendet wird, kein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein. In einigen Fällen ist ein C2c2-Protein, das in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung verwendet wird, kein C2c2-Polypeptid mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu dem Lsh C2c2-Polypeptid, das in SEQ ID NR.: 3 dargestellt ist.
  • In einigen Fällen ist das C2c2-Protein um einen Faktor von 1,2-fach oder mehr effizienter als ein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein bei der Spaltung von RNA, die nicht das Target einer C2c2-guideRNA gemäß dem Verfahren ist. In einigen Fällen ist das C2c2-Protein um einen Faktor von 1,5 oder mehr effizienter als ein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein bei der Spaltung von RNA, die nicht das Target einer C2c2-guideRNA gemäß dem Verfahren ist. In einigen Fällen spaltet das C2c2-Polypeptid, das in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung verwendet wird, wenn es aktiviert wird, Non-Target-RNA mindestens 1,2-fach, mindestens 1,5-fach, mindestens 2-fach, mindestens 2,5-fach, mindestens 3-fach, mindestens 4-fach, mindestens 5-fach, mindestens 6-fach, mindestens 7-fach, mindestens 8-fach, mindestens 9-fach, mindestens 10-fach, mindestens 15-fach, mindestens 20-fach, mindestens 30-fach oder mehr als 30-fach, effizienter als Lsh C2c2.
  • In einigen Fällen weist das C2c2-Protein eine 50%-ige RNA-Spaltungseffizienz innerhalb 1 h vom Inkontaktbringen (z.B. 55% oder mehr, 60% oder mehr, 65% oder mehr, 70% oder mehr oder 75% oder mehr Spaltungseffizienz). In einigen Fällen zeigt das C2c2-Protein innerhalb von 40 min nach dem Inkontaktbringen mindestens 50% RNA-Spaltungseffizienz (z.B. 55% oder mehr, 60% oder mehr, 65% oder mehr, 70% oder mehr oder 75% oder mehr Spaltungseffizienz). In einigen Fällen zeigt das C2c2-Protein innerhalb von 30 min nach dem Inkontaktbringen mindestens 50% RNA-Spaltungseffizienz (z.B. 55% oder mehr, 60% oder mehr, 65% oder mehr, 70% oder mehr oder 75% oder mehr Spaltungseffizienz).
  • In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der in einer Probe vorhandenen RNA in einem Zeitraum von 30 Sekunden bis 60 Minuten, z.B. von 1 Minute bis 60 Minuten, von 30 Sekunden bis 5 Minuten, 1 Minute bis 5 Minuten, 1 Minute bis 10 Minuten, 5 Minuten bis 10 Minuten, 10 Minuten bis 15 Minuten, 15 Minuten bis 20 Minuten, 20 Minuten bis 25 Minuten, 25 Minuten bis 30 Minuten, 30 Minuten bis 35 Minuten, 40 Minuten bis 45 Minuten, 45 Minuten bis 50 Minuten, 50 Minuten bis 55 Minuten oder 55 Minuten bis 60 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, die in einer Probe vorhanden ist in einem Zeitraum von 30 Sekunden bis 5 Minuten (z.B. 1 Minute bis 5 Minuten, z.B. in einem Zeitraum von 1 Minute, Minute, 2 Minuten, 3 Minuten, 4 Minuten oder 5 Minuten). In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der in einer Probe vorhandenen RNA in einem Zeitraum von 5 Minuten bis 10 Minuten (z.B. in einem Zeitraum von 5 Minuten, 6 Minuten, 7 Minuten, 8 Minuten, 9 Minuten oder 10 Minuten). In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der in einer Probe vorhandenen RNA in einem Zeitraum von 10 Minuten bis 15 Minuten (z.B. 10 Minuten, 11 Minuten, 12 Minuten, 13 Minuten, 14 Minuten, oder 15 Minuten). In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, die in einer Probe vorhanden ist, in einem Zeitraum von 15 Minuten bis 20 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, die in einer Probe vorhanden ist in einem Zeitraum von 20 Minuten bis 25 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, die in einer Probe vorhanden ist in einem Zeitraum von 25 Minuten bis 30 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, die in einer Probe vorhanden ist in einem Zeitraum von 30 Minuten bis 35 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, die in einer Probe vorhanden ist in einem Zeitraum von 35 Minuten bis 40 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, die in einer Probe vorhanden ist in einem Zeitraum von 40 Minuten bis 45 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, die in einer Probe vorhanden ist in einem Zeitraum von 45 Minuten bis 50 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, die in einer Probe vorhanden ist in einem Zeitraum von 50 Minuten bis 55 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, die in einer Probe vorhanden ist in einem Zeitraum von 55 Minuten bis 60 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der in einer Probe vorhandenen RNA in einem Zeitraum von weniger als 1 Minute, z.B. in einem Zeitraum von 50 Sekunden bis 59 Sekunden, von 40 Sekunden bis 49 Sekunden von 30 Sekunden bis 39 Sekunden oder von 20 Sekunden bis 29 Sekunden. In einigen Fällen findet die Spaltung unter physiologischen Bedingungen statt. In manchen Fällen erfolgt die Spaltung bei einer Temperatur von 15 °C bis 20 °C, von 20 °C bis 25 °C, von 25 °C bis 30 °C, von 30 °C bis 35 °C oder von 35 °C bis 40 °C. In einigen Fällen findet die Spaltung bei etwa 37 °C statt. In einigen Fällen findet die Spaltung bei etwa 37 °C statt und die Reaktionsbedingungen umfassen zweiwertige Metallionen. In einigen Fällen ist das zweiwertige Metallion Mg2+. In einigen Fällen ist das zweiwertige Metallion Mn2+. In einigen Fällen liegt der pH-Wert der Reaktionsbedingungen zwischen pH 5 und pH 6. In einigen Fällen liegt der pH-Wert der Reaktionsbedingungen zwischen pH 6 und pH 7. In einigen Fällen liegt der pH-Wert der Reaktionsbedingungen zwischen pH 6,5 und pH 7,5. In einigen Fällen liegt der pH der Reaktionsbedingungen über pH 7,5.
  • Der Begriff „Spaltungseffizienz“ wird hier verwendet, um sich auf die Fähigkeit des C2c2-Proteins zu beziehen, RNA in der Probe schnell zu spalten, sobald das C2c2-Protein durch eine geeignete C2c2-guideRNA/Target-RNA-Hybridisierung aktiviert worden ist. „Spaltungseffizienz“ bezieht sich auf die RNA-Menge, die das Protein innerhalb eines gegebenen Zeitraums spalten kann. Zum Beispiel würde 50% Spaltungseffizienz anzeigen, dass 50% einer gegebenen RNA innerhalb einer spezifizierten Zeitspanne gespalten werden. Wenn z.B. eine RNA in einer Probe bei einer Ausgangskonzentration von 100 µM vorliegt, wird eine 50%-ige Spaltung erreicht, wenn 50 µl der RNA gespalten wurden. Als weiteres Beispiel, wenn eine Mehrzahl von RNA-Molekülen in der Probe vorhanden ist, wird eine 50%-ige Spaltung erreicht, wenn 50% der RNA-Moleküle gespalten wurden; Effizienz ist ein Ausdruck der Zeit, die für einen bestimmten Prozentsatz der gesamten zu spaltenden RNA benötigt wird. Dies kann mit jedem geeigneten Verfahren gemessen werden und dem Fachmann sind viele solcher Verfahren bekannt. Zum Beispiel kann eine markierte Nachweis-RNA verwendet werden. In einigen Fällen können die RNA-Spezies (gespalten gegenüber ungespalten) auf einem Gel aufgetrennt werden und die Menge an gespaltener RNA kann mit der Menge an ungespaltener RNA verglichen werden, siehe z.B. 3.
  • Wenn der Ausdruck „worin das C2c2-Protein mindestens X% der in der Probe vorhandenen RNAs spaltet“ (z.B. innerhalb einer spezifizierten Zeitspanne) verwendet wird, bedeutet dies, dass X% der „signalbildenden“ RNAs, die in der Probe vorliegen, innerhalb der angegebenen Zeitspanne gespalten werden. Welche RNAs „signalgebende“ RNAs sind, kann von der verwendeten Nachweismethode abhängen. Wenn z.B. eine markierte Nachweis-RNA verwendet wird, könnte die markierte Nachweis-RNA die einzige „signalproduzierende RNA“ sein. Die markierte Nachweis-RNA wird jedoch verwendet, um die RNAs der Probe darzustellen, und daher wird angenommen, dass das, was man für die markierte Nachweis-RNA beobachtet, repräsentativ dafür ist, was mit den Non-Target-RNAs der Probe geschieht. Wenn 50% der markierten Nachweis-RNA gespalten werden, wird dies im Allgemeinen als repräsentativ angesehen, dass 50% der in der Probe vorhandenen „RNAs“ gespalten werden. In einigen Fällen wird die RNA-Spaltung im Allgemeinen gemessen und als solche sind alle spaltbaren RNAs der Probe „signalerzeugende RNAs“. Wenn somit auf den Prozentsatz der in der gespaltenen Probe vorhandenen RNAs Bezug genommen wird, kann dieser Wert unter Verwendung irgendeines geeigneten Verfahrens gemessen werden, und unabhängig davon, welches Verfahren verwendet wird, bedeutet der Wert hierin allgemein, dass das Enzym die Hälfte der spaltbaren Targets in der Probe gespalten hat.
  • In einigen Fällen ist das C2c2-Protein kein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein. In einigen Fällen ist das C2c2-Protein um einen Faktor von 1,2 oder mehr (z.B. 1,5-fach oder mehr, 1,7-fach oder 2-fach oder mehr) effizienter als ein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein (z.B. beim Spalten der Non-Target-RNA). Als solches ist in manchen Fällen ein hier gegenständliches C2c2-Protein um einen Faktor von 1,2 oder mehr (z.B. 1,5 oder mehr, 1,7 oder mehr oder 2 oder mehr) wirksamer als ein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein bei der Spaltung von RNA, auf die die C2c2-guideRNA des Verfahrens nicht abzielt. In einigen Fällen spaltet das in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung verwendete C2c2-Polypeptid, wenn es aktiviert wird, Non-Target-RNA mindestens 1,2-fach, mindestens 1,5-fach, mindestens 2-fach, mindestens 2,5-fach, mindestens 3-fach, mindestens 4-fach, mindestens 5-fach, mindestens 6-fach, mindestens 7-fach, mindestens 8-fach, mindestens 9-fach, mindestens 10-fach, mindestens 15-fach, mindestens 20-fach, mindestens 30-fach oder mehr als 30-fach effizienter als Lsh C2c2.
  • Abweichende C2c2-Polypeptide
  • Abweichende C2c2-Polypeptide umfassen Varianten von einer der SEQ ID NR.: 1, 2 und 4-6, wobei das abweichende C2c2-Polypeptid reduzierte (oder nicht nachweisbare) Nukleaseaktivität aufweist. Zum Beispiel fehlt einem abweichenden C2c2-Protein in einigen Fällen eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne. Als ein weiteres Beispiel fehlt einem abweichenden C2c2-Protein eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne. In einigen Fällen fehlt einem abweichenden C2c2-Protein eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne und es fehlt eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid Aminosäuresubstitutionen von 1, 2, 3 oder 4 der Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053 der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2 angegeben ist {Leptotrichia buccalis C2c2), oder eine entsprechende Aminosäure einer C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 dargestellt ist. Entsprechende Aminosäuren in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 werden leicht identifiziert; siehe z.B. 22B. Zum Beispiel sind die Amino-Positionen in SEQ ID NR.: 1 (Listeria seeligeri C2c2), die R472, H477, R1048 und H1053 von SEQ ID NR.: 2 entsprechen, R445, H450, R1016 bzw. H1021. Als ein weiteres Beispiel sind Aminosäurepositionen in SEQ ID NR.: 4 {Rhodobacter capsulatus C2c2), die R472, H477, R1048 und H1053 von SEQ ID NR.: 2 entsprechen, R464, H469, R1052 bzw. H1057. Als ein weiteres Beispiel sind Aminosäurepositionen in SEQ ID NR.: 5 {Carnobacterium gallinarum C2c2), die R472, H477, R1048 und H1053 von SEQ ID NR.: 2 entsprechen, R467, H472, R1069 bzw. H1074. Als ein weiteres Beispiel können Aminosäurepositionen in SEQ ID Nr. 6 (Herbinix hemicellulosilytica C2c2), welche R472, H477, R1048 und H1053 von SEQ ID NR.: 2 entsprechen, R472, H477, R1044 bzw. H1049 sein.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid Aminosäuresubstitutionen der Aminosäuren R472 und H477 der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder entsprechende Aminosäuren einer in SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 5 oder SEQ ID NR.: 6 dargestellten C2c2-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid Aminosäuresubstitutionen der Aminosäuren R1048 und H1053 der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder entsprechende Aminosäuren einer in SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 5 oder SEQ ID NR.: 6. dargestellten C2c2-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid Aminosäuresubstitutionen der Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053 der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder entsprechende Aminosäuren einer in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 dargestellten C2c2-Aminosäurensequenz.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472 und H477. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 472 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 477 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A und H477A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1048 und H1053. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1048 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1053 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1048A und H1053A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 472 und 1048 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 477 und 1053 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A, H477A, R1048A und H1053A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R445 und H450. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 445 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 450 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R445A und H450A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1016 und H1021. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1016 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1021 ist eine beliebige andere Aminosäure als His. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1016A und H1021A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R445, H450, R1016 und H1021. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 445 und 1016 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 450 und 1016 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R445A, H450A, R1016A und H1021A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA auf (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 4 (Rhodobacter capsulatus C2c2) angegeben ist, und umfasst die eine Substitution der Aminosäuren R464 und H469. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 464 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 469 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R464A und H469A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1052 und H1057. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1052 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1057 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1052A und H1057A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R464, H469, R1052 und H1057. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 464 und 1052 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 469 und 1057 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R464A, H469A, R1052A und H1057A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 5 (Carnobacterium gallinarum C2c2) angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R467 und H472. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 467 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 472 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R469A und H472A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1069 und H1074. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1069 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1074 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1069A und H1074A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R467, H472, R1069 und H1074. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 467 und 1069 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 472 und 1074 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R469A, H472A, R1069A und H1074A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 (Herbinix hemicellulosilytica C2c2) angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472 und H477. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 472 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 477 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A und H477A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1044 und H1049. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1044 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1049 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1044A und H1049A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 6 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472, H477, R1044 und H1049. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 472 und 1044 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 477 und 1049 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A, H477A, R1044A und H1049A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA auf (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält aber die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 angegeben ist, und umfasst die Substitution von 1, 2, 3 oder 4 der Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053, so dass das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA aufweist (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und die Fähigkeit behält, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. Zum Beispiel weist das abweichende C2c2-Polypeptid in einigen Fällen weniger als 50%, weniger als 40%, weniger als 30%, weniger als 20%, weniger als 10%, weniger als 5%, weniger als 1% oder weniger als 0,1% der RNA-guided Spaltung einer Non-Target-RNA, die von einem C2c2-Polypeptid mit der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz gezeigt wird. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA auf (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • Jede der obigen abweichenden C2c2-Polypeptide kann auch eine Mutation umfassen (z.B. an irgendeiner der Positionen R1079, R1072 und K1082, wie nachstehend ausführlicher beschrieben), was zu einer verminderten Fähigkeit (z.B. einem Verlust der Fähigkeit) führt, den Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen hat ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine verminderte Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten (siehe z.B. die folgenden Beispiele und die verbundenen 26C-26D, 35D und 37). Zum Beispiel umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid in einigen Fällen Aminosäuresubstitutionen von 1, 2 oder 3 der Aminosäuren R1079, R1072 und K1082 der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 (Leptotrichia buccalis C2c2) oder einer entsprechenden Aminosäure einer beliebigen C2c2-Aminosäuresequenz (z.B. der C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 5 oder SEQ ID NR.: 6). Entsprechende Aminosäuren in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 werden leicht identifiziert. Zum Beispiel sind die Amino-Positionen in SEQ ID NR.: 1 (Listeria seeligeri C2c2), die R1079, R1072 und K1082 von SEQ ID NR.: 2 entsprechen, R1048, R1041 bzw. K1051. Als ein weiteres Beispiel sind Aminosäurepositionen in SEQ ID NR.: 4 {Rhodobacter capsulatus C2c2), die R1079, R1072 und K1082 von SEQ ID NR.: 2 entsprechen, R1085, R1078 bzw. K1088. Als ein weiteres Beispiel sind Aminosäurepositionen in SEQ ID NR.: 5 (Carnobacterium gallinarum C2c2), die R1079, R1072 und K1082 von SEQ ID NR.: 2 entsprechen, R1099, R1092 bzw. K1102. Als ein weiteres Beispiel sind Aminosäurepositionen in SEQ ID NR.: 6 (Herbinix hemicellulosilytica C2c2), die R1079 und R1072 von SEQ ID NR.: 2 entsprechen, R1172 bzw. R1165.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure R1079 (z.B. R1079A) der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure einer beliebigen C2c2-Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure R1072 (z.B. R1072A) der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure einer beliebigen C2c2-Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure K1082 (z.B. K1082A) der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure einer beliebigen C2c2-Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine oder mehrere (z.B. zwei oder mehr oder alle drei) Aminosäuresubstitutionen an Positionen, ausgewählt aus R1079 (z.B. R1079A), R1072 (z.B. R1072A) und K1082 (z.B. K1082A) der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist, oder die entsprechende Aminosäure einer beliebigen C2c2-Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6).
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 angegeben ist, und eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure R1079 (z.B. R1079A) der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure irgendeiner C2c2 Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 angegeben ist, und eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure R1072 (z.B. R1072A) der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure irgendeiner C2c2 Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 angegeben ist, und eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure K1082 (z.B. K1082A) der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure irgendeiner C2c2 Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 angegeben ist, und eine oder mehrere (z.B. zwei oder mehr oder alle drei) Aminosäuresubstitutionen an Positionen umfasst, die aus R1079 (z.B. R1079A) R1072 (z.B. R1072A) und K1082 (z.B. K1082A) der Aminosäuresequenz ausgewählt sind, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist, oder die entsprechende Aminosäure einer beliebigen C2c2-Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6).
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist, und eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure R1041 (z.B. R1041A) der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure irgendeiner C2c2 Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 angegeben ist, und eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure R1048 (z.B. R1048A) der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure irgendeiner C2c2 Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist, und eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure K1051 (z.B. K1051A) der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure irgendeiner C2c2 Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1 angegeben ist, und eine oder mehrere (z.B. zwei oder mehr oder alle drei) Aminosäuresubstitutionen an Positionen umfasst, die aus R1048 (z.B. R1048A) ausgewählt sind. R1041 (z.B. R1041A) und K1051 (z.B. K1051A) der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist, oder die entsprechende Aminosäure einer beliebigen C2c2-Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6).
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 4 angegeben ist, und eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure R1085 (z.B. R1085A) der in SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure irgendeiner C2c2 Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 dargestellt ist, und eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure R1078 (z.B. R1078A) der in SEQ ID NR.: 4 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure irgendeiner C2c2 Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 dargestellt ist, und eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure K1088 (z.B. K1088A) der in SEQ ID NR.: 4 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure irgendeiner C2c2 Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 4 angegeben ist, und eine oder mehrere (z.B. zwei oder mehr oder alle drei) Aminosäuresubstitutionen an Positionen umfasst, die aus R1085 (z.B. R1085A) R1078 (z.B. R1078A) und K1088 (z.B. K1088A) der in SEQ ID NR.: 4 dargestellten Aminosäuresequenz ausgewählt sind oder die entsprechende Aminosäure einer beliebigen C2c2-Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6).
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist, und eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure R1099 (z.B. R1099A) der in SEQ ID NR.: 5 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure irgendeiner C2c2 Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 6). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist, und eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure R1092 (z.B. R1092A) der in SEQ ID NR.: 5 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure irgendeiner C2c2 Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 6). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist, und eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure KI 102 (z.B. KI 102A) der in SEQ ID NR.: 5 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure einer beliebigen C2c2-Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 2 oder SEQ ID NR.: 6 dargestellt ist). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 angegeben ist, und eine oder mehrere (z.B. zwei oder mehr oder alle drei) Aminosäuresubstitutionen an Positionen umfasst, die aus R1099 (z.B. R1099A). R1092 (z.B. R1092A) und K1102 (z.B. K1102A) der in SEQ ID NR.: 5 dargestellten Aminosäuresequenz ausgewählt sind oder die entsprechende Aminosäure einer C2c2-Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 6).
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 dargestellt ist, und eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure R1 172 (z.B. R1 172A) der in SEQ ID NR.: 6 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure einer beliebigen C2c2-Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 5 oder SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 angegeben ist, und eine Aminosäuresubstitution der Aminosäure R1 165 (z.B. R1 165A) der in SEQ ID NR.: 6 dargestellten Aminosäuresequenz oder die entsprechende Aminosäure einer beliebigen C2c2-Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 5 oder SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist). In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 6 angegeben ist, und eine oder mehrere (z.B. beide) Aminosäuresubstitutionen an Positionen umfasst, die aus R1172 (z.B. R117A) und R1165 (z.B. R116A) der in SEQ ID NR.: 6 angegebenen Aminosäuresequenz ausgewählt sind oder die entsprechende Aminosäure einer beliebigen C2c2-Aminosäuresequenz (z.B. eine C2c2-Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 5, oder SEQ ID NR.: 2).
  • C2c2-guideRNA
  • Eine hier gegenständliche C2c2-guideRNA (z.B. eine C2c2-crRNA) umfasst eine Guide-Sequenz und eine konstante Region (z.B. eine Region, die 5' der Guide-Sequenz ist). Die Region, die 5' der Guide-Sequenz ist, bindet an das C2c2-Protein (und kann als eine Proteinbindungsregion betrachtet werden), während die Guide-Sequenz an eine Target-Sequenz der Target-RNA hybridisiert.
  • Guide-Sequenz
  • Die Guide-Sequenz weist eine Komplementarität mit einer Target-Sequenz der einzelsträngigen Target-RNA auf (hybridisiert mit dieser). In einigen Fällen ist die Base der Target-RNA, die unmittelbar 3' von der Target-Sequenz (Protospacer) liegt, kein G. In einigen Fällen ist die Guide-Sequenz 16-28 Nukleotide (nt) lang (z.B. 16-26, 16-24, 16-22, 16-20, 16-18, 17-26, 17-24, 17-22, 17-20, 17-18, 18-26, 18-24 oder 18-22 nt lang). In einigen Fällen ist die Guide-Sequenz 18-24 Nukleotide (nt) lang. In einigen Fällen ist die Guide-Sequenz mindestens 16 nt lang (z.B. mindestens 18, 20 oder 22 nt lang). In einigen Fällen ist die Guide-Sequenz mindestens 17 nt lang. In einigen Fällen ist die Guide-Sequenz mindestens 18 nt lang. In einigen Fällen ist die Guide-Sequenz mindestens 20 nt lang.
  • In einigen Fällen hat die Guide-Sequenz 80% oder mehr (z.B. 85% oder mehr, 90% oder mehr, 95% oder mehr oder 100% Komplementarität) mit der Target-Sequenz der einzelsträngigen Target-RNA. In einigen Fällen ist die Guide-Sequenz 100% komplementär zur Target-Sequenz der einzelsträngigen Target-RNA.
  • Konstante Region
  • Die folgenden 3 Sequenzen sind jeweils ein Beispiel für eine konstante Region einer natürlich vorliegenden C2c2-guideRNA (z.B. eine Region, die 5' der Guide-Sequenz ist):
    • GACUACCUCUAUAUGAAAGAGGACUAAAAC (SEQ ID NR.: 7) (Listeria seeligeri) („Lse“)
    • CCACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAACA (SEQ ID NR.: 8) (Leptotrichia shahii) („Lsh“)
    • GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACA (SEQ ID NR.: 9) (Leptotrichia buccalis) („Lbu“)
  • In einigen Ausführungsformen umfasst eine hier gegenständliche C2c2-guideRNA eine Nukleotidsequenz mit 70% oder mehr Identität (z.B. 80% oder mehr, 85% oder mehr, 90% oder mehr, 95% oder mehr, 98% oder mehr, 99% oder mehr oder 100% Identität) mit der Sequenz, die in einem der SEQ ID NR.: 7-9 aufgeführt ist. In einigen Ausführungsformen umfasst eine hier gegenständliche C2c2-guideRNA eine Nukleotidsequenz mit einer Identität von 90% oder mehr (z.B. 95% oder mehr, 98% oder mehr, 99% oder mehr oder 100% Identität) mit der in einem beliebigen Beispiel angegebenen Sequenz von SEQ ID NR.: 7-9. In einigen Ausführungsformen umfasst eine hier gegenständliche RNA-C2c2-guideRNA die Nukleotidsequenz, die in einer der SEQ ID NR.: 7-9 angegeben ist.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst eine hier gegenständliche C2c2-guideRNA eine Nukleotidsequenz mit 70% oder mehr Identität (z.B. 80% oder mehr, 85% oder mehr, 90% oder mehr, 95% oder mehr, 98% oder mehr, 99% oder mehr oder 100% Identität) mit der in SEQ ID NO : 9 angegebenen Sequenz. In einigen Ausführungsformen umfasst eine hier gegenständliche C2c2-guideRNA eine Nukleotidsequenz mit 90% oder mehr Identität (z.B. 95% oder mehr, 98% oder mehr, 99% oder mehr oder 100% Identität) mit der in SEQ ID Nr. 9 angegebenen Sequenz. In einigen Ausführungsformen umfasst eine hier gegenständliche RNA-C2c2-guideRNA die in SEQ ID NR.: 9 angegebene Nukleotidsequenz.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst eine hier gegenständliche C2c2-guideRNA kein Nukleotidsequenz einer Letotrichia shahii (LsH) C2c2-guideRNA. Zum Beispiel ist in manchen Fällen das C2c2-Protein, das verwendet wird, kein C2c2 von Leptotrichia shahii (z.B. kein Lsh C2c2-Protein), und in einigen solchen Fällen ist die C2c2-guideRNA, die verwendet wird, auch nicht von Leptotrichia shahii (z.B. enthält die verwendete guideRNA nicht die konstante Region einer Lsh-C2c2-guideRNA). Daher enthält eine hier gegenständliche C2c2-guideRNA in einigen Fällen nicht die Sequenz, die in SEQ ID NR.: 8 angegeben ist.
  • In einigen Fällen enthält die C2c2-guideRNA einen doppelsträngigen RNA-Duplex (dsRNA-Duplex). Siehe z.B. 7A, welche eine C2c2-guideRNA von Lbu zeigt, hybridisiert an eine einzelsträngige Target-RNA, wobei die C2c2-guideRNA einen dsRNA-Duplex enthält, der 4 Basenpaare (bp) lang ist. In einigen Fällen enthält eine C2c2-guideRNA einen dsRNA-Duplex mit einer Länge von 2 bis 12 bp (z.B. 2 bis 10 bp, 2 bis 8 bp, 2 bis 6 bp, 2 bis 5 bp, 2 bis 4 bp, 3 bis 12 bp, 3 bis 10 bp, 3 bis 8 bp, 3 bis 6 bp, 3 bis 5 bp, 3 bis 4 bp, 4 bis 12 bp, 4 bis 10 bp, 4 bis 8 bp, 4 bis 6 bp, oder 4 bis 5 bp). In einigen Fällen umfasst eine C2c2-guideRNA einen dsRNA-Duplex, der eine Länge von 2 oder mehr Basenpaaren aufweist (z.B. 3 oder mehr, 4 oder mehr, 5 oder mehr, 6 oder mehr oder 7 oder mehr Basenpaare lang). In einigen Fällen enthält eine C2c2-guideRNA einen dsRNA-Duplex, der länger ist als der dsRNA-Duplex einer entsprechenden Wildtyp-C2c2-guideRNA. Siehe z.B. 7A, die eine C2c2-guideRNA von Lbu zeigt, die an eine einzelsträngige Target-RNA hybridisiert ist, wobei die C2c2-guideRNA einen dsRNA-Duplex enthält, der 4 Basenpaare (bp) lang ist. Als solche kann eine C2c2-guideRNA in einigen Fällen einen dsRNA-Duplex umfassen, der 5 oder mehr Basenpaare lang ist (z.B. 6 oder mehr, 7 oder mehr oder 8 oder mehr Basenpaare lang). In einigen Fällen enthält eine C2c2-guideRNA einen dsRNA-Duplex, der kürzer ist als der dsRNA-Duplex einer entsprechenden Wildtyp-C2c2-guideRNA. In einigen Fällen enthält eine C2c2-guideRNA einen dsRNA-Duplex, der weniger als 4 bp lang ist. In einigen Fällen enthält eine C2c2-guideRNA einen dsRNA-Duplex mit einer Länge von 2 oder 3 bp Länge.
  • In einigen Fällen ist die Region einer C2c2-guideRNA, die 5' der Guide-Sequenz ist, 15 oder mehr Nukleotide (nt) lang (z.B. 18 oder mehr, 20 oder mehr, 21 oder mehr, 22 oder mehr, 23 oder mehr, 24 oder mehr, 25 oder mehr, 26 oder mehr, 27 oder mehr, 28 oder mehr, 29 oder mehr, 30 oder mehr, 31 oder mehr, 32 oder mehr, 33 oder mehr, 34 oder mehr, oder 35 nt oder mehr lang). In einigen Fällen ist die Region einer C2c2-guideRNA, die 5' der Guide-Sequenz ist, 29 oder mehr nt lang.
  • In einigen Fällen hat die Region einer C2c2-guideRNA, die 5' der Guide-Sequenz ist, eine Länge in einem Bereich von 12 bis 100 nt (z.B. 12 bis 90, 12 bis 80, 12 bis 70, 12 bis 60, 12 bis 50, 12 bis 40, 15 bis 100, 15 bis 90, 15 bis 80, 15 bis 70, 15 bis 60, 15 bis 50, 15 bis 40, 20 bis 100, 20 bis 90, 20 bis 80, 20 bis 70, 20 bis 60, 20 bis 50, 20 bis 40, 25 bis 100, 25 bis 90, 25 bis 80, 25 bis 70, 25 bis 60, 25 bis 50, 25 bis 40, 28 bis 100, 28 bis 90 28 bis 80, 28 bis 70, 28 bis 60, 28 bis 50, 28 bis 40, 29 bis 100, 29 bis 90, 29 bis 80, 29 bis 70, 29 bis 60, 29 bis 50 oder 29 bis 40 nt). In einigen Fällen hat die Region einer C2c2-guideRNA, die 5' der Guide-Sequenz ist, eine Länge in einem Bereich von 28 bis 100 nt. In einigen Fällen hat die Region einer C2c2-guideRNA, die 5' der Guide-Sequenz ist, eine Länge in einem Bereich von 28 bis 40 nt.
  • In einigen Fällen ist die Region der C2c2-guideRNA, die 5' der Guide-Sequenz ist, relativ zu der entsprechenden Region einer entsprechenden Wildtyp-C2c2-guideRNA verkürzt (kürzer). Zum Beispiel enthält die reife LseC2c2-guideRNA eine Region 5' der Guide-Sequenz, die 30 Nukleotide (nt) lang ist, und eine vorliegende verkürzte C2c2-guideRNA (relativ zur Lse-C2c2-guideRNA) kann daher eine Region 5 der Guide-Sequenz aufweisen, die weniger als 30 nt lang ist (z.B. weniger als 29, 28, 27, 26, 25, 22 oder 20 nt lang). In einigen Fällen enthält eine verkürzte C2c2-guideRNA eine Region 5' der Guide-Sequenz, die eine Länge in einem Bereich von 12 bis 29 nt (z.B. 12 bis 28, 12 bis 27, 12 bis 26, 12 bis 25, 12 bis 22, 12 bis 20, 12 bis 18 nt) aufweist. In einigen Fällen ist die verkürzte C2c2-guideRNA um ein oder mehrere nt verkürzt (z.B. 2 oder mehr, 3 oder mehr, 4 oder mehr, 5 oder mehr oder 10 oder mehr nt), z.B. relativ zu einer entsprechenden Wildtyp C2c2 Führung).
  • In einigen Fällen ist die Region der C2c2-guideRNA, die 5' der Guide-Sequenz ist, relativ zu der entsprechenden Region einer entsprechenden Wildtyp-C2c2-guideRNA verlängert (länger). Zum Beispiel enthält die reife Lse C2c2 guideRNA eine Region 5' der Guide-Sequenz, die 30 Nukleotide (nt) lang ist, und eine verlängerte C2c2 guideRNA (relativ zur Lse C2c2 guideRNA) kann daher eine Region 5' der Guide-Sequenz aufweisen, die länger als 30 nt ist (z.B. länger als 31, länger als 32, länger als 33, länger als 34 oder länger als 35 nt). In einigen Fällen enthält eine verlängerte C2c2-guideRNA einen Bereich 5' der Guide-Sequenz, der eine Länge in einem Bereich von 30 bis 100 nt (z.B. 30 bis 90, 30 bis 80, 30 bis 70, 30 bis 60, 30 bis 50 oder 30 bis 40 nt) aufweist. In einigen Fällen umfasst die erweiterte C2c2-guideRNA eine Region 5' der Guide-Sequenz, die um ein oder mehrere nt (z.B. 2 oder mehr, 3 oder mehr, 4 oder mehr, 5 oder mehr oder 10 oder mehr nt) verlängert ist (z.B. relativ zu der entsprechenden Region einer entsprechenden Wildtyp-C2c2-guideRNA).
  • In einigen Fällen weist eine C2c2 Target-RNA eine Länge von 30 oder mehr Nukleotiden (nt) auf (z.B. 34 oder mehr, 40 oder mehr, 45 oder mehr, 50 oder mehr, 55 oder mehr, 60 oder mehr, 65 oder mehr, 70 oder mehr oder 80 oder mehr nt lang). In einigen Fällen ist die C2c2-guideRNA 35 nt oder mehr lang.
  • In einigen Fällen hat eine RNA der hier gegenständlichen C2c2-guideRNA eine Länge in einem Bereich von 30 bis 120 nt (z.B. 30 bis 110, 30 bis 100, 30 bis 90, 30 bis 80, 30 bis 70, 30 bis 60, 35 bis 120, 35 bis 110, 35 bis 100, 35 bis 90, 35 bis 80, 35 bis 70, 35 bis 60, 40 bis 120, 40 bis 110, 40 bis 100, 40 bis 90, 40 bis 80, 40 bis 70, 40 bis 60, 50 bis 120, 50 bis 110, 50 bis 100, 50 bis 90, 50 bis 80 oder 50 bis 70 nt). In einigen Fällen hat die C2c2-guideRNA eine Länge in einem Bereich von 33 bis 80 nt. In einigen Fällen hat die C2c2-guideRNA eine Länge in einem Bereich von 35 bis 60 nt.
  • In einigen Fällen ist eine hier gegenständliche C2c2-guideRNA relativ zur entsprechenden Wildtyp-C2c2-guideRNA (kürzer) verkürzt. Zum Beispiel kann eine reife Lse C2c2-guideRNA 50 Nukleotide (nt) lang sein, und eine verkürzte C2c2-guideRNA (relativ zur Lse-C2c2-guideRNA) kann daher in manchen Fällen weniger als 50 nt Länge (z.B. weniger als 49, 48, 47, 46, 45, 42 oder 40 nt Länge) aufweisen. In einigen Fällen hat eine verkürzte C2c2-guideRNA eine Länge in einem Bereich von 30 bis 49 nt (z.B. 30 bis 48, 30 bis 47, 30 bis 46, 30 bis 45, 30 bis 42, 30 bis 40, 35 bis 49, 35 bis 48, 35 bis 47, 35 bis 46, 35 bis 45, 35 bis 42 oder 35 bis 40 nt). In einigen Fällen ist die verkürzte C2c2-guideRNA um ein oder mehrere nt verkürzt (z.B. 2 oder mehr, 3 oder mehr, 4 oder mehr, 5 oder mehr oder 10 oder mehr nt), z.B. relativ zu einer entsprechenden Wildtyp C2c2-guide).
  • In einigen Fällen wird eine hier gegenständliche C2c2-guideRNA relativ zu einer entsprechenden Wildtyp-C2c2-guideRNA verlängert (länger). Zum Beispiel kann eine reife Lse C2c2 guideRNA 50 Nukleotide (nt) lang sein, und eine verlängerte C2c2 guideRNA (relativ zur Lse C2c2 guideRNA) kann daher in manchen Fällen länger als 50 nt (z.B. länger als 51, länger als 52, länger als 53, länger als 54 oder länger als 55 nt) sein. In einigen Fällen hat eine verlängerte C2c2-guideRNA eine Länge in einem Bereich von 51 bis 100 nt (z.B. 51 bis 90, 51 bis 80, 51 bis 70, 51 bis 60, 53 bis 100, 53 bis 90, 53 bis 80, 53 bis 70, 53 bis 60, 55 bis 100, 55 bis 90, 55 bis 80, 55 bis 70 oder 55 bis 60 nt). In einigen Fällen wird die verlängerte C2c2-guideRNA um ein oder mehrere nt verlängert (z.B. im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyp-C2c2-guideRNA) (z.B. 2 oder mehr, 3 oder mehr, 4 oder mehr, 5 oder mehr oder 10 oder mehr nt).
  • VERFAHREN ZUM SPALTEN EINES VORLÄUFER-C2c2-guideRNA-ARRAYS
  • Die vorliegende Offenbarung stellt ein Verfahren zum Spalten eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays in zwei oder mehr C2c2-guideRNAs bereit. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays mit einem C2c2-Protein. Der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array umfasst zwei oder mehr (z.B. 2, 3, 4, 5 oder mehr) C2c2-guideRNAs, welche jeweils eine unterschiedliche Guide-Sequenz haben können. Das C2c2-Protein spaltet den Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array in einzelne C2c2-guideRNAs. In einigen Fällen schließt die konstante Region (auch als „Handle“ bezeichnet) einer C2c2-guideRNA eine Nukleotidsequenz von der Vorläufer-guideRNA ein (z.B. eine Sequenz, die normalerweise vor der Spaltung des guideRNA-Arrays vorhanden ist). Mit anderen Worten enthält die konstante Region einer hier gegenständlichen C2c2-guideRNA in einigen Fällen einen Vorläufer-crRNA-Handle.
  • In einigen Fällen findet der Kontaktierungsschritt nicht innerhalb einer Zelle statt, z.B. innerhalb einer lebenden Zelle. In einigen Fällen findet der Kontaktierungsschritt innerhalb einer Zelle (z.B. einer Zelle in vitro (in Kultur), einer Zelle ex vivo, einer Zelle in vivo) statt. Jede Zelle ist geeignet. Beispiele für Zellen, in denen das Inkontaktbringen stattfinden kann, umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, eine eukaryotische Zelle; eine prokaryotische Zelle (z.B. eine Bakterienzelle, eine Archaeenzelle); einen einzelligen eukaryotischen Organismus; eine Pflanzenzelle; eine Algenzelle, z.B. Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens, C. agardas und dergleichen; eine Pilzzelle (z.B. eine Hefezelle); eine Tierzelle; eine Invertebratenzelle (z.B. Fruchtfliege, Nesseltier, Stachelhäuter, Nematode, ein Insekt, eine Arachnide usw.); eine Wirbeltierzelle (z.B. Fisch, Amphibie, Reptil, Vogel, Säugetier); eine Säugetierzelle (z.B. ein Mensch; ein nichtmenschlicher Primat; ein Huftier; eine Katze; ein Rind; ein Schaf; eine Ziege; eine Ratte; eine Maus; ein Nagetier; ein Schwein; ein Schaf; eine Kuh; usw.); eine Parasitenzelle (z.B. Helminthen, Malaria-Parasiten usw.).
  • C2c2-Protein
  • Wenn ein C2c2-Protein intakte HEPN-Domänen aufweist, kann es RNA (Target-RNA sowie Non-Target-RNA) spalten, nachdem es „aktiviert“ wurde. Das C2c2-Protein kann jedoch Vorläufer-C2c2-guideRNAs in reife C2c2-guideRNAs auf eine HEPN-unabhängige Weise spalten. Wenn beispielsweise einem C2c2-Protein eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne fehlt und auch eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne fehlt, kann es die Vorläufer-guideRNA noch in reife guideRNA spalten. Bei Verwendung in einem Verfahren, das eine Vorläufer-C2c2-guideRNA und/oder einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array enthält, kann dem C2c2-Protein (und wird in manchen Fällen) als solchem eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne und/oder eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne fehlen. In einigen Fällen fehlt dem C2c2-Protein eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne und eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne.
  • Ein C2c2-Protein, dem eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne fehlt und dem eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne fehlt, kann in einigen Fällen in Bindungsverfahren (z.B. Bildgebungsverfahren) verwendet werden. Zum Beispiel umfasst ein Verfahren zur Bindung (und/oder Bildgebung) in einigen Fällen das Inkontaktbringen einer Probe mit einem Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array und einem C2c2-Protein, dem eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne fehlt und dem eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne fehlt. In solchen Fällen kann das C2c2-Protein nachweisbar markiert werden (z.B. Fusion eines Epitop-Tags, Fusion mit einem Fluorophor, Fusion mit einem fluoreszierenden Protein, wie einem grün fluoreszierenden Protein, usw.).
  • Ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Spaltung eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays geeignet ist, kann intakte HEPN1- und HEPN2-Domänen aufweisen. In einigen Fällen fehlt dem C2c2-Protein jedoch eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne und/oder es fehlt eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne.
  • In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung zur Spaltung eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit 80% oder mehr (z.B. 85% oder mehr, 90% oder mehr, 95% oder mehr, 98% oder mehr, 99% oder mehr, 99,5% oder mehr oder 100%) Aminosäuresequenzidentität zur Aminosäuresequenz, die in einer der SEQ ID NR.: 1-6 angegeben ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung zur Spaltung eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Listeria seeligeri C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung zur Spaltung eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Leptotrichia buccalis C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung zur Spaltung eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Rhodobacter capsulatus C2c2 Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung zur Spaltung eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Carnobacterium gallinarum C2c2 Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung zur Spaltung eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Herbinix hemicellulosilytica C2c2 Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung zur Spaltung eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit 80% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zur in SEQ ID NR.: 2 angegebenen Leptotrichia buccalis (Lbu) C2c2-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen ist ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ein Leptotrichia buccalis (Lbu) C2c2-Protein (z.B. siehe SEQ ID NR.: 2). In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung zur Spaltung eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays geeignet ist, die Aminosäuresequenz, die in einer der SEQ ID NR.: 1-2 und 4-6 angegeben ist.
  • In einigen Fällen ist ein C2c2-Protein, das in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung zur Spaltung eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays verwendet wird, kein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein. In einigen Fällen ist ein C2c2-Protein, das in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung zur Spaltung eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays verwendet wird, kein C2c2-Polypeptid mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% bei mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu dem in SEQ ID NR.: 3 dargestellten Lsh C2c2-Polypeptid.
  • In einigen Fällen ist ein C2c2-Polypeptid, das zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung zur Spaltung eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays geeignet ist, ein abweichendes C2c2-Polypeptid. Abweichende C2c2-Polypeptide, die zur Verwendung in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung zur Spaltung eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays geeignet sind, umfassen Varianten von einer der SEQ ID NR.: 1, 2 und 4-6, wobei das abweichende C2c2-Polypeptid reduzierte (oder nicht nachweisbare) Nuklease-Aktivität aufweist. Zum Beispiel fehlt einem abweichenden C2c2-Protein in einigen Fällen eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne. Als ein weiteres Beispiel fehlt einem abweichenden C2c2-Protein eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne. In einigen Fällen fehlt einem abweichenden C2c2-Protein eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne und es fehlt eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid Aminosäuresubstitutionen von 1, 2, 3 oder 4 der Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053 der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2 angegeben ist (Leptotrichia buccalis C2c2) oder eine entsprechende Aminosäure einer C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 dargestellt ist. Entsprechende Aminosäuren in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 werden leicht identifiziert; siehe z.B. 22B. Zum Beispiel sind die Amino-Positionen in SEQ ID NR.: 1 (Listeria seeligeri C2c2), die R472, H477, R1048 und H1053 von SEQ ID NR.: 2 entsprechen, jeweils R445, H450, R1016 bzw. H1021.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid Aminosäuresubstitutionen der Aminosäuren R472 und H477 der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist, oder eine entsprechende Aminosäure einer C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 5 oder SEQ ID NR.: 6 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid Aminosäuresubstitutionen der Aminosäuren R1048 und H1053 der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 angegeben ist, oder eine entsprechende Aminosäure einer C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 5 oder SEQ ID NR.: 6 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid Aminosäuresubstitutionen der Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053 der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder einer entsprechenden Aminosäure einer in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6dargestellten C2c2-Aminosäuresequenz.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472 und H477. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 472 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 477 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A und H477A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1048 und H1053. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1048 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1053 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1048A und H1053A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 472 und 1048 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 477 und 1053 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A, H477A, R1048A und H1053A. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R445 und H450. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 445 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 450 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R445A und H450A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1016 und H1021. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1016 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1021 ist eine beliebige andere Aminosäure als His. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1016A und H1021A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R445, H450, R1016 und H1021. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 445 und 1016 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 450 und 1016 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R445A, H450A, R1016A und H1021A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 4 (Rhodobacter capsulatus C2c2) angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R464 und H469. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 464 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 469 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R464A und H469A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1052 und H1057. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1052 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1057 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1052A und H1057A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R464, H469, R1052 und H1057. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 464 und 1052 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 469 und 1057 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R464A, H469A, R1052A und H1057A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 5 (Carnobacterium gallinarum C2c2) angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R467 und H472. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 467 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 472 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R469A und H472A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1069 und H1074. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1069 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1074 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1069A und H1074A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R467, H472, R1069 und H1074. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 467 und 1069 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 472 und 1074 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R469A, H472A, R1069A und H1074A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 (Herbinix hemicellulosilytica C2c2) angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472 und H477. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 472 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 477 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A und H477A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1044 und H1049. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1044 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1049 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1044A und H1049A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 6 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472, H477, R1044 und H1049. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 472 und 1044 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 477 und 1049 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A, H477A, R1044A und H1049A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA auf (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält aber die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array
  • Wie in den folgenden Arbeitsbeispielen gezeigt, kann ein C2c2-Protein eine Vorläufer-C2c2-guideRNA in eine reife guideRNA spalten, z.B. durch endoribonukleolytische Spaltung des Vorläufers. Wie auch in den folgenden Arbeitsbeispielen gezeigt, kann ein C2c2-Protein einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array (der mehr als eine C2c2-guideRNA, angeordnet in Tandem, enthält) in zwei oder mehr einzelne C2c2-guideRNAs spalten. Somit umfasst in einigen Fällen ein Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr (z.B. 3 oder mehr, 4 oder mehr, 5 oder mehr, 2, 3, 4 oder 5) C2c2-guideRNAs (z.B. als Vorläufer Moleküle hintereinander angeordnet). In einigen Fällen hat jede guideRNA eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays eine andere Guide-Sequenz. In einigen Fällen weisen zwei oder mehr guideRNAs eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays die gleiche Guide-Sequenz auf.
  • In einigen Fällen umfasst der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr C2c2-guideRNAs, die verschiedene Target-Stellen im demselben Target-RNA-Molekül als Target haben. Zum Beispiel kann ein solches Szenario in manchen Fällen die Nachweisempfindlichkeit erhöhen, indem das C2c2-Protein aktiviert wird, wenn eines der beiden mit dem Target-RNA-Molekül hybridisiert.
  • In einigen Fällen umfasst der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr C2c2-guideRNAs, die verschiedene Target-RNA-Moleküle als Target haben. Zum Beispiel kann ein solches Szenario zu einem positiven Signal führen, wenn eine Familie einer potentiellen Target-RNA vorhanden ist. Ein solcher Array ist verwendbar, wenn eine Familie von Transkripten das Target sein soll, z.B. basierend auf Variationen, wie z.B. Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) (z.B. für diagnostische Zwecke). Dies könnte auch nützlich sein, um nachzuweisen, ob einer von mehreren verschiedenen Virusstämmen vorhanden ist (z.B. Influenzavirusvarianten, Zika-Virusvarianten, HIV-Varianten und dergleichen). Dies könnte auch nützlich sein, um nachzuweisen, ob irgendeine von einer Anzahl verschiedener Spezies, Stämme, Isolate oder Varianten eines Bakteriums vorhanden ist (z.B. verschiedene Arten, Stämme, Isolate oder Varianten von Mycobacterium, verschiedene Arten, Stämme, Isolate, oder Varianten von Neisseria, verschiedene Arten, Stämme, Isolate oder Varianten von Staphylococcus aureus, verschiedene Arten, Stämme, Isolate oder Varianten von E. coli usw.).
  • ABWEICHENDE C2c2-POLYPEPTIDE
  • Die vorliegende Offenarung stellt ein abweichendes C2c2-Polypeptid sowie eine Nukleinsäure bereit (z.B. einen rekombinanten Expressionsvektor), umfassend eine Nukleotidsequenz, die das C2c2-Polypeptid-Polypeptid kodiert.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472 und H477. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 472 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 477 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A und H477A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1048 und H1053. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1048 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1053 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1048A und H1053A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 472 und 1048 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 477 und 1053 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A, H477A, R1048A und H1053A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R445 und H450. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 445 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 450 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R445A und H450A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1016 und H1021. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1016 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1021 ist eine beliebige andere Aminosäure als His. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1016A und H1021A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R445, H450, R1016 und H1021. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 445 und 1016 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 450 und 1016 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R445A, H450A, R1016A und H1021A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 (Rhodobacter capsulatus C2c2) angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R464 und H469. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 464 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 469 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R464A und H469A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1052 und H1057. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1052 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1057 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1052A und H1057A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R464, H469, R1052 und H1057. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 464 und 1052 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 469 und 1057 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R464A, H469A, R1052A und H1057A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 5 (Carnobacterium gallinarum C2c2) angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R467 und H472. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 467 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 472 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R469A und H472A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1069 und H1074. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1069 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1074 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1069A und H1074A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R467, H472, R1069 und H1074. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 467 und 1069 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 472 und 1074 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R469A, H472A, R1069A und H1074A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 (Herbinix hemicellulosilytica C2c2) angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472 und H477. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 472 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 477 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A und H477A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1044 und H1049. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1044 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1049 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1044A und H1049A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 6 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472, H477, R1044 und H1049. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 472 und 1044 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 477 und 1049 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A, H477A, R1044A und H1049A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA auf (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält aber die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 angegeben ist, und umfasst die Substitution von 1, 2, 3 oder 4 der Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053, so dass das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA aufweist (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und die Fähigkeit behält, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. Zum Beispiel weist das abweichende C2c2-Polypeptid in einigen Fällen weniger als 50%, weniger als 40%, weniger als 30%, weniger als 20%, weniger als 10%, weniger als 5%, weniger als 1 % oder weniger als 0,1% der RNA-guided Spaltung einer Non-Target-RNA, die von einem C2c2-Polypeptid mit der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz gezeigt wird. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Nukleinsäure (z.B. eine isolierte Nukleinsäure) bereit, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein abweichendes C2c2-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung kodiert. In einigen Fällen ist die Nukleotidsequenz funktionell mit einem Transkriptionskontrollelement, z.B. einem Promotor, verbunden. In manchen Fällen ist der Promotor ein konstitutiver Promotor. In einigen Fällen ist der Promotor ein regulierbarer Promotor. In einigen Fällen ist der Promotor ein induzierbarer Promotor. In einigen Fällen ist der Promotor in einer eukaryotischen Zelle funktionsfähig. In einigen Fällen ist der Promotor in einer prokaryotischen Zelle funktionsfähig.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung umfasst, z.B. eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz, die für ein abweichendes C2c2-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung kodiert.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt eine Wirtszelle bereit, die mit einer Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung genetisch modifiziert ist, z.B. eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz, die für ein abweichendes C2c2-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung kodiert. Die vorliegende Offenbarung stellt eine Wirtszelle bereit, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor genetisch modifiziert ist, der eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung umfasst, z.B. eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz, die für ein abweichendes C2c2-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung kodiert. In einigen Fällen ist die Wirtszelle eine prokaryotische Zelle. In einigen Fällen ist die Wirtszelle eine eukaryotische Zelle. In einigen Fällen ist die Wirtszelle in vitro. In einigen Fällen ist die Wirtszelle ex vivo. In einigen Fällen ist die Wirtszelle in vivo. In einigen Fällen ist die Wirtszelle eine Bakterienzelle. In einigen Fällen ist die Wirtszelle eine Hefezelle. In einigen Fällen ist die Wirtszelle eine Pflanzenzelle. In einigen Fällen ist die Wirtszelle eine Säugetierzelle. In einigen Fällen ist die Wirtszelle eine menschliche Zelle. In einigen Fällen ist die Wirtszelle eine nicht-menschliche Säugetierzelle. In einigen Fällen ist die Wirtszelle eine Insektenzelle. In einigen Fällen ist die Wirtszelle eine Arthropodenzelle. In einigen Fällen ist die Wirtszelle eine Pilzzelle. In einigen Fällen ist die Wirtszelle eine Algenzelle.
  • KITS
  • Die vorliegende Offenbarung stellt einen Kit zum Nachweisen einer Target-RNA in einer Probe bereit, die eine Mehrzahl von RNAs umfasst. In einigen Fällen umfasst der Kit: (a) einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array, umfassend zwei oder mehr C2c2-guideRNAs, welche jeweils eine unterschiedliche Guide-Sequenz aufweisen; und (b) ein C2c2-Protein und/oder eine Nukleinsäure, die das C2c2-Protein codiert. In einigen Fällen umfasst ein solcher Kit ferner eine markierte Nachweis-RNA (z.B. eine markierte Nachweis-RNA, umfassend ein Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar, insbesondere ein FRET-Paar und/oder ein Quencher/Fluor-Paar). In einigen Fällen umfassen zwei oder mehr C2c2-guideRNAs (z.B. in einigen Fällen jede der C2c2-guideRNAs) eines gegebenen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays die gleiche Guide-Sequenz.
  • In einigen Fällen umfasst ein hier gegenständlicher Kit: (a) eine markierte Nachweis-RNA, umfassend ein Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar, insbesondere ein FRET-Paar und/oder ein Quencher/Fluor-Paar; und (b) ein C2c2-Protein und/oder eine Nukleinsäure, die das C2c2-Protein codiert. In einigen Fällen umfasst ein solcher Kit ferner (c) eine C2c2-guideRNA (und/oder eine Nukleinsäure, die für eine C2c2-guideRNA kodiert) und/oder (d) eine Vorläufer-C2c2-guideRNA (und/oder eine für eine Vorläufer-C2c2-guideRNA kodierende Aminosäure) und/oder (e) einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array (und/oder eine Nukleinsäure, die einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array codiert, z.B. eine Nukleinsäure, die einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array codiert, der Sequenz-Insertionsstellen für das Einfügen von Guide-Sequenzen durch einen Benutzer enthält).
  • Kit, umfassend einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array und ein C2c2-Protein
  • In einigen Fällen umfasst der Kit: (a) einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array, umfassend zwei oder mehr C2c2-guideRNAs, von denen jede eine unterschiedliche Guide-Sequenz aufweist; und (b) ein C2c2-Protein und/oder eine Nukleinsäure, die das C2c2-Protein codiert. Wie oben erwähnt, enthält ein solcher Kit in einigen Fällen weiterhin eine markierte Nachweis-RNA (z.B. eine markierte Nachweis-RNA, umfassend ein Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar, insbesondere ein FRET-Paar und/oder ein Quencher/Fluor-Paar).
  • C2c2-Protein
  • Ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, bindet an eine C2c2-guideRNA, wird durch die guideRNA (die mit der Target-RNA hybridisiert) zu einer einzelsträngigen Target-RNA geführt und wird dadurch „aktiviert“. Wenn die HEPN1- und HEPN2-Domänen des C2c2-Proteins intakt sind, spaltet das C2c2-Protein nach Aktivierung die Target-RNA, spaltet aber auch Non-Target-RNAs.
  • In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit 80% oder mehr (z.B. 85% oder mehr, 90% oder mehr, 95% oder mehr, 98% oder mehr, 99% oder mehr, 99,5% oder mehr oder 100%) Aminosäuresequenzidentität zur Aminosäuresequenz, die in einer der SEQ ID NR.: 1-6 angegeben ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Listeria seeligeri C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Leptotrichia buccalis C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der C2c2-Aminosäuresequenz von Rhodobacter capsulatus, die in SEQ ID NR.: 4 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Carnobacterium gallinarum C2c2 Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Herbinix hemicellulosilytica C2c2 Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit 80% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zur Leptotrichia buccalis (Lbu) C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist. In einigen Fällen ist ein C2c2-Protein, das für den Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, ein Leptotrichia buccalis (Lbu) C2c2-Protein (z.B. siehe SEQ ID NR.: 2). In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, die Aminosäuresequenz, die in einer der SEQ ID NR.: 1-2 und 4-6 angegeben ist.
  • In einigen Fällen ist ein C2c2-Protein, das in einem Kit der vorliegenden Offenbarung enthalten ist, nicht ein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein. In einigen Fällen ist ein C2c2-Protein, das in einem Kit der vorliegenden Offenbarung enthalten ist, kein C2c2-Polypeptid mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu dem Lsh C2c2-Polypeptid, das in SEQ ID NR.: 3 angegeben ist.
  • In einigen Fällen ist ein C2c2-Polypeptid, das in einem Kit der vorliegenden Offenbarung enthalten ist, ein abweichendes C2c2-Polypeptid. Abweichende C2c2-Polypeptide, die zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet sind, umfassen Varianten von irgendeiner der SEQ ID NR.: 1, 2 und 4-6, wobei das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte (oder nicht nachweisbare) Nukleaseaktivität zeigt. Zum Beispiel fehlt einem abweichenden C2c2-Protein in einigen Fällen eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne. Als ein weiteres Beispiel fehlt einem abweichenden C2c2-Protein eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne. In einigen Fällen fehlt einem abweichenden C2c2-Protein eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne und es fehlt eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid Aminosäuresubstitutionen von 1, 2, 3 oder 4 der Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053 der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2 angegeben ist (Leptotrichia buccalis C2c2), oder eine entsprechende Aminosäure einer C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 dargestellt ist. Entsprechende Aminosäuren in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 werden leicht identifiziert; siehe z.B. 22B. Zum Beispiel sind die Amino-Positionen in SEQ ID NR.: 1 (Listeria seeligeri C2c2), die R472, H477, R1048 und H1053 von SEQ ID NR.: 2 entsprechen, R445, H450, R1016 bzw. H1021.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid Aminosäuresubstitutionen der Aminosäuren R472 und H477 der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder entsprechende Aminosäuren einer in SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 5 oder SEQ ID NR.: 6 dargestellten C2c2-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid Aminosäuresubstitutionen der Aminosäuren R1048 und H1053 der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder entsprechende Aminosäuren einer in SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 5 oder SEQ ID NR.: 6 dargestellten C2c2-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid Aminosäuresubstitutionen der Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053 der in SEQ ID NR.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder entsprechende Aminosäuren einer in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 angegebenen C2c2 Aminosäuresequenz.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472 und H477. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 472 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 477 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A und H477A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1048 und H1053. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1048 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1053 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1048A und H1053A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist, und die umfasst Substitution der Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 472 und 1048 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 477 und 1053 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A, H477A, R1048A und H1053A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R445 und H450. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 445 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 450 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R445A und H450A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1016 und H1021. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1016 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1021 ist eine beliebige andere Aminosäure als His. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1016A und H1021A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R445, H450, R1016 und H1021. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 445 und 1016 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 450 und 1016 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R445A, H450A, R1016A und H1021A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 (Rhodobacter capsulatus C2c2) angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R464 und H469. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 464 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 469 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R464A und H469A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1052 und H1057. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1052 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1057 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1052A und H1057A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R464, H469, R1052 und H1057. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 464 und 1052 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 469 und 1057 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R464A, H469A, R1052A und H1057A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 5 (Carnobacterium gallinarum C2c2) angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R467 und H472. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 467 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 472 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R469A und H472A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1069 und H1074. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1069 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1074 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1069A und H1074A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R467, H472, R1069 und H1074. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 467 und 1069 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 472 und 1074 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R469A, H472A, R1069A und H1074A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält jedoch die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 (Herbinix hemicellulosilytica C2c2) angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472 und H477. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 472 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 477 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A und H477A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 dargestellt ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R1044 und H1049. In einigen Fällen ist die Aminosäure an Position 1044 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an Position 1049 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R1044A und H1049A. In einigen Fällen umfasst ein abweichendes C2c2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 6 angegeben ist, und umfasst die Substitution der Aminosäuren R472, H477, R1044 und H1049. In einigen Fällen ist die Aminosäure an den Positionen 472 und 1044 eine von Arg verschiedene Aminosäure; und die Aminosäure an den Positionen 477 und 1049 ist eine von His verschiedene Aminosäure. In einigen Fällen sind die Substitutionen R472A, H477A, R1044A und H1049A. In einigen Fällen hat das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität) und behält die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden. In einigen Fällen behält das abweichende C2c2-Polypeptid die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten. In einigen Fällen weist das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA auf (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), behält aber die Fähigkeit, C2c2-guideRNA und ssRNA zu binden und behält die Fähigkeit, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
  • Kit, umfassend eine markierte Nachweis-RNA und ein C2c2-Protein
  • In einigen Fällen umfasst der Kit: (a) eine markierte Nachweis-RNA, umfassend ein Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar, insbesondere ein FRET-Paar und/oder ein Quencher/Fluor-Paar; und (b) ein C2c2-Protein und/oder eine Nukleinsäure, die das C2c2-Protein codiert. In einigen Fällen umfasst der Kit weiterhin eine C2c2-guideRNA, einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array und/oder eine Nukleinsäure, die eine konstante Region einer C2c2-guideRNA codiert. Wie oben erwähnt, umfasst ein solcher Kit in einigen Fällen weiterhin (c) eine C2c2-guideRNA (und/oder eine Nukleinsäure, die für eine C2c2-guideRNA kodiert) und/oder (d) eine Vorläufer-C2c2-guideRNA (und/oder eine Nukleinsäure), die eine Vorläufer-C2c2-guideRNA codiert, und/oder (e) einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array (und/oder eine Nukleinsäure, die einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array codiert, z.B. eine Nukleinsäure, die einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array codiert, welcher Sequenzinsertionsstellen zum Einfügen von Guide-Sequenzen durch einen Benutzer umfasst).
  • Markierte Nachweis-RNA
  • In einigen Fällen umfasst ein Kit der vorliegenden Offenbarung eine markierte Nachweis-RNA, umfassend ein Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar, d.h. ein FRET-Paar und/oder ein Quencher/Fluor-Paar. Die markierte Nachweis-RNA produziert eine Höhe des nachweisbaren Signals, bevor sie gespalten wird, und die Höhe des nachweisbaren Signals, die gemessen wird, wird reduziert, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird. In einigen Fällen erzeugt die markierte Nachweis-RNA ein erstes nachweisbares Signal vor der Spaltung (z.B. von einem FRET-Paar) und ein zweites nachweisbares Signal, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird (z.B. von einem Quencher/Fluor-Paar). Als solche umfasst die markierte Nachweis-RNA in einigen Fällen ein FRET-Paar und ein Quencher/Fluor-Paar.
  • In einigen Fällen umfasst die markierte Nachweis-RNA ein FRET-Paar. FRET ist ein Prozess, bei dem ein strahlungsloser Energietransfer von einem angeregten Fluorophor zu einem zweiten Chromophor in unmittelbarer Nähe stattfindet. Der Bereich, über den die Energieübertragung stattfinden kann, ist auf ungefähr 10 Nanometer (100 Angström) begrenzt, und die Effizienz des Transfers ist extrem empfindlich gegenüber dem Trennungsabstand zwischen Fluorophoren. Das Donor-Akzeptor-Paar (eine FRET-Donoreinheit und eine FRET-Akzeptoreinheit) wird hierin als ein „FRET-Paar“ oder ein „Signal-FRET-Paar“ bezeichnet. In einigen Fällen enthält eine hier gegenständliche markierte Nachweis-RNA zwei Signalpartner (ein Signalpaar), wenn ein Signalpartner eine FRET-Donoreinheit und der andere Signalpartner eine FRET-Akzeptoreinheit ist. Eine hier gegenständliche markierte Nachweis-RNA, die ein solches FRET-Paar (eine FRET-Donoreinheit und eine FRET-Akzeptoreinheit) enthält, wird somit ein nachweisbares Signal (ein FRET-Signal) aufweisen, wenn sich die Signalpartner in unmittelbarer Nähe befinden (z.B. wenn sie auf demselben RNA-Molekül sind), aber das Signal wird reduziert (oder fehlt), wenn die Partner getrennt sind (z.B. nach der Spaltung des RNA-Moleküls durch ein C2c2-Protein).
  • FRET-Donor- und -Akzeptoreinheiten (FRET-Paare) sind einem Fachmann bekannt und jedes geeignete FRET-Paar (z.B. jedes geeignete Donor- und Akzeptoreinheitspaar) kann verwendet werden. Beispiele für geeignete FRET-Paare umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, diejenigen, die in der obigen Tabelle 1 aufgeführt sind.
  • In einigen Fällen wird ein nachweisbares Signal erzeugt, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird (z.B. enthält die markierte Nachweis-RNA in einigen Fällen ein Quencher/Fluor-Paar. Ein Signalpartner eines Signallquenchpaares erzeugt ein nachweisbares Signal und der andere Signalpartner ist eine Quencher-Gruppe, die das nachweisbare Signal des ersten Signalpartners quencht (insbesondere die Quencher-Gruppe quencht das Signal der Signal-Gruppe, so dass das Signal von der Signal-Gruppe reduziert (gequencht) wird, wenn die Signalpartner nahe zueinander sind, z.B. wenn die Signalpartner des Signalpaares in unmittelbarer Nähe sind).
  • Zum Beispiel nimmt in einigen Fällen die Höhe des nachweisbaren Signals zu, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird. Zum Beispiel wird in einigen Fällen das von einem Signalpartner (einer Signal-Gruppe) gezeigte Signal durch den anderen Signalpartner (eine Quencher-Signal-Gruppe) gequencht, z.B. wenn beide vor der Spaltung durch ein C2c2 Protein auf dem gleichen RNA-Molekül vorhanden sind. Ein solches Signalpaar wird hier als „Quencher/Fluor-Paar“, „Quencherpaar“ oder „Signalquencherpaar“ bezeichnet. Zum Beispiel ist in einigen Fällen ein Signalpartner (z.B. der erste Signalpartner) eine Signal-Gruppe, die ein nachweisbares Signal erzeugt, das durch den zweiten Signalpartner (z.B. eine Quencher-Gruppe) gequencht wird. Die Signalpartner eines solchen Quencher/Fluor-Paares erzeugen somit ein nachweisbares Signal, wenn die Partner getrennt werden (z.B. nach Spaltung der Nachweis-RNA durch ein C2c2-Protein), aber das Signal wird gequencht, wenn die Partner in enger Nachbarschaft sind (z.B. vor der Spaltung der Nachweis-RNA durch ein C2c2-Protein).
  • Eine Quencher-Gruppe kann ein Signal von der Signal-Gruppe (z.B. vor Abspaltung der Nachweis-RNA durch ein C2c2-Protein) in unterschiedlichem Ausmaß quenchen. In einigen Fällen quencht eine Quencher-Gruppe das Signal von der Signal-Gruppe, bei dem das Signal, das in Gegenwart der Quencher-Gruppe detektiert wird (wenn die Signalpartner in der Nähe zueinander sind) 95% oder weniger des in Abwesenheit der Quencher-Gruppe detektierten Signals beträgt (wenn die Signalpartner getrennt sind). Zum Beispiel kann in einigen Fällen das Signal, das in Gegenwart der Quencher-Gruppe detektiert wird, 90% oder weniger, 80% oder weniger, 70% oder weniger, 60% oder weniger, 50% oder weniger, 40% oder weniger, 30 betragen % oder weniger, 20% oder weniger, 15% oder weniger, 10% oder weniger oder 5% oder weniger des Signals betragen, das in Abwesenheit der Quencher-Gruppe nachgewiesen wurde. In einigen Fällen wird kein Signal (z.B. über dem Hintergrund) in Gegenwart der Quencher-Gruppe nachgewiesen.
  • In einigen Fällen ist das Signal in Abwesenheit der Quencher-Gruppe (wenn die Signalpartner getrennt sind) mindestens 1,2 mal größer (z.B. mindestens 1,3, mindestens 1,5, mindestens 1,7, mindestens 2, mindestens 2,5, mindestens 3, mindestens 3,5, mindestens 4, mindestens 5-fache, mindestens 7, mindestens 10, mindestens 20 oder mindestens das 50 mal größer) als das Signal, das in Anwesenheit der Quencher-Gruppe nachgewiesen wurde (wenn die Signalpartner nahe beieinander liegen).
  • In einigen Fällen ist die Signal-Gruppe eine Fluoreszenzmarkierung. In einigen solcher Fälle quencht die Quencher-Gruppe das Signal (das Lichtsignal) von der Fluoreszenzmarkierung (z.B. durch Absorbieren von Energie in den Emissionsspektren der Markierung). Wenn die Quencher-Komponente nicht in der Nähe der Signal-Gruppe ist, ist somit die Emission (das Signal) von der Fluoreszenzmarkierung nachweisbar, da das Signal nicht durch die Quencher-Komponente absorbiert wird. Jedes geeignete Donor-Akzeptor-Paar (Signal-Einheit/Quencher-Gruppe-Paar) kann verwendet werden und viele geeignete Paare sind Stand der Technik.
  • In einigen Fällen absorbiert die Quencher-Gruppe Energie von der Signal-Gruppe (hierin auch als „nachweisbare Markierung“ bezeichnet) und emittiert dann ein Signal (z.B. Licht bei einer anderen Wellenlänge). Somit ist in einigen Fällen die Quencher-Gruppe selbst eine Signal-Gruppe (z.B. kann eine Signal-Gruppe 6-Carboxyfluorescein sein, während die Quencher-Gruppe 6-Carboxytetramethylrhodamin sein kann), und in einigen solchen Fällen könnte das Paar auch ein FRET-Paar sein. In einigen Fällen ist eine Quencher-Gruppe ein dunkler Quencher. Ein dunkler Quencher kann Anregungsenergie absorbieren und die Energie auf andere Weise (z.B. als Wärme) abführen. Daher hat ein dunkler Quencher eine minimale bis keine eigene Fluoreszenz (emittiert keine Fluoreszenz). Beispiele von Dunkelquencher sind in den US-Patenten Nr. 8,822,673 und 8,586,718 ; in den US-Patentveröffentlichungen 20140378330, 20140349295 und 20140194611 ; und in den internationalen Patentanmeldungen: WO200142505 und WO200186001 , beschrieben, die alle hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind.
  • Beispiele für fluoreszierende Markierungen umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, ein Alexa Fluor®-Farbstoff, ein ATTO-Farbstoff (z.B. ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12 ATTO Thio12, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxa12, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740), ein DyLight-Farbstoff, ein Cyaninfarbstoff (z.B. Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3b, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5), ein FluoProbes-Farbstoff, ein Sulfo-Cy-Farbstoff, ein Seta-Farbstoff, ein IRIS-Farbstoff, ein SeTau-Farbstoff, ein SRfluor-Farbstoff, ein Square-Farbstoff, Fluorescein (FITC), Tetramethylrhodamin (TRITC), Texas Red, Oregon Green, Pacific Blue, Pacific Green, Pacific Orange, Quantum Dots und ein gebundenes fluoreszierendes Protein.
  • In einigen Fällen ist eine nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung, ausgewählt aus: einem Alexa Fluor® -Farbstoff, einem ATTO-Farbstoff (z.B. ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Thio12, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxa12, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740), ein DyLight-Farbstoff, ein Cyaninfarbstoff (z.B. Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3b, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5), ein FluoProbes-Farbstoff, ein Sulfo-Cy-Farbstoff, ein Seta-Farbstoff, ein IRIS-Farbstoff, ein SeTau-Farbstoff, ein SRfluor-Farbstoff, ein Square-Farbstoff, Fluorescein (FITC), Tetramethylrhodamin (TRITC), Texas-Rot, Oregon Green, Pacific Blue, Pacific Grün und Pacific Orange.
  • In einigen Fällen ist eine nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung, ausgewählt aus: einem Alexa Fluor® -Farbstoff, einem ATTO-Farbstoff (z.B. ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Thio12, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxa12, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740), ein DyLight-Farbstoff, ein Cyaninfarbstoff (z.B. Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3b, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5), ein FluoProbes-Farbstoff, ein Sulfo-Cy-Farbstoff, ein Seta-Farbstoff, ein IRIS-Farbstoff, ein SeTau-Farbstoff, ein SRfluor-Farbstoff, ein Square-Farbstoff, Fluorescein (FITC), Tetramethylrhodamin (TRITC), Texas Red, Oregon Green, Pacific Blue, Pacific Green, Pacific Orange, ein Quantum Dot und ein gebundenes fluoreszierendes Protein.
  • Beispiele für ATTO-Farbstoffe umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Thio12, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxa12, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725 und ATTO 740.
  • Beispiele für AlexaFluor-Farbstoffe umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 530, Alexa Fluor® 525, Alexa Fluor® 525, Alexa Fluor® 525, Alexa Fluor® 525, Alexa Fluor® Alexa Fluor® 610, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 635, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750, Alexa Fluor® 790 und dergleichen.
  • Beispiele für Quencher-Gruppeen umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, einen dunklen Quencher, einen Black Hole Quencher® (BHQ®) (z.B. BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3), einen QxI-Quencher, einen ATTO-Quencher (z.B. ATTO 540Q, ATTO 580Q und ATTO 612Q), Dimethylaminoazobenzolsulfonsäure (Dabsyl), Iowa Black RQ, Iowa Black FQ, IRDye QC-1, ein QSY-Farbstoff (z.B. QSY 7, QSY 9, QSY 21), AbsoluteQuencher, Eclipse und Metallcluster wie Goldnanopartikel und dergleichen.
  • In einigen Fällen wird eine Quencher-Gruppe ausgewählt aus: einem dunklen Quencher, einem Black Hole Quencher® (BHQ®) (z.B. BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3), einem QxI-Quencher, einem ATTO-Quencher (z.B. ATTO 540Q, ATTO 580Q und ATTO 612Q), Dimethylaminoazobenzolsulfonsäure (Dabsyl), Iowa Black RQ, Iowa Black FQ, IRDye QC-1, ein QSY-Farbstoff (z.B. QSY 7, QSY 9, QSY 21), AbsoluteQuencher, Eclipse und ein Metallcluster.
  • Beispiele für einen ATTO-Quencher umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, ATTO 540Q, ATTO 580Q und ATTO 612Q. Beispiele für einen Black Hole Quencher® (BHQ®) umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, BHQ-0 (493 nm), BHQ-1 (534 nm), BHQ-2 (579 nm) und BHQ-3 (672 nm).
  • Für Beispiele einiger nachweisbarer Markierungen (z.B. Fluoreszenzfarbstoffe) und/oder Quencher siehe: B. Bao et al., Annu Rev. Biomed Eng. 2009; 11: 25-47; sowie die US-Patente Nr. 8,822,673 und 8,586,718 ; US-Patentveröffentlichungen 20140378330, 20140349295, 20140194611, 20130323851, 20130224871, 20110223677, 20110190486, 20110172420, 20060179585 und 20030003486 ; und die internationalen Patentanmeldungen: WO200142505 und WO200186001 , auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
  • Nukleinsäure-Modifikationen
  • In einigen Fällen umfasst eine markierte Nachweis-RNA eine oder mehrere Modifikationen, z.B. eine Basenmodifikation, eine Rückgratmodifikation, eine Zuckermodifikation usw., um die Nukleinsäure mit einem neuen oder verbesserten Merkmal (z.B. verbesserte Stabilität) zu versehen. Wie auf dem Fachgebiet bekannt, ist ein Nukleosid eine Base-Zucker-Kombination. Der Base-Anteil des Nucleosids ist normalerweise eine heterocyclische Base. Die zwei häufigsten Klassen solcher heterocyclischen Basen sind die Purine und die Pyrimidine. Nukleotide sind Nukleoside, die ferner eine Phosphatgruppe umfassen, die kovalent an den Zuckerteil des Nukleosids gebunden ist. Für diejenigen Nukleoside, die einen Pentafuranosylzucker enthalten, kann die Phosphatgruppe mit der 2'-, der 3'- oder der 5'-Hydroxylgruppe des Zuckers verbunden sein. Bei der Bildung von Oligonukleotiden verknüpfen die Phosphatgruppen benachbarte Nukleoside miteinander kovalent unter Bildung einer linearen polymeren Verbindung. Die jeweiligen Enden dieser linearen polymeren Verbindung können wiederum miteinander verbunden sein, um eine kreisförmige Verbindung zu bilden; jedoch sind lineare Verbindungen im Allgemeinen geeignet. Darüber hinaus können lineare Verbindungen eine interne Nukleotidbasenkomplementarität aufweisen und daher so gefaltet werden, dass eine vollständig oder teilweise doppelsträngige Verbindung hergestellt wird. Innerhalb von Oligonukleotiden werden die Phosphatgruppen üblicherweise als das Internukleosid-Rückgrat des Oligonukleotids bildend bezeichnet. Die normale Bindung oder Rückgrat von RNA und DNA ist eine 3' zu 5' Phosphodiesterbindung.
  • Modifizierte Rückgrate und modifizierte Internukleosid-Bindungen
  • Beispiele für geeignete Modifikationen umfassen modifizierte Nukleinsäuregruppen und nicht natürliche Internukleosidbindungen. Nukleinsäuren (mit modifiziertem Rückgrat umfassen solche, die ein Phosphoratom in dem Rückgrat beibehalten und solche, die kein Phosphoratom in dem Rückgrat aufweisen.
  • Geeignete modifizierte Oligonukleotidrückgrate, die ein Phosphoratom enthalten, umfassen beispielsweise Phosphorothioate, chirale Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Phosphotriester, Aminoalkylphosphotriester, Methyl- und andere Alkylphosphonate, einschließlich 3'-Alkylenphosphonate, 5'-Alkylenphosphonate und chirale Phosphonate, Phosphinate, Phosphoramidate einschließlich 3'-Aminophosphoramidat und Aminoalkylphosphoramidate, Phosphordiamidate, Thionophosphoramidate, Thionoalkylphosphonate, Thionoalkylphosphotriester, Selenophosphate und Boranophosphate mit normalen 3'-5'-Bindungen, 2'-5'-verknüpfte Analoga von diesen und solche mit invertierter Polarität, wobei eine oder mehrere Internukleotidbindungen 3' zu 3', 5' zu 5' oder 2' zu 2' Bindungen sind. Geeignete Oligonukleotide mit invertierter Polarität umfassen eine einzelne 3' zu 3'-Bindung an der 3'-größten Internukleotidbindung, insbesondere einen einzelnen invertierten Nukleosidrest, der basisch sein kann (die Nukleobase fehlt oder ist durch eine Hydroxylgruppe ersetzt). Verschiedene Salze (wie z.B. Kalium oder Natrium), gemischte Salze und freie Säureformen sind ebenfalls umfasst.
  • In einigen Fällen umfasst eine markierte Nachweis-RNA eine oder mehrere Phosphorothioat- und/oder Heteroatom-Internukleosid-Bindungen, insbesondere -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- (bekannt als Methylen (Methylimino) oder MMI-Rückgrat), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N (CH3)-N (CH3)-CH2- und -O-N(CH3)-CH2-CH2- (worin die native Phosphodiester-Internukleotidbindung als -O-P(=O)(OH)-O-CH2-) dargestellt ist). Internukleosid-Bindungen vom MMI-Typ sind in dem oben genannten US-Patent Nr. 5,489,677 beschrieben. Geeignete Amid-Internukleosid-Bindungen sind im US-Patent Nr. 5 602 240 enthalten.
  • Geeignet sind auch Nukleinsäuren mit Morpholino-Rückgratstrukturen, wie z.B. im US-Patent Nr. 5,034,506 . Zum Beispiel umfasst eine markierte Nachweis-RNA in einigen Fällen einen 6-gliedrigen Morpholino-Ring anstelle eines Riboserings. In einigen Fällen ersetzt eine Phosphordiamidat- oder andere Nicht-Phosphodiester-Internukleosidbindung eine Phosphodiesterbindung.
  • Geeignete modifizierte Polynukleotidrückgrate, die kein Phosphoratom darin enthalten, haben Rückgrate, die durch kurzkettige Alkyl- oder Cycloalkyl-Internukleosidbindungen, gemischte Heteroatome und Alkyl- oder Cycloalkyl-Internukleosidbindungen oder eine oder mehrere kurzkettige heteroatomare oder heterocyclische Internukleosidbindungen gebildet werden. Dazu gehören solche mit Morpholino-Bindungen (die zum Teil aus dem Zuckerteil eines Nucleosids gebildet werden); Siloxan-Rückgrate; Sulfid-, Sulfoxid- und Sulfon-Rückgrate; Formacetyl- und Thioformacetyl-Rückgrate; Methylenformacetyl- und Thioformacetyl-Rückgrate; Riboacetyl-Rückgrate; Alken mit Rückgraten; Sulfamat-Rückgrate; Methylenimino- und Methylenhydrazino-Rückgrate; Sulfonat- und Sulfonamid-Rückgrate; Amid-Rückgrate; und andere mit gemischten N-, O-, S- und CH2-Komponententeilen.
  • Mimetika
  • Eine markierte Nachweis-RNA kann ein Nukleinsäure-Mimetikum sein. Der Ausdruck „mimetisch“, wie er auf Polynukleotide angewendet wird, soll Polynukleotide einschließen, in denen nur der Furanose-Ring oder sowohl der Furanose-Ring als auch die InternukleotidBindung durch Nicht-Furanose-Gruppen ersetzt sind, wobei der Ersatz nur des Furanose-Rings im Stand der Technik als Zuckersurrogat bezeichnet wird. Die heterocyclische Basengruppe oder eine modifizierte heterocyclische Basengruppe wird zur Hybridisierung mit einer geeigneten Target-Nukleinsäure aufrechterhalten. Eine solche Nukleinsäure, ein Polynukleotid-Mimetikum, von dem gezeigt wurde, dass es ausgezeichnete Hybridisierungseigenschaften aufweist, wird als eine Peptid-Nukleinsäure (PNA) bezeichnet. In der PNA ist das Zuckerrückgrat eines Polynukleotids durch ein Amid-haltiges Rückgrat, insbesondere ein Aminoethylglycin-Rückgrat, ersetzt. Die Nukleotide bleiben erhalten und sind direkt oder indirekt an Aza-Stickstoffatome des Amidteils des Rückgrats gebunden.
  • Ein Polynukleotid-Mimetikum, von dem berichtet wurde, dass es hervorragende Hybridisierungseigenschaften aufweist, ist eine Peptid-Nukleinsäure (PNA). Das Rückgrat in PNA-Verbindungen sind zwei oder mehr verbundene Aminoethylglycin-Einheiten, die der PNA ein Amid-haltiges Rückgrat verleihen. Die heterocyclischen Basenreste sind direkt oder indirekt an Aza-Stickstoffatome des Amidteils des Rückgrats gebunden. Repräsentative US-Patente, die die Herstellung von PNA-Verbindungen beschreiben, umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, US-Patent Nr. 5,539,082; 5,714,331; und 5,719,262 .
  • Eine andere Klasse von Polynukleotid-Mimetika, die untersucht wurde, basiert auf gebundenen Morpholinoeinheiten (Morpholino-Nukleinsäure) mit heterocyclischen Basen, die an den Morpholinoring gebunden sind. Eine Anzahl von Verbindungsgruppen wurde beschrieben, die die Morpholino-Monomereinheiten in einer Morpholino-Nukleinsäure verbinden. Eine Klasse von Verbindungsgruppen wurde ausgewählt, um eine nichtionische oligomere Verbindung zu ergeben. Die nicht-ionischen Morpholino-basierten oligomeren Verbindungen haben weniger wahrscheinlich unerwünschte Wechselwirkungen mit zellulären Proteinen. Morpholino-basierte Polynukleotide sind nicht-ionische Mimetika von Oligonukleotiden, die weniger wahrscheinlich unerwünschte Wechselwirkungen mit zellulären Proteinen bilden (Dwaine A. Braasch und David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41 (14), 4503-4510). Morpholino-basierte Polynukleotide sind in US-Patent Nr. 5,034,506 beschrieben. Eine Vielzahl von Verbindungen innerhalb der Morpholinklasse von Polynukleotiden wurde hergestellt, wobei eine Vielzahl von verschiedenen Verbindungsgruppen die monomeren Untereinheiten verbindet.
  • Eine weitere Klasse von Polynukleotid-Mimetika wird als Cyclohexenyl-Nukleinsäuren bezeichnet (CeNA). Der Furanose-Ring, der normalerweise in einem DNA/RNA-Molekül vorhanden ist, wird durch einen Cyclohexenylring ersetzt. CeNA-DMTgeschützte Phosphoramidit-Monomere wurden hergestellt und für die Synthese von oligomeren Verbindungen nach der klassischen Phosphoramidit-Chemie verwendet. Vollständig modifizierte oligomere CeNA-Verbindungen und Oligonukleotide mit spezifischen Positionen, die mit CeNA modifiziert wurden, wurden hergestellt und untersucht (siehe Wang et al., J. Am. Soc, 2000, 122, 8595-8602). Im Allgemeinen erhöht der Einbau von CeNA-Monomeren in eine DNA-Kette die Stabilität eines DNA/RNA-Hybrids. CeNA-Oligoadenylate bildeten Komplexe mit RNA- und DNA-Komplementen mit ähnlicher Stabilität wie die nativen Komplexe. Die Untersuchung des Einbaus von CeNA-Strukturen in natürliche Nukleinsäurestrukturen wurde durch NMR und Circulardichroismus bewiesen, um mit einer leichten Konformationsanpassung fortzufahren.
  • Eine weitere Modifikation umfasst Locked Nucleic Acids (LNAs), in denen die 2'-Hydroxylgruppe mit dem 4'-Kohlenstoffatom des Zuckerrings verbunden ist, wodurch eine 2'-C, 4'-C-Oxymethylenbindung gebildet wird, wodurch ein bicyclischer Zuckerteil gebildet wird. Die Bindung kann eine Methylengruppe (-CH2-) sein, die das 2'-Sauerstoffatom und das 4'-Kohlenstoffatom verbrückt, wobei n 1 oder 2 ist (Singh et al., Chem. Soc. Commun., 1998, 4, 455-456). LNA- und LNA-Analoga weisen sehr hohe Duplex-Thermostabilitäten mit komplementärer DNA und RNA (Tm = + 3 bis + 10 °C), Stabilität gegenüber 3'-exonukleolytischem Abbau und gute Löslichkeitseigenschaften. Potente und nichttoxische Antisense-Oligonukleotide, die LNAs enthalten, wurden bereits beschrieben (Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638).
  • Die Synthese und Herstellung der LNA-Monomere Adenin, Cytosin, Guanin, 5-Methyl-Cytosin, Thymin und Uracil, zusammen mit ihrer Oligomerisierung und die Erkennungseigenschaften von Nukleinsäuren wurden beschrieben (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607)-3630). LNAs und ihre Herstellung sind auch in WO 98/39352 und WO 99/14226 beschrieben.
  • Modifizierte Zuckereinheiten
  • Eine markierte Nachweis-RNA kann auch eine oder mehrere substituierte Zuckereinheiten enthalten.Geeignete Polynukleotide umfassen eine Zuckersubstituentengruppe, ausgewählt aus: OH; F; O-, S- oder N-Alkyl; O-, S- oder N-Alkenyl; O-, S- oder N-Alkinyl; oder O-Alkyl-O-alkyl, wobei das Alkyl, Alkenyl und Alkinyl substituiertes oder unsubstituiertes C1- bis C10-Alkyl oder C2- bis C10-Alkenyl und -Alkinyl sein können. Besonders geeignet sind O((CH2)nO)mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 und O(CH2)nON ((CH2)nCH3)2, wobei n und m 1 bis etwa 10 sind. Andere geeignete Polynukleotide umfassen eine Zuckersubstituentengruppe, ausgewählt aus: C1- bis C10-Niederalkyl, substituiertem Niederalkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkaryl, Aralkyl, O-Alkaryl oder O-Aralkyl, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, Br, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkaryl, Aminoalkylamino, Polyalkylamino, substituiertem Silyl, einer RNA-spaltenden Gruppe, einer Reportergruppe, einem Interkalator, einer Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonukleotids, oder einer Gruppe zur Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Oligonukleotids und anderer Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften. Eine geeignete Modifikation schließt 2'-Methoxyethoxy (2'-O-CH2 CH2 OCH3, auch bekannt als 2'-O-(2-Methoxyethyl) oder 2'-MOE) ein (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), d.h. eine Alkoxyalkoxygruppe. Eine weitere geeignete Modifikation umfasst 2'-Dimethylaminooxyethoxy, d.h. eine O(CH2)2ON(CH3)2-Gruppe, auch bekannt als 2'-DMAOE, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, und 2'-Dimethylaminoethoxyethoxy (auch als 2'-O-Dimethylaminoethoxyethyl oder 2'-DMAEOE bekannt), d.h. 2'-O-CH2-O-CH2-N (CH3)2.
  • Andere geeignete Zucker-Substituentengruppen umfassen Methoxy(-O-CH3), Aminopropoxy (-OCH2CH2CH2NH2), Allyl (-CH2-CH=CH2), -O-Allyl(-O-CH2-CH =CH2) und Fluor (F). 2'-Zucker-Substituentengruppen können sich in Arabino- (obere) Position oder Ribo- (untere) Position befinden. Eine geeignete 2'-Arabino-Modifikation ist 2'-F. Ähnliche Modifikationen können auch an anderen Positionen der oligomeren Verbindung vorgenommen werden, insbesondere der 3'-Position des Zuckers am 3'-terminalen Nukleosid oder in 2'-5'-verknüpften Oligonukleotiden und der 5'-Position des 5'-terminalen Nukleotids. Oligomere Verbindungen können anstelle des Pentofuranosylzuckers auch Zuckermimetika wie Cyclobutylreste aufweisen.
  • Basen-Modifikationen und Substitutionen
  • Eine markierte Nachweis-RNA kann auch Nukleobasenmodifikationen oder - substitutionen (oft in der Technik einfach als „Base“ bezeichnet) umfassen. Wie hierin verwendet, umfassen „unmodifizierte“ oder „natürliche“ Nukleobasen die Purinbasen Adenin (A) und Guanin (G) und die Pyrimidinbasen Thymin (T), Cytosin (C) und Uracil (U). Modifizierte Nucleobasen umfassen andere synthetische und natürliche Nucleobasen, wie 5-Methylcytosin (5-me-C), 5-Hydroxymethylcytosin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Thiouracil, 2-Thiothymin und 2-Thiocytosin, 5-Halouracil und Cytosin, 5-Propinyl (-C=C-CH3) uracil und Cytosin und andere Alkinylderivate von Pyrimidinbasen, 6 Azouracil, Cytosin und Thymin, 5-Uracil ‚(Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halo, 8-Amino, 8-Thiol, 8-Thioalkyl, 8-Hydroxyl und andere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Halo, insbesondere 5-Brom, 5-Trifluormethyl und andere 5-substituierte Uracile und Cytosine, 7-Methylguanin und 7-Methyladenin, 2-F-Adenin, 2-Aminoadenin, 8-Azaguanin und 8-Azaadenin, 7-Deazaguanin und 7-Deazaadenin und 3-Deazaguanin und 3-Deazaadenin. Weitere modifizierte Nucleobasen umfassen tricyclische Pyrimidine, wie Phenoxazincytidin (1H-Pyrimino (5,4-b) (1,4) benzoxazin-2 (3H)-on), Phenothiazincytidin (1H-Pyrimido (5,4-b) (I, 4) Benzothiazin-2 (3H)-on), G-Klammern, wie ein substituiertes Phenoxazin-Cytidin (z.B. 9- (2-Aminoethoxy)-H-pyrimido (5,4- (b) (1,4) benzoxazin)-2 (3H)-on), Carbazolcytidin (2H-Pyrimido (4,5-b) indol-2-on), Pyridoindolcytidin (H-Pyrido (3‘, 2': 4,5) pyrrolo (2, 3-d) Pyrimidin-2-on).
  • Heterocyclische Basengruppen können auch solche einschließen, in denen die Purin- oder Pyrimidinbase durch andere Heterocyclen ersetzt ist, beispielsweise 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanosin, 2-Aminopyridin und 2-Pyridon. Zu weiteren Nukleobasen gehören jene, die in US-Patent Nr. 3 687 808 beschrieben sind sowie diejenigen, die in der Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, Seiten 858-859, Kroschwitz, J. I., Ed. John Wiley & Sons, 1990, die von Englisch et al., Angewandte Chemie, Internationale Ausgabe, 1991, 30, 613, und diejenigen, die von Sanghvi, YS, Kapitel 15, Antisense Research and Applications, Seiten 289-302, Crooke, , ST und Lebleu, B., Hrsg., CRC Press, 1993 offenbart sind. Bestimmte dieser Nucleobasen sind nützlich zur Erhöhung der Bindungsaffinität einer oligomeren Verbindung. Diese umfassen 5-substituierte Pyrimidine, 6-Azapyrimidine und N-2-, N-6- und O-6-substituierte Purine, einschließlich 2-Aminopropyladenin, 5- Propynyluracil und 5-Propynylcytosin. Es wurde gezeigt, dass 5-Methylcytosin-Substitutionen die Nukleinsäureduplexstabilität um 0,6-1,2 °C erhöhen (Sanghvi et al., Hrsg., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, Seiten 276-278) und diese sind geeignete Basensubstitutionen, z.B. in Kombination mit 2'-O-Methoxyethylzucker-Modifikationen.
  • Kit umfassend zwei verschiedene C2c2-Proteinen und zwei verschiedene markierte Nachweis-RNAs
  • In einigen Fällen umfasst ein Kit: (a) eine erste markierte Nachweis-RNA, der U fehlt, die jedoch mindestens ein A (z.B. mindestens 2, mindestens 3 oder mindestens 4 As) umfasst, und ein erstes FRET-Paar und/oder ein erstes Quencher/Fluor-Paar umfasst; (b) eine zweite markierte Nachweis-RNA, der A fehlt, die jedoch mindestens ein U (z.B. mindestens 2, mindestens 3 oder mindestens 4 Us) umfasst, und ein zweites FRET-Paar und/oder ein zweites Quencher/Fluor-Paar umfasst; (c) ein erstes C2c2-Protein und/oder eine das erste C2c2-Protein codierende Nukleinsäure, wobei das erste C2c2-Protein Adenin+-RNAs (RNAs, die A enthalten) bei Aktivierung spaltet, aber RNAs, denen A fehlt, nicht spaltet (z.B. PolyU-RNAs) [z.B. kann das erste C2c2-Protein die erste markierte Nachweis-RNA spalten, aber nicht die zweite markierte Nachweis-RNA]; und (d) ein zweites C2c2-Protein und/oder eine Nukleinsäure, die das zweite C2c2-Protein codiert, wobei das zweite C2c2-Protein Uracil+-RNAs (RNAs, die U enthalten) bei Aktivierung spaltet, aber RNAs nicht spaltet, denen U fehlt (z.B. PolyA-RNAs) (z.B. kann das zweite C2c2-Protein die zweite markierte Nachweis-RNA spalten, aber nicht die erste markierte Nachweis-RNA).
  • In einigen Fällen fehlt der ersten markierten Nachweis-RNA U, während diese einen Abschnitt von 2 bis 15 aufeinanderfolgende As umfasst (z.B. 2 bis 12, 2 bis 10, 2 bis 8, 2 bis 6, 2 bis 4, 3 bis 15, 3 bis 12, 3 bis 10, 3 bis 8, 3 bis 6, 3 bis 5, 4 bis 15, 4 bis 12, 4 bis 10, 4 bis 8 oder 4 bis 6 aufeinanderfolgende As). In einigen Fällen fehlt der ersten markierten Nachweis-RNA U, während diese einen Abschnitt von mindestens 2 aufeinanderfolgenden As umfasst (z.B. mindestens 3, mindestens 4 oder mindestens 5 aufeinanderfolgende As). In einigen Fällen fehlt der zweiten markierten Nachweis-RNA A, während diese einen Abschnitt von 2 bis 15 aufeinanderfolgenden Us umfasst (z.B. von 2 bis 12, 2 bis 10, 2 bis 8, 2 bis 6, 2 bis 4, 3 bis 15, 3 bis 12, 3 bis 10, 3 bis 8, 3 bis 6, 3 bis 5, 4 bis 15, 4 bis 12, 4 bis 10, 4 bis 8 oder 4 bis 6 aufeinanderfolgende Us). In einigen Fällen fehlt der zweiten markierten Nachweis-RNA A während diese einen Abschnitt von mindestens 2 aufeinanderfolgenden Us umfasst (z.B. mindestens 3, mindestens 4 oder mindestens 5 aufeinanderfolgende Us).
  • In einigen Fällen umfasst ein solcher Kit weiterhin: (e) eine erste C2c2-guideRNA (und/oder eine Nukleinsäure, die die erste C2c2-guideRNA codiert), z.B. eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz, die für die erste C2c2-guideRNA kodiert, wobei die Nukleinsäure eine Sequenz-Insertionsstelle für die Insertion durch einen Benutzer einer Guide-Sequenz umfasst (z.B. eine Nukleotidsequenz, die an eine Target-RNA hybridisiert); und (f) eine zweite C2c2-guideRNA (und/oder eine Nukleinsäure, die die zweite C2c2-guideRNA codiert), z.B. eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die die zweite C2c2-guideRNA codiert, wobei die Nukleinsäure eine Sequenz-Insertionsstelle für die Insertion einer Guide-Sequenz (z.B. einer Nukleotidsequenz, die an eine Target-RNA hybridisiert) durch einen Benutzer enthält. Die erste C2c2-guideRNA umfasst eine erste Nukleotidsequenz, die mit einer ersten einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert, und eine zweite Nukleotidsequenz, die an das erste C2c2-Protein bindet. Die zweite C2c2-guideRNA umfasst eine erste Nukleotidsequenz, die mit einer zweiten einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert, und eine zweite Nukleotidsequenz, die an das zweite C2c2-Protein bindet. Das erste C2c2-Protein wird durch die zweite C2c2-guideRNA nicht aktiviert, und das erste C2c2-Protein spaltet ssRNA, die mindestens ein A enthält (z.B. keine ssRNA spaltet, der A fehlt). Das zweite C2c2-Protein wird nicht durch die erste C2c2-guideRNA aktiviert, und das zweite C2c2-Protein spaltet ssRNA, die mindestens ein U enthält (z.B. keine ssRNA spaltet, der U fehlt).
  • Die Folgenden sind nicht einschränkende Beispiele (aufgelistet als a) bis w) (unten) von ersten und zweiten C2c2-Proteinen, die zur Aufnahme in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet sind:
    • a) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Hhe-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56K dargestellt ist;
    • b) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der in 56G dargestellten Rca Cas13a-Aminosäuresequenz;
    • c) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Ppr Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56B dargestellt ist;
    • d) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lne-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56l dargestellt ist;
    • e) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lbu Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56C dargestellt ist;
    • f) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lwa Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56E dargestellt ist;
    • g) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der in 56D dargestellten Lsh Cas13a-Aminosäuresequenz;
    • h) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Hhe-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56K dargestellt ist;
    • i) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der in 56G dargestellten Rca Cas13a-Aminosäuresequenz;
    • j) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Ppr Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56B dargestellt ist;
    • k) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lne-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56l dargestellt ist;
    • I) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lbu Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56C dargestellt ist;
    • m) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lwa Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56E dargestellt ist;
    • n) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der in 56D dargestellten Lsh Cas13a-Aminosäuresequenz;
    • o) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lse-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56A dargestellt ist;
    • p) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a - Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Hhe-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56K dargestellt ist;
    • q) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a - Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der in 56G dargestellten Rca Cas13a-Aminosäuresequenz;
    • r) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a - Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Ppr Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56B dargestellt ist;
    • s) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a - Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lne-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56l dargestellt ist;
    • t) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a - Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lbu Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56C dargestellt ist;
    • u) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a - Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lwa Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56E dargestellt ist;
    • v) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a - Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der in 56F dargestellten Lsh Cas13a-Aminosäuresequenz; oder
    • w) das erste C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a - Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lse-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56A dargestellt ist.
  • C2c2-Protein
  • Ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, bindet an eine C2c2-guideRNA, wird durch die guideRNA (die mit der Target-RNA hybridisiert) zu einer einzelsträngigen Target-RNA geführt und wird dadurch „aktiviert“. Wenn die HEPN1- und HEPN2-Domänen des C2c2-Proteins intakt sind, spaltet das C2c2-Protein nach Aktivierung die Target-RNA, spaltet aber auch Non-Target-RNAs.
  • In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit 80% oder mehr (z.B. 85% oder mehr, 90% oder mehr, 95% oder mehr, 98% oder mehr, 99% oder mehr, 99,5% oder mehr oder 100%) Aminosäuresequenzidentität zur Aminosäuresequenz, die in einer der SEQ ID NR.: 1-6 angegeben ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Listeria seeligeri C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Leptotrichia buccalis C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der C2C2-Aminosäuresequenz von Rhodobacter capsulatus, die in SEQ ID NR.: 4 dargestellt ist.
    In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Carnobacterium gallinarum C2c2 Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Herbinix hemicellulosilytica C2c2 Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 dargestellt ist. In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, eine Aminosäuresequenz mit 80% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zur Leptotrichia buccalis (Lbu) C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist. In einigen Fällen ist ein C2c2-Protein, das für den Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, ein Leptotrichia buccalis (Lbu) C2c2-Protein (z.B. siehe SEQ ID NR.: 2). In einigen Fällen umfasst ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Erfindung geeignet ist, die Aminosäuresequenz, die in einer der SEQ ID NR.: 1-2 und 4-6 angegeben ist.
  • In einigen Fällen ist ein C2c2-Protein, das in einem Kit der vorliegenden Offenbarung enthalten ist, nicht ein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein. In einigen Fällen ist ein C2c2-Protein, das in einem Kit der vorliegenden Erfindung enthalten ist, kein C2c2-Polypeptid mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu dem Lsh C2c2-Polypeptid, das in SEQ ID NR.: 3 dargestellt ist.
  • In einigen Fällen ist ein C2c2-Protein, das für den Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, um einen Faktor von 1,2-fach oder mehr wirksamer als ein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein bei der Spaltung von RNA, die nicht das Target einer C2c2-guideRNA gemäß dem Verfahren ist. In einigen Fällen ist das C2c2-Protein um einen Faktor von 1,5-fach oder mehr effizienter als ein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein bei der Spaltung von RNA, die nicht das Target einer C2c2-guideRNA gemäß dem Verfahren ist. In einigen Fällen spaltet das in einem Verfahren der vorliegenden Offenbarung verwendete C2c2-Polypeptid, wenn es aktiviert wird, Non-Target-RNA mindestens 1,2-fach, mindestens 1,5-fach, mindestens 2-fach, mindestens mindestens 2,5-fach, 3-fach, mindestens 4-fach, mindestens 5-fach, mindestens 6-fach, mindestens 7-fach, mindestens 8-fach, mindestens 9-fach, mindestens 10-fach, mindestens 15-fach, mindestens 20-fach, mindestens 30-fach oder mehr als 30-fach, effizienter als Lsh C2c2.
  • In einigen Fällen zeigt ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens eine 50% ige RNA-Spaltungseffizienz innerhalb von 1 Stunde nach dem Inkontaktbringen (z.B. 55% oder mehr, 60% oder mehr, 65% oder mehr, 70% oder mehr oder 75% oder mehr Spaltungseffizienz). In einigen Fällen zeigt ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50% RNA-Spaltungseffizienz innerhalb von 40 Minuten nach dem Inkontaktbringen (z.B. 55% oder mehr, 60% oder mehr, 65% oder mehr, 70% oder mehr oder 75% oder mehr Spaltungseffizienz). In einigen Fällen zeigt ein C2c2-Protein, das für den Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50% RNA-Spaltungseffizienz innerhalb von 30 Minuten nach dem Inkontaktbringen (z.B. 55% oder mehr, 60% oder mehr, 65% oder mehr, 70% oder mehr oder 75% oder mehr Spaltungseffizienz).
  • In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Erfindung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der in einer Probe vorhandenen RNA in einem Zeitraum von 30 Sekunden bis 60 Minuten, z.B. von 1 Minute bis 60 Minuten, von 30 Sekunden bis 5 Minuten, 1 Minute bis 5 Minuten, 1 Minute bis 10 Minuten, 5 Minuten bis 10 Minuten, 10 Minuten bis 15 Minuten, 15 Minuten bis 20 Minuten, 20 Minuten bis 25 Minuten, 25 Minuten bis 30 Minuten, 30 Minuten Minuten 35 Minuten 40 Minuten 45 Minuten 45 Minuten 50 Minuten 50 Minuten 55 Minuten 60 Minuten 60 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, die in einer Probe vorhanden ist, in einem Zeitraum von 30 Sekunden bis 5 Minuten (z.B. 1 Minute bis 5 Minuten, z.B. in einem Zeitraum von 1 Minute, 2 Minuten, 3 Minuten, 4 Minuten oder 5 Minuten). In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der in einer Probe vorhandenen RNA in einem Zeitraum von 5 Minuten bis 10 Minuten (z.B. in einem Zeitraum von 5 Minuten, 6 Minuten, 7 Minuten, 8 Minuten, 9 Minuten oder 10 Minuten). In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der in einer Probe vorhandenen RNA in einem Zeitraum von 10 Minuten bis 15 Minuten (z.B. 10 Minuten, 11 Minuten, 12 Minuten, 13 Minuten, 14 Minuten, oder 15 Minuten). In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, in einem Zeitraum von 15 Minuten bis 20 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, die in einer Probe vorahandne ist, in einem Zeitraum von 20 Minuten bis 25 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, die in einer Probe vorhanden ist in einem Zeitraum von 25 Minuten bis 30 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA, die in einer Probe vorhanden ist, in einem Zeitraum von 30 Minuten bis 35 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA in einem Zeitraum von 35 Minuten bis 40 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA in einem Zeitraum von 40 Minuten bis 45 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA in einem Zeitraum von 45 Minuten bis 50 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA in einem Zeitraum von 50 Minuten bis 55 Minuten. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% der RNA in einem Zeitraum von 55 Minuten bis 60 Minuten.
  • In einigen Fällen ist das C2c2-Protein, das in einem Kit der vorliegenden Erfindung enthalten ist, kein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein. In einigen Fällen ist das C2c2-Protein um einen Faktor von 1,2-fach oder mehr (z.B. 1,5-fach oder mehr, 1,7-fach oder mehr oder 2-fach oder mehr) effizienter als ein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein (z.B. beim Spalten von Non-Target-RNA). Als solches ist in einigen Fällen ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, um einen Faktor von 1,2-fach oder mehr (z.B. 1,5-fach oder mehr, 1,7-fach oder mehr oder 2-fach oder mehr) effizienter als ein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein bei der Spaltung von RNA, die nicht Target der C2c2-guideRNA gemäß dem Verfahren ist. In einigen Fällen spaltet ein C2c2-Protein, das zum Einschluss in einem Kit der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, wenn es aktiviert wird, Non-Target-RNA mindestens 1,2-fach, mindestens 1,5-fach, mindestens 2-fach, mindestens 2,5-fach, mindestens 3-fach, mindestens 4-fach, mindestens 5-fach, mindestens 6-fach, mindestens 7-fach, mindestens 8-fach, mindestens 9-fach, mindestens 10-fach 15-fach, mindestens 20-fach, mindestens 30-fach oder mehr als 30-fach effizienter als Lsh C2c2.
  • Positivkontrollen
  • Ein Kit der vorliegenden Offenbarung, der eine markierte Nachweis-RNA und ein C2c2 Polypeptid umfasst, kann auch eine Positivkontroll-Target-RNA einschließen. In einigen Fällen umfasst der Kit auch eine Positivkontroll-RNA, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die an die Kontroll-Target-RNA hybridisiert. In einigen Fällen wird die Positivkontroll-Target-RNA in verschiedenen Mengen in getrennten Behältern bereitgestellt. In einigen Fällen wird die Positivkontroll-Target-RNA in verschiedenen bekannten Konzentrationen in getrennten Behältern zusammen mit Kontroll-Non-Target-RNAs bereitgestellt.
  • Nukleinsäure, die eine C2c2-guideRNA und/oder einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array und/oder ein C2c2-Protein codiert
  • Während die RNAs der Offenbarung (z.B. C2c2-guideRNAs und Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays) unter Verwendung irgendeines geeigneten Verfahrens synthetisiert werden können (z.B. chemische Synthese, in vitro unter Verwendung eines RNA-Polymerase-Enzyms, z.B. T7-Polymerase, T3-Polymerase, SP6-Polymerase usw.), sind Nukleinsäuren, die 2c2-guideRNAs und/oder Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays codieren, ebenfalls vorgesehen. Während C2c2-Proteine der Offenbarung (z.B. als Teil eines Kits) in Proteinform bereitgestellt werden können, können auch Nukleinsäuren (wie z.B. mRNA und/oder DNA), die das C2c2-Protein (die C2c2-Proteine) codieren, bereitgestellt werden.
  • Zum Beispiel umfasst in einigen Ausführungsformen ein Kit der vorliegenden Offenbarung eine Nukleinsäure (z.B. eine DNA, z.B. einen rekombinanten Expressionsvektor), die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für eine C2c2-guideRNA kodiert. In einigen Fällen codiert die Nukleotidsequenz eine C2c2-guideRNA ohne eine Guide-Sequenz. Zum Beispiel umfasst die Nukleinsäure in einigen Fällen eine Nukleotidsequenz, die eine konstante Region einer C2c2-guideRNA (eine C2c2-guideRNA ohne Guide-Sequenz) codiert, und eine Insertionsstelle für eine Nukleinsäure umfasst, die für eine Guide-Sequenz kodiert. In einigen Ausführungsformen umfasst ein Kit der vorliegenden Offenbarung eine Nukleinsäure (z.B. eine mRNA, eine DNA, z.B. einen rekombinanten Expressionsvektor), die eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein C2c2-Protein codiert.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst ein Kit der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäure (z.B. eine DNA, z.B. einen rekombinanten Expressionsvektor), der eine Nukleotidsequenz umfasst, die für einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array kodiert (z.B. in einigen Fällen, in denen jede guideRNA des Arrays eine andere Guide-Sequenz aufweist). In einigen Fällen haben eine oder mehrere der codierten guideRNAs des Arrays keine Guide-Sequenz, z.B. kann die Nukleinsäure Insertionsstelle(n) für die Guide-Sequenz(en) von einer oder mehreren der guideRNAs des Arrays umfassen. In einigen Fällen kann eine hier gegenständliche C2c2-guideRNA einen Handle aus einer Vorläufer-crRNA umfassen, muss jedoch nicht notwendigerweise mehrere Guide-Sequenzen umfassen.
  • In einigen Fällen kann die C2c2-Guide-Sequenz die RNA-kodierende Nukleotidsequenz (und/oder die Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array-codierende Nukleotidsequenz) funktionell mit einem Promotor verbunden sein, z.B. einem Promotor, der in einer prokaryotischen Zelle funktionell ist, einem Promotor, der in einer eukaryotischen Zelle funktionell ist, einem Promotor, der in einer Säugetierzelle funktionell ist, einem Promotor der in einer menschlichen Zelle und dergleichen funktionell ist. In einigen Fällen ist eine Nukleotidsequenz, die ein C2c2-Protein codiert, funktionsfähig mit einem Promotor verbunden, z.B. einem Promotor, der in einer prokaryotischen Zelle funktionell ist, einem Promotor, der in einer eukaryotischen Zelle funktionell ist, einem Promotor, der in einer Säugerzelle funktionell ist, einem Promotor, der in einer menschlichen Zelle funktionell ist, ein Zelltyp-spezifischer Promotor, ein regulierbarer Promotor, ein gewebespezifischer Promotor und dergleichen.
  • Beispiele für nicht beschränkende Erscheinungsformen der Offenlegung
  • Erscheinungsformen, einschließlich Ausführungsformen, des oben beschriebenen vorliegenden Gegenstands können allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen Erscheinungsformen oder Ausführungsformen nützlich sein. Ohne die vorstehende Beschreibung einzuschränken, werden nachstehend bestimmte nicht beschränkende Erscheinungsformen der Erfindung mit den Nummern 1-90 angegeben. Wie dem Fachmann beim Lesen dieser Erfindung ersichtlich sein wird, kann jeder der einzeln nummerierten Erscheinungsformen mit irgendeiner der vorhergehenden oder folgenden einzeln nummerierten Erscheinungsformen verwendet oder kombiniert werden. Dies soll alle diese Kombinationen von Erscheinungsformen gelten und ist nicht auf Kombinationen von Erscheinungsformen beschränkt, die im Folgenden explizit genannt werden:
    • Erscheinungsform 1. Verfahren zum Nachweisen einer einzelsträngigen Target-RNA in einer Probe, die eine Mehrzahl von RNAs umfasst, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
      1. a) Inkontaktbringen der Probe mit: (i) einer C2c2-guideRNA, die mit der einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert; und (ii) ein C2c2-Protein, das in der Probe vorhandene RNAs spaltet; und
      2. b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch C2c2-Protein-vermittelte RNA-Spaltung erzeugt wird.
    • Erscheinungsform 2. Verfahren zum Nachweisen einer einzelsträngigen Target-RNA in einer Probe, die eine Mehrzahl von RNAs umfasst, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
      1. (a) Inkontaktbringen der Probe mit: (i) einem Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array, umfassend zwei oder mehr C2c2-guideRNAs, welche jeweils eine unterschiedliche Guide-Sequenz aufweisen; und (ii) ein C2c2-Protein, das den Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array in einzelne C2c2-guideRNAs spaltet und auch RNAs der Probe spaltet; und
      2. (b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch C2c2-Protein-vermittelte RNA-Spaltung erzeugt wird.
    • Erscheinungsform 3. Verfahren nach Erscheinungsform 1 oder 2, wobei das C2c2-Protein mindestens 50% der in der Probe vorhandenen RNA innerhalb von 1 Stunde nach dem Inkontaktbringen spaltet.
    • Erscheinungsform 4. Verfahren gemäß Erscheinungsform 3, wobei das C2c2-Protein innerhalb von 40 Minuten nach dem Inkontaktbringen mindestens 50% der in der Probe vorhandenen RNAs spaltet.
    • Erscheinungsform 5. Verfahren gemäß Erscheinungsform 4, wobei das C2c2-Protein mindestens 50% der in der Probe vorhandenen RNA innerhalb von 5 Minuten nach dem Inkontaktbringen spaltet.
    • Erscheinungsform 6. Verfahren gemäß Erscheinungsform 5, wobei das C2c2-Protein mindestens 50% der in der Probe vorhandenen RNA innerhalb einer Minute nach dem Kontakt spaltet.
    • Erscheinungsform 7. Verfahren gemäß Erscheinungsform 1, wobei das C2c2-Protein von 50% bis zu mehr als 90% der RNAs, die in der Probe vorhanden sind, innerhalb von 1 Minute nach dem Inkontaktbringen abspaltet.
    • Erscheinungsform 8. Verfahren nach einer der Erscheinungsformen 1-7, wobei die minimale Konzentration, bei der die einzelsträngige Target-RNA nachgewiesen werden kann, in einem Bereich von 500 fM bis 1 nM liegt.
    • Erscheinungsform 9. Verfahren nach einer der Erscheinungsformen 1-7, wobei die einzelsträngige Target-RNA bei einer Konzentration von nur 800 fM nachgewiesen werden kann.
    • Erscheinungsform 10. Verfahren gemäß einer der Erscheinungsformen 1-9, wobei das C2c2-Protein kein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein ist, umfassend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 3 angegeben ist.
    • Erscheinungsform 11. Verfahren gemäß Erscheinungsform 10, wobei das C2c2-Protein Non-Target-RNA mindestens 1,2-fach effizienter spaltet als ein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein, umfassend mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95 %, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der in SEQ ID NR.: 3 angegebenen Aminosäuresequenz.
    • Erscheinungsform 12. Verfahren gemäß Erscheinungsform 11, wobei das C2c2-Protein Non-Target-RNA mindestens 1,5-fach effizienter spaltet als ein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein, umfassend die in SEQ ID NR.: 3 dargestellte Aminosäuresequenz.
    • Erscheinungsform 13. Verfahren gemäß einer der Erscheinungsformen 1-9, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von 80% oder mehr mit der in einer der SEQ ID NR.: 1, 2 oder 4-6 angegebenen Aminosäuresequenz umfasst.
    • Erscheinungsform 14. Verfahren gemäß einer der Erscheinungsformen 1-9, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Aminosäuresequenzidentität von 80% oder mehr mit der Leptotrichia buccalis (Lbu) C2c2-Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist.
    • Erscheinungsform 15. Verfahren gemäß einer der Erscheinungsformen 1-9, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Aminosäuresequenzidentität von 80% oder mehr mit der Listeria seeligeri C2c2-Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist.
    • Erscheinungsform 16. Verfahren gemäß einer der Erscheinungsformen 1-9, wobei das C2c2-Protein die Aminosäuresequenz umfasst, die in einer der SEQ ID NR.: 1-2 und 4-6 angegeben ist.
    • Erscheinungsform 17. Verfahren gemäß Erscheinungsform 1, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität zu der C2c2-Aminosäuresequenz umfasst, die in SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist, und eine Substitution von einem oder mehreren aus R472, H477, R1048 und H1053 umfasst.
    • Erscheinungsform 18. Verfahren gemäß Erscheinungsform 1, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 2 angegebenen C2c2-Aminosäuresequenz umfasst und eine Substitution der Aminosäuren R472 und H477 umfasst.
    • Erscheinungsform 19. Verfahren gemäß Erscheinungsform 1, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten C2c2-Aminosäuresequenz umfasst und eine Substitution der Aminosäuren R1048 und H1053 umfasst.
    • Erscheinungsform 20. Verfahren gemäß Erscheinungsform 1, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität zu der C2c2-Aminosäuresequenz umfasst, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist, und eine Substitution der Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053 umfasst.
    • Erscheinungsform 21. Verfahren nach einer der Erscheinungsformen 1-20, wobei die Probe vor der Messung für 2 Stunden oder weniger kontaktiert wird.
    • Erscheinungsform 22. Verfahren gemäß Erscheinungsform 21, wobei die Probe vor der Messung für 60 Minuten oder weniger kontaktiert wird.
    • Erscheinungsform 23. Verfahren gemäß Erscheinungsform 22, wobei die Probe vor der Messung für 30 Minuten oder weniger kontaktiert wird.
    • Erscheinungsform 24. Verfahren gemäß Erscheinungsform 23, wobei die Probe vor der Messung für 10 Minuten oder weniger kontaktiert wird.
    • Erscheinungsform 25. Verfahren gemäß Erscheinungsform 24, wobei die Probe vor der Messung für 1 Minute oder weniger kontaktiert wird.
    • Erscheinungsform 26. Verfahren nach einer der Erscheinungsformen 1-25, umfassend das Bestimmen einer Menge an Target-RNA, die in der Probe vorhanden ist.
    • Erscheinungsform 27. Verfahren gemäß Erscheinungsform 26, wobei das Bestimmen umfasst: Messen des nachweisbaren Signals, um eine Testmessung zu erzeugen; Messen eines nachweisbaren Signals, das von einer Referenzprobe erzeugt wird, um eine Referenzmessung zu erzeugen; und Vergleichen der Testmessung mit der Referenzmessung, um eine Menge an Target-RNA zu bestimmen, die in der Probe vorhanden ist.
    • Erscheinungsform 28. Verfahren nach Erscheinungsform 26, umfassend:
      • Messen des nachweisbaren Signals, um eine Testmessung zu erzeugen,
      • Messen eines nachweisbaren Signals, das von jeder von zwei oder mehr Referenzproben erzeugt wird, wobei die zwei oder mehr Referenzproben jeweils eine unterschiedliche Menge einer positiven Kontrolle enthalten,
      • RNA, um zwei oder mehr Referenzmessungen zu erzeugen, und
      • Vergleichen der Testmessung mit den zwei oder mehr Referenzmessungen, um eine Menge an Target-RNA zu bestimmen, die in der Probe vorhanden ist.
    • Erscheinungsform 29. Verfahren nach einer der Erscheinungsformen 1-28, wobei die Probe 5 bis 107 RNAs umfasst, die sich in der Sequenz voneinander unterscheiden.
    • Erscheinungsform 30. Verfahren nach einer der Erscheinungsformen 1-28, wobei die Probe 10 bis 106 RNAs umfasst, die sich in der Sequenz voneinander unterscheiden.
    • Erscheinungsform 31. Verfahren nach einer der Erscheinungsformen 1-30, wobei die Probe RNAs aus einem Zelllysat umfasst.
    • Erscheinungsform 32. Verfahren nach einer der Erscheinungsformen 1 bis 31, wobei das Messen eines nachweisbaren Signals eines oder mehrere von Folgendem umfasst: Nachweisen auf der Basis von Goldnanopartikeln, Fluoreszenzpolarisation, Kolloidphasenübergang/-dispersion, elektrochemische Detektion und auf Halbleitern basierende Detektion.
    • Erscheinungsform 33. Verfahren nach einer der Erscheinungsformen 1-32, wobei (i) das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit einer markierten Nachweis-RNA umfasst, die ein Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar umfasst (d.h., ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-Paar und/oder a Quencher/Fluor-Paar), (ii) das C2c2-Protein die markierte Nachweis-RNA spaltet und (iii) das nachweisbare Signal durch das FRET-Paar und/oder das Quencher/Fluor-Paar erzeugt wird.
    • Erscheinungsform 34. Verfahren gemäß Erscheinungsform 33, wobei die markierte Nachweis-RNA vor der Spaltung eine Höhe des nachweisbaren Signals erzeugt und die Höhe des nachweisbaren Signals verringert wird, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird.
    • Erscheinungsform 35. Verfahren gemäß Erscheinungsform 33, wobei die markierte Nachweis-RNA vor dem Spalten ein erstes nachweisbares Signal erzeugt und ein zweites nachweisbares Signal, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird.
    • Erscheinungsform 36. Verfahren gemäß Erscheinungsform 35, wobei die markierte Nachweis-RNA ein FRET-Paar und ein Quencher/Fluor-Paar umfasst.
    • Erscheinungsform 37. Verfahren nach einer der Erscheinungsformen 33-36, wobei die markierte Nachweis-RNA ein FRET-Paar umfasst.
    • Erscheinungsform 38. Verfahren gemäß Erscheinungsform 33, wobei ein nachweisbares Signal erzeugt wird, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird.
    • Erscheinungsform 39. Verfahren gemäß Erscheinungsform 33, wobei eine Höhe des nachweisbaren Signals ansteigt, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird.
    • Erscheinungsform 40. Verfahren nach Erscheinungsform 38 oder 39, wobei die markierte Nachweis-RNA ein Quencher/Fluor-Paar umfasst.
    • Erscheinungsform 41. Verfahren gemäß einer der Erscheinungsformen 33 bis 40, wobei die markierte Nachweis-RNA eine modifizierte Nukleobase, eine modifizierte Zuckereinheit und/oder eine modifizierte Nukleinsäureverbindung umfasst.
    • Erscheinungsform 42. Verfahren nach einer der Erscheinungsformen 1-41, wobei das Inkontaktbringen in einer zellfreien Probe durchgeführt wird.
    • Erscheinungsform 43. Verfahren gemäß einer der Erscheinungsformen 1-41, wobei das Inkontaktbringen in einer Zelle in vitro, ex vivo oder in vitro durchgeführt wird.
    • Erscheinungsform 44. Verfahren zum Spalten eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays in zwei oder mehr C2c2-guideRNAs, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Inkontaktbringen eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays, umfassend zwei oder mehr C2c2-guideRNAs, von denen jede eine unterschiedliche Guide-Sequenz aufweist, mit einem C2c2-Protein, wobei das C2c2-Protein den Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array in einzelne C2c2-guideRNAs spaltet.
    • Erscheinungsform 45. Verfahren nach Erscheinungsform 44, wobei dem C2c2-Protein eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne fehlt und/oder eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne fehlt.
    • Erscheinungsform 46. Verfahren gemäß Erscheinungsform 44 oder Erscheinungsform 45, wobei der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr C2c2-guideRNAs umfasst, die verschiedene Target-Sequenzen innerhalb desselben Target-RNA-Moleküls als Target haben.
    • Erscheinungsform 47. Verfahren nach einer der Erscheinungsformen 44-46, wobei der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr C2c2-guideRNAs umfasst, die verschiedene Target-RNA-Moleküle als Target haben.
    • Erscheinungsform 48. Verfahren nach einer der Erscheinungsformen 44-47, wobei das Inkontaktbringen nicht innerhalb einer Zelle stattfindet.
    • Erscheinungsform 49. Verfahren nach einer der Erscheinungsformen 44-48, wobei mindestens eine der guideRNAs und/oder der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array nachweisbar markiert ist.
    • Erscheinungsform 50. Kit zum Nachweisen einer Target-RNA in einer Probe, umfassend eine Mehrzahl von RNAs, wobei der Kit Folgendes umfasst:
      1. (a) einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array und/oder eine Nukleinsäure, codierend den Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array, wobei der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr C2c2-guideRNAs umfasst, welche jeweils eine unterschiedliche Guide-Sequenz und/oder Insertionsstelle für eine bevorzugte Guide-Sequenz aufweisen; und
      2. (b) ein C2c2-Protein.
    • Erscheinungsform 51. Kit nach Erscheinungsform 50, wobei dem C2c2-Protein eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne fehlt und/oder eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne fehlt.
    • Erscheinungsform 52. Kit von Erscheinungsform 50 oder 51, wobei der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr C2c2-guideRNAs umfasst, die verschiedene Target-Sequenzen innerhalb des gleichen Target-RNA-Moleküls als Target haben.
    • Erscheinungsform 53. Kit nach einer der Erscheinungsformen 50-52, wobei der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr C2c2-guideRNAs umfasst, die verschiedene Target-RNA-Moleküle als Target haben.
    • Erscheinungsform 54. Der Kit nach einer der Erscheinungsformen 50-53, wobei mindestens eine der guideRNAs und/oder der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array nachweisbar markiert ist.
    • Erscheinungsform 55. Kit nach einer der Erscheinungsformen 50 bis 54, ferner umfassend eine markierte Nachweis-RNA, umfassend ein Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar (d.h. ein FRET-Paar und/oder ein Quencher/Fluor-Paar).
    • Erscheinungsform 56. Kit zum Nachweisen einer Target-RNA in einer Probe, umfassend eine Mehrzahl von RNAs, wobei der Kit Folgendes umfasst:
      1. (a) eine markierte Nachweis-RNA, umfassend ein Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar (d.h. ein FRET-Paar und/oder ein Quencher/Fluor-Paar); und
      2. (b) ein C2c2-Protein.
    • Erscheinungsform 57. Kit nach Erscheinungsform 56, umfassend eine Positivkontroll-Target-RNA.
    • Erscheinungsform 58. Der Kit von Erscheinungsform 57, wobei in der Positivkontroll-Target-RNA in unterschiedlichen Mengen in jedem von zwei oder mehr Behältern vorhanden ist.
    • Erscheinungsform 59. Kit nach einer der Erscheinungsformen 56-58, umfassend mindestens eines aus:
      • (c) eine C2c2-guideRNA und/oder eine Nukleinsäure, die die C2c2-guideRNA kodiert;
      • (d) eine Vorläufer-C2c2-guideRNA und/oder eine Nukleinsäure, die die Vorläufer-C2c2-guideRNA codiert; und
      • (e) einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array und/oder eine Nukleinsäure, codierend den Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array, wobei der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr C2c2-guideRNAs umfasst, welche jeweils eine unterschiedliche Guide-Sequenz und/oder Insertionsstelle für eine bevorzugte Guide-Sequenz aufweisen.
    • Erscheinungsform 60. Kit nach einer der Erscheinungsformen 56 bis 59, umfassend eine DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine C2c2-guideRNA mit oder ohne eine Guide-Sequenz kodiert.
    • Erscheinungsform 61. Kit nach Erscheinungsform 60, wobei die DNA eine Insertionssequenz zum Inserieren einer Guide-Sequenz umfasst.
    • Erscheinungsform 62. Kit von Erscheinungsform 60 oder 61, wobei die DNA ein Expressionsvektor ist und die C2c2-guideRNA funktionsfähig mit einem Promotor verbunden ist.
    • Erscheinungsform 63. Kit nach Erscheinungsform 62, wobei der Promotor ein T7-Promotor ist.
    • Erscheinungsform 64. Kit nach einer der Erscheinungsformen 56-63, umfassend eine C2c2-Endoribonuclease-Variante, der Nucleaseaktivität fehlt.
    • Erscheinungsform 65. Kit nach einer der Erscheinungsformen 56-64, wobei die markierte Nachweis-RNA ein FRET-Paar umfasst.
    • Erscheinungsform 66. Kit nach einer der Erscheinungsformen 56-65, wobei die markierte Nachweis-RNA ein Quencher/Fluor-Paar umfasst.
    • Erscheinungsform 67. Kit nach einer der Erscheinungsformen 56-66, wobei die markierte Nachweis-RNA ein FRET-Paar umfasst, das ein erstes nachweisbares Signal und ein Quencher/Fluor-Paar erzeugt, das ein zweites nachweisbares Signal erzeugt.
    • Erscheinungsform 68. Abweichendes C2c2-Polypeptid, umfassend:
      1. a) eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist, und Substitution der: i) Aminosäuren R472 und H477; ii) Aminosäuren R1048 und H1053; oder iii) Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053 umfasst;
      2. b) eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist, und Substitution der: i) Aminosäuren R445 und H450; ii) Aminosäuren R1016 und H1021; oder iii) Aminosäuren R445, H450, R1016 und H1021 umfasst;
      3. c) eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 dargestellt ist, und Substitution der: i) Aminosäuren R464 und H469; ii) Aminosäuren R1052 und H1057; oder iii) Aminosäuren R464, H469, R1052 und H1057 umfasst;
      4. d) eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 dargestellt ist, und Substitution der: i) Aminosäuren R467 und H472; ii) Aminosäuren R1069 und H1074; oder iii) Aminosäuren R467, H472, R1069 und H1074 umfasst; oder
      5. e) eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 dargestellt ist, und Substitution der: i) Aminosäuren R472 und H477; ii) Aminosäuren R1044 und H1049; iii) oder die Aminosäuren R472, H477, R1044 und H1049 umfasst.
    • Erscheinungsform 69. Abweichendes C2c2-Polypeptid von Erscheinungsform 68, wobei das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA aufweist (z.B. RNA-guided Spaltungsaktivität), aber die Fähigkeit zur Bindung von C2c2-guideRNA und ssRNA beibehält und die Fähigkeit behält, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
    • Erscheinungsform 70. Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein abweichendes C2c2-Polypeptid von Erscheinungsform 68 oder 69 kodiert.
    • Erscheinungsform 71. Nukleinsäure von Erscheinungsform 70, wobei die Nukleotidsequenz funktionell mit einem konstitutiven Promotor oder einem regulierbaren Promotor verbunden ist.
    • Erscheinungsform 72. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend die Nukleinsäure von Erscheinungsform 70 oder 71.
    • Erscheinungsform 73. Wirtszelle, die mit der Nukleinsäure von Erscheinungsform 70 oder 71 oder mit dem rekombinanten Expressionsvektor von Erscheinungsform 72 genetisch modifiziert ist.
    • Erscheinungsform 74. Wirtszelle von Erscheinungsform 73, wobei die Wirtszelle eine eukaryotische Zelle ist.
    • Erscheinungsform 75. Wirtszelle von Erscheinungsform 73, wobei die Wirtszelle eine prokaryotische Zelle ist.
    • Erscheinungsform 76. Wirtszelle nach einer der Erscheinungsformen 73-75, wobei die Wirtszelle in vitro, ex vivo oder in vivo ist.
    • Erscheinungsform 77. Verfahren zum Nachweisen von mindestens zwei verschiedenen einzelsträngigen Target-RNAs in einer Probe, die eine Mehrzahl von RNAs umfasst, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
      1. a) Inkontaktbringen der Probe mit:
        1. (i) einem ersten C2c2-Protein, das einzelsträngige RNAs (ssRNAs) spaltet, die mindestens ein A enthalten;
        2. (ii) einem zweiten C2c2-Protein, das ssRNAs spaltet, die mindestens ein U enthalten;
        3. (iii) einer ersten C2c2-guideRNA, die eine erste Nukleotidsequenz umfasst, die mit der ersten einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert, und eine zweite Nukleotidsequenz umfasst, die an das erste C2c2-Protein bindet; und
        4. (iv) einer zweiten C2c2-guideRNA, die eine erste Nukleotidsequenz umfasst, die mit der zweiten einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert, und eine zweite Nukleotidsequenz umfasst, die an das zweite C2c2-Protein bindet; wobei das erste C2c2-Protein nicht durch die zweite C2c2-guideRNA aktiviert wird, und wobei das erste C2c2-Protein ssRNA spaltet, die mindestens ein A enthält, und wobei das zweite C2c2-Protein nicht durch die erste C2c2-guideRNA aktiviert wird und wobei das zweite C2c2-Protein ssRNA spaltet, die mindestens ein U umfasst; und
      2. b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch RNA-Spaltung durch das erste und das zweite C2c2-Protein erzeugt wird, wobei ein erstes nachweisbares Signal bei Aktivierung des ersten C2c2-Proteins und ein zweites nachweisbares Signal bei Aktivierung des zweiten C2c2-Proteins erzeugt wird, wobei der Nachweis des ersten Signals das Vorhandensein der ersten Target-ssRNA in der Probe anzeigt, und wobei der Nachweis des zweiten Signals das Vorhandensein der zweiten Target-ssRNA in der Probe anzeigt.
    • Erscheinungsform 78. Verfahren nach Erscheinungsform 77, wobei
      • a) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Hhe-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56K dargestellt ist, umfasst;
      • b) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Rca Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56G dargestellt ist, umfasst;
      • c) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ppr Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56B dargestellt ist, umfasst;
      • d) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lne-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56l dargestellt ist, umfasst;
      • e) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lbu Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56C dargestellt ist, umfasst;
      • f) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lwa Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56E dargestellt ist, umfasst;
      • g) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lsh Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56D dargestellt ist, umfasst;
      • h) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a -Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Hhe-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56K dargestellt ist, umfasst;
      • i) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a -Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Rca Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56G dargestellt ist, umfasst;
      • j) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a -Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ppr Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56B dargestellt ist, umfasst;
      • k) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a -Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lne-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56l dargestellt ist, umfasst;
      • I) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Amino Säuresequenzidentität zur Ere Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lbu Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56C dargestellt ist, umfasst;
      • m) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a -Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lwa Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56E dargestellt ist, umfasst;
      • n) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a -Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lsh Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56D dargestellt ist, umfasst;
      • o) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a -Aminosäuresequenz, die in 56J dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lse-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56A dargestellt ist, umfasst;
      • p) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Hhe-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56K dargestellt ist, umfasst;
      • q) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Rca Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56G dargestellt ist, umfasst;
      • r) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ppr Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56B dargestellt ist, umfasst;
      • s) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lne-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56l dargestellt ist, umfasst;
      • t) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lbu Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56C dargestellt ist, umfasst;
      • u) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lwa Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56E dargestellt ist, umfasst;
      • v) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lsh Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56F dargestellt ist, umfasst; oder
      • w) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56H dargestellt ist, umfasst; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lse-Cas13a-Aminosäuresequenz, die in 56A dargestellt ist, umfasst.
    • Erscheinungsform 79. Verfahren nach Erscheinungsform 77 oder 78, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit:
      1. i) einer ersten markierten Nachweis-RNA, die ein erstes Fluoreszenzresonanzenergietransfer- (FRET)-Paar und/oder ein erstes Quencher/Fluor-Paar umfasst, umfasst, wobei die erste markierte Nachweis-RNA mindestens ein A umfasst und kein U umfasst; und
      2. ii) einer zweiten markierten Nachweis-RNA, umfassend ein zweites FRET-Paar und/oder ein zweites Quencher/Fluor-Paar, wobei die zweite markierte Nachweis-RNA mindestens ein U umfasst und kein A umfasst, wobei das erste C2c2-Protein die erste markierte Nachweis-RNA spaltet und das erste nachweisbare Signal durch das erste FRET-Paar und/oder das erste Quencher/Fluor-Paar erzeugt wird und wobei das erste C2c2-Protein die zweite markierte Nachweis-RNA spaltet und das zweite nachweisbare Signal durch das zweite FRET-Paar und/oder das zweite Quencher/Fluor-Paar erzeugt wird.
    • Erscheinungsform 80. Verfahren gemäß Erscheinungsform 79, wobei die erste markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von 2 bis 15 aufeinanderfolgenden As und/oder die zweite markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von 2 bis 15 aufeinanderfolgenden Us umfasst.
    • Erscheinungsform 81. Verfahren gemäß Erscheinungsform 79, wobei die erste markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von 4 bis 15 aufeinanderfolgenden As umfasst und/oder die zweite markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von 4 bis 15 aufeinanderfolgenden Us umfasst.
    • Erscheinungsform 82. Verfahren gemäß Erscheinungsform 79, wobei die erste markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von mindestens 3 aufeinanderfolgenden As und/oder die zweite markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von mindestens 3 aufeinanderfolgenden Us umfasst.
    • Erscheinungsform 83. Verfahren gemäß Erscheinungsform 79, wobei die erste markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von mindestens 4 aufeinanderfolgenden As und/oder die zweite markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von mindestens 4 aufeinanderfolgenden Us umfasst.
    • Erscheinungsform 84. Kit, umfassend:
      1. (a) eine erste markierte Nachweis-RNA, der U fehlt und die mindestens ein A umfasst und ein erstes Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar umfasst;
      2. (b) eine zweite markierte Nachweis-RNA, der A fehlt und die mindestens ein U umfasst und ein zweites Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar umfasst;
      3. (c) ein erstes C2c2-Protein und/oder eine das erste C2c2-Protein codierende Nukleinsäure, wobei das erste C2c2-Protein die erste markierte Nachweis-RNA, nicht aber die zweite markierte Nachweis-RNA spalten kann (z.B. spaltet das erste C2c2-Protein Adenin+-RNAs, wenn sie aktiviert werden und RNAs, denen A fehlt, nicht spalten; und
      4. (d) ein zweites C2c2-Protein und/oder eine das zweite C2c2-Protein codierende Nukleinsäure, wobei das zweite C2c2-Protein die zweite markierte Nachweis-RNA, aber nicht die erste markierte Nachweis-RNA spalten kann (z.B. wenn das zweite C2c2-Protein Uracil+-RNA spaltet) aktiviert, spaltet jedoch RNAs, denen U fehlt, nicht.
    • Erscheinungsform 85. Kit nach Erscheinungsform 84, umfassend mindestens eines aus:
      • (e) einer ersten C2c2-guideRNA und/oder einer Nukleinsäure, die die erste C2c2-guideRNA codiert, wobei die erste C2c2-guideRNA eine Sequenz einer konstanten Region umfasst, die an das erste C2c2-Protein bindet;
      • (f) eine zweite C2c2-guideRNA und/oder eine Nukleinsäure, die für die zweite C2c2-guideRNA kodiert, wobei die zweite C2c2-guideRNA eine Sequenz einer konstanten Region umfasst, die an das zweite C2c2-Protein bindet;
      • (g) eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für eine Sequenz der konstanten Region kodiert, die an das erste C2c2-Protein bindet, und eine Insertionsstelle für eine ausgewählte Guide-Sequenz;
      • (h) eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für eine konstante Region kodiert, die an das zweite C2c2-Protein bindet, und eine Insertionsstelle für eine ausgewählte Guide-Sequenz.
    • Erscheinungsform 86. Kit nach Erscheinungsform 84, umfassend eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für eine erste C2c2-guideRNA kodiert, wobei die erste C2c2-guideRNA eine Sequenz einer konstanten Region umfasst, die an das erste C2c2-Protein bindet.
    • Erscheinungsform 87. Kit nach Erscheinungsform 84, umfassend eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine zweite C2c2-guideRNA codiert, wobei die zweite C2c2-guideRNA eine Sequenz einer konstanten Region umfasst, die an das zweite C2c2-Protein bindet.
    • Erscheinungsform 88. Kit nach Erscheinungsform 84, umfassend eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für eine Sequenz mit konstanter Region kodiert, die an das erste C2c2-Protein bindet, und eine Insertionsstelle für eine ausgewählte Guide-Sequenz.
    • Erscheinungsform 89. Kit nach Erscheinungsform 84, umfassend eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für eine Sequenz mit konstanter Region kodiert, die an das zweite C2c2-Protein bindet, und eine Insertionsstelle für eine ausgewählte Guide-Sequenz.
    • Erscheinungsform 90. Kit nach einer der Erscheinungsformen 86 bis 89, wobei die Nukleinsäure ein Expressionsvektor ist und die Nukleotidsequenz funktionell mit einem Promotor verknüpft ist.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele werden angegeben, um dem Fachman eine vollständige Offenbarung und Beschreibung der Weise bereitzustellen, in welcher die vorliegende Erfindung zu realisieren und zu verwenden ist, und sollen nicht den Umfang der Erfindung einschränken, wie sie von den Erfindern angesehen wird, noch sollen sie darstellen, dass folgende Experimente alle oder die einzigen durchgeführten Experimente sind. Es wurden versucht, die Genauigkeit in Bezug auf die verwendeten Zahlen sicherzustellen (z.B. Mengen, Temperatur usw.), aber einige experimentelle Fehler und Abweichungen sind zu berücksichtigen. Wenn nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsteile, das Molekulargewicht ist das gewichtete Mittel des Molekulargewichts, die Temperatur ist in Grad Celsius angegeben und der Druck ist bei oder in der Nähe des Atmosphärendrucks. Standardabkürzungen könnten verwendet werden, z.B. bp, Basenpaar(e); kb, Kilobase(n); pl, Picoliter(n); s, Sekunde(n); Minute oder min, Minute(n); h, Stunde(n); aa, Aminosäure(n); kb, Kilobase(n); bp, Basenpaar(e); nt, Nukleotid(e); i.m., intramuskulär; i.p., intraperitoneal; s.c., subkutan; und dergleichen.
  • Die hier beschriebenen Daten zeigen, dass C2c2 zwei verschiedene Ribonukleaseaktivitäten aufweist, die für die CRISPR-RNA-Prozessierung und den ssRNA-Abbau verantwortlich sind. Die Reifung der Vorläufer-CRISPR-RNAs (prä-crRNAs) ist ein relativ langsames, hochspezifisches katalytisches Ereignis. Im Gegensatz dazu wird C2c2 bei der Bindung an Target-RNAs, die eine Sequenzkomplementarität zum Guide-Segment der crRNA aufweisen, als robuste allgemeine RNase aktiviert, die RNA in cis und in trans spaltet, indem die Strangspaltung an Uracil-Nukleotiden eingeleitet wird. Die Daten zeigen, dass diese trans-Spaltungsaktivität für den hochempfindlichen RNA-Nachweis in komplexen Gemischen genutzt werden kann.
  • Beispiel 1: Reinigung von rekombinantem C2c2-Protein
  • 1A-1E. Zusammenfassung des endogenen C2c2-Locus und heterologer Expression und Reinigung von rekombinantem C2c2-Protein. 1A. Schematische Darstellung des Locus von Leptotricia buccalis C2c2. Vorhergesagte HEPNaktive Stellen sind in Gelb mit hervorgehobenen aktiven Stellenresten. 1B. Schematische Darstellung der reifen crRNA aus diesem CRISPR-System vom Typ VI. 1C. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-Analyse von Kationenaustausch-Chromatographie-Fraktionen. E. coli-Zellen, die His-Maltose-bindendes Protein (MBP)-C2c2 exprimieren, wurden geerntet und durch Ultraschall lysiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation geklärt, und dann wurde das His-MBP-C2c2 über Metallionen-Affinitätschromatographie isoliert. Proteineluate wurden mit TEV-Protease inkubiert, um die His-MBP-Markierung abzuspalten. Gespaltenes Protein wurde auf eine HiTrap-Heparinsäule geladen und über einen linearen KCI-Gradienten eluiert. Elutionsfraktionen wurden zur Analyse auf ein 10% SDS-PAGE-Gel geladen. 1D. Kationenaustauschchromatographie-Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert und dann auf eine S200-Größenausschlusschromatographiesäule geladen. Fraktionen aus der Größenaustauschchromatographie wurden mittels SDS-PAGE analysiert. 1E. Arbeitsmodell für die enzymatische Aktivität von C2c2.
  • Beispiel 2:C2c2 ist eine programmierbare Endoribonuklease
  • Gereinigtes C2c2 spaltete einzelsträngige RNA (ssRNA) in einer crRNA-gerichteten Weise, die von der Gegenwart katalytisch aktiver HEPN-Domänen abhängig war (2).
  • 2. Spaltungsassays wurden in 20 mM Tris-HCI, pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5% Glycerin durchgeführt. 100 nM C2c2-Protein wurde mit crRNA in einem Verhältnis von 2:1 für 10 Minuten bei 37 °C vorinkubiert, um die Komplex-Assemblierung zu fördern. Die Zugabe von ~ 1 nM 5'-32P-markierter ssRNA initiierte die Reaktion und die Zeitpunkte wurden durch Quenchen mit Formamid-Ladepuffer genommen. Die Bildung des Spaltprodukts wurde durch 15% ige denaturierende Harnstoff-PAGE aufgelöst und unter Verwendung eines Phosphorimagers sichtbar gemacht. Inaktiviertes Protein (angezeigt durch dC2c2-Bezeichnung) ist eine Vierfachpunktmutante (R472A, H477A, R1048A, H1053A), die sowohl Arginin als auch Histidin aus dem R-X4-6-H-HEPN-Motiv in beiden vorhergesagten aktiven Stellen eliminiert. In diesem Gel sind die interessierenden Spuren durch die roten Kästchen hervorgehoben. Bei Off-Target-ssRNA oder wenn die HEPN-Domänen inaktiviert sind wird keine Spaltaktivität detektiert.
  • Beispiel 3:C2c2-Spaltungsaktivität ist spezifisch für einzelsträngige RNA
  • C2c2 wies keine Spaltung von doppelsträngiger RNA oder DNA auf, wobei einzelsträngige DNA nur begrenzt und mit einer stark reduzierten Geschwindigkeit im Vergleich zu ssRNA gespalten wurde (3).
  • 3. C2c2 spaltete einzelsträngige RNA deutlich und spaltete keine doppelsträngige Substrate. Bedingungen des Spaltungsassays wie 2. Die Spaltprodukte wurden auf einem 15% igen denaturierenden Harnstoff-PAGE aufgetrennt. Die Proben wurden nach 5, 10, 30, 75 Minuten entnommen, wobei alle Kontrollspuren 75 Minuten lang parallel inkubiert wurden. Spaltprodukte des erwarteten Größenbereichs können nur in den ssRNA-Reaktionen und in einem geringeren Ausmaß bei den den Bedingungen für einzelsträngige DNA nachgewiesen werden. Die 3'-Ende-Markierung des einzelsträngigen RNA-Targets zeigt, dass die Spaltung außerhalb der Target-Spacer-Hybridisierungsregion stattfindet. Markierungen im Oberteil der Figur zeigen an, ob Protein („Lbu C2c2“) oder C2c2-guideRNA („crGAPDH1“) hinzugefügt wurden. Kontrollen umfassten (i) Protein, aber keine guideRNA, (ii) guideRNA, aber kein Protein und (iii) kein Protein und keine guideRNA.
  • Beispiel 4:C2c2 prozessiert Vorläufer-crRNAs zu reifen crRNAs
  • C2c2 prozessierte Vorläufer-crRNAs zu reifen crRNAs in einer HEPN-Domänenunabhängigen Weise (4A-4B), was das Vorhandensein einer zusätzlichen Endonuklease-Domäne anzeigt.
  • 4A. Diagramm der prä-crRNA-Prozessierung, katalysiert durch C2c2. 4B. 100 nM Lbu C2c2 wurde in 20 mM HEPES, pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 5% Glycerin mit ~ 5 nM 5'-P-markierter ssRNA für 60 min vor dem Quenchen mit Formamid-Ladepuffer inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden an 15% igem denaturierendem Harnstoff-PAGE aufgetrennt und mit einem Phosphoimager visualisiert. Inaktiviertes Protein (angezeigt durch dC2c2-Bezeichnung) ist eine Vierfachpunktmutante (R472A, H477A, R1048A, H1053A), die sowohl Arginin als auch Histidin aus dem R-X4-6-H-HEPN-Motiv in beiden vorhergesagten aktiven Stellen eliminiert. Drei verschiedene prä-crRNAs mit variablen Spacer-Sequenzen wurden auf die C2c2-Prozessierungskapazität getestet.
  • Beispiel 5: Sensitiver Nachweis von Transkripten in komplexen Gemischen
  • C2c2 wurde verwendet, um Target-Transkripte in komplexen Mischungen nachzuweisen (5).
  • 5. 50 nM C2c2:crRNA mit λ2-ssRNA als Target wurde mit 185 nM RNAse-Alert-Substrat (ein kleines Fluoreszenz-Quencher-RNA-Oligonukleotid - eine markierte Nachweis-RNA mit einem Quencher/Fluor-Paar markiert) und 100 ng HEK293T-Gesamt-RNA in Gegenwart von steigenden Mengen A2-ssRNA (0-10 nM) für 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Ein Anstieg der Fluoreszenz wurde beobachtet, wenn „aktiviertes“ C2c2 (C2c2:crRNA:λ2 ssRNA) das RNAse-Alert-Substrat spaltete und das Fluor vom Quencherelement löste.
  • Beispiel 6: Vorläufer-crRNA (prä-crRNA)-Prozessierung durch C2c2-Protein
  • C2c2 gespaltene (prozessierte) Vorläufer-crRNA (prä-crRNA), und diese Spaltung war unabhängig von einer HEPN-Domäne (6).
  • 6. 300 nM C2c2 wurden für 0 bis 60 Minuten bei 37 °C mit 1 nM 5'-32P-markierter prä-crRNA inkubiert. Die RNA-Produkte wurden auf 15% Harnstoff-PAGE getrennt und unter Verwendung eines Phosphorimagers abgebildet. Die erfolgreiche Prozessierung der prä-crRNA wird durch das Vorhandensein eines kleineren „gespaltenen RNA“-Produkts bestimmt.
  • Beispiel 7
  • MATERIALEN UND VERFAHREN
  • Die folgenden Materialien und Verfahren wurden verwendet und sind auf die Beispiele 8 bis 12 anwendbar.
  • C2c2 phylogenetische und Kandidaten-Auswahl. C2c2-Maximum-Likelihood-Phylogenien wurden unter Verwendung von RAxML mit dem PROTGAMMALG-Evolutionsmodell und 100 Bootstrap-Samplings berechnet. Sequenz-Alignment erfolgte mittels MAFFT mit der ‚einsi‘-Methode. Niewöhner, O. & Jinek, M. Structural basis for the endoribonuclease of the type III-A CRISPR-associated protein Csm6. RNA 22, 318-329 (2016). Kandidatenhomologe wurden ausgewählt, um Hauptzweige der Proteinfamilie zu untersuchen.
  • C2c2 Proteinproduktion und -reinigung. Expressionsvektoren für die Proteinreinigung wurden unter Verwendung von synthetischen gBlocks zusammengestellt, die von Integrated DNA Technologies bezogen wurden. Die Codon-optimierte genomische C2c2-Sequenz wurde N-terminal mit einer His6-MBP-TEV-Schnittstelle markiert, wobei die Expression durch einen T7-Promotor gesteuert wurde (die Karte ist auf Anfrage erhältlich). Mutante Proteine wurden „Round-the-Horn“ über die ortsgerichtete Mutagenese von Wildtyp-C2c2-Konstrukten kloniert. Expressionsvektoren wurden in Rosetta2 E. coli-Zellen transformiert, die in 2xYT-Broth bei 37 °C gezüchtet wurden. E. coli-Zellen wurden während der logarithmischen Phase mit 0,5 M Isopropyl-β-D-1-thiogalatopyranosid (ITPG) induziert, und die Temperatur wurde zur Übernacht-Expression von His-MBP-C2c2 auf 16 °C reduziert. Die Zellen wurden anschließend geerntet, in Lysepuffer (50 mM Tris-HCI pH 7,0, 500 mM NaCl, 5% Glycerin, 1 mM Tris (2-carboxyethyl)phosphin (TCEP), 0,5 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-freier Proteaseinhibitor (Roche)) resuspendiert und durch Ultraschall lysiert, und die Lysate wurden durch Zentrifugation geklärt. Lösliches His-MBP-C2c2 wurde über Metallionen-Affinitätschromatographie isoliert, und proteinhaltiges Eluat wurde mit Tobacco Etch Virus (TEV)-Protease bei 4 °C über Nacht unter Dialyse in lonenaustauschpuffer (50 mM Tris-HCI pH 7,0, 250 mM KCl, 5% Glycerin, 1 mM TCEP) inkubiert, um die His6-MBP-Markierung abzutrennen. Gespaltenes Protein wurde auf eine HiTrap SP-Säule geladen und über einen linearen KCl (0,25-1,5 M) Gradienten eluiert. Kationenaustauschchromatographie-Fraktionen wurden vereinigt und mit 30 kD-Cutoff-Konzentratoren (Thermo Fisher) konzentriert. Das C2c2-Protein wurde weiter durch Größenausschlusschromatographie auf einer S200-Säule gereinigt und in Gelfiltrationspuffer (20 mM Tris-HCI pH 7,0, 200 mM KCl, 5% Glycerin, 1 mM TCEP) für nachfolgende enzymatische Assays gelagert.
  • Herstellung von ssRNA. Alle RNAs, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden in vitro transkribiert, mit Ausnahme der crRNA AES461, die synthetisch bestellt wurde (Integrated DNA Technologies) [siehe 15 und 19]. In vitro-Transkriptionsreaktionen wurden wie zuvor beschrieben mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: die T7-Polymerasekonzentration wurde auf 10 µg/ml reduziert und die UTP-Konzentration wurde auf 2,5 mM reduziert. Die Transkriptionen wurden bei 37 °C für 1-2 Stunden inkubiert, um die Nicht-Template-Addition von Nukleotiden zu reduzieren. Alle Transkriptionsreaktionen wurden unter Verwendung von 15% denaturierenden PAGE gereinigt. Alle RNAs wurden in Spaltungspuffer (20 mM HEPES pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2 und 5% Glycerin) resuspendiert. Für radioaktive Experimente wurden 5'-Triphosphate vor der Radiomarkierung durch Kalbsdarm-Phosphatase (New England Biolabs) entfernt, und ssRNA-Substrate wurden dann unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs) und [γ-32P]-ATP (Perkin Elmer) 5'-endmarkiert, wie zuvor beschrieben. Sternberg, S.H., Haurwitz, R.E. & Doudna, J. A. Mechanismof substrate selection by a highly specific CRISPR endoribonuclease. RNA 18, 661-672 (2012).
  • DNA-Substrate, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 2, 14 dargestellt.
  • RNA-Substrate, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 3, 15, dargestellt.
  • Prä-crRNA-Prozessierungs-Assays. Prä-crRNA-Spaltungsassays wurden bei 37 °C in Prozessierungspuffer (20 mM HEPES pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 µg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 10 µg/ml tRNA, 0,05% Igepal CA -630 und 5% Glycerin) mit einem 100-fachen molaren Überschuss von C2c2 relativ zu 5'-markierter prä-crRNA durchgeführt (Endkonzentrationen von 100 nM bzw. > 1 nM). Sofern nicht anders angegeben, wurde die Reaktion nach 60 Minuten mit 1,5X RNA-beladenem Farbstoff (100% Formamid, 0,025 Gew./Vol.-% Bromphenolblau und 200 µg ml-1 Heparin) gequencht. Nach dem Quenchen wurden die Reaktionen bei 95 °C für 5 Minuten denaturiert, bevor sie durch 12% oder 15% denaturierende PAGE (0,5 × TBE-Puffer) aufgetrennt wurden. Die Metallabhängigkeit der Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA oder EGTA zum Reaktionspuffer bei Konzentrationen im Bereich von 10-100 mM getestet. Banden wurden durch Phosphorimaging visualisiert und mit ImageQuant (GE Healthcare) quantifiziert. Die prozentuale Spaltung wurde als das Verhältnis der Produktbandintensität zur Gesamtintensität sowohl der Produkt- als auch der ungespaltenen prä-crRNA-Banden bestimmt und unter Verwendung von ImageQuant TL Software (GE Healthcare) auf den Hintergrund innerhalb jedes gemessenen Substrats normiert und an eine einphasige Exponentialfunktion-Assoziation mit Prism angepasst (GraphPad).
  • Produktgrößen-Kartierung. Die Länge des Spaltprodukts wurde biochemisch bestimmt, indem die Gelmigration der Produktbanden mit alkalischen Hydrolyse- und RNase T1-Aufschlussleitern unter Verwendung des RNase T1 Kits von Ambion verglichen wurde. Für die Hydrolyse-Leiter wurden 15 nM Vollängen-RNA-Substrate bei 95 °C in alkalischem 1X-Puffer (Ambion) für 5 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden mit 1,5 × RNA-Ladepuffer gequencht und auf -20 ° C abgekühlt, um die Hydrolyse sofort zu stoppen. Für die RNase T1-Leiter wurden 15 nM Vollängen-RNA-Substrate in 1X-RNA-Sequenzierungspuffer (Ambion) bei 65 °C entfaltet. Die Reaktionen wurden auf Umgebungstemperatur abgekühlt, und dann wurde 1 µl RNase T1 zu der Reaktion gegeben. Nach 15 Minuten wurden die Reaktionen durch Phenol-Chloroform-Extraktion gestoppt und zur Lagerung wurde 1,5 × RNA-Ladepuffer zugegeben. Die Hydrolysebanden wurden parallel zu Spaltungsproben auf 15% denaturierender PAGE aufgelöst und durch Phosphorimaging sichtbar gemacht.
  • Target-Spaltungs-Assays. Target-Spaltungs-Assays wurden bei 25 °C und 37 °C in Spaltungspuffer (20 mM HEPES pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2 und 5% Glycerin) durchgeführt. Die guid-crRNA wurden vorgefaltet, indem sie 5 min auf 65 °C erhitzt wurden und dann langsam auf Umgebungstemperatur in Spaltungspuffer abgekühlt wurden. Die RNP-Komplexbildung wurde in Spaltungspuffer, im Allgemeinen bei einem Molverhältnis von 2: 1 Protein zu crRNA bei 37 °C für 10 Minuten durchgeführt, bevor am 5'-Ende markierte Target- und/oder andere nicht-radiomarkierte RNA-Target-Substrate zugegeben wurden. Sofern nicht anders angegeben, betrugen die Endkonzentrationen von Protein, guide und Targets 100 nM, 50 nM bzw. > 1 nM für alle Reaktionen. Die Reaktionen wurden mit 1,5 × RNA-Beladungsfarbstoff gequencht und durch 15% denaturierende PAGE (0,5 × TBE-Puffer) aufgetrennt. Banden wurden durch Phosphorimaging visualisiert und mit ImageQuant (GE Healthcare) quantifiziert. Die prozentuale Spaltung wurde als Verhältnis der gesamten Bandenintensität für alle kürzeren Produkte im Vergleich zur ungespaltenen Bande bestimmt und für den Hintergrund innerhalb jedes gemessenen Substrats mit ImageQuant TL Software (GE Healthcare) normalisiert und an eine einphasige exponentielle Assoziation unter Verwendung von Prism (GraphPad) angepasst.
  • crRNA-Filterbindungsassays. Filterbindungsassays wurden in RNA-Prozessierungspuffer (20 mM HEPES pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 µg/ml BSA, 10 µg/ml Hefe-tRNA, 0,01% Igepal CA-630 und 5% Glycerin) durchgeführt. LbuC2c2 wurde 1 Stunde bei 37 °C mit radiomarkierter crRNA (<0,1 nM) inkubiert. Tufryn, Protran und Hybond-N+ wurden in der oben aufgeführten Reihenfolge auf eine Dot-Blot-Vorrichtung aufgebracht. Die Membranen wurden zweimal mit 50 µl Äquilibrierungspuffer gewaschen (20 mM HEPES pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2 und 5% Glycerin), bevor die Probe auf die Membranen aufgebracht wurde. Die Membranen wurden erneut mit 50 µl Äquilibrierungspuffer gewaschen, getrocknet und durch Phosphorimaging sichtbar gemacht. Die Daten wurden mit ImageQuant TL Software (GE Healthcare) quantifiziert und mittels Prism (GraphPad Software) an eine Bindungsisotherme angepasst. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Dissoziationskonstanten und zugehörige Fehler sind in den Bildlegenden angegeben.
  • Elektrophoretic Mobility Shift Assays. Um die Dissoziation des LbuC2c2-dHEPN1/dHEPN2:crRNA-Komplexes bei niedrigen Konzentrationen während ssRNA-Bindungsexperimente zu vermeiden, enthielten die Bindungsreaktionen einen konstanten Überschuss von LbuC22c2-dHEPN1/dHEPN2 (200 nM) und steigende Konzentrationen von crRNA-A und <0,1 nM Target-ssRNA. Die Tests wurden in C2c2-Electrophoretic Mobility Shift Assa (EMSA)-Puffer (20 mM HEPES, pH 6,8, 50 mM KCl, 10 µg/ml BSA, 100 µg/ml Hefe-tRNA, 0,01% Igepal CA-630 und 5% Glycerin) durchgeführt. LbuC2c2-crRNA-A-Komplexe wurden vor der Zugabe von radioaktiv 5'-markiertem ssRNA-Substrat wie oben beschrieben für 10 Minuten bei 37 °C vorgeformt und eine weitere Inkubation für 45 Minuten bei 37 °C durchgeführt. Die Proben wurden dann durch 8% native PAGE bei 4 °C (0,5 × TBE-Puffer) getrennt. Gele wurden durch Phosphorimaging abgebildet, unter Verwendung der ImageQuant TL Software (GE Healthcare) quantifiziert und mittels Prism (GraphPad Software) an eine Bindungsisotherme angepasst. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Dissoziationskonstanten und zugehörige Fehler sind in den Bildlegenden angegeben.
  • Fluoreszenz-RNA-Nachweisassay. LbuC2c2:crRNA-Komplexe wurden durch Inkubation von 1 µM von Lbu-C2c2:C2c2 mit 500 nM crRNA für 10 Minuten bei 37 °C vorassembliert. Diese Komplexe wurden dann auf 100 nM LbuC2c2: 50 nM crRNA-λ2 in RNA-Prozessierungspuffer (20 mM HEPES pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 µg/ml BSA, 10 µg/ml Hefe-tRNA, 0,01% Igepal CA -630 und 5% Glycerin) in Gegenwart von 185 nM RNAase-Alert-Substrat (Thermo-Fisher), 100 ng HeLa-Gesamt-RNA und steigenden Mengen an ssRNA (0-1 nM) verdünnt. Diese Reaktionen wurden in einem Fluoreszenzplattenleser für bis zu 120 Minuten bei 37 °C mit Fluoreszenzmessungen inkubiert, die alle 5 Minuten durchgeführt wurden (λex: 485 nm; λem: 535 nm). Hintergrundkorrigierte Fluoreszenzwerte wurden durch Subtraktion von Fluoreszenzwerten erhalten, die aus Reaktionen erhalten wurden, die in Abwesenheit von Target-ssRNA durchgeführt wurden. Die maximale Fluoreszenz wurde durch Inkubieren von 50 nM RNaseA mit 185 nM RNAase-Alert-Substrat gemessen. Für gekoppelte prä-crRNA-Prozessierungs- und RNA-Nachweisassays wurden LbuCas9-sgRNA-Komplexe durch Inkubation von 1µM von Lbu-C2c2:C2c2 mit 500 nM prä-crRNA-A-2 für 20 min bei 37 °C vorassembliert und die Reaktionen wie oben beschrieben in Gegenwart von steigenden Mengen von ssRNA A und ssRNA λ2 (jeweils 0-1 nM) durchgeführt. In jedem Fall repräsentieren Fehlerbalken die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten.
  • Beispiel 8:C2c2-Familie prozessiert Vorläufer-crRNA-Transkripte, um reife crRNAs zu erzeugen
  • Den Typ-VI-CRISPR-Loci fehlt eine offensichtliche Cas6- oder Cas5d-artige Endonuclease oder tracrRNA. Die Frage wurde gestellt, ob C2c2 selbst eine prä-crRNA-Prozessierungsaktivität besitzen könnte. Um dies zu testen, wurden rekombinante C2c2-Homologe von Leptotrichia buccalis (Lbu), Leptotrichia shahii (Lsh) und Listeria seeligeri (Lse), die aus drei verschiedenen Zweigen der C2c2-Proteinfamilie stammen, in Escherichia coli exprimiert und gereinigt. 9A-9B.
  • Alle drei Proteine spalteten radioaktiv 5'-endmarkierte prä-crRNA-Substrate, die aus einer Volllängen-Konsensus-Repeat-Sequenz und einer 20 Nukleotid (nt) Spacer-Sequenz bestanden, in 60 Minuten. 9C. Die Spaltungsstelle für alle prä-crRNA-Homologen wurde unter Verwendung von T1-RNase- und Hydroxid-Hydrolyse-Leitern kartiert; es wurde gezeigt, dass die Verarbeitung an Positionen zwei oder fünf nts stromaufwärts von der vorhergesagten Haarnadelstruktur in Abhängigkeit von dem Homologen stattfindet. 9C.
  • Es ist möglich, dass zelluläre Faktoren die crRNA weiter verarbeiten können, da Sequenzierungsdaten aus der heterologen Expression von LseC2c2- und LshC2c2-Operons in E. coli ähnliche, aber nicht identische Prozessierungsereignisse feststellten. Spaltungsassays mit LbuC2c2 und einer prä-crRNA, die einen Tandem-Haarnadel-Repeat-Array enthält, führten zu zwei Produkten, die zwei aufeinanderfolgenden Spaltungsvorgängen entsprechen (16A-16F), was mit einer Rolle für C2c2 bei der Prozessierung von primären crRNA-Transkripten übereinstimmt. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass C2c2-Homologe in Typ-VI-CRISPR-Systemen die Reifung ihrer assoziierten crRNAs katalysieren.
  • 9A-9C. C2c2-Familie prozessiert Vorläufer-crRNA-Transkripte, um reife crRNAs zu generieren. 9A, phylogenetischer Baum nach Maximum-Likelihood-Methode von C2c2-Proteinen. Vollständige Details einschließlich Accessions, Organisationsnamen und Bootstrap-Werten sind in 22A bereitgestellt. Die in dieser Studie verwendeten Homologen sind gelb hervorgehoben. 9B, Diagramm der drei verschiedenen CRISPR-Loci vom Typ VI. Schwarze Rechtecke bezeichnen Repeat-Elemente, während gelbe Rauten Spacer-Sequenzen bezeichnen. Cas1 und Cas2 werden nur in der genomischen Umgebung von Lsh C2c2 gefunden. 9C, CC2c2-vermittelte Spaltung von prä-crRNA, abgeleitet von LbuC2c2, LseC2c2 und LshC2c2. OH: alkalische Hydrolyse-Leiter; T1: T1-RNase-Hydrolyse-Leiter; Verarbeitungsspaltungsreaktionen wurden mit 100 nM C2c2 und> 1 nM prä-crRNA durchgeführt. Eine schematische Darstellung der Spaltung ist rechts dargestellt, und die vorhergesagte prä-crRNA-Sekundärstruktur ist nachstehend graphisch dargestellt, wobei Pfeile die kartierte C2c2-Spaltungsstelle angeben.
  • 22A-22B. Vollständiger phylogenetischer Baum der C2c2-Familie und C2c2-Alignment. 22A, Phylogenetische Maximum-Likelihood-Rekonstruktion von C2c2-Proteinen. Zu den Blättern gehören die GI-Proteinzahlen und der Herkunftsorganismus; Bootstrap-Unterstützungswerte von 100 Resamplings werden für den inneren Split dargestellt. Die Skalierung erfolgt in Substitutionen pro Stelle. 22B, mehrfache Sequenz-Alignment der drei analysierten Homologe von C2c2, die Koordinaten basieren auf LbuC2c2.
  • 23A-23D. Reinigung und Herstellung von C2c2. Alle C2c2-Homologen waren in E. coli als His-MBP-Fusionen exprimiert und durch eine Kombination von Affinität, lonenaustausch und Größenausschlusschromatographie gereinigt. Ni2+-Affinitätsmarker wurde durch Inkubation mit TEV-Protease entfernt. Repräsentative SDS-PAGE von Chromatographiefraktionen sind oben in (23A-23B) gezeigt. 23C, Das Chromatogramm von der Superdex 200 (16/60)-Säule zeigt, dass C2c2 als einzelner Peak eluiert, der frei von Nukleinsäure ist. 23D, SDS-PAGE-Analyse aller in diesem Dokument verwendeten gereinigten Proteine.
  • 16A-16F. prä-crRNA-Prozessierung durch C2c2 ist Spacer-Sequenzunabhängig, kann auf Tandem-crRNA-Arrays auftreten, die von Mutationen in der 5'-flankierenden Region der prä-cRNA betroffen sind, und ist metallunabhängig, a repräsentativer zeitlicher prä-crRNA-Spaltungsassay, der die ähnliche Raten von LbuC2c2-, LshC2c2- und LseC2c2-prä-crRNA-Prozessierung demonstriert, b, Spaltstellen-Kartierung von LseC2c2 und LshCC2c2-Spaltung eines einzelnen kognaten prä-crRNA-Arrays. OH: alkalische Hydrolyse-Leiter; T1: T1-RNase-Hydrolyse-Leiter. Abspaltungsreaktionen wurden mit 100 nM Lbu C2c2 und < 1 nM prä-crRNA durchgeführt. Eine schematische Darstellung von Spaltprodukten ist dargestellt, wobei Pfeile die abgebildeten C2c2-Spaltprodukte zeigen, c, Spaltstellen-Kartierung der LbuCC2c2-Spaltung eines Tandem-prä-crRNA-Arrays. OH: alkalische Hydrolyse-Leiter; T1: T1-RNase-Hydrolyse-Leiter. Spaltungsreaktionen wurden mit 100 nM Lbu C2c2 und <1 nM prä-crRNA durchgeführt. Eine schematische Darstellung der Spaltprodukte ist rechts dargestellt, wobei Pfeile die abgebildeten C2c2-Spaltprodukte zeigen, d, repräsentativer LbuC2c2-prä-crRNA-Spaltungs-Zeitverlauf, der zeigt, dass ähnliche Raten der prä-crRNA-Prozessierung unabhängig von der crRNA-Spacer-Sequenz auftreten, e, LbuC2c2, 4-mer-Mutanten-prä-crRNA-Prozessierungsdaten, die die Bedeutung der einzelsträngigen 5'-flankierenden Region für eine effiziente prä-crRNA-Prozessierung zeigen. Der Prozentsatz der prä-crRNA-Prozessierung wurde nach 60 Minuten gemessen (Mittelwert ± SD, n = 3). f, Denaturierendes Gel, das die Prozessierungsaktivität bei verschiedenen EDTA- und EGTA-Konzentrationen zeigt. Hohe Konzentrationen von Chelatbildnern verändern das erwartete Migrationsmuster von Produkten.
  • Beispiel 9: Die LbuC2c2-vermittelte crRNA-Biogenese hängt sowohl von der Struktur als auch von der Sequenz der CRISPR-Repeats ab.
  • Andere prä-crRNA-verarbeitende Enzyme, wie Cas6 und Cas5d, erkennen die Haarnadel ihrer jeweiligen CRISPR-Repeat-Sequenz hochspezifischen. Die Sequenz- und Strukturanforderungen für die LbuC2c2-guideRNA-Prozessierung wurden bestimmt. Spaltungsassays wurden mit prä-crRNAs durchgeführt, die Mutationen in entweder der Stammschleife oder den einzelsträngigen flankierenden Regionen der Konsensus-Repeat-Sequenz enthielten (10A-10C). Die prä-crRNA-Spaltungsaktivität wurde signifikant abgeschwächt, wenn die Länge des Stammes in der Repeat-Region verändert wurde; während der repetitive Konsensus-Stamm mit 4 Basenpaaren (bp) zu einer Spaltung von 85 ± 0,7% nach 60 min führte, ergaben -1 bp und +1 bp-Stämme nur 54 ± 1,3% bzw. 6 + 3,8% Spaltung (10A). In ähnlicher Weise reduzierte die Inversion der Stammschleife oder die Verringerung der Schleifenlänge die Prozessierungsaktivität. Anfängliche Studien mit zusammenhängenden 4-nt-Mutationen einschließlich oder nahe der spaltbaren Bindung beseitigten vollständig die Fähigkeit von LbuC2c2, die prä-crRNAs zu prozessieren ( 16D). Eine umfassendere Mutationsanalyse der vollständigen crRNA-Repeat-Sequenz zeigte zwei getrennte Regionen auf beiden Seiten der Haarnadel mit ausgeprägter Empfindlichkeit gegenüber Basenveränderungen (10B; 17). Die Prozessierungsaktivität blieb in Anwesenheit der zweiwertigen Metallionen-Chelatbildner EDTA oder EGTA vollständig unbeeinflusst (10C; 16E). Zusammenfassend weisen diese Daten darauf hin, dass die C2c2-prä-crRNA-Spaltung ein von zweiwertigen Metallionen unabhängiges Verfahren ist, das durch eine Kombination von struktur- und sequenzspezifischer Erkennung von Repeat-abgeleiteten Haarnadeln im Vorläufer-CRISPR-Transkript bestimmt wird.
  • 10A-10C. Die LbuC2c2-vermittelte crRNA-Biogenese hängt sowohl von der Struktur als auch von der Sequenz der CRISPR-Repeats ab. 10A, Repräsentatives Gel der LbuC2c2-Prozessierung von prä-crRNAs, die strukturelle Mutationen innerhalb der Stamm- und Schleifenregionen der Haarnadel enthalten. Die nachstehend aufgeführten Prozessierungsprozentsätze werden für jede Bedingung nach 60 Minuten quantifiziert (Mittelwert ± SD, n = 3). 10B, Graphik, die die Abhängigkeit der prä-crRNA-Prozessierung von der CRISPR-Repeat-Sequenz zeigt. Die Wildtyp-Repeat-Sequenz ist nachstehend mit einzelnen Balken gezeigt, die 2 Nukleotidmutationen darstellen, wie oben in Rot angegeben. Die Spaltungsstelle ist mit einer Schere gekennzeichnet. Der prozentuale Anteil wurde nach 60 Minuten gemessen (Mittelwert ± SD, n = 3). Grafisch dargestellte Haarnadeln getesteter Mutanten finden sich in 16A-16F und 17. 10C, Die Abhängigkeit der Prozessierungsreaktion vom bivalenten Metallen wurde durch Zugabe von 10-100 mM EDTA zu Standard-Prozessierungsreaktionsbedingungen untersucht. Reaktionsendpunkt bei 60 min wird gezeigt.
  • 17. Detaillierte Zusammenfassung der Wirkung von prä-crRNA-Doppelmutationen auf die prä-crRNA-Prozessierungsaktivität. Der prozentuale Anteil der prä-crRNA-Prozessierung wurde nach 60 min (Mittelwert ± SD, n = 3) gemäß den Verfahren gemessen. Mutierte Nukleotide sind gelb hervorgehoben. Siehe 10B für die grafische Darstellung.
  • Beispiel 10: LbuC2c2 katalysiert den guide-abhängigen ssRNA-Abbau an cis- und trans-Targets
  • Nach der Reifung binden crRNAs typischerweise mit hoher Affinität an Cas-EffektorProtein(e), um RNA-guided Überwachungskomplexe zu erzeugen, die zur sequenzspezifischen Nukleinsäureerkennung fähig sind. Um die Funktionalität der C2c2-verarbeiteten crRNA zu testen, wurde das LbuC2c2-Protein verwendet, das in anfänglichen Spaltungsversuchen die deutlichste Aktivität aufwies. Für mehrere ssRNA-Substrate wurde beobachtet, dass LbuC2c2 nur wirksam spaltete, wenn es an die komplementäre crRNA gebunden war, was darauf hinweist, dass LbuC2c2:crRNA ssRNA RNA-guided spaltet (11b). Diese Aktivität wird im folgenden als On-Target- oder cis-Target-Spaltung bezeichnet (11a). Die durch LbuC2c2 vermittelte cis-Spaltung führte zu einer Leiterbildugn mehrerer Produkte, wobei die Spaltung bevorzugt vor Uracil-Resten erfolgte, analog zu LshC2c2 (18A-18B) 9. Diese Aktivität unterscheidet sich von anderen CRISPR-Effektoren der Klasse II (wie Cas9 und Cpf1), die Target-Nukleinsäurespaltung nur innerhalb einer durch Basenpaarung definierten Region an die crRNA katalysieren. Die Fähigkeit von LbuC2c2, als eine crRNA-aktivierte nicht-spezifische RNA-Endonuklease in trans zu wirken (insbesondere die C2c2-katalysierte Spaltung von RNA-Molekülen, die nicht von der crRNA angegriffen werden) wurde getestet (11A). Diese Fähigkeit wurde untersucht, indem Non-Target-Spaltungsreaktionen in Gegenwart von nicht markierter, On-Target (crRNA-komplementärer)-ssRNA wiederholt wurden. Es wurde ein schneller Abbau von 5'-markierter Non-Target-RNA unter diesen trans-Spaltungsbedingungen beobachtet (11B). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Erkennung einer Target-ssRNA, die zu dem Spacer-Segment der crRNA komplementär ist, C2c2 für einen schnellen und unspezifischen Abbau von RNA in trans aktiviert. Die ähnlichen RNA-Spaltungsraten und nahezu identischen Spaltprodukte, die sowohl für die cis-On-Target-Spaltung als auch für die trans-Non-Target-Spaltung beobachtet werden, implizieren das gleiche Nukleasezentrum in beiden Aktivitäten. Darüber hinaus legen diese Ergebnisse nahe, dass das, was als „cis“-Aktivität beobachtet wird, einfach trans-Aktivität ist, die auftritt, wenn nur ein Substrat verfügbar ist (18A-18B).
  • 11A-11C. LbuC2c2 katalysiert den guide-abhängigen ssRNA-Abbau an cis- und trans-Targets. 11A, Schema der beiden Modi des C2c2, guide-abhängigem ssRNA-Abbaus. 11B, Spaltung von zwei verschiedenen radioaktiv markierten ssRNA-Substraten, A und B, durch LbuC2c2. Komplexe von 100 nM C2c2 und 50 nM crRNA wurden bei 37 °C vorgeformt und die Reaktion wurde nach Zugabe von> 1 nM 5'-markierter Target-RNA bei 25 °C gestartet. trans-Spaltungsreaktionen enthielten gleiche molare (> 1 nM) Konzentrationen von radiomarkiertem, nicht-guide-komplementärem Substrat und nicht markiert On-Target-ssRNA. In der 11C, LbuC2c2, beladen mit crRNA mit Spacer A, wurde sowohl unter den Bedingungen cis (Target A-markiert)- als auch trans (Target B-markiert in Gegenwart von nicht markiertem Target A)-Spaltungsbedingungen in Gegenwart von EDTA auf Spaltungsaktivität getestet.
  • 18A-18B. LbuC2c2-ssRNA-Target-Spaltungsstellen-Kartierung, a, ssRNA-Target-Spaltungsassay durchgeführt nach Verfahren, die die LbuC2c2-vermittelte „cis“-Spaltung mehrerer radiomarkierter ssRNA-Substrate mit identischen Spacer-komplementären Sequenzen, aber unterschiedlichen 5'-flankierenden Sequenzen variabler Länge und Nukleotidzusammensetzung zeigen. Sequenzen von ssRNA-Substraten sind auf der rechten und unteren Seite des Gels gezeigt, wobei Spacer-komplementäre Sequenzen für crRNA-A und crRNA-B in gelb bzw. rot hervorgehoben sind. Pfeile zeigen vorhergesagte Spaltungsstellen an. Das Gel wurde zur Klarheit abgeschnitten. Es sollte angemerkt werden, dass das Muster von Spaltungsprodukten, die auf verschiedenen Substraten hergestellt sind (z.B. A.1 vs. A.2 vs. A.3), zeigt, dass die Wahl der Spaltungsstelle hauptsächlich von einer Uracil-Präferenz bestimmt wird und ein Fehlen eines offensichtlichen „crRNA-Maßstab-basierten“ Spaltungsmechanismus aufweist, was im Gegensatz zu dem steht, was für andere CRISPR-Einzeleffektorkomplexe der Klasse II wie Cas9 und Cpfl <ref?> beobachtet wird. Interessanterweise deutet das für Substrat A.0 beobachtete Spaltungsmuster auf eine sekundäre Präferenz für polyG-Sequenzen hin, die möglicherweise G-Quadruplexe oder ähnliche Sekundärstrukturen formen können, b, LbuC2c2-ssRNA-Target-Spaltungsassay, gemäß den Verfahren, unter Verwendung einer Reihe von crRNAs die die Länge des ssRNA-Targets abdecken. Die Sequenz der ssRNA-Substrate, die in diesem Experiment verwendet wurden, ist unter dem Gel mit Spacer-komplementären Sequenzen für jede crRNA, die gelb hervorgehoben ist, gezeigt. Pfeile zeigen vorhergesagte Spaltungsstellen an. Gleichermaßen sollte beachtet werden, dass für jede crRNA die Länge der Spaltproduktlänge sehr ähnlich ist, was wiederum auf ein Fehlen eines offensichtlichen „crRNA-Maßstab-basierten“ Spaltungsmechanismus hinweist. Das Fehlen mehrerer Spaltungsprodukte in einer Teilmenge der Reaktionen könnte durch die Anwesenheit von gebundener C2c2:crRNA auf dem ssRNA-Target erklärt werden, welche sterisch Zugang zu Uracilen durch beliebige cis (intramolekulare)- oder trans (intermolekulare)-aktive LbuC2c2-Stellen verschließt. Während eine geeignete Analyse der Präferenz von PFS für LbuC2c2 den Rahmen dieser Studie sprengen würde, wurde eine minimale Auswirkung der 3'-flankierenden Sequenz beobachtet. Erwartete PFS-Base wird in Diagramm neben jeder getesteten Führung rot notiert.
  • Beispiel 11: LbuC2c2 enthält zwei unterschiedliche Ribonuklease-Aktivitäten
  • Die prä-crRNA-Prozessierungsaktivität trat mit einer scheinbar 80-mal langsameren Geschwindigkeit auf als die crRNA-vermittelte Spaltung von entweder Target-RNA oder einer nicht-komplementären trans-ssRNA (12a). Unter sättigenden Enzymbedingungen erreichte die prä-crRNA-Prozessierung nach 1 h nur -85%, während die Geschwindigkeit der RNA-guided Spaltung von trans-Substraten aufgrund der bei 37 °C innerhalb von 1 min abgeschlossenen Reaktion nahezu nicht messbar war (19A-19C).. Es wurde auch gefunden, dass im Gegensatz zur prä-crRNA-Prozessierung die RNA-guided Spaltung in Gegenwart von EDTA vollständig aufgehoben wurde, was darauf hinweist, dass diese Aktivität von zweiwertigen Metallionen abhängig ist (11c). Angesichts der deutlichen Unterschiede in der Kinetik und Metallionenabhängigkeit zwischen der prä-crRNA-Prozessierung und der RNA-guided Spaltung wurde C2c2 als eine neue Klasse von CRISPR-Effektorproteinen angesehen, die zwei orthogonale RNA-Spaltungsaktivitäten aufweisen: eine für die crRNA-Reifung und die andere für den crRNA-gerichteten, unspezifischen RNA-Abbau. Um diese Hypothese zu testen, wurden mehrere Reste innerhalb der konservierten HEPN-Domänen des LbuC2c2, von denen vorhergesagt wird, dass sie RNA-aktive Spaltungsstellen enthalten, systematisch mutiert; und prä-crRNA-Prozessierung und RNA-guided RNase-Aktivität der Mutanten wurde beurteilt (12b). Doppel- und Vierfachmutanten von konservierten HEPN-Resten (R472A, R477A, R1048A und R1053) behielten eine deutliche prä-crRNA-Spaltungsaktivität bei (12c). Im Gegensatz dazu beseitigten alle HEPN-Mutanten die RNA-guided Spaltungsaktivität, während sie die crRNA- oder ssRNA-Bindungsfähigkeit nicht beeinflussen (20A-20C). Die Diskrepanzen bei den Spaltungsraten und der differentiellen Empfindlichkeit gegenüber Punktmutationen und EDTA zeigen, dass prä-crRNA-Prozessierung und RNA-guided RNA-Spaltung durch bestimmte katalytische Zentren im C2c2-Protein vermittelt werden, wobei das erstere metallunabhängig ist und das letztere von zweiwertigen Metallionen abhängige HEPN-Domänen benötigt.
  • 12A-12D. LbuC2c2 enthält zwei verschiedene Ribonuklease-Aktivitäten. 4A, Quantifizierte Zeitverlaufsdaten von cis-ssRNA-Target (schwarz) und prä-crRNA (blaugrün) Spaltung durch LbuC2c2, durchgeführt bei 37 °C. Exponentielle Anpassungen sind als durchgezogene Linien dargestellt (n = 3) und berechnete Geschwindigkeitskonstanten erster Ordnung (kbeob) sind 9,74 ± 1,15 und 0,12 ± 0,02 für cis-Target- bzw. prä-crRNA-Spaltung. 12B, Domänenarchitektur von LbuC2c2, die den Ort von HEPN-Mutationen zeigt. 12C und 12D, Ribonuklease-Aktivität von Doppel- und Vierfach-HEPN-Domänen-Mutanten für die prä-crRNA-Prozessierung in 12C und ssRNA-Targeting in 12D. cis- und trans-Spaltungsreaktionen, wie in 11c durchgeführt, unter Verwendung von crRNA, die den Spacer A für beide Aktivitäten als Target hat.
  • 19A-19C. Abhängigkeit der Länge der crRNA-Spacer, Reaktionstemperatur, 5'-Ende-Sequenz der crRNA von der Effizienz der Target-RNA-Spaltungsaktivität. 19A, Es wurde ein LbuC2c2-ssRNA-Target-Spaltungsassay durchgeführt, wie bei Verfahren mit crRNAs, die 16-nt-, 20-nt- oder 24-nt-Spacer besitzen. 19B, LbuC2c2-ssRNA-Target-Spaltungs-Zeitverlauf, durchgeführt entweder bei 25 °C oder 37 °C, gemäß den Verfahren. 19C, LbuC2c2-ssRNA-Target-Spaltungs-Zeitverlauf, durchgeführt nach Verfahren mit crRNAs, die verschiedene 5'-flankierende Nukleotidmutationen besitzen. Mutationen sind rot markiert. 1-2 Nukleotide 5'-Verlängerungen beeinflussten die Spaltungseffizienzen vernachlässigbar. Im Gegensatz dazu verlangsamte die Verkürzung der flankierenden Region auf 3 nts die Spaltungseffizienzen. Exponentielle Anpassungen sind als durchgezogene Linien für repräsentative Replikate dargestellt.
  • 20A-20C. Bindungsdaten für LbuC2c2 zum Reifen von crRNA und Target-ssRNA. 20A. Es wurden Filterbindungsassays, wie in den Verfahren zur Bestimmung der Bindungsaffinität von reifer crRNA-A zu LbuC2c2-WT, LbuC2c2-dHEPN1, LbuC2c2-dHEPN2 oder LbuC2c2-dHEPN1/dHEPN2 beschrieben, durchgeführt. Die quantifizierten Daten wurden an Standard-Bindungsisoformen angepasst. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. Die gemessenen Dissoziationskonstanten aus drei unabhängigen Experimenten (Mittelwert ± SD) betrugen 27,1 ± 7,5 nM (LbuC2c2-WT), 15,2 ± 3,2 nM (LbuC2c2-dHEPN1), 11,5 ± 2,5 nM (LbuC2c2-dHEPN2) und 43,3 ± 11,5 nM (LbuC2c2-dHEPN 1/dHEPN2). 20B, repräsentativer Electrophoretic Mobility Shift Assay für Bindungsreaktionen zwischen LbuC2c2-dHEPN1/dHEPN2:crRNA-A und entweder On-Target-A-ssRNA oder Off-Target-B-ssRNA, wie angegeben. Drei unabhängige Experimente wurden wie in den Verfahren beschrieben durchgeführt. Das Gel wurde zur Klarheit abgeschnitten. 20C, Quantifizierte Bindungsdaten von (b) wurden an Standard-Bindungsisoformen angepasst. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. Die gemessenen Dissoziationskonstanten aus drei unabhängigen Experimenten (Mittelwert ± SD) betrugen 1.62 ± 0.43 nM für ssRNA A und N.D (>>10 nM) für ssRNA B.
  • Beispiel 12: C2c2 ermöglicht einen empfindlichen visuellen Nachweis von Transkripten in komplexen Gemischen.
  • Die deutliche RNA-stimulierte Spaltung von trans-Substraten durch C2c2s kann als ein Mittel zum Nachweisen spezifischer RNAs innerhalb eines Pools von Transkripten verwendet werden. Bis heute erfordern die empfindlichsten RNA-Nachweisstrategien mehrere Runden von Polymerase- und/oder Reverse-Transcriptase-basierter Amplifikation. Als eine Alternative wurde getestet, ob die RNA-guided Transendonucleaseaktivität von C2c2 genutzt werden könnte, um einen Fluorophor-Quencher-markiertes Reporter-RNA-Substrat zu spalten, was zu einer Zunahme der Fluoreszenz bei Target-RNA-ausgelöster RNase-Aktivierung führt (13a). Kurz gesagt wurde LbuC2c2 mit crRNAs, die den Bakteriophagen λ als Target haben, beladen und auf seine Fähigkeit getestet, die entsprechenden λ-ssRNA-Targets zu nachweisen, mit denen HeLa-Zell-Gesamt-RNA versetzt war. Wenn LbuC2c2 das komplementäre Target erfolgreich nachweisen würde, würde die trans-Spaltungsaktivität aktiviert werden, um den Reporter zu spalten, wobei das Fluorophor aus dem Quencher freigesetzt wird. Bei Zugabe von nur 1-10 pM Target-RNA wurde nach 30 Minuten eine wesentliche crRNA-spezifische Zunahme der Fluoreszenz beobachtet (13b und 21). Kontrollexperimente mit entweder C2c2:crRNA-Komplex allein oder in Gegenwart von crRNA und einer nicht-komplementären Target-RNA führten zu vernachlässigbaren Zunahmen der Fluoreszenz relativ zu einer RNase A-positiven Kontrolle (13b und 21). Bei der 10 pM-Konzentration einer λ-Target-RNA wird nur -0,02% des C2c2:crRNA-Komplexes vorhergesagt, in dem aktiven Zustand zu sein, jedoch reflektiert das beobachtete Fluoreszenzsignal eine ~25-50%-ige Spaltung des Reporter-RNA-Substrats, abhängig von dem RNA-Target, was auf eine stabile enzymatische Aktivität mit mehreren Umsätzen durch LbuC2c2 hindeutet. Somit ist die crRNA-guided trans-Spaltung sogar bei extrem niedrigen Spiegeln an aktivem Protein potent und nachweisbar.
  • Da C2c2 seine eigene prä-crRNA prozessiert, wurde getestet, ob prä-crRNA Prozessierung und RNA-Nachweis in einer einzigen Reaktion kombiniert werden könnten. Um diese Idee zu testen, wurden Tandem-crRNA-Repeat-enthaltende Spacer, die zu den Target-RNAs A und λ2 komplementär sind, entworfen, und ihre Fähigkeit, abnehmende Mengen an A- und λ2-RNA nachzuweisen, die in HeLa-Gesamt-RNA gespiked waren, wurde getestet. Ein signifikanter Anstieg der Fluoreszenz, ähnlich in Größe und Empfindlichkeit zu Experimenten unter Verwendung von reifen crRNAs, wurde beobachtet (13b, 13c), was nahe legt, dass eine Tandem-prä-crRNA durch C2c2 erfolgreich für RNA-Targeting prozessiert und verwendet werden kann. Diese Daten unterstreichen das Potenzial für den multiplexierten RNA-Nachweis von einzelnen und/oder mehreren RNA-Molekülen in einem Assay unter Verwendung eines einzigen Tandem-prä-crRNA-Transkripts.
  • Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird vorgeschlagen, dass, wenn invasive Transkripte innerhalb der Wirtszelle über Basenpaarung mit crRNAs nachgewiesen werden, C2c2 für die promiskuitive Spaltung von RNA in trans aktiviert wird (13d).
  • 13A-13D. C2c2 ermöglicht einen sensitiven visuellen Nachweis von Transkripten in komplexen Mischungen. 13A, Veranschaulichung des RNA-Nachweisansatzes durch C2c2 unter Verwendung eines gequenchten Fluoreszenz-RNA-Reporters. Nach komplementärer Target-RNA-Bindung katalysiert C2c2 den Abbau der Reporter-RNA, was zur Akkumulation von Fluoreszenzsignal führt. 13B, Quantifizierung des Fluoreszenzsignals nach 30 Minuten für unterschiedliche Konzentrationen der Target-RNA durch C2c2 in Gegenwart von 100 ng Gesamt-RNA. RNaseA wird als Positivkontrolle für den RNA-Abbau gezeigt. Daten, dargestellt als Mittelwert ± SD für n = 3 unabhängige Experimente. 13C, Tandem-prä-crRNA-Prozessierung ermöglicht auch den RNA-Nachweis. Daten, dargestellt als Mittelwert ± SD für n = 3 unabhängige Experimente. 13D, Modell des Typ-VI-CRISPR-Synthsewegs, der beide C2c2-Ribonukleaseaktivitäten hervorhebt.
  • 21. RNase-Nachweis-Assay λ2-ssRNA-Zeitverlauf. LbuC2c2:crRNA-2 wurde mit RNAase-Alert-Substrat (Thermo-Fisher) und 100 ng HeLa Gesamt-RNA in Gegenwart von zunehmenden Mengen von λ2-ssRNA (0-1 nM) für 120 Minuten bei 37 °C inkubiert. Fluoreszenzmessungen wurden alle 5 Minuten durchgeführt. Die 1 nM-ssRNA-Reaktion erreichte eine Sättigung, bevor der erste Zeitpunkt gemessen werden konnte. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten.
  • Beispiel 13
  • Materialen und Verfahren
  • MEC2c2 Phylogenie- und Kandidaten-Auswahl. C2c2-Maximum-Likelihood-Phylogenien wurden unter Verwendung von RAxML mit dem PROTGAMMALG-Evolutionsmodell und 100 Bootstrap-Samplings berechnet. Sequenz-Alignment erfolgte mittels MAFFT mit der ‚einsi‘-Methode.
  • C2c2-Protein-Produktion und -Reinigung. Expressionsvektoren für die Proteinreinigung wurden unter Verwendung von synthetischen gBlocks zusammengestellt, die von Integrated DNA Technologies bestellt wurden. Die genomische Codon-optimierte C2c2-Sequenz wurde N-terminal mit einer His6-MBP-TEV-Schnittstelle markiert, wobei die Expression durch einen T7-Promotor gesteuert wurde. Mutante Proteine wurden über ortsgerichtete Mutagenese von C2c2-Wildtyp-Konstrukten kloniert. Expressionsvektoren wurden in Rosetta2 E. coli-Zellen transformiert, die in 2xYT-Bouillon bei 37 °C gezüchtet wurden. E. coli-Zellen wurden während der logarithmischen Phase mit 0,5 M ITPG induziert, und die Temperatur wurde zur Übernacht-Expression von His-MBP-C2c2 auf 16 °C reduziert. Die Zellen wurden anschließend geerntet, in Lysepuffer (50 mM Tris-HCI pH 7,0, 500 mM NaCl, 5% Glycerin, 1 mM TCEP, 0,5 mM PMSF und EDTA-freier Proteaseinhibitor (Roche)) resuspendiert und durch Ultraschall lysiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation geklärt. Lösliches His-MBP-C2c2 wurde über Metallionenaffinitätschromatographie isoliert, und proteinhaltiges Eluat wurde mit TEV-Protease bei 4 °C über Nacht inkubiert, während in lonenaustauschpuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,0, 250 mM KCl, 5%) Glycerin, 1 mM TCEP) dialysiert wurde, um den His6-MBP-Tag abzutrennen. Gespaltenes Protein wurde auf eine HiTrap SP-Säule geladen und über einen linearen KCl (0,25-1,5 M)-Gradienten eluiert. Kationenaustauschchromatographie-Fraktionen wurden vereinigt und mit 30 kD-Cutoff-Konzentratoren (Thermo Fisher) konzentriert. Das C2c2-Protein wurde weiter durch Größenausschlusschromatographie auf einer S200-Säule gereinigt und in Gelfiltrationspuffer (20 mM Tris-HCI pH 7,0, 200 mM KCl, 5% Glycerin, 1 mM TCEP) für nachfolgende enzymatische Assays gelagert. Expressionsplasmide werden mit Addgene hinterlegt.
  • Herstellung von RNA. Alle RNAs, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden in vitro transkribiert, mit Ausnahme der crRNA AES461, die synthetisch bezogen wurde (Integrated DNA Technologies) (siehe 33). In vitro-Transkriptionsreaktionen wurden mit den folgenden Modifikationen wie zuvor beschrieben durchgeführt: Die T7-Polymerasekonzentration wurde auf 10 µg/ml reduziert und die UTP-Konzentration wurde auf 2,5 mM reduziert. Die Transkriptionen wurden bei 37 °C für 1 bis 2 Stunden inkubiert, um die Nicht-Template-Addition von Nukleotiden zu reduzieren, und durch eine Behandlung mit DNase I bei 37 °C für 0,5 bis 1 Stunde gequencht. Die Transkriptionsreaktionen wurden durch 15%-ige denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigt, und alle RNAs wurden in Spaltungspuffer (20 mM HEPES pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2 und 5% Glycerin) resuspendiert. Für radioaktive Experimente wurden 5'-Triphosphate vor der Radiomarkierung durch Kalbsdarm-Phosphatase (New England Biolabs) entfernt, und ssRNA-Substrate wurden dann am 5'-Ende unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs) und [y-32P]-ATP (Perkin Elmer) markiert, wie zuvor beschrieben.
  • prä-crRNA-Prozessierungs-Assays. prä-crRNA-Spaltungsassays wurden bei 37 °C in RNA-Prozessierungspuffer (20 mM HEPES pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 µg/ml BSA, 10 µg/ml tRNA, 0,05% Igepal CA-630 und 5% Glycerin) mit einem 100-fachen molaren Überschuss an C2c2 relativ zu 5'-markierter prä-crRNA (Endkonzentrationen von 100 nM bzw. <1 nM) durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurde die Reaktion nach 60 Minuten mit 1,5X RNA-Beladungsfarbstoff (100% Formamid, 0,025 Gew./Vol.-% Bromphenolblau und 200 g ml Heparin) gequencht. Nach dem Quenchen wurden die Reaktionen bei 95 °C für 5 Minuten denaturiert, bevor sie durch 12% oder 15% denaturierende PAGE (0,5 × TBE-Puffer) aufgetrennt wurden. Die Metallabhängigkeit der Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA oder EGTA zum Reaktionspuffer bei Konzentrationen im Bereich von 10-100 mM getestet. Banden wurden durch Phosphorimaging visualisiert und mit ImageQuant (GE Healthcare) quantifiziert. Die prozentuale Spaltung wurde als das Verhältnis der Produktbandintensität zur Gesamtintensität sowohl der Produkt- als auch der ungespaltenen prä-crRNA-Banden bestimmt und unter Verwendung von ImageQuant TL Software (GE Healthcare) auf den Hintergrund innerhalb jedes gemessenen Substrats normiert und an eine einphasige Exponential-Assoziation mit Prism angepasst (GraphPad).
  • Produktgrößen-Kartierung und Identifizierung der 3'-Ende-Gruppen. Die Länge des Spaltprodukts wurde biochemisch bestimmt, indem die Gelmigration der Produktbanden mit alkalischen Hydrolyse- und RNase T1-Verdau-Leitern unter Verwendung des RNase T1 Kits von Ambion verglichen wurde. Für die Hydrolyse-Leiter wurden 15 nM RNA-Substrate voller Länge bei 95 °C in alkalischem IX-Puffer (Ambion) für 5 min inkubiert. Die Reaktionen wurden mit 1,5 × RNA-Ladepuffer gequencht und auf -20 °C gekühlt, um die Hydrolyse sofort zu stoppen. Für die RNase T1-Leiter wurden 15 nM Volllängen-RNA-Substrate in 1X-RNA-Sequenzierungspuffer (Ambion) bei 65 °C entfaltet. Die Reaktionen wurden auf Umgebungstemperatur abgekühlt, und dann wurde 1 U RNase T1 (Ambion) zur Reaktion gegeben. Nach 15 Minuten wurden die Reaktionen durch Phenol-Chloroform-Extraktion gestoppt und zur Lagerung wurde 1,5 × RNA-Ladepuffer zugegeben. Die Hydrolysebanden wurden parallel zu Spaltproben auf 15% denaturierender PAGE aufgelöst und durch Phosphorimaging sichtbar gemacht. Zur Identifizierung der 3'-Ende-Gruppe wurden Produkte aus der Prozessierungsreaktion mit 10 U T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs) für 1 Stunde bei 37 °C in Verarbeitungspuffer inkubiert. Die Reaktionen wurden mit 1,5X RNA-Ladepuffer gequencht, auf 20% denaturierender PAGE aufgetrennt und durch Phosphorimaging sichtbar gemacht.
  • Sequenzanalyse kleiner RNAs. RNA-Sequenzauslesungen von Smakov et al. wurden von den SRA-Läufen SRR3713697, SRR3713948 und SRR3713950 heruntergeladen. Die Paired-End-Auslesungen wurden lokal auf die Referenzsequenzen unter Verwendung von Bowtie2 mit den folgenden Optionen kartiert: „-reorder--very-fast-local -- local“. Die Kartierung wurde dann gefiltert, um nur Alignments beizubehalten, die keinen Konflikt enthielten, indem mapped.py mit den Optionen „-m 0 -p both“ verwendet wurde. BAM-Datei des resultierenden Kartierung verfügbar. Sequenzauslesungen wurde mit Geneious visualisiert und mit Prism (GraphPad) geplottet.
  • Target-Spaltungs-Assays. Target-Spaltungs-Assays wurden bei 25 °C oder 37 °C in Spaltungspuffer (20 mM HEPES pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2 und 5% Glycerin) durchgeführt. Die crRNA-Guides wurden vorgefaltet, indem sie 5 min auf 65 °C erhitzt wurden und dann langsam auf Umgebungstemperatur in Spaltungspuffer abgekühlt wurden. Die C2c2:crRNA-Komplexbildung wurde in Spaltungspuffer, im Allgemeinen bei einem molaren Verhältnis von 2: 1 Protein zu crRNA bei 37 °C für 10 Minuten durchgeführt, bevor am 5'-Ende markierte Target- und/oder andere nicht radioaktiv markierte RNA-Target-Substrate zugegeben wurden. Sofern nicht anders angegeben, betrugen die Endkonzentrationen von Protein, guide und Targets 100 nM, 50 nM bzw. <1 nM für alle Reaktionen. Die Reaktionen wurden mit 1,5 × RNA-Beladungsfarbstoff gequencht und durch 15% denaturierende PAGE (0,5 × TBE-Puffer) aufgetrennt. Banden wurden durch Phosphorimaging visualisiert und mit ImageQuant quantifiziert (GE Healthcare). Die prozentuale Spaltung wurde als das Verhältnis der gesamten Bandenintensität für alle kürzeren Produkte relativ zu der ungespaltenen Bande bestimmt und für den Hintergrund innerhalb jedes gemessenen Substrats unter Verwendung von ImageQuant TL Software (GE Healthcare) normalisiert und an eine einphasige exponentielle Assoziation unter Verwendung von Prism angepasst (GraphPad).
  • crRNA-Filterbindungsassays. Filterbindungsassays wurden in RNA-Prozessierungspuffer (20 mM HEPES pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 µg/ml BSA, 10 µg/ml Hefe-tRNA, 0,01% Igepal CA-630 und 5% Glycerin) durchgeführt. LbuC2c2 wurde 1 Stunde bei 37 °C mit radiomarkierter crRNA (<0,1 nM) inkubiert. Tufryn, Protran und Hybond-N+ wurden in der oben aufgeführten Reihenfolge auf eine Dot-Blot-Vorrichtung aufgebracht. Die Membranen wurden zweimal mit 50 µl Äquilibrierungspuffer gewaschen (20 mM HEPES pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2 und 5% Glycerin), bevor die Probe auf die Membranen aufgebracht wurde. Die Membranen wurden erneut mit 50 µl Äquilibrierungspuffer gewaschen, getrocknet und durch Phosphorimaging sichtbar gemacht. Die Daten wurden mit ImageQuant TL Software (GE Healthcare) quantifiziert und mittels Prism (GraphPad Software) an eine Bindungsisotherme angepasst. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Dissoziationskonstanten und zugehörige Fehler werden in den Bildlegenden angegeben.
  • Electrophoretic Mobility Shift Assays. Um die Dissoziation der LbuC2c2-dHEPN1/dHEPN2:crRNA-Komplexe bei niedrigen Konzentrationen während ssRNA-Bindungsexperimente zu vermeiden, umfassten die Bindungsreaktionen einen konstanten Überschuss von LbuC22c2-dHEPN1/dHEPN2 (200 nM) und steigende Konzentrationen von crRNA-A und <0,1 nM Target-ssRNA. Die Tests wurden in C2c2-EMSA-Puffer (20 mM HEPES pH 6,8, 50 mM KCl, 10 µg/ml BSA, 100 µg/ml Hefe-tRNA, 0,01% Igepal CA-630 und 5% Glycerin) durchgeführt. LbuC2c2-crRNA-A-Komplexe wurden vor der Zugabe von 5'-radiomarkiertem ssRNA-Substrat und einer weiteren Inkubation für 45 min bei 37 °C wie oben beschrieben für 10 min bei 37 °C vorgeformt. Die Proben wurden dann durch 8% native PAGE bei 4 °C (0,5 × TBE-Puffer) getrennt. Gele wurden durch Phosphorimaging abgebildet, unter Verwendung der ImageQuant TL Software (GE Healthcare) quantifiziert und mittels Prism (GraphPad Software) an eine Bindungsisotherme angepasst. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Dissoziationskonstanten und zugehörige Fehler werden in den Bildlegenden angegeben.
  • Fluoreszenz-RNA-Nachweisassay. LbuC2c2:crRNA-Komplexe wurden durch Inkubation von 1 µM von Lbu-C2c2:C2c2 mit 500 nM crRNA für 10 Minuten bei 37 °C vorassembliert. Diese Komplexe wurden dann auf 100ηM LbuC2c2: 50 nM crRNA-2 in RNA-Prozessierungspuffer (20 mM HEPES pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 µg/ml BSA, 10 µg/ml Hefe-tRNA, 0,01% Igepal CA verdünnt -630 und 5% Glycerin) in Gegenwart von 185 nM RNAase-Alert-Substrat (Thermo-Fisher), 100 ng HeLa-Gesamt-RNA und steigenden Mengen von 60 nt Target-ssRNA (0-1 nM) verdünnt. Diese Reaktionen wurden in einem Fluoreszenzplattenleser für bis zu 120 min bei 37 °C inkubiert, wobei Fluoreszenzmessungen alle 5 min durchgeführt wurden (λex: 485 nm; λem: 535 nm). Hintergrundkorrigierte Fluoreszenzwerte wurden durch Subtraktion von Fluoreszenzwerten erhalten, die aus Reaktionen erhalten wurden, die in Abwesenheit von Target-ssRNA durchgeführt wurden. Die maximale Fluoreszenz wurde durch Inkubieren von 50 nM RNAseA mit 185 nM RNAase-Alert-Substrat gemessen. Zur Messung der durch crRNA-ACTB vermittelten LbuC2c2-Aktivierung durch beta-Actin-mRNA in menschlicher Gesamt-RNA wurden LbuCas9:crRNA-Komplexe durch Inkubation von 1 µM von LbuC2c2 mit 500 nM crRNA-ACTB für 10 min bei 37 °C vorassembliert und die Reaktionen wurden bei den obigen Bedingungen in Gegenwart von steigenden Mengen (0-1 µg) von entweder HeLa-Zell-Gesamt-RNA oder E. coli-Gesamt-RNA (als Negativkontrolle) durchgeführt. Diese Reaktionen wurden in einem Fluoreszenzplattenleser für bis zu 180 min bei 37 °C mit inkubiert, wobei Fluoreszenzmessungen alle 5 min durchgeführt wurden (λex: 485 nm; λem: 535 nm). Hintergrundkorrigierte Fluoreszenzwerte wurden durch Subtrahieren von Fluoreszenzwerten erhalten, die aus Reaktionen erhalten wurden, die in Abwesenheit von Target-ssRNA durchgeführt wurden. Für gekoppelte prä-crRNA-Prozessierungs- und RNA-Nachweisassays wurden LbuCas9-crRNA-Komplexe durch Inkubation von 1 µl LbuC2c2 mit 500 nM prä-crRNA-A-A2 für 20 min bei 37 °C vorassembliert und die Reaktionen wie oben beschrieben in Gegenwart steigender Mengen an ssRNA A und ssRNA λ2 (jeweils 0-1 nM) durchgeführt. In jedem Fall repräsentieren Fehlerbalken die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten.
  • Hintergrundspaltung in Gesamt-RNA. LbuC2c2:crRNA λ4-Komplexe wurden wie zuvor für den Fluoreszenz-RNA-Nachweisassay beschrieben assembliert. Die Komplexe wurden in RNA-Prozessierungspuffer in Gegenwart von 3 µg Gesamt-RNA mit und ohne 10 nM λ4-ssRNA-Target inkubiert. Nach 2 Stunden wurde RNA durch Trizolextraktion und Ethanolfällung isoliert. Die RNA-Fragmentgrößenverteilung der resuspendierten Proben wurde unter Verwendung des Small-RNA-Analysekits (Agilent) auf einem Bioanalyzer 2100 (Agilent) unter Verwendung des Protokolls des Herstellers aufgelöst. Fluoreszenzintensitätskurven wurden in Prism für Kurvenüberlagerung normalisiert (GraphPad Software).
  • Ergebnisse
  • Den Typ-VI-CRISPR-Loci fehlt eine offensichtliche Cas6- oder Cas5d-artige Endonuclease oder tracrRNA. Bei Verwendung gereinigter rekombinanter C2c2-Proteinhomologe aus drei verschiedenen Zweigen der C2c2-Proteinfamilie (24a-24b und 28 und 29) zeigen die hier dargestellten Daten, dass alle drei C2c2-Enzyme am 5'-Ende radiomarkierte prä-crRNA Substrate spalten, bestehend aus einer Volllängen-Konsensus-Repeat-Sequenz und einer 20 Nukleotid (nt) Spacer-Sequenz (24c). Die Spaltungsstelle für jedes prä-crRNA:C2c2-Homologenpaar wurde kartiert, was zeigt, dass die Verarbeitung an einer Position entweder zwei oder fünf Nukleotide stromaufwärts von der vorhergesagten Repeat-Sequenz-Haarnadelstruktur stattfindet, abhängig von dem C2c2-Homolog (24c, 30A). Überraschenderweise stimmten die biochemisch kartierten 5'-Spaltungsstellen nicht mit zuvor beschriebenen Spaltungsstellen für Leptotrichia shahii (LshC2c2) oder Listeria seeligeri (LseC2c2) prä-crRNAs überein. Eine Nachanalyse des RNA-Sequenzierungsdatensatzes von Shmakov et al. zeigte eine Übereinstimmung der in vivo-Spaltungsstellen mit der hier berichteten in vitro-Stelle (30b-i). Außerdem führten Spaltungsassays unter Verwendung von C2c2 aus Leptotricia buccalis (LbuC2c2) und einer größeren prä-crRNA, die einen Tandem-Haarnadel-Repeat-Array umfasste, zu zwei Produkten, die aus zwei getrennten Spaltungsereignissen resultieren (31a), in Übereinstimmung mit einer Rolle für C2c2 bei der Prozessierung von Vorläufer-crRNA-Transkripten, die aus Typ-VI-CRISPR-Loci erzeugt wurden.
  • Um die Substratanforderungen und den Mechanismus der C2c2-guideRNA Prozessierung zu verstehen, wurden prä-crRNAs, die Mutationen entweder in der Stammschleife oder in den einzelsträngigen flankierenden Regionen der Konsensus-Repeat-Sequenz enthielten, erzeugt und ihre Fähigkeit, durch LbuC2c2 prozessiert zu werden, getestet (25). Die Daten zeigten, dass die C2c2-katalysierte Spaltung durch Veränderung der Länge des Stamms in der Repeat-Region abgeschwächt wurde (25a). Die Inversion der Stammschleife oder die Verringerung der Schleifenlänge verringerte auch die Prozessierungsaktivität von C2c2, während zusammenhängende 4-nt-Mutationen einschließlich oder nahe der spaltbaren Bindung diese vollständig beseitigten (31b). Eine umfangreichere Mutationsanalyse der vollständigen crRNA-Repeat-Sequenz zeigte zwei getrennte Regionen auf beiden Seiten der Haarnadel mit einer ausgeprägten Empfindlichkeit gegenüber Basenveränderungen (25b). Im Gegensatz dazu gab es für die Kinetik der Verarbeitung keine Abhängigkeit von der Spacer-Sequenz (31c). Diese Empfindlichkeit für beide flankierenden Bereiche der Haarnadel erinnert an die Sequenz- und Strukturmotive, die von vielen Cas6- und Cas5d-Enzymen benötigt werden. Im Gegensatz dazu hat Cpf1 keine Abhängigkeit von der 3'-Haarnadel-flankierenden Region, da die variable Spacer-Region an dem Haarnadel-Stamm angrenzt.
  • Mechanistische Untersuchungen von LbuC2c2 zeigten, dass die Prozessaktivität durch die Anwesenheit der Chelatbildner für zweiwertige Metallionen, EDTA oder EGTA, unbeeinflusst bleibt (25c), was auf einen Metallionen-unabhängigen RNA-Hydrolyse-Mechanismus hinweist. Eine metallionenunabhängige RNA-Hydrolyse wird durch die Bildung eines 2',3'-cyclischen Phosphats und 5'-Hydroxids an den 5'- bzw. 3'-Hälften der crRNA-Spaltungsprodukte typisiert. Um die chemische Identität der Endgruppen von C2c2-verarbeiteten Substraten zu bestimmen, wurden die 5'-flankierenden Produkte weiter mit T4-Polynukleotidkinase inkubiert, die 2',3'-cyclische Phosphate entfernt, um ein 3'-Hydroxyl zu hinterlassen. Eine veränderte Wanderung im denaturierenden Gel des 5'-flankierenden Produkts wurde nach der Kinasebehandlung beobachtet, was mit der Entfernung einer 3'-Phosphatgruppe übereinstimmte (31d). Die Unabhängigkeit vom bivalenten Metallion der C2c2s prä-crRNA-Prozessierungsaktivität steht in deutlichem Gegensatz zu der Abhängigkeit vom zweiwertigen Metallionen von Cpf1, dem einzigen anderen CREPR-Effektor mit einem einzigen Protein, der eine guide-Prozessierung zeigt. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass die C2c2-katalysierte prä-crRNA-Spaltung ein zweiwertiges Metallionen-unabhängiges Verfahren ist, das wahrscheinlich einen allgemeinen Säure-Base-Katalyse-Mechanismus verwendet.
  • Nach der Reifung binden crRNAs typischerweise mit hoher Affinität an Cas-EffektorProtein(e), um RNA-guided Überwachungskomplexe zu erzeugen, die zur sequenzspezifischen Nukleinsäureerkennung fähig sind. In Übereinstimmung mit früheren Arbeiten mit LshC2c2 katalysierte LbuC2c2 eine effiziente Spaltung von Target-RNA nur dann, wenn solche Substrate mit einer komplementären Sequenz in der crRNA basenpaaren konnten (32-34). Angesichts des promiskuitiven Spaltungsmusters, das für C2c2 beobachtet wurde (33), wurde die Fähigkeit von LbuC2c2 getestet, als eine crRNA-aktivierte unspezifische RNA-Endonuklease in trans zu wirken (32b). Im Gegensatz zu Non-Target-Spaltungs-Experimenten, die in cis durchgeführt wurden und mit früheren Beobachtungen für LshC2c2 übereinstimmten, wurde ein schneller Abbau von Non-Target-RNA in trans beobachtet (32b). Dieses Ergebnis zeigt, dass die Target-Erkennung C2c2 für den allgemeinen nicht-spezifischen Abbau von RNA aktiviert. Wichtig ist, dass die ähnlichen RNA-Spaltungsraten und nahezu identischen Spaltungsprodukte, die sowohl für die cis-On-Target-Spaltung als auch für die trans-Non-Target-Spaltung des gleichen RNA-Substrats beobachtet wurden, das gleiche Nukleasezentrum in beiden Aktivitäten implizieren (32b).
  • Bemerkenswerterweise trat die crRNA-vermittelte Spaltung der Target-ssRNA mit einer etwa 80-fach höheren Geschwindigkeit auf als die prä-crRNA-Prozessierung (26a), und im Gegensatz zur prä-crRNA-Prozessierung wurde die RNA-guided Target-Spaltung in Gegenwart von EDTA stark reduziert, was anzeigt, dass diese Aktivität von zweiwertigen Metallionen abhängig ist (26a, (32c, 34). Angesichts dieser deutlichen Unterschiede wurde angenommen, dass C2c2 zwei orthogonale RNA-Spaltungsaktivitäten besitzt: eine für die crRNA-Reifung und die andere für den crRNA-gerichteten, unspezifischen RNA-Abbau. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden mehrere Reste innerhalb der konservierten HEPN-Motive von LbuC2c2 systematisch mutiert, und die prä-crRNA-Prozessierung, und die RNA-guided RNase-Aktivität der Mutanten wurde bewertet (26, 34d). Doppel- und Vierfachmutanten von konservierten HEPN-Resten (R472A, R477A, R1048A und R1053) behielten eine robuste prä-crRNA-Spaltungsaktivität bei (26c). Im Gegensatz dazu zerstörten alle HEPN-Mutationen die RNA-guided Spaltungsaktivität, während sie die crRNA- oder ssRNA-Bindungsfähigkeit nicht beeinflussten (34d, 35).
  • Als nächstes wurden Mutationen gesucht, die die prä-crRNA-Prozessierungsaktivität aufheben würden, ohne die Target-RNA-Spaltung zu zerstören. In Anbetracht der Tatsache, dass alle anderen möglichen RNase-Motive jenseits der HEPN-Motive nicht vorhergesagt werden konnten und dass C2c2-Proteine keine Homologie zu Cpf1 aufweisen, wurden die geladenen Reste in LbuC2c2 systematisch mutiert. Ein Argininrest (R1079A) wurde identifiziert, der nach Mutation zu einer stark abgeschwächten prä-crRNA-Prozessierungsaktivität führte (26c). Dieses C2c2-mutierte Enzym behielt sowohl die crRNA-Bindungsfähigkeit als auch die RNA-Target-Spaltungsaktivität bei (35d, 26d). Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass verschiedene aktive Stellen innerhalb des C2c2-Proteins die prä-crRNA-Prozessierung und RNA-gerichtete RNA-Spaltung katalysieren.
  • Als nächstes wurde geprüft, ob die robuste RNA-stimulierte Spaltung von trans-Substraten von C2c2 als ein Mittel zum Nachweisen spezifischer RNAs in einem Pool von Transkripten verwendet werden kann. Während viele Polymerase-basierte Verfahren für RNA-Amplifikation und anschließendes Nachweisen entwickelt wurden, sind nur wenige Ansätze in der Lage, die Target-RNA ohne signifikante technische oder stringente Designbeschränkungen für jedes neue RNA-Target direkt nachzuweisen. Als leicht programmierbare Alternative wurde getestet, ob die RNA-guided trans-Endonukleaseaktivität von C2c2 genutzt werden kann, um ein Fluorophor-Quencher-markiertes Reporter-RNA-Substrat zu spalten, was zu einer erhöhten Fluoreszenz bei RNA-gerichteter RNase-Aktivierung führt (27a). LbuC2c2 wurde mit crRNAs beladen, die den Bakteriophagen λ als Target haben, und auf seine Fähigkeit getestet, in HeLa-Zell-Gesamt-RNA gespikete λ ssRNA-Targets nachzuweisen. Bei Zugabe von nur 1 bis 10 pM komplementärer λ-Target-RNA trat innerhalb von 30 min ein wesentlicher Anstieg der Fluoreszenz von crRNA auf (27b und 36a). Kontrollexperimente entweder mit C2c2:crRNA-Komplex allein oder in Gegenwart von crRNA und einer nicht-komplementären Target-RNA führten zu einer vernachlässigbaren Zunahme der Fluoreszenz relativ zu einer RNAse A-positiven Kontrolle (27b und 36a). Es wurde festgestellt, dass für die Konzentration einer λ-Target-RNA von 10 pM nach Vorhersage nur -0,02% des C2c2:crRNA-Komplexes in dem aktiven Zustand vorliegen würden, das beobachtete Fluoreszenzsignal jedoch eine 25-50%-ige Spaltung der Reporter-RNA Substrat widerspiegelte, abhängig vom RNA-Target. Die Fragmentgrößenauflösung der Hintergrund-RNA in diesen Reaktionen zeigte einen signifikanten Abbau sogar bei hochstrukturierten tRNAs (36b). Da die Reporter-RNA-Spaltung in Gegenwart eines großen Überschusses an nicht markierter RNA erfolgte, wurde gefolgert, dass LbuC2c2 ein starkes Multiple-Turnover-Enzym ist, das zu mindestens 104 Turnover pro erkanntem Target-RNA fähig ist. Im Gegensatz zu früheren Beobachtungen ist somit die crRNA-guided trans-Spaltung wirksam und sogar bei extrem niedrigen Konzentrationen an aktiviertem Protein nachweisbar.
  • Um dieses LbuC2c2-RNA-Nachweissystem zu erweitern, wurde eine crRNA für endogene beta-Actin-mRNA als Target entwickelt. Ein messbarer Anstieg der Fluoreszenz wurde in Gegenwart von menschlicher Gesamt-RNA im Vergleich zu Gesamt-RNA von E. coli beobachtet, was die Spezifität dieses Verfahrens zeigt (27c). Da C2c2 seine eigene guide verarbeitet, wurden die prä-crRNA-Prozessierung und der RNA-Nachweis in einer einzigen Reaktion kombiniert, indem komplementäre Tandem-crRNA-Repeats enthaltende Spacer für die Target-RNAs A und λ2 entwickelt wurden. LbuC2c2, das mit dieser unprozessierten Tandem-guideRNA im Nachweisassay inkubiert wurde, erzeugte eine signifikante Zunahme der Fluoreszenz, ähnlich in der Größe und Empfindlichkeit gegenüber Experimenten unter Verwendung von reifen crRNAs (27b, 27d). Zusammengefasst heben diese Daten die aufregende Möglichkeit hervor, die zwei verschiedene RNase-Aktivitäten von C2c2 für eine Reihe von biotechnologischen Anwendungen zu nutzen ( 27e).
  • In Bakterien funktioniert C2c2 wahrscheinlich als „Wächter“ für virale RNAs. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird vorgeschlagen, dass, wenn invasive Transkripte innerhalb der Wirtszelle über Basenpaarung mit crRNAs detektiert werden, C2c2 für die promiskuitive Spaltung von RNA in trans aktiviert wird (27e). Als Abwehrmechanismus weist dies eine auffällige Ähnlichkeit zu RNase L- und Caspasesystemen in Eukaryoten auf, wobei ein zelluläres Signal einen promiskuitiven ribonukleolytischen oder proteolytischen Abbau innerhalb der Wirtszelle auslöst, der zur Apoptose führt. Während die RNA-Targeting-Mechanismen von Typ-III-CRISPR-Systemen im Allgemeinen zur RNA-Spaltung innerhalb des Protospacer-Guide-Duplex führen, bieten jüngste Beispiele der assoziierten Nukleasen Csxl und Csm6 überzeugende Parallelen zwischen den Typ-VI-Systemen und den Mehrkomponenten-Typ-III-Inferenzkomplexen.
  • Die hierin beschriebenen Daten zeigen, dass CRISPR-C2c2-Proteine eine neue Klasse von Enzymen darstellen, die zu zwei separaten RNA-Erkennungs- und - Spaltungsaktivitäten fähig sind. Eine effiziente prä-crRNA-Prozessierung erfordert Sequenz- und Strukturmotive innerhalb des CRISPR-Repeats, die eine nicht-endogene crRNA-Beladung verhindern und dazu beitragen, die potentielle Toxizität dieser potenten RNase zu reduzieren. Die völlig unterschiedlichen prä-crRNA-Prozessierungsmechanismen von C2c2 und dem Typ V-CRISPR-Effektorprotein Cpf 1 zeigen, dass jede Proteinfamilie auf unabhängige Aktivitäten konvergierte, die sowohl die Verarbeitungs- als auch die Interferenzfunktionen ihrer jeweiligen CRISPR-Wege umfassen. Darüber hinaus können die beiden unterschiedlichen katalytischen Fähigkeiten von C2c2 gemeinsam für den RNA-Nachweis genutzt werden, da die Aktivierung von C2c2 zur Spaltung tausender trans-RNAs für jede detektierte Target-RNA eine potente Signalverstärkung ermöglicht. Die Fähigkeit von C2c2, seine eigenen guideRNAs aus Arrays zu verarbeiten, ermöglicht die Verwendung von gewebespezifischen Pol II-Promotoren für die Expression von Guide-Strukturen zusätzlich zum Target-Multiplexing für eine breite Palette von Anwendungen. Das C2c2-Enzym ist einzigartig in der bakteriellen adaptiven Immunität für seine dualen RNase-Aktivitäten und unterstreicht den Nutzen der Verwendung von CRISPR-Proteinen für die präzise Manipulation von Nukleinsäuren in Zellen und zellfreien Systemen.
  • Beispiel 14
  • Zusätzliche Aminosäurepositionen wurden in LbuC2c2 identifiziert, die, wenn sie mutiert sind, zu einer stark abgeschwächten prä-crRNA-Prozessierungsaktivität führen ( 37). Die Aminosäurepositionen umfassten R1079 (z.B. R1079A), R1072 (z.B. R1072A) und K1082 (z.B. K1082A).
  • Beispiel 15
  • Cas13a-Enzyme umfassen zwei unterschiedliche funktionelle Gruppen, die orthogonale crRNA-Sätze erkennen und unterschiedliche ssRNA-Spaltungsspezifitäten besitzen. Die Cas13a-prä-crRNA-Prozessierung ist für die ssRNA-Spaltung nicht essentiell, obwohl sie das ssRNA-Targeting für crRNAs verstärkt, die innerhalb der CRISPR-Arrays codiert sind. Zwei Cas13a-Protein-Unterfamilien wurden definiert, wobei diese Unterfamilien parallel für den RNA-Nachweis und -Zerstörung sowohl in Bakterien als auch für diagnostische Anwendungen arbeiten können.
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • Cas13a phylogenetische und Repeat-Konservierungsanalyse. Cas13a Maximum-Likelihood-Phylogenien wurden mit RA×ML (Stamatakis, Bioinformatics., Mai 2014, 1; 30 (9): 1312-3) mit dem PROTGAMMALG evolutionären Modell und 100 Bootstraps berechnet. Die Protein-Klasen Alpha und Beta wurden als Verzweigungspunkte mit Bootstrap-Werten größer als 90 definiert, was auf eine hohe Konfidenz für einen gemeinsamen Vorfahren schließen lässt. Die verbleibenden Proteine wurden als unklarer Abstammung gekennzeichnet, da die phylogenetischen Beziehungen zwischen ihnen eine geringe Konfidenz aufwiesen, was sich in Bootstrap-Werten von weniger als 90 widerspiegelte. Sequenz-Alignment erfolgte mittels MAFFT mit der ‚einsi‘-Methode (Katoh und Standley, Mol Biol Evol. 2013 Apr. 30 (4): 772-80). Die Kandidaten wurden ausgewählt, um jeden der Hauptzweige des Cas13a-Proteinbaums darzustellen. Alignments wurden für alle nicht-redundanten Homologen (41) und Kandidatenproteine durchgeführt. Ein Vergleich der CRISPR-RNA- (crRNA)-Repeats wurde durchgeführt, indem paarweise Ähnlichkeits-Scores unter Verwendung des Needleman-Wunsch-Algorithmus durch das Needle-Tool auf EMBL-EBi berechnet wurden (Mc William et al., Nucleic Acids Res. 1961). 2013 Jul; 41 (Webserverproblem): W597-600). Hierarchisches Clustering von CRISPRcrRNA wurde in R unter Verwendung der Ähnlichkeits-Score-Matrix durchgeführt.
  • Cas13a-Proteinexpression und -reinigung. Expressionsvektoren für ProteinReinigung wurden unter Verwendung von synthetischen gBlocks assembliert, die von Integrated DNA Technologies (IDT) bezogen wurden. Die Codon-optimierten Cas13a-Genomsequenzen wurden N-terminal mit einer His6-MBP-TEV-Spaltungsstellensequenz markiert, wobei die Expression durch einen T7-Promotor gesteuert wurde. Mutantenproteine wurden über ortsgerichtete Mutagenese von Cas13a-Wildtyp-Konstrukten kloniert. Die Reinigung aller Homologen wurde wie in den Beispielen 7 und 13 oben beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, Expressionsvektoren wurden in Rosetta2-DE3- oder BL21-E.coli-Zellen transformiert, die in 2xYT-Bouillon bei 37 °C gezüchtet wurden, in der mittleren logarithmischen Phase mit 0,5 mM IPTG induziert und dann zur Übernacht-Expression auf 16 °C transferiert. Die Zellpellets wurden in Lysepuffer (50 mM Tris-Cl pH 7,0, 500 mM NaCl, 5% Glycerin, 1 mM TCEP, 0,5 mM PMSF und EDTA-freier Proteaseinhibitor (Roche)) resuspendiert, durch Ultraschall lysiert und durch Zentrifugation bei 15.000 g geklärt. Lösliches His6-MBP-TEV-Cas13a wurde über Metallionen-Affinitätschromatographie isoliert, und um das His6-MBP-Tag abzuspalten, wurde das proteinhaltige Eluat mit der TEV-Protease über Nacht bei 4 °C inkubiert, während es in lonenaustauschpuffer dialysiert wurde (50 mM Tris-Cl, pH 7,0, 250 mM KCl, 5% Glycerin, 1 mM TCEP). Gespaltenes Protein wurde auf eine HiTrap SP-Säule (GE Healthcare) geladen und über einen linearen KCI-Gradienten (0,25-1,5 M) eluiert. Cas13a enthaltende Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und weiter durch Größenausschlusschromatographie auf einer S200-Säule (GE Healthcare) in Gelfiltrationspuffer (20 mM Tris-Cl pH 7,0, 200 mM KCl, 5% Glycerin, 1 mM TCEP) gereinigt und anschließend bei -80 °C gelagert. Alle Homologe wurden unter Verwendung dieses Protokolls gereinigt, mit Ausnahme von LwaCas13a, das anstelle einer SP-Säule an eine HiTrap-Heparin-Säule gebunden war, und der Größenausschluss der Chromatographieschritt wurde aufgrund der ausreichenden Reinheit der Probe nach dem lonenaustausch weggelassen. Alle Expressionsplasmide werden mit Addgene hinterlegt.
  • In-vitro-RNA-Transkription. Alle prä-crRNAs, reife crRNAs und Targets wurden in vitro unter Verwendung zuvor beschriebener Verfahren (Sternberg et al., RNA. 2012 Apr. 18 (4): 661-72) und wie in den obigen Beispielen beschrieben transkribiert. Kurz gesagt, wurden alle Substrate von einer einzelsträngigen DNA-Oligonukleotid-Matrize (IDT) mit Ausnahme von reifen crRNAs, die einen Non-GR-5'-Terminus erfordern, transkribiert. Für diese reifen crRNAs wurden T7-Polymerase-Matrizen, die eine Hammerhead-Ribozym-Sequenz unmittelbar stromaufwärts der reifen crRNA-Sequenz enthielten, unter Verwendung überlappender PCRs erzeugt und dann zur Verwendung als Matrize für die T7-Transkription gereinigt (siehe 50 (Tabelle 5) für Sequenzen). Lbu-6-mer-CRISPR-Array-in-vitro-Transkriptions-Template wurde von GeneArt (Thermofisher) als ein Plasmid synthetisiert. Die T7-Promotor-CRISPR-Array-Region wurde vor der Verwendung als Matrize für die T7-Transkription PCR-amplifiziert und gereinigt. Alle transkribierten RNAs wurden unter Verwendung von 15% Harnstoff-PAGE gereinigt, mit Ausnahme des Arrays, der unter Verwendung von 6% Harnstoff-PAGE gereinigt wurde. Alle RNAs wurden anschließend mit alkalischer Phosphatase aus Kälbern behandelt, um 5'-Phosphate zu entfernen. Radiomarkierung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Sternberg et al., RNA. 2012, Apr. 18 (4): 661-72) und wie in den obigen Beispielen beschrieben. A-, C-, G- und U-Homopolymere und fluoreszenzmarkierte RNA-Reporter für trans-RNA-Spaltung wurden durch IDT synthetisiert. Die Homopolymere wurden unter Verwendung von 25% Harnstoff-PAGE nach Radiomarkierung gereinigt, um die Substratheterogenität zu verringern.
  • Radioaktiv markierte ssRNA-Nuklease-Assays. Prä-crRNA-Prozessierungsassays wurden bei 37 °C in RNA-Prozessierungspuffer (20 mM HEPES-Na pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 µg/ml BSA, 10 µg/ml tRNA, 0,05% Igepal CA-630 und 5% Glycerin) mit einem 100-fachen molaren Überschuss von Cas13a relativ zu 5'-markierter prä-crRNA (Endkonzentrationen von 100 nM bzw. <1 nM) ausgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Reaktionen nach 60 Minuten mit 1,5X RNA-Beladungsfarbstoff (100% Formamid, 0,025% Bromphenolblau und 200 g ml Heparin) gequencht. Nach dem Quenchen wurden die Reaktionen bei 95 °C für 5 Minuten denaturiert, bevor sie durch 15% ige denaturierende PAGE (0,5 × TBE-Puffer) aufgetrennt wurden. Target-Spaltungs-Assays wurden bei 37 °C in Spaltungspuffer (20 mM HEPES-Na pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2 und 5% Glycerin) durchgeführt. Im Allgemeinen wurde die Bildung des Cas13a:crRNA-Komplexes in Spaltungspuffer bei einem Molverhältnis von 2: 1-Protein zu crRNA bei 37 °C für 60 Minuten durchgeführt, bevor 5'-markierte Target- und/oder andere nicht radioaktiv markierte RNA-Targetsubstrate zugegeben wurden. Wenn nicht anders angegeben, waren die Endkonzentrationen 100 nM Cas13a, 50 nM crRNA oder prä-crRNA, 50 nM crRNAkomplementäre Target-ssRNA (im Folgenden als „Aktivator“ bezeichnet) und <1 nM trans-ssRNA-Target. Alle Banden wurden durch Phosphorimaging (Typhoon, GE Healthcare) visualisiert und mit ImageQuant (GE Healthcare) quantifiziert. Für die prä-crRNA-Prozessierung wurde die prozentuale Spaltung als das Verhältnis der Produktbandintensität zur Gesamtintensität sowohl der Produkt- als auch der ungespaltenen prä-crRNA-Banden bestimmt und für den Hintergrund innerhalb jedes gemessenen Substrats normalisiert. Für trans-ssRNA-Spaltungsreaktionen wurde die prozentuale Spaltung als das Verhältnis aller Fragmente, die kleiner als das Target waren, zu der Gesamtintensität innerhalb der Spur bestimmt und für den Hintergrund innerhalb jedes Substrats normalisiert. Diese Daten wurden anschließend unter Verwendung von Prism7 (GraphPad) an einen einzelnen exponentiellen Zerfall angepasst und die Spaltungsraten sind in den Bildlegenden angegeben.
  • Fluoreszierende ssRNA-Nuklease-Assays. Cas13a:crRNA-Komplexe wurden wie oben beschrieben in Spaltungspuffer assembliert. 150 nM RNase Alert Reporter (IDT) und verschiedene Endkonzentrationen (0-1 µS) von ssRNA-Aktivator wurden hinzugefügt, um die Reaktion zu initiieren. Bemerkenswerterweise sind diese Reaktionen in Abwesenheit von Kompetitor-tRNA oder Gesamt-RNA, um die trans-Spaltungsaktivität genauer zu messen. Diese Reaktionen wurden in einem Fluoreszenzplattenleser (Tecan Infinite Pro F2000) für bis zu 120 min bei 37 °C inkubiert, wobei Fluoreszenzmessungen alle 5 min durchgeführt wurden (λex: 485 nm; λem: 535 nm). Hintergrundkorrigierte Fluoreszenzwerte wurden durch Subtrahieren von Fluoreszenzwerten erhalten, die aus Reaktionen erhalten wurden, die in Abwesenheit eines Target-ssRNA-Aktivators durchgeführt wurden. Zur Bestimmung der Homologsensibilitäten und Array-Prozessierungseffekte wurden die korrigierten Hintergrundwerte unter Verwendung von Prism7 (GraphPad) an einen exponentiellen Zerfall angepasst und die berechneten Raten mit ihren zugehörigen Standardabweichungen von n = 3 aufgetragen. Zum Vergleich der nicht-kognaten crRNA-gerichteten trans-ssRNA-Spaltung wurden anfängliche Reaktionsraten stattdessen aufgrund von Diskrepanzen in den Fluoreszenzplateauwerten über den Datensatz berechnet. Die Raten wurden dann relativ zu der kognaten crRNA skaliert, um die Geschwindigkeiten über die Homologen hinweg zu normalisieren. Siehe 52, 53 und 54, welche die Tabellen 7, 8 bzw. 9 für normierte Werte darstellt. Für fluoreszierende Homopolymer-ssRNA-Reporterstudien wurden Cas13a:crRNA-Komplexe bei 37 °C für 60 Minuten bei Standardbedingungen vorinkubiert. Activator ssRNA und 200 nM fluoreszierende ssRNA-Reporter wurden hinzugefügt, um die Reaktion unmittelbar vor dem Einstellen der Reaktion in den Plattenleser zu initiieren. Für Lbu- und Lb-Cas13a-enthaltende Proben mit fluoreszierenden Homopolymer-ssRNA-Reportern wurden 10 pM bzw. 1 nM Aktivator verwendet. Für prä-crRNA-Array-Experimente wurden 300 nM Cas13a zuerst mit 50 nM prä-crRNA-Array für 1 Stunde in Spaltungspuffer inkubiert, um die Bindung und Verarbeitung des Arrays zu ermöglichen. 100 pM jedes ssRNA-Aktivators wurden zusammen mit 150 nM RNase-Alert-Reporter (IDT) zugegeben, um die Reaktion in biologischen Triplikaten für jede Spacer-Sequenz zu initiieren. Die scheinbaren Raten wurden unter Verwendung eines einzelnen exponentiellen Zerfalls unter Verwendung von Prism7 (GraphPad) berechnet, und die berechneten Raten wurden mit ihren zugehörigen Standardabweichungen aufgetragen.
  • crRNA-Filterbindungsassays. Filterbindungsassays wurden wie in oben beschrieben Beispielen durchgeführt. Kurz gesagt wurden Cas13a und radiomarkierte crRNA für 1 Stunde bei 37 °C in RNA-Prozessierungspuffer (20 mM HEPES-Na pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 µg/ml BSA, 10 µg/ml Hefe-tRNA, 0,01 % Igepal CA-630 und 5% Glycerin) inkubiert. Tufryn, Protran und Hybond-N+ wurden in der oben angegebenen Reihenfolge auf eine Dot-Blot-Vorrichtung aufgebracht. Die Membranen wurden zweimal mit 50 µl Äquilibrierungspuffer (20 mM HEPES-Na pH 6,8, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2 und 5% Glycerin) gewaschen, bevor die Probe auf die Membranen aufgebracht wurde. Die Membranen wurden erneut mit 50 µl Äquilibrierungspuffer gewaschen, getrocknet und durch Phosphorimaging sichtbar gemacht. Die Daten wurden mit ImageQuant TL Software (GE Healthcare) quantifiziert und mittels Prism (GraphPad Software) an eine Bindungsisotherme angepasst. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Dissoziationskonstanten und zugehörige Fehler werden in den Legenden der Figur angegeben.
  • ERGEBNISSE
  • Die meisten Cas13a-Homologen weisen eine prä-crRNA-Prozessierungsaktivität auf
  • Um die funktionelle Vielfalt von Cas13a-Proteinen zu erforschen, wurden die prä-crRNA-Prozessierungsaktivitäten von zehn Homologen aus dem gesamten Proteinfamilienbaum auf ihre Fähigkeit verglichen, reife crRNAs aus kognaten prä-crRNAs zu erzeugen (38A; 39). Ähnlich zu den drei oben diskutierten Homologen besitzen sieben weitere Cas13a-Enzyme eine crRNA-Reifung (38B und 38C). Nur eines der elf bis heute getesteten Cas13a-Proteine zeigte keine nachweisbare Spaltung seiner kognaten prä-crRNA über einen weiten Bereich von Testbedingungen (HheCas13a) (38; 39A). Von den Homologen, die ihre nativen crRNAs prozssirten, spalteten alle außer LshCas13a an der Phosphodiesterbindung vier Nukleotide stromaufwärts von der konservierten crRNA-Repeat-Haarnadel (38B und 38C). Diese Ergebnisse zeigen eine starke Konservierung von Cas13a-vermittelter crRNA-Biogenese-Aktivität innerhalb von Typ VI-A-CRISPR-Systemen.
  • Ein konserviertes crRNA-Reifungszentrum in den meisten Cas13a-Enzymen
  • Frühere Studien haben zwei unterschiedliche Regionen von Cas13a als verantwortlich für die prä-crRNA-Prozessierung in Verbindung gebracht. Die allgemeine Cas13a-Proteinarchitektur, die durch die LshCas13a-Kristallstruktur etabliert wurde, besteht aus einer N-terminalen Domäne und zwei HEPN-Domänen (höhere eukaryotische und prokaryotische Nukleotidbindungsdomänen), die durch zwei helikale Domänen getrennt sind (40A) (Liu et al., Cell 2017) Jan 12; 168 (1-2): 121-134.el2). Für LbuCas13a war die Mutation eines einzelnen Rests (R1079) innerhalb der HEPN2-Domäne ausreichend, um die prä-crRNA-Prozessierungsaktivität wesentlich zu reduzieren. Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass Mutationen an zwei Positionen in der helikalen 1-Domäne, R438 und K441, die prä-crRNA-Spaltung durch LshCas13a verringern (Liu et al., Cell 2017, Jan 12; 168 (1-2): 121-134). el2). Während diese beiden Regionen an der prä-crRNA-Prozessierung beteiligt sein können, ist es unklar, ob die Prozssierung durch LbuCas13a durch Helical 1-Domänen-Mutationen inhibiert wird und welche Domäne primär für die crRNA-Reifung über die Cas13a-Proteinfamilie verantwortlich ist.
  • Die Konservierung sowohl der helikalen 1- als auch der HEPN2-Domänen über 19 Cas13a-Homologe wurde untersucht. Zuvor berichtete Alignments (Liu et al., Cell 2017, 12. Januar; 168 (1-2): 121-134.el2; Shmakov et al., Mol Cell. 2015 Nov 5; 60 (3): 385-97) widersprechen sich in der helikalen 1-Domänen-Region, was eine hohe Ambiguität in der Beziehung zwischen Homologen in diesem Bereich nahelegt. Eine minimale Konservierung innerhalb des Alignments der helikalen 1-Domäne, die an der prä-crRNA-Prozessierung beteiligt ist, wurde beobachtet; im Gegensatz dazu ist eine konsistente Konservierung innerhalb der HEPN2-Domäne vorhanden (40B-40C; 41). Das einzige prä-crRNA-defiziente Homolog, HheCas13a, behält einen Großteil der konservierten geladenen Reste in beiden Domänen bei, was nahelegt, dass andere Teile des Proteins oder der Repeat-Sequenz die prä-crRNA-Spaltung verhindern könnten. Unter den Homologen, die in dieser Studie verwendet wurden, ist LshCas13a das am weitesten divergierende Protein innerhalb der HEPN2-Domäne, was möglicherweise die alternative katalytische Domäne und die atypische Spaltungsstellenauswahl durch dieses Homolog erklärt.
  • Die Wirkung der helikalen 1 Domänen-Reste, die für die LrshCas13a-prä-crRNA-Prozessierung auf LbuCas13a's prä-crRNA-Prozessierungsaktivität kritisch sind, wurde getestet. Vier Reste (E299, K310, R311 und N314) wurden auf ihre Rolle bei der prä-crRNA-Spaltung getestet (40B und 40C) (Liu et al., Cell 2017, Jan 12; 168 (1-2): 121-134.e12; Shmakov et al., Mol Cell. 2015 5. Nov., 60 (3): 385-97). Die Mutation dieser Reste zu Alanin zeigte eine Reihe von Auswirkungen auf prä-crRNA-Prozessierungseffizienzen: N314A reduzierte signifikant die Spaltungsrate, R311A beeinträchtigte die Aktivität minimal und E299A und K310 hatten keinen Effekt auf die prä-crRNA-Prozessierung (40D). Parallel dazu wurde eine Mutagenese innerhalb der HEPN2-Domäne von LbuCas13a durchgeführt. Alanin-Substitutionen bei R1072 und K1082 reduzierten die prä-crRNA-Spaltung signifikant, während andere Mutationen in der gleichen Region (D1078A, K1080A und K1087A) minimale Auswirkungen auf die prä-crRNA-Prozessierung hatten (40E). Diese Ergebnisse legen nahe, dass das HEPN2 und in geringerem Maße die helicalen 1-Domänen eine wichtige Rolle in der cRRNA-Biogenese für LbuCas13a spielen, obwohl die direkt für die Hydrolyse verantwortlichen Reste unbekannt sind. Der Unterschied zwischen den Regionen, die an der prä-crRNA-Prozessierung über LbuCas13a und LshCas13a beteiligt sind (Liu et al., Cell 2017 Jan 12; 168 (1-2): 121-134.el2) widersprechen sich nicht notwendigerweise, da der 5'-Terminus der crRNA zwischen HEPN2- und helikalen 1-Domänen in der LshCas13a-Struktur gehalten wird (Liu et al., Cell 2017, Jan 12; 168 (1-2): 121-134.e12). Rückstände aus beiden Domänen könnten eine entscheidende Rolle bei der prä-crRNA-Prozessierung spielen, indem sie entweder die Substratbindung stabilisieren, die richtige Substratausrichtung fördern und/oder die Hydrolyse katalysieren.
  • Der Mangel an Konservierung innerhalb der HEPN2-Domäne von LshCas13a, die mutmaßliche aktive Stelle der prä-crRNA-Prozessierung und die atypische prä-crRNA-Spaltstelle dieses Enzyms führte zu der Hypothese, dass LshCas13a eine andere Region innerhalb der helikalen 1-Domäne zur Katalyse der prä-crRNA Verarbeitung nutzen könnte. In Abwesenheit einer dreidimensionalen Struktur eines prä-crRNA-gebundenen Cas13a-Homologs wurde diese Hypothese durch Kartieren der LshCas13a-Spaltungsstellen auf nicht kognaten prä-crRNAs getestet (40F). LshCas13a konnte prä-crRNAs aus LwaCas13a und LbuCas13a verarbeiten, wobei eine um ein Nukleotid von der vorhergesagten Haarnadel-Base verschobene Spaltungsstelle erzeugt wurde. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung tritt die Verarbeitung der Lsh-prä-crRNA durch LwaCas13a und LbuCas13a bei dem Standardnukleotidintervall von dem Repeat-Stamm auf, der sich von der kognaten LshCas13a-Stelle unterscheidet. Dies unterstützt die Beobachtungen, dass die unterschiedliche LshCas13a-Prozessierungsstelle von der Proteinarchitektur und nicht von der prä-crRNA-Sequenz abhängt, und dass LshCas13a ein Ausreißer im Cas13a-Baum in Bezug auf die prä-crRNA-Prozessierung ist.
  • Cas13a-Enzyme initiieren die ssRNA-Spaltung entweder an Uridinen oder Adenosinen
  • Frühere Studien haben gezeigt, dass Cas13a:crRNA-Komplexe komplementäre ssRNA-Targets erkennen und binden, die hiermit als ssRNA-Aktivatoren bezeichnet werden, um eine allgemeine RNase-Aktivität an exponierten Uridinresten auszulösen (42A). Ob das Panel von Homologen die unspezifische Abbauaktivität, die von LbuCas13a und LshCas13a gezeigt wurde, beibehielt, wurde getestet. Es wurde auch getestet, ob die Uridin-Präferenz innerhalb der HEPN-aktiven Stelle innerhalb der Familie universell ist. Um die allgemeine RNase-Aktivität systematisch zu testen, wurde die Fähigkeit eines ternären Komplexes, umfassend Cas13a:crRNA mit einem gebundenen ssRNA-Aktivator, ein trans-ssRNA-Target abzubauen, untersucht (42A). Die trans-ssRNA-Spaltungsaktivität wurde für acht der zehn Homologen über eine Stunde nachgewiesen (42B; 43A). Das bemerkenswerteste der Cas13a-Homologen, die für die trans-ssRNA-Spaltung aktiv sind, ist HheCas13a, das keine nachweisbare prä-crRNA-Prozessierungsaktivität besitzt, jedoch den vollständigen Abbau von Substraten durch seine kognate Volllängen-prä-crRNA katalysierte. Während die zuvor charakterisierten Homologen LshCas13a (Abudayyeh et al., Science. 2016 August 5; 353 (6299): aaf5573) und LbuCas13a beide eine Präferenz für Uridin 5' gegenüber der spaltbaren Bindung zeigen, legen Produkte unterschiedlicher Länge, die von den anderen Homologen erzeugt werden, nahe, dass verschiedene Nukleotidpräferenzen an aktiven Zentren innerhalb dieser Proteinfamilie existieren können (43B).
  • Zur weiteren Untersuchung der trans-ssRNA-Spaltung Nukleotidpräferenzen des Cas13a Homologen wurde die trans-Spaltungskapazität dieser Enzyme unter Verwendung von 5-mer-Homopolymeren von A, C, G und U als Substrate gemessen. Sechs Homologe konnten diese kurzen Substrate spalten (42C; 43C; 50 (Tabelle 5)). Vier der Homologen, LbuCas13a, LwaCas13a, HheCas13a und PprCas13a, zeigten eine bevorzugte Spaltung des Homo-Uridin-Substrats, obwohl für die Homologen mit den höchsten Aktivitäten sekundäre Präferenzen beobachtet wurden (42C; 43D). Im Gegensatz dazu bevorzugten LbaCas13a und EreCas13a Homo-Adenosin in Übereinstimmung mit biochemisch kartierten Schnittstellen auf längere Targets (43B). Die identische Produktbildung von diesen langen Substraten durch CamCas13a ist konsistent mit der Adenosin-Präferenz durch diese Gruppe des Cas13a-Baums (42, 39; 43).
  • Ein bemerkenswerter Unterschied zwischen diesen Enzymen war die Geschwindigkeit, mit der die trans-ssRNA Spaltung eine Sättigung unter den getesteten Bedingungen mit äquimolarem ssRNA-Aktivator und Cas13a:crRNA-Interferenzkomplex erreicht. Diese enzymatischen Unterschiede könnten dramatische Auswirkungen auf die biologische Rolle von Cas13a haben. Die Varianz der trans-ssRNA-Spaltung innerhalb der Cas13a-Homologie-Familie wurde quantifiziert. Ein High-Throughput-Screen mit einem kurzen fluoreszierenden ssRNA-Reporter für die RNA-Spaltung wurde entwickelt, um sowohl die ssRNA-Aktivator-Bindung als auch die trans-ssRNA-Spaltung, die beiden Kerneigenschaften von Cas13a-Enzymen, die zur gesamten enzymatischen Produktion beitragen, zu berücksichtigen. Um die Empfindlichkeit jedes Cas13a-Homologs zu untersuchen, wurden abnehmende Mengen an komplementärem ssRNA-Aktivator zugegeben, um die Reaktion zu initiieren, und die scheinbare Geschwindigkeit der Fluoreszenz-ssRNA-Reporterspaltung wurde aus jedem der resultierenden Zeitläufe berechnet. Während die berechneten Raten eine Konvolution der Bindungsaffinität des ssRNA-Aktivators und der katalytischen Umsatzrate für jedes der Enzyme sind, geben sie ein relatives Maß für die Spaltungsaktivität, die über Homologe vergleichbar ist.
  • Fünf Homologe (LbuCas13a, LwaCas13a, LbaCas13a, HheCas13a und PprCas13a) zeigten innerhalb dieses Tests eine ausreichend nachweisbare Spaltungsaktivität für eine reproduzierbare Analyse. Von diesen fünf Homologen zeigte LbuCas13a die höchste Empfindlichkeit mit nachweisbarer Reporterspaltung in Gegenwart von nur 10 fM komplementärem Aktivator (42D). Nur zwei Homologe, LwaCas13a und PprCas13a, zeigten genügend Aktivität, um den Aktivator im pikomolaren Bereich mit Empfindlichkeiten von 10 pM bzw. 100 pM nachzuweisen. LbaCas13a und HheCas13a waren viel weniger empfindlich und wurden nur bei nanomolaren Mengen an Reporter aktiv, was im Vergleich zum Cas13a-Komplex nahezu äquimolar ist. Da dieser Assay auf einer beträchtlichen Anzahl von trans-Spaltungs-Ereignissen beruht, um nachweisbare Fluoreszenz zu erzeugen, kann angenommen werden, dass die drei Homologen, die trotz ähnlicher Spaltungsstellen-Präferenzen kein nachweisbares Signal über dem Hintergrund produzieren können (EreCas13a, CamCas13a und LshCas13a), noch kleinere komplementäre Target-Sensitivitäten aufweisen. Der bemerkenswert breite Bereich der Empfindlichkeiten (~ 107-fach) legt eine vielfältige Kapazität von Cas13a-Enzymen zum Schutz eines Wirtsorganismus vor fremder RNA nahe.
  • Die CRISPR-Repeat-Sequenz bestimmt eine nicht-kognate prä-crRNA-Prozessierung
  • Die dualen Aktivitäten von Cas13a bieten die Möglichkeit, die Interdependenz von prä-crRNA-Prozessierung und Targeting zwischen verschiedenen CRISPR-Operons vom Typ VI-A zu untersuchen. Um die Substratanforderungen für beide Aktivitäten zu bestimmen, wurde das Ausmaß getestet, in dem verschiedene Homologe nicht-kognate crRNAs für Guide-Prozessierung und Targeting erkennen können. Zunächst wurde versucht, bioinformatisch die wahrscheinliche crRNA-Austauschbarkeit durch phylogenetische Analyse der Cas13a-Familie und crRNA-Ähnlichkeiten vorherzusagen. Diese Analyse legt nahe, dass zwei verschiedene Homologen-Kladen existieren, die aus Gründen der Klarheit als Alpha und Beta bezeichnet werden (Stamatakis, Bioinformatics. 2014 1. Mai 30 (9): 1312-3) (44A). Fünf der gereinigten Homologen existieren außerhalb dieser Gruppen mit unklaren Abstammungsbeziehungen. Es wurde in Frage gestellt, ob die prä-crRNA (CRISPR-Repeat)-Sequenz funktionelle Orthogonalität diktieren könnte. Aufgrund des kurzen und strukturierten Inhalts der CRISPR-Repeats wurde eine paarweise Sequenz-Alignment-Score-Matrix verwendet, um eine hierarchische Clusterbeziehung zwischen den CRISPR-Repeats aufzubauen, um die Variation über die Familie zu erhalten (Burstein et al., Nat. 2016 3. Februar; 7: 10613). Überraschenderweise wies diese Analyse auf die Existenz von zwei crRNA-Clustern hin, die überlappen, sich aber von den Protein-Kladen unterscheiden, die durch die Aminosäuresequenzen bestimmt werden (44B und 44C). Während Cluster-1-crRNAs gut mit einer Untergruppe der Alpha-Klade-Proteine korrelieren und alle Beta-Klade-assoziierten crRNAs innerhalb von Cluster 2 liegen, werden die Homologen mit mehrdeutigen phylogenetischen Beziehungen auf die zwei Cluster aufgeteilt (44C).
  • Da die Cas13a:crRNA-Orthogonalität unter Verwendung bioinformatischer Analyse allein nicht vorhersagbar ist, wurde das Ausmaß der funktionellen Austauschbarkeit zwischen nicht-kognaten crRNAs sowohl für die Verarbeitung als auch die trans-ssRNA-Target-Spaltung durch jedes der Cas13a-Homologen getestet (44D und 44F). Für die prä-crRNA-Prozessierung wurde gefunden, dass die durch die paarweisen Sequenzvergleiche definierten crRNA-Cluster ihre Fähigkeit vorhersagten, von ihren assoziierten Cas13a-Proteinen verarbeitet zu werden (44D). Zum Beispiel werden prä-crRNAs von Cluster 1 nur von den Proteinen von Klade Alpha verarbeitet und umgekehrt für Cluster 2 und Klade Beta. Im Gegensatz dazu ist die Proteinklassifikation weniger prädiktiv, da die meisten der unklar klassifizierten Proteine Sequenzen von Repeat-Cluster 2 prozessieren könnten, unabhängig davon, wo ihre Repeat-Sequenzen gruppiert waren.
  • Drei Homologe (PprCas13a, HheCas13a und Rca13a) waren prä-crRNA-prozessierende Ausreißer in Bezug auf ihre Position innerhalb der crRNA-Cluster. HheCas13a konnte keine nicht-kognaten prä-crRNAs spalten, und umgekehrt prozessierte kein Homolog, einschließlich HheCas13a, die Hhe-prä-crRNA. Dies deutet darauf hin, dass die Unfähigkeit von HheCas13a, seine zugehörigen prä-crRNA zu prozessieren, nicht nur die divergierende Repeat-Sequenz (38; 39) widerspiegelt, sondern auch den Verlust der prä-crRNA-Prozessierungsaktivität innerhalb des Proteins. Im Gegensatz dazu wird die abweichende Aktivität von PprCas13a und RcaCas13a durch die Divergenz der crRNA-Repeat-Sequenz erklärt. PprCas13a und RcaCas13a verarbeiten ihre eigenen crRNAs, beide verarbeiten jedoch auch die nicht-kognaten crRNA-Repeat-Cluster 2-Sequenzen. Die PprCas13a-crRNA-Repeat-Sequenz unterscheidet sich von den anderen Cluster 2-crRNA-Repeats über die Spaltungsstelle in der 5'-flankierende Region, was auf eine größere Substratflexibilität für die prä-crRNA-Prozessierung durch PprCas13a hindeutet. In ähnlicher Weise ist ein unterscheidendes Sequenzmerkmal der RcaCas13a-crRNA eine verlängerte Stamm-Schleife mit sechs Basenpaaren relativ zu der Standard-Fünf-Basenpaar-Stamm-Schleife, die in crRNAs des Rests der Familie vorhanden ist. Es ist bemerkenswert, dass die positionelle Substitutionstoleranz innerhalb jedes crRNA-Repeats für die Cas13a-prä-crRNA-Prozessierung mit Mutationsstudien des oben diskutierten LbuCas13a:crRNA-Komplexes und kürzlich erhaltenen strukturellen Einsichten des LshCas13a:crRNA-Komplexes übereinstimmt (Liu et al., Cell 2017 Jan 12; 168 (1-2): 121- 134.el2). Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass die Sequenz eines CRISPR-Repeats vom Typ VI-A ihre Fähigkeit zur prä-crRNA-Prozessierung durch die Cas13a-Familie bestimmt. Homologe, die sich in Gegenwart divergenter Repeats (PprCas13a und RcaCas13a) entwickelten, behalten jedoch die Fähigkeit, andere Cluster 2-Sequenzen zu prozessieren.
  • Zwei Unterfamilien funktionell orthogonaler Cas13a-Enzyme
  • Es wurde untersucht, ob die in 44D definierten prä-crRNA-verarbeitenden Austauschbarkeitscluster kompetent für die Steuerung der trans-ssRNA-Spaltung durch nicht-kognate Cas13a-Homologe waren. Um die Cas13a-vermittelte trans-ssRNA-Spaltung zu untersuchen, die von nicht-kognaten prä-crRNAs und reifen crRNAs gesteuert wird, wurde der in den obigen Beispielen beschriebene Fluoreszenz-Assay modifiziert und die Analyse auf die fünf Homologen beschränkt, die eine signifikante Spaltungsaktivität in den ssRNA Spaltungsversuchen aufwiesen (siehe 42C). Im Großen und Ganzen spiegelten diese Ergebnisse die prä-crRNA-Prozessierungsergebnisse wider, wobei die crRNA-Repeat-Cluster-Identität funktionelle Gruppen bestimmte, jedoch mit einigen auffälligen Kontrasten konsistent mit der Tatsache, dass Prozessierung und Targeting unabhängige enzymatische Aktivitäten waren (44E und 44F). Zum Beispiel kann die Ppr-prä- und die reife crRNA die ssRNA-Spaltung durch die nicht-kognate Proteine LwaCas13a und LbuCas13a steuern, trotz ihrer Unfähigkeit, diese prä-crRNAs zu prozessieren. Eine weitere Überraschung ist die Promiskuität von HheCas13a, die von allen prä- und reifen crRNAs des Clusters 2 für die trans-ssRNA-Spaltung gesteuert wird, trotz fehlender prä-crRNA-Prozessierungsaktivität mit irgendeinem dieser Guides. Dies deutet darauf hin, dass die crRNA-Reifung für die trans-ssRNA-Spaltung nicht erforderlich ist, eine Beobachtung in Übereinstimmung mit Befunden, dass LbuCas13a-prä-crRNA-prozessierungsdefiziente Mutanten eine unveränderte trans-ssRNA-Spaltungskapazität besitzen.
  • Der Vergleich der crRNA-Austauschbarkeit sowohl für die prä-crRNA-Prozessierung als auch für die trans-ssRNA-Spaltung definiert zwei funktionell orthogonale Unterfamilien innerhalb der Cas13a-Proteinfamilie. Die erste Gruppe (z.B. LbuCas13a) weist eine große Promiskuität sowohl für die prä-crRNA-Prozessierung als auch für die trans-ssRNA-Spaltung auf, die durch crRNAs aus der gesamten Proteinfamilie gesteuert wird. Diese polyphyletische Gruppe zeigt auch eine Präferenz für Uridin innerhalb der aktiven Stelle der trans-ssRNA-Spaltung. Die zweite Gruppe (z.B. LbaCas13a), die sowohl durch crRNA- als auch Proteinsequenzen definiert ist, weist ein ausgeprägtes crRNA-Austauschbarkeitsprofil auf und spaltet vorzugsweise während der trans-ssRNA-Target-Spaltung an Adenosin. Um die orthogonalen Reaktivitäten dieser Cas13a-Unterfamilien zu testen, wurde verifiziert, dass LbuCas13a und LbaCas13a Homo-A- bzw. Homo-U-ssRNA-Reporter spalteten (45A und 45B). Während die verschiedenen Sonden ähnliche Niveaus der Fluoreszenzsignale erzeugten, sollte angemerkt werden, dass im Wesentlichen unterschiedliche Mengen an ssRNA-Aktivator aufgrund der unterschiedlichen Empfindlichkeiten der Homologen zugegeben wurden (10 pM gegenüber 1 nM für LbuCas13a bzw. LbaCas13a). Um die Orthogonalität zu überprüfen, wurde eine Reihe von Kontrollreaktionen mit allen möglichen nicht-kognaten Kombinationen zwischen crRNA, Aktivator und Reporter getestet, wobei außer den kognaten Kombinationen kein wesentliches Signal detektiert wurde (45C). Zusammengefasst definieren diese Ergebnisse verschiedene Cas13a-Homologe, die innerhalb desselben Systems parallel funktionieren können.
  • Die Prä-crRNA-Prozessierung verbessert die Target-Effizienz im Rahmen eines CRISPR-Arrays
  • Ein rätselhafter Befund dieser Studie ist das Fehlen einer stringenten Anforderung für reife crRNA, die nachfolgende trans-ssRNA-Target-Spaltungsreaktion durch Cas13a auszulösen. Darüber hinaus behalten prozessdefiziente Mutanten von LbuCas13a ähnliche Effizienzen der trans-ssRNA-Spaltung bei, selbst wenn sie durch eine prä-crRNA anstelle einer reifen crRNA gesteuert werden (46; 47). Dies führte zu der Hypothese, dass die Rolle der prä-crRNA-Prozessierung in CRISPR-Loci vom Typ VI nicht notwendigerweise für ein effizientes ssRNA-Targeting, sondern stattdessen für die Freisetzung jeder crRNA aus den Grenzen eines langen CRISPR-Array-Transkripts verantwortlich ist. Es wurde in Frage gestellt, ob die prä-crRNA-Prozessierung die Beschränkungen der RNA-Faltung und mögliche sterische Hinderung benachbarter Cas13a:crRNA-Spacer-Spezies während der crRNA-Beladung und/oder dem ssRNA-Targeting lösen könnte. Um dies zu testen, wird die Effizienz der trans-ssRNA-Spaltung durch einen CRISPR-Array unter Verwendung von entweder Wildtyp LbuCas13a oder einer prä-crRNA-prozessierungsinaktive Mutante verglichen.
  • Da alle prozessierungsdefizienten Einzelpunktmutanten von LbuCas13a (40) geringe Mengen an prä-crRNA-Prozessierungsaktivität beibehielten, wurde eine Doppelmutante (R1079A/K1080A) erzeugt, die keine nachweisbare Prozessierungsaktivität besaß, jedoch ähnliche oder größere trans-ssRNA-Spaltungswirkungsgrade der Wildtyp LbuCas13a behielt (46A und 46B). Diese Doppelmutante und das Wildtyp-LbuCas13a-Enzym wurden auf ssRNA-Spaltung in Gegenwart einer Target-RNA und eines kleinen CRISPR-Array-Transkripts getestet, das aus sechs verschiedenen Repeat-Spacer-Einheiten bestand ( 46C und 46D). Die Geschwindigkeit der trans-ssRNA-Spaltung durch die crRNA-prozessierungsinaktive Mutante war für alle Spacer-Sequenzen innerhalb des Arrays signifikant reduziert (einseitiger t-Test: p <0,001 für alle Paare). Die verringerte Aktivität im Vergleich zum Wildtyp-LbuCas13a ist mit jedem nachfolgenden Spacer innerhalb des Arrays ausgeprägter, wobei der letzte Spacer die Spaltung mit einer Rate steuert, die nur 15% derjenigen beträgt, die durch das Wildtyp-Enzym katalysiert wird. Dieser Befund legt nahe, dass, während die prä-crRNA-Prozessierung für das Targeting nicht notwendig ist, sie die Aktivität durch Freisetzung von crRNAs aus dem CRISPR-Array erhöht, was zu einem überarbeiteten Modell für CRISPR-Typ-VI-Systeme führt (55).
  • 38A-38C. Die prä-crRNA-Prozessierung ist in der Cas13a-Proteinfamilie weitgehend konserviert. (A) Schema des durch Cas13a katalysierten crRNA-Biogenese-Wegs. prä-crRNA-Transkripte werden durch Cas13a gespalten, um reife crRNAs zu erzeugen. Unten eine schematische Darstellung einer prä-crRNA, die wichtige funktionelle Merkmale hervorhebt. (B) Alignment des 5'-Teils der CRISPR-Repeat-Sequenzen aus den untersuchten CRISPR-Systemen vom Typ VI, die die prä-crRNA-Spaltungsstelle hervorheben. Kartierte Spaltungsstellen sind als rote Balken dargestellt. Abweichungen von der Lbu crRNA-Repeat-Sequenz sind in schwarzem Text notiert. Kleingeschriebene „g“s wurden für Transkriptionszwecke benötigt und sind nicht Teil der nativen crRNA-Repeat-Sequenzen. Die vollständige CRISPR-Repeat-Sequenz ist in 4 graphisch dargestellt. 39B. (C) Repräsentatives Gel der Cas13a-vermittelten prä-crRNA-Spaltung durch 9 Cas13a-Homologe nach 60-minütiger Inkubation mit 5'-radiomarkierten prä-crRNA-Substraten.
  • 39A-39C. CRISPR-Loci und crRNA-Repeat-Architektur für Cas13a-Homologe, die in dieser Studie verwendet wurden (A) phylogenetischer Baum nach Maximum-Likelihood-Methode von Cas13a-Proteinen mit Diagrammen von Typ VI-A-Loci, adaptiert aus (Shmakov et al., Mol Cell. 2015 5. Nov., 60 (3): 385-97). Cas13a-ORFs sind in blaugrün dargestellt. CRISPR-Arrays, dargestellt als Black Boxes (Repeats), gelbe Rauten (Spacer) und Spacer-Array-Größe für größere Arrays, wie oben erwähnt. ORFs von Interesse, die die Loci umgeben, sind mit den folgenden Abkürzungen gekennzeichnet: T-Toxin, AT-Antitoxin und TP-Transposase. (B) Manuelles Alignment von CRISPR-Repeat-Sequenzen von verwendeten Homologen. prä-crRNA-Prozessierung-Spaltungsstellen, markiert durch rote Linien. Abweichungen von der Lbu crRNA-Repeat-Sequenz sind in schwarzem Text notiert. Kleingeschriebene „g“s wurden für Transkriptionszwecke benötigt und sind nicht Teil der nativen crRNA-Repeat-Sequenzen. Zwei separate Hhe-crRNA-Sequenzen wurden getestet, wobei die erste die native Sequenz und eine zweite die Nukleotid-Verlängerung enthielt, um den atypisch kurzen nativen Repeat zu verlängern. Unter allen untersuchten Bedingungen wurde kein crRNA-Repeat durch HheCas13a gespalten. (C) prä-crRNA-Prozessierungsassay mit HheCas13a auf nativer crRNA-Repeat-Sequenz über variable Salz- und pH-Bedingungen. Es wurden keine Spaltprodukte beobachtet.
  • 40A-40F. Identifizierung von Resten, die für die prä-crRNA-Spaltung von LbuCas13a von Bedeutung sind. (A) LbuCas13a-Domänen-Organisationsschema mit annotierten Domänen basierend auf einer LshCas13a-Kristallstruktur (Liu et al., Cell 2017, 12. Januar; 168 (1-2): 121-134.el2). Multi-Sequenz-Aminosäure-Alignment von (B) der lokalen Region in der helikalen 1-Domäne von Cas13a, beteiligt an der prä-crRNA-Prozessierung durch LshCas13a, und (C) der Region innerhalb der Cas13a-HEPN2-Domäne, die durch Studien an LbuCas13a an der prä-crRNA beteiligt ist. Siehe 41 für die vollständiges Famillienbaum-Alignment dieser Regionen und 57 für ein vollständiges Protein-Alignment. Reste, deren Mutation die prä-crRNA-Prozessierung stark beeinflussen, sind durch gelbe Rauten markiert, und Reste, deren Mutation die prä-crRNA-Prozessierung minimal beeinflusst, sind mit türkisfarbenen Rauten markiert. Symbole oberhalb der LbuCas13a-Sequenzen entsprechen Mutationen, die an LbuCas13a vorgenommen wurden, und Symbole unterhalb der LshCas13a-Sequenz entsprechen Mutationen, die an Liu et al., Cell 2017, Jan 12; 168 (1-2): 121-134.el2 an LshCas13a vorgenommen wurden. Die Färbung des Matrix-Alignment zeigt die Konservierung der Reste unter Verwendung des ClustalX-Schemas, wobei dunklere Farbtöne die Stärke der Konservierung anzeigen. prä-crRNA-Prozessierung unter Einzelumsetzungsbedingungen, gemessen für Mutanten in (D) der helikalen 1-Domäne und (E) der HEPN2-Domäne. Quantifizierte Daten wurden mit einfach exponentiellen Zerfällen mit berechneten Geschwindigkeitskonstanten pseudo-erster Ordnung (kobs) (Mittelwert ± SD, n = 3) wie folgt angepasst: Lbu WT 0,074 ± 0,003 min-1, E299A 0,071 ± 0,005 min-1, K310A 0,071 ± 0,003 min-1, R311A 0,054 ± 0,007 min-1, N314A 0,029 ± 0,008 min-1, R1079A 0,009 ± 0,007 min-1, D1078A 0,023 ± 0,002 min-1, K1080A 0,016 ± 0,004 min-1 und K1087A 0,076 ± 0,007 min-1, während R1072A und K1082A nicht angepasst werden konnten. (F) Repräsentatives Gel der prä-crRNA-Prozessierung von LshCas13a-, LwaCas13a- und LbuCas13a-prä-crRNAs durch LbuCas13a-, LshCas13a- und LwaCas13a-Proteine unter Standardbedingungen. Die Hydrolyse-Leiter in der am weitesten rechts liegenden Spur ermöglicht relative Größenvergleiche, obwohl geringe Sequenzunterschiede über die drei prä-crRNAs die Migration dieser kleinen Fragmente verändern.
  • 41A-41B. Vollständiges Alignment der Helical 1- und HEPN-Domänen (A-B) Mehrfachsequenz-Alignment von 19 Cas13a-Familienmitgliedern über (A) die Helical 1-Domäne und (B) die HEPN2-Domäne. GI-Accession-Nummern sind vor jedem Artennamen aufgeführt. Koordinaten basierend auf der LbuCas13a-Sequenz, die über den Alignment- und LshCas13a-Sequenzkoordinaten aufgelistet ist, sind nachstehend aufgelistet. Mutationen, die in dieser Studie getestet wurden, sind oberhalb des Alignments durch gelbe und türkisfarbene Rauten, die Alanin-Substitutionen entsprechen, die die prä-crRNA-Prozessierungsreaktion negativ beeinflussten, oder diejenigen angegeben, die minimale Auswirkungen auf die prä-crRNA-Prozessierung haben. Mutationen, die von Liu et al., Cell 2017, Jan 12; 168 (1-2): 121-134.el2, getestet wurden, sind unterhalb der LshCas13a-Sequenz dargestellt. Die Konservierungs-Scores wurden mittels Jalview unter Verwendung der AMAS-Methode berechnet.
  • 42A-42D. Mitglieder der Cas13a-Proteinfamilie spalten ssRNA mit einer Reihe von Effizienzen. (A) Schema des ssRNA-Targeting durch Cas13a. Der Einfachheit halber stand die trans-ssRNA-Spaltung im Mittelpunkt der Untersuchungen. (B) Repräsentatives Gel der Cas13a-vermittelten trans-ssRNA-Spaltung durch alle zehn Homologen nach 60-minütiger Inkubation. Cas13a:crRNA-Komplexe wurden wie in den Verfahren beschrieben unter Verwendung von reifen crRNA-Produkten mit einer Endkonzentration des RNP-Komplexes von 50 nM gebildet. <1 nM radioaktiv markiertes trans-ssRNA-Target wurde hinzugefügt, um die Reaktion in Gegenwart und Abwesenheit von 50 nM nicht-markiertem, crRNA-komplementärem ssRNA-Aktivator zu initiieren. Schwache trans-ssRNA-Spaltungsaktivität wurde von LshCas13a bei Produktbanden beobachtet, die durch Doppelpfeile rechts markiert sind. (C) Heatmap, die Cas13a-katalysierte trans-ssRNA-Spaltungsprozentsätze für jedes 5-mer-Homopolymer-ssRNA-Substrat für sechs verschiedene Cas13a zeigt. Die Testbedingungen waren identisch mit Teil (B), mit der Ausnahme, dass LbuCas13a und LwaCas13a für 5 min anstelle von 60 min inkubiert wurden. (n = 3, Werte mit zugehörigen Fehlern, die in 51 dargestellt sind (Tabelle 6). (D) Scheinbare Spaltungsraten eines fluoreszierenden ssRNA-Reporters durch fünf Homologe über eine Reihe von ssRNA-Aktivator-Konzentrationen. Cas13a:crRNA-Komplexe wurden jeweils in einem Verhältnis von 2: 1 mit einer aktiven Endkonzentration des Komplexes von 50 nM vorinkubiert. Komplementäre ssRNA-Aktivator und fluoreszierende ssRNA-Spaltungsreporter wurden hinzugefügt, um Reaktionen zu initiieren. Normalisierte Reporter-Signalkurven-Zeitläufe wurden mit einfach-exponentiellen Zerfällen angepasst und die scheinbaren Raten wurden aufgetragen (n = 3). Einige Bedingungen haben vor dem ersten gemessenen Zeitpunkt ein Plateau erreicht, daher wird angenommen, dass ihre Raten minimal 0,5 min-1 betragen, und sind in der Tabelle mit einem * gekennzeichnet.
  • 43A-43D. trans-ssRNA-Spaltung durch Cas13a-Homologe (A) Zeitverlaufsanalyse von trans-ssRNA-Spaltung durch zehn verschiedene Cas13a-Homologe in Gegenwart und Abwesenheit von ssRNA-Aktivator. Zeitpunkte wurden nach 1, 10 und 60 Minuten genommen. ssRNA-Aktivator-spezifische Spaltprodukte sind für LbuCas13a, LwaCas13a, LbaCas13a, EreCas13a, HheCas13a, PprCas13a, CamCas13a und LshCas13a angegeben. Die gepunktete Linie bezeichnet die Grenze zwischen getrennten PAGE. (B) Kartierte trans-ssRNA-Schnittstellen über mehrere Spaltungsreaktionen für vier Cas13a-Homologe. Unterschiedliche Spaltungsmuster sind durch rote Pfeile gekennzeichnet. Es scheint, dass LbaCas13a und EreCas13a eine Adenosin-Präferenz haben können, während LwaCas13a im Hinblick auf die Nukleotidpräferenz Promiskuität zeigt. (C-D) Repräsentative trans-ssRNA-Spaltungsgele von Homopolymer-ssRNA-Substraten durch fünf Cas13a-Homologe.
  • 44A-44F. crRNA-Austauschbarkeit innerhalb der Cas13a-Familie (A) phylogenetischer Baum nach Maximum-Likelihood-Methode von Cas13a-Proteinen. Homologe, die in dieser Studie verwendet wurden, sind fett angezeigt und Gruppen sind hervorgehoben. Bootstrapped-Werte sind in 39 angeordnet. (B) Symmetrische Ähnlichkeits-Score-Matrix für CRISPR-Repeats von Homologen, die in dieser Studie verwendet wurden. Zeilen und Spalten werden nach CRISPR-Repeat-Cluster geordnet. (C) Asymmetrische Ähnlichkeits-Score-Matrix für CRISPR-Repeats von Homologen, die in dieser Studie verwendet wurden. Die gleichen paarweisen Bewertungen sind hier wie in (B) dargestellt, außer dass die Zeilen neu angeordnet sind, um dem phylogenetischen Baum von Cas13a zu entsprechen. (D-F) Funktionelle Aktivitätsmatrix für die prä-crRNA-Prozessierung (D) durch nicht-kognate Proteine, (E) trans-ssRNA-Spaltung durch prä-crRNAs und (F) trans-ssRNA-Spaltung durch reife crRNAs. Die Prozessierungstests wurden unter Verwendung von Standardbedingungen durchgeführt, und 60 min-Reaktionsendpunkte wurden analysiert. trans-ssRNA-Spaltungsassays wurden unter Verwendung des fluoreszierenden ssRNA-Reporterassays mit angepassten Anfangsgeschwindigkeiten durchgeführt. ssRNA-Aktivator-Konzentrationen waren wie folgt: LbuCas13a: 100 pM, LwaCas13a: 100 pM, PprCas13a: 100 nM, LbaCas13a: 10 nM und HheCas13a: 100 nM. Die anfänglichen Raten wurden über drei Replikate angepasst, um Unterschiede in den Fluoreszenzplateauwerten zu berücksichtigen und auf jedes Cas13a:crRNA-kognates Paar normalisiert zu werden. Siehe 52, 53 und 54 (Tabellen 7, 8 und 9) für numerische Werte und zugehörige Fehler (n = 3).
  • 45A-45C. Funktionelle Validierung von orthogonalen Cas13a-Unterfamilien für RNA-Nachweis (A) Schema des RNA-Nachweisassays, modifiziert für die Verwendung von fluoreszierenden Homopolymer-ssRNA-Reporter-Substraten, um trans-ssRNA-Spaltungsaktivierung durch entweder LbuCas13a oder LbaCas13a zu untersuchen. (B) Zeitverlauf von Roh-Fluoreszenzmessungen, erzeugt durch Homopolymer-Reporter, inkubiert entweder mit LbuCas13a: Lbu-crRNA: 10 pM ssRNA-Aktivator oder LbaCas13a: Lba-crRNA: 1 nM ssRNA-Aktivator (Mittelwert ± SD, n = 3). (C) Roh-Fluoreszenzmessungen, die von den fluoreszierenden Homopolymer-ssRNA-Reportern über eine Reihe von crRNA-, ssRNA-Aktivator- und Cas13a-Proteinkombinationen (Mittelwert ± SD, n = 3) erzeugt wurden.
  • 46A-46D. Entschlüsselung der Rolle der crRNA-Array-Prozessierung für LbuCas13a. (A) Quantifizierte Zeitverlaufsdaten von prä-crRNA-Prozessierungsassays für R1079A/K1080A-Mutante im Vergleich zu Wildtyp-LbuCas13a. Quantifizierte Daten wurden an einzelne exponentielle Zerfälle und eine Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster Ordnung (kobs) (Mittelwert ± SD, n = 3) für LbuCas13a WT von 0,074 ± 0,003 min-1 angepasst, während die R1079A/K1080A-Mutante nicht mit ausreichender Sicherheit angepasst werden konnte, um eine Geschwindigkeitskonstante zu erhalten. (B) Scheinbare Rate von fluoreszierendem Reporter mittels LbuCas13a-Wildtyp und prozssierungsinaktive Mutante R1079A/K1080A, wie durch prä-crRNA und reife crRNAs gerichtet. Cas13a: RNA-Komplexe wurden für 60 min in einem Verhältnis von 1: 1 präinkubiert, und dann wurden 10 pM Aktivator und 150 nM Reporter zugegeben, um die Reaktion zu initiieren (Mittelwert ± SD, n = 3). (C) Scheinbare Fluoreszenzraten der ssRNA-Reporter-Spaltung mittels 300 nM Wildtyp-LbuCas13a oder prä-crRNA-prozessierungsinaktive Mutante R1079A/K1080A, wie durch 50 nM eines CRISPR-Arrays mit sechs crRNA-Repeat-Spacern gerichtet. Jede Balkengruppe repräsentiert die Zugabe von 100 pM einer distinkten ssRNA-Aktivator-Sequenz, die zu schematisierten Positionen innerhalb der CRISPR-Arrays komplementär ist, die unter jeder Balkengruppe angezeigt sind. Jede Rate wird aus Daten von drei biologischen Replikaten angepasst und die Standardabweichung der Rate wird dargestellt. Die Rate des mutanten Proteins unterscheidet sich statistisch signifikant vom Wildtyp LbuCas13a für alle Spacer-Positionen (einseitiger t-Test: p <0,001). (D) Daten von (C), dargestellt als Prozentsatz der Wildtyp-LbuCAs13a-Aktivität, zeigen den positionsmäßigen Effekt der verringerten trans-ssRNA-Targeting-Effizienzen durch die prä-crRNA-prozessierungsinaktive Mutante.
  • 47A-47C. trans-Spaltung durch LbuCas13a-Punktmutanten in Regionen, die an der prä-crRNA-Prozessierung beteiligt sind. (A-C) trans-ssRNA-Spaltung durch verschiedene prä-crRNA-prozessierende „implizierte“ Punktmutanten von LbuCas13a. Spaltungsreaktionen wurden mit 50 nM Cas13a:crRNA bei entweder 25 °C oder 37 °C mit 0,2 nM oder 1 nM ssRNA-Aktivator wie angegeben durchgeführt. Niedrigere Temperaturen und Aktivator-Konzentrationen wurden verwendet, um die Reaktionskinetik für genauere Messungen zu verlangsamen. Angepasste Kurven sind einfach-exponentielle Zerfälle mit berechneten Geschwindigkeitskonstanten pseudo-erster Ordnung (Mittelwert ± SD, n = 3) wie folgt: 25 °C-Bedingungen: Lbu WT 1,76 ± 0,24 min-1, K299A 1,72 ± 0,65 min-1, K310A 3,19 ± 0,27 min-1, R1072A 2,95 ± 0,53 min-1, R1079A 0,93 ± 0,28 min-1 und K1082A 2,64 ± 0,63 min-1 und 37 °C Bedingungen: R311A 0,39 ± 0,09 min-1 und N314A 0,54 + 0,11 min-1, während Wildtyp und die prozessierungsinaktive Mutante (R1079A/K1080A) ein Plateau zu schnell erreichten, um eine genaue Geschwindigkeitsmessung auszuführen: WT 2,95 ± 1,97 min-1 und R1079A/K1080A 4,86 ± 4,99 min-1.
  • 48A-48B. Die crRNA-prozessierungsinaktive Mutante R1079A/K1080A behält eine ähnliche crRNA-Bindungsaffinität und prozessiert keine prä-cRNA-Arrays. (A) Filterbindungsassays wurden wie in den Verfahren zur Bestimmung der Bindungsaffinität von reifer crRNA zu LbuCas13a WT und LbuCas13a R1079A/K1080A beschrieben durchgeführt. Die quantifizierten Daten wurden an Standard-Bindungsisothermen angepasst. Die gemessenen Dissoziationskonstanten aus drei unabhängigen Experimenten (Mittelwert ± SD) betrugen 1,21 ± 0,57 nM (LbuCas13a WT) und 3,11 ± 0,89 nM (LbuCas13a R1079A/K1080A). (B) prä-cRNA-Prozessierungsassay unter Verwendung eines 6-mer-CRISPR-Arrays als Substrat mit LbuCas13a- und LbuCas13a R1079A/K1080A-Mutanten zusammen mit verschiedenen Größenmarkern. Produktidentitäten sind auf der rechten Seite des Gels dargestellt. Aufgrund einer zusätzlichen Leader-Region, die gelegentlich nicht prozessiert wurde, traten gelegentlich größere Produkte auf, wie angegeben.
  • 49 (Tabelle 4). CRISPR-Repeat-Konsensussequenzen: Für Homologe mit mehreren CRISPR-Loci innerhalb von 10 kb des Cas13a-enthaltenden Operons (RcaCas13a, LbaCas13a und EreCas13a) oder lange Arrays mit Repeat-Variationen (PprCas13a) sind mehrere crRNA-Repeat-Sequenzen mit rot markierten Mutationen aufgelistet. Für PprCas13a wurde der erste crRNA-Repeat an der Leader-Seite des Arrays für diese Studie gewählt. Für RcaCas13a, LbaCas13a und EreCas13a wurden die crRNA-Repeat-Sequenzen für zwei Faktoren analysiert, um eine repräsentative crRNA für diese Studie zu wählen (1): die Länge des Arrays und (2) die Fähigkeit, trans-ssRNA-Spaltung durch das kognate Cas13a-Protein zu steuern. Die im Haupttext verwendeten Sequenzen sind in der letzten Spalte notiert.
  • 50 (Tabelle 5). * Oligo ID - eine Indexnummer zur Aufrechterhaltung der Konsistenz für RNA-Substrate, die in dieser Studie verwendet wurden. ** Quellenabkürzungen: SS - einzelsträngiges DNA-Oligonukleotid-Template wurde für in vitro-Transkription verwendet, HH PCR - in vitro-Transkriptions-Template ist ein PCR-Produkt von überlappenden Oligonukleotiden einschließlich einer Hammerhead-Ribozym-Template-Sequenz, IDT - synthetisiert durch IDT, PCR - in vitro-Transkriptions-Template, amplifiziert aus Plasmid.
  • Die 51 zeigt die Tabelle 6. Die 52 zeigt die Tabelle 7. Die 53 zeigt die Tabelle 8. Die 54 zeigt die Tabelle 9.
  • 55. Ein überarbeitetes Modell für die Funktion des CRISPR-Systems vom Typ VI-A. (A) Grafische Zusammenfassung der wichtigsten Ergebnisse dieser Studie. Die Homologen, die in dieser Studie verwendet wurden, sind mit Abkürzungen in Fettschrift angegeben, wobei die in trans-ssRNA-spaltungsinaktiven Homologen in grau dargestellt sind. Farbige Kreise heben die zwei orthogonalen Cas13a-Enzymgruppen hervor, wie durch ihre verallgemeinerte crRNA-Austauschbarkeit und trans-ssRNA-Spaltungssubstrat-Nukleotidpräferenz definiert. (B) Schematische Darstellung eines überarbeiteten Modells für die Funktion des CRISPR-Systems vom Typ VI-A.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte es dem Fachmann jedoch klar sein, dass verschiedene Änderungen vorgenommen werden können und Äquivalente ersetzt werden können, ohne vom wahren Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. Zusätzlich können viele Modifikationen eingeführt werden, um eine bestimmte Situation, ein bestimmtes Material, eine bestimmte Zusammensetzung, einen bestimmten Prozess, einen oder mehrere Prozessschritte dem Ziel, Geist und Umfang der vorliegenden Erfindung anzupassen. Alle derartigen Modifikationen sind im Umfang der hier anliegenden Ansprüche eingeschlossen.
  • Das Folgende sind besondere, nicht einschränkende Ausführungsformen der Erfindung:
    1. 1. Verfahren zum Nachweisen einer einzelsträngigen Target-RNA in einer Probe, die eine Mehrzahl von RNAs umfasst, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
      1. a) Inkontaktbringen der Probe mit:
        1. (i) einer C2c2-guideRNA, die mit der einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert; und
        2. (ii) einem C2c2-Protein, das in der Probe vorhandene RNAs spaltet; und
      2. b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch C2c2-Protein-vermittelte RNA-Spaltung erzeugt wird.
    2. 2. Verfahren zum Nachweisen einer einzelsträngigen Target-RNA in einer Probe, die eine Mehrzahl von RNAs umfasst, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
      1. (a) Inkontaktbringen der Probe mit:
        1. (i) einem Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array, umfassend zwei oder mehr C2c2-guideRNAs, welche jeweils eine andere Guide-Sequenz aufweisen; und
        2. (ii) einem C2c2-Protein, das den Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array in einzelne C2c2-guideRNAs spaltet und auch RNAs der Probe spaltet; und
      2. (b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch C2c2-Protein-vermittelte RNA-Spaltung erzeugt wird.
    3. 3. Verfahren nach Ausführungsform 1 oder 2, wobei das C2c2-Protein innerhalb von 1 Stunde nach dem Inkontaktbringen mindestens 50% der in der Probe vorhandenen RNAs spaltet.
    4. 4. Verfahren nach Ausführungsform 3, wobei das C2c2-Protein innerhalb von 40 Minuten nach dem Inkontaktbringen mindestens 50% der in der Probe vorhandenen RNAs spaltet.
    5. 5. Verfahren nach Ausführungsform 4, wobei das C2c2-Protein mindestens 50% der in der Probe vorhandenen RNAs innerhalb von 5 Minuten nach dem Inkontaktbringen spaltet.
    6. 6. Verfahren nach Ausführungsform 5, wobei das C2c2-Protein mindestens 50% der in der Probe vorhandenen RNAs innerhalb einer Minute nach dem Inkontaktbringen spaltet.
    7. 7. Verfahren nach Ausführungsform 1, wobei das C2c2-Protein von 50% bis zu mehr als 90% der RNAs, die in der Probe vorhanden sind, innerhalb von 1 Minute nach dem Inkontaktbringen spaltet.
    8. 8. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-7, wobei die minimale Konzentration, bei der die einzelsträngige Target-RNA nachgewiesen werden kann, in einem Bereich von 500 fM bis 1 nM liegt.
    9. 9. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-7, wobei die einzelsträngige Target-RNA bei einer Konzentration von nur 800 fM nachgewiesen werden kann.
    10. 10. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-9, wobei das C2c2-Protein kein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein ist, umfassend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 3 angegeben ist.
    11. 11. Verfahren nach Ausführungsform 10, wobei das C2c2-Protein Non-Target-RNA mindestens 1,2-fach effizienter spaltet als ein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein, umfassend mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95 %, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der in SEQ ID NR.: 3 angegebenen Aminosäuresequenz.
    12. 12. Verfahren nach Ausführungsform 11, wobei das C2c2-Protein Non-Target-RNA mindestens 1,5-fach effizienter spaltet als ein Leptotrichia shahii (Lsh) C2c2-Protein, umfassend die in SEQ ID NR.: 3 dargestellte Aminosäuresequenz.
    13. 13. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-9, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von 80% oder mehr mit der in einer der SEQ ID NR.: 1, 2 oder 4-6 angegebenen Aminosäuresequenz umfasst.
    14. 14. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-9, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Aminosäuresequenzidentität von 80% oder mehr zur Leptotrichia buccalis (Lbu) C2c2-Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NR.: 2 angegeben ist.
    15. 15. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-9, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Aminosäuresequenzidentität von 80% oder mehr zur Listeria seeligeri C2c2-Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NR.: 1 angegeben ist.
    16. 16. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-9, wobei das C2c2-Protein die Aminosäuresequenz umfasst, die in irgendeiner der SEQ ID NR.: 1-2 und 4-6 angegeben ist.
    17. 17. Verfahren nach Ausführungsform 1, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität zu der C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist, umfasst und eine Substitution von einem oder mehreren aus R472, H477, R1048 und H1053 umfasst.
    18. 18. Verfahren nach Ausführungsform 1, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 2 angegebenen C2c2-Aminosäuresequenz umfasst und eine Substitution der Aminosäuren R472 und H477 umfasst.
    19. 19. Verfahren nach Ausführungsform 1, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten C2c2-Aminosäuresequenz umfasst und eine Substitution der Aminosäuren R1048 und H1053 umfasst.
    20. 20. Verfahren nach Ausführungsform 1, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität zu der C2c2-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 dargestellt ist, umfasst und eine Substitution der Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053 umfasst.
    21. 21. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-20, wobei die Probe vor der Messung für 2 Stunden oder weniger kontaktiert wird.
    22. 22. Verfahren nach Ausführungsform 21, wobei die Probe vor der Messung für 60 Minuten oder weniger kontaktiert wird.
    23. 23. Verfahren nach Ausführungsform 22, wobei die Probe vor der Messung für 30 Minuten oder weniger kontaktiert wird.
    24. 24. Verfahren nach Ausführungsform 23, wobei die Probe vor der Messung für 10 Minuten oder weniger kontaktiert wird.
    25. 25. Verfahren nach Ausführungsform 24, wobei die Probe vor der Messung für 1 Minute oder weniger kontaktiert wird.
    26. 26. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-25, umfassend das Bestimmen einer Menge an Target-RNA, die in der Probe vorhanden ist.
    27. 27. Verfahren nach Ausführungsform 26, wobei das Bestimmen Folgendes umfasst:
      • Messen des nachweisbaren Signals, um eine Testmessung zu erzeugen;
      • Messen eines nachweisbaren Signals, das von einer Referenzprobe erzeugt wird, um eine Referenzmessung zu erzeugen; und
      • Vergleichen der Testmessung mit der Referenzmessung, um eine Menge an Target-RNA zu bestimmen, die in der Probe vorhanden ist.
    28. 28. Verfahren nach Ausführungsform 26, umfassend:
      • Messen des nachweisbaren Signals, um eine Testmessung zu erzeugen,
      • Messen eines nachweisbaren Signals, das von jeder von zwei oder mehr Referenzproben erzeugt wird, wobei die zwei oder mehr Referenzproben jeweils eine unterschiedliche Menge einer RNA-Positivkontrolle enthalten, um zwei oder mehr Referenzmessungen zu erzeugen, und
      • Vergleichen der Testmessung mit den zwei oder mehr Referenzmessungen, um eine Menge an Target-RNA zu bestimmen, die in der Probe vorhanden ist.
    29. 29. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-28, wobei die Probe 5 bis 107 RNAs umfasst, die sich in der Sequenz voneinander unterscheiden.
    30. 30. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-28, wobei die Probe 10 bis 106 RNAs umfasst, die sich in der Sequenz voneinander unterscheiden.
    31. 31. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-30, wobei die Probe RNAs aus einem Zelllysat umfasst.
    32. 32. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-31, wobei das Messen eines nachweisbaren Signals eines oder mehreres aus Folgendem umfasst: Goldnanopartikelbasierter Nachweis, Fluoreszenzpolarisation, Kolloidphasenübergang/-dispersion, elektrochemischer Nachweis und Halbleiter-basierter Nachweis.
    33. 33. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-32, wobei (i) das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit einer markierten Nachweis-RNA umfasst, die ein Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar umfasst, (ii) das C2c2-Protein die markierte Nachweis-RNA spaltet und (iii) das nachweisbare Signal durch das Fluoreszenz-emittierende Farbstoffpaar erzeugt wird.
    34. 34. Verfahren nach Ausführungsform 33, wobei die markierte Nachweis-RNA vor der Spaltung eine Höhe des nachweisbaren Signals erzeugt und die Höhe des nachweisbaren Signals verringert wird, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird.
    35. 35. Verfahren nach Ausführungsform 33, wobei die markierte Nachweis-RNA vor dem Spalten ein erstes nachweisbares Signal erzeugt und ein zweites nachweisbares Signal erzeugt, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird.
    36. 36. Verfahren nach Ausführungsform 35, wobei die markierte Nachweis-RNA ein FRET-Paar und ein Quencher/Fluor-Paar umfasst.
    37. 37. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 33-36, wobei die markierte Nachweis-RNA ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Paar umfasst.
    38. 38. Verfahren nach Ausführungsform 33, wobei ein nachweisbares Signal erzeugt wird, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird.
    39. 39. Verfahren nach Ausführungsform 33, wobei die Höhe des nachweisbaren Signals steigt, wenn die markierte Nachweis-RNA gespalten wird.
    40. 40. Verfahren nach Ausführungsform 38 oder Ausführungsform 39, wobei die markierte Nachweis-RNA ein Quencher/Fluor-Paar umfasst.
    41. 41. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 33 bis 40, wobei die markierte Nachweis-RNA eine modifizierte Nukleobase, eine modifizierte Zucker-Gruppe und/oder eine modifizierte Nukleinsäure-Bindung umfasst.
    42. 42. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-41, wobei das Inkontaktbringen in einer zellfreien Probe durchgeführt wird.
    43. 43. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 1-41, wobei das Inkontaktbringen in einer Zelle in vitro, ex vivo oder in vitro durchgeführt wird.
    44. 44. Verfahren zum Spalten eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays in zwei oder mehr C2c2-guideRNAs, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
      • Inkontaktbringen eines Vorläufer-C2c2-guideRNA-Arrays, umfassend zwei oder mehr C2c2-guideRNAs, welche jeweils eine unterschiedliche Guide-Sequenz aufweisen, mit einem C2c2-Protein, wobei das C2c2-Protein den Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array in einzelne C2c2-guideRNAs spaltet.
    45. 45. Verfahren nach Ausführungsform 44, wobei dem C2c2-Protein eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne fehlt und/oder eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne fehlt.
    46. 46. Verfahren nach Ausführungsform 44 oder Ausführungsform 45, wobei der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr C2c2-guideRNAs umfasst, die verschiedene Target-Sequenzen innerhalb desselben Target-RNA-Moleküls als Target haben.
    47. 47. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 44-46, wobei der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr C2c2-guideRNAs umfasst, die verschiedene Target-RNA-Moleküle als Target haben.
    48. 48. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 44-47, wobei das Inkontaktbringen nicht innerhalb einer Zelle stattfindet.
    49. 49. Verfahren nach einem der Ausführungsformen 44-48, wobei mindestens eine der guideRNAs und/oder der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array nachweisbar markiert ist.
    50. 50. Kit zum Nachweisen einer Target-RNA in einer Probe, umfassend eine Mehrzahl von RNAs, wobei der Kit Folgendes umfasst:
      1. (a) einen Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array und/oder eine Nukleinsäure, welche den Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array kodiert, wobei der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr C2c2-guideRNAs umfasst, welche jeweils eine andere Guide-Sequenz und/oder eine andere Insertionsstelle für eine ausgewählte Guide-Sequenz aufweisen; und
      2. (b) ein C2c2-Protein.
    51. 51. Kit nach Ausführungsform 50, wobei dem C2c2-Protein eine katalytisch aktive HEPN1-Domäne und/oder eine katalytisch aktive HEPN2-Domäne fehlt.
    52. 52. Kit nach Ausführungsform 50 oder Ausführungsform 51, wobei der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr C2c2-guideRNAs umfasst, die verschiedene Target-Sequenzen innerhalb des gleichen Target-RNA-Moleküls als Target haben.
    53. 53. Kit nach einem der Ausführungsformen 50-52, wobei der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr C2c2-guideRNAs umfasst, die verschiedene Target-RNA-Moleküle als Target haben.
    54. 54. Kit nach einem der Ausführungsformen 50-53, wobei mindestens eine der guideRNAs und/oder der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array nachweisbar markiert ist.
    55. 55. Kit nach einem der Ausführungsformen 50 bis 54, ferner umfassend eine markierte Nachweis-RNA, umfassend ein Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar.
    56. 56. Kit zum Nachweisen einer Target-RNA in einer Probe, umfassend eine Mehrzahl von RNAs, wobei der Kit Folgendes umfasst:
      1. (a) eine markierte Nachweis-RNA, umfassend ein Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar; und
      2. (b) ein C2c2-Protein.
    57. 57. Kit nach Ausführungsform 56, umfassend eine Target-RNA-Positivkontrolle.
    58. 58. Kit nach Ausführungsform 57, wobei die Target-RNA-Positivkontrolle in unterschiedlichen Mengen in jedem von zwei oder mehr Behältern vorhanden ist.
    59. 59. Kit nach einem der Ausführungsformen 56-58, umfassend mindestens eines aus:
      • (c) einer C2c2-guideRNA und/oder einer Nukleinsäure, die die C2c2-guideRNA kodiert;
      • (d) einer Vorläufer-C2c2-guideRNA und/oder einer Nukleinsäure, die die Vorläufer-C2c2-guideRNA codiert; und
      • (e) einem Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array und/oder einer Nukleinsäure, welche den Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array kodiert, wobei der Vorläufer-C2c2-guideRNA-Array zwei oder mehr C2c2-guideRNAs umfasst, welche jeweils eine unterschiedliche Guide-Sequenz und/oder eine unterschiedliche Insertionsstelle für eine bevorzugte Guide-Sequenz aufweisen.
    60. 60. Kit nach einem der Ausführungsformen 56 bis 59, umfassend eine DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine C2c2-guideRNA mit oder ohne Guide-Sequenz kodiert.
    61. 61. Kit nach Ausführungsform 60, wobei die DNA eine Insertionssequenz für die Insertion einer Guide-Sequenz umfasst.
    62. 62. Kit nach Ausführungsform 60 oder 61, wobei die DNA ein Expressionsvektor ist und die C2c2-guideRNA funktionsfähig mit einem Promotor verbunden ist.
    63. 63. Kit nach Ausführungsform 62, wobei der Promotor ein T7-Promotor ist.
    64. 64. Kit nach einem der Ausführungsformen 56-63, umfassend eine C2c2-Endoribonuclease-Variante ohne Nucleaseaktivität.
    65. 65. Kit nach einem der Ausführungsformen 56-64, wobei die markierte Nachweis-RNA ein FRET-Paar umfasst.
    66. 66. Kit nach einem der Ausführungsformen 56-65, wobei die markierte Nachweis-RNA ein Quencher/Fluor-Paar umfasst.
    67. 67. Kit nach einem der Ausführungsformen 56-66, wobei die markierte Nachweis-RNA ein FRET-Paar, das ein erstes nachweisbares Signal erzeugt, und ein Quencher/Fluor-Paar umfasst, das ein zweites nachweisbares Signal erzeugt.
    68. 68. Abweichendes C2c2-Polypeptid, umfassend:
      1. a) eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 2 angegeben ist, und die Substitution von: i) Aminosäuren R472 und H477; ii) Aminosäuren R1048 und H1053; oder iii) Aminosäuren R472, H477, R1048 und H1053 umfasst;
      2. b) eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 angegeben ist, und die Substitution von: i) Aminosäuren R445 und H450; ii) Aminosäuren R1016 und H1021; oder iii) Aminosäuren R445, H450, R1016 und H1021 umfasst;
      3. c) eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 4 angegeben ist, und die Substitution von: i) Aminosäuren R464 und H469; ii) Aminosäuren R1052 und H1057; oder iii) Aminosäuren R464, H469, R1052 und H1057 umfasst;
      4. d) eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 5 angegeben ist, und die Substitution von: i) Aminosäuren R467 und H472; ii) Aminosäuren R1069 und H1074; oder iii) Aminosäuren R467, H472, R1069 und H1074 umfasst; oder
      5. e) eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 6 angegeben ist, und die Substitution von: i) Aminosäuren R472 und H477; ii) Aminosäuren R1044 und H1049; iii) oder Aminosäuren R472, H477, R1044 und H1049 umfasst.
    69. 69. Abweichendes C2c2-Polypeptid nach Ausführungsform 68, wobei das abweichende C2c2-Polypeptid eine reduzierte oder nicht nachweisbare Spaltung von ssRNA aufweist (z.B. eine RNA-guided Spaltungsaktivität), aber die Fähigkeit zur Bindung von C2c2-guideRNA und ssRNA sowie die Fähigkeit beibehält, Vorläufer-C2c2-guideRNA zu spalten.
    70. 70. Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein abweichendes C2c2-Polypeptid nach Ausführungsform 68 oder 69 kodiert.
    71. 71. Nukleinsäure nach Ausführungsform 70, wobei die Nukleotidsequenz funktionell mit einem konstitutiven Promotor oder einem regulierbaren Promotor verbunden ist.
    72. 72. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend die Nukleinsäure nach Ausführungsform 70 oder 71.
    73. 73. Wirtszelle, die mit der Nukleinsäure nach Ausführungsform 70 oder 71 oder mit dem rekombinanten Expressionsvektor nach Ausführungsform 72 genetisch modifiziert ist.
    74. 74. Wirtszelle nach Ausführungsform 73, wobei die Wirtszelle eine eukaryotische Zelle ist.
    75. 75. Wirtszelle nach Ausführungsform 73, wobei die Wirtszelle eine prokaryotische Zelle ist.
    76. 76. Wirtszelle nach einem der Ausführungsformen 73-75, wobei die Wirtszelle in vitro, ex vivo oder in vivo ist.
    77. 77. Verfahren zum Nachweisen von mindestens zwei verschiedenen einzelsträngigen Target-RNAs in einer Probe, die eine Mehrzahl von RNAs umfasst, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
      1. a) Inkontaktbringen der Probe mit:
        1. (i) einem ersten C2c2-Protein, das einzelsträngige RNAs (ssRNAs) spaltet, die mindestens ein A enthalten;
        2. (ii) einem zweiten C2c2-Protein, das ssRNAs spaltet, die mindestens ein U enthalten;
        3. (iii) einer ersten C2c2-guideRNA, die eine erste Nukleotidsequenz, die mit der ersten einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert, und eine zweite Nukleotidsequenz umfasst, die an das erste C2c2-Protein bindet; und
        4. (iv) einer zweiten C2c2-guideRNA, die eine erste Nukleotidsequenz, die mit der zweiten einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert, und eine zweite Nukleotidsequenz umfasst, die an das zweite C2c2-Protein bindet; wobei das erste C2c2-Protein nicht durch die zweite C2c2-guideRNA aktiviert wird, und wobei das erste C2c2-Protein ssRNA spaltet, die mindestens ein A enthält, und wobei das zweite C2c2-Protein nicht durch die erste C2c2-guideRNA aktiviert wird und wobei das zweite C2c2-Protein ssRNA spaltet, die mindestens ein U umfasst; und
      2. b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch RNA-Spaltung durch das erste und das zweite C2c2-Protein erzeugt wird, wobei ein erstes nachweisbares Signal bei Aktivierung des ersten C2c2-Proteins und ein zweites nachweisbares Signal bei Aktivierung des zweiten C2c2-Proteins erzeugt wird, wobei der Nachweis des ersten Signals das Vorhandensein der ersten Target-ssRNA in der Probe anzeigt, und wobei der Nachweis des zweiten Signals das Vorhandensein der zweiten Target-ssRNA in der Probe anzeigt.
    78. 78. Verfahren nach Ausführungsform 77, wobei
      • a) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56F dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Hhe-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56K dargestellt ist;
      • b) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56F dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der in 56G dargestellten Rca Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst;
      • c) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56F dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Ppr Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56B dargestellt ist;
      • d) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56F dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lne-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56I dargestellt ist;
      • e) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56F dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lbu Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56C dargestellt ist;
      • f) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56F dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lwa Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56E dargestellt ist;
      • g) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Lba-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56F dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der in 56D dargestellten Lsh Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst;
      • h) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Hhe-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56K dargestellt ist;
      • i) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der in 56G dargestellten Rca Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst;
      • j) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Ppr Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56B dargestellt ist;
      • k) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lne-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56I dargestellt ist;
      • l) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zur Ere Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lbu Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56C dargestellt ist;
      • m) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lwa Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56E dargestellt ist;
      • n) das erste C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der in 56D dargestellten Lsh Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst;
      • o) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Ere Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56J dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lse-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56A dargestellt ist;
      • p) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Hhe-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56K dargestellt ist;
      • q) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der in 56G dargestellten Rca Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst;
      • r) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Ppr Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56B dargestellt ist;
      • s) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lne-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56I dargestellt ist;
      • t) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lbu Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56C dargestellt ist;
      • u) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lwa Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56E dargestellt ist;
      • v) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der in 56F dargestellten Lsh Cas13a-Aminosäuresequenz. dargestellt ist; oder w) das erste C2c2 Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu der Cam Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56H dargestellt ist; und das zweite C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%, Aminosäuresequenzidentität zu der Lse-Cas13a-Aminosäuresequenz umfasst, die in 56A dargestellt ist.
    79. 79. Verfahren nach Ausführungsform 77 oder 78, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit:
      1. i) einer ersten markierten Nachweis-RNA umfasst, die ein erstes Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar umfasst, wobei die erste markierte Nachweis-RNA mindestens ein A und kein U umfasst; und
      2. ii) einer zweiten markierten Nachweis-RNA umfasst, umfassend ein zweites Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar, wobei die zweite markierte Nachweis-RNA mindestens ein U umfasst und kein A umfasst, wobei das erste C2c2-Protein die erste markierte Nachweis-RNA spaltet und das erste nachweisbare Signal durch das erste Fluoreszenz-emittierende Farbstoffpaar erzeugt wird und wobei das erste C2c2-Protein die zweite markierte Nachweis-RNA spaltet und das zweite nachweisbare Signal durch das zweite Fluoreszenz-emittierende Farbstoffpaar erzeugt wird.
    80. 80. Verfahren nach Ausführungsform 79, wobei die erste markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von 2 bis 15 aufeinanderfolgenden As und/oder die zweite markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von 2 bis 15 aufeinanderfolgenden Us umfasst.
    81. 81. Verfahren nach Ausführungsform 79, wobei die erste markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von 4 bis 15 aufeinanderfolgenden As umfasst und/oder die zweite markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von 4 bis 15 aufeinanderfolgenden Us umfasst.
    82. 82. Verfahren nach Ausführungsform 79, wobei die erste markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von mindestens 3 aufeinanderfolgenden As und/oder die zweite markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von mindestens 3 aufeinanderfolgenden Us umfasst.
    83. 83. Verfahren nach Ausführungsform 79, wobei die erste markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von mindestens 4 aufeinanderfolgenden As und/oder die zweite markierte Nachweis-RNA einen Abschnitt von mindestens 4 aufeinanderfolgenden Us umfasst.
    84. 84. Kit, umfassend:
      1. (a) eine erste markierte Nachweis-RNA, der U fehlt und mindestens ein A und ein erstes Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar umfasst;
      2. (b) eine zweite markierte Nachweis-RNA, der A fehlt und die mindestens ein U und ein zweites Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar umfasst;
      3. (c) ein erstes C2c2-Protein und/oder eine das erste C2c2-Protein kodierende Nukleinsäure, wobei das erste C2c2-Protein die erste markierte Nachweis-RNA, nicht aber die zweite markierte Nachweis-RNA spalten kann; und
      4. (d) ein zweites C2c2-Protein und/oder eine das zweite C2c2-Protein kodierende Nukleinsäure, wobei das zweite C2c2-Protein die zweite markierte Nachweis-RNA, aber nicht die erste markierte Nachweis-RNA spalten kann.
    85. 85. Kit nach Ausführungsform 84, umfassend mindestens eines aus:
      • (e) einer ersten C2c2-guideRNA und/oder einer Nukleinsäure, die die erste C2c2-guideRNA kodiert, wobei die erste C2c2-guideRNA eine Sequenz der konstanten Regions umfasst, die an das erste C2c2-Protein bindet;
      • (f) einer zweiten C2c2-guideRNA und/oder einer Nukleinsäure, die die zweite C2c2-guideRNA kodiert, wobei die zweite C2c2-guideRNA eine Sequenz der konstanten Regions umfasst, die an das zweite C2c2-Protein bindet;
      • (g) einer Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für eine Sequenz der konstanten Region kodiert, die an das erste C2c2-Protein bindet, und eine Insertionsstelle für eine ausgewählte Guide-Sequenz;
      • (h) einer Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für eine Sequenz der konstanten Region kodiert, die an das zweite C2c2-Protein bindet, und eine Insertionsstelle für eine ausgewählte Guide-Sequenz.
    86. 86. Kit nach Ausführungsform 84, umfassend eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine erste C2c2-guideRNA kodiert, wobei die erste C2c2-guideRNA eine Sequenz einer konstanten Region umfasst, die an das erste C2c2-Protein bindet.
    87. 87. Kit nach Ausführungsform 84, umfassend eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine zweite C2c2-guideRNA kodiert, wobei die zweite C2c2-guideRNA eine Sequenz einer konstanten Region umfasst, die an das zweite C2c2-Protein bindet.
    88. 88. Kit nach Ausführungsform 84, umfassend eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Sequenz der konstanten Region kodiert, die an das erste C2c2-Protein bindet, und eine Insertionsstelle für eine ausgewählte Guide-Sequenz.
    89. 89. Kit nach Ausführungsform 84, umfassend eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Sequenz der konstanten Region kodiert, die an das zweite C2c2-Protein bindet, und eine Insertionsstelle für eine ausgewählte Guide-Sequenz.
    90. 90. Kit nach einem der Ausführungsformen 86-89, wobei die Nukleinsäure ein Expressionsvektor ist und die Nukleotidsequenz funktionell mit einem Promotor verbunden ist.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    • <110> Doudna, Jennifer A 0'Connell, Mitchell Seletsky, Alexandra E Knight, Spencer C Cate, Jamie
    • <120> Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweisen einer Ziel-RNA
    • <130> BERK-337
    • <150> US 62/351,172 <151> 2016-06-16
    • <150> US 62/378,156 <151> 2016-08-22
    • <160> 26
    • <170> PatentIn Version 3.5
    • <210> 1 <211> 1120 <212> PRT <213> Listeria seeligeri
    • <400> 1
      Figure DE212017000061U1_0001
      Figure DE212017000061U1_0002
      Figure DE212017000061U1_0003
      Figure DE212017000061U1_0004
      Figure DE212017000061U1_0005
      Figure DE212017000061U1_0006
    • <210> 2 <211> 1159 <212> PRT <213> Leptotrichia buccalis
    • <400> 2
      Figure DE212017000061U1_0007
      Figure DE212017000061U1_0008
      Figure DE212017000061U1_0009
      Figure DE212017000061U1_0010
      Figure DE212017000061U1_0011
      Figure DE212017000061U1_0012
      Figure DE212017000061U1_0013
    • <210> 3 <211> 1389 <212> PRT <213> Leptotrichia shahii
    • <400> 3
      Figure DE212017000061U1_0014
      Figure DE212017000061U1_0015
      Figure DE212017000061U1_0016
      Figure DE212017000061U1_0017
      Figure DE212017000061U1_0018
      Figure DE212017000061U1_0019
      Figure DE212017000061U1_0020
    • <210> 4 <211> 1285 <212> PRT <213> Rhodobacter capsulatus R121
    • <400> 4
      Figure DE212017000061U1_0021
      Figure DE212017000061U1_0022
      Figure DE212017000061U1_0023
      Figure DE212017000061U1_0024
      Figure DE212017000061U1_0025
      Figure DE212017000061U1_0026
      Figure DE212017000061U1_0027
    • <210> 5 <211> 1175 <212> PRT <213> Carnobacterium gallinarum
    • <400> 5
      Figure DE212017000061U1_0028
      Figure DE212017000061U1_0029
      Figure DE212017000061U1_0030
      Figure DE212017000061U1_0031
      Figure DE212017000061U1_0032
      Figure DE212017000061U1_0033
    • <210> 6 <211> 1285 <212> PRT <213> Herbinix hemicellulosilytica
    • <400> 6
      Figure DE212017000061U1_0034
      Figure DE212017000061U1_0035
      Figure DE212017000061U1_0036
      Figure DE212017000061U1_0037
      Figure DE212017000061U1_0038
      Figure DE212017000061U1_0039
      Figure DE212017000061U1_0040
    • <210> 7 <211> 30 <212> RNA <213> Listeria seeligeri
    • <400> 7 gacuaccucu auaugaaaga ggacuaaaac    30
    • <210> 8 <211> 29 <212> RNA <213> Leptotrichia shahii
    • <400> 8 ccaccccaau aucgaagggg acuaaaaca    329
    • <210> 9 <211> 31 <212> RNA <213> Leptotrichia buccalis
    • <400> 9 gaccacccca aaaaugaagg ggacuaaaac a    331
    • <210> 10 <211> 50 <212> RNA <213> Listeria seeligeri
    • <400> 10 gacuaccucu auaugaaaga ggacuaaaac caaacaugau cugggucauc    350
    • <210> 11 <211> 55 <212> RNA <213> Listeria seeligeri
    • <400> 11 uaagagacua ccucuauaug aaagaggacu aaaaccaaac augaucuggg ucauc    355
    • <210> 12 <211> 49 <212> RNA <213> Leptotrichia shahii
    • <400> 12 ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacag gggcagagau gaugacccu    349
    • <210> 13 <211> 58 <212> RNA <213> Leptotrichia shahii
    • <400> 13 ggauuuagac caccccaaua ucgaagggga cuaaaacagg ggcagagaug augacccu    358
    • <210> 14 <211> 51 <212> RNA <213> Leptotrichia buccalis
    • <400> 14 gaccacccca aaaaugaagg ggacuaaaac aggggcagag augaugaccc u    351
    • <210> 15 <211> 56 <212> RNA <213> Leptotrichia buccalis
    • <400> 15 auuuagacca ccccaaaaau gaaggggacu aaaacagggg cagagaugau gacccu    356
    • <210> 16 <211> 27 <212> RNA <213> Artifizielle Sequenz
    • <220> <223> Synthetische Sequenz
    • <400> 16 agauagccca agaaagaggg caauaac    327
    • <210> 17 <211> 32 <212> RNA <213> Artifizielle Sequenz
    • <220> <223> Synthetische Sequenz
    • <400> 17 guaacaaucc ccguagacag gggaacugca ac    332
    • <210> 18 <211> 31 <212> RNA <213> Artifizielle Sequenz
    • <220> <223> Synthetische Sequenz
    • <400> 18 caucaccgcc aagacgacgg cggacugaac c    331
    • <210> 19 <211> 30 <212> RNA <213> Artifizielle Sequenz
    • <220> <223> Synthetische Sequenz
    • <400> 19 aauuauccca aaauugaagg gaacuacaac    330
    • <210> 20 <211> 30 <212> RNA <213> Artifizielle Sequenz
    • <220> <223> Synthetische Sequenz
    • <400> 20 gaguaccuca aaacaaaaga ggacuaaaac    330
    • <210> 21 <211> 32 <212> RNA <213> Artifizielle Sequenz
    • <220> <223> Synthetische Sequenz
    • <400> 21 gaccacccca auaucgaagg ggacuaaaac uu    332
    • <210> 22 <211> 27 <212> RNA <213> Artifizielle Sequenz
    • <220> <223> Synthetische Sequenz
    • <400> 22 caccccaaua ucgaagggga cuaaaac    327
    • <210> 23 <211> 27 <212> RNA <213> Artifizielle Sequenz
    • <220> <223> Synthetische Sequenz
    • <400> 23 aaguagcccg auauagaggg caauaac    327
    • <210> 24 <211> 27 <212> RNA <213> Artifizielle Sequenz
    • <220> <223> Synthetische Sequenz
    • <400> 24 auacagcucg auauagugag caauaag    327
    • <210> 25 <211> 34 <212> RNA <213> Artifizielle Sequenz
    • <220> <223> Synthetische Sequenz
    • <400> 25 ucacaucacc gccaagacga cggcggacug aacc    334
    • <210> 26 <211> 28 <212> RNA <213> Artifizielle Sequenz
    • <220> <223> Synthetische Sequenz
    • <400> 26 gaacagcccg auauagaggg caauagac    328
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
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Claims (15)

  1. Zusammensetzung zum Nachweis einer einzelsträngigen Target-RNA in einer azellulären Probe umfassend eine Vielzahl von RNAs, umfassend: (i) eine C2c2-guideRNA, die mit der einzelsträngigen Target-RNA hybridisiert; (ii) eine markierte Nachweis-RNA; und (iii) ein C2c2-Protein, das in der Probe vorhandene RNAs spaltet, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von 80% oder mehr mit der in einer der SEQ ID Nrn.: 1, 2 und 4-6 angegebenen Aminosäuresequenzen umfasst, und wobei das C2c2-Protein innerhalb von 60 Minuten nach dem Inkontaktbringen mit einer Probe, die eine C2c2-guideRNA und eine Target-RNA umfasst, mindestens 50% der markierten Nachweis-RNAs spaltet.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die markierte Nachweis-RNA eine farbbasierte Nachweismarkierung umfasst.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die markierte Nachweis-RNA eine Markierung zum visuellen oder sensorischen Nachweis umfasst.
  4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die markierte Nachweis-RNA eine Markierung zum Goldnanopartikel-basierten Nachweis, Fluoreszenzpolarisation, Kolloidphasenübergang/-dispersion, elektrochemischen Nachweis oder Halbleiter-basierten Nachweis umfasst.
  5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die markierte Nachweis-RNA ein Fluoreszenz-emittierendes Farbstoffpaar umfasst.
  6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die markierte Nachweis-RNA ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Paar umfasst.
  7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die markierte Nachweis-RNA eine modifizierte Nukleobase, eine modifizierte Zucker-Gruppe und/oder eine modifizierte Nukleinsäure-Bindung umfasst.
  8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die einzelsträngige RNA von einem Virus, einem Parasiten oder einem Bakterium ist.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei der Virus Zikavirus, HIV oder ein Influenzavirus ist.
  10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Probe von einer eukaryontischen Zelle, bakteriellen Zelle, archaealen Zelle, Pflanzenzelle oder Algenzelle ist.
  11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Probe von einer menschlichen oder tierischen Zelle ist.
  12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Probe von einer Krebszelle, einer infizierten Zelle oder einer kranken Zelle ist.
  13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Quelle der Probe eine/ein Pathogen-infizierte Zelle, Gewebe oder Organ ist.
  14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das Pathogen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Viren, Pilzen, Helminthen, Protozoen, Malaria-Parasiten, Plasmodium-Parasiten, Toxoplasma-Parasiten und Schistosoma-Parasiten.
  15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das C2c2-Protein eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von 80% oder mehr mit der in SEQ ID Nr: 2 oder 6 angegebenen Aminosäuresequenz umfasst.
DE212017000061.9U 2016-06-16 2017-06-13 Zusammensetzung zum Nachweis einer einzelsträngigen Target-RNA Active DE212017000061U1 (de)

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