WO2007137701A1 - Mutierte dna-polymerase mit erhöhter reverse transkriptase aktivität - Google Patents

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WO2007137701A1
WO2007137701A1 PCT/EP2007/004316 EP2007004316W WO2007137701A1 WO 2007137701 A1 WO2007137701 A1 WO 2007137701A1 EP 2007004316 W EP2007004316 W EP 2007004316W WO 2007137701 A1 WO2007137701 A1 WO 2007137701A1
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dna polymerase
nucleic acid
wild
seq
pcr
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PCT/EP2007/004316
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Andreas Marx
Katharina Sauter
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Universität Konstanz
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Definitions

  • the present invention relates to a DNA polymerase with increased reverse transcriptase activity, which has at least one mutation in its amino acid sequence compared to the wild-type variant, as well as a host cell and a method for producing the DNA polymerase. Furthermore, the present invention relates to a method for the identification of a nucleic acid and a kit containing the DNA polymerase.
  • Viable organisms that can not be cultivated can not be detected or identified.
  • Genotyping methods have, therefore, been widely used in the recent past (see P. Belgrader et al., 1999, HK Nogva et al., 2000, J. Hoorfar et al., 2000, M. Dahlenborg et al., 2001 , R. Knutsson et al., 2002; C. Löfström et al., 2004).
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR specificity of PCR is often insufficient to detect low levels of bacterial DNA in the presence of DNA from the host.
  • One reason for this is the frequently observed false amplification, such as of primer dimers leading to false-positive signals. This property can only be avoided by increasing the initial amount of material to be tested and thus at the expense of sensitivity.
  • numerous inhibitors in foods that inhibit PCR pose a major problem (see DL Wiedbrauck et al., 1995). More robust and reliable systems are imperative. Another problem is the discrimination of living and dead organisms by PCR methods.
  • RT-PCR PCR coupled with reverse transcription
  • the present invention is therefore based on the object to provide a DNA polymerase, which makes it possible to detect the presence of microorganisms with high selectivity and sensitivity without complex manipulations and / or workup steps.
  • the invention provides a DNA polymerase which differs from its wild-type variant by at least one mutation and has an increased reverse transcriptase (RT) activity compared to the wild-type variant.
  • RT reverse transcriptase
  • DNA polymerase encompasses all DNA polymerases which can be used in an amplification reaction, such as, for example, generally in PCR or allele-specific amplification.
  • the DNA polymerase preferably has a thermostability within the temperature range used in the PCR.
  • amplification or “amplification reaction” in this context designate in particular the replication or amplification of a nucleic acid such as, for example, DNA or RNA.
  • the present invention includes all functionally active derivatives of the above-defined DNA polymerase, ie also those derivatives which have slight changes in the amino acid sequence. which have no significant effect on the function of the DNA polymerase.
  • the present invention also includes in this context those DNA polymerases whose amino acid chain may be modified either by natural processes, such as post-translational processing, or by chemical methods known in the art. Such modifications may occur at various sites and several times in the DNA polymerase of the invention, such as at the peptide backbone, at the amino acid side chains or at the amino and / or carboxy terminus.
  • DNA polymerase of the invention may be present as an individual protein or as part of a larger protein, e.g. a fusion protein. Furthermore, it may allow secretion or "leader" sequences, pro-sequences, sequences that allow for easy purification and / or isolation, such as multiple histidine residues, or easy detection, such as fluorescent or radioactive labels.
  • mutation encompasses any modification of an amino acid sequence of the wild-type variant of the DNA polymerase defined above, such as, for example, deletions, additions and / or substitutions of amino acids.
  • these addition-added or substitution-substituting amino acids are not particularly limited, and in addition to all natural amino acids, include non-natural amino acids such as D-amino acids or amino acids having modified side chains.
  • the DNA polymerase according to the invention or its wild-type variant is not subject to any particular restriction with regard to its origin, but can be derived from any desired organism, for example from mammals, animals, plants or microorganisms.
  • the DNA polymerase according to the invention is preferably derived from bacterial DNA polymerases, such as polymerases from E.
  • thermostable organisms such as Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus fliformis, Rhodothermus obamensis, Bacillus stearothermophilus, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus wosei, Thermococcus litoralis, Pyrococcus species, Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus fu ⁇ osus ,
  • the wild-type variant of the above-defined DNA polymerase can also correspond to a DNA polymerase from sequence family A known to the person skilled in the art and, for example, from microorganisms such as Thermus aquaticus (Taq), E. coli, Thermus thermophilus, Thermus filiformis, Rhodothermus obamensis, Bacillus stearothermophilus come.
  • sequence family A known to the person skilled in the art and, for example, from microorganisms such as Thermus aquaticus (Taq), E. coli, Thermus thermophilus, Thermus filiformis, Rhodothermus obamensis, Bacillus stearothermophilus come.
  • the wild-type variant of the DNA polymerase defined above is derived from Thermus aquaticus (Taq) and has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1.
  • Taq Thermus aquaticus
  • This also includes modified forms of Taq DNA polymerase, such as the truncated form Klentaq DNA polymerase.
  • the amino acid sequence of the above-defined DNA polymerase in comparison to the wild-type variant one, two or more of the mutations L322M, L459M, S515R, I638F, S739G, E773G, L789F in any combination or all of them Mutations on.
  • the DNA polymerase has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2.
  • a further subject of the present invention relates to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence which codes for the DNA polymerase according to the invention.
  • the above-defined nucleic acid has a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 3.
  • a vector containing the above-defined nucleic acid is provided.
  • the vector of the invention is not particularly limited, with suitable vectors being known in the art.
  • the vector is preferably capable of expression and / or amplification in a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • the vector preferably contains suitable regulatory elements, such as promoters, enhancers, termination sequences etc.
  • the vector can also be used for the stable integration of the nucleic acid according to the invention into the genetic material of a host cell. Examples of suitable vectors are pET15b, pET21b, pTTQ18, pASK-IBA37plus and pET30 Xa Lic.
  • Another subject of the invention relates to such a host cell containing the above-defined vector or the above-defined nucleic acid.
  • the term "host cell” as used herein is not particularly limited and includes both eukaryotic and prokaryotic cells suitable for the production of heterologous proteins and known in the art. These are, for example, mammalian cells, animal cells, plant cells or cells of microorganisms.
  • the host cell according to the invention is preferably a cell which is derived from a microorganism, such as E. coli, Saccharomyces, both prokaryotic cells, such as E. coli (in particular E.
  • coli XH-blue DH5 ⁇ , B121 (DE3), M15 [ pREP4], SG13005 [pREP4], BL21 (DE3) pLysS), Halomonas elongata, Caulobacter sp.
  • Halobacterium halobium as well as eukaryotic cells, such as yeast and other fungal cells, plant and animal cells, including isolated human cells, which are in cell culture.
  • the term "host cell” is also understood to mean cell extracts which, upon presentation of an mRNA, can translate these, such as wheat germ extract and rabbit protein. Reticulocytenex Exercise.
  • here in vitro expression systems are understood as a "host cell", such.
  • T7 Expression System pBAD Expression System, ThioFusion Expression Systems, trc Expression System, PL Expression System, PurePro Caulobacter Expression System, Microbiological Media and Media Components, Qiagen pQE Expression System and the Novagen pET Expression System.
  • a further aspect of the present invention relates to a method for producing the DNA polymerase according to the invention, comprising the steps (a) of providing a host cell as defined above,
  • the DNA polymerase according to the invention is preferably prepared by expression with the aid of suitable expression systems, preferably as a segregated product of selectable stable transfectants of the cell line E. coli BL21 (DE3) pLysS.
  • the present invention includes all cell culture techniques known in the art.
  • the term "isolate” as used herein is not particularly limited and includes all techniques known to those skilled in the art for isolating recombinantly produced peptides, proteins and nucleic acids, such as electrophoresis, gel filtration, microfiltration, microdiafiltration, dialysis, chromatographic methods, centrifugation, etc.
  • the present invention provides a method for identifying a nucleic acid comprising the above-defined DNA polymerase.
  • the above-defined nucleic acid is derived from a contamination in a foodstuff.
  • contamination includes all contaminants that may occur in a foodstuff, such as impurities that may be introduced through the manufacture, processing, storage or use of the foodstuff.
  • contamination includes microorganisms such as bacteria, viruses, fungi, etc.
  • the term "food” as used herein is not particularly limited in this context and may be a food, a dietary supplement or a feed. Furthermore, the term includes all foods which may be contaminated by microorganisms, such as, in particular, foods containing meat, fruit, fish, dairy, bakery products and the like.
  • the nucleic acid defined above in the method according to the invention is an RNA and / or comes from a microorganism.
  • microorganism as used herein includes all microorganisms which may be contained in a food.
  • microorganism includes those microorganisms that may be harmful to the consumer of the food.
  • Another object of the present invention relates to the use of the above-defined DNA polymerase in a diagnostic or molecular biological method.
  • the DNA polymerase according to the invention can be used for mRNA quantification, for example by real-time PCR. An example of this is a quantification of the expression of certain genes.
  • kits for use in one of the abovementioned methods comprising the DNA polymerase according to the invention or the nucleic acid according to the invention.
  • the kit according to the invention is not subject to any use particular limitation and can be used in all methods in which the DNA polymerase according to the invention has an effect.
  • the kit may also contain other substances, such as, for example, buffers, indicators, salts, further enzymes, proteinaceous compounds or adjuvants.
  • the DNA polymerase according to the invention can be used, for example, in reverse transcriptase-coupled amplification methods (RT-PCR) and thus makes it possible to detect RNA and / or DNA without the use of a further enzyme or a complicated work-up step.
  • RT-PCR reverse transcriptase-coupled amplification methods
  • Fig. 1 Amino acid sequence of Klentaq DNA polymerase wild-type.
  • Fig. 2 Amino acid sequence of the mutant L322M, L459M, S515R, I638F, S739G, E773G (2-07) from Klentaq DNA polymerase.
  • Fig. 3 14% SDS-PAGE gel of purified polymerases.
  • Fig. 4 RT-PCR activity of Klentaq wt and mutant 2-O7 (0.8% agarose gel). The template used is shown in the figure.
  • Fig. 5 Primer extension assays with Klentaq wt and mutant 2-O7 using a 50mer RNA template (12% PAGE gel).
  • Fig. 6 Primer extension assays with Klentaq wt and mutant 2-07 using a RNA template from Roche (12% PAGE gel).
  • the Klentaq wild-type construct is obtained by cloning the gene into the Bsal site of pASK-IBA37plus (IBA). The insert is sequenced to confirm that it has no mutations. The introduction of random mutations is done with error-prone PCR.
  • PCR reactions are performed using 5 units Taq DNA polymerase (Fermentas), 10 mM Tris-HCl (pH 8.8), 50 mM KCl, 0.08% Nonidet P40, 1.5 mM MgCl 2 , 50 ⁇ M MnCl 2 , 2.5 ⁇ M of each dNTP, 20 ⁇ M template pASK-IBA37plus KTQ wt and 500 nM of each primer (5'-ATG GTA CGT CTC AGC GCG CCC TGG AGG AGG CCC CCT-3 1 forward (SEQ ID NO: 4 ), 5'-ATG GTA CGT CTC ATA TCA CTC CTT GGC GGA GAG CCA GTC-3 'reverse (SEQ ID NO: 5)) in a 100 ⁇ L mixture.
  • Taq DNA polymerase Fermentas
  • 10 mM Tris-HCl pH 8.8
  • 50 mM KCl 0.08% Nonidet P40
  • the product (1655 bp) is purified (MinElute TM Reaction Cleanup Kit, Qiagen) followed by digestion with BsmB ⁇ . The restriction fragment is then isolated and purified by electrophoresis in a 0.8% agarose gel (MinElute TM Gel Extraction Kit, Qiagen). It is ligated with the ßSsal digested pASK! BA37plus by incubating at 22 0 C for 1 hour with T4 DNA ligase (Fermentas). The resulting plasmid library is transformed into E. coli BL21.
  • 5000 clones are selected from agar plates and grown overnight in LB-medium (100 ⁇ g / ml carbenicillin) containing 96-well plates separately.
  • the K / enfaq mutants are expressed in parallel in 1 mL cultures in 96-well plates by induction with 200 ⁇ g / L AHT.
  • Lysis is dissolved in a 600 ⁇ L mixture containing 50 mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Tween 20, 2.5 mM MgCl 2 and 1 mg / ml lysozyme contains, performed.
  • the lysate is kept on ice for 30 min. followed by heat denaturation of all non-thermostable proteins at 72 ° C. for 45 min. After centrifugation, the lysate is added directly to the Screening used.
  • Reaction mixtures (20 ⁇ l_) for library screening contain 50 mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Tween 20, 2.5 mM MgCl 2 , 200 ⁇ M of each dNTP, 20 pM template MS2 (10000, 5'-ATC GCT CGA GAA CGC AAG TTC TTC AGC GAA AAG CAC GAC AGT GGT CGC TAC ATA GCG TGG TTC CAT ACT GGA GGT GAA ATC ACC GAC AGC ATG AAG TCC G-3 ' (SEQ ID NO: 6)), 100 nM of each primer (5'-ATC GCT CGA GAA CGC AAG TT-3 'forward (SEQ ID NO: 7), 5'-CGG ACT TCA TGC TGT CGG TG-3' reverse (SEQ ID NO: 8)) and 0.6x SYBRgreen I (Molecular Probes).
  • the initial threshold for detection of a hit was 1.2 times higher fluorescence compared to the wild-type. This factor was sufficient to successfully identify PCR active enzymes. These mutants were separated and further analyzed in a reverse transcription coupled PCR reaction (RT-PCR).
  • RT-PCR reverse transcription coupled PCR reaction
  • reaction mixtures (20 ⁇ L) contain 50 mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Tween 20, 2.5 mM MgCl 2 , 200 ⁇ M of each dNTP, 50 pg / ul
  • Klentaq wt and selected mutants are expressed as described above and purified using Ni-NTA agarose (BIO-RAD) following the manufacturer's protocol, omitting imidazole during lysis and washing steps.
  • the enzymes thus obtained were> 95% pure, as confirmed by Coomassie blue stained SDS-PAGE.
  • the reaction mixtures (50 ⁇ L) contain 50 mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Tween 20, 2.5 mM MgCl 2 , 200 ⁇ M of each dNTP, 50 pg / ul Templat RNA from bacteriophage MS2 (Roche) / 2O pM template MS2 (100g, 5'-ATC GCT CGA GAA CGC AAG TTC TTC AGC GAA AAG CAC GAC AGT GGT CGC TAC ATA GCG TGG TTC CAT ACT GGA GGT GAA ATC ACC GAC AGC ATG AAG TCC G-3 '(SEQ ID NO: 11)), 100 nM of each primer (5'-ATC GCT CGA GAA CGC AAG TT-3 "forward (SEQ ID NO: 12), 5'-ACC TCC AGT ATG GAA CCA CG-3 'reverse (SEQ ID NO: 13)
  • both the wildtype variant (wt) and the mutant 2-O7 of the Klentaq DNA polymerase are PCR active when DNA is offered as a template.
  • the mutant 2-O7 surprisingly has a significantly increased reverse transcriptase activity and also accepts RNA as a template, which is efficiently amplified after initial reverse transcription in DNA.
  • the reaction mixtures (30 ⁇ L) contain 50 mM Tris-HCl (pH 0.2), 16 mM (NhU) 2 SO 4 , 0.1% Tween 20, 2.5 mM MgCl 2 , 10 ⁇ M of each dNTP, 150 nM Templat RNA (50mer, 5'-AUC GCU CGA GAA CGC AAG UUC UUC AGC GAA AAG CAC GAC AGU GGU CGC UA-3 '(SEQ ID NO: 14), see Fig. 5) / RNA from bacteriophage MS2 (Roche, see Fig.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Polymerase mit erhöhter Reverse Transkriptase Aktivität, welche im Vergleich zur Wildtyp-Variante mindestens eine Mutation in ihrer Aminosäuresequenz aufweist, sowie eine Wirtszelle und ein Verfahren zur Herstellung der DNA-Polymerase. Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifikation einer Nukleinsäure und ein Kit, welches die DNA-Polymerase enthält.

Description

MUTIERTE DNA-POLYMERASE MIT ERHÖHTER REVERSE TRANSKRIPTASE AKTIVITÄT
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Polymerase mit erhöhter Reverse Tran- skriptase Aktivität, welche im Vergleich zur Wildtyp-Variante mindestens eine Mutation in ihrer Aminosäuresequenz aufweist, sowie eine Wirtszelle und ein Verfahren zur Herstellung der DNA-Polymerase. Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifikation einer Nukleinsäure und ein Kit, welches die DNA- Polymerase enthält.
Lebensmittelinfektionen gehören heutzutage zu den ernsthaftesten öffentlichen Gesundheitsrisiken. Mit über die Jahre ansteigendem globalen Reise- und Handelsauf- kommen wird das Risiko der Ausbreitung von Pathogenen ständig anwachsen. Ferner spielt die mikrobiologische Qualitätskontrolle in der Nahrungsmittelproduktion zur Vermeidung von Infektionen der Verbraucher eine immer wichtigere Rolle. Aus diesen Gründen ist die Entwicklung von schnelleren, robusteren und selektiveren Methoden zur Detektion und Charakterisierung von Mikroorganismen von herausragen- dem Interesse in zahlreichen Forschungsansätzen und -gebieten, in der biologische Sicherheit eine fundamentale Rolle spielt (vgl. B. Malorny et al., 2003; P. G. Lantz et al., 2000; P. M. Scheu et al., 1998; C A. Foy et al., 2001 ).
Traditionelle und standardisierte Methoden zum Nachweis von unerwünschten Or- ganismen in Nahrungsmitteln beruhen auf der Vervielfältigung verdächtiger Kolonien gefolgt von deren biochemischer und/oder serologischer Identifizierung (vgl. B. Malorny et al., 2003; P. G. Lantz et al., 2000; P. M. Scheu ef al., 1998; C. A. Foy et al., 2001). Diese Methoden weisen jedoch einige Nachteile auf:
- Hohe Zeitdauer: der Zeitraum, der für die Auswertung und Analyse notwendig ist, kann oft mehrere Tage bis zu Wochen in Anspruch nehmen. Unzureichende Robustheit und Verlässlichkeit: Phänotypische Merkmale werden von manchen Mikroorganismen oft nicht ausreichend ausgebildet, um einen verlässlichen Nachweis führen zu können.
- Eingeschränkte Eignung: Lebensfähige Organismen, die nicht kultivierbar sind, können nicht nachgewiesen bzw. identifiziert werden.
Eine attraktive Alternative zu den herkömmlichen Verfahren ist der spezifische Nachweis des Genoms des jeweiligen Organismus. Genotypisierende Verfahren fin- den daher in der jüngeren Vergangenheit eine verbreitete Anwendung (vgl. P. Belgrader et al., 1999; H. K. Nogva et al., 2000; J. Hoorfar et al., 2000; M. Dahlenborg et al., 2001 , R. Knutsson et al., 2002; C. Löfström et al., 2004). Dabei ist der Nachweis des bakteriellen Genoms durch Amplifikation mittels der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) möglich. Nichtsdestotrotz haben diese Methoden noch signifi- kante Nachteile, was ihrer breiten und generellen Anwendung und Akzeptanz noch im Wege steht. So ist die Spezifität der PCR oft nicht ausreichend, um geringe Mengen bakterieller DNA in Gegenwart von DNA des Wirts nachzuweisen. Ein Grund dafür ist die häufig zu beobachtende Fehlamplifikation wie z.B. von Primerdimeren die zu falsch-positiven Signalen führt. Diese Eigenschaft ist nur durch Erhöhung der Ausgangsmenge an zu untersuchendem Material zu vermeiden und geht somit auf Kosten der Sensitivität. Ferner stellen zahlreiche Inhibitoren in Nahrungsmitteln, die eine PCR inhibieren, ein großes Problem dar (vgl. D. L. Wiedbrauck et ak., 1995) Hier sind robustere und verlässlichere Systeme zwingend erforderlich. Ein weiteres Problem ist die Unterscheidung von lebenden und abgestorbenen Organismen durch PCR-Methoden. Die Möglichkeit des Nachweises von mRNA, welche nur in lebenden Zellen vorkommt, durch eine mit reverser Transkription gekoppelten PCR (RT- PCR) zeigte bereits erste Erfolge und ihre prinzipielle Anwendbarkeit (vgl. B. K. R. Patel et al., 1993; I. Hein et al., 2001 ; G. E. Sheridan et al., 1998; E. A. Szabo et al., 1999; A. K. Bej et al., 1991 ). Sie geht aber erheblich zu Lasten der Selektivität und Sensitivität, sodass teilweise mehr als 1000-fach erhöhte Mengen an Ziel-DNA verwendet werden müssen. Auch hier sind Optimierungen dringend erforderlich. Die wenigen bereits im Handel erhältlichen Kits (z.B. Qiagen) für die Anwendung in solchen RT-PCR-Verfahren enthalten stets zwei Enzyme (jeweils Reverse Trans- kriptase und DNA-Polymerase). Der Einsatz von Tth Polymerase (Roche) als einzelnes Enzym verlangt hingegen die Verwendung von Mn2+ und erfordert zudem eine aufwendige Probenmanipulation, in der das Probengefäß geöffnet werden muss, wodurch eine erhöhte Gefahr der Kontaminierung besteht.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine DNA-Polymerase bereitzustellen, welche es ermöglicht, die Anwesenheit von Mikroorganismen mit hoher Selektivität und Sensitivität ohne aufwendige Manipulationen und/oder Aufarbeitungschritte nachzuweisen.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.
Insbesondere wird erfindungsgemäß eine DNA-Polymerase bereitgestellt, welche sich durch mindestens eine Mutation von ihrer Wildtyp-Variante unterscheidet und im Vergleich zur Wildtyp-Variante eine erhöhte reverse Transkriptase (RT) Aktivität aufweist.
Der Begriff "DNA-Polymerase" umfasst erfindungsgemäß alle DNA-Polymerasen, welche in einer Amplifikationsreaktion, wie beispielsweise allgemein in der PCR oder der allelspezifischen Amplifikation, eingesetzt werden können. Zur Verwendung einer DNA-Polymerase beispielsweise in der PCR, weist die DNA-Polymerase vorzugs- weise eine Thermostabilität innerhalb des in der PCR verwendeten Temperaturbereichs auf.
Die Begriffe "Amplifikation" bzw. "Amplifikationsreaktion" bezeichnen in diesem Zusammenhang insbesondere die Replikation bzw. Vervielfältigung einer Nukleinsäure wie beispielsweise DNA oder RNA. Desweiteren schließt die vorliegende Erfindung alle funktionell aktiven Derivate der vorstehend definierten DNA-Polymerase ein, d.h. auch solche Derivate, die geringfügige Änderungen in der Aminosäuresequenz auf- weisen, welche keine wesentliche Auswirkung auf die Funktion der DNA-Polymerase haben.
Die vorliegende Erfindung umfasst in diesem Zusammenhang auch solche DNA- Polymerasen, deren Aminosäurekette entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase vorkommen, wie beispielsweise an dem Peptid-Rückgrat, an den Aminosäure- Seitenketten oder am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, ko- valente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid- Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbindungen, Methylierungen und Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma- Carboxylierungen, Glycolysierungen, Hydroxylierungen, Phosphorylierungen und tRNA-vermittelte Addition von Aminosäuren. Die erfindungsgemäße DNA- Polymerase kann als individuelles Protein oder als Teil eines größeren Proteins, z.B. eines Fusionsproteins vorliegen. Desweiteren kann sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung und/oder Isolierung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder eine einfache Detektion ermöglichen, wie beispielweise Fluoreszenz- oder radioaktive Marker enthalten.
Der Begriff "Mutation" umfasst erfindungsgemäß jede Veränderung einer Aminosäu- resequenz der Wildtyp-Variante der vorstehend definierten DNA-Polymerase wie beispielsweise Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen von Aminosäuren.
Weiterhin unterliegen diese, durch Addition hinzugefügten oder durch Substitution ersetzenden Aminosäuren keiner besonderen Einschränkung und umfassen neben allen natürliche Aminosäuren auch nicht-natürliche Aminosäuren wie beispielsweise D-Aminosäuren oder Aminosäuren mit modifizierten Seitenketten. Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase bzw. ihre Wildtyp-Variante unterliegt hinsichtlich ihrer Herkunft keiner besonderen Einschränkung, sondern kann aus jedem beliebigen Organismus stammen, wie beispielsweise aus Säugern, Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen. Vorzugsweise leiten sich die erfindungsgemässe DNA- Polymerase von bakteriellen DNA-Polymerasen, wie Polymerasen von E. coli, Aqui- fex, Borielia, Bacillus, Chlamydia, Chlamydophila, Chloroflexus, Haemophilis, HeIi- obacter, Lacococcus, Methylobakterium, Myocobaktehum, Rohodothermus, Rickettsie, Streptococcus, Streptomyces, Syncechocysts, Treponema, insbesondere von Polymerasen thermostabiler Organismen wie Thermus aquaticus, Thermus thermo- philus, Thermus fliformis, Rhodothermus obamensis, Bacillus stearothermophilus, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus wosei, Thermococcus litoralis, Pyrococcus species, Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus fuήosus ab.
Die Wildtyp-Variante der vorstehend definierten DNA-Polymerase kann auch einer dem Fachmann bekannten DNA-Polymerase aus der Sequenzfamilie A entsprechen und beispielsweise aus Mikroorganismen wie Thermus aquaticus (Taq), E. coli, Thermus thermophilus, Thermus filiformis, Rhodothermus obamensis, Bacillus stearothermophilus stammen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt die Wildtyp- Variante der vorstehend definierten DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq) und weist eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 auf. Dies schließt auch modifizierte Formen der Taq DNA-Polyermase ein, wie beispielsweise die verkürzte Form Klentaq DNA-Polymerase.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Aminosäure-Sequenz der vorstehend definierten DNA-Polymerase im Vergleich zur Wildtyp-Variante eine, zwei oder mehrere der Mutationen L322M, L459M, S515R, I638F, S739G, E773G, L789F in beliebiger Kombination oder alle diese Mutationen auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die DNA-Polymerase eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 auf. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für die erfindungsgemäße DNA-Polymerase kodiert. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform, weist die vorstehend definierte Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 3 auf.
Desweiteren wird erfindungsgemäß ein Vektor, enthaltend die vorstehend definierte Nukleinsäure, bereitgestellt. Der erfindungsgemäße Vektor unterliegt keiner besonderen Einschränkung, wobei geeignete Vektoren im Stand der Technik bekannt sind. Der Vektor ist vorzugsweise zur Expression und/oder Amplifikation in einer prokaryo- tischen oder eukaryotischen Zelle befähigt. Dazu enthält der Vektor vorzugsweise geeignete regulatorische Elemente, wie Promotoren, Enhancer, Terminations- Sequenzen usw. Der Vektor kann auch zur stabilen Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das genetische Material einer Wirtszelle verwendet werden. Beispiele geeigneter Vektoren sind pET15b, pET21 b, pTTQ18, pASK-IBA37plus und pET30 Xa Lic.
Ein weiterer Gegenstand betrifft erfindungsgemäß eine solche Wirtszelle, enthaltend den vorstehend definierten Vektor oder die vorstehend definierte Nukleinsäure.
Der hierin verwendete Ausdruck "Wirtszelle" unterliegt keiner besonderen Einschränkung und umfasst sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Zellen, welche zur Produktion heterologer Proteine geeignet und im Stand der Technik bekannt sind. Dies sind beispielsweise Säugerzellen, tierische Zellen Pflanzenzellen oder Zellen von Mikroorganismen. Die erfindungsgemäße Wirtszelle ist vorzugsweise eine Zelle welche von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, wie beispielsweise E. coli, Sac- charomyces, sowohl prokaryontische Zellen, wie E. coli (insbesondere E. coli XH- blue, DH5α, B121 (DE3), M15 [pREP4], SG13005 [pREP4], BL21 (DE3)pLysS), Ha- lomonas elongata, Caulobacter sp. Halobacteriumhalobium, als auch eukaryontische Zellen, wie Hefe- und andere Pilzzellen, pflanzliche und tierische Zellen, einschliess- lieh isolierter menschlicher Zellen, die sich in Zellkultur befinden. Des Weiteren werden unter dem Begriff "Wirtszelle" auch Zellextrakte verstanden, die bei Vorlage einer mRNA diese translatieren können, wie Weizenkeimextrakt als auch Kaninchen- Reticulocytenextrakt. Weiterhin werden hier auch in vitro Expressionssysteme als "Wirtszelle" verstanden, wie z. B. das T7 Expression System pBAD Expression System, ThioFusion" Expression Systems, trc Expression System, PL Expression System, PurePro Caulobacter Expression System, Microbiological Media and Media Components, Qiagen pQE Expression System und das Novagen pET Expression System.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase, umfassend die Schritte (a) des Bereitstellens einer wie vorstehend definierten Wirtszelle,
(b) des Züchtens der Wirtszelle in einem geeigneten Medium und
(c) des Isolierens der DNA-Polymerase.
Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase wird vorzugsweise durch Expression mit Hilfe geeigneter Expressionsysteme, vorzugsweise als sezemiertes Produkt selek- tionierbarer stabiler Transfektanden der Zelllinie E. coli BL21 (DE3) pLysS, hergestellt.
Die vorliegende Erfindung schließt alle im Stand der Technik bekannten Techniken zum Züchten von Zellen ein. Ebenso unterliegt der hierin verwendete Begriff "Isolieren" keiner besonderen Einschränkung und beinhaltet alle dem Fachmann bekannten Techniken zum Isolieren rekombinant hergestellter Peptide, Proteine und Nukleinsäuren, wie beispielsweise Elektrophorese, Gelfiltration, Mikrofiltration, Mi- krodiafiltration, Dialyse, chromatographische Verfahren, Zentrifugation usw.
Desweiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Nukleinsäure bereit, umfassend die vorstehend definierte DNA-Polymerase.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, stammt die vorstehend definierte Nukleinsäure aus einer Kontamination in einem Nahrungsmittel. Der Begriff "Kontamination" schließt alle Verunreinigungen ein, die in einem Nahrungsmittel auftreten können, beispielsweise Verunreinigungen, welche durch die Herstellung, die Verarbeitungen, die Lagerung oder die Verwendung des Nahrungsmittels eingeführt werden können. Insbesondere schließt der Begriff "Kontamination" Mikroorganismen wie Bakterien, Viren, Pilze usw. ein.
Der hierin verwendete Begriff "Nahrungsmittel" unterliegt in diesem Zusammenhang keiner besonderen Einschränkung und kann ein Nahrungsmittel, eine Nahrungser- gänzungsmittel oder ein Futtermittel sein. Desweiteren schließt der Begriff alle Nah- rungsmittel ein, welche durch Mikroorganismen verunreinigt werden können wie insbesondere solche Nahrungsmittel, die Fleisch, Obst, Fisch, Molkereiprodukte, Backprodukte und Ähnliches enthalten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die vorstehend definierte Nu- kleinsäure in dem erfindungsgemäßen Verfahren eine RNA und/oder stammt aus einem Mikroorganismus.
Der Ausdruck "Mikroorganismus", wie er hierin verwendet wird, schließt alle Mikroorganismen ein, welche in einem Nahrungsmittel enthalten sein können. Insbesondere umfasst der Begriff "Mikroorganismus" solche Mikroorganismen, die gesundheitsschädlich für den Konsumenten der Nahrung sein können.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der vorstehend definierten DNA-Polymerase in einem diagnostischen oder molekular- biologischen Verfahren. Ferner kann die erfindungsgemäße DNA-Polymerase zur mRNA-Quantifizierung, beispielsweise durch Echtzeit-PCR, verwendet werden. Ein Beispiel hierfür ist eine Quantifizierung der Expression bestimmter Gene.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Verwendung in einem der vorstehend genannten Verfahren bereitgestellt, enthaltend die erfindungsgemäße DNA-Polymerase, oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure. Das erfindungsgemäße Kit unterliegt jedoch bezüglich der möglichen Verwendung keiner besonderen Einschränkung und kann in allen Verfahren verwendet werden, in denen die erfindungsgemäße DNA-Polymerase einen Effekt aufweist. Desweiteren kann das Kit neben der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase auch andere Substanzen, wie beispielsweise Puffer, Indikatoren, Salze, weitere Enzyme, proteinartige Verbin- düngen oder Hilfsstoffe enthalten.
Aufgrund der im Vergleich zur Wildtyp-Variante mindestens einen enthaltenden Mutation in der Aminosäure-Sequenz der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase, weist diese eine überraschend erhöhte Reverse Transkriptase Aktivität auf. Durch diese vorteilhaften Eigenschaft kann die erfindungsgemäße DNA-Polymerase beispielsweise in Reverse Transkriptase gekoppelten Amplifikationsverfahren (RT-PCR) eingesetzt werden und ermöglicht so den Nachweis von RNA und/oder DNA ohne den Einsatz eines weiteren Enzyms oder aufwendiger Aufarbeitungsschritt. Durch diesen überraschenden Effekt erlaubt die erfindungsgemäße DNA-Polymerase die Ent- Wicklung neuer vorteilhafter Verfahren wie beispielsweise zum Nachweis von schädlichen Mikroorganismen in Nahrungsmitteln.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 : Aminosäure-Sequenz von Klentaq DNA-Polymerase Wildtyp.
Fig. 2: Aminosäure-Sequenz der Mutante L322M, L459M, S515R, I638F, S739G, E773G (2-07) von Klentaq DNA-Polymerase.
Fig. 3: 14 % SDS-PAGE Gel von gereinigten Polymerasen.
Fig. 4: RT-PCR-Aktivität von Klentaq wt und der Mutante 2-O7 (0.8 % Agarose- GeI). Das verwendete Templat ist in der Figur gezeigt.
Fig. 5: Primer-Extension-Assays mit Klentaq wt und der Mutante 2-O7 mittels eines 50mer RNA Templats (12 % PAGE Gel). Fig. 6: Primer-Extension-Assays mit Klentaq wt und der Mutante 2-07 mittels eines RNA Templats von Roche (12 % PAGE Gel).
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht einschränkenden Bei- spiele näher erläutert.
Beispiel 1 : Konstruktion der Bibliothek
Das Klentaq Wildtyp-Konstrukt wird durch Klonierung des Gens in die Bsal-Stelle von pASK-IBA37plus (IBA) erhalten. Das Insert wird sequenziert, um zu bestätigen, dass es keine Mutationen aufweist. Die Einführung zufälliger Mutationen wird mit Error-prone PCR durchgeführt. PCR-Reaktionen werden unter Verwendung von 5 Einheiten Taq DNA-Polymerase (Fermentas), 10 mM Tris-HCI (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,08% Nonidet P40, 1 ,5 mM MgCI2, 50 μM MnCI2, 2,5 μM von jedem dNTP, 20 pM Templat pASK-IBA37plus KTQ wt und 500 nM von jedem Primer (5'-ATG GTA CGT CTC AGC GCG CCC TGG AGG AGG CCC CCT-31 forward (SEQ ID NO: 4), 5'-ATG GTA CGT CTC ATA TCA CTC CTT GGC GGA GAG CCA GTC-3' reverse (SEQ ID NO: 5)) in einem 100 μL Gemisch durchgeführt. Es wird durch 14 PCR-Zyklen ampli- fiziert (95 0C für 1 min., 65 0C für 1 min. und 72 0C für 2 min.). Das Produkt (1655 bp) wird gereinigt (MinElute™ Reaction Cleanup Kit, Qiagen) gefolgt von einer Verdauung mit BsmB\. Das Restriktionsfragment wird dann durch Elektrophorese in einem 0,8% Agarose-Gel isoliert und gereinigt (MinElute™ Gel Extraction Kit, Qiagen). Es wird mit dem durch ßsal verdauten pASK-!BA37plus durch Inkubieren bei 22 0C für 1 Stunde mit T4 DNA Ligase (Fermentas) ligiert. Die resultierende Plasmid-Bibliothek wird in E. coli BL21 transformiert. 5000 Klone werden von Agarplatten ausgewählt und über Nacht separat in LB-Medium (100 μg/mL Carbenicillin) enthaltenden 96- well-Platten gezüchtet. Die K/enfaq-Mutanten werden parallel in 1-mL-Kulturen in 96- well-Platten durch Induktion mit 200 μg/L AHT exprimiert. Lysis wird in einem 600 μL Gemisch, welches 5O mM Tris-HCI (pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1 % Tween 20, 2,5 mM MgCI2 und 1 mg/mL Lysozym enthält, durchgeführt. Das Lysat wird auf Eis für 30 min. inkubiert, gefolgt von Hitze-Denaturierung aller nicht thermostabilen Proteine bei 72 0C über 45 min. Nach dem Zentrifugieren wird das Lysat direkt zum Screenen verwendet.
Beispiel 2: Screening nach PCR-aktiven Mutanten
Reaktionsgemische (20 μl_) für das Bibliotheks-Screenen enthalten 50 mM Tris-HCI (pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20, 2,5 mM MgCI2, 200 μM von jedem dNTP, 20 pM Templat MS2 (lOOmer, 5'-ATC GCT CGA GAA CGC AAG TTC TTC AGC GAA AAG CAC GAC AGT GGT CGC TAC ATA GCG TGG TTC CAT ACT GGA GGT GAA ATC ACC GAC AGC ATG AAG TCC G-3' (SEQ ID NO: 6)), 100 nM von jedem Primer (5'-ATC GCT CGA GAA CGC AAG TT-3' forward (SEQ ID NO: 7), 5'-CGG ACT TCA TGC TGT CGG TG-3' reverse (SEQ ID NO: 8)) und 0,6x SYBRgreen I (Molecular Probes). Diese werden unter Verwendung eines automatischen Flüssigkeits-Manipulationsgerätes (Hamilton Microlab Star) in 384-well-Platten gegeben, gefolgt von der Zugabe von 5 μL Lysat-Lösung. Als Negativ-Kontrollen werden analog behandelte Kulturen von XL10 Gold Zellen, welche den nicht- kodierenden Vektor pASK-IBA37plus enthalten, verwendet. Nach 50 PCR-Zyklen (95 0C für 30 s, 55 0C für 35 s und 72 0C für 40 s) werden die Fluoreszenz- Intensitäten mittels eines Fluoreszenzplatten-Lesers (Polarstar Optima, BMG Lab- technologies GmbH) mit einer Anregung bei 485 nm und einer Emission bei 520 nm quantifiziert.
Der anfängliche Grenzwert für die Erkennung eines Treffers war eine 1 ,2-fach höhere Fluoreszenz in Vergleich zu dem Wildtyp. Dieser Faktor war ausreichend, um PCR-aktive Enzyme erfolgreich zu identifizieren. Diese Mutanten wurden getrennt und weiter in einer mit reverser Transkription gekopplten PCR-Reaktion (RT-PCR) analysiert.
Beispiel 3: Screening nach Reverse Transkription (RT)-aktiven Mutanten
Die Reaktionsgemische (20 μL) enthalten 5O mM Tris-HCI (pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1 % Tween 20, 2,5 mM MgCI2, 200 μM von jedem dNTP, 50 pg/μL
Templat RNA von Bacteriophage MS2 (Roche), 100 nM von jedem Primer (5'-ATC
GCT CGA GAA CGC AAG TT-3' forward (SEQ ID NO: 9), 5'-CGG ACT TCA TGC TGT CGG TG-31 reverse (SEQ ID NO: 10)) und 0,6x SYBRgreen I (Molecular Pro- bes). Diese werden unter Verwendung eines automatischen Flüssigkeits- Manipulationsgerätes (Hamilton Microlab Star) in 96-well-PCR-Platten gegeben, gefolgt von der Zugabe von 5 μL Lysat-Lösung. Die Reaktionen werden in einem Echt- zeit PCR-Cycler (iCycler, BIO-RAD) durchgeführt. Nach einem anfänglichen reversen Transkriptions-Zyklus (95 0C für 30 s, 55 0C für 35 s und 72 0C für 15 min.) und 50 PCR-Zyklen (95 0C für 30 s, 55 0C für 35 s und 72 0C für 40 s) werden aktive Mutanten durch Messen der Fluoreszenz-Schmelzkurve des amplifizierten Produkts identifiziert.
3% der PCR-aktiven Mutanten zeigten eine RT-Aktivität. Eine dieser Mutanten (2-O7) wurde gereinigt und weiter analysiert.
Beispiel 4: Reinigung von K/eπfaq-Mutanten
Klentaq wt und ausgewählte Mutanten werden wie oben beschrieben exprimiert und unter Verwendung von Ni-NTA Agarose (BIO-RAD) gereinigt, wobei dem Protokoll des Herstellers, unter Weglassen von Imidazol während der Lysis- und Waschschritte, gefolgt wird.
Die auf diese Weise erhaltenen Enzyme waren >95% rein, wie durch Coomassie- Blau gefärbtes SDS-PAGE bestätigt.
Nach dem Puffer-Austausch zu 50 mM Tris-HCI (pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1 % Tween 20, 2,5 mM MgCb und 1 mM DTT, enthaltend 50% Glycerin, werden die Kon- zentrationen mittels Nanoorange-Assay (Molecular Probes) gemessen (vgl. Fig. 3).
Beispiel 5: Vergleich von Klentag wt und der Klentaα Mutante 2-O7
RT-PCR-Aktivität
Die Reaktionsgemische (50 μL) enthalten 5O mM Tris-HCI (pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1 % Tween 20, 2,5 mM MgCI2, 200 μM von jedem dNTP, 50 pg/μL Templat RNA von Bacteriophage MS2 (Roche) / 2O pM Templat MS2 (lOOmer, 5'-ATC GCT CGA GAA CGC AAG TTC TTC AGC GAA AAG CAC GAC AGT GGT CGC TAC ATA GCG TGG TTC CAT ACT GGA GGT GAA ATC ACC GAC AGC ATG AAG TCC G-3' (SEQ ID NO: 11 )), 100 nM von jedem Primer (5'-ATC GCT CGA GAA CGC AAG TT-3" forward (SEQ ID NO: 12), 5'-ACC TCC AGT ATG GAA CCA CG-3' reverse (SEQ ID NO: 13)) und 50 nM Klentaq DNA-Polymerase. Nach einem anfänglichen reversen Transpriptions-Zyklus (95 CC für 30 s, 55 0C für 35 s and 72 0C für 15 min.) wird das Produkt durch 40 PCR-Zyklen (95 0C für 30 s, 55 0C für 35 s and 72 0C für 40 s) amplifiziert.
Wie in Fig. 4 zu sehen ist, sind sowohl die Wildtyp-Variante (wt) als auch die Mutante 2-O7 der Klentaq DNA-Polymerase PCR-aktiv wenn DNA als Templat angeboten wird. Im Gegensatz zur Wildtyp-Variante weist die Mutante 2-O7 jedoch überraschenderweise eine erheblich erhöhte reverse Transkriptase Aktivität auf und akzep- tiert ebenso RNA als Templat, welches nach anfänglicher reverser Transkription in DNA effizient amplifiziert wird.
Primer-Extension-Assavs mit einem RNA-Templat
Die Reaktionsgemische (30 μL) enthalten 5O mM Tris-HCI (pH 0,2), 16 mM (NhU)2SO4, 0,1 % Tween 20, 2,5 mM MgCI2, 10 μM von jedem dNTP, 150 nM Templat RNA (50mer, 5'-AUC GCU CGA GAA CGC AAG UUC UUC AGC GAA AAG CAC GAC AGU GGU CGC UA-3' (SEQ ID NO: 14), vgl. Fig. 5) / RNA von Bacteriophage MS2 (Roche, vgl. Fig. 6), 100 nM 5'-[32P] primer (5'-TAG CGA CCA CTG TCG TGC TT-3' (SEQ ID NO: 15)) und 25 nM Klentaq DNA-Polymerase. Nach einer Inkubation bei 95 0C für 30 s, 55 0C für 35 0C und 72 0C für 15 min. bis 4 h, werden die Reaktionen durch Zugabe von 3 Volumina Gel-Beladungspuffer (80% Formamid, 20 mM EDTA) gestoppt.
Die Ergebnisse der Primer-Extension-Assays mit RNA-Templaten sind in den Fig. 5 und 6 abgebildet. Bei beiden untersuchten RNA-Templaten konnte eine überraschend erhöhte Aktivität der Mutante 2-O7 der Klentaq DNA-Polymerase gegenüber der Wildtyp-Variante beobachtet werden.

Claims

Ansprüche
1. DNA-Polymerase, welche sich durch mindestens eine Mutation von ihrer Wildtyp-Variante unterscheidet und im Vergleich zur Wildtyp-Variante eine erhöhte reverse Transkriptase (RT) Aktivität aufweist.
2. DNA-Polymerase nach Anspruch 1 , wobei die Wildtyp-Variante aus Thermus aquaticus (Taq) stammt und eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 aufweist.
3. DNA-Polymerase nach Anspruch 2, wobei die Aminosäure-Sequenz im Vergleich zur Wildtyp-Variante eine, zwei oder mehrere der Mutationen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L322M, L459M, S515R, I638F, S739G, E773G und L789F, in beliebiger Kombination oder alle diese Mutationen aufweist.
4. DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die DNA- Polymerase eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist.
5. Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für die DNA- Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.
6. Nukleinsäure nach Anspruch 5, mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 3.
7. Vektor, enthaltend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 oder 6.
8. Wirtszelle, enthaltend den Vektor nach Anspruch 7 oder die Nukleinsäure nach Anspruch 5 oder 6.
9. Verfahren zur Herstellung einer DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend die Schritte
(a) des Bereitstellens einer Wirtszelle nach Anspruch 8, (b) des Züchtens der Wirtszelle in einem geeigneten Medium und
(c) des Isolierens der DNA-Polymerase.
10. Verfahren zur Identifizierung einer Nukleinsäure, umfassend die DNA- Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Nukleinsäure aus einer Kontamination in einem Nahrungsmittel stammt.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , wobei die Nukleinsäure RNA ist und/oder aus einem Mikroorganismus stammt.
13. Verwendung der DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einem diagnostischen oder molekularbiologischen Verfahren.
14. Kit zur Verwendung in einem gemäß der in den Ansprüchen 10 bis 13 genannten Verfahren, enthaltend die DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
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