WO2007137700A2 - Mutierte dna-polymerasen mit höherer selektivität - Google Patents

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WO2007137700A2
WO2007137700A2 PCT/EP2007/004315 EP2007004315W WO2007137700A2 WO 2007137700 A2 WO2007137700 A2 WO 2007137700A2 EP 2007004315 W EP2007004315 W EP 2007004315W WO 2007137700 A2 WO2007137700 A2 WO 2007137700A2
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Andreas Marx
Nicolas Rudinger
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Universität Konstanz
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Definitions

  • the present invention relates to a DNA polymerase with increased Fehlbyungsdiskrimintechnik, which has at least one mutation in its amino acid sequence compared to the wild-type variant, and a host cell and a method for producing the DNA polymerase. Furthermore, the present invention relates to the use of DNA polymerase in diagnostic and molecular biological methods and a kit containing the DNA polymerase.
  • nucleic acid variants such as mutations or single nucleotide polymorphisms (SNP).
  • SNP single nucleotide polymorphisms
  • the variant of a target nucleic acid can be effected by hybridization of the nucleic acid sample to be analyzed with a sequence variant-specific hybridization probe under suitable hybridization conditions.
  • hybridization methods in particular the clinical requirements with regard to the required selectivity of such assays are not enough.
  • PCR polymerase chain reaction
  • ASA allele-specific amplification
  • US Pat. No. 5,595,890 for example, describes such methods for allele-specific amplification and their use for the detection of clinically relevant point mutations, for example in the k-ras oncogene.
  • US Pat. No. 5,521,301 also describes methods for allele-specific amplification for genotyping the ABO blood group system.
  • U.S. Patent 5,639,611 discloses the use of allele-specific amplification in the detection of the point mutation responsible for sickle cell anemia.
  • Such methods for the detection of sequence variants, polymorphisms and, above all, point mutations require allele-specific amplification in particular when the sequence variant to be detected is in a deficit compared to an excess variant of the same nucleic acid segment (or gene).
  • ASA allele-specific amplification
  • the present invention is therefore based on the object to provide a DNA polymerase with increased Fehlbyungsdiskrimintechnik and thus an increased selectivity.
  • the invention provides a DNA polymerase which differs from its WiId-type variant by at least one mutation in the amino acid sequence and has an increased mismatch discrimination in comparison to the wild-type variant.
  • DNA polymerase encompasses all DNA polymerases which can be used in an amplification reaction, such as, for example, generally in PCR or allele-specific amplification.
  • the DNA polymerase preferably has a thermal stability within the temperature range used in the PCR.
  • the DNA polymerase of the present invention comprises, according to a specific embodiment, the highly conserved motif C (see “Motif C” in Delarue et al., 1990, Protein Engineering 3 (6), 461-467) or the highly conserved motif KKRYAV ( See “Motif KKRYAV” in Braithwaite, DK, Ito, J., 1993, NAR 21 (4), 787-802) or a combination thereof.
  • amplification or “amplification reaction” in this context designate in particular the replication or amplification of a nucleic acid such as, for example, DNA or RNA.
  • the present invention includes all functionally active derivatives of the DNA polymerase defined above, ie also those derivatives which have slight changes in the amino acid sequence, which have no significant effect on the function of the DNA polymerase.
  • the present invention also includes in this context those DNA polymerases whose amino acid chain may be modified either by natural processes, such as post-translational processing, or by chemical methods known in the art.
  • Such modifications may occur at various sites and several times in the DNA polymerase according to the invention, such as, for example, on the peptide backbone, on the amino acid side chains or on the amino and / or carboxy terminus. They include, for example, acetylations, acylations, ADP-ribosylations, amidations, covalent linkages with flavins, heme portions, nucleotides or nucleotide derivatives, lipids or lipid derivatives, cyclizations, disulfide bridge bonds, methylations and demethylations, cystine formations, formylations, gamma-carboxylations, glycosylations, hydroxylations, phosphorylations and tRNA-mediated addition of amino acids.
  • the DNA polymerase according to the invention can be present as an individual protein or as part of a larger protein, for example a fusion protein. Furthermore, it may allow secretion or "leader" sequences, pro-sequences, sequences that allow for easy purification and / or isolation, such as multiple histidine residues, or allow easy detection, such as fluorescence or radioactive labels.
  • leader secretion or "leader" sequences, pro-sequences, sequences that allow for easy purification and / or isolation, such as multiple histidine residues, or allow easy detection, such as fluorescence or radioactive labels.
  • mismatch discrimination refers to selectivity or recognition for base mismatch in a nucleic acid as well as incorporation of mismatched or non-canonical nucleotides.
  • mutation encompasses any modification of an amino acid sequence of the wild-type variant of the above-defined DNA polymerase, such as, for example, deletions, additions and / or substitutions of amino acids.
  • these addition-added or substitution-substituting amino acids are not particularly limited and include all natural amino acids include non-natural amino acids such as D-amino acids or amino acids with modified side chains.
  • the mutation of the above-defined DNA polymerase comprises the substitution of at least one amino acid by a more hydrophobic amino acid.
  • more hydrophobic amino acid refers to an amino acid having greater hydrophobicity than that of the amino acid to be replaced, and thus does not indicate absolute but relative size.
  • the hydrophobicity of an amino acid is a quantity well known to those skilled in the art, but may vary with factors such as pH.
  • the mutation comprises the replacement of a lysine residue (Lys) with a methionine residue (Met) and / or an asparagine residue (Asp) against a leucine residue (Leu).
  • the DNA polymerase according to the invention or its wild-type variant is not subject to any particular restriction with regard to its origin, but can be derived from any desired organism, for example from mammals, animals, plants or microorganisms.
  • the DNA polymerase is derived of bacterial DNA polymerases such as polymerases from E.
  • thermostable organisms such as Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus fliformis, Rhodothermus obamensis, Bacillus safarothermophilus, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus wosei, Thermococcus litoralis, Pyrococcus species, Thermococcus kodakaraensis.
  • the wild-type variant of the DNA polymerase defined above may also correspond to a DNA polymerase known from the family B and, for example, from microorganisms such as Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus spec, Thermococcus litoralis (Vent), phi29, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus Wosei, Thermococcus litoralis, Pyrococcus species, Thermococcus kodakaraensis.
  • microorganisms such as Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus spec, Thermococcus litoralis (Vent), phi29, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus Wosei, Thermococcus litoralis, Pyrococcus species, Thermococcus kodakaraensis.
  • the wild-type variant of the DNA polymerase defined above is derived from Pyrococcus furiosus (Pfu) and has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of the DNA polymerase according to the invention in comparison to its above-defined, from Pyrococcus furiosus derived wild-type variant, the mutation D541 L or K593M or the combination thereof.
  • the above-defined DNA polymerase has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence of the DNA polymerase according to the invention has at least one mutation in Motif C or Motif KKRYAV compared to its wild-type variant.
  • all mutations are Motif C and / or Motif KKRYAV.
  • At least one mutation is in Motif C and at least one mutation is in Motif KKRYAV.
  • the above-defined, from Pyrococcus furiosus derived wild-type variant of the DNA polymerase of the invention comprises a nucleic acid comprising a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 3.
  • a further subject of the present invention relates to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence which codes for the DNA polymerase defined according to the invention.
  • the above-defined nucleic acid has a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 4.
  • a vector containing the above-defined nucleic acid is provided.
  • the vector of the invention is not particularly limited, with suitable vectors being known in the art.
  • the vector is preferably capable of expression and / or amplification in a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • the vector preferably contains suitable regulatory elements, such as promoters, enhancers, termination sequences etc.
  • the vector can also be used for the stable integration of the nucleic acid according to the invention into the genetic material of a host cell. Examples of suitable vectors are pET15b, pET21b, pTTQ18, pASK-IBA37plus and pET30 Xa Lic.
  • the term "host cell” as used herein is not particularly limited and includes both eukaryotic and prokaryotic cells suitable for the production of heterologous proteins and known in the art. These are, for example, mammalian cells, animal cells, plant cells or cells of microorganisms.
  • the host cell according to the invention is preferably a cell which is derived from a microorganism, such as, for example, both prokaryotic cells, such as E. coli (in particular E. coli XM-blue, DH5 ⁇ , B121 (DE3), M15 [pREP4], SG13005 [pREP4], BL21 (DE3) pLysS), Halomonas elongata, Caulobacter sp.
  • E. coli in particular E. coli XM-blue, DH5 ⁇ , B121 (DE3), M15 [pREP4], SG13005 [pREP4], BL21 (DE3) pLysS
  • Halobacterium halobium as well as eukaryotic cells, such as yeast and other fungal cells, plant and animal cells, including isolated human cells that are in cell culture.
  • the term "host cell” also cell extracts understood that can translate them upon presentation of an mRNA, such as wheat germ extract and rabbit reticulocyte extract.
  • here in vitro expression systems are understood as a "host cell”, such.
  • the T7 Expression System pBAD Expression System, ThioFusion Expression Systems, trc Expression System, PL Expression System, PurePro Caulobacter Expression System, Microbiological Media and Media Components, Qiagen pQE Expression System and the Novagen pET Expression System are examples of the T7 Expression System pBAD Expression System, ThioFusion Expression Systems, trc Expression System, PL Expression System, PurePro Caulobacter Expression System, Microbiological Media and Media Components, Qiagen pQE Expression System and the Novagen pET Expression System.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for producing the DNA polymerase of the invention comprising the steps
  • the DNA polymerase according to the invention is preferably prepared by expression with the aid of suitable expression systems, preferably as a secreted product of selectable stable transfectants of the cell line E. coli BL21 (DE3) pLysS.
  • suitable expression systems preferably as a secreted product of selectable stable transfectants of the cell line E. coli BL21 (DE3) pLysS.
  • the present invention includes all cell culture techniques known in the art.
  • the term "isolate” as used herein is not particularly limited and includes all techniques known to those skilled in the art for isolating recombinantly produced peptides, proteins and nucleic acids, such as electrophoresis, gel filtration, microfiltration, microdiafiltration, dialysis, chromatographic methods, centrifugation, etc.
  • Another object of the present invention relates to the use of the above-defined DNA polymerase in a diagnostic or molecular biological method.
  • this method comprises allele-specific PCR, DNA amplification or cloning.
  • DNA polymerase of the present invention can be used as a highly selective enzyme for (standard) PCR amplification of e.g. Genes or gene fragments and optionally used for their subsequent cloning.
  • Another object of the present invention relates to a method for the identification of one or more nucleic acid mismatches, which comprises the above-defined use of the DNA polymerase according to the invention.
  • a further subject matter of the present invention relates to a kit for use in one of the methods defined above, comprising the DNA polymerase according to the invention or the nucleic acid according to the invention.
  • the above-defined kit is not particularly limited in potential use and can be used in any methods in which the DNA polymerase of the present invention has an effect.
  • the above-defined kit may also contain other substances, for example buffers, indicators, salts, further enzymes, proteinaceous compounds or auxiliaries. Because of the at least one mutation contained in the amino acid sequence of the above-defined DNA polymerase compared to the wild-type variant, this has a surprisingly increased mismatch discrimination. This increase in the selectivity of DNA polymerase activity advantageously allows the development of reliable systems for the detection of mutations or polymorphisms in a target nucleic acid. Furthermore, the above-defined DNA polymerase allows a particularly advantageous diagnosis, for example, directly by allele-specific PCR without the need of downstream time and cost-intensive purification or analysis methods.
  • FIG. 1 Protein sequence of Pyrococcus furiosus (Pfu) wildtype exo
  • FIG. 2 Protein sequence of the mutant Pfu D541 L / K593M exo-
  • Fig. 5 SDS-PAGE of the purified Pfu DNA polymerases - Coomassie stained blue. It was applied 40 fmol polymerase. From left to right: marker (M), Pfu wt exo- (wt exo-), Pfu mutant D541 L / K593M exo- (D541 L / K593M exo-). The proteins are> 95% pure.
  • Fig. 6 Agarose (0.8%) gel electrophoretic verification of the PCR experiments - from left to right: marker (M); Pfu wt exo- (wt), mutant D541 L / K593M exo- (D541 L / K593M).
  • PCR protocol initial denaturation 95 ° C., 2 minutes, then 25 cycles of 95 ° C., 1 minute, 55 ° C., 1 minute, 72 ° C., 3 minutes. Template pETPfu wt exo-, 10 ng. Fiq.
  • Figure 8 primer extension reaction - marker (-); Pfu wt exo- (wt exo-), mutant D541 L / K593M exo- (D541 L / K593M exo-). 150 nM enzyme each, 200 ⁇ M dNTPs, 150 nM primer / template, reaction time 30 min.
  • Figure 9 Primer extension reaction for the detection of remote mismatches - marker (-); Pfu wt exo- (wt exo-), mutant D541 L / K593M exo- (D541L / K593M exo-). 150 nM enzyme each, 200 ⁇ M dNTPs, 150 nM primer / template, reaction time 30 min.
  • Pfu DNA polymerases in pETPfu exo- is carried out in E. coli BL21 (DE3) pLysS.
  • the cell pellets are suspended in lysis buffer (10 mM Tris-HCl pH 9.55, 30 mM NaCl, 0.1% Triton-X100, 1 mM benzamidine, 1 mM PMSF v Pefabloc, 1 mg / ml lysozyme, 5 ml lysis buffer / 50 ml of culture) and at 37 0 C for 10 min. lysed.
  • E. coli proteins are obtained by heat denaturation at 75 ° C. for 45 min. followed by centrifugation at 25,000 xg for 30 min. at 4 0 C away.
  • the remaining supernatant is then further purified by NTA affinity chromatography (batch method).
  • the centrifuged expression lysates (in 10 mM Tris-HCl pH 9.55, 300 mM NaCl, 0.1% Triton-X100) are incubated with NTA matrix (Qiagen, 2-3 ml slurry / 20 ml lysate) for 20 min. incubated at 4 0 C in an overhead shaker.
  • NTA matrix Qiagen, 2-3 ml slurry / 20 ml lysate
  • NTA matrix is then washed twice with NTA wash buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.1, 100 mM NaCl, 0.1% Triton-X100, 20 mM imidazole) and the protein is washed twice with NTA elution buffer ( 10 mM Tris-HCl pH 8.1, 100 mM NaCl, 0.1% Triton-X100, 150 mM imidazole).
  • the resulting protein solutions are purified on a Sephacryl S-300 High Resolution (Amersham) column preequilibrated with 150 mM Tris-HCl pH 8.2, 0.3 mM EDTA to exchange the buffer, remove imidazole and remove residual protein contaminants ,
  • fractions containing Pfu DNA polymerase are collected and concentrated over a VIVASPIN 20 50000 MWCO PES 20x.
  • the purified DNA polymerases (wild-type variant (wt) and mutant D541 L / K593M) were transformed into Pfu storage buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.05% CHAPS , 50% glycerol) and were> 95% pure, as verified by SDS-PAGE ( Figure 5). Protein concentrations were determined by a Bradford test (Roth) with a BSA standard curve (PIERCE albumin standard).
  • the reaction volume is 50 ul with 10 ng template (pETPfu wt exo-) in Pfu DNA polymerase buffer (20 mM Tris-HCI (pH 8.8 at 25 0 C), 2 mM MgSO 4, 10 mM (NH 4) 2 SO 4 , 10 mM KCl, 0.1% (v / v) Triton-X100, 0.1 mg / ml BSA).
  • the reactions contain 15O nM of the corresponding enzyme, dNTPs (200 ⁇ M of dATP, dGTP, dCTP, and TTP) and primers (0.5 ⁇ M each). All PCR experiments are performed in a Biometra thermocycler.
  • Primer 1 5'-GGT ATT GAG GGT CGC ATG ATT TTA GAT GTG GAT TAC ATA ACT G-3 1 (SEQ ID NO: 5)
  • the reaction volume is 20 .mu.l with 40 pM template in Pfu DNA polymerase buffer (2O mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 0 C), 2 mM MgSO 4 , 10 mM (NH-O 2 SO 4 , 10 mM KCl, 0 , 1% (v / v) Triton-X100, 0.1 mg / ml BSA.)
  • the reactions contain 20 nM wild type, mutant and 40 nM mutant for the same activity, dNTPs (200 ⁇ M of dATP, dGTP, dCTP, and TTP .), primer (0.5 uM), and 0.4 x SYBR Green I (Molecular Probes)
  • the PCR amplifications are according to the following program performed: Initialdenaturierung at 95 0 C for 3 min, followed by 20 cycles of denaturation at 95 0 C for 30 s, primer
  • Fart primer 5 '-d (TCC CGT TGG AGG TGA AGG AT) (SEQ ID NO: 7)
  • reverse primer 5'-d
  • CGC GCA GCA CGC GCC GCC GT 5'-d
  • Target Template FarX 5'-d (CCG TCA GCT GTG CCG TCG CGC AGC ACG CGC CGC CGT GGA CAG AGG ACT GCA GAA AAT CAA CCT XTC CTC CTT CAG GAC CAA CGT ACA GAG) (SEQ ID NO: 9);
  • X A, FarA; G, FarG;
  • 150 nM 5 are for the Anarilagem of primer and template '32P-labeled primer and template in Pfu reaction buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.8, 10 mM (NHU) 2 SO 4, 1 O mM KCl, 0.1% Triton X100, 0.1 mg / ml BSA, 2 mM MgSO 4 mixed) and min after heating for 5 hours. to 95 0 C in a thermo shaker (Eppendorf) at 20 0 C within 30 min. cooled. After attachment, the reaction is started by adding dNTPs (in 1x reaction buffer). The reactions are incubated at 68 ° C. for appropriate periods of time ((a) - (d)). (a) 30 minutes for the qualitative primer extension reaction (100 ⁇ M dNTPs, 150 nM enzyme each)
  • the wild-type enzyme is able to extend from correctly paired and mismatched primers, albeit with reduced activity compared to the canonically paired primer / template (see Figure 8).
  • the mutant D541 L / K593M shows significantly higher discrimination with respect to a canonically or non-canonically paired primer / template than the wild-type variant (see Figure 9) and thus allows the surprisingly efficient detection of a mismatch.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Polymerase mit erhöhter Fehlpaarungsdiskriminierung, welche im Vergleich zur Wildtyp-Variante mindestens eine Mutation in ihrer Aminosäure-Sequenz aufweist, sowie eine Wirtszelle und ein Verfahren zur Herstellung der DNA-Polymerase. Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der DNA-Polymerase in diagnostischen und molekularbiologischen Verfahren und ein Kit, welches die DNA-Polymerase enthält.

Description

MUTIERTE DNA-POLYMERASEN MIT HÖHERER SELEKTIVITÄT
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Polymerase mit erhöhter Fehlpaarungsdiskriminierung, welche im Vergleich zur Wildtyp-Variante mindestens eine Mutation in ihrer Aminosäure-Sequenz aufweist, sowie eine Wirtszelle und ein Verfahren zur Herstellung der DNA-Polymerase. Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der DNA-Polymerase in diagnostischen und molekularbiologischen Verfahren und ein Kit, welches die DNA-Polymerase enthält.
Seit der Vorstellung der ersten menschlichen Genomsequenzen konzentriert sich die Forschung auf die Entdeckung genetischer Unterschiede zwischen den Individuen wie z.B. Einzelbasenmutationen (SNPs). Dies ist von Interesse, da zunehmend ersichtlich wird, dass Einzelbasenvariationen im Genom mit unterschiedli- eher Arzneimittelverträglichkeit oder einer Prädisposition für verschiedenste Krankheiten verknüpft sind. In Zukunft könnte die Kenntnis medizinisch relevanter Nukleotidvariationen es ermöglichen, Therapien auf die individuelle genetische Ausstattung anzupassen und die Behandlung mit Medikamenten, die ineffektiv sind oder sogar zu Nebenwirkungen führen, zu verhindern. Es ist offensichtlich, dass Entwicklungen, die eine zeit- und kosteneffiziente Identifizierung von Nukleotidvariationen ermöglichen, zu weiteren Fortschritten in der Pharmakogenetik führen. Viele Methoden zur Erkennung von Nukleotidvariationen sind bereits beschrieben. Jede dieser Methoden weist jedoch entscheidende Nachteile auf, so dass sich bisher keine dieser Methoden durchsetzen konnte.
Zum Nachweis von Nukleinsäure-Varianten wie Mutationen oder Single-Nukleotid- Polymorphismen (SNP) können verschiedene Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise kann die Variante einer Target-Nukleinsäure durch Hybridisierung der zu analysierenden Nukleinsäure-Probe mit einer Sequenzvarianten-spezifischen Hybridisierungssonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen erfolgen. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass derartige Hybridisierungsmethoden, insbesondere den klinischen Anforderungen hinsichtlich der erforderlichen Selektivität derartiger Assays, nicht genügen. Deshalb hat zum Nachweis von Mutationen, Single-Nukleotid-Polymorphismen sowie anderen allelischen Sequenzvarianten insbesondere auch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) einen breiten Eingang in molekularbiologische und diagnostische Untersuchungsverfahren gefunden, wobei eine im Hinblick auf die Existenz einer Variante zu untersuchende Target- Nukleinsäure durch PCR vor der Hybridisierung amplifiziert wird. Den meisten im Stand der Technik bekannten Methoden geht eine solche Polymerase- Kettenreaktion voraus. Dazu wird, nach Isolation des genetischen Materials, die interessierende Sequenz vor der eigentlichen Analyse durch PCR amplifiziert und angereichert. Als Hybridisierungssonden für derartige Assays werden in der Regel einzelsträngige Oligonukleotide verwendet. Methoden zur direkten Bestimmung von Nukleotidunterschieden durch die PCR sind hingegen selten. Ein Grund hierfür ist die Tatsache, dass natürliche Enzyme unter typischen Bedingungen der PCR nicht ausreichend diskriminieren, um eine Aussage über die An- bzw. Abwe- senheit einer Mutation, insbesondere einer Punktmutation, direkt durch PCR machen zu können.
Eine bereits im Stand der Technik bekannte Alternative zur Sequenzvarianten- spezifischen Hybridisierung bietet die sogenannte allelspezifische Amplifikation (ASA). Bei diesem Nachweisverfahren werden bereits während der Amplifikation durch die PCR Varianten-spezifische Amplifikationsprimer eingesetzt, die in der Regel am 3'-terminalen Ende des Primers einen sogenannten diskriminierenden Nukleotidrest besitzen, welcher lediglich komplementär zu nur einer speziellen Variante der nachzuweisenden Target-Nukleinsäure ist.
US-Patent 5,595,890 beschreibt beispielsweise derartige Verfahren zur allelspezi- fischen Amplifikation sowie deren Anwendung zum Nachweis von klinisch relevanten Punktmutationen, beispielsweise im k-ras-Onkogen. US-Patent 5,521 ,301 beschreibt ebenfalls Verfahren zur allelspezifischen Amplifikation zur Genotypisie- rung des ABO-Blutgruppensystems. US-Patent 5,639,611 offenbart dagegen die Verwendung allelspezifischer Amplifikation im Zusammenhang mit dem Nachweis der für Sichelzell-Anämie verantwortlichen Punktmutation. Derartige Verfahren zum Nachweis von Sequenzvarianten, Polymorphismen und vor allem Punktmutationen erfordern insbesondere dann eine allelspezifische Amplifikation, wenn sich die nachzuweisende Sequenzvariante im Unterschuss verglichen mit einer im Überschuss vorhandenen Variante desselben Nukleinsäu- reabschnitts (bzw. desselben Gens) befindet. Eine derartige Situation ist beispielsweise dann gegeben, wenn mit Hilfe von allelspezifischer Amplifikation disseminierte Tumorzellen in Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum oder Plasma nachgewiesen werden sollen (vgl. US-Patent 5,496,699). Zu diesem Zweck wird zunächst DNA aus Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum oder Plasma isoliert, wel- che sich aus einem Unterschuss von DNA aus disseminierten Tumorzellen sowie einem Überschuss an DNA aus nicht proliferierenden Zellen zusammensetzt. Die für die tumorale DNA signifikanten Mutationen im k-ras Gen müssen somit aufgrund von wenigen Kopien tumoraler DNA in Gegenwart eines Überschusses an Wildtyp-DNA nachgewiesen werden.
In diesen Methoden der allelspezifischen Amplifikation (ASA) werden Nukleotidva- riationen durch die An- und Abwesenheit von DNA-Produkt nach der PCR Amplifikation bestimmt. Das Prinzip dieser ASA basiert auf der Ausbildung von kanonischen oder nicht-kanonischen Primer-Templat-Komplexen am Ende von allelspe- zifischen Primersonden. An einem korrekt gepaarten 3'-Primerende kann die Amplifikation durch eine DNA-Polymerase stattfinden, bei fehlgepaartem Prime- rende hingegen sollte die Verlängerung gehemmt sein. Jedoch weist diese Methode aufgrund der geringen Fehlpaarungsdiskriminierung von im Stand der Technik bekannten Enzymen unter typischen Bedingungen der PCR nur eine ge- ringe Selektivität auf, die weitere aufwendige und damit zeit- und kostenintensive Optimierungsschritte bedingt. Neuerungen, die eine Erhöhung der Selektivität der allelspezifischen PCR-Amplifikation bewirken, sollten einen signifikanten Einfluss auf Verlässlichkeit und Robustheit der direkten SNP-Analyse durch die PCR haben. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine DNA- Polymerase mit erhöhter Fehlpaarungsdiskriminierung und damit einer erhöhten Selektivität bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.
Insbesondere wird erfindungsgemäß eine DNA-Polymerase bereitgestellt, welche sich durch mindestens eine Mutation in der Aminosäure-Sequenz von ihrer WiId- typ-Variante unterscheidet und im Vergleich zur Wildtyp-Variante eine erhöhte Fehlpaarungsdiskriminierung aufweist.
Der Begriff "DNA-Polymerase" umfasst erfindungsgemäß alle DNA-Polymerasen, welche in einer Amplifikationsreaktion, wie beispielsweise allgemein in der PCR oder der allelspezifischen Amplifikation, eingesetzt werden können. Zur Verwendung einer DNA-Polymerase beispielsweise in der PCR, weist die DNA- Polymerase vorzugsweise eine Thermostabilität innerhalb des in der PCR verwendeten Temperaturbereichs auf.
Die DNA-Polymerase der vorliegenden Verbindung weist gemäß einer spezifischen Ausführungsform das hoch konservierte Motiv C (vgl. "Motif C" in Delarue et al., 1990, Protein Engineering 3(6), 461-467) oder das hoch konservierte Motiv KKRYAV (vgl. "Motif KKRYAV" in Braithwaite, D. K.; Ito, J., 1993, NAR 21 (4), 787- 802) oder eine Kombination davon auf.
Die Begriffe "Amplifikation" bzw. "Amplifikationsreaktion" bezeichnen in diesem Zusammenhang insbesondere die Replikation bzw. Vervielfältigung einer Nukleinsäure wie beispielsweise DNA oder RNA. Desweiteren schließt die vorliegende Erfindung alle funktionell aktiven Derivate der vorstehend definierten DNA- Polymerase ein, d.h. auch solche Derivate, die geringfügige Änderungen in der Aminosäuresequenz aufweisen,, welche keine wesentliche Auswirkung auf die Funktion der DNA-Polymerase haben. Die vorliegende Erfindung umfasst in diesem Zusammenhang auch solche DNA- Polymerasen, deren Aminosäurekette entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in der erfindungsgemäßen DNA- Polymerase vorkommen, wie beispielsweise an dem Peptid-Rückgrat, an den Aminosäure-Seitenketten oder am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten, Cyclisierungen, Disulfid- brückenbindungen, Methylierungen und Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Glycolysierungen, Hydroxylierungen, Phosphorylierungen und tRNA-vermittelte Addition von Aminosäuren. Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase kann als individuelles Protein oder als Teil eines größeren Proteins, z.B. eines Fusionsproteins vorliegen. Desweiteren kann sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung und/oder Isolierung ermöglichen, wie mehrfache Histidin- Reste, oder eine einfache Detektion ermöglichen, wie beispielsweise Fluoreszenzoder radioaktive Marker enthalten.
Der Begriff "Fehlpaarungsdiskriminierung", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Selektivität bzw. eine Erkennung gegenüber einer Basenfehlpaarung in einer Nukleinsäure sowie gegenüber dem Einbau von fehlgepaarten bzw. nicht kanonischen Nukleotiden.
Der Begriff "Mutation" umfasst erfindungsgemäß jede Veränderung einer Aminosäuresequenz der Wildtyp-Variante der vorstehend definierten DNA- Polymerase wie beispielsweise Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen von Aminosäuren.
Weiterhin unterliegen diese, durch Addition hinzugefügten oder durch Substitution ersetzenden Aminosäuren keiner besonderen Einschränkung und umfassen ne- ben allen natürliche Aminosäuren auch nicht-natürliche Aminosäuren wie beispielsweise D-Aminosäuren oder Aminosäuren mit modifizierten Seitenketten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Mutation der vorstehend definierten DNA-Polymerase die Substitution mindestens einer Aminosäure durch eine hydrophobere Aminosäure.
Der Begriff "hydrophobere Aminosäure" beschreibt hierin eine Aminosäure mit einer größeren Hydrophobizität als die der zu ersetzenden Aminosäure und gibt somit keine absolute, sondern eine relative Größe an. Die Hydrophobizität einer Aminosäure ist eine dem Fachmann allgemein bekannte Größe, die jedoch mit Faktoren wie beispielsweise dem pH-Wert variieren kann.
Ohne hierauf einzuschränken, gibt die folgende Tabelle 1 eine grobe Einteilung der natürlichen Aminosäuren nach ihrer Hydrophobizität an.
Tabelle 1
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindungum- fasst die Mutation den Austausch eines Lysin-Rests (Lys) gegen einen Methionin- Rest (Met) und/oder eines Asparagin-Rests (Asp) gegen einen Leucin-Rest (Leu).
Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase bzw. ihre Wildtyp-Variante unterliegt hinsichtlich ihrer Herkunft keiner besonderen Einschränkung, sondern kann aus jedem beliebigen Organismus stammen, wie beispielsweise aus Säugern, Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen. Vorzugsweise leitet sich die DNA-Polymerase von bakteriellen DNA-Polymerasen wie Polymerasen von E. coli, Thermus aqua- ticus, Aquifex, Boήelia, Bacillus, Chlamydia.Chlamydophila, Chloroflexus, Haemo- philis, Heliobacter, Lacococcυs, Methylobakterium, Myocobakteriυm, Rohodo- thermus, Rickettsie, Streptococcus, Streptomyces, Syncechocysts, Treponema, insbesondere Polymerasen thermostabiler Organismen wie Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus fliformis, Rhodothermus obamensis, Bacillus sie- arothermophilus, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus wosei, Thermococcus litoralis, Pyrococcus species, Thermococcus kodakaraensis ab.
Die Wildtyp-Variante der vorstehend definierten DNA-Polymerase kann ebenso einer dem Fachmann bekannten DNA-Polymerase aus der Sequenzfamilie B entsprechen und beispielsweise aus Mikroorganismen wie Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus spec, Thermococcus litoralis (Vent), phi29, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus wosei, Thermococcus litoralis, Pyrococcus species, Thermo- coccus kodakaraensis stammen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt die Wildtyp- Variante der vorstehend definierten DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus (Pfu) und weist eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Aminosäure-Sequenz der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase im Vergleich zur ihrer vorstehend definierten, aus Pyrococcus furiosus stammenden Wildtyp-Variante, die Mutation D541 L oder K593M oder die Kombination davon auf.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die vorstehend definierte DNA-Polymerase eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 auf. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Aminosäure- Sequenz der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase im Vergleich zu ihrer Wildtyp- Variante mindestens eine Mutation in Motif C oder in Motif KKRYAV auf.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegen sämtliche Mutationen in Motif C und/oder in Motif KKRYAV.
Gemäß einer spezifischen Ausführungsform liegt mindestens eine Mutation in Motif C und mindestens eine Mutation in Motif KKRYAV.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die vorstehend definierte, aus Pyrococcus furiosus stammende Wildtyp-Variante der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase eine Nukleinsäure auf, die eine Nukleotidse- quenz gemäß SEQ ID NO: 3 umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für die erfindungsgemäß definierte DNA-Polymerase kodiert.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform weist die vorstehend definierte Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 4 auf.
Desweiteren wird erfindungsgemäß ein Vektor, enthaltend die vorstehend definierte Nukleinsäure, bereitgestellt. Der erfindungsgemäße Vektor unterliegt keiner besonderen Einschränkung, wobei geeignete Vektoren im Stand der Technik bekannt sind. Der Vektor ist vorzugsweise zur Expression und/oder Amplifikation in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle befähigt. Dazu enthält der Vektor vorzugsweise geeignete regulatorische Elemente, wie Promotoren, Enhancer, Terminations-Sequenzen usw. Der Vektor kann auch zur stabilen Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das genetische Material einer Wirtszelle verwendet werden. Beispiele geeigneter Vektoren sind pET15b, pET21 b, pTTQ18, pASK-IBA37plus und pET30 Xa Lic. Der hierin verwendete Ausdruck "Wirtszelle" unterliegt keiner besonderen Einschränkung und umfasst sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Zellen, welche zur Produktion heterologer Proteine geeignet und im Stand der Technik bekannt sind. Dies sind beispielsweise Säugerzellen, tierische Zellen Pflanzen- zellen oder Zellen von Mikroorganismen. Die erfindungsgemäße Wirtszelle ist vorzugsweise eine Zelle welche von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, wie beispielsweise sowohl prokaryontische Zellen, wie E. coli (insbesondere E. coli XM- blue, DH5α, B121 (DE3), M15 [pREP4], SG13005 [pREP4], BL21 (DE3)pLysS), Halomonas elongata, Caulobacter sp. Halobacteriumhalobium, als auch eu- karyontische Zellen, wie Hefe- und andere Pilzzellen, pflanzliche und tierische Zellen, einschliesslich isolierter menschlicher Zellen, die sich in Zellkultur befinden. Des Weiteren werden unter dem Begriff "Wirtszelle" auch Zellextrakte verstanden, die bei Vorlage einer mRNA diese translatieren können, wie Weizenkeimextrakt als auch Kaninchen-Reticulocytenextrakt. Weiterhin werden hier auch in vitro Expressionssysteme als "Wirtszelle" verstanden, wie z. B. das T7 Expression System pBAD Expression System, ThioFusion" Expression Systems, trc Expression System, PL Expression System, PurePro Caulobacter Expression System, Microbiological Media and Media Components, Qiagen pQE Expression System und das Novagen pET Expression System.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase, umfassend die Schritte
(a) des Bereitsteilens einer wie vorstehend definierten Wirtszelle,
(b) des Züchtens der Wirtszelle in einem geeigneten Medium und (c) des Isolierens der DNA-Polymerase.
Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase wird vorzugsweise durch Expression mit Hilfe geeigneter Expressionsysteme, vorzugsweise als sezemiertes Produkt se- lektionierbarer stabiler Transfektanden der Zelllinie E. coli BL21 (DE3) pLysS, hergestellt. Die vorliegende Erfindung schließt alle im Stand der Technik bekannten Techniken zum Züchten von Zellen ein. Ebenso unterliegt der hierin verwendete Begriff "Isolieren" keiner besonderen Einschränkung und beinhaltet alle dem Fachmann bekannten Techniken zum Isolieren rekombinant hergestellter Peptide, Proteine und Nukleinsäuren, wie beispielsweise Elektrophorese, Gelfiltration, Microfiltration, Microdiafiltration, Dialyse, chromatographische Verfahren, Zentrifugation usw.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der vorstehend definierten DNA-Polymerase in einem diagnostischen oder molekular- biologischen Verfahren. Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst dieses Verfahren allelspezifische PCR, DNA-Amplifikation oder Klonierung.
Desweiteren kann die erfindungsgemäße DNA-Polymerase als hochselektives Enzym zur (Standard-)PCR-Amplifikation von z.B. Genen oder Genfragmenten und gegebenenfalls zu deren anschließenden Klonierung verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation von einer oder mehreren Nukleinsäure-Fehlpaarungen, welches die vorstehend definierte Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Verwendung in einem der vorstehend definierten Verfahren, enthaltend die erfindungs- gemäße DNA-Polymerase oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure.
Das vorstehend definierte Kit unterliegt jedoch bezüglich der möglichen Verwendung keiner besonderen Einschränkung und kann in allen Verfahren verwendet werden, in denen die erfindungsgemäße DNA-Polymerase einen Effekt aufweist. Desweiteren kann das vorstehend definierte Kit neben der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase auch andere Substanzen, wie beispielsweise Puffer, Indikatoren, Salze, weitere Enzyme, proteinartige Verbindungen oder Hilfsstoffe enthalten. Aufgrund der im Vergleich zur Wildtyp-Variante mindestens einen enthaltenen Mutation in der Aminosäure-Sequenz der vorstehend definierten DNA-Polymerase weist diese eine überraschend erhöhte Fehlpaarungsdiskriminierung auf. Diese Erhöhung der Selektivität der Aktivität der DNA-Polymerase ermöglicht auf vorteil- hafte Weise die Entwicklung verlässlicher Systeme zum Nachweis von Mutationen oder Polymorphismen in einer Zielnukleinsäure. Desweiteren ermöglicht die vorstehend definierte DNA-Polymerase eine besonders vorteilhafte Diagnose beispielsweise direkt durch allelspezifische PCR ohne die Notwendigkeit von nachgeschalteten zeit- und kostenintensiven Aufreinigungs- oder Analyseverfahren.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 : Proteinsequenz von Pyrococcus furiosυs (Pfu) wildtype exo-
Fig. 2: Proteinsequenz der Mutante Pfu D541 L/K593M exo-
Fig. 3: Nukleotidsequenz von Pfu wildtype exo-
Fiq. 4: Nukleotidsequenz der Mutante D541L/K593M exo-
Fig. 5: SDS-PAGE der gereinigten Pfu DNA Polymerasen - Coomassie Blau gefärbt. Es wurde 40 fmol Polymerase aufgetragen. Von links nach rechts: Marker (M), Pfu wt exo- (wt exo-), Pfu Mutante D541 L/K593M exo- (D541 L/K593M exo-). Die Proteine sind zu >95% rein.
Fig. 6: Agarose (0,8%) gelelektrophoretische Überprüfung der PCR Experimente - von links nach rechts: Marker (M); Pfu wt exo- (wt), Mutante D541 L/K593M exo- (D541 L/K593M). PCR-Protokoll: Initial- denaturierung 95 0C, 2 min., dann 25 Zyklen von 95 0C, 1 min., 55 0C, 1 min., 72 0C, 3 min. Templat pETPfu wt exo-, 10 ng. Fiq. 7: Echtzeit PCR Experimente mit gleicher Polymerasekonzentration und Polymeraseaktivität - von links nach rechts: Pfu wt exo- 20 nM (A), Mutante D541 L/K593M exo- 2O nM, gestrichelte Linien (B), Mutante D541 L/K593M exo- 4O nM, gestrichelte Linien (C). Schwarze Linien - Korrekt gepaarter Primer/Templat Komplex. Graue Linien: Fehlgepaarter Primer/Templat Komplex. PCR-Protokoll: Initialdenaturierung 95 0C, 3 min., dann Zyklen von 95 0C, 30 s, 56 0C, 35 s, 72 0C, 40 s. Template FarA und FarG jeweils 40 pM, 0,5 μM von jedem Primer, 200 μM dNTPs und 0,4x SybrGreen. Die realtime PCR Experimente wurden in einem Biorad iCycler durchgeführt.
Fig. 8: Primer Verlängerungsreaktion - Marker (-); Pfu wt exo- (wt exo-), Mutante D541 L/K593M exo- (D541 L/K593M exo-). Jeweils 150 nM Enzym, 200 μM dNTPs, 150 nM Primer/Templat, Reaktionszeit 30 min.
Fig. 9: Primer Verlängerungsreaktion zur Detektion entfernter Fehlpaarungen - Marker (-); Pfu wt exo- (wt exo-), Mutante D541 L/K593M exo- (D541L/K593M exo-). Jeweils 150 nM Enzym, 200 μM dNTPs, 150 nM Primer/Templat, Reaktionszeit 30 min.
Fig. 10: Proteinsequenz der Pfu DNA-Polymerase mit den darin markierten hoch konservierten Motiven Motif C (vgl. Delarue et al., 1990, Protein Engineering 3(6), 461-467) und Motif KKRYAV (vgl. Braithwaite, D. K.; Ito, J., 1993, NAR 21(4), 787-802).
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1 : Expression und Proteinreiniqunq
Die Expression der Pfu DNA Polymerasen (in pETPfu exo-) wird in E. coli BL21 (DE3) pLysS durchgeführt. Expressionskulturen (LB-Medium mit 34 ng/μl Ka- namycin, 34 ng/μl Chloramphenicol) werden 2%ig mit einer Übernachtkultur, die bei 30 0C inkubiert wird, angeimpft. Die Induktion erfolgt bei einer OD6oo = 0,5 mit 1 mM IPTG. Nach 4 h Expression werden die Kulturen bei 5300 x g für 30 min. abzentrifugiert.
Die Zellpellets werden in Lysepuffer (1O mM Tris-HCI pH 9,55, 30O mM NaCI, 0,1% Triton-X100, 1 mM Benzamidin, 1 mM PMSF v Pefabloc, 1 mg/ml Lysozym; 5 ml Lysis-Puffer/ 50 ml Kultur) resuspendiert und bei 37 0C für 10 min. lysiert. E. coli Proteine werden durch Hitzedenatuerierung bei 75 0C für 45 min. mit nachfol- gender Zentrifugation bei 25000 x g für 30 min. bei 4 0C entfernt.
Der verbleibende Überstand wird dann durch NTA-Affinitätschromatographie (Batch-Methode) weiter gereinigt.
Die zentrifugierten Expressionslysate (in 10 mM Tris-HCI pH 9,55, 300 mM NaCI, 0,1% Triton-X100) werden mit NTA-Matrix (Qiagen, 2 - 3 ml slurry/ 20 ml Lysat) für 20 min. bei 4 0C in einem Überkopfschüttler inkubiert. Die NTA-Matrix wird dann zweifach mit NTA-Waschpuffer (10 mM Tris-HCI pH 8,1 , 100 mM NaCI, 0,1 % Tri- ton-X100, 2O mM Imidazol) gewaschen und das Protein zweimal mit NTA- Elutionspuffer (10 mM Tris-HCI pH 8,1 , 100 mM NaCI, 0,1 % Triton-X100, 150 mM Imidazol) eluiert.
Die erhaltenen Proteinlösungen werden über eine Sephacryl S-300 High Resolution (Amersham) Säule, voräquilibriert mit 150 mM Tris-HCI pH 8,2, 0,3 mM EDTA, gereinigt um den Puffer zu tauschen, Imidazol zu entfernen und restliche Proteinverunreinigungen zu entfernen.
Die Fraktionen, die Pfu DNA-Polymerase enthalten werden gesammelt und über eine VIVASPIN 20 50000 MWCO PES 20 x konzentriert.
Nach der Konzentration der Polymerasen, wird jeweils 1 Vol. Proteinlösung (in 150 mM Tris-HCI pH 8,2, 0,3 mM EDTA) mit 2 Vol. 75% Glycerol, 1 ,5 mM DTT, 0,075% CHAPS auf 50 mM Tris-HCI pH 8,2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,05% CHAPS, 50% Glycerol verdünnt.
Die gereinigten DNA-Polymerasen (Wildtyp-Variante (wt) und Mutante D541 L/K593M) wurden in Pfu-Lagerpuffer (5O mM Tris-HCI pH 8,2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,05% CHAPS, 50% Glycerol) gelagert und waren >95% rein, was durch SDS-PAGE (Fig. 5) überprüft wurde. Proteinkonzentrationen wurden durch einen Bradford-Test (Roth) mit einer BSA-Standardkurve (PIERCE Albumin Standard) bestimmt.
Beispiel 2: PCR
Zunächst wurde die PCR-Aktivität der jeweiligen DNA-Polymerasen (Wildtyp- Variante (wt) und Mutante D541 L/K593M) untersucht:
Das Reaktionsvolumen beträgt 50 μl mit 10 ng Templat (pETPfu wt exo-) in Pfu DNA Polymerasepuffer (20 mM Tris-HCI (pH 8,8 bei 25 0C), 2 mM MgSO4, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 0.1 % (v/v) Triton-X100, 0,1 mg/ml BSA). Die Reaktionen enthalten 15O nM des entsprechenden Enzyms, dNTPs (200 μM von dATP, dGTP, dCTP, und TTP) und Primer (jeweils 0,5 μM). Alle PCR Experimente werden in einem Biometra Thermocycler durchgeführt.
DNA Sequenzen:
Primer 1 5'-GGT ATT GAG GGT CGC ATG ATT TTA GAT GTG GAT TAC ATA ACT G-31 (SEQ ID NO: 5)
Primer 2 5'-AGA GGA GAG TTA GAG CC CTA GGA TTT TTT AAT GTT AAG CCA GGA AG-3" (SEQ ID NO: 6) Templat: pETPfu
Wie aus Fig. 6 ersichtlich ist, war das Wildtyp-Enzym in der Lage, DNA zu amplifi- zieren. Es stellte sich heraus, dass die Mutante D541 L/K593M ebenfalls PCR- aktiv ist. Beispiel 3: Echtzeit PCR Experimente
Alle Echtzeit PCR Experimente werden in einem iCycler System (BIORAD) durchgeführt. Das Reaktionsvolumen beträgt 20 μl mit 40 pM Templat in Pfu DNA Po- lymerasepuffer (2O mM Tris-HCI (pH 8.8 bei 25 0C), 2 mM MgSO4, 1O mM (NH-O2SO4, 10 mM KCl, 0,1 % (v/v) Triton-X100, 0,1 mg/ml BSA). Die Reaktionen enthalten 20 nM Wildtyp, Mutante und 40 nM Mutante für gleiche Aktivität, dNTPs (200 μM von dATP, dGTP, dCTP, und TTP), Primer (jeweils 0,5 μM) und 0,4 x SybrGreen I (Molecular Probes). Die PCR Amplifikationen werden nach folgen- dem Programm durchgeführt: Initialdenaturierung bei 95 0C für 3 min, gefolgt durch 20 Zyklen Denaturierung bei 95 0C für 30 s, Primeranlagerung bei 55 0C für 35 s und Extension bei 72 0C für 40 s. Alle gezeigten Daten gehen aus drei unabhängigen Experimenten hervor.
DNA Sequenzen. Primer FarT: 5'-d(CGT TGG TCC TGA AGG AGG AT) (SEQ ID NO: 7), reverse primer: 5'-d(CGC GCA GCA CGC GCC GCC GT) (SEQ ID NO: 8). Zieltemplat FarX: 5'-d(CCG TCA GCT GTG CCG TCG CGC AGC ACG CGC CGC CGT GGA CAG AGG ACT GCA GAA AAT CAA CCT XTC CTC CTT CAG GAC CAA CGT ACA GAG) (SEQ ID NO: 9); X: A, FarA; G, FarG;
Das Ergebnis der Echtzeit-PCR-Experimente wird in Fig. 7 gezeigt. Dabei ist deutlich zu erkennen, dass die Wildtyp-Variante der Pfu DNA-Polymerase nicht zwischen korrekter Basenpaarung und Basenfehlpaarung unterscheidet, sondern in beiden Fällen das PCR-Produkt mit einer vergleichbaren Amplifikationsrate her- stellt (vgl. Fig. 7A). Im Gegensatz dazu ist die Amplifikationseffizienz bei Verwendung der Mutante D541 L/K593M (vgl. Fig. 7B (20 nM) und 7C (40 nm)) bei Anwesenheit einer Fehlpaarung stark herabgesetzt. Beispiel 4: Primer-Verlänqerunqsexperimente
Für das Aneinanderlagem von Primer und Templat werden 150 nM 5'-32P markierter Primer und Templat in Pfu Reaktionspuffer (20 mM Tris-HCI pH 8.8, 10 mM (NhU)2SO4, 1 O mM KCl , 0,1 % Triton-X100, 0,1 mg/ml BSA, 2 mM MgSO4) gemischt und nach Erhitzen für 5 min. auf 95 0C in einem Thermoschüttler (Eppendorf) auf 20 0C innerhalb von 30 min. abgekühlt. Nach der Anlagerung werden die Reaktion durch Zugabe von dNTPs (in 1x Reaktionspuffer) gestartet. Die Reaktionen werden bei 68 0C für entsprechende Zeiträume ((a)- (d)) inkubiert. (a) 30 Minuten für die qualitative Primerverlängerungsreaktion (100 μM dNTPs, jeweils 150 nM Enzym)
(b) für die Detektion entfernter Fehlpaarungen 30 Minuten, mit 200 μM dATP und 22.5 nM Enzym.
Nach der Inkubation werden die Reaktionen durch Zugabe von 2 Vol. GeI- Ladepuffer (80% formamide, EDTA (20 mM) gestoppt und durch denaturierende PAGE (12%) untersucht und autoradiographisch ausgewertet.
DNA Sequenzen:
FT20H δ'-CGTTGGTCCTGAAGGAGGAT-S' (SEQ ID NO: 10) F33A 5'-TTTAGTTGGACAGAAGGAAGTCCTGGTTGCATG-3■ (SEQ ID NO: 11 ) F33G 5'-TTTAGTTGGACAGGAGGAAGTCCTGGTTGCATG-S' (SEQ ID NO: 12)
Die Untersuchungen ergaben, dass das Wildtyp-Enzym in der Lage ist, von korrekt gepaarten und fehlgepaarten Primern zu verlängern, wenngleich mit vermin- derter Aktivität im Vergleich zum kanonisch gepaartem Primer/Templat (vgl. Fig. 8). Im Gegensatz dazu zeigt die Mutante D541 L/K593M eine wesentlich höhere Diskriminierung bezüglich einem kanonisch bzw. nicht-kanonisch gepaartem Primer/Templat als die Wildtyp-Variante (vgl. Fig. 9) und ermöglicht so die überraschend effiziente Detektion einer Fehlpaarung.

Claims

Ansprüche
1. DNA-Polymerase, welche sich durch mindestens eine Mutation in der Aminosäure-Sequenz von ihrer Wildtyp-Variante unterscheidet und im Vergleich zur Wildtyp-Variante eine erhöhte Fehlpaarungsdiskriminierung aufweist.
2. DNA-Polymerase nach Anspruch 1 , wobei die Mutation die Substitution mindestens einer Aminosäure durch eine hydrophobere Aminosäure umfasst.
3. DNA-Polmerase nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mutation die Substitution eines Lysin-Rests gegen einen Methionin-Rest und/oder eines Asparagin- Rests gegen einen Leucin-Rest umfasst.
4. DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Wildtyp- Variante aus Pyrococcus furiosus stammt und eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 aufweist.
5. DNA-Polymerase nach Anspruch 4, wobei die Aminosäure-Sequenz im Vergleich zur Wildtyp-Variante die Mutation D541 L oder K593M oder die Kom- bination davon aufweist.
6. DNA-Polymerase nach Anspruch 5 mit einer Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2.
7. Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für die DNA- Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert.
8. Nukleinsäure nach Anspruch 7, mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 4.
9. Vektor, enthaltend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 7 oder 8.
10. Wirtszelle, enthaltend den Vektor nach Anspruch 9 oder die Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8.
11. Verfahren zur Herstellung einer DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend die Schritte
(a) des Bereitsteilens einer Wirtszelle nach Anspruch 10,
(b) des Züchtens der Wirtszelle in einem geeigneten Medium und
(c) des Isolierens der DNA-Polymerase.
12. Verwendung der DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in einem diagnostischen oder molekularbiologischen Verfahren.
13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Verfahren allelspezifische PCR, DNA-Amplifikation oder Klonierung umfasst.
14. Verfahren zur Identifikation von einer oder mehreren Nukleinsäure- Fehlpaarungen, welches die Verwendung der DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst.
15. Kit zur Verwendung in einem gemäß der in den Ansprüchen 12 bis 14 genannten Verfahren, enthaltend die DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
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