JP3404716B2 - 耐熱性が向上し、かつ、プライマーエクステンションの長さと効率が向上したｄｎａポリメラーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、ＤＮＡポリメラ
ーゼに、より詳細には、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉ
ｃｕｓ及びＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメ
ラーゼの新規の突然変異であって現在知られるあらゆる
形のこれらの酵素よりも向上した耐熱性（熱安定性）を
呈するものに関するものである。また、この発明は、こ
のようなＤＮＡポリメラーゼをコード化する組換えＤＮ
Ａ配列と、これら組換えＤＮＡ配列の発現に適したベク
タープラスミド及び宿主細胞とに関するものである。さ
らに、この発明は、本願発明のＤＮＡポリメラーゼ及び
他のＤＮＡポリメラーゼの新規の配合（ｆｏｒｍｕｌａ
ｔｉｏｎ）に関するものである。この酵素配合は、非常
に長くかつ信頼性の高い生成物のＰＣＲ（ポリメラーゼ
連鎖反応）による増幅に対して効果的に触媒作用を及ぼ
すことが出来る。

【０００２】

【従来の技術】温泉細菌のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔ
ｉｃｕｓから得られるＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ）は、耐熱性であるため、ＤＮＡの増
幅、ＤＮＡ配列決定及び関連するＤＮＡプライマーエク
ステンション技術において、かなり有用であることが立
証されている。ここで、耐熱性であるとは、不可逆的に
変性せずに長時間９５℃に達する温度に耐えうる能力、
及びＤＮＡを高温（６０〜７５℃）で重合（ｐｏｌｙｍ
ｅｒｉｚｅ）する能力を備えていることと定義する。

【０００３】ローヤー（Ｌａｗｙｅｒ）氏他、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４：６４２７（１９８９年）に
記載された、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０４６３９の、
ＤＮＡ及びアミノ酸配列は、遺伝子コード化Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ及び酵素
Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラー
ゼを、本願でそれらの用語を使用しているように定義し
ている。

【０００４】これと密接に関連する細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｆｌａｖｕｓにより発現する、非常によく似たＤＮＡ
ポリメラーゼ（ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ）は、アクメ
チヤノフ（Ａｋｈｍｅｔｚｊａｎｏｖ， Ａ．Ａ．）氏
及びヴァクヒトフ（Ｖａｋｈｉｔｏｖ，Ｖ．Ａ．）氏、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２
０：５８３９（１９９２年）に記載された、ＧｅｎＢａ
ｎｋ受入番号Ｘ６６１０５の、ＤＮＡ及びアミノ酸配列
により定義されている。これらの酵素も、耐熱性であ
る、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡ
ポリメラーゼをも含む１種のＤＮＡポリメラーゼ族を表
している。これらの酵素には、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリ
メラーゼＩ、及びファージＴ７、Ｔ３、及びＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼにおける校正（ｅ
ｄｉｔｔｉｎｇ）を行う目的に対して有効であるような
３’−エキソヌクレアーゼ活性が欠けている。

【０００５】ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）氏他によ
る米国特許第４８８９８１８号には、野生型（ここでは
ＷＴの略号を用いる）の自然のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕ
ａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼが記載されている。ゲ
ルファンド氏他による米国特許第５０７９３５２号に
は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメ
ラーゼのＮ−末端２８９アミノ酸が消去されたＴｈｅｒ
ｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの突然
変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）をコード化する組換え
ＤＮＡ配列（米国特許第５０７９３５２号のクレーム
３、商品名Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、ここで
はＳＴの略号を用いる）と、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔ
ｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端３アミノ酸が消
去されたＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポ
リメラーゼの突然変異タンパク質をコード化する組換え
ＤＮＡ配列（米国特許第５０７９３５２号のクレーム
４、商標名ＡｍｐｌｉＴａｑ、ここではＡＴの略号を用
いる）とが記載されている。これらの突然変異タンパク
質はＤＮＡポリメラーゼの検定において「十分に活性」
であることがゲルファンド氏他により報告されている
が、その最大耐熱性に関するデータは示されていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかし、Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの他の酵素
活性の突然変異タンパク質誘導体の開発については、何
らかの特殊な修飾がこのタンパク質の構造的及び機能的
特性に対して及ぼす影響を予測できないため進んでいな
い。発現を行うためにＤＮＡ及び酵素を修飾する場合に
は、折り畳みパタン（ｆｏｌｄｉｎｇ ｐａｔｔｅｒ
ｎ）及び臨界結合（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｂｏｎｄｉｎ
ｇ）の起こりうる分裂（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｒ
ｕｐｔｉｏｎ）を含む多くの因子を考慮しなくてはなら
ない。高温Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡ
ポリメラーゼのＮ−末端欠失突然変異タンパク質の発生
に関する重大な問題として、高温度範囲において新しい
タンパク質のアミノ末端が著しく不秩序となり、そのた
めにタンパク質の（１又は複数の）触媒領域との好まし
くない相互作用が生じて変性が起こるという予測があ
る。

【０００７】実際、ＤＮＡポリメラーゼの識別可能領域
が損なわれずに残っていると思われる幾つかの欠失体
（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）が構成されたが、これらの欠失体
はいずれも９９℃もの高温度における耐熱性を持たな
い。Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメ
ラーゼは、他のＤＮＡポリメラーゼが呈するよりもずっ
と高い温度での顕著な耐熱性を示すが、９５〜９７℃よ
りも高い温度にさらされると酵素活性を失う。更に、そ
の７２℃（ＤＮＡ合成を行うに好ましい温度）における
忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）は、約１／９０００ｂｐの
有効エラー率に限定される。

【０００８】ゲルファンド氏他のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑ
ｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの突然変異タンパク
質ＳＴ（Ｎ−末端２８９ａ．ａ．欠失を有するもの）は
ＡＴよりもずっと安定であるが、ＰＣＲサイクルの変性
段階期間中に、９８℃にサイクルするとＳＴが呈する活
性は非常に低下し、９９℃にサイクルすると活性があっ
たとしてもさらに小さなものとなる。

【０００９】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤ
ＮＡスパンの増幅は、触媒用に耐熱性ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼが導入されて以来遺伝分析の重要な手法として
普及した。ＰＣＲの先行技術の方法には、最終生成物の
忠実度と増幅することができる生成物スパンのサイズと
いう２つの制限要素がある。忠実度の問題は、突然変異
／ｂｐ／サイクルを約１０^-4から約１０^-5に減少させる
ことが明らかである一体型（ｉｎｔｅｇｒａｌ）３’−
（校正）エキソヌクレアーゼを与えるＰｆｕ（Ｐｙｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ
をＴａｑＤＮＡポリメラーゼの代わりに使うことによっ
て部分的に処理されている。

【００１０】しかし、実験によれば、この酵素は、Ｋｌ
ｅｎｔａｑ−２７８（Ｋｌｅｎｔａｑ１としても知られ
ている）（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端欠失
体、ＷＭＢ未公開）又はＡｍｐｌｉＴａｑ（無欠損（ｆ
ｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、参
考文献３）が容易に増幅できる１．５〜２ｋｂのサイズ
の範囲の所定のＤＮＡ配列を増幅することができず、ま
た、Ｐｆｕは、あらゆる形体のＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼと同様にしか５〜７ｋｂを超えるＤＮＡ生成物スパン
を増幅することが出来ない（即ち増幅不可能である）と
いうことが分かっている。

【００１１】無欠損ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及びＮ−
末端切断変異体Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８、Ｋｌｅｎｔａ
ｑ５及びＳｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔについて、
標的のスパンの長さが５〜６ｋｂを超えると、ＰＣＲ増
幅が急速に効果を失ったり、存在しなくなったりするこ
とが明らかである。このことは、各サイクルの伸長（エ
クステンション）ステップ期間に３０分が費やされても
起こった。

【００１２】非能率的ではあるが検出可能である、９〜
１０ｋｂの標的の長さでの増幅及び１５ｋｂのものでの
増幅の報告が幾つかあるが、殆どの一般利用は５ｋｂの
ものに限定されている。

【００１３】カインツェ（Ｋａｉｎｚｅ）氏他（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２：４６−４９
（１９９２年））によれば、未公開の生物源の酵素
（「Ｈｏｔ Ｔｕｂ」ＤＮＡポリメラーゼとして市販さ
れている）を利用した、１０ｋｂよりも大きい、即ち、
１０．９ｋｂ及び１５．６ｋｂの生成物のＰＣＲ増幅が
報告されている。カインツェ氏他は、反応容量１００ｕ
ｌにつき１ｎｇのλＤＮＡ鋳型で開始して３０サイクル
後、１５．６ｋｂにかろうじて見えるバンドを得たこと
を報告している。この増幅効率の量的な計算は示されて
いないが、増幅効率は比較的低かったことが示されてい
る。カインツェ氏他によるＷＴＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕ
ａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼを１０〜１５ｋｂのサ
イズ範囲で機能させるという試みは成功ではなかった
し、他の誰かによってもこのサイズ範囲のＴｈｅｒｍｕ
ｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのいずれか
の形体に関する成功の結果は報告されていない。ＰＣＲ
により増幅可能な長いＤＮＡ生成物についての報告は全
く無いのである。

【００１４】９８°又は９９℃での耐熱性を保持するＤ
ＮＡポリメラーゼが存在すれば、「コロニーＰＣＲ」
（図５参照）を含む幾つかの状況においてより効率的で
便利なＤＮＡ分析を行うことが出来、及び／又は、酵素
活性の不活化なしに熱サイクラー（ｃｙｃｌｅｒ）のオ
ーバーシュートを許容することができるであろう。合成
に最適な温度に於けるＡＴ又はＷＴＴｈｅｒｍｕｓ ａ
ｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼに対する忠実度を
向上させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡポリメ
ラーゼ配合は、標的及び生成物のＤＮＡが単に検出され
るのではなくこれを発現させる使用分野において非常に
望ましいものである。

【００１５】６ｋｂを超えたＤＮＡスパンの効率的な増
幅を行うことが出来るＤＮＡポリメラーゼ配合は、ＰＣ
Ｒの使用分野の範囲を大きく広げるものとなろう。例え
ば、全プラスミド及び全プラスミドのサイズの構成体
は、問題とするＤＮＡの一部がＥ．ｃｏｌｉに導入され
るとき毒性であったり、プラスミド複製と両立しない場
合に特に有用なこの方法で調製することができる。同時
にこの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの調製によってＰＣＲ
増幅に対して忠実度が増加するならば、その結果得られ
る大きな生成物は非常に正確、活性であり、及び／また
は研究および種々の利用において、特に、増幅された配
列の発現に関する状況において有用なものとなろう。さ
らに、この耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの調製によって非
常に高い濃度の収率の純生成物が得られるならば、この
ことによって、ＰＣＲの方法を、所望のＤＮＡフラグメ
ントを大量に生成する手法として、プラスミド複製に換
えてより効率的に使用するところまで向上させることが
できるであろう。

【００１６】

【課題を解決するための手段】そのため、この発明の幾
つかの目的のうち、有意味的に９９℃の温度に繰り返し
さらしても耐えることが出来るＤＮＡポリメラーゼを提
供すること、標準的なＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃ
ｕｓＤＮＡポリメラーゼ伸長反応温度において利用する
際にＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメ
ラーゼよりも高い忠実度を呈する高耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼを提供すること、ＤＮＡ鋳型からの及びＤＮＡの
Ｅ．ｃｏｌｉ一本鎖（線形）増幅の単コロニーからのＰ
ＣＲ増幅技術、核酸の配列決定、ＤＮＡ制限消化フィリ
ング（ｄｉｇｅｓｔ ｆｉｌｌｉｎｇ）、ＤＮＡの標識
化、ｉｎ ｖｉｖｏフットプリント法（ｆｏｏｔｐｒｉ
ｎｔｉｎｇ）、及びプライマー指向性（ｐｒｉｍｅｒ−
ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発に有用であるようなＤ
ＮＡポリメラーゼの提供について述べる。この発明のさ
らに別の目的には、上記ＤＮＡポリメラーゼの発現用の
組換えＤＮＡ配列、ベクター及び宿主細胞の提供があ
る。

【００１７】さらなる目的としては、フレキシビリテ
ィ、特異性及び効率性をあまり犠牲にすることなく、特
に先行技術のＤＮＡポリメラーゼに比べて、かつ、いか
なる標的の長さについてもＰＣＲプロセスにより生じる
突然変異原性を減少させ、ＰＣＲの標的フラグメントの
収率をできるだけ高くすると同時にＰＣＲ生成物バンド
の強度と鮮鋭度を高める、少なくとも３５キロベースま
での長さを含む、従来の配合で可能なものよりも長い長
さをもつプライマーエクステンション生成物に効率的に
触媒作用を及ぼすことができるＤＮＡポリメラーゼの配
合の提供と、より長い長さの核酸配列を信頼性を持って
合成するために利用され、かつ、プライマーとしてＰＣ
Ｒ生成物を効果的に利用することが出来るＰＣＲによる
増幅のための改良型プロセスの提供がある。

【００１８】

【発明の実施の形態】従って、簡単に言えば、本願発明
は、ＷＴＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓのＮ−末
端２８０アミノ酸残基あるいはＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａ
ｖｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２７９アミノ酸を
除いて、実質的にＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ
又はＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼ
と同じアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するＤＮ
Ａポリメラーゼをコード化する新規の組換えＤＮＡ配列
に関するものである。

【００１９】さらに言えば、この発明は、Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ又はＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖ
ｕｓＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と実質的に同じ
であるが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡ
ポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸残基あるいはＴ
ｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−
末端２７９アミノ酸が欠けたものからなるアミノ酸配列
を有するＤＮＡポリメラーゼに関するものである。

【００２０】さらに実施例において、本願発明は、３’
−エキソヌクレアーゼ活性を持たない少なくとも１つの
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼからなる主成分と、３’−
（校正）エキソヌクレアーゼ活性を呈する少なくとも１
つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼからなる少量成分とを含
む耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの新規の配合に関係してい
る。

【００２１】また、本願発明は、野生型形体において
３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈しかつ温度サイクル
型ポリメラーゼ連鎖反応に触媒作用を及ぼすことが出来
る少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡポ
リメラーゼの配合であって、この少なくとも１つのＤＮ
Ａポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼ活性が、そ
の野生型形体における少なくとも１つのＤＮＡポリメラ
ーゼの３’−エキソヌクレアーゼ活性の約０．２％〜７
％の範囲にまで低減された配合に関するものである。

【００２２】別の点では、Ｅ１及びＥ２からなるＤＮＡ
ポリメラーゼの配合が提供されている。Ｅ１は有意味的
な３’−エキソヌクレアーゼ活性を全く持たない１つ又
はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼであり、Ｅ２は有意味
的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈する１つ又はそ
れ以上のＤＮＡポリメラーゼである。この与えられた混
合物については、Ｅ１のＥ２に対する相対ＤＮＡポリメ
ラーゼ単位比が少なくとも約４：１である。

【００２３】さらに、この発明は、上記した型のＤＮＡ
ポリメラーゼを配合することを含む、ＰＣＲによる核酸
配列の増幅を行うためのプロセスにおける改良に関する
ものである。これにより生じた配合は、ＰＣＲプロセス
中のプライマーエクステンションに触媒作用を及ぼすた
めに使用されるものであり、従って、効率的なＰＣＲ増
幅に使用できるサイズの範囲を拡大するものである。

【００２４】本願で検討されているようなＤＮＡポリメ
ラーゼは、通常、５’−エキソヌクレアーゼ、３’−エ
キソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端からＣ
−末端までの物理的順序において、酵素活性の３つまで
の識別可能及び分離可能領域から構成される。ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼは、３’−エキソヌクレアーゼを全く
有していなかったものであるが、この発明の最初の部分
は、その５’−エキソヌクレアーゼの欠失に関するもの
である。

【００２５】ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ等の他の上記し
たＤＮＡポリメラーゼは、５’−エキソヌクレアーゼを
有していないが、それらの３’−エキソヌクレアーゼ機
能は、ＤＮＡポリメラーゼＥ１（有意味的な３’−エキ
ソヌクレアーゼを持たないもの）及びＥ２（３’−エキ
ソヌクレアーゼを有するもの）の混合物に関するこの発
明の特徴について中核をなすものである。５’−エキソ
ヌクレアーゼの存在がこれらの混合物のＥ１またはＥ２
のいずれにおいてもこの発明の主要な利点にとって不可
欠であることは示されていない。他の目的及び特徴につ
いては、一部は明らかであり、一部は以下に示す。

【００２６】略号一覧 本願明細書で使用する列挙した略号を以下のように定義
する。略号 ｂｐ ＝ 塩基対 ｋｂ ＝ キロベース、１０００塩基対 ｎｔ ＝ ヌクレオチド ＢＭＥ ＝ ベータ−メルカプトエタノール ＰＰ_i ＝ ピロリン酸ナトリウム Ｐｆｕ ＝ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ Ｔａｑ ＝ Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ Ｔｆｌ ＝ Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ Ｔｌｉ ＝ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａ
ｌｉｓ Ｋｌｅｎｔａｑ−ｎｎｎ＝ コドンｎｎｎ＋１で開始さ
れる、Ｎ−末端が欠失したＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔ
ｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ。但し、開始コドン及びそ
の次のコドンは適当な制限サイト（ｓｉｔｅ）を生成す
るためのＤＮＡ配列の改変のためＷＴ配列に適合しない
場合がある。 ＷＴ ＝ 野生型（無欠損）または３ａａのみ欠失。 ａａ ＝ アミノ酸 ＳＴ ＝ Ｓｔｏｆｆｅｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｋｌ
ｅｎｔａｑ−２８８と呼ばれることもあるＴｈｅｒｍｕ
ｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端
欠失体 −ＬＡ ＝ Ｌｏｎｇ ａｎｄ Ａｃｃｕｒａｔｅ；少
なくとも１つは有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活
性を持たず、少なくとも１つは有意味的な３’−エキソ
ヌクレアーゼ活性を呈する２つのＤＮＡポリメラーゼの
不均衡な混合物 ＰＣＲ ＝（名詞） １． ポリメラーゼ連鎖反応 ２． １つの上記反応／増幅実験 （動詞） ３． ポリメラーゼ連鎖反応を介して増幅すること ｕｌ ＝ マイクロリッター ＡＴＣＣ ＝ アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ） メガプライマー（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ） ＝ 複数ス
テップ処理の後続ＰＣＲ段階においてプライマーとして
使用される二本鎖ＤＮＡ・ＰＣＲ生成物 Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＝ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ
−ＤからのＤＮＡポリメラーゼ； 精製酵素はＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から入手できる。 Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ^- ＝ ３’（校正）−エ
キソヌクレアーゼを持たない、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＤＮ
Ａポリメラーゼの突然変異体形体 Ｖｅｎｔ ＝ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒ
ａｌｉｓからのＤＮＡポリメラーゼ； 精製酵素はＮｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から入手でき
る。 Ｖｅｎｔ ｅｘｏ^- ＝ ３’（校正）−エキソヌクレ
アーゼを持たない、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼの突然
変異体形体 Ｐｆｕ ＝ ３’（校正）−エキソヌクレアーゼを持た
ない、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓからの
ＤＮＡポリメラーゼ； 精製酵素はＳｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手でき
る。 Ｐｆｕ ｅｘｏ^- ＝ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの突
然変異体形体； 精製酵素はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手できる。 シークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ） ＝ ファージ
Ｔ７又はＴ３ＤＮＡポリメラーゼの、化学的に修飾され
た、あるいは、突然変異した形体であって、その修飾あ
るいは突然変異によって３’−エキソヌクレアーゼ活性
が消失したものである。

【００２７】この発明に添付した図について説明する
と、図１は、この発明のＤＮＡポリメラーゼの推奨実施
例に関する遺伝子の増幅に使用できるプライマーのヌク
レオチド配列を示す図である。（プライマー間の）遺伝
子に対するＤＮＡ配列及び結果として得られる酵素のア
ミノ酸配列のバルク部分は、上記したＧｅｎＢａｎｋ登
録によって定義されている。

【００２８】図２は、図１と同じプライマーのヌクレオ
チド配列を示す図であり、これらの同じプライマーがＴ
ｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓからの類似する遺伝子の増
幅に使用できることが示されている。図３は、従来技術
の酵素Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリ
メラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ；ＡＴ）及びこの発明の推
奨実施例のＤＮＡポリメラーゼを使用して行い、２０サ
イクルに対して各々２分間完全に持続させるピーク変性
温度を変えて試験したＰＣＲ増幅反応を示すアガロース
ゲルの写真である。この発明の推奨実施例については、
９８°において完全な活性を呈しており、９９°におい
ては不完全ではあるが有用な活性を呈している。一方Ａ
Ｔはこれらの温度に耐えられない。図３は、本願発明の
酵素が、実地試験即ちＰＣＲ増幅において、ＡＴよりも
高い耐熱性を有することを明示している。

【００２９】図４は、４つの酵素を使用して行ったＰＣ
Ｒ増幅反応を示すアガロースゲルの写真である。４つの
酵素とは、先行技術の酵素Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔ
ｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ；Ａ
Ｔ）、この発明のＤＮＡポリメラーゼ（ＫｌｅｎＴａｑ
−２７８）、先行技術の酵素ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｓｔｏ
ｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＳＴ）、及びＫｌｅｎＴ
ａｑ−２９１である。これら全てを、ＰＣＲ変性ステッ
プを９５℃（制御標準温度）及び９８℃で行って試験し
た。全てについて、酵素のレベルを２つにして試験し
た。低い方のレベルは、制御温度での反応を維持するた
めに必要な最小値に、実際に使用できる程度まで近づけ
ている。

【００３０】ＫｌｅｎＴａｑ−２９１及びＳＴの双方
は、９８℃にて使用した際、同様に挙動し、全部ではな
いが殆どの活性を失うが、ＫｌｅｎＴａｑ−２７８は高
い変性温度の使用に対して少なくとも２倍の耐性がある
ことに注意されたい。ＡＴは９８℃の温度にさらされる
と有効性が激烈に低減することがわかる。これらの酵素
の挙動は、ＳＴを除いて再現できる。ＳＴは、提示した
実験においては最もよい結果を示すが、製造者により推
奨された量を使用した場合の作用はそれよりも劣る。

【００３１】図５は、この発明の酵素により使用できる
ようにされた９８℃の新しい実施可能温度と９５℃の標
準ピーク変性温度とで比較して行われたコロニーＰＣＲ
の生成物のアガロースゲル分析の写真である。図５によ
って、新しく実施可能となったピーク変性温度を使用す
るについての応用的な利点が明示されている。

【００３２】図６および図１４のＡ、Ｂは、各々に、試
験したＰＣＲ実験の一部がローディングされたアガロー
スゲルの３枚の写真である。図６および図１４は、この
発明の推奨実施例の酵素配合を様々に変えることによっ
て得られる高ＤＮＡスパンＰＣＲの効率が大幅に増大す
ることを明示している。ＫｌｅｎＴａｑ−２７８あるい
はＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを単独で使用すると、６．
６ｋｂＰＣＲ生成物形成に及ぼす触媒作用が低レベルで
あることが示されているが、これら２つを種々に組み合
わせると、非常に効率が増大することがわかる。Ｋｌｅ
ｎＴａｑ−２７８と組み合わせるＰｆｕの量を徐々に少
なくして図示の最小値１／６４０まで低減すると、効果
的であることがわかる。図示したもののうち、Ｋｌｅｎ
Ｔａｑ−２７８及びＰｆｕの組合せのみが６．６ｋｂの
効率的な増幅に触媒作用を及ぼすことが出来る。１００
ｕｌに対して表示レベルの各酵素（単位濃度について
は、例８の方法を参照）を使用して、１９ｎｇのλｐｌ
ａｃ５ＤＮＡ及びプライマーＭＢＬ及びＭＢＲで鋳型処
理（ｔｅｍｐｌａｔｅ）されたＰＣＲ反応に触媒作用を
与えた。９４°で２分、６０°で２分、７２°で１０分
の２０サイクルである。

【００３３】図７は、６．６ｋｂよりもさらに長いフラ
グメントの増幅に触媒作用を及ぼす場合において、ＰＣ
Ｒ実験の生成物を分析してこの発明の実施例の性能を調
査したアガロースゲルの写真である。図７は、この発明
の酵素配合の比率１／６４０の実施例を利用した場合、
８．４ｋｂ、１２．５ｋｂ、１５ｋｂ及び１８ｋｂの増
幅能力に高い効率性と高い収率が付与されていることを
示している。標的生成物のサイズは、各レーンに対しｋ
ｂとして上記に表示している。１００ｕｌに対する鋳型
のレベルは、ｎｇλとして示されている。即ち、ＰＣＲ
は、各々、９４°で２秒、７０°で１１分の２０又は３
０サイクルである。これらの早期の増幅は、現在の最適
手法（例８の方法を参照）に比べて幾つかの点で、最適
とは言えないものであった。従って、薄壁の管ではなく
厚い壁の管を使用し、触媒として１ｕｌのＫｌｅｎｔａ
ｑＬＡ−６４（６３：１のＫｌｅｎｔａｑ−２７８：Ｐ
ｆｕ）をＫｌｅｎｔａｑＬＡ−１６の代わりに使用し、
２７ｍｅｒ（２７量体）のプライマーを長いプライマー
の代わりに使用し（表１参照）、伸長／アニーリング温
度を６８°ではなく７０°にし、オムニゲン（Ｏｍｎｉ
ｇｅｎｅ）熱サイクラーを使用した。

【００３４】図８は、ほぼ無損失の先行技術の−３欠失
のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラ
ーゼによってＰＣＲ生成物であるｌａｃＺ遺伝子に導入
された突然変異の数とＫｌｅｎｔａｑ−２７８によって
導入された突然変異の数とを比較して、差を計数してい
る棒グラフである。

【００３５】図９は、４３ｍｅｒオリゴヌクレオチドプ
ライマーＢｔＶ５と対にされた３８４ｂｐメガプライマ
ー（二本鎖ＰＣＲ生成物）を用いて行われたＰＣＲ増幅
を示すアガロースゲルの写真である。１００ｕｌの反応
容量に対して、以下の酵素（単位濃度については例８の
方法を参照）を使用して増幅に対して触媒作用を与え
た。レーン１、１ｕｌのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ；レ
ーン２、１／１６ｕｌのＰｆｕ；レーン３、１ｕｌのＫ
ｌｅｎｔａｑ−２７８；レーン４、両酵素を同時使用
（１ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−２７８＋１／１６ｕｌのＰ
ｆｕ）。ゲルの底部付近の３８４ｂｐのバンドはメガプ
ライマーであり、最初にＫｌｅｎｔａｑ−２７８を使用
して増幅されたものである。λＨ３＝ＨｉｎｄＩＩＩで
消化されたラムダＤＮＡ。２つの酵素の組合せ（レーン
４）によってのみ良好な増幅が得られた。Ｐｆｕのかわ
りにＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼを使用した場合も同じ
結果が得られた（データは示していない）。

【００３６】図１０は、３３ｍｅｒの方が２７ｍｅｒよ
りも良好な結果を得られることを示すアガロースゲルの
写真である。２７ｍｅｒプライマー（レーン１〜３、７
〜９）又は３３ｍｅｒプライマー（レーン４〜６、１０
〜１２）を使用して、１００ｕｌの反応容量に対して、
２ｎｇ（レーン１〜６）または１０ｎｇ（レーン７〜１
２）のラムダ導入ファージ鋳型を増幅した。３３ｍｅｒ
ラムダプライマー配列は、長いだけでなく、ラムダゲノ
ムにおいて、プライマーＭＢＬの左側に１００ｂｐで、
また、プライマーＭＢＲの右側に２００ｂｐで配置され
ている。１．２、１．４及び１．６ｕｌの量のＫｌｅｎ
ｔａｑＬＡ−１６を使用して、１２．５、１５及び１８
ｋｂのそれぞれの増幅に触媒作用を与えた。１５ｕｌの
アリコート（０．３又は１．５ｎｇのλ鋳型と等価）を
０．８％のアガロースの電気泳動で分析した。

【００３７】図１１は、ｐＨ（ＰＣ２バッファをそのま
ま使用）及び熱サイクラー（オムニゲン）に関して最適
次善の条件下でＫｌｅｎｔａｑＬＡ−１６（１．２ｕ
ｌ）によって増幅された高ＰＣＲ生成物のＣＨＥＦパル
スフィールド分析（参考文献１１、４秒の切換時間）を
示すアガロースゲルの写真である。開始鋳型（表１参
照）は０．１ｎｇ／ｕｌであり、各サイクルにおける６
８°での時間は、２０ｋｂを超える生成物については２
１分、レーン４及び５については１３分、及びレーン１
１〜１４については１１分であった。ローディングされ
たＰＣＲ反応生成物の体積は、ほぼ等しい強度を示すよ
うに調整されており、ｕｌ単位で１２、１２、４、２；
１０、１０、１０；２、２、４、１である。標準のサイ
ズのレーン（Ｓ）は、λＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物
と混合された無欠損λｐｌａｃ５ＤＮＡ（４８６４５ｂ
ｐ）を示している。表１については、５桁のサイズが、
λｐｌａｃ５ＤＮＡの配列についてプライマーの位置か
ら予測された塩基対で示されており、小数点の付いたサ
イズは、このゲルから求めたｋｂで示されている。

【００３８】図１２は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによる
消化が行われていない（レーン２、３）及び消化が行わ
れた（レーン５、６）２８ｋｂと３５ｋｂの生成物を示
すアガロースゲルの写真である。ＨｉｎｄＩＩＩ消化の
前に、２８ｋｂ生成物は１サイクルにつき２１分の伸長
時間で、及び、３５ｋｂ生成物は２４分の伸長時間で増
幅され、かつ、双方ともに最適なｐＨ（例８の方法を参
照）にてロボサイクラー（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ）で増
幅された。レーンＳ（１、４、７）は、未消化のλｐｌ
ａｃ５及びＨｉｎｄＩＩＩ消化がなされたλｐｌａｃ５
ＤＮＡのマーカーを含んでいる。

【００３９】図１３は、Ｐｆｕ ｅｘｏ^- 突然変異体の
試験結果を示すアガロースゲルの写真である。３０単位
（０．７ｕｇ）のＫｌｅｎｔａｑ−２７８を単独で用い
て（レーン１、７）、また、これを古細菌Ｐｆｕ野生型
ｅｘｏ⁺ ＤＮＡポリメラーゼ（＋；レーン２、３）又は
その３’−エキソヌクレアーゼ活性を持たない突然変異
体（−；レーン４、５）の非常に少量の混合物（１／１
６ｕｌ又は１／６４ｕｌ、１／６又は１／２５単位と等
価）と組み合わせて、８．４ｋｂのＰＣＲ増幅を行っ
た。レーン６は、１ｕｌ（２．５単位）の単独のＰｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ（ｗｔ、ｅｘｏ⁺ ) が使用された場
合の結果である。

【００４０】推奨実施例の説明 図１を参照すると、この発明の推奨実施例のＤＮＡポリ
メラーゼ（ここではＫｌｅｎｔａｑ−２７８と称する）
をコード化する組換えＤＮＡ配列のＰＣＲによる増幅に
ついてのプライマーと論理が示されている。図１に示す
ように、開始メチオニン及びグリシン残基が、Ｋｌｅｎ
ｔａｑ−２７８の最初の２つのＮ−末端位置を占めてい
るが、それは、その前にＷＴＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａ
ｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの残基２７８及び２８０
が占めていた位置である。そのあとに、ローヤー氏他の
記載のように、位置２８１のアミノ酸残基から始まっ
て、野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡ
ポリメラーゼのアミノ酸配列が続いている。そのため、
Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラー
ゼの１から２８０のアミノ酸残基をコード化するコドン
が欠失しており、１〜２８０のアミノ酸は、結果として
得られる遺伝子生成物中に存在しない。

【００４１】この発明の別の推奨実施例のＤＮＡポリメ
ラーゼを図２に示す。この推奨実施例では、上記したと
同じ欠失突然変異が、非常に類似した酵素Ｔｈｅｒｍｕ
ｓｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼに生じている。アミ
ノ酸配列を実質的に上記したように保持し、かつ、ポリ
メラーゼの耐熱性にあまり影響しない、ここに記載する
アミノ酸配列に対するＤＮＡコード化又はアミノ酸配列
になされる些細な改変は、この発明の範囲内に含まれる
ことを理解されたい。

【００４２】突然変異体ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｔ
ａｑ−２７８が、それ以前のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａ
ｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのあらゆる変異型に関し
て報告された温度よりも高い温度において耐熱性を呈
し、ＤＮＡ合成に適した７２℃の温度で使用する場合
に、最終的なＰＣＲ生成物において、ＷＴＴｈｅｒｍｕ
ｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼよりも高い忠
実度を示すことは驚くべきことである。さらに、Ｋｌｅ
ｎｔａｑ−２７８には（Ｎ−末端欠失の結果として除去
された）Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポ
リメラーゼに関連する５’−エキソヌクレアーゼ活性が
ないため、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８はＤＮＡ配列決定に
ついて野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮ
Ａポリメラーゼに比して非常に優れたものである。突然
変異誘発の結果及びミスマッチ化プライマーの調査によ
って、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８が、野生型Ｔｈｅｒｍｕ
ｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼよりも進行的
でなく、誤対合した塩基を伸長させにくいことが分か
る。

【００４３】Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８、Ｓｔｏｆｆｅｌ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＳＴ、別名称Ｋｌｅｎｔａｑ−２
８８）及びＫｌｅｎｔａｑ−２９１について耐熱性試験
を行った。行った試験は、９７℃、９８℃又は９９℃等
のピーク試験温度において各々完全に２分を有する２０
ＰＣＲサイクルを含んでおり、得られる増幅バンドの強
度を９７℃で又は９５℃等の低い制御変性温度（この温
度では、これら全ての変異型が安定である）で２分間の
ものと比較する。これらのデータは、ＳＴとＫｌｅｎｔ
ａｑ−２９１が同様の挙動を示し、これらの試験におい
て９８℃で検出可能な熱不安定性を殆ど呈することのな
かったＫｌｅｎｔａｑ−２７８とは異なって、互いに同
様の９８℃での不安定性を有していることを示してい
る。これらのデータによれば、Ｎ−末端アミノ酸の数は
この発明のＤＮＡポリメラーゼが呈する耐熱性の増強に
とって重要であることがわかる。欠失ＳＴ及びＫｌｅｎ
ｔａｑ−２９１が、この発明のＫｌｅｎｔａｑ−２７８
が示す最適の安定性に対して過剰のアミノ酸（１０過剰
及び１３過剰）を除去したクラスであることは明らかで
ある。

【００４４】Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓと表示され
ることがある（及びＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ
であることもある、ＡＴＣＣのカタログ参照）細菌から
得たＤＮＡポリメラーゼは、ＷＴＴｈｅｒｍｕｓ ａｑ
ｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼに対して非常に相同
である。ここで検討する欠失の領域においては、酵素及
び遺伝子が正確に相同であり、類似の欠失が構成された
場合、対のＳＴ、Ｋｌｅｎｔａｑ−２９１及び優れてい
るＫｌｅｎｔａｑ−２７８の違いはそのままとなると思
われる。実際に、図２のプライマーをＴｈｅｒｍｕｓ
ｆｌａｖｕｓＤＮＡに使用して、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７
８の構成及び単離のために正確にここで記載する態様で
ＫｌｅｎＴｆｌ−２７７を構成することができよう。Ｔ
ｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼ−２７
７酵素及び同様の耐熱性を呈するその改変体もこの発明
の範囲内である。

【００４５】また、この発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑ
ｕａｔｉｃｕｓ又はＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓＤＮＡ
ポリメラーゼのアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラー
ゼをコード化する組換えＤＮＡ配列を含むベクターを特
徴として有する。但し、これがＮ−末端にメチオニン及
びグリシン残基を付加すること及び野生型Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端
２８０アミノ酸を排除すること（ローヤー氏他、上記参
照）を除く。

【００４６】推奨実施例において、ベクターはＡＴＣＣ
第６９２４４号として供託されたプラスミドｐＷＢ２５
４ｂ（配列番号５）として存在する核酸あるいはそのよ
うなベクターを含む宿主細胞である。関連する点では、
この発明は、上記したようなアミノ酸配列を有する精製
ＤＮＡポリメラーゼを特徴としている。ここで使用され
ているとおり、「精製」とはこの発明のポリメラーゼ
を、通常それに関連する大多数の宿主細胞タンパク質か
ら単離することを意味する。このポリメラーゼは調製物
中のタンパク質の少なくとも１０％（ｗ／ｗ）であるこ
とが好ましい。それが均一系調製物、例えば、均一系溶
液とされていれば更に好ましい。

【００４７】概略的には、この発明の組換えＤＮＡ配列
は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓゲノムＤＮＡ
から、あるいは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の所望のスパンよりも大きい
部分のクローンから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、
サイキ（Ｓａｉｋｉ）氏他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、
４８７（１９８８年））によって、後続の消化のために
適切な制限サイトが含まれている図２に示すようなプラ
イマーを用いて増幅される。

【００４８】その後、組換えＤＮＡ配列は、当業者に周
知の手法によって発現ベクターにクローニングされる。
ベクターの特定のヌクレオチド配列は、ＮｃｏＩ及びＨ
ｉｎｄＩＩＩ等のサイト特異的制限酵素により切断され
る。次いで、ベクターを任意にアルカリ性ホスファター
ゼ処理した後、ベクター及び標的フラグメントの配位子
結合が、結果としてなされる、所望の対照（ｃｏｎｔｒ
ｏｌ）及び発現配列に隣接した位置への標的コドンの挿
入とともになされる。使用される特定のベクターは、遺
伝子発現に使用されるために選択される宿主細胞の型に
ある程度依存することとなる。代表的には、アンピシリ
ン又はテトラサイクリン耐性等のマーカー用遺伝子を含
み、かつ、適切なプロモーター及びターミネーター配列
を含む宿主親和性（ｈｏｓｔ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）
プラスミドが使用される。

【００４９】推奨実施例において、この発明の組換えＤ
ＮＡ発現配列は、バックボーンがｐＴＡＣ２（ワシント
ン大学メージャーズ（Ｊ．Ｍａｊｏｒｓ）氏による）、
ｐＢＲ３２２誘導体である、プラスミドｐＷＢ２５０
（ルシフェラーゼ／ＮＰＴＩＩ融合を発現させる）ある
いはｐＷＢ２５３（ＡＴＣＣ第６８４３１号として供託
されたＫｌｅｎＴａｑ−２３５を発現させる）について
クローニングされる。その結果得られる、ｐＷＢ２５４
ｂと呼ばれるプラスミドの特定の配列は、配列番号５で
ある。

【００５０】Ｅ．ｃｏｌｉの種々の菌株等の細菌及びパ
ン酵母等の酵母菌は、ＤＮＡポリメラーゼの発現用宿主
細胞として非常によく用いられるが、さらに複雑な細胞
を使用する技術も知られている。例えば、デピッカー
（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，Ａ．）氏他による、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ． １、５６１（１９８２年）に記載
の植物細胞を使用する手法を参照されたい。この発明の
推奨実施例においては、ｌａｃオペロンをカバーする欠
失Ｘ７４を有するＥ．ｃｏｌｉ宿主菌株Ｘ７０２９、野
生型Ｆが使用されている。

【００５１】宿主細胞は、所定の宿主細胞に対して特定
的に作られたプロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いて
形質転換される。Ｅ．ｃｏｌｉについては、コーエン
（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．）氏によるＰｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ６９、２１１０（１９７２
年）記載のカルシウム処理によって形質転換が生じる。
あるいは、より効果的であるのは、ドワー（Ｄｏｗｅ
ｒ）氏他によるＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ １６、６１２７−６１４５（１９８８年）に記
載の方法を行った後、無塩（ｓａｌｔ−ｆｒｅｅ）Ｅ．
ｃｏｌｉのエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）を行うことである。形質転換後、形質
転換宿主を、アンピシリン耐性等の発現ベクターから得
られる特性に基づいて他の細菌から選択して、細菌の形
質転換コロニーを、高レベルのイソプロピルチオガラク
トシド（ＩＰＴＧ）誘導化耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活
性を生じさせる能力に関してさらにスクリーニングす
る。次いで、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉのコロニーを大量に
生長させて、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８ＤＮＡポリメラー
ゼの発現を誘導し、単離及び精製を行う。

【００５２】精製技術は様々なものが知られているが、
それら全ては、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の破壊、自然タンパク
質の不活性化及び除去、及び核酸の沈殿のステップを含
んでいる。ＤＮＡポリメラーゼの分離は、その重量（遠
心分離）、サイズ（透析、ゲル濾過クロマトグラフィ）
または電荷（イオン交換クロマトグラフィ）のような特
性を利用することによってなされる。一般的には、精製
プロセスにおいて、これらの技法は一緒に組み合わせて
使用される。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８を精製するための
推奨プロセスでは、リゾチームを用いてＥ．ｃｏｌｉ細
胞を弱め、この細胞を溶解させ、また、細胞懸濁液を８
０℃に急速加熱して８０〜８１℃で２０分間インキュベ
ートすることによって殆ど全ての自然タンパク質を変性
させる。次いでこの懸濁液を冷却し遠心分離して変性タ
ンパク質を沈殿させる。その後、この上澄み液（Ｋｌｅ
ｎｔａｑ−２７８が含まれている）を高塩（ｈｉｇｈ−
ｓａｌｔ）ポリエチレン−イミン処理して核酸を沈殿さ
せる。抽出物の遠心分離によって核酸が除去される。好
ましくは、ヘパリン−アガロースカラムでのクロマトグ
ラフィによってほぼ純粋な酵素が得られる。この単離に
ついての詳細は例３に後述する。

【００５３】この発明の新規のＤＮＡポリメラーゼは、
このような酵素を有利に使用できるあらゆるプロセスに
使用できる。具体的には、この酵素は、ＰＣＲ増幅技
術、核酸の配列決定、サイクル配列決定、ＤＮＡ制限消
化の標識化及び平滑末端化（ＤＮＡ ｒｅｓｔｒｉｃｔ
ｉｏｎ ｄｉｇｅｓｔ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄｂ
ｌｕｎｔｉｎｇ）、ＤＮＡの標識化、ｉｎ ｖｉｖｏＤ
ＮＡフットプリント法、及びプライマー指向性突然変異
誘発に有用である。

【００５４】増幅 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、幾何進行におい
て、１００万以上の折り畳みにまでＤＮＡの特定のセグ
メントを急速に増幅するための方法である。例えば、参
考文献として本願明細書の一部とするミュリス（Ｍｕｌ
ｌｉｓ）氏による米国特許第４６８３２０２号を参照さ
れたい。この技法は、増幅されるべきＤＮＡセグメント
の５’末端と及び３’末端の補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ
ｔ）と相同関係を有する一対のプライマーからの、ＤＮ
Ａポリメラーゼで触媒作用を与えられた伸長の繰り返し
サイクルに基づくものである。このプロセスの主要なス
テップは、別の増幅ラウンドが得られるようにＤＮＡプ
ライマーエクステンション生成物をその鋳型から熱変性
することである。この変性ステップの実施可能温度範囲
は、通常、約９３℃から約９５℃の範囲である。この範
囲では殆どのＤＮＡポリメラーゼが不可逆的に変性して
しまうので、各変性サイクル後にさらに別のポリメラー
ゼを付加することが必要とある。しかし、Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ等の耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、二本鎖核酸を変
性させる温度での活性を保持することができるため、更
にＤＮＡポリメラーゼを付加する必要はない。例４に後
述するように、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、以前に知ら
れていたあらゆるＤＮＡポリメラーゼに対するものより
も高い９９℃の温度に有意味的に繰り返しさらしてもそ
れに耐え得る能力を示している。

【００５５】また、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、推奨合
成温度である７２℃において、野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼよりも高い忠実
度を有することが分かっている。これに関するデータ
は、２つの選択可能なマーカーが横に配置されたｌａｃ
Ｚ ＤＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅に関する方法（バーネス
（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．）氏、Ｇｅｎｅ １１２、２
９−３５（１９９２年））で収集された。この発明の推
奨実施例Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８とＡＴ及び類似した別
のＮ−末端欠失であるＫｌｅｎｔａｑ−２３５とを比較
する代表的なデータが図８に示されており、これによ
り、相異なるＮ−末端欠失が、最終ＰＣＲ生成物におい
て測定されたような異なる忠実度を再現可能に呈するこ
とがわかっている。

【００５６】酵素ＳＴについては、この酵素の市販の調
剤で、この検定に用いられる長い試験フラグメント
（４．８ｋｂ）のＰＣＲに触媒作用を及ぼすことが難し
いため、同様の忠実度のデータが得られない。しかし、
ＳＴに関するこれらの実験の難点が単に配合（２ｋｂＰ
ＣＲ増幅に必要な容積が１０〜１５倍も多い容積となる
ほどその濃度が低く、これらの欠失について、長い標的
ＤＮＡを得るのに必要な酵素がもっと必要である）によ
るものなのか、ＳＴがこのような長い標的のＰＣＲ増幅
に触媒作用を及ぼすことが本質的に出来ないのかという
ことについては分かっていない。

【００５７】ＤＮＡ配列決定 所定のＤＮＡ配列は、ジデオキシ類似体を用いて、サン
ガー法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ．）氏、ニクレ
ン（Ｎｉｃｋｌｅｎ， Ｓ）氏及びクールソン（Ｃｏｕ
ｌｓｏｎ， Ａ．Ｒ．）氏による鎖終結阻害剤を用いた
ＤＮＡ配列決定、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７４、５４６３−５４６７（１９７７
年））によって解明することが出来る。これらの方法で
は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して核酸連鎖の伸長に触
媒作用を及ぼす。しかし、その自然形体において、Ｔｈ
ｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼは
（多くの他のポリメラーゼと同様に）５’−エキソヌク
レアーゼ活性に関する領域を有している。この関連する
エキソヌクレアーゼ活性は、僅かに過剰の酵素が存在す
ることやインキュベートの時間が過剰にされた場合を含
む所定の条件下で、１〜３のヌクレオチドを配列決定プ
ライマーの５’末端から取り除くことができ、それによ
って、アルファ標識化配列決定用ゲルにおける各バンド
が多かれ少なかれ多重線として現れるようにすることが
できる。配列決定用ゲルの標識が５’である場合には、
エキソヌクレアーゼによって多重線を生じさせることは
出来ないが、そのかわりにシグナルを減少させる。Ｔｈ
ｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの
Ｎ−末端２８０アミノ酸残基の欠失の結果として、Ｋｌ
ｅｎｔａｑ−２７８にはエキソヌクレアーゼ活性がな
く、５’−エキソヌクレアーゼ活性により生じる配列決
定の危険性が回避される。

【００５８】Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼのＤＮＡ配列決定に効果的に使用すること
ができる。基本的には、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８を使用
するに適したジデオキシＤＮＡ配列決定には２種類あ
る。即ち、元来のジデオキシ配列決定（上述のサンガー
氏他；イニス（Ｉｎｎｉｓ）氏他によるＰｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５、９４３６（１
９８８年））及びサイクル配列決定である。

【００５９】イニス氏他によりジデオキシ配列決定に適
した手法が記載されているが、ＷＴＴｈｅｒｍｕｓ ａ
ｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼを使用すると、こ
の手法は、審査官には入手可能でありかつ参考文献とし
て本願明細書の一部とする特許出願第０７／５９４６３
７号に明示されているように、配列決定用ゲル上で二重
又は三重のバンドを示す傾向がある。Ｋｌｅｎｔａｑ−
２７８は、この問題の解決において、上記特許出願の主
題であるＫｌｅｎｔａｑ−２３５，ａ．ｋ．ａ． Ｄｅ
ｌｔａＴａｑと同じ効果をもつ。

【００６０】Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８による元来型（非
サイクル型、イニス氏他）のジデオキシ配列決定を行う
に好ましい手法は、ＵＳＢのＴａｑｕｅｎｃｅ２．０ジ
デオキシ配列決定キットにおけるものである。サイクル
配列決定に好ましい手法は、ＵＳＢサイクル配列決定キ
ットにおけるものである。

【００６１】その他の用途 Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、プライマー指向性突然変異
誘発、ｉｎ ｖｉｖｏフットプリント法、ＤＮＡの標識
化及び非スティッキー・ラムダＤＮＡフラグメントのサ
イズ標準の調製にも有効に利用されたものである。これ
らの手法については以下に述べる。

【００６２】Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、特に配合Ｋｌ
ｅｎｔａｑ−ＬＡ（後述）において、一本鎖鋳型になる
ようにアニーリングされるサイト特異的突然変異原生プ
ライマーを伸長させるために使用することができる。そ
れは、このプロセスではクレノウ酵素（Ｅ．ｃｏｌｉＤ
ＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメント）及びＴ７Ｄ
ＮＡポリメラーゼと置き換わるが、３７℃におけるクレ
ノウ酵素よりも高いプライマー選択性を６０〜６５℃で
示し、クレノウ酵素に必要な時間が１時間以上であるの
に比べて１２分で完全あるいは十分な取り込みの状態に
なる。

【００６３】また、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、リガー
ゼ仲介ＰＣＲ補助ｉｎ ｖｉｖｏフットプリント法にお
ける第３（第２ネスト（ｓｅｃｏｎｄ−ｎｅｓｔｅ
ｄ））プライマーでのＰＣＲ後の標識化ステップに対し
て有用（及び野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓＤＮＡポリメラーゼよりも優れたもの）である。この
情報がえられたのは、ミズーリ州セントルイスのワシン
トン大学のガッタス（Ｉ．Ｇｈａｔｔａｓ）氏のおかげ
である。これらの研究は、ガリッティ氏及びウォルド氏
の研究（Ｇａｒｒｉｔｙ，Ｐ．Ａ．及びＷｏｌｄ，Ｂ．
Ｊ．（１９９２年）、連結反応仲介ＰＣＲ増強遺伝子配
列決定及びｉｎ ｖｉｖｏフットプリント法における種
々のＤＮＡポリメラーゼの効果、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９、１０２１−１０２
５）と同様である。

【００６４】さらに、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８はＤＮＡ
標識化に有用である。ランダムプライマーについては、
少なくとも９ｎｔの長さが推奨され、反応を３７℃から
６５℃にゆっくりと（２０〜３０分かけて）温めて行う
ことが好ましい。最も好ましいのは、当業者に周知であ
る手法を用いて、プログラム可能な熱ブロックをＤＮＡ
標識化に利用することである。

【００６５】Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８の別の用途は、部
分的に付着末端（スティッキーエンド）が付着し合って
いないラムダＤＮＡ制限消化物の調製に使用することで
ある。５５℃で反応が行われるＨｉｎｄＩＩＩ消化物に
Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８及び４つのＤＮＡｄＮＴＰが含
まれていると、その結果として、バンド１及び４が部分
的に相互に結びつかない。

【００６６】供託 菌株ｐＷＢ２５４ｂ／Ｘ７０２９は、１９９３年２月１
８日にメリーランドのアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションに供託されており、ＡＴＣＣ６９２４４
号の番号が付与されている。出願人は、これについて付
与された特許の存続期間の終了前、培養に対する最後の
請求をしてから５年、或いは、３０年のいずれか長い方
の期間の経過前にこの培養が死んでしまった場合にこの
培養を取り替える責任、及び、供託物が公に入手できる
ようになる特許付与の時点に、このような特許の付与の
受託者を告知する責任のあることを認めるものである。
その時まで、供託物は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１
〜１４及び３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２の条件のもとに特
許局の長に対して入手可能となろう。

【００６７】この発明のさらに別の特徴については、標
的長さがＤＮＡのＰＣＲ増幅に制限されることが確認さ
れ、取り扱われている。それに付随して、塩基対の忠実
度、ＰＣＲ生成物をプライマーとして使用する能力、及
び標的フラグメントの最大収率が増加した。これらの向
上は、有意的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を持たな
いＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＫｌｅｎｔａｑ−２
７８と、低レベルの、有意的な３’−エキソヌクレアー
ゼ活性を呈するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕ、
Ｖｅｎｔ、又はＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ）とを組み合わせる
ことによって得られた。驚くべきことに、この系で、例
えば１ｎｇのラムダＤＮＡ鋳型から少なくとも３５ｋｂ
の標的フラグメントが、高い収率になるまで増幅可能で
ある。

【００６８】更に、少なくとも１つの３’−エキソヌク
レアーゼ活性を持たない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼから
なる主成分と、少なくとも１つの３’−エキソヌクレア
ーゼ活性を呈する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼからなる少
量成分とから構成される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配
合によって、６．６〜８．４ｋｂの範囲の生成物を効果
的に増幅することができる。

【００６９】先行技術の方法では、このサイズの範囲の
フラグメントはあまり効力のない形でかつ散発的にしか
増幅されず、比較的弱い生成物バンドが生じたり、検出
可能な生成物が全く生じなかったりした。本願の開示を
みると、先願技術の無効性の理由が（何らかの特殊な理
論に制限されることなく）理解されるものと思われる。

【００７０】Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮ
Ａポリメラーゼ及びその変異型は、（それらに３’−エ
キソヌクレアーゼがないため除去できない）誤対合した
塩基対を容易に伸長させないものと思われる。誤対合し
た塩基の除去によって伸長を有効にし、かつ、より正確
にコピーされた生成物を生成させることが出来るであろ
うと思われる、３’−（校正）エキソヌクレアーゼを呈
する耐熱性酵素は、２社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって導入
された。実際には、これら２つの酵素（Ｖｅｎｔ及びＰ
ｆｕＤＮＡポリメラーゼ）は信頼性がなく、期待されて
いた程の効果はあまり得られていない。

【００７１】ＰＣＲに関しこれらの酵素に信頼性がない
ことに対して考えられる説明の１つとして、３’−エキ
ソヌクレアーゼが見かけ上プライマーを攻撃してこれを
劣化させることがよくあり、ＰＣＲが殆ど或いは全く起
こりえないということがある。このプライマー攻撃の問
題は、あるプライマーに対しては他のものよりもさらに
悪いものとなる。ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼが５’１
５ｎｔに影響を及ぼさないようにして、アニーリング条
件によってその１５ｎｔをプライマー化（ｐｒｉｍｅ）
させる場合にＰＣＲをおそらく進行させることが出来る
ようにすることが報告されている（作者不明、ＮＥＢ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ、（１９９１年３月）４頁）。勿論、この場
合、アニーリングはより低い、非選択的な温度でしか行
われないものとなり、プライマーの５’１５ｎｔは鋳型
に対して正確に相同でなければならない。

【００７２】出願人は、３’−エキソヌクレアーゼの有
益な効果が、ある古細菌ＤＮＡポリメラーゼ等の、有意
味的な（この定義は生化学的に分析可能ということであ
る）３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈する１つ以上の
ＤＮＡポリメラーゼ（ここではＥ２と呼ぶ）が意外にも
微小に存在することによって得られる一方、有効な伸長
が、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８或いはＡＴ等の、有意味的
な３’−エキソヌクレアーゼ活性をなんら持たない１つ
以上のＤＮＡポリメラーゼ（ここではＥ１と呼ぶ）が大
量に存在することによって触媒作用を受けることを発見
した。ＤＮＡポリメラーゼの配合又は混合物の少量成分
としては、上述した、３’−エキソヌクレアーゼＤＮＡ
ポリメラーゼの信頼性に欠ける点及び無効力な点が、実
質的に緩和されていたり、無くなっていたりする。更
に、３’−エキソヌクレアーゼが誤対合を除去して誤対
合での一時減衰（ｐａｕｓｉｎｇ）を無くすと考えられ
るため、結果として生成したＤＮＡが呈する塩基対の変
化はより少なくなり、それによって、忠実度、特異性及
び効率を犠牲にすることなくＰＣＲの突然変異誘発が減
少して有用なものとなる。実際には、２０００もの高い
Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８／Ｐｆｕ単位比についてさえ、
組合せが呈する増幅の効率は非常に増加する。

【００７３】大抵の使用分野については、ＤＮＡポリメ
ラーゼの混合物は、増強された生成物長さ及び収率が得
られるまでは少なくとも約４：１のＥ１のＥ２に対する
相対ＤＮＡポリメラーゼ単位比でなければならない。Ｐ
ｆｕＤＮＡポリメラーゼを配合に使用した場合、その比
は、プライマー−鋳型の組合せにある程度左右される
が、Ｐｆｕ１部（単位）につき８０〜１０００部のＫｌ
ｅｎｔａｑ−２７８の範囲にあることが好ましく、さら
に好ましくは、約１５０〜約１７０：１であり、最も好
ましいのは、約１６０：１である。同様の比は、Ｐｆｕ
とＫｌｅｎｔａｑ−２９１の混合物についても好まし
い。

【００７４】Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８又は２９１と組み
合わせて使用する際にＰｆｕの代わりにＤｅｅｐ Ｖｅ
ｎｔを使う場合では、殆どの使用分野において最も好ま
しいＥ１のＥ２に対する比は、約４５０〜約５００：１
に増大する。また、Ｅ１として無損失（ＷＴ）Ｔａｑ又
はＡｍｐｌｉｔａｑが含まれている場合、その最も好ま
しいＰｆｕ又は他のＥ２成分に対する比は、Ｅ１のＥ２
に対する比が約１０〜約１５：１の範囲にある場合であ
る。

【００７５】この発明のＥ２には、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、
Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｔ７コリファージ、Ｔｍａ又はそ
の組合せからの遺伝子によってコード化されたＤＮＡポ
リメラーゼが含まれるが、これに限定されるものではな
い。この発明のＥ１には、突然変異体、Ｅ２ ＤＮＡポ
リメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼ陰性形体、或い
は、Ｔａｑ、Ｔｆｌ又はＴｔｈ或いはその組合せからの
遺伝子によってコード化されたＤＮＡポリメラーゼ等
の、突然変異していない形体の中で有意味的な３’−エ
キソヌクレアーゼ活性を示さないＤＮＡポリメラーゼが
含まれるが、これに限定されるものではない。

【００７６】以下に述べるように、この発明のＤＮＡポ
リメラーゼ配合も、Ｅ１がシークエナーゼ等の逆転写酵
素からなるＤＮＡポリメラーゼの配合を含んでいる。

【００７７】この発明の配合の更なる例として、Ｅ１が
Ｔ７又はＴ３ ＤＮＡポリメラーゼの突然変異体或いは
化学的な修飾を含み又はそれから構成され、Ｅ２が野生
型Ｔ７又はＴ３ ＤＮＡポリメラーゼを含み又はそれか
ら構成されている混合物、或いは、別の変形として、Ｅ
１が、何ら有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を
持たないＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｅｘ
ｏ^- としてＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓか
ら販売されている）を含み又はそれから構成され、ま
た、Ｅ２がＶｅｎｔを含み又はそれから構成されている
ものがある。

【００７８】ここで発見された原理、即ち、３’エキソ
ヌクレアーゼを持たないＤＮＡポリメラーゼによりプラ
イマーの伸長を行う間に低レベルの３’エキソヌクレア
ーゼを使用するということは、標準温度インキュベーシ
ョン（即ち、非耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用するこ
と）、及び、３’−（校正）エキソヌクレアーゼを持た
ないことが知られている逆転写酵素（Ｂａｔｔｕｌａ及
びＬｏｅｂ、１９７６年）を含む、一般的なＤＮＡポリ
メラーゼのプライマーエクステンション法に適用でき
る。前者の例は、主成分の酵素としてシークエナーゼ
（ｅｘｏ^- ）を使用し、少量成分として野生型Ｔ７ＤＮ
Ａポリメラーゼ（ｅｘｏ⁺ ）又はクレノウ・フラグメン
トを使用することである。後者の例は、ＡＭＶ（Ａｖｉ
ａｎ Ｍｙｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）又はＭ
ＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）
の逆転写酵素を主成分とし、クレノウ・フラグメント、
Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは、Ｐｆｕ又はＤｅｅ
ｐ Ｖｅｎｔ等の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼを少量成分
として使用することである。

【００７９】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはこれらの逆転
写酵素によって使用される３７度及び４２度の温度では
活性がより低くなるため、ＰＣＲにおいて使用する場合
よりも必要と思われるレベルは高くなりやすい。クレノ
ウ・フラグメントＤＮＡポリメラーゼは、鋳型としてＲ
ＮＡを使用する際には好ましいＤＮＡポリメラーゼでは
ないが、特に、付加したＭｎイオンの存在下で、この鋳
型（Ｋａｒｋａｓ、１９７３年；Ｇｕｌａｔｉ，Ｋａｃ
ｉａｎ 及びＳｐｉｅｇｅｌｍａｎ、１９７４年）を認
識する作用を行う。付加したＭｎイオンは、（先行技術
では）残念ながらｅｘｏ⁺ 成分の恩恵を受けることな
く、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＴｔｈによって逆転写を
行うために型通りに使用される。逆転写酵素反応にｅｘ
ｏ⁺ 成分を使用するについては、ｅｘｏ⁺ 成分がＲＮＡ
ｓｅに完全に汚染されていない状態にするように特別な
注意が必要であることを強調しておかなければならな
い。

【００８０】次の参考文献には、逆転写酵素を使用する
技術分野において周知である方法が記載されており、こ
れらを参考文献として本願明細書の一部とする。

【００８１】バッツラ（Ｂａｔｔｕｌａ Ｎ．）氏、ロ
エブ（Ｌｏｅｂ ＬＡ．）氏 ＤＮＡ複製の忠実度につ
いて。トリ骨髄芽球症ウィルス（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌ
ｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）ＤＮＡポリメラー
ゼにおけるエキソデオキシリボヌクレアーゼ活性及びエ
ラー補正機能の欠如。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５１（４）、９
８２−６、１９７６年２月２５日。グラチ（Ｇｕｌａｔ
ｉ ＳＣ．）氏、カシアン（Ｋａｃｉａｎ ＤＬ．）
氏、スピーゲルマン（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ Ｓ．）氏
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとしてＤＮＡポリメ
ラーゼＩを使用するための条件。Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅ
ｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ７１
（４）、１０３５−９、１９７４年４月。カーカス（Ｋ
ａｒｋａｓ ＪＤ．）氏 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩによる逆転写。
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ． ７０
（１２）、３８３４−８、１９７３年１２月。ポリメラ
ーゼ活性がなく３’−エキソヌクレアーゼ活性しか持た
ないＤＮＡポリメラーゼ：

【００８２】出願人は、特殊な理論に限定するわけでは
ないが、少量（Ｅ２）成分の酵素活性は、３’−エキソ
ヌクレアーゼ活性であってＤＮＡポリメラーゼ活性では
ないと考える。実際、このＤＮＡポリメラーゼ活性は、
少量成分ではなく主要（Ｅ１）成分に最適な条件下で望
ましくない合成あるいはあまり正確ではない合成を生じ
させる厄介なものとなりえるとも考えられる。ｐｈｉ２
９ＤＮＡポリメラーゼの「領域Ｉ」ＤＮＡ変換ＤＮＡポ
リメラーゼのモチーフを突然変異させたバーナード（Ｂ
ｅｒｎａｄ）氏、ブランコ（Ｂｌａｎｃｏ）氏及びサラ
ス（Ｓａｌａｓ）氏のｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの
ＹＣＤＴＤＳアミノ酸モチーフのサイト指向性突然変異
誘発（Ｇｅｎｅ ９４、４５−５１（１９９０年））に
教示されている様に、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
の領域ＩＩＩ又は領域Ｉのいずれかに突然変異が起こ
り、それらは、ウエモリ（Ｕｅｍｏｒｉ，Ｔ．）氏、イ
シノ（Ｉｓｈｉｎｏ，Ｙ）氏、トウ（Ｔｏｈ，Ｈ．）
氏、アサダ（Ａｓａｄａ，Ｆ）氏及びカトウ（Ｋａｔ
ｏ，Ｉ．）氏によって（古（ａｒｃｈａｅｏｎ）Ｐｙｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓからのＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子の機構とヌクレオチド配列、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１、２５９−２６５（１
９９３年））配列決定された。

【００８３】この発明の更に別の実施例では、野生型形
体において３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈し、か
つ、上記した１以上のＤＮＡポリメラーゼの３’−エキ
ソヌクレアーゼ活性を無くしてはいないが実質的に低減
させた温度サイクル型ポリメラーゼ連鎖反応に触媒作用
を与えることができる、少なくとも１つのＤＮＡポリメ
ラーゼを含み或いはこれから構成されているＤＮＡポリ
メラーゼの配合が提供されている。低減した３’−エキ
ソヌクレアーゼ活性は、突然変異によって、又は、当業
者には周知である化学的又はその他の手段によって得ら
れる。その際、ＤＮＡポリメラーゼの配合を、ＰＣＲ増
幅においてプライマーエクステンションに触媒作用を与
えるために使用してもよい。

【００８４】また、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ及びＤｅｅｐ Ｖ
ｅｎｔＤＮＡポリメラーゼを含むアルファ類の遠縁のＤ
ＮＡポリメラーゼを研究しているスペインの研究者（ソ
エンガス（Ｓｏｅｎｇａｓ，Ｍ．Ｓ．）氏、エステバン
（Ｅｓｔｅｂａｎ，Ｊ．Ａ．）氏、ラザロ（Ｌａｚａｒ
ｏ，Ｊ．Ｍ．）氏、ベルナッド（Ｂｅｒｎａｄ，Ｓ．）
氏、ブラスコ（Ｂｌａｓｃｏ， Ｍ．Ａ．）氏、ルサラ
ス（．ｌ Ｓａｌａｓ，Ｍ．）氏及びブランコ（Ｂｌａ
ｎｃｏ，Ｌ．）氏、Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ１１、４
２２７−４２３７（１９９２年））も、３’−エキソヌ
クレアーゼ領域の突然変異を識別及び立証し、さらに、
（１又は複数の）ＤＮＡポリメラーゼモチーフが突然変
異している間に分離し容易に回避した。この同じ報告に
おいて、彼らは、保存Ｔｙｒ残基をＰｈｅ又はＣｙｓに
変えることによってエキソヌクレアーゼを４〜７％の活
性に低減することができる一方、保存ＡｓｐをＡｌａで
置換することによって０．１％だけの活性に低減するこ
とができることを立証している。長く正確なＰＣＲにつ
いては、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ又はＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ等の
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで生じるに最適なｅｘｏ
^- （３’−エキソヌクレアーゼ陰性）突然変異は、エキ
ソヌクレアーゼを消去はしないが低減するものであり、
例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌク
レアーゼ活性の、０．２〜７％、好ましくは０．５〜７
％、最も好ましくは１〜７％までの低減となる。

【００８５】突然変異を導入する別の方法として（及び
上記のＢｔ Ｃｒｙ Ｖ遺伝子例について実証するよう
に）、Ｋｌｅｎｔａｑ−ＬＡ、この発明が２つの相同Ｒ
ＥＧＩＯＮ ＩＩＩ及びＲＥＧＩＯＮ Ｉに対するＤＮ
Ａ配列コード化に及ぶ小さなＰＣＲ生成物に変化を導入
するために使用される。この変化は、ＭＡＣＡＷコンピ
ュータ・プログラムの助けを借りて以下に示す保存モチ
ーフをガイドとして使用して、ＲＥＧＩＯＮ ＩＩＩ及
び／又はＲＥＧＩＯＮ Ｉの保存アミノ酸を変化させる
ように選択される。

【００８６】出願人は、（表示しないが、上記のように
例１に相似であり、当業者によって容易に実行されるデ
ータの詳細）ガイドとしてウエモリ（Ｕｅｍｏｒｉ）氏
他によって公表された配列を用いて、ＰｆｕＤＮＡから
のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のＯＲＦをＰＣＲ増
幅した。上記例２に相似的に、このＯＲＦを、Ｋｌｅｎ
ｔａｑ−２７８の発現に使用したように同じ発現ベクタ
ーにクローニングし、また、ＤＮＡポリメラーゼが上記
例３にてＫｌｅｎｔａｑ−２７８に対してここに述べた
と同じ手法で精製可能であることを示した。

【００８７】突然変異を導入する別の（上記ソエンガス
氏他によるものに代わる）方法として（及び上記のＢｔ
Ｃｒｙ Ｖ遺伝子例について実証するように）、Ｋｌ
ｅｎｔａｑ−ＬＡ、この発明が２つの相同ＲＥＧＩＯＮ
ＩＩＩ及びＲＥＧＩＯＮＩに対するＤＮＡ配列コード
化に及ぶ小さなＰＣＲ精製物に変化を導入するために使
用される。この変化は、ＭＡＣＡＷコンピュータ・プロ
グラムの助けを借りて以下に示す保存モチーフをガイド
として使用して、ＲＥＧＩＯＮ ＩＩＩ及び／又はＲＥ
ＧＩＯＮ Ｉの保存アミノ酸を変化させるように選択さ
れる。

【００８８】以下は、ＤＮＡポリメラーゼ保存モチーフ
の２つを実行する、コンピュータ・プログラムＭＡＣＡ
Ｗからの番号を付された出力である。また、これら及び
他のＤＮＡポリメラーゼモチーフの有用な発表はパーラ
ー（Ｐｅｒｌｅｒ）氏他によるＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ． ８
９、５５７７−５５８１（１９９２年）にも見られる。

【００８９】 配列番号３０ ＲＥＧＩＯＮ ＩＩＩ Phi29 ------KLMLNSLYGkfasnpdvtgkvpylkengalgfrlgeeetkdpvytpmgvfITA 435 :: :: :: :: Pfu dyrqkaiKLLANSFYGyygyakarwyckecaes--------------------VTA 516 配列番号３１ 配列番号３２ ＲＥＧＩＯＮ I Phi29 WARyttitaaqacyd----RIIYCDTDSIHLTgteipdvikdivdpkklgywah------ 485 : : : ::: : : Pfu WGRkyielvwkeleekfgfKVLYIDTDGLYATipggeseeikkkalefvkyinsklpgll 576 配列番号３３

【００９０】

【実施例】以下、次の例によってこの発明を説明する。

【００９１】実施例１ Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８として表される遺伝子の構築 図１にヌクレオチド配列として示す組換えＤＮＡ配列を
有するＫｌｅｎｔａｑ−２７８ＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子を組み立てる（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）ために、次の手
順に従った。変異遺伝子は図１の２つの合成ＤＮＡプラ
イマーから用意した（ｐｒｉｍｅｄ）ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ，Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２３９：４８７，１９８８）を用いて全Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡの０．２５ｕｇから増
幅した。

【００９２】プライマーＫＴ１，配列番号：１は、コド
ン２８０でスタートする野生型ＤＮＡと異体同形であ
り、このプライマーは生成ａｍｐｌｉｆｉｅｄしたＤＮ
Ａ中にＮｃｏＩサイトに組込むことを意図している。プ
ライマーＫｌｅｎｔａｑ３２，配列番号：３，３３ｍｅ
ｒはＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラ
ーゼをコード化する野生型遺伝子の他の鎖上で停止コド
ンに及びＨｉｎｄＩＩＩサイトと生成ＤＮＡ中で二重停
止コドンに組込まれる。

【００９３】ＰＣＲ反応の緩衝剤は２０ｍＭのトリスＨ
Ｃｌ ｐＨ８．５５、２．５ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、１６ｍ
Ｍの（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ 、１５０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、
２００ｕＭのｄＮＴＰよりなる。サイクルパラメーター
（ｃｙｃｌｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）は２′９５°、
２′６５°、５′７２°である。ＰＣＲ（Ｓａｉｋｉ
ｅｔ ａｌ．，上記）によって導入される突然変異を最
少とするために、ＰＣＲの１６サイクルだけ（ｏｎｌ
ｙ）はフェノール抽出、エタノール沈殿前に制限酵素Ｎ
ｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化を行った。

【００９４】実施例２ 発現ベクターの調製 生成物ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、
ＮｃｏＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，そして子牛腸内のアルカリ
性フォスファターゼで加水分解（ｄｉｇｅｓｔｅｄ）し
たプラスミドｐＷＢ２５４ｂ中に分枝した。このプラス
ミドのバックボーンは、予め命名されたｐＴＡＣ２で、
Ｊ．Ｍａｊｏｒｓによって得られたものであり、ｐＢＲ
３２２（発現の方向が時計の針と反対方向でなく、時計
の針方向であるものはアポストロフィー ’を付す）の
ＰｖｕＩＩサイトから時計の針と反対方向に次の元素を
導く：１部分のｌａｃＺ’配列、ｌａｃＩ’、ｌａｃＰ
ＵＶ５（配向は知られていない）、ＰＬ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ；カタログ
ｎｏ．２７−４８８３）からのｔａｃプロモーターの２
つの複写、Ｔ７遺伝子１０プロモーターそしてＮｃｏＩ
サイト、ＨｉｎｄＩＩＩサイトからなる修飾した開始コ
ドン、ｔｒｐＡターミネータ（ＰＬｎｏ．２７−４８８
４−０１）、複製のＭ１３オリジン、ｐＢＲ３２２のＡ
ｍｐ ^R 遺伝子である。クローン化遺伝子の発現は０．１
ｍＭ ＩＰＴＧによって誘発されるべきであると予想さ
れる。

【００９５】クローニングから起こるアンピシリン耐性
コロニーズは、Ｓａｇｎｅｒ ｅｔａｌ．（１９９１）
〔ＧＥＮＥ９７：１１９−２３〕のシングル コロニー
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ測定によって測定した。そし
て、４ｓｔｒｏｎｇ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓはトゥースピ
ック（ｔｏｏｔｈｐｉｃｋ）分析（Ｂａｒｎｅｓ，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ １９５：３９３、１９７７）によって分画
（ｓｉｚｅｄ）した。

【００９６】これらの１つで、ナンバー２５４．７は二
重挿入の小部分を除いて期待した大きさであった。この
プラスミドは、さらにＥ．ｃｏｌｉ Ｘ７０２９中でエ
レクトロポレーションによって精製され、トゥースピッ
ク分析によってサイズを揃えるためにスクリーニング
し、そして、二重挿入不純物のない期待したサイズの１
つのプラスミドはｐＷＢ２５４ｂと命名された。このプ
ラスミドはここに述べたＫｌｅｎｔａｑ−２７８の製造
に使用されるものである。

【００９７】実施例３ 大量のＫｌｅｎｔａｑ−２７８の精製 プラスミドｐＷＢ２５４ｂは二重（直列反復）のｔａｃ
プロモーターとＴ７遺伝子１０リーダー配列、ＡＴＧ開
始コドン、グリシンコドン、そしてＴｈｅｒｍｕｓ ａ
ｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼの２８０−８３
２のコドンを持っていて、停止コドンの直列対はｔｒｐ
転写末端に続いている。このｐＢＲ３２２−ベースプラ
スミドベクター（Ｊｏｈｎ ＭａｊｏｒｓからのｐＴａ
ｃ２）はアンピシリン耐性がある。細胞は非常にリッチ
な培地（下記参照）の上で成長する。細菌性宿主Ｘ７０
２９はラクトースオペロンのＸ７４欠失を除いて野生型
Ｆ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。

【００９８】培地（Ｍｅｄｉｕｍ）： 水１リッター当
り、１００ｍｇのｔｉｃａｒｃｉｌｌｉｎ（冷やして加
える）、１０ｇのＹ．Ｅ．、２５ｇのトリプトン、１０
ｇのグルコース、ＮａＣｌではない１０ＸＭ９塩（４２
ｍＭのＮａ₂ ＨＰＯ₄ 、２２ｍＭのＫＨ₂ ＰＯ₄ 、１９
ｍＭのＮＨ₄ Ｃｌ）からなる。グルコースと１０ＸＭ９
を一緒にしオートクレーブに入れないで、それらを１つ
づつ分けてオートクレーブに入れ、後で混合する。５Ｍ
のＮａＯＨ（約１ｍｌ）でｐＨ８に調節する。ＯＤ₅₅₀
＝１または２で０．１ｍＭのＩＰＴＧを加え、３０℃で
充分に振とうする。ＯＤ＝２から８〜１０に達してから
半時間毎に次のことを行う。

【００９９】１．ｐＨ ｓｔｉｃｋｓ５〜１０でｐＨを
読み取る。５ＭのＮａＯＨでｐＨ８．５に調節し、ｐＨ
が８以下に下がったときはいつでも（リッター当り２〜
５ｍｌで）ｓｗｉｒｌｉｎｇする。 ２．ＯＤ₅₅₀ を通常１／１０あるいは１／５０希釈液と
して読み取り、記録する。 ３．このグルコースの付加は、任意であり、必ずしも何
らかの価値のあるものではない（この時期にこの問題の
評価は不十分である）。グルコースｓｔｉｃｋでグルコ
ースレベルを読み、もしレベルが０．２％以下に落ちて
いたら付加物０．５％（５０％の１０ｍｌ）を加える。
もし、その添加が遅れるなら、細胞は最後のｐＨ調節後
一晩中３０℃で振とうさせる。代わりに、もしそれらが
数時間で充分に成長しないならば、冷たい室内にそれら
を置いておく。細胞は、例えばＧＳ３ローターにて８ｋ
ｒｐｍで８分間遠心分離することで濃縮する。上澄みを
洗い流し、同じペレット上にゆっくりした回転で培養液
を加える。

【０１００】細胞の破壊と溶解（Ｌｙｓｉｓ）：パック
した細胞のｇ重量の２倍に等しいＴＭＮバッファー（５
０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．５５、１０ｍＭのＭ
ｇＣｌ₂ 、１６ｍＭの（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ ₄ ）のミリリッ
ターに細胞を再懸濁する。細胞懸濁液の各３００ｍｌに
６０ｍｇのリソチームを加え、１５分間時々ｓｗｉｒｌ
ｉｎｇしながら５〜１０℃で細胞を培養する。それか
ら、ＮＰ４０あるいはＴｒｉｔｏｎＸ１００を０．１
％、Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％、各々に１０％溶液の１
／１００容量付加の形で加える。それから細胞懸濁液を
煮沸水浴中でｓｗｉｒｌｉｎｇしながら急速に８０℃ま
で加熱し、細胞（素早く抽出物となる）を２０分間で８
０〜８１℃に維持する。温度を測定するために細胞内に
きれいな温度計を用いる。フラスコの口縁まで一様に十
分な熱処理が得られるようにするために、フラスコや浴
は確実に覆うべきである。この処理の後、少量の酵素を
除いた殆どを不活性とすることを期待して、抽出物を３
７℃あるいはそれ以下に氷浴で冷却し、それから２ｍｌ
のプロテアーゼ阻害剤（イソプロパノールに溶かした１
００ｍＭのＰＭＳＦ）を加える。この点に進んでから、
フラスコや撹拌棒や他のものでの混合、もしくはオート
クレーブに入れられていない溶剤を接触させようとして
はいけない。（デタージェントとＢＭＥはオートクレー
ブ処理できない。ＰＥＩと硫酸アンモニウムもまたオー
トクレーブ処理されない。）オートクレーブする目的
は、微生物汚染を避けるだけでなく、ＤＮＡあるいはヌ
クレアーゼによる汚染を避けるためである。遠心分離機
の容器に分配し２℃で遠心分離する（例えば、Ｓｏｒｖ
ａｌ ＳＳ−３４ローターでは１５ｋｒｐｍで３０分、
あるいはＧＳ３ローターでは４ｋｒｐｍで１４時間であ
る）。上澄みはフラクションＩと呼び、ＤＮＡポリメラ
ーゼ活性度に対する測定ができる。

【０１０１】高−塩ＰＥＩ沈殿 フラクションＩを０．２５ＭのＮａＣｌ（リッター当り
１４．６ｇ加える）に溶かしたのち、５％のポリミン−
Ｐ（ＰＥＩ，ポリエチレン−イミン，Ｓｉｇｍａ）を核
酸を沈殿させるために氷上で撹拌しながら滴状に加え
る。十分なポリミン−Ｐが加えられたことを確認するた
めに、そして必要最少量以上の添加を避けるために、ポ
リミン−Ｐの一滴の添加によって遠心分離した抽出物１
／２ｍｌをテストし、多量の沈殿物が生ずる時は、大部
分の抽出物に多くのポリミン−Ｐを加え、よく混合して
再テストする。抽出物の試験結果を汚すことなく容器に
戻す。

【０１０２】十分にＰＥＩが加えられたことを確認する
ために、遠心分離物３ｍｌと１／２ｍｌアリコート中に
上澄みをアリコートする。５％のＰＥＩを０、２、４、
６あるいは１０ｕｌ加える。氷の上において振とうし、
そして冷たい中で遠心分離した。これらのアリコート上
澄みの１５ｕｌを臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂ
ｒｏｍｉｄｅ）を含むアガロースゲル上に載せ、青色素
が２ｃｍに及ぶまで電気泳動する。上澄みにＤＮＡある
いはＲＮＡを検出するためにＵＶ光ボックス上でゲルを
詳しく調べる。大部分の抽出物に対しては、アガロース
ゲルテストによる全てのＤＮＡを除去するために最少必
要量以上の過剰の５％ＰＥＩを約１／１００容量（即
ち、３００ｍｌの抽出物に対して２〜３ｍｌ）使用す
る。少なくとも１５分冷中で撹拌する。それから抽出物
の遠心分離を行って大部分の核酸を除去する。上澄みは
ペレットの少しの痕跡も避けるように保つ。伝導度が下
がるまでＫＴＡバッファーでＰＥＩ上澄みを希釈する、
あるいは２２ｍＭの硫酸アンモニウムを加えることでＫ
ＴＡバッファーの伝導度を低下させる。（ＫＴＡに純正
の２２ｍＭ Ａ．Ｓ．の類似の希釈液に比べて１／４０
の希釈液を加えて伝導度をチェックする）。通常これは
約５倍の希釈液である。

【０１０３】Ｂｉｏ−Ｒｅｘ７０（Ｊｏｙｃｅ＆Ｇｒｉ
ｎｄｌｅｙが用いた）（Ｊｏｙｃｅ，Ｃ．Ｍ．＆Ｇｒｉ
ｎｄｌｅｙ，Ｎ．Ｄ．Ｅ．（１９８３）Ｅ．ｃｏｌｉの
ＤＮＡポリメラーゼＩの多くのタンパク質分解フラグメ
ントを過剰に生産するプラスミド構築、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０，１８３０
−１８３４）によるクロマトグラフィーは不成功（結合
しない）であるが、それなしでは次のカラム（ヘパリン
アガロース）が効率的に作用しないであろうから止むを
得ない。我々はＢｉｏ−Ｒｅｘ７０ステップの重要な作
用が幾つかのタンパク質をよく除去することができるけ
れども、過剰のＰＥＩを全て除去することであると信じ
ている。ＣＭ−セルロースはＢｉｏ−Ｒｅｘ７０に対す
る代用物ではない。

【０１０４】希釈したＰＥＩ上澄みにそれに釣り合うＢ
ｉｏ−Ｒｅｘ７０を通す（１００ｇ細胞当り１０ｍ
ｌ）。ポリメラーゼ活性は流れ通ってしまう。２カラム
容量の２２ｍＭ Ａ．Ｓ．／ＫＴＡでカラムを濯ぐ。我
々の手順は、Ｂｉｏ−ＲＥＸ７０をカラムに直接流すよ
うにして次のようなヘパリンアガロースカラムをセット
アップする。

【０１０５】ヘパリンアガロースクロマトグラフィー
（室温、フラクションをそれらが離れるように氷上に置
く）。ヘパリンアガロース（シグマ社；細胞の１００ｇ
当り１０ｍｌ〔これはヘパリンアガロースを非常に少な
くできる〕。）の上にＢｉｏ−Ｒｅｘをゆっくり流し入
れて充填する。ＫＴＡ＋２２ｍＭ Ａ．Ｓ．の数カラム
容量分、それからＫＴＡ＋６３％グリセロール＋１１ｍ
Ｍ Ａ．Ｓ．の３カラム容量分で洗浄する、それからＫ
ＴＡ＋６３％グリセロール＋２２２ｍＭ Ａ．Ｓ．＋
０．５％Ｔｈｅｓｉｔ（これは最終溶離のためのＴｈｅ
ｓｉｔである）で純粋な酵素を溶離する。ポリメラーゼ
活性あるいはＯＤ₂₈₀ ／（２２２ｍＭでスタート後１つ
のカラム容量の２／３でスタートする、それはおよそ２
カラム容量分の広さである）のピークをプールする。−
２０℃でプールを貯蔵する。

【０１０６】貯蔵バッファーは混成物であり、僅かな変
異体である、即ち、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔ
ｕｓにより推薦されるＡｍｐｌｉＴａｑ貯蔵バッファ
ー、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍが用いた
Ｔａｑ貯蔵バッファー：５０％グリセロール（ｖ／ｖ；
６３％ｗ／ｖ），２２２ｍＭ硫酸アンモニウム（ベンチ
強さサンプルに対して約５０ｍＭに希釈）、２０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．５５、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１０ｍＭ メルカプトエタノール、０．５％Ｔｈｅ
ｓｉｔ）である。このＴｈｅｓｉｔは幾つかの厚さと曇
りを−１０℃以下で引き起こす。これは害を引き起こす
ことはないと思われるが、本発明者は使用に当たってア
リコーティングする前に氷の上で０℃で酵素を温めるこ
とを提案する。Ｔｈｅｓｉｔは２者択一として考えら
れ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，０．５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０の化合物に置き換える。

【０１０７】凍結は酵素の活動を阻止することを本発明
者は折々に報告した。問題はこの点にある。この問題は
現在研究されている。−８０℃での貯蔵（液体窒素で急
冷後）はテストされつつあり、そして見込みのあるよう
に思われるが、１回より多い凍結融解サイクルは数回の
酵素調製で有害であった。７リッター（１００ｇ細胞）
からの酵素の最終収率は、ｍｌ当り（４ｘベンチ強さ）
１２０，０００ユニットの濃度で２８ｍｌであった。１
／４ｕｌのベンチ強さの酵素は１００μｌ反応において
２ｋｂスパンのＤＮＡのＰＣＲを支持する。鋳型は５〜
１０ｎｇのプラスミドＤＮＡである。各サイクルは１ｍ
ｉｎ９８℃、１ｍｉｎ６５℃、６ｍｉｎ７２℃である。
サイクル数は１６〜２０である。より小さい酵素はより
小径の生成物（５００ｂｐに対して１／８ｕｌ）のため
に必要であり、より大きい酵素はより大きな生成物（５
ｋｂに対して１ｕｌ）に必要である。

【０１０８】 ＫＴＡバッファー １リッター当り ２０ｍＭ トリス８．５５ １０ｍｌの２Ｍ １０ｍＭ ＢＭＥ ０．７ｍｌ ニート １０％ ｗ／ｖグリセロール １００ｇ ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ０．２ｍｌの０．５Ｍ ０．１％ ｗ／ｖ Ｔｈｅｓｉｔ １０ｍｌの１０％

【０１０９】ラフなＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ分析 １Ｘ ＰＣ２ バッファー（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
ｐＨ８．５５、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１６ｍＭ
（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ 、１００ｕｇ／ｍｌ ＢＳＡ） ２００〜２５０ｕｇ／ｍｌ活性化したサーモン（ｓａｌ
ｍｏｎ）スペルム（ｓｐｅｒｍ）ＤＮＡ ４０ｕＭの各ｄＮＴＰ＋ｍｌ当り１０〜５０ｕＣｉα−
³²Ｐ−ｄＡＴＰ

【０１１０】氷の上の２５ｕｌの分析混合物に未希釈の
あるいは８ｕｌの１ＸＰＣ２バッファー（あるいはその
１／５または１／２５希釈物）で希釈した０．２ｕｌの
酵素断片を加える。標準ＫｌｅｎｔａｑあるいはＡｍｐ
ｌｉｔａｑ、ゼロ酵素とインプットする全試料を準備す
る。７２℃で１０分インキュベートし、それから冷や
す。濾紙上に５あるいは８ｕｌスポットし、５〜１０分
で２回５％ＴＣＡ，１％ＰＰで洗う。若し、数枚の濾紙
を用いる時は、セレンコフ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ）放射線
あるいはハンドモニターでそれぞれカウントする。若
し、１枚の３ＭＭ紙を使用したときは、６０′でオート
ラジオグラフする。

【０１１１】２ｋｂ生成物を得るためのＰＣＲ分析 ５０ｎｇのプラスミドｐＬｃ（とうもろこし（ｍａｉｚ
ｅ）からのＲ色対照ｃＤＮＡのクローン（ｃｌｏｎｅ）
ＰＮＡＳ ８６：７０９２；サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）２４７：４４９））を含む１ｍｌのＰＣＲ反応物を
調合し、プライマーＬｃ５（配列番号：１１）およびＬ
ｃ３（配列番号：１２）、ＰＣ２ バッファーと２００
ｕＭのｄＮＴＰのそれぞれ２００ｐモルを加える、しか
し酵素は加えない。チューブの１つのなかに１００ｕｌ
を、そして残りの８〜１０のチューブのなかに５０ｕｌ
を分配する。チューブの１つにＫｌｅｎＴａｑのファイ
ナルプール（ｆｉｎａｌ ｐｏｏｌ）１ｕｌを加え混合
する。それから、５０ｕｌの２つのチューブを切り離
し、それを混合し、２段階で減少しつつある量の酵素を
加える。各５０ｕｌの反応物に鉱油、スピンの１滴を加
えて蓋をし、そして２′９５°、２′６５°、５′７２
°でＰＣＲ１６サイクルを行う。

【０１１２】最終的なＫｌｅｎｔａｑ−２７８酵素のベ
ンチ長さ ２２２ｍＭの硫酸アンモニウムを含む６３％グリセロー
ル／ＫＴＡ（．５％Ｔｈｅｓｉｔ）バッファーを用いな
がら、ＰＣＲによる２ｋｂスパンの増幅をその１／４ｕ
ｌを触媒として用いてプールを慎重に希釈する。硫酸ア
ンモニウム濃度は５０ｍＭ以下に減少させない。貯蔵は
−２０℃である。

【０１１３】実施例４ ＤＮＡ増幅 図３にレポートしたように、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａ
ｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ）
（先行技術、ＤＮＡポリメラーゼ）とＫｌｅｎｔａｑ−
２７８を用いて導かれた２ｋｂのＤＮＡ生成物を作るた
めにＰＣＲ増幅を測定する。ポリメラーゼの耐熱性をテ
ストするために、温度を上げ、ＰＣＲ増幅反応のＤＮＡ
変性段階を等級別にした濃度のＤＮＡポリメラーゼを用
いながら、それぞれ２分で９７℃、９８℃、９９℃で導
いた。増幅手段は、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３９：４８７，１９８８によって概要が述
べられた増幅する核酸配列のための、おおよそ次のよう
なプロトコルを用いた。１００ｎｇのプラスミドｐＬ
Ｃ，プライマーＬｃ５（配列番号：１１）とＬｃ３（配
列番号：１２）の夫々２００ｐモル、反応バッファー
（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．５５、１６ｍＭ
の硫酸アンモニウム、２．５ｍＭのＭｇＣｌ₂ および１
５０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ）、２００ｕＭのｄＮＴＰを含
有する１ｍｌの反応混合物を準備した。酵素は用いな
い。反応混合物の１００ｕｌはチューブの中においた。
それから、ＡｍｐｌｉＴａｑとＫｌｅｎｔａｑ−２７８
の割り切れる数を加え、そしてＰＣＲを２０サイクル行
った（ｕｎｄｅｒｔａｋｅｎ）。

【０１１４】図３は実用の耐熱性限界を比較するために
行った実験の結果を示すものである。３枚のパネルの間
で示される唯一の違いは、２分、変性段階：９７℃、９
８℃、９９℃の温度である。酵素濃度の範囲は効果的な
ＰＣＲ触媒活性度の上に小さな効果を検出するために用
いた。

【０１１５】鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）は１０ｎｇのｐ
Ｌｃ（とうもろこしからのＲ色対照ｃＤＮＡのクロー
ン。ＰＮＡＳ ８６：７０９２，サイエンス２４７：４
４９）である。プライマーはＬｃ５（配列番号：１１）
とＬｃ３（配列番号：１２）である。この反応の他の詳
細は実施例３の測定の項に与えられている。この実験に
おいて、９８℃がＫｌｅｎＴａｑ−２７８に対して損害
が検出されず、なおかつＡＴはこの温度で殆ど完全に不
活性になるということを見ることができる。

【０１１６】図４に示す実験において、４つの酵素（Ａ
Ｔ，ＫｌｅｎＴａｑ−２７８，ＳＴ，ＫｌｅｎＴａｑ−
２９１）のそれぞれの９８℃での耐熱性のテストを行っ
た。それぞれを２つのファクターによって異なる２つの
濃度の対（ペア）にしてテストした。現実の酵素調製の
容量はｕｌにて上記各レーンに示した。使用した量は、
活性度において２倍のドロップオフ（ｄｒｏｐ−ｏｆ
ｆ）を検出したように、前以て滴定で調節した（実施例
３と図３における凡例で２ｋｂのＰＣＲ測定のために記
述したようにして導いた。）９５℃で対照ＰＣＲを機能
させるために多量のＳＴを必要とする。前述のこの実験
の試み（データは示していない）は、ＳＴの１／４量の
みを用いた（ＳＴはＫＴ−２９１とＫＴ−２７８を比較
した同等標準ＤＮＡポリメラーゼ導入ユニットである）
が、生成物は得られなかった。

【０１１７】実施例５ 単コロニーＰＣＲ ＰＣＲによるシングルＥ．ｃｏｌｉの分析は、クローニ
ングあるいはリクローニング中に所望するＤＮＡフラグ
メント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の存在および／または配向
を決定するための都合のよいスクリーン（ｓｃｒｅｅ
ｎ）である。先行技術において、細菌はそれらがＰＣＲ
にとって鋳型となるべきプラスミドＤＮＡを解放するた
めに十分に有効なリーゼ（ｌｙｓｅ）でないことが明ら
かなので、完全なＰＣＲ反応に対して容易に加えること
はできない。その代わりとして、そして厄介な全く余分
のラベル付きテストチューブを必要とするので、細菌は
最初に水で懸濁し、バッファーなしで任意に、しかし推
薦された（Ｒｉｇｇｓ ｅｔａｌ）キレート樹脂の存在
下で数分間（１０のような）１００℃に加熱する。それ
から加熱した細菌懸濁液の１〜１０ｕｌを別の反応容器
に加える。それからこのＰＣＲ反応を循環し、普通に分
析する。

【０１１８】ここに改良は、各ＰＣＲサイクルの変性段
階中、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は９８〜９９℃を凌ぐこ
とがあるので、細菌は直接加えることができ、そして完
全な（Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８酵素を含んでいる）ＰＣ
Ｒ反応にとって都合がよく、それからさらに予備処理す
ることなくＰＣＲサイクリングを開始することができい
るということである。普通のＰＣＲサイクリングと唯一
異なるのは十分な９８℃（２分）あるいは９９℃（１
分）の温度がＰＣＲの各変性段階（あるいは少なくとも
最初の５〜１０段階）中で用いられることである。図５
における実験では全２５サイクルに対して９８℃で２分
を使用し、そしてこの方法では１０′１００℃の分離処
理を利用するこれまでの方法よりもっと強靱で確実に区
別した生成物バンドが与えられることを示している。こ
の改良はＡＴ酵素が９８℃（図３および４に示すよう
に）で不活性化されるので、ＡＴ酵素と一緒には行うこ
とはできない。

【０１１９】図５はコロニーＰＣＲの標準９５℃の温度
と比較した９８℃での変性段階の利益の実例を示すアガ
ロースゲルの写真である。レーン１と３はＰＣＲ反応へ
の付加の前に１００℃で１０分間、蒸留した水で細菌の
先行技術の予備処理を行ったものである。レーン２と４
は、都合よくこの段階を免除して同じ量の細菌懸濁液
（約２〜４Ｘ１０⁶ 細胞、しかし同一容量の同じ細菌懸
濁液）を完全なＰＣＲ反応（バッファー、トリ燐酸塩、
プライマーそして酵素ＫｌｅｎＴａｑ−２７８）に単に
導入したものである。レーン１と２は標準９５℃で使用
し、レーン３と４は新たに可能な９８℃変性／細胞破壊
温度を用いた。サイクル条件は２５サイクルに対して９
８℃あるいは９５℃で２分、６５℃で２分、７２℃で５
分である。

【０１２０】プライマーはＫＴ２（３７ｍｅｒＧＡＧ
ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＡ ＡＣＣＴＧＴ ＧＧＧ ＧＧ
Ａ ＧＧＣ ＴＴＧ ＡＧＧ ＧＧＧ Ａ）とＫｌｅｎ
Ｔａｑ−３２（図１参照）を使用した。細菌細胞はプラ
スミドｐＷＢ３１９を含むＸ７０２９、ＫｌｅｎＴａｑ
−２７８に対する遺伝子のコーディング域を含む広い宿
主範囲のプラスミドを用いた。レーン４は最も都合のよ
い、最も効率のよい方法であって、ＫｌｅｎＴａｑ−２
７８の新しい安定性を利用するものである。

【０１２１】実施例６ 長いＤＮＡターゲットの効率的で適格なＰＣＲ増幅：
（ＰａｒｔＡ） 上式（ＫｌｅｎＴａｑ−ＬＡ）の好ましい具体例：貯蔵
したバッファーに精製した酵素、２．５ｕ．／ｕｌで１
ｕｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、２５ｕ．／ｕｌで
６４ｕｌのＫｌｅｎＴａｑ−２７８を入れてスタートす
る。貯蔵は−２０℃である。大量のＰｆｕは幾らかのＰ
ＣＲ増幅に対して損害を生じ、幾らかに対しては同等で
あり、そして幾らかに対しては有益である。Ｐｆｕの最
適レベルのテストについて、ＫｌｅｎＴａｑ−２７８と
ともに幾つかの反応を果たすには、左から右へ７５ｕ
ｌ、２５ｕｌ、２５ｕｌの量の割り切れる数のＰｆｕが
必要である。そして多くの付加において所望されるのは
２５ｕｌの割り切れる数である。それから、３／８ｕｌ
のＰｆｕ（１００ｕｌ当り０．５ｕｌで当量−これは要
望されるところのほぼ最大である）が最も左の７５ｕｌ
反応物に加えられ、混合される。引き続き、２倍の希釈
液がチューブの列に沿って左から右に２５ｕｌ＋２５ｕ
ｌのように作られ、ＫｌｅｎＴａｑ−２７８のみの対照
とする最後のものにはＰｆｕは加えない。また、Ｐｆｕ
のみの１／２あるいは１ｕｌ（１００ｕｌ当り）も行
う。

【０１２２】反応バッファーは上記のようなＰＣ２であ
って、各２００ｕＭのｄＮＴＰで補足され、そして８０
０ｕＭのＭｇＣｌ₂ （トータルＭｇ⁺⁺３．３ｍＭ）、反
応容量の１００ｕｌ当り各プライマーＭＢＬ（配列番
号：７）とＭＢＲ（配列番号：８）の２０ｐモルと損な
われていないファージλｐｌａｃ５の３０ｎｇを加え
る。反応容量の１００ｕｌ当り、１あるいは１／２ｕｌ
のＫＴＬＡが酵素の効率的なレベルである。

【０１２３】適当なＰＣＲサイクリング条件は２つの温
度である：それは２０サイクルに対し、９４℃で２０
秒、７０℃で１１分である。２つの温度を含む交互のサ
イクリング条件９８℃で１分と６５℃で１０分をＰＣＲ
に適用した。臭化エチジウムで着色することによって生
成物分析のためにアガロースゲルの上に１０〜１６ｕｌ
を入れた。他の詳細と変異は図６および図１４を参照さ
れたい。鋳型はλｐｌａｃ５であり、これはＥ．ｃｏｌ
ｉゲノムのｌａｃオペロン領域の部分に運ばれる。３０
ｎｇのＤＮＡは反応容量の各１００ｕｌに含まれてい
て、そっくりファージ粒子として導入される。プライマ
ーは野生型ラムダＤＮＡと同族体であり、ｌａｃＤＮＡ
ではなくλＤＮＡを拡大する。プライマーＭＢＬＮｏ．
８７５７（５’ヌクレオチド組合わせ塩基対２７９１４
のλＤＮＡ）はＧＣＴ ＴＡＴ ＣＴＧ ＣＴＴ ＣＴ
Ｃ ＡＴＡ ＧＡＧ ＴＣＴ ＴＧＣ（配列番号：７）
である。プライマーＭＢＲＮｏ．８８３５（５’ヌクレ
オチド組合わせｂｐ３４５７０のλＤＮＡ）はＡＴＡ
ＡＣＧ ＡＴＣ ＡＴＡ ＴＡＣ ＡＴＧ ＧＴＴ Ｃ
ＴＣ ＴＣＣ（配列番号：８）である。従って増幅した
生成物のサイズは６６５７ｂｐであると断定される。

【０１２４】図６と図１４Ａに示すように、各ＤＮＡポ
リメラーゼ酵素（ＫｌｅｎＴａｑ−２７８あるいはＰｆ
ｕ）のみは弱い生成物バンド（幾つかの反応を除いて、
Ｐｆｕのみは少しも作用しない時）に対してのみ生ずる
が、それ自身触媒の働きをすることができる酵素より２
０〜５０倍強い生成物バンドに対しては全て結合を生ず
る。図１４Ｂの右から２番目のレーンは１ｕｌのＫｌｅ
ｎＴａｑ−２７８（１ユニットに対する割合１／６４
０）に対して１／６４ｕｌのＰｆｕの少量を加えること
で驚くべき結果を示している。データは示されていない
が、１／２００ｕｌ（ユニットに対し１／２０００）の
Ｐｆｕ少量がこの増幅テストの効率の改良に顕著に寄与
する。

【０１２５】ベント（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼは
類似の機能性のために１０倍以上の量（しかしまだ少
量）が要求される。加うるに、ＰＣＲ反応における有利
なそして期待しない特性はＫｌｅｎＴａｑ−ＬＡによる
触媒作用が驚くべきことで、決してＰＣＲ生成物バンド
に対する前もって観察した強烈で鋭いというほどではな
い。ある程度までこの増加した収量は撮影した写真の中
央のバンド部に暗い領域として明らかにされている。エ
チジウム蛍光によるこの暗い領域はバンドの外側部分に
おけるＵＶ吸収によるものと思われ、ポテンシャルＵＶ
−活性の蛍光で減少する。このシステムは先行技術から
した時、生成物の大きな収量の増加を明白に認めてお
り、そしてこれは生成物の広い汚れを作りだす傾向にあ
り、そして増幅がこの評価を続けた時、副生物の量を増
加させる。

【０１２６】実施例７ 長いＤＮＡターゲットの効率的で適格なＰＣＲ増幅：
（ＰａｒｔＢ） ８．４ｋｂ、１２．５ｋｂ、１８ｋｂの有効な増幅が図
７に描かれた実験によって示された。この実験は、発明
の１／６４０ＫｌｅｎＴａｑ−ＬＡ、さらに同等の好ま
しい具体例の性能表示を拡大したものである。この増幅
は８．４〜１５ｋｂの大きさの範囲における大いなる成
功であり、１８ｋｂにおいても上首尾を確かめたが１
９．７ｋｂの試みに対しては不成功であった。８つの異
なるＰＣＲ反応が、この実験において行われた。図７に
凡例で示すように、鋳型あるいは鋳型の量あるいはプラ
イマーの対におけるお互いの差異が用いられた。各反応
は３つの方法に分けられ、パートＡ，Ｂ，Ｃに別々に循
環した。パートＡとＢの間では、この実験は変性相を９
４°で３０サイクルに対して２０サイクルの比較を行っ
た。パートＢとＣにおいては、この実験は３０サイクル
における９３°と９４°の比較を行った。

【０１２７】この実験は、反応の１００ｕｌ当り１．３
ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−ＬＡ（Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８
／Ｐｆｕの比は６４０）を用いた。高酵素が前以ての実
験においてゲルを入れることができない大異変の生成物
合成が想起されたことから、チャンネル２Ｂと６Ｃにお
いてはここで反応生成物が生じるので、あまりにも多い
酵素を少量とした。発明で用いている長い（ｌｏｎｇ）
ＰＣＲの成長の一般に知られている段階では約１０％の
時間ではこれは僅かな結果が生じている。

【０１２８】条件ＢとＣを比較すると、多少低い変性温
度が必要であることが明らかである。これは９４℃で同
じような実験で比較した時間と一致しており、長いＰＣ
Ｒ生成物の収量は、各サイクルの変性段階で９４℃で
２、２０、６０、そして１８０秒において変性時間の増
加につれて減少することがわかっている。これらのデー
タはそれが少なくとも１つの弱点であることを示してお
り、即ち、反応において最少の耐熱性成分は９４°で不
活性となるのである。９４°がＤＮＡポリメラーゼ活性
度とこのＤＮＡに損害を与える低い温度であることが知
られているので、それは不耐熱性の成分ではないと信じ
られている。本発明でこの点の別の具体例において、Ｐ
ｆｕＤＮＡポリメラーゼは少量の成分として多くの耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼと置
き換えられるが、制限はなく、それは古代細菌株ＥＳ４
で知られ、１１４℃以上の温度で成長できるものであり
〔Ｐｌｅｄｇｅｒ，Ｒ．ＪおよびＢａｒｏｓｓ，Ｊ．
Ａ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３７（１９
９１）〕、その最大成長温度はＰｆｕＤＮＡポリメラー
ゼ（１０３℃；Ｂｌｕｍｅｎｔａｌｓ，Ｉ．Ｉ．ｅｔ
ａｌ．（１９９０）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅＮ．
Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５８９：３０１−３１４．）の
それを越えるものである。

【０１２９】図７の実験において、１５ｋｂバンドの最
終の強さは、類似サイズのバンドで３０サイクルにおい
てＫａｉｎｚｅ ｅｔ ａｌ上記が得た収量および類似
のλＤＮＡ鋳型量に２０サイクルのみにおけるものを組
み合わせたものである。これは発明で用意した改良した
効率の物差しであり、そしてさらなる結果は、３０サイ
クルで発明が触媒とした収量が３０サイクルでこれらの
人達が報告した収量を大きく越えるものである。この２
つの方法の効率を測定しての正確な量はまだわからない
が、図７の検査はＫａｉｎｚｅ ｅｔ ａｌが公にした
数量に比べると、１５ｋｂフラグメントの収量は約１０
０倍高いと見積もられることを示している。これはＰＣ
Ｒ拡張のおよそ２倍の効率に対応する。

【０１３０】実施例８ 長いＤＮＡターゲットの効率的で適格なＰＣＲ増幅：
（ＰａｒｔＣ） 材料と方法 ＤＮＡポリメラーゼ。Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼと
Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼは新しい英国
の生化学研究所から供給されている。ＰｆｕＤＮＡポリ
メラーゼとそのエキソ突然変異体はＳｔｒａｔａｇｅｎ
ｅから２．５ユニット／ｕｌで供給されている。Ｋｌｅ
ｎｔａｑ−２７８はＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＷＭ
Ｂ，未公開）のＮ−末端欠失変異型である。この欠失終
点はＫｌｅｎｔａｑ５（１０）とＳｔｏｆｆｅｌフラグ
メント（３）のそれとの間である。精製したＫｌｅｎｔ
ａｑ−２７８は２５〜３５ユニット／ｕｌ（約０．７ｕ
ｇ／ｕｌのタンパク質濃度）で抗体ペプタイド、セント
ルイス、ＭＯ，ＵＳＡから供給されている。１ユニット
のＤＮＡポリメラーゼ活性度は７２℃で３０分で１０ｎ
モルのヌクレオチドに導入され、鋳型として活性化した
（部分的に退化した）仔牛の胸腺ＤＮＡが利用されてい
る。活性化した仔牛の胸腺ＤＮＡは多少はっきりしない
基質であり、構造上ＰＣＲ反応基質とは異なっている。
この分析は上のＫｌｅｎｔａｑ−２７８の貯蔵濃度にセ
ットしてＰＣＲ−塩基対を測定する一定した手順を避け
た：６５℃で７分のアニーリング／伸長を含むサイクリ
ング条件で、１０ｎｇのプラスミド基質から２ｋｂ標的
スパンの増幅を触媒する（しかし、．１２ｕｌより少な
いことが効率的）のに０．２５ｕｌが効率的であるの
で、貯蔵しているＫｌｅｎｔａｑ−２７８の濃度を調節
した。

【０１３１】１５／１６ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−２７８
＋１／１６ｕｌのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの混合物は
ＫｌｅｎｔａｑＬＡ−１６と呼ばれている。アガロース
ゲルの電気泳動は装填する色素中にグリセロールに代え
て３％のフィコルと２〜３ｖ／ｃｍの１ＸＧＧＢ（ＴＥ
Ａ）バッファー〔４０ｍＭのトリス酢酸塩ｐＨ８．３、
２０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．２ｍＭのＥＤＴＡ〕に
０．７％〜１％のアガロースが使用される。図１１は４
秒のスイッチング時間で１％のアガロースパルス型ＣＨ
ＥＦ（１１）を使用した。各図における標準ＤＮＡフラ
グメントサイズはキロベース（ｋｂ）において２３．
１、９．４、６．６、４．４ ２．３、２．０、そして
０．５６である。また、図１１と１２はλｐｌａｃ５標
準バンドの全長は４８６４５ｂｐであった。

【０１３２】全アガロースゲルを注ぎあるいは０．５ｕ
ｇ／ｍｌの臭化エチジウムにて着色し、そしてＵＶ光の
下で写真（３５ｍｍＡＳＡ４００，白黒フィルム）かビ
デオグラフ（アルファＩｎｎｏｔｅｃｈあるいはＳｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ ＥａｇｌｅＥｙｅ）に撮った。ゲル写
真を印刷したところ、図７と１０の左半分は右半分より
５０％露光が少なかった。

【０１３３】表１と配列表に載せたＤＮＡプライマー。 λＤＮＡ鋳型。Ｓ．Ｐｈａｄｎｉｓからの贈り物である
λｖａｃＡは蝸牛状のｐｙｌｏｒｉＤＮＡの細胞傷害遺
伝子領域のλＥＭＢＬ４−ベクトルクローンである。こ
のＤＮＡは抽出して凍結貯蔵される。他のファージ鋳型
ＤＮＡｓλｐｌａｃ５（１２）とλＫ１３８（１３）は
ＣｓＣｌの平衡遠心分離によって精製されたそのままの
ファージ粒子として加えられ、透析され、そして１ＸＰ
Ｃ２バッファーにて希釈される。

【０１３４】長くそして正確なＰＣＲ。２０ｍＭのトリ
ス−ＨＣｌ ２５℃のｐＨ８．５５、１５０ｕｇ／ｍｌ
のＢＳＡ、１６ｍＭの硫酸アンモニウム、３．５ｍＭの
ＭｇＣｌ₂ 各ｄＮＴＰよりなるＰＣ２反応バッファー
（１０）。上記の２８ｋｂ（ａｔ３５ｋｂ）を成功させ
るために、２５℃で水に２０ｍＭのみのトリス−ＨＣｌ
成分を加えて測定したｐＨ９．１に対応させるべく、
１．５ｕｌの２Ｍのトリスベースを各々の反応液に加え
た。反応に有害であるものはｐＨ探査で接触させ、そこ
でｐＨを分離アリコートのみについて測定し、２５℃で
最終反応物はｐＨ８．７６であった。反応容量の各１０
０ｕｌには各プライマー２０ｐモルを含んでおり、そし
て０．１〜１０ｎｇのファージＤＮＡ鋳型を含んでい
る。夫々に２０ｋｂ下または２０ｋｂ以上で０．８ある
いは１．２ｕｌのＫｌｅｎｔａｑＬＡ−１６を加えた。
チューブ当りの反応容量は３３〜５０ｕｌであり、プラ
スチックテストチューブの薄壁（ＰＧＣあるいはＳｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）に４０ｕｌの鉱油を加えた。

【０１３５】ＰＣＲ反応はファージ粒子を引き裂くため
に、そしてプライマー同族体を完成するためのλ付着末
端の充満を認めるために６８〜７２℃で５分の前保温
（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）を必要とする末端λの
プライマーを利用している。最適のサイクリング条件
は、複合のブロック器具（ロボサイクラー、Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）で表１に示す範囲を越えて標的長さに依存
しながら、サイクル当り９９°で３０秒、６７°で３０
秒そして６８°で１１〜２４分で段取りした。第２の最
良サイクラーはオムニゲン（ＨｙｂＡｉｄ）で類似のア
ニーリング／拡張時間に対してサイクル当り９５°で２
秒でチューブ管理の下で段取りした。別の状態がなけれ
ば、ここでの実験の全ては２４サイクルを用いて記録し
た。

【０１３６】サイクリング温度と時間、熱サイクラー
機、厚くそして薄い壁を有するチューブ等のような条件
の比較結果を記録するために、反応物を１００ｕｌとし
て調合し、それからＰＣＲサイクリングに委ねる前に同
一の３３ｕｌのアリコート中で分離した。

【０１３７】

【表１】

【０１３８】表１に対する凡例 整数ベース対で生成物の大きさはＧｅｎｂａｎｋ受入番
号ＪＯ２４５９と参考文献（２１）に記録された配列と
λとλｐｌａｃ５の構造から予示されたものである。ｋ
ｂの小数点による生成物サイズは、それらの生成物とλ
Ｈ３を標準標識とするλ＋ＨｉｎｄＩＩＩとの比較によ
って決定される。プライマーの配列は配列表に与えられ
ている。

【０１３９】メガプライマーはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈ
ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（１４）のＣｒｙＶＩＣＰとし
てコーディングされる遺伝子のＥｃｏＲＩサイトとＢａ
ｍＨ１との間の領域に対する同類のゲル−純化した３８
４ｂｐＰＣＲ生成物ＤＮＡからなり、そしてこれらの制
限サイトを除去するためにプライマー修飾した。図１０
におけるＰＣＲ反応は、メガプライマー（３００ｎ
ｇ）、プライマーＢｔＶ５そしてＢａｃｉｌｌｕｓ ｔ
ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株ＮＲＤ１２（１５）から
の２０ｎｇのゲノミック（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡそし
て上記図９の記載に示されている酵素を夫々使用してい
る。サイクリング条件は２０サイクルで９５°で３０
秒、６０°で７分である。

【０１４０】ＨｉｎｄＩＩＩ消化作用。未分別、２８お
よび３５ｋｂターゲットに対する全ＰＣＲ反応は１／１
０容量の１０ＸＮａＴＭＳ（１Ｘ＝５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ，１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．７，１０ｍＭ
のＭｇＣｌ₂ ，１０ｍＭのメルカプトエタノール）と２
ｕｌ（１０ユニット）の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで補強
し、そして５５℃で９０分のインキュベートを行った。

【０１４１】エキソ−（ｅｘｏ−）Ｐｆｕのテスト。各
１００ｕｌの反応（４０ｕｌのオイルの下で３３ｕｌと
してインキュベートした）は、１ｕｌのＰｆｕＤＮＡポ
リメラーゼ（２．５ｕ．）のみを含む反応６を除いて、
純化したファージ粒子として２ｎｇのλｐｌａｃ５ＤＮ
Ａ、プライマーＭＢＬ−１．７そしてＭＢＲの各２０ｐ
モル、反応バッファーＰＣ２および１ｕｌのＫｌｅｎｔ
ａｑ−２７８（０．７ｕｇ）を含んでいる。他の詳細は
図１２の記述にある。温度条件は９４°で２秒、７０°
で１１分の２４サイクルである。

【０１４２】本発明のＤＮＡポリメラーゼ混合物を導く
発見は、ＰＣＲに不適当な組み合わせであるＡ−Ａ塩基
対でその３’末端を持つプライマーを利用する試みの中
から作られたものである。事実プライマーはそれ自身Ｐ
ＣＲ生成物”メガプライマー”の３８４ｂｐであり、そ
して不適当な組み合わせＡはＤＮＡポリメラーゼ（１
６）にふつう非−鋳型末端トランスフェラーゼ活性度を
有するＫｌｅｎｔａｑ−２７８が加えられる。Ｋｌｅｎ
ｔａｑ−２７８（図９、レーン３）もＰｆｕＤＮＡポリ
メラーゼ（図９、レーン１および２、そして他の酵素の
レベルは示していない）もＰＣＲ−生成物メガプライマ
ーと４２ｍｅｒオリゴヌクレオチドプライマーの間に横
たわっている１５００ｂｐ標的の増幅を触媒することは
できない。しかしながら、２つの酵素の結合は所望する
標的フラグメント（図９、レーン４）の増幅を十分に触
媒することはできる。明らかに、ＰｆｕＤＮＡポリメラ
ーゼは敢えて３’Ａ−Ａを除去し、ＰＣＲの各段階を効
率的に続行するために、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８を触媒
とすることができる。同じ結果はＰｆｕをベントＤＮＡ
ポリメラーゼで置き換えることで得られた（データは示
していない）。

【０１４３】出願人は一般に不適当な組み合わせの３’
−末端が少数のｋｂより大きい標的のＰＣＲ中で能率的
でないプライマーを延長させられるという仮説をたて
た。テストシステムとして、種々の標準状況でＡｍｐｌ
ｉＴａｑ，Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８あるいはＰｆｕＤＮ
Ａポリメラーゼによって貧弱にではあるが、拡大して検
出しうる６．６ｋｂのλＤＮＡ標的を用いた。１００ｕ
ｌの反応容量当り、１ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−２７８を
種々の量のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼと結合し、１／２
ｕｌからＰｆｕの１／２００ｕｌまでさげる。Ｐｆｕ群
（ｓｔｏｃｋ）（２．５ユニット／ｕｌ）はＫｌｅｎｔ
ａｑ−２７８群（２５〜３０ユニット／ｕｌ）より少な
くとも１０倍少ない濃度であるので、実際のテスト比は
ＤＮＡポリメラーゼユニットに対して１／２０〜１／２
０００である。

【０１４４】これらのテストの明らかな結果は図１４Ａ
に示されている。高収量の標的バンドは２つの酵素の結
合を全てテストして観察されるが、各酵素の幾つかのレ
ベルはそれ自身弱い検出増幅より多く触媒するため失敗
することがある。最も低いレベルのＰｆｕテストでは１
／２００ｕｌで僅かな有益な効果を示す。Ｋｌｅｎｔａ
ｑ−２７８対Ｐｆｕ１の外見の最適の割合は容積にして
１６あるいは６４であり、これはＤＮＡポリメラーゼ導
入ユニットを基準として約１６０あるいは６４０であ
る。

【０１４５】６〜８ｋｂでテストしたとき（データは示
していない）、３’−ｅｘｏ^- および３’−ｅｘｏ⁺ 耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼの他の結合もまたＡｍｐｌｉｔ
ａｑ／Ｐｆｕ，Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８／Ｖｅｎｔ，Ｋ
ｌｅｎｔａｑ５（デルタＴａｑ，ＵＳＢ）／Ｐｆｕ，Ｓ
ｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ／Ｐｆｕ，Ｋｌｅｎｔ
ａｑ−２７８／Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（本発明の第２の選
択）、そしてＰｆｕｅｘｏ^- ／Ｐｆｕ ｅｘｏ⁺ を含む
とき、効果を示した。たとえ、比較的に少ない試験で楽
観的に実施したとはいえ、他の結合試験はＫｌｅｎｔａ
ｑ−２７８／Ｐｆｕと同じ効果はなかった。

【０１４６】非常に短い加熱段階が好適である。次に出
願人はλ導入ファ−ジ鋳型で８．４〜１８ｋｂのサイズ
範囲でＤＮＡ増幅を企てた。我々の早期のサイクリング
原案は９５°あるいは９８°で１あるいは２分の変性段
階を用いたが、この加熱段階のパラメーターを９３°あ
るいは９４°で２秒あるいは２０秒に減ずるまで過剰の
８．４ｋｂで有用な生成物は得られなかった。９４°で
２０、６０、あるいは１８０秒の実験において、８．４
ｋｂ生成物はこの加熱段階（データは示していない）の
長さを増すことで減少した収量を示した。明らかに、反
応の構成成分が耐熱性の限界である。図７は短い２秒を
用いての結果を示している。８．４〜１８ｋｂの範囲内
において全サイズで幾つかの反応で得られる標的フラグ
メントは、変性段階でもし３０ＰＣＲサイクルを用いる
ならば、１５ｋｂで非常に高い生成物収量で得ることが
できる。また、図７は出願人が説明できない幾つかの失
敗した反応を示している。塊状のエチジウムで試料を汚
す（３０サイクル、レーン２）ことで引き起こす失敗モ
ードは特に高酵素レベルでは普通のことである。

【０１４７】より長いプライマー。プライマーの長さを
２７から３３に変えると、失敗反応の頻度を非常に減少
させることができる。図１０は２７ｍｅｒのプライマー
で所望の標的生成物に対して引き起こした失敗におい
て、別に最適の高酵素の条件下でより長い３３ｍｅｒで
１２．５、１５および１８ｋｂで増幅すると、信頼度を
改良できることを示している。この結果はプライマー長
さの広範な調査を示すものではなく、そして以下の改良
で繰り返されるものでもない。そのため、長いＰＣＲと
して留まるプライマー長さの最適条件を決めるべきであ
る。図１１に分析した増幅の幾つかは、真の末端λから
３６ｍｅｒのプライマーを利用したものである。６８〜
７２°（２２）で２〜５分の前保温はファージ粒子から
鋳型ＤＮＡを解放するため、そして鋳型同族体を完成す
るために接着端部のλにプライマーλＬ３６とλＲ３６
を満たすために必要である。

【０１４８】急速サイクリング。薄い壁面のチューブに
対する変化は、より低い熱容量とより多い熱伝導効率を
持たせることで更に反応を改良できる。図１１はＤＮＡ
スパン６−２６ｋｂサイズの増幅を成功させるＣＨＥＦ
ｐｕｌｓｅ−ｆｉｅｌｄアガロースゲル分析を示す。
２８ｋｂの標的はオムニゲン熱サイクラー（データは示
していない）で増幅しないが、ロボサイクラーを用いた
ときは増幅が現れる（図１２、レーン２）。

【０１４９】熱的サイクラーの幾つかの型を用いたとこ
ろ、すべては最適化できないが、幾つかは長いＰＣＲと
して好ましい。熱サイクラーの様々なモデルが使用され
ており、そして全てが楽観的ではないが、幾つかは長い
ＰＣＲに対して好ましい。上記に記した薄壁チューブの
有用性から断定できるように、成功は熱サイクラーのデ
ザインで決まる温度変化の高いスピードと積極的に相互
関係があると思われる。ロボサイクラーは塊から塊へチ
ューブを運動することによって急速な温度変化をなし遂
げるのであり、そしてサーミスター温度探針の指示で観
察するもので、僅か５秒で反応温度は９３〜９５°まで
上がり、変性条件下で（９９°ブロックで３０秒）、急
速前（３０秒以内）６８°反応を返す、のように使用し
た。

【０１５０】より高いｐＨ。現在の記録３５ｋｂ（図１
２、レーン３）はｐＨが上がると増幅性のみである。よ
り高いｐＨの予備調査を実施し（データは示していな
い）、ｐＨ８．８〜９．２で３５ｋｂバンドの外見でみ
たところ、（上記）方法で述べたように９．１が最適で
あるという結果を得た。さらに３５ｋｂ生成物の高収量
に対する改良では２４分まで延長時間を長くすることで
達成された。より高いｐＨであるほかに、長いＰＣＲ手
順はこれらの楽観的な８．４ｋｂからバッファー条件の
変化からは未だ何らの潜在利益も実現していない。２０
ｋｂｓ以上の標的にとって延長時間は２０分を越えるこ
とが好ましく、そして延長温度は６０℃以下が好まし
い。

【０１５１】ＰＣＲ生成物の同一性。図７、１０そして
１１でわかるように、大きなＤＮＡ生成物の成功の流動
性は表１に予言した使用したプライマーの既知のマップ
ポジションに一致している。未純化の２８そして３５ｋ
ｂ生成物（図１２、レーン５と６）のＨｉｎｄＩＩＩ制
限消化酵素はλ（２３ｋｂ）の左側と２．３ｋｂバンド
の両方から期待された結果で、そして右ＰＣＲプライマ
ーで末端化した予想されるバンドである：２８ｋｂから
４４７ｂｐ（やっと目で見える）の生成物と３５ｋｂか
ら７３３１ｂＰの生成物。

【０１５２】エキソヌクレアーゼ突然変異体。３’−エ
キソヌクレアーゼ活性度において欠陥のあるＰｆｕＤＮ
Ａポリメラーゼ（８）の有用な突然変異体をテストし
た。図１３はＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの３’−ｅｘｏ
^- 突然変異体が長いＤＮＡ標的の効果的な増幅を増進す
ることに失敗したことを示している。これはこのサイズ
範囲内で３’−エキソヌクレアーゼ活性度がＰＣＲ増幅
の効率化のために重要であるという我々の仮説を支持し
ている。

【０１５３】忠実度テスト。３’−エキソヌクレアーゼ
の生物学的目的から、忠実に高複製するためのミスマッ
チ塩基対が編集されており、、２つの選択的マーカー
（１０）が側面を接する完全なｌａｃＺ（β−ガラクト
シダーゼ）遺伝子の増幅と分子クローニングを含むアッ
セイを用いて出願人はＰＣＲ生成物の忠実度をテストし
た。これまでにＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（２）で触媒
されたＰＣＲ増幅の最高の忠実度を報告した。表２はＫ
ｌｅｎｔａｑ−２７８とＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの６
４０：１混合物で増幅した生成物の忠実度が、ＰｆｕＤ
ＮＡポリメラーゼのみが得られるという、各々が１６サ
イクルのＰＣＲを用いた時、少なくとも釣り合っている
ことを示している。我々のＫｌｅｎｔａｑ−ＬＡ（長く
て正確なＫｌｅｎＴａｑ）のような酵素混合物の指摘
は、高い忠実度の性能を跳ね返すものである。

【０１５４】

【表２】

【０１５５】（ａ）Ｋｌｅｎｔａｑ５は参考文献１０に
述べられたＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端欠失
である。（ｂ）参考文献１０の式１はｂｐ当りの誤差を
解きあかすために次のように再配列したものであって：
Ｘ＝−（ｌｎ（２Ｆ^(1/m-1) −１））／１０００、でこ
こでＸはｂｐ当り組み込まれる誤差、１０００はｌａｃ
Ｚ遺伝子（１０）における有効標的サイズであり、Ｆは
青コロニーの分別、そしてｍは有効サイクル数である。
（ｃ）参考文献１０におけるように有効サイクル数は現
実の反応効率に反映するマシンサイクルより少なく算出
されるが、しかし組合わせ増幅から計算した最小値より
高い。生成物鎖の不完全合成によるべき鎖ロスは理想的
な増幅効率より低い予想される。このため、成功（失敗
なし）生成物分子は計算した最少複製数より少ないと判
断される。ＫＴＬＡ−６４（容量でＫｌｅｎｔａｑ−２
７８：Ｐｆｕ：：６４：１）はその反応が生成物の比較
レベルで計算して１０倍の欠失ＤＮＡ（１．５ｎｇｖ
ｓ．１５ｎｇプラスミドｐＷＢ３０５）で開始されるの
で、より高い有効サイクル数が課されている。

【０１５６】討議 ＰＣＲ増幅のための先の長さ制限はミスマッチド塩基対
の結合サイトで延長の低効率によって生じると主張され
ている。けれどもそれはこれらのミスマッチのためのキ
ュアーが３’−（校正）−エキソヌクレアーゼとともに
酵素に用いられると思われている。出願人はＰｆｕとベ
ントＤＮＡポリメラーゼが触媒として用いられるとき、
それらの失敗は、特に要求される長い合成時間の間中、
そして最適な高いＤＮＡポリメラーゼレベルでそれらの
３’−エキソヌクレアーゼによるＰＣＲプライマーの減
成によるものであると信じている。明らかに、低レベル
の３’−エキソヌクレアーゼはＫｌｅｎｔａｑ−２７８
と増幅を進めるミスマッチの除去のために十分で最適で
ある。それは最適な低いレベルの３’−エキソヌクレア
ーゼが有効に、便利にそして柔軟に混合と希釈によって
セットすることができることを表している。

【０１５７】好ましくはｅｘｏ^- ／ｅｘｏ⁺ 酵素の割合
が高いことである。もし、等レベルの２つのタイプの酵
素が用いられるならば、（あるいはＥ２構成成分が過剰
にあるところの）あるいはもしｅｘｏ^- ／ｅｘｏ⁺ が４
あるいはそれ以下であるならば、たとえ下記で討議する
最適のサイクリング状況であっても、長いＰＣＲの有効
性は全く存在しないかあるいは大いに減少する。

【０１５８】ある応用のために、ＰＣＲの熱変性段階の
長さと温度を最小に保つことが重要である。さらに、増
加するｐＨによって得られる改良は僅かに鋳型の除プリ
ンの減少に対応することができる。もし除プリンを減少
することができるなら、あるいはもし除プリン位置を迂
回することができるような大多数のＤＮＡポリメラーゼ
成分をみつけることができるなら、さらなる改良を得る
ことができる。

【０１５９】短い変性時間が最適であることは分かって
おり、好ましくは２０秒以下、最も好ましくは５秒ある
いはそれ以下で、９５°で反応それ自身３５ｋｂの増幅
にとって驚くべき効果である。そうであるから長いＰＣ
Ｒ標的を完全に変性するために長い変性時間を要するの
である。もしＰＣＲにとって完全な変性が要求され、そ
してもしより長いＤＮＡを９５°でほどくためにもっと
時間を必要とするなら、要求したほどくための時間は結
局、５秒より以上重要となるのである。これは長い変性
時間によって生じた増えた除プリンのために増幅性生成
物のサイズを限定することができる。

【０１６０】これらの増幅は幾つかの異なった標的配
列、幾つかのプライマー結合で出来上がったものであ
り、生成物サイズでλ中にクローンした挿入物の最大サ
イズの２倍近くである。全ウイルスとプラスミドが長さ
において３５ｋｂまでアップし、このシステムとともに
増幅性となる。この方法はλより非常に複雑なＤＮＡに
適用できることが証明され、ゲノミック製図や次にくる
応用、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅が都合よく、そしてＤＮＡ
再配列を避け、そしてｉｎ ｖｉｖｏクローニングの遺
伝子毒性誘惑のために恩恵を証明することができる。

【０１６１】上記の見解において、この発明の幾つかの
目的が達成され、そして他の有利な結果に達することが
わかった。この発明の範囲からはずれることなく、上記
の方法と生成物から種々の変化を作り出すことができる
ので、上記記述に含まれる全ての事柄が例証として説明
され、制限を受けるものではない。参考文献 １．Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Schar
f, S.J., Higuchi, R.,Horn, G.T., Mullis, K.B., and
Erlich, H.A. (1988) Science 239, 487-491. ２．Lundberg, K.S., Shoemaker,D.D., Adams, M.W.W.,
Short, J.M., Sorge,J.A., and Mathur, E.J., (1991)
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【０１６２】 配列リストの内容の表 配列番号１： ＰＣＲプライマー ＫＴ１ 配列番号２： Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８のＮ−末端 配列番号３： ＰＣＲプライマー Ｋｌｅｎｔａｑ３２ 配列番号４： Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＣ− 末端 配列番号５： ｐＷＢ２５４ｂプラスミド発現ベクター 配列番号６： Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８のアミノ酸配列、完全形 配列番号７： ラムダＥＭＢＬ４挿入断片の左側のＰＣＲプライマー ＭＢＬ 配列番号８： ラムダＥＭＢＬ４挿入断片の右側のＰＣＲプライマー ＭＢＲ 配列番号９： ＰＣＲプライマー ＭＢＬ−１．７、 ＭＢＬの左に１７２９ｂｐ 配列番号１０： ｌａｃＺのＣ−末端におけるＰＣＲプライマー ＭＳＡ１９ 配列番号１１： ＰＣＲプライマー Ｌｃ５ 配列番号１２： ＰＣＲプライマー Ｌｃ３ 配列番号１３： ＰＣＲプライマー ＫＴ２ 配列番号１４： ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ遺伝子、ＫＴ１末端 配列番号１５： ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ遺伝子、３’末端 配列番号１６： ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ遺伝子、ＫＴ１末端 配列番号１７： ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ遺伝子、３’末端 配列番号１８： ＰＣＲプライマー ＢｔＶ３ 配列番号１９： ＰＣＲプライマー ＢｔＶ５ 配列番号２０： ＰＣＲプライマー λＬ３６ 配列番号２１： ＰＣＲプライマー ｌａｃＺ’５３３ 配列番号２２： ＰＣＲプライマー ｌａｃＺ３３３ 配列番号２３： ＰＣＲプライマー ｌａｃＺ５３６ 配列番号２４： ＰＣＲプライマー ＭＢＬ００２ 配列番号２５： ＰＣＲプライマー ＭＢＬ１０１ 配列番号２６： ＰＣＲプライマー ＭＢＲ００１ 配列番号２７： ＰＣＲプライマー ＭＢＲ２０２ 配列番号２８： ＰＣＲプライマー ＭＳＡ１９３３ 配列番号２９： ＰＣＲプライマー λＲ３６ 配列番号３０： Ｐｈｉ２９フラグメント１、領域ＩＩＩ 配列番号３１： Ｐｆｕフラグメント１、領域ＩＩＩ 配列番号３２： Ｐｈｉ２９フラグメント２、領域Ｉ 配列番号３３： Ｐｆｕフラグメント２、領域Ｉ

【０１６３】

【配列表】SEQUENCE LISTING <110> 寳酒造株式会社 Takara Shuzo Co., Ltd. <120> DNA Polymerases with Enhanced Thermostabilit
y and Enhanced Lengthand Efficiency of Primer Exte
nsion. <130> P1794 <150> US 08/021,623 <151> 1993-02-19 <150> US 08/202,032 <151> 1994-02-22 <160> 33

【０１６４】<210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Thermus aquaticus <220> <221> CDS <222> (6)...(35) <400> 1 gagcc atg ggc ctc ctc cac gag ttc ggc ctt ctg g 36 Met Gly Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 1 5 10

【０１６５】<210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Thermus aquaticus

【０１６６】<210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Thermus aquaticus <220> <221> CDS <222> (8)...(34) <400> 3 gcgaagctta ctactccttg gcggagagcc agtcc 35

【０１６７】<210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <220> <221> unsure <222> (8)...(9)

【０１６８】<210> 5 <211> 6714 <212> DNA <213> Expression vector <220> <221> CDS <222> (1)...(1665) <400> 5 atg ggc ctc ctc cac gag ttc ggc ctt ctg gaa agc ccc aag gcc ctg 48 Met Gly Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu Ser Pro Lys Ala Leu 1 5 10 15 gag gag gcc ccc tgg ccc ccg ccg gaa ggg gcc ttc gtg ggc ttt gtg 96 Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val 20 25 30 ctt tcc cgc aag gag ccc atg tgg gcc gat ctt ctg gcc ctg gcc gcc 144 Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala 35 40 45 gcc agg ggg ggc cgg gtc cac cgg gcc ccc gag cct tat aaa gcc ctc 192 Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu 50 55 60 agg gac ctg aag gag gcg cgg ggg ctt ctc gcc aaa gac ctg agc gtt 240 Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val 65 70 75 80 ctg gcc ctg agg gaa ggc ctt ggc ctc ccg ccc ggc gac gac ccc atg 288 Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp Asp Pro Met 85 90 95 ctc ctc gcc tac ctc ctg gac cct tcc aac acc acc ccc gag ggg gtg 336 Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val 100 105 110 gcc cgg cgc tac ggc ggg gag tgg acg gag gag gcg ggg gag cgg gcc 384 Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu Arg Ala 115 120 125 gcc ctt tcc gag agg ctc ttc gcc aac ctg tgg ggg agg ctt gag ggg 432 Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu Glu Gly 130 135 140 gag gag agg ctc ctt tgg ctt tac cgg gag gtg gag agg ccc ctt tcc 480 Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser 145 150 155 160 gct gtc ctg gcc cac atg gag gcc acg ggg gtg cgc ctg gac gtg gcc 528 Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala 165 170 175 tat ctc agg gcc ttg tcc ctg gag gtg gcc gag gag atc gcc cgc ctc 576 Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu Ile Ala Arg Leu 180 185 190 gag gcc gag gtc ttc cgc ctg gcc ggc cac ccc ttc aac ctc aac tcc 624 Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser 195 200 205 cgg gac cag ctg gaa agg gtc ctc ttt gac gag cta ggg ctt ccc gcc 672 Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala 210 215 220 atc ggc aag acg gag aag acc ggc aag cgc tcc acc agc gcc gcc gtc 720 Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val 225 230 235 240 ctg gag gcc ctc cgc gag gcc cac ccc atc gtg gag aag atc ctg cag 768 Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln 245 250 255 tac cgg gag ctc acc aag ctg aag agc acc tac att gac ccc ttg ccg 816 Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro 260 265 270 gac ctc atc cac ccc agg acg ggc cgc ctc cac acc cgc ttc aac cag 864 Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln 275 280 285 acg gcc acg gcc acg ggc agg cta agt agc tcc gat ccc aac ctc cag 912 Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln 290 295 300 aac atc ccc gtc cgc acc ccg ctt ggg cag agg atc cgc cgg gcc ttc 960 Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe 305 310 315 320 atc gcc gag gag ggg tgg cta ttg gtg gcc ctg gac tat agc cag ata 1008 Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile 325 330 335 gag ctc agg gtg ctg gcc cac ctc tcc ggc gac gag aac ctg atc cgg 1056 Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg 340 345 350 gtc ttc cag gag ggg cgg gac atc cac acg gag acc gcc agc tgg atg 1104 Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met 355 360 365 ttc ggc gtc ccc cgg gag gcc gtg gac ccc ctg atg cgc cgg gcg gcc 1152 Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala 370 375 380 aag acc atc aac ttc ggg gtc ctc tac ggc atg tcg gcc cac cgc ctc 1200 Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu 385 390 395 400 tcc cag gag cta gcc atc cct tac gag gag gcc cag gcc ttc att gag 1248 Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln Ala Phe Ile Glu 405 410 4I5 cgc tac ttt cag agc ttc ccc aag gtg cgg gcc tgg att gag aag acc 1296 Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr 420 425 430 ctg gag gag ggc agg agg cgg ggg tac gtg gag acc ctc ttc ggc cgc 1344 Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg 435 440 445 cgc cgc tac gtg cca gac cta gag gcc cgg gtg aag agc gtg cgg gag 1392 Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu 450 455 460 gcg gcc gag cgc atg gcc ttc aac atg ccc gtc cag ggc acc gcc gcc 1440 Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala 465 470 475 480 gac ctc atg aag ctg gct atg gtg aag ctc ttc ccc agg ctg gag gaa 1488 Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu 485 490 495 atg ggg gcc agg atg ctc ctt cag gtc cac gac gag ctg gtc ctc gag 1536 Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu 500 505 510 gcc cca aaa gag agg gcg gag gcc gtg gcc cgg ctg gcc aag gag gtc 1584 Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val 515 520 525 atg gag ggg gtg tat ccc ctg gcc gtg ccc ctg gag gtg gag gtg ggg 1632 Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly 530 535 540 ata ggg gag gac tgg ctc tcc gcc aag gag tagtaagctt atcgatgata 1682 Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 545 550 555 agctgtcaaa catgagaatt agcccgccta atgagcgggc ttttttttaa ttcttgaaga 1742 cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 1802 tagcgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg ccgggtgtgg 1862 tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 1922 tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 1982 tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 2042 gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 2102 agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaacttg aacaacactc aaccctatct 2162 cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 2222 agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag 2282 gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 2342 caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 2402 ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 2462 gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 2522 tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 2582 ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 2642 tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 2702 atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 2762 gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 2822 caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 2882 ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 2942 ccacgatgcc tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 3002 ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 3062 ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 3122 gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 3182 ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 3242 taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 3302 agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 3362 atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 3422 aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 3482 caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 3542 ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 3602 cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 3662 tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 3722 gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 3782 ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 3842 gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 3902 caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 3962 ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 4022 tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 4082 ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 4142 agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 4202 aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 4262 gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac 4322 tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga 4382 cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc 4442 cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagaacgc 4502 catcaaaaat aattcgcgtc tggccttcct gtagccagct ttcatcaaca ttaaatgtga 4562 gcgagtaaca acccgtcgga ttctccgtgg gaacaaacgg cggattgacc gtaatgggat 4622 aggttacgtt ggtgtagatg ggcgcatcgt aaccgtgcat ctgccagttt gaggggacga 4682 cgacagtatc ggcctcagga agatcgcact ccagccagct ttccggcacc gcttctggtg 4742 ccggaaacca ggcaaagcgc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat 4802 cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat 4862 taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat 4922 ccgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 4982 aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc 5042 acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 5102 cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ccagggtggt 5162 ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc ttcaccgcct ggccctgaga 5222 gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg ccccagcagg cgaaaatcct gtttgatggt 5282 ggttgacggc gggatataac atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca ctaccgagat 5342 atccgcacca acgcgcagcc cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca gcgccatctg 5402 atcgttggca accagcatcg cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt gcatggtttg 5462 ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct gaatttgatt 5522 gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg 5582 gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg 5642 cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag 5702 aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct ggtcatccag 5762 cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgcttt 5822 acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc 5882 ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt 5942 ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat 6002 gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct 6062 ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc 6122 gtataacgtt actggtttca cattcaccac cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca 6182 tgccataccg cgaaaggttt tgcgccattc gatggtgtcc cagtgaatcc gtaatcatgg 6242 tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacat tatacgagcc 6302 ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg 6362 ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc 6422 ggagcttact ccccatcccc ctgttgacaa ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat 6482 tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa caggatcgat ccagcttact ccccatcccc 6542 ctgttgacaa ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 6602 acacaggaaa caggatctgg gcccttcgaa attaatacga ctcactatag ggagaccaca 6662 acggtttccc tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatat cc 6714

【０１６９】<210> 6 <211> 554 <212> PRT <213> Expression vector <400> 6 Met Gly Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu Ser Pro Lys Ala Leu 1 5 10 15 Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val 20 25 30 Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala 35 40 45 Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu 50 55 60 Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val 65 70 75 80 Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp Asp Pro Met 85 90 95 Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val 100 105 110 Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu Arg Ala 115 120 125 Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu Glu Gly 130 135 140 Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser 145 150 155 160 Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala 165 170 175 Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu Ile Ala Arg Leu 180 185 190 Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser 195 200 205 Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala 210 215 220 Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val 225 230 235 240 Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln 245 250 255 Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro 260 265 270 Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln 275 280 285 Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln 290 295 300 Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe 305 310 315 320 Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile 325 330 335 Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg 340 345 350 Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met 355 360 365 Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala 370 375 380 Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu 385 390 395 400 Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln Ala Phe Ile Glu 405 410 415 Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr 420 425 430 Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg 435 440 445 Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu 450 455 460 Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala 465 470 475 480 Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu 485 490 495 Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu 500 505 510 Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val 515 520 525 Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly 530 535 540 Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 545 550

【０１７０】<210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> bacteriophage lambda <400> 7 gcttatctgc ttctcataga gtcttgc 27

【０１７１】<210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> bacteriophage lambda <400> 8 ataacgatca tatacatggt tctctcc 27

【０１７２】<210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> bacteriophage lambda <400> 9 ttttgctggg tcaggttgtt ctttagg 27

【０１７３】<210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> E.coli <400> 10 ggaagcttat ttttgacacc agaccaac 28

【０１７４】<210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> Zea maize <400> 11 gtgatggatc cttcagcttc ccgagttcag caggcgg 37

【０１７５】<210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Zea maize <400> 12 ggtctcgagc gaagcttccc tatagctttg cgaagag 37

【０１７６】<210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Thermus aquaticus <400> 13 gagccatggc caacctgtgg gggaggcttg aggggga 37

【０１７７】<210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Thermus aquaticus <400> 14 agtttggcag cctcctccac gagttcggcc ttctgg 36

【０１７８】<210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Thermus aquaticus <400> 15 ggactggctc tccgccaagg agtgatacca cc 32

【０１７９】<210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Thermus flavis <400> 16 agtttggaag cctcctccac gagttcggcc tcctgg 36

【０１８０】<210> 17 <211> 35 <212> DNA<213> Thermus flavis <400> 17 ggactggctc tccgccaagg agtagggggg tcctg 35

【０１８１】<210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 18 gcgaagcttc tcgagttacg ctcaatatgg agttgcttc 39

【０１８２】<210> 19 <211> 43 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 19 ccgagatctc catggatcca aagaatcaag ataagcatca aag 43

【０１８３】<210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> bacteriophage lambda <400> 20 gggcggcgac ctcgcgggtt ttcgctattt atgaaa 36

【０１８４】<210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> E.coli <400> 21 cgacggccag tgaatccgta atcatggtca tag 33

【０１８５】<210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> E.coli <400> 22 accagccatc gccatctgct gcacgcggaa gaa 33

【０１８６】<210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> E.coli <400> 23 ctatgaccat gattacggat tcactggccg tcgttt 36

【０１８７】<210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> bacteriophage lambda <400> 24 gcaagactct atgagaagca gataagcgat aag 33

【０１８８】<210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> bacteriophage lambda <400> 25 atcattattt gatttcaatt ttgtcccact ccc 33

【０１８９】<210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> bacteriophage lambda <400> 26 ggagagaacc atgtatatga tcgttatctg ggt 33

【０１９０】<210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> bacteriophage lambda <400> 27 gcgcacaaaa ccatagattg ctcttctgta agg 33

【０１９１】<210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> E.coli <400> 28 cccggttatt attatttttg acaccagacc aac 33

【０１９２】<210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> bacteriophage lambda <400> 29 aggtcgccgc cccgtaacct gtcggatcac cggaaa 36

【０１９３】<210> 30 <211> 53 <212> PRT <213> phi 29 <400> 30 Lys Leu Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp 1 5 10 15 Val Thr Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe 20 25 30 Arg Leu Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly 35 40 45 Val Phe Ile Thr Ala 50

【０１９４】<210> 31 <211> 36 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 31 Asp Tyr Arg Gln Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly 1 5 10 15 Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu 20 25 30 Ser Val Thr Ala 35

【０１９５】<210> 32 <211> 50 <212> PRT <213> phi 29 <400> 32 Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys Tyr Asp Arg 1 5 10 15 Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly Thr Glu Ile 20 25 30 Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu Gly Tyr Trp 35 40 45 Ala His 50

【０１９６】<210> 33 <211> 60 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 33 Trp Gly Arg Lys Tyr Ile Glu Leu Val Trp Lys Glu Leu Glu Glu Lys 1 5 10 15 Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp Thr Asp Gly Leu Tyr Ala Thr 20 25 30 Ile Pro Gly Gly Glu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Lys Ala Leu Glu Phe 35 40 45 Val Lys Tyr Ile Asn Ser Lys Leu Pro Gly Leu Leu 50 55 60

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明のＤＮＡポリメラーゼの増幅に使用で
きるプライマーのヌクレオチド配列を示す図である。

【図２】図１と同じプライマーのヌクレオチド配列を示
す図である。

【図３】従来の酵素Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓＤＮＡポリメラーゼと本発明のＤＮＡポリメラーゼを
用いたＰＣＲ増幅反応を示すアガロースゲルの写真であ
る。

【図４】４つの酵素を用いて行ったＰＣＲ増幅反応を示
すアガロースゲルの写真である。

【図５】コロニーＰＣＲ生成物のアガロースゲル分析の
写真である。

【図６】ＰＣＲ実験の一部がローディングされたアガロ
ースゲルの写真である。

【図７】ＰＣＲ実験の生成物を分析したアガロースゲル
の写真である。

【図８】３欠失のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ
ＤＮＡポリメラーゼによってＰＣＲ生成物であるｌａｃ
Ｚ遺伝子に導入された突然変異の数とＫｌｅｎｔａｑ−
２７８によって導入された突然変異の数との差異を示す
棒グラフである。

【図９】４３ｍｅｒオリゴヌクレオチドプライマーＢｔ
Ｖ５と対にされた３８４ｂｐメガプライマーを用いて行
ったＰＣＲ増幅を示すアガロースゲルの写真である。

【図１０】３３ｍｅｒの方が２７ｍｅｒより良好な結果
が得られることを示すアガロースゲルの写真である。

【図１１】高ＰＣＲ生成物のＣＨＥＦパルスフィールド
分析を示すアガロースゲルの写真である。

【図１２】制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによる消化を行わな
い、及び行った２８ｋｂと３５ｋｂの生成物を示すアガ
ロースゲルの写真である。

【図１３】Ｐｆｕ ｅｘｏ^- 突然変異体の試験結果を示
すアガロースゲルの写真である。

【図１４】ＰＣＲ実験の一部がローディングされたアガ
ロースゲルの写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C12P 21/08 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ
   ＤＮＡポリメラーゼと同じアミノ酸配列からなるが、前
   記ＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸残基を
   欠くアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ、または
   これと同等の耐熱性を有するその改変体であって、配列
   表の配列番号２に示されるアミノ酸配列をＮ−末端に有
   する改変体ＤＮＡポリメラーゼをコード化する組換えＤ
   ＮＡ配列。
2. 【請求項２】 Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ
   ＤＮＡポリメラーゼと同じアミノ酸配列からなるが、前
   記ＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸残基を
   欠くアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ、または
   これと同等の耐熱性を有するその改変体であって、配列
   表の配列番号２に示されるアミノ酸配列をＮ−末端に有
   する改変体ＤＮＡポリメラーゼ。
3. 【請求項３】 配列番号：６のアミノ酸配列を有する請
   求項２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
4. 【請求項４】 プラスミドｐＷＢ２５４ｂに含まれるＤ
   ＮＡ配列によってコード化されている請求項２に記載の
   ＤＮＡポリメラーゼ。
5. 【請求項５】 実質的にＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ
   のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸２８０−８３１からな
   るアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ。