JP2010514453A - 分断ポリメラーゼを使用する組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、単一のポリメラーゼを形成するために安定に会合する、少なくとも２つの分離したポリペプチドを構成する分断ポリメラーゼ酵素を利用する、組成物および方法に関連する。本発明はさらに、本発明の分断ポリメラーゼの発現に対する核酸構築物、および本発明の分断ポリメラーゼを用いた方法に関連する。本発明の酵素は多くの適用において有用であり、核酸の検出可能な標識化要求する、ならびに特に定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）およびＤＮＡ配列解析における適用に有用である。

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２００６年１２月２９日に出願された米国特許仮出願第６０／８７８，０２０号、および２００７年１月１９日に出願された米国特許仮出願第６０／８８１，６９４号の開示に依存し、かつ利益を主張し、両方の開示の全体が参照として本明細書中に組み込まれる。

本発明は、安定に会合して単一のポリメラーゼを生じる、少なくとも２つの分離したポリペプチドから構成される、分断ポリメラーゼを利用する組成物および方法に関連する。本発明はさらに、本発明の分断ポリメラーゼを発現するための核酸構築物、および本発明の分断ポリメラーゼを作成するための方法に関連する。本発明の酵素は、ＤＮＡ合成に要求される多くの適用において有用である。

検出可能な核酸の標識化は、研究ならびに臨床診断技術への適用を含む、分子生物学における多くの適用に必要で核酸の標識化に一般的な方法は、１つまたはそれ以上の非従来型ヌクレオチド、および新たに合成される相補鎖中への非従来型ヌクレオチドの鋳型依存的な取り込みを触媒するポリメラーゼ酵素を使用する。

正しいデオキシヌクレオチドを取り込むためのＤＮＡポリメラーゼの能力は、生体内での高い忠実性のＤＮＡ複製に基づく。ポリメラーゼの活性部位中のアミノ酸は、鋳型ヌクレオチドに対して正しい相補的なヌクレオチドの配置を好む、特異的な結合ポケットを形成する。不適正なヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはヌクレオチドアナログがその場所に充填されると、入ってくるヌクレオチドに接触するアミノ酸の正確な整列は、ＤＮＡ重合に好ましくない場所に歪められ得る。それ故、ＤＮＡを標識化するのに使用される非従来型ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、標準のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ、いわゆる「標準の」ｄＮＴＰｓは、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシトシン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、およびチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ、またはＴＴＰ）を含む）に比べて、低い効率で伸長鎖中に取り込まれる傾向がある。

ポリメラーゼによって取り込まれる非従来型ヌクレオチドの効率の減少は、ＤＮＡ標識化に必要な非従来型ヌクレオチドの量を増加させる。特定のヌクレオチドの取り込み効率の減少は、均一なシグナル強度での非従来型ヌクレオチドの不偏性取り込みに依存するＤＮＡ配列解析などの、技術またはアッセイの実行にも悪影響を与える。

入ってくるヌクレオチド三リン酸に接触するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸の同一性および正確な配置は、ポリメラーゼ酵素によって取り込まれ得る、従来型および非従来型の両方のヌクレオチドの性質を特定する。結合または鎖の伸長のどの段階でも入ってくるヌクレオチド三リン酸に接触する、アミノ酸の正確な配置中の変化は、普通でない、または非従来型ヌクレオチドの利用に対するポリメラーゼの能力を劇的に変化させることができる。たまに、離れたアミノ酸における変化は、間接的な全体への、または構造的な効果に起因する、ヌクレオチドアナログの取り込みに影響することができる。ヌクレオチドアナログを取り込む能力が増加したポリメラーゼは、色素、反応基、または不安定なアイソトープなどのシグナル部分で修飾されたヌクレオチドによる、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の標識化に有用である。

標識化ヌクレオチドに加えて修飾されたヌクレオチドの最も重要なクラスは、ジデオキシヌクレオチドである。いわゆる「サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）」または「ジデオキシ」ＤＮＡ配列解析方法（参照として本明細書中に組み込まれるＳａｎｇｅｒ等、１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３）は、デオキシ‐、およびジデオキシヌクレオチドを含む混合物より、ＤＮＡポリメラーゼによる、アニールしたプライマー上への、ヌクレオチドの鋳型方向性取り込みに依存する。ジデオキシヌクレオチドの取り込みは鎖の終止、および鎖のさらなる伸長を触媒する酵素の無力化をもたらす。反応産物の電気泳動的な分離は、鋳型中の反対側のヌクレオチドに相補的な、特定のジデオキシヌクレオチド中のそれぞれの伸長産物末端である、伸長産物の「ラダー（ｌａｄｄｅｒ）」をもたらす。プライマーからのジデオキシヌクレオチドアナログの距離は、伸長産物の長さによって示される。それぞれ４つのジデオキシヌクレオチドアナログｄｄＡ、ｄｄＣ、ｄｄＧ、またはｄｄＴ（ｄｄＮＴＰｓ）のうちの１つを含む４つの反応が、同じゲル上で分離された場合、鋳型の配列はラダーのパターンから直接読み得る。伸長産物は、例えば、アイソトープ標識化もしくは蛍光標識化されたプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸またはジデオキシヌクレオチド三リン酸を反応中に含む、いくつかの方法で検出し得る。

ゲル泳動している間に検出を行い得、かつ単回の反応およびゲルより配列データの長い解読が可能であり得るため、蛍光標識化は、迅速なデータ回収という有利な点がある。さらに蛍光配列検出は、４つの異なる標識化をした蛍光色素ターミネーターを含む、１つの反応チューブ内で行う配列解析を可能にする（いわゆる色素ターミネーター法、参照として本明細書中に組み込まれるＬｅｅ等、１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２４７１）。

ＤＮＡ配列解析に有用であるポリメラーゼに要求される性質は、ジデオキシヌクレオチドの取り込みの改善である。ジデオキシヌクレオチドの取り込みの改善は、高価な放射活性または蛍光色素標識化ジデオキシヌクレオチドの必要を減らすことで、ＤＮＡ配列解析をより費用効率の高いものにすることができる。さらに、不偏性ジデオキシヌクレオチドの取り込みは、改善されたシグナル統一性を提供し、塩基決定の正確性の増加をもたらす。均一なシグナル出力は、検出される対立遺伝子の変化などに起因する、微妙な配列の違いをさらに可能にする。関連する位置で２つの異なる半強度のシグナルを産生する対立遺伝子の変化は、不均一性ｄｄＮＴＰを利用したポリメラーゼに起因するシグナル強度の変化によって、容易に隠すことができる。

二重標識化ヌクレオチドアナログ（例えば、米国特許出願第２００４００１４０９６号を参照されたい）は、取り込まれる前は非蛍光であり、蛍光基はヌクレオチドより開裂する分子をもたらす、蛍光基および消光基の両方が付着したヌクレオチドアナログである。蛍光部分および消光部分の両方を含む二重標識化ヌクレオチドアナログは、当技術分野で一般的な、ジデオキシヌクレオチド鎖ターミネーターに代えて、鎖ターミネーターとして用いることができる。鎖終結二重標識化ヌクレオチドアナログは、２’，３’‐ジデオキシピロフラノース分子であるか、またはそれと同等である、糖部分を有する。二重標識化ヌクレオチドアナログは、伝統的な標識化鎖終結ヌクレオチドアナログと比べて、より蛍光バックグラウンドが減少するという有利な点がある。二重標識化ヌクレオチドアナログは、ポリヌクレオチド鎖内に取り込まれるまでは蛍光シグナルを発しないが、取り込まれなかったアナログによる蛍光バックグラウンドは、顕著に減少する。二重標識化ヌクレオチドアナログは、定量的ＰＣＲ(ＱＰＣＲ)法におけるリアルタイム（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ）増幅の進行をモニターするのにも有用である。

このような二重標識化アナログの使用は、ポリメラーゼによるこのようなアナログの利用度に制限される。伸長している鎖内へのアナログの取り込みを促進するために、比較的高濃度のアナログを使用しなければならない。アナログは高価で、かつ伸長率を減少させ、潜在的にポリメラーゼの処理能力を低下させる。高濃度の二重標識化アナログはバックグラウンドシグナルおよび分子間消光の増加をももたらす。二重標識化ヌクレオチドアナログに対する識別が弱いポリメラーゼは、反応当たりに必要なアナログ量の減少によるコストの減少の一方で、蛍光シグナル、ならびにＱＰＣＲおよび配列解析反応の感度の増強をもたらすことができる。

天然型のＤＮＡポリメラーゼによるリボヌクレオチドの取り込みは、めったに起こらない。リボヌクレオチドを高いレベルで取り込む変異体は、部分的なリボヌクレオチド置換による配列解析などの適用に用いることができる。この系において、同じ塩基に対応するリボヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチの混合物は、変異体ポリメラーゼによって取り込まれる（Ｂａｍｅｓ、１９７８．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１９：８３‐９９）。リボヌクレオチド配列解析反応をアルカリ条件下で曝露後に加熱した場合、伸長した鎖の断片化が起こる。４種すべての塩基に対する反応が変性アクリルアミドゲル上で分離された場合、配列解析ラダーを産生する。本特許出願の出願人は、この配列解析の代替方法のための、リボヌクレオチドの利用度が高いポリメラーゼ変異体が、当技術分野において必要であると認識している。

あるいは、アルカリ加水分解後のリボヌクレオチドの取り込みは、分子ブリーディング（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ）、性別ＰＣＲ（ｓｅｘｕａｌ ＰＣＲ）、および定方向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）とも呼ばれるＤＮＡシャッフリング（（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９‐３９１）などのＤＮＡ分子のランダム開裂が必要な系に利用することができる。

ＤＮＡ標識化酵素に要求される別の性質は、熱安定性である。熱変性、プライマーアニーリング、およびＤＮＡ鋳型を増幅するための酵素的プライマー伸長のサイクルを用いる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の開発により、熱安定性を示すＤＮＡポリメラーゼは、分子生物学および臨床診断の多面において革命をもたらした。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの原型はＴａｑポリメラーゼであり、好熱性真性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓより最初に単離された。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる、いわゆる「サイクル配列解析」反応は、従来型（すなわち、非サイクル）配列解析反応と比較して、少量の出発鋳型を要求するという有利な点がある。

ＤＮＡポリメラーゼの３つの主要なファミリーが存在し、ファミリーＡ、Ｂ、およびＣと定義されている。これら３つのファミリーのうちの１つへのポリメラーゼの分類は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（ファミリーＡ）、ＩＩ（ファミリーＢ）またはＩＩＩ（ファミリーＣ）の既知のポリメラーゼとの構造的な類似に基づく。例として、ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼI（Ｔａｑポリメラーゼ)、およびバクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない；以前はα-ファミリーポリメラーゼ（ＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ、１９９１，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４０４５）として知られていたファミリーB ＤＮＡポリメラーゼは、ヒトα、δおよびε ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４、ＲＢ６９、およびΦ２９バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓＤＮＡポリメラーゼ(Ｐｆｕポリメラーゼ)を含むが、これらに限定されない；ならびに、ファミリーＣ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼIII、および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼIIIαおよびεサブユニット（ＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ、１９９３，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：７８７に、それぞれｄｎａＥおよびｄｎａＱ遺伝子の産物として記載されている）を含むが、これらに限定されない。古細菌、細菌、ウイルス、および真核生物の広域スペクトルにまたがる、それぞれのファミリーのＤＮＡポリメラーゼタンパク質配列の配置は、参照として本明細書中に組み込まれるＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ（１９９３、上記を参照）に示されている。

ＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ（１９９３、上記を参照）に示すように、領域Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ中には、一連の高度に保存された残基は、露出した芳香族残基(ＲＢ６９番号、Ｙ４１６、Ｙ５６７、およびＹ３９１)、負電荷残基（Ｄ６２１、Ｄ６２３、Ｄ４１１、Ｄ６８４、およびＥ６８６）、および正電荷クラスター（Ｋ５６０、Ｒ４８１、およびＫ４８６）からなる３つの特徴的なクラスターを形成する。ＴａｑポリメラーゼＤＮＡ複合体との比較により、これら３つのクラスターは、プライマー末端、および入ってくるｄＮＴＰが結合すると予想される領域を包含することを示唆する。ＲＢ６９におけるｄＮＴＰとプライマー鋳型複合体とのモデル化は、逆転写酵素とｃ‐ＤＮＡとの共結晶の原子配置を用いて行われた。このモデルは、ＲＢ６９ Ｙ４１６は、ｄＮＴＰのデオキシリボース部位を包むことを予想している。この位置のチロシンはリボース選択性に関与しており、哺乳動物の逆転写酵素におけるリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチド間のポリメラーゼ識別に貢献している（Ｙ１１５）（Ｇａｏ等、１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４０７；Ｊｏｙｃｅ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１６１９）。

ファミリーＢポリメラーゼの領域ＩＩＩ(モチーフBとも呼ばれる) は、ヌクレオチド認識における役割を担うことも明らかにされている。ＪＤＦ‐３ファミリーB ＤＮＡポリメラーゼのＡＡ４８７〜４９５に対応するこの領域は、共通配列ＫＸ_３ＮＳＸＹＧ（配列番号１）を有し（Ｊｕｎｇ等、１９９０，上記を参照；Ｂｌａｓｃｏ等、１９９２，上記を参照；Ｄｏｎｇ等、１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１１ ６３；Ｚｈｕ等、１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ‐１２１９：２６０；ＤｏｎｇおよびＷａｎｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２ １５６３）、かつ機能的であるが、ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼのへリックスＯ内のＫＸ_３（Ｆ／Ｙ）ＧＸ_２ＹＧ（配列番号２）とは構造的に類似していない（Ｗａｎｇ等、１９９７，上記を参照）。断片およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの、ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼにおいて、ＯへリックスはｄＮＴＰ結合において主要な役割をするアミノ酸を含む（Ａｓｔａｔｋｅ等、１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：１４７；Ａｓｔａｔｋｅ等、１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９４５；Ｐｏｌｅｓｋｙ等、１９９２，１ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：８４１７；Ｐｏｌｅｓｋｙ等、１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４５７９；Ｐａｎｄｅｙ等、１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３２５９；Ｋａｕｓｈｉｋ等、１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ ３５：７２５６）。特にへリックスOは、ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼにおいてｄｄＮＴＰ識別を与えるＦ（断片中のＦ７６３；Ｔａｑ中のＦ６６７）を含む（ＫＸ_３（Ｆ／Ｙ）ＧＸ_２ＹＧ；配列番号２）（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９５，上記を参照）。

新生ＤＮＡポリマー内に非天然型ヌクレオチドを取り込まないＤＮＡポリメラーゼの傾向を表すために用いられる用語は、「識別」である。ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼにおいて、ジデオキシヌクレオチドアナログの取り込みに対する効果的な識別は、主として単一のアミノ酸残基に対する会合である。ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼ由来の酵素の大部分は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ断片内のＦ７６２に相当する位置に、フェニルアラニン（ｐｈｅまたはＦ）残基を有し、かつジデオキシヌクレオチドに対する強い識別を明示する。いくつかのポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ）は対応する位置においてチロシン（ｔｙｒまたはＹ）残基を有し、かつジデオキシヌクレオチドに対して比較的弱い識別を示す。この位置でチロシンを有するファミリーＡポリメラーゼは、デオキシヌクレオチドを取り込むのと同じレベルで、またはほんの少しだけ異なるレベルで、ジデオキシヌクレオチドを容易に取り込む。識別に関係する部位におけるチロシンまたはフェニルアラニン残基への変換は、ファミリーＡ酵素のジデオキシヌクレオチド識別特性を逆転させる（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６４４９）。

熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ間において、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）として知られている、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼの変異型は、ＤＮＡポリメラーゼのＦ７６２に相当する位置にＦ６６７Ｙ変異を含み、および野生型酵素と比較して、ジデオキシヌクレオチドの取り込みの増大（すなわち、ｄｄＮＴＰｓに対する識別の減少）を示す。ジデオキシヌクレオチドの取り込みに対する識別の減少は、野生型酵素に比べて、蛍光および標識化ジデオキシヌクレオチド配列解析に、より有用である。

Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＦ６６７Ｙ変異体は、ローダミン色素ターミネーターの使用を必要とする、フルオレセイン標識化ジデオキシヌクレオチドの使用に適していない。ＤＮＡ二次構造を安定化する、Ｔａｑ配列解析反応に現在利用されているローダミン色素ターミネーターは、シグナルの圧縮をもたらす。圧縮の問題をなくす努力は、デオキシグアノシン三リン酸に代わるヌクレオチドアナログ、デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）を多量に使用する系をもたらす。（ｄＩＴＰ）の取り込みがシグナルの圧縮を減少する一方で、反応中のｄＩＴＰの存在は、反応温度の低下、および反応時間の増加を含む、追加の問題を生じる。さらに、配列解析におけるローダミン色素の使用は、望ましくない反応後精製を必要とする（Ｂｒａｎｄｉｓ，１９９９ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２７：１９１２）。ファミリーＡ 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ断片において、保存されたグルタミン酸残基（Ｅ７１０）の改変は、リボヌクレオチドに対する識別が減少する（Ａｓｔａｔｋｅ等、１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：３４０２）。

Ｋｌｅｎｏｗ断片およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの、ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼにおいて、ＯへリックスはｄＮＴＰ結合において主要な役割をするアミノ酸を含む（Ａｓｔａｔｋｅ等、１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：１４７；Ａｓｔａｔｋｅ等、１９９５，１ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９４５；Ｐｏｌｅｓｋｙ等、１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：８４ １７；Ｐｏｌｅｓｋｙ等、１９９０．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４５７９；Ｐａｎｄｅｙ等、１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３２５９；Ｋａｕｓｈｉｋ等、１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：７２５６）。特にへリックスＯは、ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼにおいてdｄＮＴＰ識別を与えるＦ（Ｋｌｅｎｏｗ断片中のＦ７６３；Ｔａｑ中のＦ６６７）を含む（ＫＸ_３（Ｆ／Ｙ）ＧＸ_２ＹＧ；配列番号２）（Ｔａｂｏｒおよび Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９５，上記を参照）。

いわゆるパームドメインにおける触媒反応に関連する酸性残基の位置を除いて、ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼと比較して、実質的に異なる構造を示す（Ｗａｎｇ等、１９９７，Ｃｅｌｌ ８９：１０８７；Ｈｏｐｆｈｅｒ等、１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：３６００）。ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼ独自の構造は、完全に異なるヌクレオチドアナログとの相互作用のスペクトルを許容し、おそらく構造的な制約に起因する、ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼでの使用に適していないアナログの利用を可能にする。熱安定性ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼは、超好熱古細菌において同定された。これらの生物は９１℃以上の温度で生育し、およびこれらの酵素は、好熱性真性細菌ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼより高い熱安定性を明示する（Ｍａｔｈｕｒ等、１９９２，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ５：１１）。いくつかのファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼの配列を、図２および６に示す。

Ａファミリーポリメラーゼ、Ｐｏｌβ、ＨＩＶ逆転写酵素、およびBファミリーポリメラーゼｇｐ４３の構造解析は、すべてが右手を模したパーム、フィンガー、およびサムドメインから構築される機能的なポリメラーゼ構造を共有していることを明らかにする（参照として本明細書中に組み込まれるＢｒａｕｔｉｇｍａｎおよびＳｔｅｉｔｚ，１９９８，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃ Ｂｉｏｌ ８：５４を評価のために参照されたい）。Ｐｏｌβを除き、パームドメインは、すべてのファミリー間で類似のトポロジーを示す。フィンガーおよびサムドメインは異なるファミリー間で高度に多様であり、かつサムドメインは主としてα-ヘリックスであるが、ドメインの詳細な構造は関連していない。おそらく驚くべきことに、４種すべてのファミリー内のフィンガーおよびサムドメインは、異なる祖先から生じている。

ポリメラーゼは多くの実験室応用に対して使用されるため、いくつかのポリメラーゼが、さまざまな実験室応用に対して望ましい特性を持つように開発された。例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）（配列番号３）中のアミノ酸Ｅ１４１およびＤ１４３に対応する部位における変異は、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性をなくすことが知られている。アミノ酸Ｌ４０９、Ｙ４１０、Ｐ４１１、Ｒ４６１、Ｋ４６５、Ｑ４７２、Ａ４８６、Ｒ４８８、Ｌ４９０、Ａ４９１、Ｎ４９２、Ｙ４９５、およびＹ４９７に対応する部位における変異は、ポリメラーゼのヌクレオチド識別を減少させることが知られている（例えば、参照として本明細書中に組み込まれる、米国特許第６９４６２７３号、米国特許第６３３３１８３号、米国特許第５８８２９０４号、米国特許第５８２７７１６号、Ｙａｎｇ等、１９９９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：８０９４，ＧａｒｄｎｅｒおよびＪａｃｋ，１９９９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：２５４５を参照されたい）。アミノ酸Ｖ９３における変異、特にＶ９３Ｒ（Ｐｆｕ番号）は、ウラシル検出を混乱させることが知られている。Ｓｓｏ７ｄのＤＮＡ結合領域などの非配列特異的なＤＮＡ結合領域は、ポリメラーゼの処理能力を増加させるために、ポリメラーゼ内に取り込むことができる。さらに、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ中にを提供されているアミノ酸に対応する部位は、刊行された配列配置、または、ＢＬＡＳＴなどの任意のいくつかの配列配置プログラムを用いて、他のファミリーＢポリメラーゼ配列上に容易にマッピングすることができる（例えば、ＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ、１９９３，上記を参照；ＢｒａｕｔｉｇｍａｎおよびＳｔｅｉｔｚ，１９９８，上記を参照；ならびにＨｏｐｆｎｅｒ等、１９９９，上記を参照；ＢｉｌｅｓおよびＣｏｎｎｏｌｌｙ，２００４，上記を参照；ＧａｒｄｎｅｒおよびＪａｃｋ １９９９，上記を参照；Ｅｄｇｅｌｌ等、１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：２６３２）。

基質の利用を拡大するための戦略としての、酵素内への分断（ｓｐｌｉｔ）の導入は、アミノ酸交換に基づく、現在使用されている手法と大きく異なる。ポリメラーゼ ファミリー中への天然の分断の、４つの例がある。Ｔ４‐ファージファミリーは、フィンガードメイン内に分断を含む、５つのメンバーを含む（Ｐｅｔｒｏｖ等、（２００６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６１：４６‐６８）。これらの分断は自然に起こり、かつ非分断Ｔ４‐様ファージＤＮＡポリメラーゼと比較して、分断酵素が基質の利用の拡大などの独自の特性を示すかどうかは未知である。第二の天然の分断は、古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＤＮＡポリメラーゼについて報告されている（Ｋｅｌｍａｎ等、（９９）ＪＢＣ ２７４：２８７５ １‐６１）。この分断も自然に起こり、かつフィンガードメインの下流（外側）に見出される。この分断も、非分断古細菌ＤＮＡポリメラーゼと比較して、基質の利用の拡大を示すかどうかに関して、特徴付けられていない。天然の分断の２つの実施例において、ポリメラーゼは、ゲノムにおいて２ｂｐ〜３ｋｂ（Ｔ４様ファージ）から８５Ｋｂｐ（Ｍｔｈ）分離された異なる遺伝子によってコードされる。天然の分断の第３の例は、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子においてである。しかしながらこの分断は、Ｎ．ｅｑｕｉｔａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼのミニインテイン内で起こり、ポリメラーゼが２つの別々のポリペプチドとして発現された場合、互いにスプライシングして（トランス‐スプライシング）全長ポリメラーゼを形成する。分断はフィンガードメインの外側に位置し、かつスプライシングイベントが完了するまでタンパク質を安定化する、追加の配列（インテイン）を有する（Ｃｈｏｉ等、（０６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５６：１０９３‐１１０６）。天然の分断の第４の例は、古細菌Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＢ１において見出される（Ｓａｖｉｎｏ等、（２００４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １２：２００１‐２００８）。この場合、ポリメラーゼはタンパク質分解的に切断されて、２つの活性断片、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する５０ｋＤ断片と、エキソヌクレアーゼ活性を有する４０ｋＤ断片とを産生する。しかしながら、筆者等は、これらの活性は野生型と比較して減少したのか、もしくは代替のまたは改善された活性についてタンパク質分解断片を試験したかどうかについては、記載していない。この例における分断は、フィンガードメインの外側にも見出される。

減少した識別を有するポリメラーゼは、非従来型の核酸の取り込みを必要とする適用に有用である。このような適用は、しばしば核酸またはＤＮＡ「チップ」として参照される、複数の異なる核酸配列の同時解析における核酸アレイの標識化を含む。米国特許第５８８２９０４号（Ｒｉｅｄｌ等）の記載などの、これらの適用の多くは、特に蛍光標識化非従来型ヌクレオチドである、非従来型のヌクレオチドの取り込みに対して識別の減少を示すＤＮＡポリメラーゼの利益を享受する。チップのフォーマットに対処した適用は、特にＤＮＡ 配列解析および変異検出を含む。実施例は、「ミニ配列解析」法（例えば、Ｐａｓｔｉｎｅｎ等、１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６０６；Ｓｙｖａｎｅｎ １９９９，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ １３：１１０）、およびアレイ化プライマー伸長（ＡＰＥＸ）変異検出法（Ｓｈｕｍａｋｅｒ等、１９９６，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．７：３４６）を含む。

本出願人は、当技術分野で、チップまたはゲルベースのミニ配列解析系における使用に対する、非識別ＤＮＡポリメラーゼがであると認識している。このような系は、多重化した一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出を有利に許容し、かつ定量的な遺伝子型同定を可能にする。配列の変異の同定は、遺伝子疾患の診断および治療、多様性疾患の素因、および新規または既存の医薬品に対する感受性を許容する。

さらに出願人は、当技術分野で、非従来型ヌクレオチドに対して識別の減少を有するＤＮＡポリメラーゼが必要であると認識している。出願人は、特に当技術分野で、ジデオキシヌクレオチドに対して識別の減少を示す熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および蛍光標識化ジデオキシヌクレオチドに対して識別の減少を示すＤＮＡポリメラーゼが必要であると実感している。出願人は、特に二重標識化オリゴヌクレオチドである、ヌクレオチドのポリリン酸部位に改変を含むヌクレオチドアナログに対して、識別の減少を示す熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、特に必要であるとも認識している。

本発明は、１つまたはそれ以上の非天然型発生分断を、酵素の基質の利用の拡大のために導入された酵素に関連する。本発明は、多くの異なる型の酵素に適用できる。本発明を限定することなく、このような非天然型分断は、サブドメイン間の可動性を増加させ、かつ基質相互作用上の制約を減少すると予想される。ポリメラーゼと呼ばれるクラスの酵素において、ポリメラーゼ中の分断は、ポリメラーゼの活性を修飾するために見出される。特にこのクラスの酵素は、ＱＰＣＲおよび核酸配列解析などへの適用に有用にする、特に二重標識化ヌクレオチドアナログに対する識別の減少を有する。

一態様において、本発明は、少なくとも１つの分断を含む非天然型ポリメラーゼ、およびこのようなポリメラーゼを含む組成物を提供する。これらは逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡプライマーゼを含むが、これらに限定されない。一態様において、本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のファミリーＡポリメラーゼなどの、Ａファミリーポリメラーゼ由来の分断ポリメラーゼを提供する。別の態様において、本発明は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ＪＤＦ‐３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ （Ｔｇｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢＤ（Ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｂｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ、および古細菌ポリメラーゼIなどの古細菌Bファミリーポリメラーゼ由来の、分断ポリメラーゼを含む。さらに別の態様において、分断ポリメラーゼは、キメラポリメラーゼ、第一のポリメラーゼ由来のＮ末端断片と第二のポリメラーゼのＣ末端断片との組み合わせである。好ましい態様において、断片は、同じファミリーのポリメラーゼ（例えば、両方ともファミリーＢ ポリメラーゼ）由来である。

分断ポリメラーゼは、分断ポリメラーゼの安定性を改善するため、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を除くため、ウラシル検出をなくすため、処理能力を増加させる等のため、分断の領域および／またはさらに非天然型基質の利用を改善する分断が起こるところから離れた領域のいずれかで、コード配列中の他の改変または変異を含み得る。コード配列への他の付加は、ポリメラーゼを翻訳後に分断するためのタンパク質分解切断部位の挿入、ウイルスが翻訳の開始および停止をもたらすフレームシフト（工程は、プログラムされたリボソームフレームシフトと呼ばれる；Ｈａｎｓｅｎ等、２００７，ＰＮＡＳ １０４（１４）：５８３０‐５８３５）を引き起こすのに使用する「ｓｌｉｐｐｅｒｙ配列」の挿入可能にし、または分断ポリメラーゼを作成する他の方法を可能にする。ポリメラーゼは、単離されたまたは精製された物質として、もしくは１つまたはそれ以上の追加の物質（例えば、水または水溶液）を含む組成物の一部として、提供することができる。本明細書において、用語「単離された」および「精製した」は、目的のタンパク質、核酸等が、その自然環境から除去され、かつ好ましくはタンパク質、核酸等の自然環境に存在する、１つの、いくつかの、実質的にすべての、またはすべての物質の存在から除去されることを示すために、交互に用いられる。

別の態様において、本発明は、本発明の分断ポリメラーゼをコードする核酸に関連する。分断ポリメラーゼは、単一の、機能的なポリメラーゼ分子を形成するために非共有結合的に会合する、少なくとも２つの分離したポリペプチド（例えば、Ｎ末端断片およびＣ末端断片）として発現されたポリメラーゼ、と理解される。好ましい態様において、本発明の分断ポリメラーゼは、分断ポリメラーゼのそれぞれの部位またはシストロンの発現が、分断ポリメラーゼの少なくとも１つの他の部位の翻訳と翻訳的に結合する（ｃｏｕｐｌｅｄ）、ポリシストロンのオペロンによってコードされる。一態様において、ポリシストロンのコード配列は、フレームシフト終止コドンの近位にある少なくとも１つのリボソーム再開シグナルを含む。別の態様において、本発明の分断ポリメラーゼは、同じ宿主細胞内、または２つの別々の宿主細胞内の２つの別々のプラスミド上に存在する、２つのコード配列によってコードされる。核酸は、精製されたまたは単離された物質として、単独または少なくとも１つの他の物質（例えば、水または水溶液）を含む組成物内に提供することができる。

さらなる一態様において、本発明は、本発明の分断ポリメラーゼを作成する方法を提供する。一般に、本方法は、コード領域はプロモーターと作動的に連結する、宿主細胞内に分断ポリメラーゼをコードする核酸を導入するステップと、および分断ポリメラーゼの産生を許容する条件下で細胞を培養するステップと、を含む。好ましい態様において、分断ポリメラーゼは、分断ポリメラーゼのそれぞれの部位またはシストロンの発現が、分断ポリメラーゼの少なくとも１つの他の部位の翻訳と翻訳的に結合する、ポリシストロンのオペロンによってコードされる。つまり本方法は、コード配列が挿入された宿主細胞内で機能的なプロモーター配列と作動的に連結した、ポリシストロンのコード配列を使用するステップを含む。別の態様において、本発明の分断ポリメラーゼは、同じ宿主細胞内、または２つの別々の宿主細胞内の２つの別々のプラスミド上に存在する、２つのコード配列によってコードされる。両方の態様において、分断ポリメラーゼのそれぞれの区域は翻訳され、かつ区域はその後、生体内または試験管内のいずれかで、完全分断ポリメラーゼを形成するために、互いに会合する。

さらなる態様において、本発明は、本発明の分断ポリメラーゼを用いた方法を提供する。本発明の分断ポリメラーゼは、核酸増幅、核配列解析、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）、核酸標識化、修飾されたプライマーまたは鋳型の合成、またはポリメラーゼを必要とする任意の反応に用いることができる。一般にこれらの態様は、特に非従来型のヌクレオチド、および二重標識化ヌクレオチドアナログなどのヌクレオチドアナログの使用に対して適している。

複数の態様において、本発明の方法は、非天然型ヌクレオチドの利用（例えば、新生核酸鎖内への結合および／または取り込み）増加させるのに使用される。これは、ポリメラーゼが、非天然型ヌクレオチドに対して増加した活性を示すような方法で、ポリメラーゼを分断することによって達成される。高いヌクレオチドアナログの取り込みは、分断をアミノ酸配列中の他の変異と組み合わせることによって、分断またはアミノ酸交換のみを用いた場合と比較して、さらに増加する。

別の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明の分断ポリメラーゼを含む、組成物およびキットを提供する。組成物は、本発明の分断ポリメラーゼの少なくとも１つの分子と、本発明の方法に役立つ一般的な物質である、１つまたはそれ以上の物質を、共に含み得る。一般に本発明によるキットは、分断ポリメラーゼが生じることを用いた少なくとも１つの方法を可能にする、十分量の分断ポリメラーゼを含み、かつ少なくとも１つの容器を含む。キットは通常、ポリメラーゼまたは本発明の核酸、および随意に本発明の方法の実施に有用である１つまたはそれ以上の他の組成物を含み、ここでキットの組成物は、貯蔵および使用の容易さと組み合わせて包装される、１つまたはそれ以上の容器を含む。複数の容器は、本発明の方法の複数回の実施を可能にするため、しばしば存在する。

この明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの態様および、本発明の様々な原理を説明する役割をする記載の説明と共に、例示する。図面は本発明の範囲または内容を限定するようには解釈されないと理解されるべきである。
ＤＮＡ ファミリーBポリメラーゼ由来の、一連のフィンガードメインの、複数のＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ配列アライメントを示す。 図２Ａ‐２Ｂは、いくつかのファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の位置を示す。Aは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）（配列番号３）；Ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（配列番号７）；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈｏ） （配列番号８）；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ（Ｔｇｏ）（配列番号９）；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉs （古細菌）（配列番号１０）(古細菌ＤＮＡポリメラーゼとして知られている)；ＪＤＦ‐３ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（配列番号：１１）；９°Ｎ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（配列番号：１２）；およびｖｅｎｔ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（配列番号１３）由来のものである。Ｂは、配列番号４、５および６のフィンガーモチーフの共通アミノ酸を示す。 図３Ａ‐３Ｅは、核酸コード配列、および対応するＡに対する翻訳産物を示す。天然型Ｐｆｕ（配列番号：３）およびB．アミノ酸Ｋ４６７の後ろでのシームレス分断のＰｆｕである。リボソーム再開およびフレームシフト終止コドンが記載されている。図３Ｃ‐３Ｅは、アミノ酸４６６での分断の後ろに挿入された３つの分断の、翻訳再開を促進するためのメチオニン残基を示す。図３Ｄにおいて、メチオニンは単一の再開部位を提供するために変異導入される。 分断ＪＤＦ‐３ ＤＮＡポリメラーゼに対する、ＪＤＦ‐３ ２０２のアミノ酸コード配列を示す。パネルAは、分断のアミノ断片（断片Ｉ）を示し、パネルBは、リボソームが停止コドン（ＴＧＡ）に遭遇し、かつＡＴＧコドンより再開する場合の、１から３への翻訳の読み枠のシフトを示し、およびパネルＣは、分断のカルボキシ断片（断片ＩＩ）を示す。 Ｎ末端断片のＣ末端における１０アミノ酸の挿入をもたらす、アミノ酸４６９の後ろでの分断を有する変異体ＪＤＦ‐３ Ｚ２に対するアミノ酸コード配列を示す。パネルＡは、分断のアミノ断片を示し、パネルＢは、リボソームが停止コドン（ＴＡＧ）に遭遇し、かつＡＴＧコドンより再開する場合の、１から３への翻訳の読み枠のシフトを示し、およびパネルＣは、分断のカルボキシ断片を示す。 Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈｏ）（配列番号６２）(受入番号：ＮＰ＿１４３７７６．１ ＧＩ：１４５９１６８８)；ＤＮＡポリメラーゼ１ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ（Ｐａｂポリメラーゼ）（配列番号６０）（受入番号：Ｐ７７９１６ ＧＩ：６６４８０７３）； ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；エンドヌクレアーゼ［Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．］（配列番号６１）（受入番号：ＣＡＡ９０８８７．１ ＧＩ：１４９５７７０）；Ｖｅｎｔ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（配列番号５７）（受入番号：Ｐ３０３１７ ＧＩ：２３２０２０）；Ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（配列番号６４）（受入番号：Ｑ５１３３４ ＧＩ：２４９４１８６）；９°Ｎ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（９０Ｎ‐７）（配列番号６７）（受入番号： １ＱＨＴＡ ＧＩ：８５６９２９７）；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ（Ｔｇｏ）（配列番号６９）(受入番号：１ＴＧＯ＿Ａ ＧＩ：４６９９８０６)；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ（Ｔｆｕ）（配列番号５９）（受入番号：０３３８４５ ＧＩ：３９１３５２４）；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＳＴ７００（ＳＴ７００）（配列番号６３）（受入番号ＣＡＣ１２８４７．１ ＧＩ：１０７９９８６９）；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）（配列番号６６）（受入番号： ＡＡＬ８ ０３３６．１ ０１：１８８９２１４７）；ＤＮＡポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＥ８（配列番号６８）（受入番号：ＣＡＣ１２８５０．１ ＧＩ：１０７９９８９５）；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＬＩ）（配列番号５８）（受入番号：ＡＡＡ７２１０Ｈ ＧＩ：３４８６８９）；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＮＡ１前駆体（ＴＳＰＮＡ１）ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ（配列番号７１）（受入番号： ＡＢＣ１ １９７２．１ ＧＩ：８３３３８４８６）；ＤＮＡ定方向ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＣ ２．７．７．７）Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＫＯＤ１系）前駆体含有ＫＯＤインテイン（ＴＳＰＫＯＤ）（配列番号７２）（受入番号：ＡＢＣ１ １９７２．１ ＧＩ：８３３３８４８６）；ＰｏｌＡ前駆体Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ（ＴＺＩ）（配列番号７０）（受入番号：ＡＢＤ１４８６８．１ＧＩ：８６７５３３８９）；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉs （ＴＨＹ）（配列番号７３）（受入番号：１ＷＮ７＿Ａ ＧＩ：７３５３５４４７）；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ（ＰＧＬ）（配列番号６５）（受入番号：ＣＡＣ１２８４９．１ ＧＩ：１０７９９８９９）；ＤＮＡ ポリメラーゼ ＩＩ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉ（ＳＵＬＦＯＴＯ）（配列番号７４）（受入番号：ＮＰ３７８０６６．１ ＧＩ：１５９２２３９７）；およびＤｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｔｏｋ（ＴＯＫ）（配列番号：７５）（受入番号：１Ｄ５ＡＡ ＧＩ：７５４６３９４）由来の、いくつかのファミリー B ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の配置を示す。 ＪＤＦ‐３ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（配列番号３３）；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ （Ｐｈｏ）（配列番号３４）（受入番号：ＮＰ＿１４３７７６．１ ＧＩ：１４５９１６８８）；ＤＮＡポリメラーゼ１ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ （Ｐａｂ ポリメラーゼ）（配列番号３５）（受入番号：Ｐ７７９ １６ ０１：６６４８０７３）；ＤＮＡ依存性 ＤＮＡポリメラーゼ；エンドヌクレアーゼ [Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．]（配列番号３６）（受入番号： ＣＡＡ９０８８７．１ ＧＩ：１４９５７７０）；ｖｅｎｔ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（配列番号３７）（受入番号：Ｐ３０３ １７ ＧＩ：２３２０２０）；Ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（配列番号３８）（受入番号：Ｑ５１３３４ ＧＩ：２４９４１８６）；９°Ｎ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（９ＯＮ‐７）（配列番号３９）（受入番号：１ＱＨＴＡ ＧＩ：８５６９２９７）；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｏｎａｒｉｕｓ（Ｔｇｏ）（配列番号：４０）（受入番号：１ＴＧＯ＿Ａ ＧＩ：４６９９８０６）；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ （Ｔｆｕ）（配列番号４１）（受入番号：０３３８４５ ＧＩ：３９１３５２４）；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＳＴ７００（ＳＴ７００）（配列番号４２）（受入番号：ＣＡＣ１２８４７．１０１１０７９９８６９）；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）（配列番号４３）(受入番号：ＡＡＬ８０３３６．１ ０１：１８８９２ １４７)；ＤＮＡポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＥ８（配列番号４４）（受入番号：ＣＡＣ１２８５０．１ ０１１０７９９８９５）；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ(ＴＬＩ)（配列番号４５）（受入番号：ＡＡＡ７２１０１．１ ＧＩ：３４８６８９）；ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ 前駆体 ＆ｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＮＡ１（ＴＳＰＮＡ１）（配列番号４６）（受入番号： ＡＢＣＩ １９７２．１ ０１：８３３３８４８６）；ＤＮＡ-方向性 ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＣ２．７．７．７） ＫＯＤインテインを含む前駆体Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＫＯＤ１系）（ＴＳＰＫＯＤ）（配列番号４７）（受入番号：ＡＢＣ１１９７２．１０１：８３３３８４８６）；ＰｏｌＡ前駆体Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ（ＴＺＩ）（配列番号４８）（受入番号：ＡＢＤ１４８６８．１ ＧＩ：８６７５３３８９)；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉs （ＴＨＹ）（配列番号４９）（受入番号：１ＷＮ７＿Ａ ＧＩ：７３５３５４４７）；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ（ＰＧＬ）（配列番号５０）（受入番号：ＣＡＣ１２８４９．１ ０１１０７９９８９９）；ＤＮＡポリメラーゼＩＩ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｚ ｓｔｒ．７ （ＳＵＬＦＯＴＯ）（配列番号５１）（受入番号：ＮＰ ３７８０６６．１ ＧＩ：１５９２２３９７）；およびＤｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｔｏｋ（ＴＯＫ）（配列番号５２）（受入番号：１Ｄ５ＡＡ ＧＩ：７５４６３９４）由来の、いくつかのファミリーB ＤＮＡポリメラーゼのフィンガードメインのアミノ酸配列を示す。ＤＮＡポリメラーゼ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉ ｓｔｒ． ７を含むフィンガーモチーフ配列番号５３および５４、およびＤＮＡポリメラーゼ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉ ｓｔｒ．７を除く配列番号５５および５６の共通アミノ酸が示されている。配列番号５４および５６において、ＢはＭ、Ｖ、ＬまたはＩで、ＪはＳまたはＴで、OはDまたはEで、 ＵはＦまたはＹで、ＺはＱ，ＫまたはＲで、ならびにＸは任意のアミノ酸である。 本発明のいくつかのＪＤＦ‐３変異体の、ＰＣＲ増幅活性を示す。 追加のＱ４８４Ｒ変異を有する、４Ｃ１１ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ断片（パネルＡ）およびカルボキシル断片（パネルＢ）のアミノ酸配列を示す。 γーリン酸においてダブシル標識化したｄＣＴＰアナログの存在下における、追加のＱ４８４Ｒ変異（二重変異体）を有するフレームシフト（分断）変異体のＰＣＲ増幅活性を示す。 ヌクレオチドアナログＦＣＤで標識化したｄＣＴＰの存在下における、エキソ（−）変異を有する４Ｃ１１変異体のＰＣＲ増幅活性を示す。パネルAにおいて、ゲルは未染色であり、およびＰＣＲ産物はヌクレオチド中の蛍光標識化によって明らかになる。パネルＢにおいて、ゲルは全体ＤＮＡを示すため、臭化エチジウムで染色される。アナログのμＭ濃度は、ウェルの上部に示す。 別々に発現した４Ｃ１１分断ポリメラーゼ断片を、封入体より一部精製後可溶化したＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（パネルＡおよびＢ）、リフォールディングした４Ｃ１１分断ポリメラーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（パネルＣ）、リフォールディングしたタンパク質のＰＣＲアッセイ (パネルD)およびさらにカラムクロマトグラフィーで精製後リフォールディングした、タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（パネルＥ）を示す。 リボソームが停止コドン（ＴＧＡ）に遭遇し、かつＡＴＧコドン(パネルＢ)から再開する場合、１から３への翻訳の読み枠のシフトしたアミノ断片(パネルＡ；断片I)のアミノ酸配列、および追加のＱ４８４Ｒ変異をシームレス分断Ｐｆｕ ポリメラーゼである、クローンＳＱのカルボキシル断片（パネルＣ；断片ＩＩ）を示す。

タンパク質構造変化させる変異を作る能力は、タンパク質の機能の解明、および以前は不適当であった反応を完了させるためのタンパク質の利用に対する基本的なツールとなっている（Ａｒｎｏｌｄ，１９９３，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：７４４）。速度の変化、熱安定性、最適ｐＨ、基質および反応における最終産物などの酵素特性の変化は、研究および産業において広く使用されている。これらの変化は、標的の酵素のアミノ酸の変更、付加、または削除に関連する。これらの構想における一般的な望ましくない変異は、ヌクレオチド配列中の付加または削除が、リボソーム翻訳複合体に、見当はずれのトリプレットＤＮＡコドンの読み込み、間違ったアミノ酸取り込みの読み込み、および早期切断を引き起こす、フレームシフト変異である。多くの場合、翻訳の早期終止は、非機能的なまたは機能に乏しい酵素を導く。本明細書で報告しているように、ＤＮＡポリメラーゼ酵素において破壊を戦略的に引き起こす能力（開始コドンから停止コドンを通じて）は、ポリメラーゼ機能を維持していただけでなく、おそらく可動性の増加または重要なドメインの再配置を通して、幅広い基質を許容する驚くべき能力も与えた。

本発明は、基質の利用を幅広くするための、酵素中への非天然型分断の導入に関連する。「非天然型」は、分断が、酵素が自然に分断されることが知られていない部位中に導入されることを意味する。よってこれは例えば既知の天然の分断ポリメラーゼのことを呼ばないが、追加のまたは代替の分断部位を有するこのような酵素を包含する。本発明は、多くの異なる型の酵素に適用することができる。本発明を制限することを除いて、このような非天然型分断は、サブドメイン間の可動性を増加させること、および基質相互作用上の制約を減少させることが期待される。分断部位（および対応する分断の除去）における挿入は、例えばサブドメイン間の可動性を増加させるなどの、分断と類似の効果を有することが予測される。非天然型分断ポリメラーゼの作成に代わって、非天然型非分断ポリメラーゼを形成し得ることも予測される。この態様において、停止コドンは、単量体酵素を作るための、一組の直列にコードされたヘテロ二量体酵素の間から除去される。例えば、ファミリーD Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは自然界において、２つの直列にコードされたヘテロ二量体酵素の立体配置を有する。

本発明を分断ＤＮＡ ポリメラーゼのために用いる場合、改善された二重標識化ヌクレオチド（例えば、米国特許出願２００４００１４０９６に記載のアナログ）などの非天然型基質の取り込みが見られる。分断は、修飾された当初鋳型の利用を改善するために、またはポリメラーゼの他の活性を修飾するために、フィンガードメイン内、３’プライマー結合/エディティング部位内、二重鎖ＤＮＡ結合部位内、一本鎖ＤＮＡ鋳型結合領域内などに導入することができる。また、アクセサリータンパク質結合に関連したドメイン近傍の分断は、これらの因子間の相互作用を変化させることができ、複製複合体の会合および変化した活性における違いを導く。ポリメラーゼに対するアクセサリー因子は、クランプ（ＰＣＮＡ）、一本鎖結合タンパク質（ＲＰＡ）およびヘリケースを含むが、これらに限定されない。

本発明は、入ってくるヌクレオチド、プライマーの３’末端、および／またはＤＮＡ鋳型と相互作用するポリメラーゼ領域における、もしくは非天然型基質の利用などのＤＮＡ重合の一面を改善するであろう任意の他の領域における、分断の導入を含む。

本発明の分断ポリメラーゼの１つは、Ｐｆｕ ４Ｃ１１であり、いくつかの変異（１‐４６７ Ｖ９３Ｒ／A３１８T）／（４６８‐７７５ Ｑ４８４Ｒ／V６０４L／A６６２V‐Ｓｓ０７ｄ７ｍ）を含む。Ｐｆｕ ４Ｃ１１（図３Ｂ、図９を参照）をコードするヌクレオチド配列は、野生型配列と比較して翻訳の未成熟終止をもたらすフレームシフト削除、および任意のアミノ酸の欠失または変化を除く、１つのヌクレオチドの後ろの上流リボソームシフトの翻訳の再開を含む。この工程は翻訳の結合として知られており、かつ第１の遺伝子の制御および転写のために、第２の、またはさらに第３の遺伝子の翻訳と連結している、いくつかのポリシストロンのオペロン中に見出される（Ａｋｓｏｙ等、１９８４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：３６３）。大腸菌における実験方法は、翻訳が未成熟で終了すると、７コドン下流内のメチオニンコドン（ＡＵＧ）は、リボソームリサイクル因子またはＳｈｉｎｅ‐Ｄａｌｇａｒｎｏ共通配列（Ｋａｒａｍｙｓｈｅｖ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ．１２：９３３）を除き、翻訳を再開することができることを明らかにする。開始コドンおよび終結コドンの最適の翻訳の結合位置は、ＵＧＡ終止コドンの前に存在する、ＡＵＧ開始を有するＡＵＧＡによって実証された（Ｈｏｐｆｎｅｒ，１９９９，上記を参照）。Ｐｆｕ配列において、任意のヌクレオチド１３９８〜１４０２由来のｄＡのいずれか一つの削除は、同じフレームシフト/結合翻訳最終産物をもたらす。切断されたポリペプチド（断片Ｉ）は、前のＰｆｕのカルボキシ末端に対応する新しいポリペプチドである一方で、Ｍｅｔ４６８から始まり、かつアミノ酸４６８‐７５５（断片ＩＩ）を包含する、アミノ酸１‐４６７に対応する。

別々におよび同時の、Ｐｆｕ １‐４６７および４６８‐７７５断片（フレームシフトによって産生される）の発現は、アミノ酸４６８から始まるおよび配列番号３のアミノ酸４６８−７５５を包含するカルボキシタンパク質ドメインは、アミノ断片の一部から発現した場合、極端に不溶であることを明らかにする。連結翻訳を通じて互いに発現する場合、２つのペプチドが同モル量共精製されることは、断片は互いに安定な複合体にフォールディングしたことを示す。２つのペプチドをコードする遺伝子断片が互いに分離して発現する場合、全長天然型タンパク質のように安定なまたは可溶性でなくとも、アミノタンパク質は精製することができる。

Ｑ４８４Ｒ変異が分断に加えられる場合、ヌクレオチドアナログ取り込みにおける相乗効果がある。２つの変異は、フィンガーの先端の近くにある反対側のαへリックスで近接近している。Ｐｆｕにおいて、分断誘導フレームシフトおよびＱ４８４Ｒ変異は、別々にＦＡＭ‐ｄＣＴＰ‐ダブシル取り込みを改善する一方で、これらの２つの変異の組み合わせは、より良いアナログ取り込みを産生する。二重変異体の立体配置は、特にγーリン酸においてダブシル‐ｄＣＴＰ修飾されたものの取り込みを改善する（図１０）。作用機序により結合することが望まれない一方で、フィンガーが入ってくるヌクレオチドを覆うようにしてフォールディングされる場合、かさ高いヌクレオチドアナログの取り込みは、ヌクレオチド結合ポケットを緩めることで改善されることが示されている。

４Ｃ１１分断ＰｆｕおよびＱ４８４Ｒ二重変異体はＰＣＲ反応において頑強であり、かつ観測できる範囲の活性の欠陥はないことが明らである。特にこのような高度に保存されたドメインにおける小さな変化が活性に有害であることが予測できるという事実を考慮すると、これはいくらか驚くべきことである。

分断は野生型および変異体Ｑ４８４Ｒ Ｐｆｕ ポリメラーゼバックグラウンド中に挿入され、および終了点（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ）ＰＣＲアッセイにおいて、かさ高いヌクレオチドアナログ５−アミノアリル−（５−ＦＡＭ）−２’−デオキシシチジン−５’−γ−トリホスホ―Ｎ６−（６−アミノヘキシル）−ダブシル（ＦＣＤ）を取り込む能力に対して試験された。反応は、標準の濃度のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰと共に行った。ｄＣＴＰプールは、ｄＣＴＰおよびＦＣＤの組み合わせであり、ｄＣＴＰプール中のＦＣＤの割合は、０％（１００％ｄＣＴＰ：０％ＦＣＤ）から１００％（０％ｄＣＴＰ：１００％ＦＣＤ）まで変化させた。臭化エチジウムなしのアガロースまたはアクリルアミドゲル上でのＰＣＲ産物の電気泳動は、紫外線励起およびグリーンフィルターによって結果として生じるＦＡＭ-標識化ＤＮＡ産物を可視化することを可能にする（図１１）。ゲルはその後臭化エチジウムで染色後、すべてのＤＮＡ分子を反映するために、オレンジフィルターによって可視化された。野生型エキソ（−）ＰｆｕはＦＣＤアナログを取り込むことができない一方で、分断Ｐｆｕ Ｑ４８４Ｒ二重変異体は、５０‐７５％ＦＣＤ（これらの条件下において）のＦＡＭ‐ｄＣＭＰの適切な取り込みを示した。本発明において「エキソ（−）」は、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ変異を含むポリメラーゼとして定義される（例えば、米国特許第５４８９５２３号を参照されたい）。

さらにＱ４８４Ｒ変異を含む分断ポリメラーゼは、エキソ‐（＋）またはエキソ（−）（それぞれ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａの変異を含まず、およびＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａの変異を含む）型のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼについても試験された。なぜなら、標識化アナログは活性型３’‐５’エキソヌクレアーゼによって活性化させることができ、エキソ‐（＋）酵素によって産生された単位複製配列はエキソ（−）分断Ｐｆｕ Ｑ４８４Ｒによって産生された単位複製配列よりも蛍光が弱く、およびプルーフリーディング活性によって放出された遊離ＦＡＭ‐ｄＣＭＰは、容易にゲル上で可視化される。したがって、３’‐５’エキソ活性を欠く分断ポリメラーゼは、終末点反応における非従来型のヌクレオチドの取り込みに対する使用に好ましい。他の適用において、エキソ活性を有するポリメラーゼの使用が好ましい。

変異体Ｓｓｏ７ｄタンパク質ドメインに対するコード配列（＜９０％同一性；米国特許出願第２００５００４８５３０号を参照されたい）は、ポリメラーゼの処理能力を増加させるために、Ｃ末端部のＰｆｕ ４６８‐７７５（Ｑ４８４Ｒ）断片の末端に取り込まれる。ポリメラーゼは、アミノ酸４６６の後ろでの分断を有する、エキソ‐（＋）またはエキソ（−）型のＰｆｕのいずれかを有する、バイシストロニックＤＮＡポリメラーゼから発現される。ＤＮＡ結合領域の取り込みは、ＤＮＡ結合領域を欠くポリメラーゼと比較して、ポリメラーゼの識別特性を変化させなかった。

ポリメラーゼ内への分断の挿入によって二重標識化ヌクレオチドアナログの利用が増大することを特定することは、Ｐｆｕ固有のものであり、ＪＤＦ‐３分断ポリメラーゼバイシストロニックコード配列が作成される。得られたポリメラーゼは、図５に示す（ＪＤＦ‐３ Ｚ２）。アミノ酸４６９の後ろの分断に加えて、１０アミノ酸がＮ末端ＪＤＦ‐３断片のＣ末端上に付加された。これは、アミノ酸が野生型配列に加えられない点で、Ｐｆｕ ４Ｃ１１変異とは異なる。ＪＤＦ‐３変異体Ｚ２は、フィンガードメインの先端近傍におけるフィンガーの挿入を示し、かつ伸長反応における非従来型のヌクレオチドの取り込みの増加をもたらすことが見出された。

上記のように、本発明は基質の利用を拡げる非天然型分断を有する酵素を提供する。本発明は、多くの異なる型の酵素に適用することができる。例えば、非天然型分断は、フィンガー領域中などの、ポリメラーゼ活性を修飾する任意の領域において存在することができる。好ましくは、ポリメラーゼにおける非天然型分断は、非天然型ヌクレオチド、特に二重標識化ヌクレオチドアナログに対する改善された取り込み、または識別の減少を有する分断ポリメラーゼをもたらす。分断ポリメラーゼはさらに非天然型ヌクレオチドの取り込みを改善するため、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を減少させるため、５’‐３’エキソヌクレアーゼ活性を減少させるため、ウラシル検出活性を減少させるため、非分断ポリメラーゼと比較して安定性を増加させるため、またはＤＮＡ結合領域を取り込むように修飾されるために、さらに修飾されうる。好ましい態様において、分断ポリメラーゼを作り出すために用いられた熱安定性ポリメラーゼは、ファミリーＡおよびファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼから選択される。これは古細菌、哺乳動物、またはバクテリオファージポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。一態様において、１つまたはそれ以上の分断を含む、分断ポリメラーゼは熱安定性古細菌ポリメラーゼである。一態様において、分断ポリメラーゼは、フィンガードメインにおいて分断されるポリメラーゼである。

分断ポリメラーゼは、単一の、機能的なポリメラーゼ分子を形成するために会合する、少なくとも２つの分離したポリペプチド（例えば、Ｎ末端断片及びＣ末端断片）として発現されたポリメラーゼと理解される。一般に会合は非共有結合であり、硫黄‐硫黄架橋などの共有結合架橋でもあるが、ポリペプチドへの連結を形成しうる。必要でなければ、分断ポリメラーゼの断片の発現は、好ましくは適切なフォールディングを促進するために翻訳的に結合する。分断ポリメラーゼは、少なくとも１つの分断、好ましくはタンパク質のフィンガードメイン中に好ましい１つの分断を有することを含む。分断は、分断ポリメラーゼを構成する少なくとも２つのポリペプチドなどの、ポリメラーゼのアミノ酸配列における切断と理解されている。分断はさらに、挿入、欠損、および／または分断の部位におけるアミノ酸の変異をもたらすことができる。すなわち、ポリペプチドが結合した場合、ギャップ、挿入、および／または分断の部位における野生型配列と比較した変異となるであろう。好ましい態様において、分断の部位において最大約５アミノ酸を削除することができる。あるいは、他の好ましい態様において、分断において生じた新規のＣ末端および／またはN末端のいずれかまたは両方に、最大約４０アミノ酸をに加えることができる。しばしば、メチオニンがポリメラーゼのC末端断片に対する野生型コード配列中に存在しない場合、１つのメチオニンが、翻訳の開始部位の作成のために、コード配列のN末端に加えられる。メチオニンに対するコード配列は、一般的には別々のベクターまたは発現構築物において、ポリシストロンのｍＲＮＡにおける翻訳のリボソーム再開を促進するために挿入され、または二次プロモーターからのC末端断片の翻訳の開始を可能にする。あるいは、ＧＴＧのような他の開始コドンも、翻訳の結合に働く。

さまざまなポリメラーゼの領域IIIは、２つの長い非平行αへリックスからなり、短いループ（フィンガー先端）によって分離される、「フィンガードメイン」を包含する。フィンガードメインの配列は、図１および７に示す。αへリックスは、ＰｆｕにおけるヘリックスＮ／Ｏ（ＢｉｌｅｓおよびＣｏｎｎｏｌｌｙ，２００４，上記を参照）、ＳｓｏにおけるＲ‐Ｒ’／Ｓ（Ｓａｖｉｎｏ等、２００４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １２：２００１）およびＴｇｏ ＤＮＡポリメラーゼにおけるＯＴＰ（Ｈｏｐｆｎｅｒ，Ｃｔ等、１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，９６：３６００）に対応する、古細菌ＤＮＡポリメラーゼのフィンガードメインを含む。いくつかの古細菌ＤＮＡポリメラーゼの構造が特定され、およびフィンガードメインの特性が、いくつかの刊行物において考察された（Ｈｏｐｆｎｅｒ，等、１９９９，上記を参照；Ｚｈａｏ等、１９９９．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ７：１１８９；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ等、２０００．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９９：４４７；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ等、２００１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０６：４６９；Ｓａｖｉｎｏ等、２００４，上記を参照）。バクテリオファージＲＢ６９ ＤＮＡ ｐｏｌ-プライマー／鋳型-ｄＮＴＰ結晶構造との比較は、ｄＮＴＰ結合および忠実性において、フィンガードメイン中の保存されたアミノ酸を関連付ける。しかしながら、Ｔ４およびＴ４‐様ファージのフィンガードメインは、延長したフィンガー先端ドメインを有しており、すなわち古細菌ファミリーBポリメラーゼにおいて見出されない。フィンガードメインは古細菌にわたって高度に保存されており、すべてのＤＮＡポリメラーゼは類似のヘリックス‐ループ‐へリックスモチーフを有しており、かつしたがってｄＮＴＰ認識に対する同じ作用機序を使用していることを示唆する。さらにその上、多くのポリメラーゼのアミノ酸配列が知られており、分断部位および１つのポリメラーゼから別のポリメラーゼへの変異の推定を可能にする。へリックス‐ループ‐へリックスのフォールディングは、両方のαへリックス由来の、いくつかの高度に保存されたアミノ酸の近傍の配置を導く。

フィンガーサブドメインは、保存された領域IIIおよびIVを含む、主として２つの長い非並行型αへリックスを形成する。フィンガードメインの長さは、ファミリーBポリメラーゼ中で実質的に変化する。例えば、Ｔ４およびＴ４‐様ウイルスＲＢ６９、ＲＢ４９、ＲＢ４３、およびＡｅｈ １由来のいくつかのｇｐ４３ タンパク質は、ｇｐ４３ タンパク質間で広く分布する、フィンガーの先端の配列における構造的に不規則な５０〜７５アミノ酸残基を含む（Ｐｅｔｒｏｖ等、２００６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６１：４６）。さらに興味深いことに、いくつかの古細菌のファミリーBポリメラーゼは、全体的な構造においてＲＢ６９ ｇｐ４３と類似しているが、フィンガードメインの全体においてこのフィンガー先端の特徴を欠く。しかしながら、ヘリックス間の短い介在配列におけるアミノ酸、特にアミノ酸４７２および４７３(Ｐｆｕ番号)は、ポリメラーゼの忠実性に関連することを示す（ＢｉｌｅｓおよびＣｏｎｎｏｌｌｙ、２００４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：ｅ１７６）。他のｇｐ４３ タンパク質において、コード配列はフィンガー先端配列において中断されるため、２つの分離したＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、またはシストロン４３Ａおよび４３Ｂに遺伝子を分断する。天然の分断ポリメラーゼは古細菌においても同定されたが、分断はフィンガードメインの外側に位置する（Ｋｅｌｍａｎ等、１９９９．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２８７５１）。

本明細書において、「ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼ」または「Ａファミリー ＤＮＡポリメラーゼ」またはこれらの変異は、ファミリーＡポリメラーゼのメンバーとして分類された任意のＤＮＡポリメラーゼを参照し、ここでファミリーＡ分類は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩとの構造的な類似性に基づく。ファミリーＡポリメラーゼは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｓｔｒｐｔｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅ ＤＮ ポリメラーゼＩ；バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｐｏｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｐｏ２ ＤＮＡポリメラーゼ；酵母ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼＩＩ；およびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼなどの、細菌ＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。

本明細書において、「ファミリーB ＤＮＡポリメラーゼ」または「BファミリーＤＮＡポリメラーゼ」またはこれらの変異は、ファミリーB ＤＮＡポリメラーゼのメンバーとして分類された任意のＤＮＡポリメラーゼを参照し、ここでファミリーB分類は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩとの構造的な類似性に基づく。以前はα‐ファミリーポリメラーゼとして知られていた（ＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ、１９９１，上記を参照）ファミリーB ＤＮＡポリメラーゼは、ヒトα、δおよびεＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４、ＲＢ６９およびΦ２９バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕポリメラーゼ）を含むが、これらに限定されない（例えば、表１を参照されたい）。

ファミリーB ＤＮＡポリメラーゼの配列比較は、降順に類似性が番号付けされる、６つの保存された領域Ｉ‐ＶＩで示される（例えば、ＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ、１９９３，上記を参照、Ｅｄｇｅｌｌ等、１９９７を参照されたい）。ファミリーBポリメラーゼにおいて最も保存された残基は、３つの最も保存されたカルボン酸を特徴とする、ポリメラーゼ触媒中心から半径１０オングストローム以内に位置する（Ｗａｎｇ等、１９９７，Ｃｅｌｌ ８９：１０８７）。３つの最も高度に保存された領域（Ｉ、ＩＩ、およびIIIと指定）は、接触する保存された表面を産生するために、パーム（Ｉ）、フィンガー（ＩＩ）、およびサム（ＩＩＩ）の塩基から、活性部位の中心に収束する。幅広い種類のファミリーBポリメラーゼ由来のフィンガードメインの配列は、この領域が高度に保存されていることを示す（図１）。

ファミリーB ＤＮＡポリメラーゼは、ＦＩＰＳＸＬＸＸＬＸＸＸＲＱＸＸＫＸＸＭＫＸＸＸＤＰＸＥＫＸＸＬＤＹＲＱＸＡＩＫＸＬＡＮ（配列番号５）の配列を有するフィンガードメインにおいて、モチーフを有することで特徴付けることができ、ここでＸは任意のアミノ酸である。配列は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％モチーフと同一であり得る。クローン化ファミリー B ＤＮＡ ポリメラーゼは、ｖｅｎｔ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（Ｓｔｒａ１１‘’ＴＴＹ），Ｐａｂ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ，ＰＹＲＨＯ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、ＰＹＲＳＥ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＧＥ２３系）、Ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ、Ｐｆｕ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、ＪＤＦ‐３ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、９°N Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（９０Ｎ‐７系）、ＫＯＤ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｔｇｏ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ，ＴＨＥＦＭ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｕｃｏｌａｎｓ、ＭＥＴＴＨ Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｊ Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、ＰＯＣ Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ、ＡｐｅＩ Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、ＡＲＣＦＵ Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｄｅｓｕｕｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｔｏｋ、およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉsを含むが、これらに限定されない。

古細菌、細菌、ウイルスおよび真核生物の広域性にわたる、それぞれのファミリーＡ、Ｂ、およびＣのＤＮＡポリメラーゼタンパク質配列の配置は、参照として本明細書中に組み込まれるＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＨｏ（１９９３）中に含まれる。最近、ファミリーD（古細菌のユリ古細菌門（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）サブドメインにおいて見出される）、ファミリーＸ（例えば、既知の真核生物ポリメラーゼＰｏｌ βを含む）、およびファミリーＹ（損傷乗り越え合成ポリメラーゼを含む）が報告されている。ＤＮＡポリメラーゼ ファミリーＡ、ファミリーB、および逆転写酵素において保存されたモチーフは、モチーフＡ（ファミリーＡ共通配列のＤｈＳｘＩＥＬＲ、ファミリーB共通配列のＤｈｘＳＬＹＰＳ、逆転写酵素共通配列のＤｈ‐‐ＧＹ）およびモチーフB（ファミリーＡ共通配列の ＧＫｘｈＮＦＧＶＬＹＧ、ファミリーＢ共通配列のＫｈｘｘＮ‐ＳＬＹＧ）を含む（ＧａｒｄｎｅｒおよびＪａｃｋ、１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７：１２，２５４５‐２５５３）。ファミリーＡおよびファミリーB ＤＮＡポリメラーゼにおいて見出されるB‐モチーフは、広い範囲のＤＮＡポリメラーゼにおいて見出される保存されたモチーフでもある（Ｅｖａｎｓ等、２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：１０５９‐１０６６）。プライマー-鋳型相互作用に重要なアミノ酸は、ファミリーＡおよびファミリーBポリメラーゼにおいても同定された（Ｈｏｇｇ等、２００４，ＥＭＢＯ，２３：１４８３‐１４９３）。したがって、本発明の分断ポリメラーゼは、フィンガーモチーフ以外の保存されたモチーフにおいて分断されているファミリーＡおよびファミリーＢポリメラーゼ、または保存されたモチーフを示す任意の他のポリメラーゼであることができる。

本発明の分断ポリメラーゼは、非天然型ヌクレオチドの取り込みを増加、および／または非分断ポリメラーゼと比較して修飾されたプライマー鋳型の利用の増加をもたらすことができる。これらは特に、二重標識化ヌクレオチドアナログなどの非天然型ヌクレオチドの識別の減少に対して適している。非天然型ヌクレオチドは、ポリリン酸および／または塩基において修飾され得る。改変は、フルオロフォアまたは消光剤を含み得る。標識化は、蛍光標識、消光剤、アイソトープ、化学発光標識、量子ドット標識、抗原、親和性部分、またはヌクレオチドアナログの検出を可能にする任意の他の構造を含むが、これらに限定されない。好ましい態様において、消光剤標識はポリリン酸基に結合し、かつ蛍光部分は核酸塩基またはヌクレオチドアナログの糖に結合する。

核酸塩基部分は好ましくはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群から選択されるが、これらの修飾型および機能的なアナログは特に熟慮される。例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって認識され、かつ取り込まれる、４つの従来型デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰのうちの１つではないヌクレオチド構造を意味する、非従来型のヌクレオチドも本発明に適用できると想定される。これらは、合成ヌクレオチド、修飾された従来型ヌクレオチド、リボヌクレオチドなどを含む。上記の非従来型のヌクレオチドうちのいずれか１つは「接合したヌクレオチド」であり得、ここで、本明細書において参照される、検出可能な標識化を生ずるヌクレオチドは、蛍光標識、消光剤、アイソトープ、化学発光標識、量子ドット標識、抗原、または親和性部分を含むが、これらに限定されない。さらに、本発明による二重標識化ヌクレオチドアナログは、核酸ポリメラーゼによるポリヌクレオチドの鋳型方向性重合に対する鎖ターミネーターとして振舞う。

分断ポリメラーゼは、キメラポリメラーゼ、第一のポリメラーゼ由来のＮ末端断片と第二のポリメラーゼのＣ末端断片との組み合わせであり得、好ましくは、断片は同じファミリーのポリメラーゼ由来である（例えば、両方ともファミリーＢポリメラーゼ）。組み合わせが単一の、機能的なポリメラーゼ 分子を形成するために会合する少なくとも２つの分離したポリペプチドを含む限り、ポリメラーゼの任意の組み合わせが本発明において使用し得る。

本発明において、コード配列内への分断の挿入は、一般的には分断ポリメラーゼのＣ末端断片の翻訳の再開のための開始因子メチオニンを導入するための、分断部位における少なくとも１つのアミノ酸中のコード配列の変異を含み得る。変異は、別の読み枠におけるメチオニンに対するコード配列を除くために、特に分断部位の下流である、分断部位の近傍のコード配列内へ導入され得る。リボソーム再開に対して競合する、２つのノンコーディングフレームにおけるＡＴＧメチオニン配列は、正しい読み枠における、コドンのｗｏｂｂｌｅ塩基の変更によってしばしば除去される。最終アミノ酸配列に変異を導入しないでコード配列内に変異を導入する方法は、当業者に既知である。

本発明の別の態様において、分断は、分断部位において、野生型配列と比較して少なくとも１つの追加のアミノ酸に対するコード配列の付加をもたらす、コード配列の改変をもたらす。改変は、追加のアミノ酸に対するコード配列の挿入を、またはリボソームの終止コドンの上流の再開コドンへの逆行（ｂａｃｋｓｌｉｄｉｎｇ）を促進する改変を、もたらし得る。野生型ポリメラーゼに挿入されうるものと比較して、最終ポリメラーゼに付加されたアミノ酸の数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、または４０アミノ酸である。

本発明の別の態様において、分断は、分断部位における野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸に対するコード配列の欠損をもたらす。修飾は、いくつかのアミノ酸に対するコード配列の欠損、またはリボソームの終止コドンの下流の再開コドンへのスライドを促進する改変をもたらし得る。削除しうるアミノ酸の数は、少なくとも１、２、３、４、または５アミノ酸である。

本発明の一態様において、分断に起因する任意の変異に加えて、分断ポリメラーゼはさらに野生型コード配列と比較して、１つまたはそれ以上の変異を含む。複数の変異は、分断ポリメラーゼに一つの新しい特性を与えるために、導入することができ、または複数の変異は、ポリメラーゼに複数の新しい特性を与えるために導入することができる。変異は、フィンガー領域内、または分断が起こる近傍またはその位置に導入することができ、または分断からさらに遠い領域に加えることができる。

分断ポリメラーゼにおける変異は、酵素において１つまたはそれ以上の変化をもたらす。例えば変異は、変異を含まない分断ポリメラーゼと比較して、分断ポリメラーゼの安定性を増加させることができる。他の実施例において、変異は、変異を含まないポリメラーゼと比較して、実質的にポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を減少させる。さらに他の実施例において、変異は、変異を含まないポリメラーゼと比較して、さらにポリメラーゼの識別を減少させる。これは、ウラシル検出の減少 および／または非従来型のヌクレオチドまたはヌクレオシドを取り込む傾向の増加をもたらすことができる。別の態様において、ポリメラーゼは、ドメインを有しないポリメラーゼと比較してポリメラーゼの処理能力を増加させる、ポリメラーゼに結合した非配列特異的な二本鎖ＤＮＡ結合領域を含み、好ましくは分断ポリメラーゼのＣ末端断片のＣ末端において含む。

本発明の一態様において、分断ポリメラーゼは、ＲＸＸＸＫ（Ｘ）ｎＱＸＸＸＫＸＸＸＮＳＸＧＸ（配列番号４）を含むモチーフを有することで特徴付けられ、ここでＸは任意のアミノ酸であり、およびｎ＝１５‐８０である。さらなる態様において、分断は、配列番号４のモチーフに存在する。

本発明の一態様において，本発明の分断ポリメラーゼは、Xは任意のアミノ酸である、ＦＩＰＳＸＬＸＸＬＸＸＸＲＱＸＸＫＸＸＭＫＸＸＸＤＰＸＥＫＸＸＬＤＹＲＱＸＡＩＫＸＬＡＮ（配列番号５）を含むモチーフを有することで特徴づけられる。さらなる態様において、分断は、配列番号５のモチーフに存在する。一態様において、分断は、配列番号５のアミノ酸５〜４０の領域に存在する。一態様において、分断は、配列番号５のアミノ酸５〜３０の領域に存在する。一態様において、分断は、配列番号５のアミノ酸１０〜２５の領域に存在する。一態様において、分断は、配列番号５のアミノ酸１５〜２５の領域に存在する。

本発明の一態様において、ポリメラーゼは、ＢはＭ、Ｖ、ＬまたはＩで、ＪはＳまたはＴで、ＵはＦまたはＹで、ＺはＱ、ＫまたはＲで、およびＸは任意のアミノ酸である、ＦＩＰＳＢＬＸＸＬＢＸＸＲＸＸＢＫＸＺＭＫＸＪＸＤＰＢＥＫＸＢＬＤＹＲＱＺＡＩＫＢＬＡＮ（配列番号６）を含むモチーフを有することで特徴づけられる。さらなる態様において、分断は、配列番号６のモチーフに存在する。一態様において、分断は、配列番号６のアミノ酸５〜４０の領域に存在する。一態様において、分断は、配列番号６のアミノ酸５〜３０の領域に存在する。一態様において、分断は、配列番号６のアミノ酸１０〜２５の領域に存在する。一態様において、分断は、配列番号６のアミノ酸１５〜２５の領域に存在する。

本発明の一態様において、分断ポリメラーゼはＧＸＸＸＸＸＬＸＸＬＸＸＸＲＸＸＸＫＸＸＭＸＸＸＸＤＸＸＸＸＸＸＬＤＸＲＱＸＡＸＫＸＸＡＮＸＸＹＧＹＸＸＸ（配列番号５３）を含むモチーフを有することで特徴付けられ、ここでＸは任意のアミノ酸であり、およびｎ＝１５‐４０であり、Ｘは任意のアミノ酸である。さらなる態様において、分断は配列番号５３のモチーフに存在する。さらなる態様において、分断は配列番号５３のモチーフに存在する。一態様において、分断は配列番号５３のアミノ酸５〜４０の領域に存在する。一態様において、分断は配列番号５３のアミノ酸５〜３０の領域に存在する。一態様において、分断は配列番号５３のアミノ酸１０〜２５の領域に存在する。一態様において、分断は配列番号５３のアミノ酸１５〜２５の領域に存在する。

本発明の一態様において、本発明の分断ポリメラーゼは、ＧＸＸＸＸＢＬＸＸＬＢＸＸＲＸＸＢＫＸＸＭＸＸＪＸＤＸＸＯＺＸＢＬＤＸＲＱＺＡＢＫＢＢＡＮＸＵＹＧＹＸＸＸ（配列番号５４）を含むモチーフを有することで特徴付けられ、ここでＸは任意のアミノ酸である。さらなる態様において、分断は配列番号５４のモチーフに存在する。一態様において、分断は配列番号５４のアミノ酸５〜４０の領域に存在する。一態様において、分断は配列番号５４のアミノ酸５〜３０の領域に存在する。一態様において、分断は配列番号５４のアミノ酸１０〜２５の領域に存在する。一態様において、分断は配列番号５４のアミノ酸１５〜２５の領域に存在する。

本発明の一態様において、分断ポリメラーゼは、ＧＦＩＰＳＸＬＸＸＬＸＸＸＲＱＸＸＫＸＸＭＺＸＸＸＤＰＸＸＸＸＸＬＤＹＲＱＸＡＩＫＸＬＡＮＳＵＹＧＹＸＸＹ（配列番号５５）を含むモチーフを有することで特徴付けられ、ここでＸは任意のアミノ酸であり、およびｎ＝１５‐４０であり、Ｘは任意のアミノ酸である。さらなる態様において、分断は配列番号５５のモチーフに存在する。さらなる態様において、分断は配列番号５５のモチーフに存在する。一態様において、分断は配列番号５５のアミノ酸５〜４０の領域に存在する。一態様において、分断は配列番号５５のアミノ酸５〜３０の領域に存在する。一態様において、分断は配列番号５５のアミノ酸１０〜２５の領域に存在する。一態様において、分断は配列番号５５のアミノ酸１５〜２５の領域に存在する。

本発明の一態様において、本発明の分断ポリメラーゼはＧＦＩＰＳＢＬＸＸＬＢＸＸＲＸＸＢＫＸＸＭＺＸＪＸＤＰＢＥＺＢＢＬＤＹＲＱＺＡＩＫＢＬＡＮＳＵＹＧＹＸＸＹ（配列番号５６）を含むモチーフを有することで特徴付けられ、ここでＸは任意のアミノ酸である。さらなる態様において、分断は配列番号５６のモチーフに存在する。一態様において、分断は配列番号５６のアミノ酸５〜４０の領域に存在する。一態様において、分断は配列番号５６アミノ酸５〜３０の領域に存在する。一態様において、分断は配列番号５６のアミノ酸１０〜２５の領域に存在する。一態様において、分断は配列番号５６のアミノ酸１５〜２５の領域に存在する。一態様において、配列番号５６において追加のＱ４８４Ｒ変異が存在する。

本発明の一態様において、ポリメラーゼは、少なくとも７５％同一、８０％同一、８５％ 同一、９０％同一、または９５％同一などの、配列番号４、５、６、５３、５４、５５、または５６と少なくとも７０％同一の配列を有することによって特徴付けられる。さらなる態様において、分断は、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一などの、配列番号４、５、６、５３、５４、５５、または５６のモチーフと少なくとも７０％同一の配列に存在する。一態様において、分断は、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一などの、配列番号５、６、５３、５４、５５、または５６のモチーフと少なくとも７０％同一の配列内の、アミノ酸５〜４０の領域に存在する。一態様において、分断は、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一などの、配列番号５または６のモチーフと少なくとも７０％同一の配列内の、アミノ酸５〜３０の領域に存在する。一態様において、分断は、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一などの、配列番号５または６のモチーフと少なくとも７０％ 同一である配列内のアミノ酸１０〜２５の領域に存在する。一態様において、分断は、少なくとも７５％ 同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一などの、配列番号５、６、５３、５４、５５、または５６のモチーフと少なくとも ７０％ 同一である配列内のアミノ酸１５〜２５の領域に存在する。もちろん、任意のこれらの態様の同一性は、特に提示しない限り、８４％同一または９２％同一などを範囲に含むことができる。すなわち、本発明は任意の特定の値または引用した範囲内の値の範囲、および値およびよく熟慮される範囲の収集を理解するために、当業者にとって特に本明細書で引用される必要がない、それぞれの特定の値を意図する。

本発明のさらなる態様において、分断はＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの領域内の部位において存在する。好ましくは、分断はポリメラーゼのフィンガードメイン中に導入される。実施例のように、分断は、アミノ酸４４８〜５００（ＧＦＩＰＳＬＬＧＨＬＬＥＥＲＱＫＩＫＴＫＭＫＥＴＱＤＰＩＥＫＩＬＬＤＹＲＱＫＡＩＫＬＬＡＮＳＦＹＧＹＹＧＹ）のいずれかの領域、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸４６０〜４８０、アミノ酸４６５〜４７５、またはアミノ酸４６６〜４７０で起こったことを見出すことができる。一態様において、分断ポリメラーゼはフィンガードメイン内に位置し、かつ少なくとも５５％同一性、少なくとも６０％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも８０％同一性、または少なくとも９０％同一性などの、Ｐｆｕポリメラーゼのアミノ酸４４８〜５００と少なくとも５０％同一性を有する。

要約すると、本発明の一態様において、ポリメラーゼが分断ポリメラーゼであり、分断はＦＩＰＳＢＬＸＸＬＢＸＸＲＸＸＢＫＸＺＭＫＸＪＸＤＰＢＥＫＢＬＤＹＲＱＺＡＩＫＢＬＡＮ（配列番号６）を含むモチーフによって特徴付けられる領域内のフィンガードメイン内に存在し、ＢはＭ、Ｖ、ＬまたはＩ；ＪはＳまたはＴ；ＵはＦまたはＹ；ＺはＱ、ＫまたはＲ；およびＸは任意のアミノ酸である、精製された熱安定性ポリメラーゼが提供される。一態様において、ポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ） ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ＪＤＦ‐３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ（Ｔｇｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢＤ（Ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、および古細菌ポリメラーゼＩからなる群から選択される。ポリメラーゼは、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓからなる群から選択される、ＤＮＡポリメラーゼであることができる。一態様において、ポリメラーゼは、アミノ酸配列が、配列番号４、５、または６と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である、フィンガードメインを含む。

一態様において、本発明は、ポリメラーゼが分断Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼフィンガードメインを含み、かつ分断がフィンガードメイン内に存在している、単離された核酸ポリメラーゼを提供する。ポリメラーゼは、アミノ酸４４８および５００、またはアミノ酸４６７および４６８間の分断を含み得る。

一態様において、本発明の分断ポリメラーゼはさらに、非分断ポリメラーゼと比較して、アミノ酸配列において変異を含む。変異は、変異を除いたポリメラーゼと比較して、ポリメラーゼの識別を減少させる、Ｌ４０９、Ｙ４１０、Ｐ４１１、Ｒ４６１、Ｋ４６５、Ｑ４７２、Ｑ４８４、Ａ４８６、Ｒ４８８、Ｌ４９０、Ａ４９１、Ｎ４９２、Ｙ４９５、およびＹ４９７からなる群から選択される、アミノ酸においてあり得る。識別の減少は、ウラシル検出の減少または非従来型のヌクレオチドまたはヌクレオシドを取り込む傾向の増加を含み得る。変異は、Ｌ４０９Ｈ、Ｙ４１０Ｖ、Ｐ４１１Ｌ、Ｒ４６１、Ａ／Ｎ、Ｋ４６５Ａ／Ｎ、Ｑ４７２Ｈ、Ｑ４８４Ｒ／Ｋ、Ａ４８６Ｔ、Ｒ４８８Ａ、Ｌ４９０Ｙ、Ａ４９１Ｙ、Ｎ４９２Ａ、Ｙ４９５Ｓ、Ｙ４９７Ａ１Ｌからなる群から選択される。ポリメラーゼはさらに、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ二重変異、およびＶ９３Ｒからなる群から選択される、変異がないポリメラーゼと比較して３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を減少させる、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼにおける部位に対応する、アミノ酸における変異を含みうる。ポリメラーゼはさらに、変異がないポリメラーゼと比較して分断ポリメラーゼの安定性を増加させる、Ａ３１８、Ｖ６０４およびＡ６６２からなる群から選択される、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼにおける部位に対応する、アミノ酸における変異を含み得る。別の態様において、変異は、非分断ポリメラーゼのレベルに匹敵する、分断ポリメラーゼの安定性を増加させる。変異は、Ａ３１８Ｔ、Ｖ６０４Ｌ、Ａ６６２Ｖ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。一実施例として、ポリメラーゼは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼにおけるアミノ酸Ｑ４８４に対応するアミノ酸部位での変異を含む。本発明による好ましい変異は、Ｑ４８４Ｒである。ポリメラーゼはさらに、Ａ３１８Ｔ、Ｖ６０４Ｌ、Ａ６６２Ｖ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、およびＶ９３Ｒからなる群から選択される、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼにおける部位に対応するアミノ酸部位を含む。

一態様において、ポリメラーゼはさらに、ポリメラーゼに結合した二本鎖配列非特異的核酸結合領域を含む。配列非特異的核酸結合領域は、野生型Ｓｓｏ７と９０％未満の同一性を有するＳｓｏ７派生物であり得る。

本発明の別の態様において、本発明は、ポリメラーゼが分断ポリメラーゼであり、分断がＧＸＸＸＸＢＬＸＸＬＢＸＸＲＸＸＢＫＸＸＭＸＸＪＸＤＸＸＯＺＸＢＬＤＸＲＱＺＡＢＫＢＢＡＮＸＵＹＧＹＸＸＸ （配列番号５４）を含むモチーフで特徴付けられる領域内に存在し、ＢはＭ、Ｖ、ＬまたはＩ；ＪはＳまたはＴ；OはDまたはE；ＵはＦまたはＹ；ＺはＱ、ＫまたはＲ；およびＸは任意のアミノ酸である、精製した熱安定性ポリメラーゼを提供する。ポリメラーゼは、ＪＤＦ‐３ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈｏ）ＤＮＡポリメラーゼ；ＤＮＡポリメラーゼ１ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ（Ｐａｂポリメラーゼ）；ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；エンドヌクレアーゼ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．；Ｖｅｎｔ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＤＮＡ ポリメラーゼ；９°Ｎ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（９０Ｎ‐７）ＤＮＡ ポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ（Ｔｇｏ）ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ （Ｔｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ．ＳＴ７００（ＳＴ７００）ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ；ＤＮＡポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＥ８；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼＴＬＩ）；ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ前駆体Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｕｕｓ ｓｐ． ＮＡＩ（ＴＳＰＮＡ１）；ＤＮＡ方向性ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＣ ２．７．７．７）ＫＯＤ、インテイン含有前駆体Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＫＯＤ１系）（ＴＳＰＫＯＤ）；ＰｏｌＡ前駆体 Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ（ＴＺＩ）；Ｔｈｅｒｍｏｏｃｕｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ（ＴＨＹ）ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ（ＰＧＬ）ＤＮＡポリメラーゼ；ＤＮＡポリメラーゼII Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉ ｓｔｒ．７（ＳＵＬＦＯＴＯ）ＤＮＡポリメラーゼ；およびＤｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｔｏｋ（ＴＯＫ）ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択され得る。一態様において、ポリメラーゼは、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓからなる群から選択される、古細菌ＤＮＡポリメラーゼである。ポリメラーゼは、配列番号５３、５４、５５、または５６と少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、または少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するフィンガードメインを含み得る。ポリメラーゼはさらに、変異なしのポリメラーゼと比較して、ポリメラーゼの識別を減少させる、Ｌ４０９、Ｙ４１０、Ｐ４１１、Ｒ４６１、Ｋ４６５、Ｑ４７２、Ｑ４８４、Ａ４８６、Ｒ４８８、Ｌ４９０、Ａ４９１、Ｎ４９２、Ｙ４９５、およびＹ４９７からなる群から選択される、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼにおいて対応する部位におけるアミノ酸での変異を含み得る。ポリメラーゼは、ウラシル検出の減少または非従来型のヌクレオチドまたはヌクレオシドを取り込む傾向の増大を含む、識別の減少を有しうる。ポリメラーゼは、Ｌ４０９Ｈ、Ｙ４１０Ｖ、Ｐ４１１Ｌ、Ｒ４６１ＡＩＮ、Ｋ４６５Ａ／Ｎ、Q４７２H、Ｑ４８４Ｒ／Ｋ、Ａ４８６Ｔ、Ｒ４８８Ａ、Ｌ４９０Ｙ、Ａ４９１Ｙ、Ｎ４９２Ａ、Ｙ４９５Ｓ、Ｙ４９７Ａ／Ｌ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される変異を有し得る。ポリメラーゼは、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ二重変異、およびＶ９３Ｒからなる群から選択され、さらに変異なしのポリメラーゼと比較して３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を減少させる少なくとも１つの変異を含む、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼにおける対応する部位におけるアミノ酸の変異を有し得る。ポリメラーゼは、変異なしのポリメラーゼと比較して、分断ポリメラーゼの安定性を増加させる、Ａ３１８、Ｖ６０４およびＡ６６２からなる群から選択される、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼにおける対応する部位におけるアミノ酸の変異を含み得る。変異は、分断ポリメラーゼの安定性を、非分断ポリメラーゼに匹敵するレベルに増大させる。変異は、Ａ３１８Ｔ、Ｖ６０４Ｌ、Ａ６６２Ｖ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。ポリメラーゼは、Ｑ４８４ＲまたはＱ４８４Kなどの、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼにおけるアミノ酸Ｑ４８４に対応するアミノ酸部位における変異を含む。ポリメラーゼは、３１８Ｔ、Ｖ６０４Ｌ、Ａ６６２Ｖ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｒ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ内の対応する部位におけるアミノ酸部位での変異を含み得る。ポリメラーゼは、さらにポリメラーゼに結合した二本鎖配列非特異的核酸結合領域を含み得る。配列非特異的核酸結合領域は、野生型Ｓｓｏ７と９０％未満の同一性を有するＳｓｏ７派生物であり得る。

要約すれば、本発明の分断ポリメラーゼのアミノ酸配列は、Ｌ４０９、Ｙ４１０、Ｐ４１１、Ｒ４６１、Ｋ４６５、Ｑ４７２、Ｑ４８４、Ａ４８６、Ｒ４８８、Ｌ４９０、Ａ４９１、Ｎ４９２、Ｙ４９５、およびＹ４９７からなる群から選択される、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ内の対応する部位における少なくとも１つのアミノ酸の変異を含むことができる。分断ポリメラーゼのアミノ酸配列はさらに、Ｌ４０９Ｈ、Ｙ４１０Ｖ、Ｐ４１１Ｌ、Ｒ４６１Ａ／Ｎ、Ｋ４６５Ａ／Ｎ、Q４７２H、Ｑ４８４Ｒ／Ｋ、Ａ４８６Ｔ、Ｒ４８８Ａ、Ｌ４９０Ｙ、Ａ４９１Ｙ、Ｎ４９２Ａ、Ｙ４９５Ｓ、Ｙ４９７Ａ／Ｌ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ内の対応する部位における変異を含み得る。別の態様において、本発明の分断ポリメラーゼのアミノ酸配列は、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ内の対応する部位における、変異がないポリメラーゼと比較して３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を減少させる、二重変異Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、単一変異Ｖ９３Ｒ、または両方を含む。一態様において、ポリメラーゼのアミノ酸配列は、さらにＡ３１８、Ｖ６０４、Ａ６６２、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、変異がないポリメラーゼと比較して分断ポリメラーゼの安定性を増加させる、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ内の対応する部位のアミノ酸における変異を含む。分断ポリメラーゼのアミノ酸配列は、さらにＤＮＡ結合タンパク質とのC末端融合を含み得る。

１つの例示的な実施例において、分断ポリメラーゼはＳＱ分断ポリメラーゼである。この変異体は、アミノ酸１‐４６７を包含する断片、および追加の変異Ｑ４８４Ｒを有するアミノ酸４６８‐７７５を包含する断片を作成するための、アミノ酸４６７の後ろのシームレス分断を含む。ＳＱは、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ変異を付加することで、さらにエキソヌクレアーゼ活性をなくす修飾をすることができる（図１３）。ＳＱは、変異体４Ｃ１１（１‐４６７ Ｖ９３Ｒ／Ａ３１８Ｔ）／（４６８‐７７５ Ｖ６０４Ｌ／Ａ６６２Ｖ‐Ｓｓ０７ｄ７ｍ）において見出される追加の変異を含まない。エキソ‐ＳＱ変異体の核酸配列も開示されている（配列番号９３）。エキソ‐ＳＱ変異体は、非従来型のヌクレオチド取り込みアッセイにおいて４Ｃ１１変異体と同様に作用することが見出された。なぜなら、エキソ‐ＳＱ変異体はシームレス分断、Ｑ４８４Ｒ、およびエキソ（−）（Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）変異のみを含み、一態様において、本発明は、非従来型のヌクレオチド取り込みを増大させるための方法として、この一連の変異を提供する。本明細書において、「エキソ‐」または「エキソ（−）」エキソヌクレアーゼ活性を有しない変異体を参照する。

別の一般的な態様において、本発明は、本発明の分断ポリメラーゼをコードする核酸を提供する。なぜなら分断ポリメラーゼは、完全ポリメラーゼ配列の一部または部位であるに過ぎず、本発明の核酸は、任意の１つの読み枠におけるポリメラーゼの一部または部位をコードするだけである。分断ポリメラーゼは好ましくは、ポリメラーゼのN末端ポリペプチド部位（断片Ｉ）およびC末端ポリペプチド部位（断片ＩＩ）の発現が翻訳的に結合したオペロンの、ポリシストロン系、好ましくはバイシストロン系から発現される。別の態様において分断ポリメラーゼは、同じ宿主細胞における、または２つの別々の宿主細胞における、２つまたはそれ以上に分離されたプラスミドに存在する、２つまたはそれ以上のコード配列にコードされる。

コード配列またはｍＲＮＡは、一般的なｍＲＮＡからのリボソームの遊離を除き、単一のプロモーターより１つ以上のポリペプチドを翻訳する遺伝子情報を含む場合、ポリシストロンであると考えられる。ポリシストロンのｍＲＮＡは、少なくとも２つのシストロンを構成する。本明細書において、シストロンは、単一のポリペプチド単位を特定するＤＮＡの区域である。ポリシストロンのｍＲＮＡから発現されるポリペプチドは、翻訳後複合体を形成するか、または形成し得ない。原核生物において見出されるｍＲＮＡのほとんどはポリシストロンである。

翻訳的に結合したとは、分断ポリメラーゼの複数の部位の翻訳が調様式で翻訳され、翻訳時におけるサブユニットの会合を可能にすることを意味すると理解される。言い換えれば、「翻訳的に結合した」は、リボソームは停止コドンと遭遇し、翻訳を終了するが、ＲＮＡから遊離せず、かつ探索し、発見し、およびＡＴＧ近傍より翻訳を再度開始することを意味すると理解される。それぞれのサブユニット由来のコード配列は、協調発現を可能にする同じ誘導性プロモーターの制御下であり得る。あるいは、断片は、単一の、ポリシストロンのｍＲＮＡをコードし得る。

本発明の一態様において、分断はシームレス分断であり、ここで野生型コード配列と比較して、分断部位において新規アミノ酸は導入または削除されない。例えば、４Ｃ１１変異体（図３Bに示す）における分断は、読み枠（ＡＡＡＡＴＧＡ）から１つの「Ａ」を削除している。偶然に、前のコドン（ＡＡＡ）に維持されている下流のＡＴＧの「Ａ」は、ポリメラーゼアミノ酸配列の保存を可能にする。フレームシフトにおける第二のコドンは、翻訳を終結するＴＧＡとして認識される。ＡＴＧ、ＴＧＡより１塩基上流からの翻訳の再開は、フレームシフトを訂正し、第二のタンパク質断片を産生し、第一の断片内の相補性は、ポリメラーゼのアミノ酸を保存する。この方法では、当業者に既知の方法を用いた注意深い設計であっても、ポリペプチド配列の変化がないように、シームレス分断は導入することができる。しかしながら、本発明は野生型核酸配列と異なる核酸を提供する。例えば、ヌクレオチド置換は核酸配列の変化によって作成することができるが、ポリペプチド配列は変化しない。

シームレスでない分断などの、他の設計も本発明において想定されている。この態様において、フレームシフトは終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）を産生するのに加えて、タンパク質コード領域をフレームの外にシフトすることで、追加のアミノ酸が導入される。終止コドンは第一の断片の翻訳を終結するが、リボソームが７（上流のまたは下流）コドン内の、または上流または下流から４６ヌクレオチド離れた再開コドンを見つけることができれば、翻訳は再度開始される（Ｋａｒａｍｙｓｈｅｖ、２００４、上記を参照）。さらに遠い開始コドンの位置も可能であるが、断片ＩＩの翻訳効率の低下を起因するようなのであまり好ましくない。再開コドンは通常ＡＴＧであるが、ＡＣＧ（Ｔｈｒ）、ＣＴＧ（Ｌｅｕ）およびＧＴＧ（Ｖａｌ）もできる。開始コドンは別のアミノ酸をコードするけれども、メチオニンはペプチド鎖の第一の位置に挿入される。もちろんこれらの設計において、本発明は、野生型核酸配列と比較して、付加または欠損を含む核酸配列を提供する。本発明の実施には重要ではないけれども、しばしばそれぞれの断片の類似のモル量を提供するだけでなく、時間的に近似した様式においてそれぞれの断片の産生をもたらすような様式で、分断ポリメラーゼを構成する断片を発現することが望ましい。いずれか１つの反応の作用機序に限定するものではないが、これらの考察は、機能的な最終産物を作成するためのさまざまな断片の適切な産生、およびフォールディングを可能にすると考えられる。

いくつかの設計は、メチオニン開始を導入するための、１つまたはそれ以上のアミノ酸交換を要求する。フレーム外のＡＴＧトリプレット以外で、間違った翻訳の再開を避けるために所望の再開メチオニンに変化させることは好ましい。アミノ酸配列を変化させる以外の、ヌクレオチド配列を変化させる方法は、当業者に知られている。コードフレーム内の非開始因子メチオニンを変異させて、アミノ酸配列中に保存的な変異を導入することも有益である。フレーム中にコードされているメチオニンを変化させる相対的な利点および欠点は、当業者の能力の範囲で十分である。

シームレスでない分断は、変異を含む分断ポリメラーゼをもたらす。したがって本発明は、１つまたはそれ以上のアミノ酸の変異を含む、変異体分断ポリメラーゼを提供する。これらの変異は、分断ポリメラーゼの機能的な区域を作成するために、コード配列に加えられ得る。変異は分断ポリメラーゼのより良い、および／または異なる活性を可能にするために加えられ、かつ分断部位とは異なる領域において見出され得る。変異は、分断ポリメラーゼの安定性を増加させるため、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を減少させるため、ポリメラーゼの識別を減少させるため、および／または分断ポリメラーゼの使用に対して有用であり得る任意の他の特性のために、ポリメラーゼの野生型配列に加えられ得る。変異は、どの特性が分断ポリメラーゼに所望されるかに依存して選択することができ、および変異の任意の組み合わせは、１つの分断ポリメラーゼにおいて見出される。

好ましい態様において、本発明の分断ポリメラーゼは、分断ポリメラーゼのそれぞれの部位またはシストロンの発現が、少なくとも１つの分断ポリメラーゼの他の部位の翻訳と翻訳的に結合する、ポリシストロンのオペロンにコードされる。一態様において、ポリシストロンのコード配列は、フレームシフト終止コドンの近位にある、少なくとも１つのリボソーム再開シグナルを含む。

別の態様において、本発明の分断ポリメラーゼは、同じ宿主細胞内、または２つの別々の宿主細胞内の、２つの別々のプラスミドに存在する、２つのコード配列にコードされる。２つのプラスミドが一の宿主細胞内に含まれている場合、同じ誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンまたはＩＰＴＧ誘導性）は、分断ポリメラーゼの断片の協調発現を促進するために用いることができる。しかしながら、２つの異なる誘導性プロモーターを使用することは有用であり得る。例えば、分断ポリメラーゼの１つの断片が、他の一方より不安定なため、したがって、強力なプロモーターが必要であり、より不安定な断片が産生する場合があり得る。分断ポリメラーゼの発現に対して依存する常時発現プロモーターの使用も、いくつかの場合で有用であり得る。

要約すれば、本発明は、分断ポリメラーゼの一部またはすべてをコードする核酸を提供する。一態様において、分断はフィンガードメイン内であり得る。一態様において、核酸は、非天然型ヌクレオチドの取り込みを改善する、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を減少する、５’‐３’エキソヌクレアーゼ活性を減少する、ウラシル検出活性を減少する、または非分断ポリメラーゼと比較して分断ポリメラーゼとして発現された場合、安定性が増す、少なくとも１つの変異をさらに含み得る。別の態様において、核酸は、Ｌ４０９、Ｙ４１０、Ｐ４１１、Ｒ４６１、Ｋ４６５、Q４７２、Ｑ４８４、Ａ４８６、Ｒ４８８、Ｌ４９０、Ａ４９１、Ｎ４９２、Ｙ４９５、Ｙ４９７、Ｄ１４１、Ｅ１４３、Ｖ９３、Ａ３１８、Ｖ６０４およびＡ６６２からなる群から選択されるＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼにおける対応する部位に、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む核酸から発現される分断ポリメラーゼのような、少なくとも１つの変異を含む。

さらなる一般的な態様において、本発明は、本発明の分断ポリメラーゼを作成する方法を提供する。
一般に、本方法は、少なくとも１つのプロモーターと作動的に連結する、少なくとも２つのポリメラーゼコード領域を提供するステップと、少なくとも１つの宿主細胞内または試験管内発現系内などの、領域が発現することができる系にコード領域を導入するステップと、および機能的な分断ポリメラーゼの形成を可能にする条件下で系を培養するステップと、を含む。つまり、複数の態様において、本方法は、ポリメラーゼの一部をコードする少なくとも２つのコード配列を、少なくとも１つの宿主細胞内に導入するステップと、ならびに、コード領域の翻訳および翻訳産物の生体内で機能的な分断ポリメラーゼに会合することを可能にする条件下で、宿主細胞を培養するステップと、を含む。随意に、会合した分断ポリメラーゼは、精製および／または活性に対する試験をすることができる。あるいは、本方法は、宿主細胞からの分断ポリメラーゼポリペプチドの精製後の、翻訳産物の機能的な分断ポリメラーゼへの会合を含み得る。この場合、会合は宿主細胞または試験管内の外で行われる。

好ましい態様において、本方法は、分断ポリメラーゼをコードするポリシストロンのコード領域配列を提供するステップと、コード領域を宿主細胞内に導入するステップと、および分断ポリメラーゼの産生を許容する条件下で細胞を培養するステップとを含む。随意に、分断ポリメラーゼは会合前または会合後に精製し得る。さらに随意に、本発明の方法によって産生される分断ポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性に対して、および／または非従来型のヌクレオチドの取り込みに対して、試験することができる。本発明のこの態様を考慮して、本発明が、分断ポリメラーゼをコードするヌクレオチドを含む組換え細胞、および非天然に起こった分断ポリメラーゼを含む組換え細胞を包含することは明らかである。

本方法は、コード領域がプロモーターと作動的に連結する、ポリメラーゼをコードするポリシストロンコード領域配列を含む核酸を宿主細胞内に導入するステップと、およびポリメラーゼの産生を許容する条件下で細胞を培養するステップと、を含み得る。宿主細胞は、大腸菌、またはＴｈｅｍｏｃｏｃｃｕｓまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属であり得る。一態様において、本方法は、ＦＩＰＳＢＬＸＸＬＢＸＸＲＸＸＢＫＸＺＭＫＸＪＸＤＰＢＥＫＸＢＬＤＹＲＱＺＡＩＫＢＬＡＮ（配列番号６）を含むモチーフによって特徴付けられるポリメラーゼの領域内に、分断を導入することで、ポリメラーゼの識別を減少させる方法であり、ここでＢはＭ、Ｖ、ＬまたはＩ；ＪはＳまたはＴ；ＵはＦまたはＹ；ＺはＱ、ＫまたはＲ；およびＸは任意のアミノ酸である。ポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ＪＤＦ‐３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ（Ｔｇｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢＤ（Ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、および古細菌ポリメラーゼＩからなる群から選択され得る。一態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ＪＤＦ‐３ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈｏ）ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ （Ｔｇｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢＤ（Ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、および古細菌ポリメラーゼＩなどの、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓからなる群から選択される。一態様において、ポリメラーゼは、分断Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼである。分断は、アミノ酸４４８および５００、または４６７および４６８間であり得る。

本方法は、Ｌ４０９、Ｙ４１０、Ｐ４１１、Ｒ４６１、Ｋ４６５、Q４７２、Ｑ４８４、Ａ４８６、Ｒ４８８、Ｌ４９０、Ａ４９１、Ｎ４９２、Ｙ４９５、およびＹ４９７からなる群から選択される、変異がないポリメラーゼと比較して、ポリメラーゼの識別を減少させる、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼにおいて対応する部位のアミノ酸における変異を有するポリメラーゼを含み得る。識別の減少は、ウラシル検出の減少、または非従来型のヌクレオチドを取り込む傾向の増加を含み得る。変異は、Ｌ４０９Ｈ、Ｙ４１０Ｖ、Ｐ４１１Ｌ、Ｒ４６１Ａ／Ｎ、Ｋ４６５Ａ／Ｎ、Q４７２H、Ｑ４８４Ｒ／K、Ａ４８６Ｔ、Ｒ４８８Ａ、Ｌ４９０Ｙ、Ａ４９１Ｙ、Ｎ４９２Ａ、Ｙ４９５Ｓ、およびＹ４９７Ａ／Ｌからなる群から選択され得る。別の態様において、ポリメラーゼは、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ二重変異、およびＶ９３Ｒからなる群から選択される、変異がないポリメラーゼと比較して、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を減少させる、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ内の対応する部位におけるアミノ酸の変異をさらに含み得る。別の態様において、ポリメラーゼは、Ａ３１８、Ｖ６０４およびＡ６６２からなる群から選択される、変異がないポリメラーゼと比較して、分断ポリメラーゼの安定性を増加させる、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ内の対応する部位におけるアミノ酸の変異を含み得る。一態様において、変異は分断ポリメラーゼの安定性を、非分断ポリメラーゼに匹敵するレベルに増加させる。また、変異はＡ３１８Ｔ、Ｖ６０４Ｌ、およびＡ６６２Ｖからなる群から選択され得る。好ましい態様において、ポリメラーゼはさらに、Ｑ４８４Ｒなどの、Ｐｈｉ ＤＮＡポリメラーゼ内のアミノ酸Ｑ４８４に対応する部位における、アミノ酸の変異を含む。本方法はさらに、Ａ３１８Ｔ、Ｖ６０４Ｌ、Ａ６６２Ｖ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、およびＶ９３Ｒからなる群から選択される、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ内の対応する部位におけるアミノ酸の、少なくとも１つの変異を有するポリメラーゼを含み得る。一態様において、本方法は、ポリメラーゼに結合した二本鎖配列非特異的核酸結合領域を有するポリメラーゼを含む。配列非特異的核酸結合領域は、野生型Ｓｓｏ７と９０％未満の同一性を有する、Ｓｓｏ７派生物であり得る。本発明の分断ポリメラーゼの作成方法は、追加の変異（分断を作成する任意の形成以外）、１つの変異、または１つ以上の変異を含まないことが想定される。分断ポリメラーゼは、ポリメラーゼはさらに非天然型ヌクレオチドの取り込みを改善するために、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を減少させるために、５’‐３’エキソヌクレアーゼ活性を減少させるために、ウラシル検出活性を減少させるために、非分断ポリメラーゼと比較して安定性を増加させるためにさらに修飾され、またはＤＮＡ結合領域を取り込むために修飾されるものであり得る。

さらなる態様において、本発明は、本発明の分断ポリメラーゼを用いた方法を提供する。本発明の分断ポリメラーゼは、核酸増幅、核酸配列解析、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）、核酸標識化、修飾されたプライマーまたは鋳型の合成、またはポリメラーゼを必要とする任意の反応に用いることができる。本発明は、二重標識化ヌクレオチドアナログなどの、非従来型のヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログに関連する方法に対して、特に適している。別の態様において、本発明は、別々に発現した２つのポリメラーゼ断片が互いに会合する場合、ポリメラーゼシグナルが産生される、相補性系の開発のために用いることができる。この場合、１つのポリメラーゼ断片は、他のポリメラーゼ断片に融合したライブラリーから選択するための餌（ｂａｉｔ）として使用することができる。

本方法は、（ａ）本発明のＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと、および（ｂ）ポリメラーゼがＤＮＡ合成を許容する、ポリメラーゼと核酸鋳型を接触させるステップと、を含み得る。別の態様において、本方法は、野生型ＤＮＡポリメラーゼでの合成と比較して、識別が減少したＤＮＡの合成方法であって、（ａ）本発明のＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと、および（ｂ）ポリメラーゼがＤＮＡ合成を許容する、ポリメラーゼと、核酸鋳型および非従来型のヌクレオチドを接触させるステップと、を含む。本方法は、（ａ）本発明のＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと、および（ｂ）古細菌ＤＮＡポリメラーゼが合成ＤＮＡ産物を産生するＤＮＡ合成を許容する、ＤＮＡポリメラーゼと核酸鋳型を接触させるステップと、および（ｃ）合成されたＤＮＡ産物をクローニングベクター内に挿入するステップと、を含む、ＤＮＡ合成産物のクローニング方法であり得る。別の態様において、本方法は、（ａ）本発明のＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと、（ｂ）少なくとも１つの鎖終結試薬、および１つまたはそれ以上のヌクレオチド三リン酸の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼによって配列解析されるＤＮＡ鋳型から、鎖終結断片を産生するステップと、および（ｃ）断片のサイズからＤＮＡの配列を決定するステップと、を含む。本方法は、（ａ）本発明のＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと、および（ｂ）ポリメラーゼがＤＮＡ合成を許容する、ポリメラーゼを核酸鋳型および二重標識化ヌクレオチドと接触させるステップと、を含む、野生型ＤＮＡポリメラーゼでの合成と比較して、二重標識化ヌクレオチドの取り込みが増加したＤＮＡ合成の方法であり得る。本方法は、（ａ）本発明のＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと、および（ｂ）ポリメラーゼがＤＮＡ合成を許容する、ポリメラーゼを、核酸鋳型および二重標識化ヌクレオチドと接触させるステップと、を含む、野生型ＤＮＡポリメラーゼでの定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）と比較して、二重標識化ヌクレオチドの取り込みが増大した、ＱＰＣＲの方法であり得る。いくつかの態様において、分断ポリメラーゼの安定性を改善するため、本方法はジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはβ‐メルカプトエタノールなどの還元剤の非存在下で行う。

別の態様において、本発明の方法は、非天然型ヌクレオチドの取り込みを増加させるのに使用される。これは、ポリメラーゼが非天然型ヌクレオチドに対して増加した活性を示すような方法で、ポリメラーゼを分断することで達成することができる。高いヌクレオチドアナログ取り込み率は、分断またはアミノ酸交換のみを用いた場合と比較して、分断とアミノ酸配列における他の変異とを結合させることによっても増加することができる。

本発明は、非天然型分断ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと、およびポリメラーゼがＤＮＡ合成を許容する、ポリメラーゼと核酸鋳型を接触させるステップと、を含む、ＤＮＡ合成の方法を提供する。一態様において、本方法のＤＮＡ合成は、非天然型ヌクレオチドを取り込む能力が増大した、または非分断ポリメラーゼと比較して、修飾されたプライマー鋳型を利用する能力が増大した、分断ポリメラーゼを含む方法である。本方法は、ＤＮＡ配列解析、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）、ＤＮＡ標識化、またはこれらの組み合わせなどの、ＤＮＡ合成の方法であり得る。本発明の方法の実施は、タンパク質および／または本発明の核酸を含む、多くの組成物を生じさせる。

さらなる一般的な態様において、本発明は少なくとも１つの本発明の分断ポリメラーゼを含む、組成物およびキットを提供する。組成物は、分断ポリメラーゼ、または本発明の核酸のうちの、少なくとも１つの分子を含む。組成物中の分断ポリメラーゼまたは核酸の量は幅広く変化させることができるが、分断ポリメラーゼに使用するなどの通常量は、本発明の少なくとも１つの方法またはアッセイを行うのに十分である。本方法またはアッセイは、核酸配列解析、増幅、ＱＰＣＲ、または核酸ポリメラーゼの使用に関連する、任意の他の方法に関連し得る。好ましい態様において、組成物は、本発明の分断ポリメラーゼ酵素をより安定化させるため、ＤＴＴまたはβ-メルカプトエタノールなどの還元剤を除く。

一般に、本発明によるキットは、本発明による方法を実行するための、いくつかのまたはすべての組成物、試薬、供給物などを含む。本発明による分断ポリメラーゼを含むキットにおいて、キットは一般的に、適切な条件下で行うための、分断ポリメラーゼに関連する少なくとも１つの反応を可能にする、十分量の分断ポリメラーゼを含む。一態様において、キットは、非天然型分断ポリメラーゼを含む、少なくとも１つの容器（例えば、バイアル、チューブ、アンプル）を含む。複数の態様において、キットはさらに、核酸ポリメラーゼ反応（例えば、増幅、配列解析）に使用される、少なくとも１つの他の物質を含む。一般的に、分断ポリメラーゼは１つまたはそれ以上の容器内に供給され、それぞれの容器は、分断ポリメラーゼに関連する少なくとも１つの反応を行うことを可能にする、十分量の分断ポリメラーゼを含む。キットは、本発明の方法に役立つ一般的な物質である、１つまたはそれ以上の他の物質も含み得る。これらは滅菌水、緩衝液、ｄＮＴＰ、対照ＤＮＡ、プライマー等を含み得る。

本発明はさらに、純粋に例示的な本発明を意図するものである、以下の実施例によって説明され、およびいかなる場合であっても本発明を限定するとみなされるものではない。

実施例１：部位方向性変異誘発およびアフィニティータグ精製による、分断Ｐｆｕ ポリメラーゼの調製

メーカーの使用説明書に従って、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ部位方向性変異誘発キットを用いて、分断は部位特異的な変異誘発によってＰｆｕ ４ ＤＮＡポリメラーゼ内に導入された。使用したプライマーを表１に示す。

クローン１０５、１０６および１０７を作成するために、上記のプライマーはC末端６Xヒスチジンアフィニティータグを有する、Ｐｆｕ Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ（エキソ‐）ＤＮＡポリメラーゼをコードするプラスミド鋳型と使用した。１０８、１０９および１１０クローンを、さらにＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ配列内にＱ４８４Ｒ変異を含む、類似のＤＮＡ鋳型を用いて作成した。クローン１０５内の分断部位は１残基上流に移動されたため、残基１‐４６７を包含する４Ｃ１１の断片Ｉと比較して、クローン１０５の断片Iは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ残基１‐４６６に対応する。クローン１０５において、以前は断片Ｉ（４Ｃ１１の）のリジン４６７は、断片ＩＩの第二の残基として見出される。新規の分断部位は再開に対するメチオニンの付加を除いて設計されないが、追加のメチオニンもクローン１０５内に存在する。そのため野生型Ｐｆｕアミノ酸配列を基準とすると、もたらされた分断Ｐｆｕ １０５変異体は、Ｉ（１‐４６６）／ＩＩ（Ｍ‐４６７‐７７５）として記録される。クローン１０６は、クローン１０５のように、同じ分断およびメチオニンの付加を使用するように設計されたが、さらに断片ＩＩにおいてＭ３Ｋ変異を有する。したがって、分断Ｐｆｕ１０６変異体は、野生型Ｐｆｕを基準とすると、I（１‐４６６）／ＩＩ（Ｋ４６７Ｍ‐Ｍ４６８Ｋ‐（４６９‐７７５）と記載することができる。クローン１０７の断片Iは、Ｐｆｕ Ｔｙｒ５４６と同じ位置で終了している。配列は非天然メチオニンによって再開され、かつ流のリボソーム結合ドメインによって増幅された。よって、分断Ｐｆｕ１０７は、１（１‐５４６）／ＩＩ（Ｍ‐５４７‐７７５）と記録されることができる。すべての３つの分断は個々に計画され、かつさらに４Ｃ１１（Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ配列の番号と比較して）におけるＦＣＤ取り込みを増幅する、Ｑ４８４Ｒ 変異と併用される。これらのクローンを、１０８（１０５＋Ｑ４８４Ｒ）、１０９（１０６＋Ｑ４８４Ｒ）および１１０（１０７＋Ｑ４８４Ｒ）と名づけた。図３は、野生型Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（パネルＡ）、クローン ４Ｃ１１（パネルＢ）、クローン１０５および１０８（パネルＣ）、クローン１０６および１０９（パネルＤ）およびクローン１０７および１１０（パネルＥ）と関連性のあるアミノ酸配列を示す。

反応は以下で構成された：
２．５μｌの１０Ｘ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ反応緩衝液
１８．５μｌ Ｈ_２Ｏ
１μｌ プラスミド鋳型
１μｌ ｄＮＴＰ混合物
１μｌ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ酵素ブレンド
１μｌ プラスミド鋳型

サイクルのパラメータを以下に示す：
１サイクル
９５℃ １分
３０サイクル
９５℃ １分
５０℃ １分
６５℃ １７分

親プラスミドを除くために、反応は制限酵素Ｄｐｎ Ｉで、３７℃で１時間処理した。２μｌの反応は、ＸＬ１０ Ｇｏｌｄコンピテントセル内に形質転換された後、ＬＢａｍｐ５０プレート上に播種して、３０℃で２０時間培養した。コロニーは採取後、ＬＢａｍｐ５０培地において３０℃で一晩の、５ｍｌ一晩培養の開始のために用いられた。プラスミドＤＮＡは、Ｓｔｒａｔａｐｒｅｐ（登録商標）プラスミドミニプレップキットを用いて、細胞から単離された。調整されたプラスミドは、所望の変異の取り込みを確定するために配列解析した。陽性物はBL２１‐コドン（＋）（登録商標）（ＤＥ３）‐ＲＩＰＬ コンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）細胞内に形質転換された後、ＬＢａｍｐ５０プレートに播種され、３０℃で１６時間（一晩）培養した。コロニーは採取された後、ＬＢａｍｐ５０培地内で、３０℃で一晩生育した。１６時間後、１ｍｌの培地は、５０ｍｌのＬＢａｍｐ５０での培養開始のために用いられた。細胞はＯＤ＝６００の値が０．８〜１．０に到達するまで３０℃で生育した後、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導した細胞は、遠心分離による回収、および−２０℃で凍結保存する前に、３０℃で２−４ 時間振とうした。

Ｈｉｓ‐タグ化分断Ｐｆｕポリメラーゼの精製は、Ｑｉａｇｅｎ社のＮｉ‐ＮＴＡスラリーを用いて行った後、ＱｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ Ｍａｎｕａｌ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ９および１２（Ｑｉａｇｅｎ社 ６／２００３）中の大腸菌細胞用の指示に従った。７５μｌの溶出ＤＮＡポリメラーゼを Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ６（ＢｉｏＲａｄ社）脱塩カラムに通した後、（最終）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐Ｃｌ ｐＨ８．２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ‐１００ｍＭ ＫＣｌからなる緩衝液中に出した。

実施例２：分断Ｐｆｕの精製

エキソ（−）Ｐｆｕ ４Ｃ１１（１‐４６７ Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ａ３１８Ｔ）／（４６８‐７７５Ｑ４８４Ｒ／Ｖ６０４Ｌ／Ａ６６２Ｖ‐Ｓｓ０７ｄ７ｍ）／ＤＮＡポリメラーゼは、ｐＥＴ１１ベクターより大腸菌中で発現した。誘導した細胞は集菌後、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中に再懸濁した。プロテアーゼ阻害剤、リゾチーム（〜０．２５ｍｇ／ｍｌ）、および２‐メルカプトエタノール（１０ｍＭ）を加えた。細胞を超音波破砕により破砕した。 抽出物は、熱不安定性タンパク質を変性させるために熱処理（８５℃、１５分）した。ＮａＣｌを１Mで加えた後、混入した核酸を沈殿させるために、０．１７５%のポリエチレンイミンを加えた。沈殿させた物質は、遠心分離で除去した。上清は、硫酸アンモニウムで６５%飽和させた。沈殿させたタンパク質は遠心分離で回収して、６５%飽和硫酸アンモニウムで一回洗浄した後、緩衝液Ａ‐１（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ‐１ ｍＭ ２-メルカプトエタノール、ｐＨ７．５）中に溶解させた。これを一晩緩衝液Ａ‐１で透析後、緩衝液Ａ‐１で平衡化したＱ‐セファロースＦＦに添加した。エキソ‐４Ｃ１１を含むフロースルー分画を回収後、緩衝液Ａ‐１で平衡化したＳＰ‐セファロースＨＰカラムに直接添加した。緩衝液Ａ‐１で洗浄後、エキソ‐Ｐｆｕ ４Ｃ１１は、５００ｍＭ ＫＣｌの３０カラム量勾配で、主要ピークとして溶出した。ピークは貯蔵後、緩衝液Ａ‐１で一晩、再度透析した。これを、緩衝液Ａ‐１で平衡化したヘパリンセファロースＨＰカラムに添加した。緩衝液Ａ‐１で洗浄後、エキソ‐４Ｃ１１は７５０ｍＭ ＫＣｌの２０カラム量勾配で、主要ピークとして再度溶出した。ピークは貯蔵、濃縮後、最終透析緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐Ｃｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ‐１ ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＫＣｌ、５０％グリセロール、ｐＨ ８．２）で透析した後、−２０℃で保存した。

実施例３：分離したＰｆｕ断片のクローニング、発現、および精製

ベクター調製
ｐＥＴ２１ｂベクターを、ＥｃｏＲＩで一回切断したのと類似の直鎖状分子を産生する逆性プライマーで、スーパコイルドプラスミドベクターを増幅することで調整した。

９個の５０μｌ反応は、以下のパラメータを用いて構築した：
５μｌ １０Ｘ Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ（登録商標）ＩＩ融合ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）
０．５μｌ １００ ｍＭ ｄＮＴＰs（各２５ｍＭ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）
１．２５μｌ 順方向プライマー（１００μＭ）
１．２５μｌ 逆方向プライマー(１００μM)
０．２μｌ プラスミドＤＮＡ（〜０．２ｎｇ）
１μｌ Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ（登録商標）ＩＩ 融合ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）
４０．８μｌ Ｈ_２Ｏ

サイクルのパラメータを以下に示す：
１サイクル
９５℃ １分
３０サイクル
９５℃ ４５秒
５０℃ ４５秒
７２℃ ２分
１サイクル
７２℃ ５分

増幅後、９個の複製は混合した後、５μｌのＤｐｎ Ｉ制限酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、４ｕ／μｌ）で、３７℃で１時間処理して、プラスミド鋳型を分解した。ＤＮＡは、製造者の推奨マニュアルに従って、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ ＰＣＲキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）で精製した。

１μｇの精製した直鎖状ベクターＤＮＡ（５０μｌの全体量中）は、５.５μｌのＸｉ‐Ｃｌｏｎｃ緩衝液、および２μｌのＸｉ‐Ｃｌｏｎｃ酵素（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ社）と混合後、室温で３０分反応させた。反応物は精製後、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐスピンカラム（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ社）で濃縮した後、２０℃に保存した。

挿入断片調製
２つのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ断片、断片Ｉ(Ｐｆｕ１‐４６７、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ａ３１８Ｔ)、および断片ＩＩ（Ｐｆｕ４６８‐７７５ Ｑ４８４Ｒ、Ｖ６０４Ｌ／Ａ６６２Ｖ）、はｐＥＴ２１ｂ内にクローニングして、別々に発現した。使用した順方向プライマーおよび逆方向プライマーを下記の表ＩＩに示す。

産物は、以下のプライマーおよび方法で４Ｃ１１プラスミドより増幅した。
５μｌ １０Ｘ ＰｆｕＵｌｔｒａｌ（登録商標）ＩＩ 融合ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）
０．５μｌ １００ｍＭ ｄＮＴＰｓ（それぞれ２５ｍＭ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）
２μｌ 順方向プライマー（５０ｎｇ／μｌ）
２μｌ 逆方向プライマー(５０ｎｇ／μｌ)
１μｌ プラスミドＤＮＡ（〜０．２ｎｇ）
１μｌ ＰｆｕＵｌｔｒａ（登録商標）ＩＩ 融合ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）
３８．５μｌ Ｈ_２Ｏ

２つの５０μｌ反応は、それぞれの断片に対して、以下の条件で増幅した：
１サイクル
９５℃ １分
３０ サイクル
９５℃ ４５ 秒
５０℃ ４５ 秒
７２℃ ３０ 秒
１サイクル
７２℃ ５分

増幅後、４単位の制限酵素Ｄｐｎ Ｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、４ｕ／μｌ）を、プラスミド鋳型を消化するために、それぞれのＰＣＲ増幅反応物に加えた。ＤＮＡは、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ ＰＣＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）で精製した。

２μｌの調整したｐＥＴ２１ｂベクターを、１０μｌの精製した挿入断片に加えた後、５０μｌのＸＬ１０‐Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｕｌｔｒａコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中に形質転換した。形質転換した細胞は、ＬＢアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）上に播種後、３０℃で１８時間培養した。コロニーは、ＰＣＲ増幅で挿入断片の存在について選別後、挿入断片はＤＮＡ配列解析で確認した。

Ｐｆｕ断片の精製は、実施例２に記載の手順を用いて行った。同じ方法を用いて精製する場合、未変化のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼと比較して、断片Ｉは異なる溶出特性を示し、等電点の違いと一致する。断片ＩＩは極端に不溶性であったため、いかなるカラムにも添加しなかった。

実施例４：終末点ＰＣＲによるヌクレオチドアナログ取り込みアッセイ

ヌクレオチドアナログのあるなしでＰＣＲを行うときの分断Ｐｆｕ酵素の能力を試験するため、単純なプラスミド鋳型を使用した（プラスミド２‐２０）。このプラスミドは、ベクター挿入部位のどちらかのプライマーにより、ｐＥＴベクターより増幅され出された、８００ｂｐ挿入断片を含む。

ＦＣＤ利用を試験するために設計されたＰＣＲ反応混合物は、以下からなる：
１．２μｌ １０ｘクローン化Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）
０．２４μｌ １０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ
０．２９μｌ Ｐｅｔｒｅｖプライマー（１０μＭ）
０．２９μｌ Ｐｅｔｆｏｒプライマー（１０μＭ）
０．５μｌ 希釈プラスミド２-２０
１．０μｌのポリメラーゼ
１．０μｌの６００μM（全体）ｄＣＴＰ/ＦＣＤ混合物（５０％ｄＣＴＰ、５０％ＦＣＤ）
７．４８μｌ Ｈ_２Ｏ

ＰＣＲ反応における使用の最適量を見つけるために、酵素は上記のＰＣＲにおいて、いくつかの希釈率で試験した。特定された最適値は、野生型エキソ‐Ｐｆｕおよび他の変異体との比較で使用した。

ＰＣＲ反応は、以下のパラメータで増幅した：
１サイクル
９５℃ １分
３０サイクル
９５℃ ４５秒
５８℃ ４５秒
７２℃ １分
１サイクル
７２℃ ５分

ＦＣＤがＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれた場合、ＦＡＭ-ｄＣＭＰは、ダブシル‐ピロリン酸（ＰＰ）の遊離と同時に、伸長鎖に加えられる。溶液中または均一なアッセイ中（例えば、ＱＰＣＲ）において、蛍光は、取り込まれたＦＡＭ-ｄＣＭＰ分子の数、または未消光ＦＡＭ部分の数と正比例して増加する。アナログの取り込みは、この方法により、いくつかの分断ポリメラーゼについて明らかになった。

アナログの取り込みは、終末点ＰＣＲと、続くゲル電気泳動および蛍光単位複製配列の検出を行うことで、評価した。全体のＰＣＲ反応混合物は１%アガロース、１ｘＴＢＥゲル（Ｗｉｄｅ Ｍｉｎｉ Ｒｅａｄｙアガロースゲル、１ｘＴＢＥ、１％、２０ウェル １５ｘ１０ ｃｍ、Ｂｉｏ‐Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で泳動し、およびＦＡＭ標識化は、紫外線光およびグリーンフィルターで検出した。適切なサイズの可視化バンドは、表ＩＩＩ中のアナログ取り込みにおいて、「あり」のスコアをもたらす。画像の記録後、ゲルは臭化エチジウムで染色して、すべてのＤＮＡ産物を可視化した。

分断ポリメラーゼが従来型ヌクレオチドの取り込みに対して機能的かどうかを特定するために、ＰＣＲ反応を、原則的に等量の４種すべてのｄＮＴＰsおよびヌクレオチドアナログなしの条件下で行った。ゲルの検出限界は、核酸バンドあたり約１ｎｇであった。適切なサイズの可視化バンドは、表ＶＩ中の従来型ヌクレオチド取り込みにおいて、「あり」のスコアをもたらす。

実施例５：分断キメラＪＤＦ‐３／Ｐｆｕポリメラーゼの調製

キメラポリメラーゼは、ＪＤＦ‐３ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼから構築された。分断は、Ｐｆｕ ＤＮＡ ポリメラーゼにおける４Ｃ１１の分断と相同的であった。断片ＩがＪＤＦ‐３ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子よりコードされる一方で、断片ＩＩはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子にコードされる。構築物は、第一の断片および第二の断片に対応する２つのＰＣＲ産物を作成するステップと、産物を精製するステップと、およびスプライス重複によって産物を融合するステップとで、設計された。断片Ｉは、図４（パネルＢ）に示す分断ＪＤＦ‐３断片Ｉと同じアミノ酸で終了し、および断片ＩＩはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（図３を参照）のM４６８より開始する。

ＪＤＦ‐３配列特異的なヌクレオチドに加えて、第一の産物に対する順方向プライマーは、ｐＥＴ２１ｂベクターへの組換えによる挿入を可能にする、追加の配列を５’末端に有する（表ＩＶ）。第一の断片に対する逆方向プライマーは、断片２の始めの配列と相補的な追加の配列を、５’末端に含む。

断片２に対する順方向プライマーは、断片１の末端配列に対応する追加の５’配列、ならびに断片２の始めをコードする同じ配列を含む。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ配列に加えて、断片２の逆方向プライマーは、ベクター中に相同的な組換えを可能にする、ｐＥＴ２１ｂベクターの６Ｘ Ｈｉｓの領域に相同的な配列も含む。

増幅反応は以下のように構築した：

断片Ｉ ＰＣＲ設定
１０μｌ ５Ｘ Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）
０．４μｌ １００ｍＭ ｄＮＴＰ混合物（それぞれ２５ｍＭ）
１．２μｌ ＪＤＦ‐３ ＸｉＦ プライマー １２５μ１M
１．２μｌ ＪＰｃｈｉｍＲ プライマー １２５μpM
０．５μｌ エキソ‐ＪＤＦ‐３ ＤＮＡポリメラーゼ プラスミドクローン（〜５０ｎｇ／μｌ）
１．０μｌ Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ 融合ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）
３５．７μｌ Ｈ_２Ｏ

断片２ ＰＣＲ設定
１０μｌ ５Ｘ Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ緩衝液(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社)
０．４μｌ １００ｍＭ ｄＮＴＰ混合物（それぞれ２５ｍＭ）
１．２μｌ ＪＰｃｈｉｍＦ プライマー １２５μｌM
１．２μｌ ＰｆｕｘｉＲ プライマー １２５μｌM
０．５μｌ エキソ‐Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ プラスミドクローン（５０ｎｇ／μｌ）
１．０μｌ Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ 融合ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）
３５．７μｌ Ｈ_２Ｏ

増幅条件：
１サイクル
９５℃ １分
３０サイクル
９５℃ ４５秒
５０℃ ４５ 秒
１サイクル
７２℃ １分

増幅後、Ｄｐｎ Ｉ制限酵素を、親プラスミドＤＮＡ鋳型を分解するために、反応物に加えた。産物は、メーカーの使用説明書に従って、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ ＰＣＲキットで精製した。

スプライス重複設定
５μｌ １０ｘ ｃＰｆｕ緩衝液
０．４μｌ １００ｍＭ ｄＮＴＰ（それぞれ２５ｍＭ）
５μｌ 精製断片I
５μｌ 精製断片２
１μｌ Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）
３３．６μｌ Ｈ_２Ｏ

増幅条件：
１サイクル
９５℃ １分
１５サイクル
９５℃ ４５秒
５０℃ ４５秒
７２℃ １分、５０秒

１μｌのスプライス重複反応物は、下記のように、反応中において鋳型として使用した：
５μｌ １０ｘ cＰｆｕ緩衝液
０．４μｌ １００ｍＭ ｄＮＴＰ（それぞれ２５ｍＭ）
１．２μｌ ＪｄＦ３ｘｉＦ プライマー １２５μｌM
１．２μｌ ＰｆｕｘｉＲ プライマー １２５μｌM
１μｌ 重複反応物
１μｌ Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）
４０．２μｌ Ｈ_２Ｏ

増幅条件：
１サイクル
９５℃ １分
３０サイクル
９５℃ ４５秒
５０℃ ４５秒
７２℃ ３分

ＰＣＲ産物はゲル精製した後、Ｘｉ‐Ｃｌｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｅｄクローニングキット（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ社）を使用するように調整されたｐＥＴ２１ベクター内に、メーカーの使用説明書（実施例３のベクター調製に記載）に従ってクローン化した。クローンはＸＬ１０‐Ｇｏｌｄ ｕｌｔｒａコンピテントセル(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社)内に形質転換された後、３０℃でおよそ２０時間培養した。コロニーは、正しいサイズの挿入断片に対するＰＣＲによって選別した。陽性コロニーは培養された後、ＤＮＡ精製を行った。プラスミド挿入断片は、分断領域、ならびに５’および３’挿入部位を確認するために、配列解析を行った。

確認したプラスミドは、メーカーの使用説明書（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にしたがって、ＢＬ２１‐コドン（＋）（ＤＥ３）‐ＲＩＬ（またはＲＩＬＰ）コンピテントセルに形質転換した後、他の項に記載のように発現および精製した。

実施例６：変異を含む他の分断ポリメラーゼ

４Ｃ１１ Ｐｆｕ分断ポリメラーゼ、およびＪＤＦ‐３ Ｚ２ポリメラーゼは、２つの実質的に異なる型の分断を提供する。４Ｃ１１分断は、アミノ酸が導入されていないか、または分断部位で除去されている「シームレス分断」であり、かつ分断近傍のアミノ酸の配列は、野生型Ｐｆｕと比較しても変化していない。ＪＤＦ‐３ Ｚ２分断ポリメラーゼは、断片Iの末端上に１０アミノ酸の挿入を含み、N末端断片にアミノ酸４６７‐４６９のトリペプチドの重複を含む。これは、分断部位における挿入に対する許容を明示する。

いくつかの追加のアミノ酸変異が、４Ｃ１１変異体との関連で、詳細に調べられた。アミノ酸変異は分断部位から遠く、アミノ酸４６７の後ろである。Ｑ４８４Ｒ変異は、変異がない４Ｃ１１変異体と比較して、二重標識化ヌクレオチドアナログの利用が増加した。Ｐｆｕ Ｌ４０９、Ｙ４１０、Ｐ４１１、Ｒ４６１、Ｋ４６５、Ｑ４７２、Ｑ４８４、Ａ４８６、Ｒ４８８、Ｌ４９０、Ａ４９１、Ｎ４９２、Ｙ４９５、およびＹ４９７に対応する位置などの、いくつかの他の点変異が、非従来型のヌクレオチドアナログの取り込みを増加させることが知られている。このような変異は、伸長反応における分断ポリメラーゼによる、非従来型のヌクレオチドの取り込みの増加に有用であり得る。３つの追加の変異、Ａ３１８Ｔ、Ｖ６０４Ｌ、およびＡ６６２Ｖは、分断ポリメラーゼの安定性に貢献しうる。その後４Ｃ１１に加えられる、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を減少させるＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、およびC末端断片のＣ末端への、Ｓｓｏ様ＤＮＡ結合領域の付加である、他の変異は、当初の４Ｃ１１変異体で観測された、二重標識化ヌクレオチドアナログの取り込みの増大を混乱させなかった。これは、分断部位から遠くの部位での変異は、さらに変異を含まない分断ポリメラーゼにおいて観測された二重標識化ヌクレオチドアナログの取り込みの増大を変化させないで、予想される活性を有することを明示する。

さらに分断ポリメラーゼは、表Vに示すいくつかのプライマーを用いて、ＰｆｕおよびＪＤＦ‐３において設計された。いくつかの分断ポリメラーゼが、発現、精製、およびポリメラーゼ活性について試験され、および非従来型のヌクレオチドの取り込みが改善された（表ＶＩ）。分断およびアミノ酸の変化の部位は、天然型ポリペプチドにおける部位で示される。例えば、Ｐｆｕ 分断ポリメラーゼ４Ｃ１１において見出される同じ分断は、ＪＤＦ‐３ポリメラーゼにおける同一部位でも作成された（変異体ＪＤＦ‐３ ２０１およびＪＤＦ‐３ ２０２（図４に示す））。

表ＶＩ中のすべての変異体は、エキソ（−）、ならびにアミノ酸Ｄ１４１ＡおよびＥ１４３Ａでの変異を含む。

従来型ヌクレオチドの取り込みに対する、またはアナログ取り込みに対する、標準のＰＣＲにおける活性に対する試験は、実施例４における方法を用いて行った。従来型ヌクレオチドの取り込みは、産物の予想されるサイズがアガロースゲルの臭化エチジウム染色で検出可能な場合に、「あり」とスコアされる（少なくとも約１ｎｇの核酸）。アナログの取り込みは、産物の予想されるサイズが、比較できるアガロースゲルの臭化エチジウム染色の前に、アナログの検出に対して適切な波長下で検出される場合、「あり」とスコアされる。検出される核酸の量は、反応において使用したアナログの割合、および産生された産物の量に依存する。ＱＰＣＲ法は、アナログの取り込みを検出するために用いることもできる。

天然の分断Ｍｔｈ古細菌ポリメラーゼと大まかに類似している、アミノ酸５４７における分断は、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの機能を阻害することが特徴的である。

図８は、いくつかの試験された他の変異体に対する、非従来型のヌクレオチドの取り込みアッセイを示す。それぞれの変異体に対して、酵素は、大腸菌系ＢＬ２１‐ＤＥ３-コドン（＋）（ＲＩＬ）におけるｐＥＴベクターから発現後、１L培養物より精製された。精製は以下のステップを含む：８５℃、１５分での細胞可溶化物の熱処理；核酸を除くための、熱処理可溶化物の０.１５% ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）および１Ｍ ＮａＣｌでの処理；遠心分離による清澄；その後、Q-セファロースＦＦに続くヘパリンセファロースＨＰカラムクロマトグラフィー。酵素は、Q-セファロースではフロースルー分画において見出され、およびヘパリンセファロースではＫＣｌ勾配で溶出される。精製された酵素は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで解析された。変異体ＪＤＦ‐３ Ｚ２は、主に２つのペプチド断片を含むと予想された。他の非分断変異体は、単一の断片を含んでいた。

ＰＣＲ活性は、ＪＤＦ‐３変異体について、９６２ｂｐ λＤＮＡ標的を用いて測定された。反応は、５ｎｇのλＤＮＡ、０．４μMのそれぞれのプライマー（順方向：５’‐ＡＴＣＡＧＡＡＡＣＧＡＡＣＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＴ、逆方向：５’‐ＧＣＣＴＣＧＣＡＴＡＴＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣ）、２００μMのそれぞれのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰ、および望ましい量のｄＣＴＰ、ＦＣＤ、および／またはＲＣＤ（５‐アミノアリル‐（５‐ＲＯＸ）‐２’‐デオキシシチジン‐５’‐トリホスホ‐Ｎ６‐（６-アミノへキシル）‐ダブシル）を含む、２５μｌ反応の１ｘ ＴａｑＰＣＲ反応緩衝液において行った。サイクル条件は：９３℃、１分；９３℃、１分、５８℃、５０秒、７２℃、１分を３０サイクル；その後７２℃、１０分、である。サンプル（それぞれの反応は５μｌまたは７５ｎｇ）は、１%アガロースゲルで泳動した。ゲルは、まず、（Ａ）取り込まれたフルオレセイン（ＦＣＤ）を可視化するために、臭化エチジウムの非存在下、グリーンフィルターを用いて、または（Ｂ）取り込まれたＲＯＸ（ＲＣＤ）を可視化するために、臭化エチジウムフィルターを用いて、撮影した。その後、ゲルは臭化エチジウムで染色した後、再度臭化エチジウムフィルターを用いて撮影した（Ｃ）。「ａ」で指定するサンプルは、d反応混合物に２５μM ＦＣＤ+２５μM ｄＣＴＰを含み、および「ｂ」で指定するサンプルは、５μM ＲＣＤ+４５μＭ ｄＣＴＰを含む。添加したサンプルは、エキソ（−）ＪＤＦ‐３（「１」で指定するサンプル）、エキソ（−）ＪＤＦ‐３、Ｌ４０８Ｈ、Ａ４９０Ｙ(「２」)、エキソ（−）ＪＤＦ‐３ Ｚ２(「３」)、エキソ（−）Ｐｆｕ ４Ｃ１１(「４」)、およびエキソ（−）Ｐｆｕ、Ｌ４０９Ｈ、Ａ４９１Ｙ(「５」)である。上記のように、エキソ（−）の表記は、追加の変異Ｄ１４１ＡおよびＥ１４３Ａがポリメラーゼ内に存在していることを意味する。

ＦＡＭ（ＦＡＭ‐ｄＣＴＰ‐ダブシル取り込み）取り込み（パネルＡ）、およびＲＯＸ取り込み（パネルＢ）の両方は、野生型ＪＤＦ‐３（レーン１）と比較して、ＪＤＦ‐３ Ｚ２（図８中の、それぞれのゲルのレーン３）、ＪＤＦ‐３ Ｌ４０８Ｈ、およびＡ４９０Ｙ（レーン２）、ならびにＰｆｕ Ｌ４０９Ｈ、およびＡ４９１Ｙ、（レーン５）変異体で増加した。

図９は、アミノ断片（パネルＡ）およびカルボキシル断片（パネルＢ）の両方を含む、Ｑ４８４Ｒ変異を有する４Ｃ１１ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。配列は、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ変異（エキソ（−））を有する。変化したアミノ酸は、後の配列の若干上方に示す。対応する核酸配列（配列番号：８０）は、以下の配列リストに示す。

図１０は、Ｐｆｕ二重変異体を用いたＰＣＲ増幅アッセイの結果を示す。これは、エキソ（−）変異および追加のＱ４８４Ｒ変異を有する、分断Ｐｆｕ変異体である（実施例２に記載のエキソ（−）Ｐｆｕ ４Ｃ１１ 変異体とは違う）。増幅は、γーリン酸においてダブシル標識化された、ｄＣＴＰアナログと共に行われた。使用したヌクレオチドプールは、２００μM ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰであった。ｄＣＴＰの全体プールは５０μMであり、およびこのプールにおけるダブシル-ｄＣＴＰの割合は、図に示すように０〜１００％で変化させた。二重変異体は、エキソ（−）ｃＰｆｕ、エキソヌクレアーゼ（−）の非分断ポリメラーゼ（変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む）と比較した。図１０から見られるように、二重変異体および非分断酵素の活性は、低濃度のｄＣＴＰアナログ（最大７５μＭ）において実質的に同じである。しかしながら、高濃度のｄＣＴＰ アナログ（７５及び９０μＭ）において、非分断ポリメラーゼは活性を失うが、二重変異体の立体配置は、特にγーリン酸において修飾されたダブシルｄＣＴＰの取り込みを改善する。任意の作用機序に限定せずに、これはおそらく、フィンガーが入ってくるヌクレオチドに対して折り重なる場合、ヌクレオチド結合ポケットが緩んだ結果である。

図１１は、ヌクレオチドアナログＦＣＤで標識化したｄＣＴＰでの、プラスミド鋳型のＰＣＲ増幅の結果を示す。２００μMのそれぞれのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰ、ならびに５０μMの全体ｄＣＴＰ（ｄＣＴＰ＋ＦＣＤ）プールを用いた終了点ＰＣＲ（１ｘ ｃＰｆｕ緩衝液；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社中のプラスミド鋳型）が、反応において使用された。ｄＣＴＰプール中のＦＣＤの割合は、図１１中に示すように、０％（１００％ｄＣＴＰ：０％ＦＣＤ）から１００％（０％ｄＣＴＰ：１００％ＦＣＤ）まで変化させた。エキソ（−）変異（Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａ）を有する４Ｃ１１変異体は、エキソ（−）変異（Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａ）を有する非分断Ｐｆｕ酵素と比較した。臭化エチジウム非存在化での、アガロースまたはアクリルアミドゲル上でのＰＣＲ産物の電気泳動は、結果として生じるＦＡＭ-標識化ＤＮＡ産物の、紫外線励起およびグリーンフィルター（パネルＡ）による可視化を可能にする。ゲルはその後臭化エチジウムで染色した後、すべてのＤＮＡ分子を反映するために、オレンジフィルターで可視化した（パネルＢ）。図に示すように、野生型（非分断）エキソ（−）Ｐｆｕ酵素はＦＣＤアナログを取り込むことができない一方で、分断Ｐｆｕ Ｑ４８４Ｒ二重変異体は、５０‐７５％のＦＣＤにおいて、ＦＡＭ-ｄＣＭＰの最適な取り込みを示す。この実験は、本発明の分断ポリメラーゼは、使用することができる類のヌクレオチドアナログに限定されないが、異なる型の修飾されたヌクレオチドに対して働くことを示す。

実施例７：それぞれの断片の別々の発現後の、４Ｃ１１分断ポリメラーゼのリフォールディング

この実施例において、４Ｃ１１分断ポリメラーゼのＮ末端およびＣ末端断片は、実施例３におけるように、別々に発現および精製される。しかしながらこの場合、断片は可溶化、およびリフォールディングもされる（図１２）。それぞれは２Ｌ培養液において、大腸菌系ＢＬ２１‐ＤＥ３‐コドン（＋）ＲＩＬ中の、ｐＥＴベクターから発現される。細胞破壊後の不溶沈殿物（すなわち封入体）は、０．１５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ Ｘ-１００を含む緩衝液、緩衝液のみ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５ １０ｍＭ ２‐メルカプトエタノール）の順に洗浄した。Ｎ末端およびＣ末端断片の沈殿物は、４Ｍまたは５Ｍ塩酸グアニジンに、それぞれ溶解した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥサンプルは、塩酸グアニジンを含む調製物より、ＴＣＡ沈殿で調製した。

部分精製した断片は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで可視化された（パネルＡ及びＢ）。結果は、N末端断片（パネルＡ）およびC末端断片（パネルＢ）の両方が発現したが、発現量は異なることを示す。N末端断片はおよそ５０％可溶で、かつ大量に作られた。しかしながら、C末端断片はそれほど作られず、かつそのままで発現した場合は完全に不溶であった。４Ｃ１１対照に対して染色した強度と比較した、断片のバンド強度に基づき、Ｎ末端断片の調製物は、C末端断片よりおよそ５倍以上濃縮されていると見積もられた。C末端断片の調製物はＮ末端断片よりも純度が低いのは、おそらく発現したＣ末端断片の、当初から低い収率に起因する。

リフォールディング実験について、それぞれのサンプルの不溶分画を精製した。リフォールディング実験は、２つの可溶化断片をおよそ１：１の量比（すなわち、C末端：N末端の５：１量）で単純に混合することで行った。対照は、それぞれの断片のみを含む反応である。リフォールディングは、塩酸グアニジンおよび２-メルカプトエタノールを含まない、２００当量の緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ‐１００ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール）に対して、混合物を単純に透析することによって達成される。透析緩衝液は、２４時間にわたって、２回交換した。塩酸グアニジン濃度を段階的に減らす（２Ｍ、１Ｍ、０Ｍ）多段階透析も試したが、ワンステップ法の結果とほぼ同一の結果を生じた。透析からサンプルを回収後、不溶物は遠心分離で除去した。サンプル中のタンパク質は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで定量した。

リフォールディングしたサンプルは、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで解析した（パネル１Ｃ）。添加したサンプルは、可溶化N末端断片（Ｎ‐ｔｅｒｍ）、可溶化C末端断片（Ｃ‐ｔｅｒｍ）、精製４Ｃ１１対照（４Ｃ１１）、N末端およびＣ末端断片を含む完全リフォールディング反応物（１）、N末端断片のみを含む対照リフォールディング反応物（２）、およびＣ末端断片のみを含む対照リフォールディング反応物(３)である。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイは、サンプル１では１．０ｍｇ／ｍｌ、サンプル２では１．１ｍｇ／ｍｌ、およびサンプル３では≦０．１ｍｇ／ｍｌの可溶タンパク質が回収されたことを示す。興味深いことに、N末端断片は、そのままで可溶状態に多くリフォールディングされる。これは、両方の断片を反応させたときよりも、わずかに多く可溶タンパク質が回収されたことを示し、おそらくリフォールディングの間に、大変不溶なＣ末端断片は、Ｎ末端 断片の部位と共沈殿したことを示す。

リフォールディングの成功を明らかにするために、リフォールディングタンパク質はＰＣＲアッセイでも解析された（パネルＤ）。添加したサンプルは、対照としてＰｆｕ ＵｌｔｒａＩＩ ポリメラーゼ （ＵｌｔｒａＩＩ）、Ｎ末端およびＣ末端断片を含むリフォールディング反応物（＃１）、Ｎ末端断片のみを含むリフォールディング反応物（＃２）、およびＣ末端断片のみを含むリフォールディング反応物（＃３）である。それぞれのリフォールディング反応物の表示量（および対照としてｎｇ量のＰｆｕ ＵｌｔｒａＩＩポリメラーゼ）は、１ｘ Ｐｆｕ ＵｌｔｒａＩＩ反応緩衝液、１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、１００ｎｇのそれぞれのプライマー（順方向：５’‐ＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＡＣ；逆方向：５’ＧＡＧＧＴＡＣＡＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＡＧＴＧ）、および２５０μMのそれぞれのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰからなる、５０μｌ反応でのＰＣＲ（０．９ｋｂヒトα‐１‐アンチトリプシン標的）でアッセイした。サイクル条件：９５℃、２分を１サイクル；９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１５秒、を３０サイクル、その後７２℃で１０分を１サイクル。１０μｌのそれぞれのＰＣＲ反応物は、１％アガロースゲル上で解析された。すべての反応物は２回泳動した。結果は、ＰＣＲアッセイはN末端およびC末端断片の両方が存在している場合にのみ成功することを明確に示す。ＰＣＲ増幅産物はサンプル＃１を含むレーンにのみ見られ、および産物のサイズに関連する産物のサイズは、対照レーンに見られる（ＵｌｔｒａＩＩ）。

リフォールディングしたサンプルは、完全性を明らかにするため、およびバイシストロニック発現ベクターより精製される酵素と同じように振舞うかどうかを明らかにするために、クロマトグラフィー精製（パネルＥ）にさらされた。Ｎ末端およびＣ末端断片の両方を用いて、上記のように得られたリフォールディングしたサンプルは、さらにＰｆｕポリメラーゼに対する標準の方法を用いて精製した。これは、Ｐｆｕポリメラーゼはカラムに結合しないで通過するＱ‐セファロースカラムクロマトグラフィー、続くＰｆｕポリメラーゼが結合するＳＰ、およびその後のＫＣｌ勾配での溶出を含む。精製したサンプルは、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで解析した。添加したサンプルは、最初にリフォールディングしたサンプル（Ｑ‐セファロースに添加したもの）、Q-セファロースフロースルー、ＳＰ‐セファロースフロースルー、およびＳＰ‐セファロース勾配分画（Ｃ１１、D１１、D８、D５、およびD２）である。結果は、リフォールディングしたポリメラーゼは、ＳＰ‐セファロースに成功裏に結合し、かつ勾配によって精製型で溶出されたことを示す。分断ポリメラーゼがバイシストロニック発現ベクターから発現される場合、ポリペプチド断片は封入体を形成しないため、したがって、可溶化およびリフォールディングの必要がない。したがって、本発明の方法の好ましい態様は、封入体からの可溶化、および断片の機能的な分断ポリメラーゼへのリフォールディングのステップを回避するための、ポリシストロンの発現系を用いた、本発明の分断ポリメラーゼの産生を含む。ポリシストロンの発現系からの分断ポリメラーゼの発現は、産生の容易さ、コストパフォーマンス、時間の短縮等の利点を有する。

さまざまな改変および変異は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、本発明の実施によって作成されることは、当業者にとって明らかである。本発明の他の態様は、明細書および本発明の実施を考慮することで、当業者にとって明らかである。明細書および実施例は、以下の請求項で示す、発明の正しい範囲および精神の、単なる例示であると考慮されることを目的としている。

例えばいくつかの場合において、フィンガー先端領域は、追加のアミノ酸を含み得る。このような場合、分断部位に対する共通配列は、ＧＸＸＸＸＢＬＸＸＬＢＸＸＲＸ‐ＢＫＸＸＭＸＸＪＸ_{（１‐２）}ＤＸＸＯＺＸＢＬＤＸＲＱＺＡＢＫＢＢＡＮＸＵＹＧＹＸＸＸに近似し、ここで、表記した文字は、Ｘ_{（１‐２）}がその領域内で１つのまたは２つのアミノ酸のいずれかであることを除き、本明細書に記載のものと同じ意味を持つ。

Claims (29)

1. 非天然型分断ポリメラーゼ。
2. 前記分断ポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１の分断ポリメラーゼ。
3. 前記分断ポリメラーゼがファミリーB ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１の分断ポリメラーゼ。
4. 前記ポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼである、請求項１の分断ポリメラーゼ。
5. ＪＤＦ‐３ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋ４６４Ａ変異の有無に関わらず、配列番号９１および配列番号９２を含み、またはＪＤＦ‐３ ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号９７および配列番号９８を含む、請求項４の分断ポリメラーゼ。
6. Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号９４および配列番号９５を含む、請求項４の分断ポリメラーゼ。
7. 分断が、前記ポリメラーゼの前記フィンガードメイン内に存在する、請求項１の分断ポリメラーゼ。
8. 前記分断ポリメラーゼは、前記非分断ポリメラーゼと比較して、非天然型ヌクレオチドの取り込み、または修飾されたプライマー鋳型の利用が増大する、請求項１の分断ポリメラーゼ。
9. 前記ポリメラーゼは、ｎは１５から８０の間、および１５から８０を含む任意のアミノ酸の数である、配列ＲＸＸＸＫ（Ｘ）ｎＱＸＸＸＸＫＸＸＸＮＳＸＹＧ（配列番号４）を有するモチーフを含み、および前記分断がこの配列内で起こる、請求項１の分断ポリメラーゼ。
10. 前記分断は、前記フィンガードメイン内に位置し、かつ前記Ｐｆｕポリメラーゼのアミノ酸４４８〜５００と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項１の分断ポリメラーゼ。
11. 前記分断ポリメラーゼは、前記分断ポリメラーゼによってポリマー化された核酸内への非天然型ヌクレオチドの取り込みを改善する、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性が減少する、５’‐３’エキソヌクレアーゼ活性が減少する、ウラシル検出活性が減少する、対応する非分断ポリメラーゼと比較して前記分断ポリメラーゼの安定性が増加する、またはＤＮＡ結合領域を取り込む、１つまたはそれ以上の変異を含む、請求項１の分断ポリメラーゼ。
12. 前記ポリメラーゼの前記アミノ酸配列が、前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ内の１つまたはそれ以上の、以下のアミノ酸に対応するアミノ酸における変異を含む、請求項１の分断ポリメラーゼ：Ｌ４０９、Ｙ４１０、Ｐ４１１、Ｒ４６１、Ｋ４６５、Ｑ４７２、Ｑ４８４、Ａ４８６、Ｒ４８８、Ｌ４９０、Ａ４９１、Ｎ４９２、Ｙ４９５、およびＹ４９７。
13. 前記アミノ酸変異が、１つまたはそれ以上の、以下のＰｆｕ変異に対応する、請求項１２の分断ポリメラーゼ：Ｌ４０９Ｈ、Ｙ４１０Ｖ、Ｐ４１１Ｌ、Ｒ４６１Ａ／Ｎ、Ｋ４６５、Ａ／Ｎ、Q４７２H、Ｑ４８４Ｒ/K、Ａ４８６Ｔ、Ｒ４８８Ａ、Ｌ４９０Ｙ、Ａ４９１Ｙ、Ｎ４９２Ａ、Ｙ４９５Ｓ、Ｙ４９７Ａ／Ｌ。
14. 前記ポリメラーゼの前記アミノ酸配列は、前記変異を含まない前記同じポリメラーゼと比較して、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性が減少し、またはウラシルへの感受性が減少する、対応するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ配列に関する、二重変異Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、単一変異Ｖ９３Ｒ、または両方を含む、請求項１の分断ポリメラーゼ。
15. 前記ポリメラーゼの前記アミノ酸配列は、前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ内の、１つまたはそれ以上の、アミノ酸Ａ３１８、Ｖ６０４、Ａ６６２に対応するアミノ酸における変異を含み、前記変異は、前記変異を含まない前記ポリメラーゼと比較して、前記分断ポリメラーゼの安定性を増大させる、請求項１の分断ポリメラーゼ。
16. さらにＤＮＡ結合タンパク質とのC末端融合を含む、請求項１の分断ポリメラーゼ。
17. 請求項１の分断ポリメラーゼ、および核酸重合反応に必要である少なくとも１つの他の物質を含む、組成物。
18. 非天然型分断ポリメラーゼまたはそれらの機能的な断片をコードする核酸。
19. 前記核酸は、前記ポリメラーゼの前記フィンガードメイン中に分断が存在するポリメラーゼをコードする、請求項１８の核酸。
20. 前記核酸は、前記コードされた分断ポリメラーゼと、それが由来する非分断野生型ポリメラーゼとの間で違いが見られる、非天然型ヌクレオチドの取り込みを改善する、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を減少する、５’‐３’エキソヌクレアーゼ活性を減少する、ウラシル検出活性を減少する、安定性を増大させる、または分断ポリメラーゼとして発現された場合、ＤＮＡ結合部位を取り込む、少なくとも１つの変異を含む、請求項１８の核酸。
21. 前記核酸はさらに少なくとも１つの変異を含み、分断ポリメラーゼは、Ｐｆｕ ＤＮＡ ポリメラーゼの以下のアミノ酸に対応する、少なくとも１つのアミノ酸における変異を含む前記核酸によってコードされる、請求項１８の核酸：Ｌ４０９、Ｙ４１０、Ｐ４１１、Ｒ４６１、Ｋ４６５、Q４７２、Ｑ４８４、Ａ４８６、Ｒ４８８、Ｌ４９０、Ａ４９１、Ｎ４９２、Ｙ４９５、Ｙ４９７、Ｄ１４１、Ｅ１４３、Ｖ９３、Ａ３１８、Ｖ６０４およびＡ６６２。
22. 配列番号９１をコードするコード領域、および配列番号９２をコードする別々のコード領域を含む、または配列番号９７をコードするコード領域、および配列番号９８をコードする別々のコード領域を含む、請求項１８の核酸。
23. 配列番号９４をコードするコード領域、および配列番号９５をコードする別々のコード領域を含む、請求項１８の核酸。
24. 請求項１８の核酸、および前記核酸の複製または増幅に必要な少なくとも１つの他の物質を含む、組成物。
25. 非天然型分断ＤＮＡポリメラーゼと核酸鋳型とを混合するステップと、
    ＤＮＡ合成を許容する条件を提供するステップと、
    を含む、ＤＮＡ合成の方法。
26. 前記非天然型分断ポリメラーゼは、前記同じ配列由来の非分断ポリメラーゼと比較して、非天然型ヌクレオチドを取り込む能力が増加した分断ポリメラーゼ、または修飾プライマー鋳型を利用する能力が増加した分断ポリメラーゼを含む、請求項２５の方法。
27. 前記ＤＮＡ合成の方法は、ＤＮＡ配列解析、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）、ＤＮＡ標識化、またはこれらの組み合わせの方法である、請求項２５の方法。
28. 前記非天然型分断ポリメラーゼは、Ｋ４６４Ａ変異の有無に関わらず配列番号９１および配列番号９２を、または配列番号９４および配列番号９５を、または配列番号９７および配列番号９８を含む、請求項２５の方法。
29. 非天然型分断ポリメラーゼを含むキット。

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