ES2747227T3 - Polimerasas modificadas para la incorporación mejorada de análogos de nucleótidos - Google Patents

Abstract

Una ADN polimerasa recombinante que comprende una secuencia aminoacídica que es al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, cuya ADN polimerasa recombinante comprende al menos una mutación por sustitución aminoacídica en una o más posiciones posicionalmente equivalentes a Lys476 y Thr590, en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N, en la que la mutación en la posición posicionalmente equivalente a Lys476 comprende una mutación por un aminoácido hidrófobo.

Description

DESCRIPCIÓN

Polimerasas modificadas para la incorporación mejorada de análogos de nucleótidos

Antecedentes

Todos los organismos cuentan con ADN polimerasas para replicar y mantener sus genomas. Permiten una replicación de alta fidelidad del ADN mediante la detección de complementariedad entre bases así como el reconocimiento de rasgos estructurales adicionales de la base. Sigue habiendo la necesidad de polimerasas modificadas con incorporación mejorada de análogos de nucleótidos, en particular nucleótidos que estén modificados en el hidroxilo del azúcar 3'.

El documento WO2014/142921 divulga polimerasas modificadas para la incorporación mejorada de análogos de nucleótidos, que reduce los efectos de retraso de fase en aplicaciones de secuenciación por síntesis.

El documento EP0822256 divulga una ADN polimerasa KOD mutante (144TV) con un 90,60 % de identidad con la SEQ ID NO: 10 y que exhibe T144V y G153A.

Hopfner Karl-Peter et al. “Crystal structure of a thermostable type B DNA polymerase from Thermococcus gorgonarius”, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 96, n.° 7, 30 de marzo de 1999, páginas 3600-3605 divulga una polimerasa de Thermococcus gorgonarius con un 91,80 % de identidad con la SEQ D NO:10 y que exhibe G153A.

Listado de secuencias

La presente solicitud se presenta junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias de proporciona como un fichero titulado IP1201.TXT, creado el 30 de septiembre de 2014, que es de 216 kB de tamaño.

Breve compendio

Se presentan en la presente memoria enzimas polimerasas para la incorporación mejorada de análogos de nucleótido, en particular nucleótidos que estén modificados en el hidroxilo del azúcar 3' de tal modo que el sustituyente sea de mayor tamaño que el grupo hidroxilo 3' de origen natural. Los presentes inventores han identificado sorprendentemente ciertas polimerasas alteradas que exhiben una incorporación mejorada de los análogos deseados y tienen una serie de otras ventajas asociadas.

En ciertas realizaciones la polimerasa alterada comprende una secuencia aminoacídica que es al menos un 80 %, 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, cuya ADN polimerasa recombinante comprende al menos una mutación por sustitución aminoacídica en una o más posiciones equivalentes posicionalmente a Lys476 y Thr590 en la secuencia aminoacídica de la ADN polimerasa 9°N, en la que la mutación en la posición posicionalmente equivalente a Lys476 comprende una mutación por un aminoácido hidrófobo. Se expone la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N de tipo silvestre en la SEQ ID NO: 10.

Se divulga también cuando una mutación por sustitución en la posición Thr144 comprende una mutación por un aminoácido no polar, por ejemplo, una mutación homóloga a Thr144Ala, Thr144Gly o Thr144Leu. Se divulga también cuando una mutación por sustitución en la posición Gly153 comprende una mutación por un aminoácido polar, por ejemplo, una mutación homóloga a Gly153Asp. La mutación por sustitución en la posición Lys476 comprende una mutación por un aminoácido hidrófobo, por ejemplo, una mutación homóloga a Lys476Trp. Se divulga también cuando una mutación por sustitución en posición Leu478 comprende una mutación por un aminoácido polar, por ejemplo, una mutación homóloga a Leu478Ser, Leu478Arg o Leu478Thr. En ciertas realizaciones, la mutación por sustitución en posición Thr590 comprende una mutación por un aminoácido no polar, por ejemplo, una mutación homóloga a Thr590Ile. Se divulga también cuando una mutación por sustitución en posición Ala639 comprende, por ejemplo, una mutación homóloga a Ala639Val o Ala639Phe. Se divulga también cuando una mutación por sustitución en posición Asp718 comprende una mutación por un aminoácido no cargado, por ejemplo, una mutación homóloga a Asp718Asn.

En algunas realizaciones, la polimerasa es una ADN polimerasa. Por ejemplo, la ADN polimerasa puede ser una ADN polimerasa de tipo de familia B. La polimerasa puede ser, por ejemplo, una ADN polimerasa arqueal de la familia B, ADN polimerasa a humana y ADN polimerasas de fago T4, RB69 y phi29. En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa arqueal de la familia B es de un género seleccionado del grupo consistente en Thermococcus, Pyrococcus y Methanococcus. Por ejemplo, la polimerasa puede seleccionarse del grupo consistente en polimerasas Vent, Deep Vent, 9°N y Pfu. En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa arqueal de la familia B es la polimerasa 9°N.

En algunas realizaciones, además de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender adicionalmente mutaciones por sustitución en posiciones equivalentes posicionalmente a Leu408 y/o Tyr409 y/o Pro410 en la secuencia aminoacídica de la ADN polimerasa 9°N. Por ejemplo, las mutaciones por sustitución pueden comprender mutaciones por sustitución homólogas de Leu408Ala y/o Tyr409Ala y/o Pro410Ile en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N.

En algunas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una actividad exonucleasa reducida en comparación con una polimerasa de tipo silvestre. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende mutaciones por sustitución en posiciones equivalentes posicionalmente a Asp141 y/o Glu143 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N.

En ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende adicionalmente mutaciones por sustitución en posiciones equivalentes posicionalmente a Ala485 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la polimerasa comprende una mutación por sustitución posicionalmente equivalente a Ala485Leu o Ala485 Val en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

Se divulga también cuando la polimerasa alterada comprende adicionalmente una mutación por sustitución por un aminoácido diferente en la posición funcionalmente equivalente a Cys223 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N. Por ejemplo, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Cys223Ser en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

Se divulga también cuando la al menos una mutación por sustitución comprende una mutación en una posición equivalente a Thr514, Lys477 y/o Ile521. Por ejemplo, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Thr514Ala, Thr514Ser, Lys477Met y/o Ile521Leu en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

Se divulga también cuando la polimerasa alterada puede comprender una mutación por sustitución adicional para retirar una metionina interna. Por ejemplo, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución por un aminoácido diferente en una posición funcionalmente equivalente a Met129 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N. Se divulga también cuando la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Met129Ala en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

Se presenta también en la presente memoria una polimerasa alterada que comprende una mutación por sustitución en el dominio semiconservado que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 1, en la que la mutación por sustitución comprende una mutación seleccionada de una sustitución en posición 5 por cualquier residuo distinto de Thr o Val. La mutación puede comprender una sustitución en posición 5 por Ala, Gly o Leu.

Se presenta también en la presente memoria una polimerasa alterada que comprende una mutación por sustitución en el dominio semiconservado que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 2, en la que la mutación por sustitución comprende una mutación seleccionada de una sustitución en posición 7 por cualquier residuo distinto de Gly, Ala o Lys. La mutación puede comprender una sustitución en posición 7 por Asp.

Se presenta también en la presente memoria una polimerasa alterada que comprende una mutación por sustitución en el dominio semiconservado que comprende la secuencia aminoacídica de cualquiera de las SEQ ID NO: 3-6, en la que la mutación por sustitución comprende una mutación seleccionada de una sustitución en posición 2 por cualquier residuo distinto de Lys, Arg, Tyr o Glu. La mutación puede comprender una sustitución en posición 2 por Trp.

Se presenta también en la presente memoria una polimerasa alterada que comprende una mutación por sustitución en el dominio semiconservado que comprende la secuencia aminoacídica de cualquiera de las SEQ ID NO: 3-6, en la que la mutación por sustitución comprende una mutación seleccionada de una sustitución en posición 4 por cualquier residuo distinto de Leu, Ile o Ala. La mutación puede comprender una sustitución en posición 4 por Ser, Arg o Thr.

Se presenta también en la presente memoria una polimerasa alterada que comprende una mutación por sustitución en el dominio semiconservado que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 7, en la que la mutación por sustitución comprende una mutación seleccionada de una sustitución en posición 6 por cualquier residuo distinto de Thr. La mutación puede comprender una sustitución en posición 6 por Ile o Gly.

Se presenta también en la presente memoria una polimerasa alterada que comprende una mutación por sustitución en el dominio semiconservado que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 8, en la que la mutación por sustitución comprende una mutación seleccionada de una sustitución en posición 6 por cualquier residuo distinto de Ala. La mutación puede comprender una sustitución en posición 6 por Val o Phe.

Se presenta también en la presente memoria una polimerasa alterada que comprende una mutación por sustitución en el dominio semiconservado que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 9, en la que la mutación por sustitución comprende una mutación seleccionada de una sustitución en posición 7 por cualquier residuo distinto de Asp o Glu. La mutación puede comprender una sustitución en posición 7 por Asn.

Además de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender adicionalmente mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Leu408 y/o Tyr409 y/o Pro410 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N. Por ejemplo, las mutaciones por sustitución pueden comprender mutaciones por sustitución homólogas de Leu408Ala y/o Tyr409Ala y/o Pro410Ie en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N.

La polimerasa alterada puede comprender actividad exonucleasa reducida en comparación con una polimerasa de tipo silvestre. Por ejemplo, la polimerasa alterada comprende mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Asp141 y/o Glu143 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N.

Se divulga también cuando la polimerasa alterada comprende adicionalmente mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Ala485 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N. Por ejemplo, la polimerasa puede comprender una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Ala485Leu o Ala485Val en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

Se divulga también cuando la polimerasa alterada comprende adicionalmente una mutación por sustitución por un aminoácido diferente en una posición funcionalmente equivalente a Cys233 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N. Por ejemplo, la polimerasa alterada puede comprender una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Cys223Ser en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

Se divulga también cuando la al menos una mutación por sustitución comprende una mutación en la posición equivalente a Thr514, Lys477 y/o Ile521. Por ejemplo, la polimerasa alterada puede comprender una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Thr514Ala, Thr514Ser, Lys477Met y/o Ile521Leu en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

Se divulga también cuando la polimerasa alterada puede comprender una mutación por sustitución adicional para retirar una metionina interna. Por ejemplo, la polimerasa alterada puede comprender una mutación por sustitución por un aminoácido diferente en una posición funcionalmente equivalente a Met129 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Met129Ala en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

Se presenta también en la presente memoria una polimerasa alterada que comprende la secuencia aminoacídica de una cualquiera de las SEQ ID NO: 11-12, 14-15, 17, 19-20, 22-23, 25-26, 28, 30 y 32-40.

Se presenta también en la presente memoria una molécula de ácido nucleico que codifica una polimerasa alterada como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores. Se presenta también en la presente memoria un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. Se presenta también en la presente memoria una célula hospedadora que comprende el vector descrito anteriormente.

Se presenta también en la presente memoria un método para incorporar nucleótidos modificados a ADN que comprende permitir interaccionar los siguientes componentes: (i) una polimerasa alterada según cualquiera de las realizaciones anteriores, (ii) un molde de ADN y (iii) una solución de nucleótidos. El molde de ADN puede comprender una matriz agrupada.

Se proporciona también en la presente memoria un kit para efectuar una reacción de incorporación de nucleótidos que comprende: una polimerasa como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores y una solución de nucleótidos. La solución de nucleótidos puede comprender nucleótidos marcados. Los nucleótidos pueden comprender nucleótidos sintéticos. Los nucleótidos pueden comprender nucleótidos modificados. Los nucleótidos modificados pueden modificarse en el hidroxilo del azúcar 3' de tal modo que el sustituyente sea de mayor tamaño que el grupo hidroxilo 3' de origen natural. Los nucleótidos modificados pueden comprender una molécula de nucleótido o nucleósido modificado que comprende una base de purina o pirimidina y un resto de azúcar ribosa o desoxirribosa que tiene un grupo de bloqueo de 3'-OH retirable enlazado covalentemente con la misma, de tal modo que el átomo de carbono 3' tenga enlazado un grupo de estructura

-O-Z

en la que Z es cualquiera de -C (R >O -R ”, -C (R >N (R ”)², -C (R >N (H )R ”, -C (R >S -R ” y -C (R >F,

en los que cada R" es o es parte de un grupo protector retirable;

cada R' es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heterociclo, acilo, ciano, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi o amido, o un marcaje detectable enlazado a través de un grupo ligador; o (R ^{' ) 2} representa un grupo alquilideno de fórmula =C(R ^{' ' ' ) 2} en la que cada R''' puede ser igual o diferente y se selecciona del grupo que comprende átomos de hidrógeno y halógeno y grupos alquilo; y

en la que la molécula puede hacerse reaccionar procurando un intermedio en que cada R" se intercambia por H o, cuando Z es -C(R')²-F, el F se intercambia por OH, SH o NH² , preferiblemente OH, cuyo intermedio se disocia en condiciones acuosas dando una molécula con un 3'OH libre;

con la condición de que cuando Z sea -C(R')²-S-R”, ambos grupos R' no sean H.

R' del nucleótido o nucleósido modificado puede ser un alquilo o alquilo sustituido. -Z del nucleótido o nucleósido modificado puede ser de fórmula -C(R')²-N³. Z puede ser un grupo azidometilo.

Los nucleótidos modificados pueden estar marcados fluorescentemente para permitir su detección. Los nucleótidos modificados pueden comprender un nucleótido o nucleósido que tiene una base enlazada con un marcaje detectable a través de un ligador escindible. El marcaje detectable puede comprender un marcaje fluorescente. El kit puede comprender además una o más moléculas de molde y/o cebadores de ADN.

Se exponen los detalles de una o más de las realizaciones en los dibujos acompañantes y la descripción siguiente. Otros rasgos, objetos y ventajas resultarán evidentes a partir de la descripción y dibujos y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un esquema que muestra el alineamiento de secuencias aminoacídicas de polimerasa de Thermococcus sp. 9°N-7 (9°N), mutante T514S/I521L de polimerasa 9°N (Pol957), Thermococcus gorgonarius (TGO), Thermococcus kodakaraensis (KOD1), Pyrococcus furiosus (Pfu), Methanococcus maripaludis (MMS2) y ADN polimerasa de fago RB69. La numeración mostrada representa la numeración de los residuos aminoacídicos en la polimerasa 9°N.

La Figura 2 es un esquema que muestra dos porciones destacadas del alineamiento mostrado en la Figura 1.

Descripción detallada

Se presentan en la presente memoria enzimas polimerasas para la incorporación mejorada de análogos de nucleótidos, en particular nucleótidos que están modificados en el hidroxilo de azúcar 3' de tal modo que el sustituyente sea de mayor tamaño que el grupo hidroxilo 3' de origen natural. Los presentes inventores han identificado sorprendentemente ciertas polimerasas alteradas que exhiben la incorporación mejorada de los análogos deseados y tienen una serie de otras ventajas asociadas, incluyendo tasa de error reducida, retraso de fase y adelantamiento de fase reducidos y métricas de calidad mejoradas en reacciones de secuenciación por síntesis.

Como se describe con más detalle a continuación en la presente memoria, los inventores han encontrado sorprendentemente que una o más mutaciones en la polimerasa dan como resultado profundos aumentos de la tasa de recambio y la reducción de la pirofosforólisis. Estas polimerasas alteradas tienen un rendimiento mejorado en la secuenciación de ADN por síntesis (SBS) y dan como resultado retraso de fase y/o adelantamiento de fase reducidos, y unas métricas de calidad mejoradas globalmente en reacciones de secuenciación por síntesis.

Retraso de fase y adelantamiento de fase son términos conocidos por los especialistas en la materia y se usan para describir la pérdida de sincronización en la lectura de las copias de secuencia de un agrupamiento. El retraso de fase y adelantamiento de fase causan que las intensidades extraídas de un ciclo específico consistan en la señal del ciclo actual así como ruido de ciclos precedentes y siguientes. Por tanto, como se usa en la presente memoria, el término “retraso de fase” hace referencia a un fenómeno en SBS que está causado por la incorporación incompleta de un nucleótido a alguna porción de hebras de ADN en agrupamientos por la polimerasa en un ciclo de secuenciación dado, y es por tanto una medida de la tasa a la que moléculas individuales en un agrupamiento pierden sincronización entre sí. El retraso de fase puede medirse durante la detección de la señal del agrupamiento en cada ciclo, y puede reseñarse como el porcentaje de señal detectable de un agrupamiento que está fuera de sincronización con la señal en el agrupamiento. Como ejemplo, un agrupamiento se detecta por una señal de fluoróforo “verde” durante el ciclo N. En el ciclo posterior (ciclo N+1), se detecta el 99,9 % de la señal del agrupamiento en el canal “rojo” y permanece un 0,1 % de la señal del ciclo anterior y se detecta en el canal “verde”. Este resultado indicaría que aparece retraso de fase, y puede reseñarse como un valor numérico, tal como un valor de retraso de fase de 0,1, indicando que un 0,1 % de las moléculas en un agrupamiento se quedan atrás en cada ciclo.

El término “adelantamiento de fase” como se usa en la presente memoria hace referencia a un fenómeno en SBS que está causado por la incorporación de nucleótidos sin terminadores 3' eficaces, causando que el evento de incorporación vaya 1 ciclo por delante. A medida que aumenta el número de ciclos, aumenta la fracción de secuencias por agrupamiento afectadas por retraso de fase, obstaculizando la identificación de la base correcta. El adelantamiento de fase puede detectarse mediante un instrumento de secuenciación y reseñarse como un valor numérico, tal como un valor de adelantamiento de fase de 0,1, indicando que un 0,1 % de las moléculas en el agrupamiento van por delante en cada ciclo.

La detección de retraso de fase y adelantamiento de fase pueden efectuarse y reseñarse según cualquier metodología adecuada como es conocida en la materia, por ejemplo, como se describe en el documento U.S. 2012/0020537, que se incorpora como referencia en su totalidad. Por ejemplo, como se describe en los ejemplos siguientes, el retraso de fase se detecta y reseña rutinariamente durante tandas de secuenciación de SBS en instrumentos de secuenciación tales como las plataformas de secuenciación HiSeq, Genome Analyzer, NextSeq o MiSeq de Illumina, Inc. (San Diego, CA) o cualquier otro instrumento adecuado conocido en la materia.

El retraso de fase puede causarse, por ejemplo, por una polimerasa que efectúa la reacción inversa de incorporación de nucleótidos, como es conocido que sucede en condiciones tendentes a la pirofosforólisis. Por consiguiente, el descubrimiento de polimerasas alteradas que disminuyen la incidencia de retraso de fase y/o adelantamiento de fase es sorprendente y proporciona una gran ventaja en aplicaciones de SBS. Por ejemplo, las polimerasas alteradas proporcionan un tiempo de ciclo de SBS más rápido, menores valores de retraso de fase y/o adelantamiento de fase y longitudes de lectura de secuenciación más largas. Se expone en la sección de ejemplos siguiente la caracterización del retraso de fase y adelantamiento de fase para polimerasas alteradas como se proporciona en la presente memoria.

La fidelidad con la que una colección secuenciada coincide con la secuencia genómica original puede variar dependiendo de la frecuencia de la mutación de base que ocurre en cualquier paso desde la extracción del ácido nucleico a su secuenciación en una plataforma de secuenciación. Esta frecuencia pone un límite superior a la probabilidad de que una base secuenciada sea correcta. En algunas realizaciones, la puntuación de calidad se presenta como un valor numérico. Por ejemplo, la puntuación de calidad puede citarse como QXX, donde XX es la puntuación, y significa que esa petición particular tiene una probabilidad de error de 10-XX/10 Por tanto, como ejemplo, Q30 es igual a una tasa de error de 1 en 1000, o 0,1 % y Q40 es igual a una tasa de error de 1 en 10.000 o 0,01 %. Dicho de otro modo, si ocurre una mutación una de cada mil veces, entonces la confianza (probabilidad) máxima de que cualquier base sea correcta es de 1 cada 103, concretamente un máximo de Q30.

En ciertas realizaciones, la sustitución por mutación comprende una mutación por un residuo que tiene una cadena lateral no polar. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares son bien conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo: alanina, cisteína, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina.

En ciertas realizaciones, la mutación por sustitución comprende una mutación por un residuo que tiene una cadena lateral polar. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales polares son bien conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo: arginina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, histidina, lisina, serina y treonina.

En ciertas realizaciones, la mutación por sustitución comprende una mutación por un residuo que tiene una cadena lateral hidrófoba. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófobas son bien conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano.

En ciertas realizaciones, la mutación por sustitución comprende una mutación por un residuo que tiene una cadena lateral no cargada. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales no cargadas son bien conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo: glicina, serina, cisteína, asparagina, glutamina, tirosina y treonina.

Se presenta también en la presente memoria una polimerasa alterada que comprende una mutación por sustitución en un dominio semiconservado de la polimerasa. Como se usa en la presente memoria, el término “dominio semiconservado” hace referencia a una porción de la polimerasa que está totalmente conservada, o al menos parcialmente conservada, entre diversas especies. Se ha descubierto sorprendentemente que la mutación de uno o más residuos en un dominio semiconservado afecta a la actividad polimerasa en presencia de nucleótidos bloqueados 3', dando como resultado un rendimiento profundamente mejorado de la secuenciación de ADN por síntesis y dando como resultado errores de retraso fase reducidos, como se describe en la sección de Ejemplos siguiente.

Se expone en las Figuras 1 y 2 un alineamiento que muestra la conservación entre diversas polimerasas en los dominios semiconservados. Las secuencias de polimerasa mostradas en las Figuras 1 y 2 se obtuvieron de la base de datos Genbank, números de acceso Q56366 (ADN polimerasa 9°N), NP_577941 (Pfu), YP_182414 (KOD1), NP_987500 (MMS2), AAP75958 (RB69) y P56689 (TGo).

Se divulga también cuando el dominio semiconservado comprende aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 1 expone residuos en el dominio semiconservado que están conservados entre diversas polimerasas, y corresponde a los residuos 140-149 de la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N, que se expone en la presente memoria como SEQ ID NO: 10. Por consiguiente, en algunas de las polimerasas alteradas presentadas en la presente memoria que comprenden una mutación por sustitución en un dominio semiconservado de la polimerasa, la mutación por sustitución comprende una mutación en posición 5 de la SEQ ID NO: 1 por cualquier residuo distinto de Thr o Val. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por un residuo no polar en posición 5 de la SEQ ID NO: 1. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por Ala, Gly o Leu en posición 5 de la SEQ ID NO: 1.

El dominio semiconservado puede comprender aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 2 expone residuos en el dominio semiconservado que están conservados entre diversas polimerasas, y corresponde a los residuos 147-157 de la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N, que se expone en la presente memoria como SEQ ID NO: 10. Por consiguiente, en algunas de las polimerasas alteradas presentadas en la presente memoria que comprenden una mutación por sustitución en un dominio semiconservado de la polimerasa, la mutación por sustitución comprende una mutación en posición 7 de la SEQ ID NO: 2 por cualquier residuo distinto de Gly, Ala o Lys. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por un residuo polar en posición 7 de la SEQ ID NO: 2. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por Asp en posición 7 de la SEQ ID NO: 2.

Se divulga también cuando el dominio semiconservado comprende aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3-6. Las SEQ ID NO: 3-6 exponen residuos en el dominio semiconservado que están conservados entre diversas polimerasas, y corresponde a los residuos 475-492 de la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N, que se expone en la presente memoria como SEQ ID NO: 10. Por consiguiente, en algunas de las polimerasas alteradas presentadas en la presente memoria que comprenden una mutación por sustitución en un dominio semiconservado de la polimerasa, la mutación por sustitución comprende una mutación en posición 2 de cualquiera de las SEQ ID NO: 3-6 por cualquier residuo distinto de Lys, Arg, Tyr o Glu. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por un residuo hidrófobo en posición 2 de cualquiera de las SEQ ID NO: 3-6. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por Trp en posición 2 de cualquiera de las SEQ ID NO: 3-6.

En algunas de las polimerasas alteradas presentadas en la presente memoria que comprenden una mutación por sustitución en un dominio semiconservado de la polimerasa, la mutación por sustitución comprende una mutación en posición 4 de cualquiera de las SEQ ID NO: 3-6 por cualquier residuo distinto de Leu, Ile o Ala. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por un residuo polar en posición 4 de cualquiera de las s Eq ID NO: 3-6. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por Ser, Arg o Thr en posición 4 de cualquiera de las SEQ ID NO: 3-6.

Se divulga también cuando el dominio semiconservado comprende aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 7. La SEQ ID NO: 7 expone residuos en el dominio semiconservado que están conservados entre diversas polimerasas, y corresponde a los residuos 585-598 de la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N, que se expone en la presente memoria como SEQ ID NO: 10. Por consiguiente, en algunas de las polimerasas alteradas presentadas en la presente memoria que comprenden una mutación por sustitución en un dominio semiconservado de la polimerasa, la mutación por sustitución comprende una mutación en posición 6 de la SEQ ID NO: 7 por cualquier residuo distinto de Thr. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por un residuo no polar en posición 6 de la SEQ ID NO: 7. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por Ile o Gly en posición 6 de la SEQ ID NO: 7.

Se divulga también cuando el dominio semiconservado comprende aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8. La SEQ ID NO: 8 expone residuos en el dominio semiconservado que están conservados entre diversas polimerasas, y corresponde a los residuos 634-646 de la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N, que expone en la presente memoria como SEQ ID NO: 10. Por consiguiente, en algunas de las polimerasas alteradas presentadas en la presente memoria que comprenden una mutación por sustitución en un dominio semiconservado de la polimerasa, la mutación por sustitución comprende una mutación en posición 6 de la SEQ ID NO: 8 por cualquier residuo distinto de Ala o Gln. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por Val o Phe en posición 6 de la SEQ ID NO: 8.

Se divulga también cuando el dominio semiconservado comprende aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 9. La SEQ ID NO: 9 expone residuos en el dominio semiconservado que están conservados entre diversas polimerasas, y corresponde a los residuos 712-722 de la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N, que se expone en la presente memoria como SEQ ID NO: 10. Por consiguiente, en algunas de las polimerasas alteradas presentadas en la presente memoria que comprenden una mutación por sustitución en un dominio semiconservado de la polimerasa, la mutación por sustitución comprende una mutación en posición 7 de la SEQ ID NO: 9 por cualquier residuo distinto de Asp, Glu o Gly. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por un residuo no cargado en posición 7 de la SEQ ID NO: 9. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por Asn en posición 7 de la s Eq ID NO: 9.

En algunas realizaciones, la polimerasa es una ADN polimerasa. En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa de tipo de familia B. La polimerasa puede ser, por ejemplo, una ADN polimerasa arqueal de familia B, ADN polimerasa a humana y polimerasas de fago. Puede usarse cualquier polimerasa de fago en las realizaciones presentadas en la presente memoria, incluyendo por ejemplo polimerasas de fago tales como ADN polimerasas de fago T4, RB69 y phi29.

Las ADN polimerasas arqueales de familia B son bien conocidas en la materia como se ejemplifica por la divulgación de la patente de EE. UU. n.° 8.283.149. En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa arqueal es de arqueas hipertermófilas, lo que significa que las polimerasas son a menudo termoestables. Por consiguiente, en una realización preferida adicional, la polimerasa se selecciona de polimerasa Vent, Deep Vent, 9°N y Pfu. Vent y Deep Vent son nombres comerciales usados por ADN polimerasas de la familia B aisladas de la arquea hipertermófila Thermococcus litoralis. La polimerasa 9°N se identificó también a partir de Thermococcus sp. La polimerasa Pfu se aisló de Pyrococcus furiosus.

En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa arqueal de familia B es de un género tal como, por ejemplo, aquellas del género Thermococcus, Pyrococcus y Methanococcus. Los miembros del género Thermococcus son bien conocidos en la materia e incluyen, pero sin limitación, Thermococcus 4557, Thermococcus barophilus, Thermococcus gammatolerans, Thermococcus onnurineus, Thermococcus sibiricus, Thermococcus kodakarensis, Thermococcus gorgonarius. Los miembros del género Pyrococcus son bien conocidos en la materia e incluyen, pero sin limitación, Pyrococcus NA2, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus yayanosii, Pyrococcus endeavori, Pyrococcus glycovorans y Pyrococcus woesei. Los miembros del género Methanococcus son bien conocidos en la materia e incluyen, pero sin limitación, M. aeolicus, M. maripaludis, M. vannielii, M. voltae, "M. thermolithotrophicus" y "M. jannaschii".

Por ejemplo, la polimerasa puede seleccionarse del grupo consistente en polimerasa Vent, Deep Vent, 9°N y Pfu. En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa arqueal de familia B es la polimerasa 9°N.

Se entiende por “funcionalmente equivalente” que la polimerasa de control, en el caso de estudios que usan una polimerasa enteramente diferente, contendrá la sustitución aminoacídica que se considera que aparece en la posición aminoacídica en la otra polimerasa que tiene el mismo papel funcional en la enzima. Como ejemplo, la mutación en posición 412 de tirosina a valina (Y412V) en la ADN polimerasa Vent sería funcionalmente equivalente a una sustitución en posición 409 de tirosina a valina (Y409V) en la polimerasa 9°N.

Generalmente, las mutaciones por sustitución funcionalmente equivalentes en dos o más polimerasas diferentes aparecen en posiciones aminoacídicas homólogas en las secuencias aminoacídicas de las polimerasas. Por ello, el uso en la presente memoria de la expresión “funcionalmente equivalente” engloba también mutaciones que son “posicionalmente equivalentes” u “homólogas” a una mutación dada, independientemente de si la función particular del aminoácido mutado es conocida. Los residuos aminoacídicos posicionalmente equivalentes u homólogos en las secuencias aminoacídicas de dos o más polimerasas diferentes se determinan basándose en el alineamiento de secuencias. Se expone en las Figuras 1 y 2 un ejemplo de alineamiento de secuencias para identificar residuos posicionalmente equivalentes y/o funcionalmente equivalentes. Por tanto, por ejemplo, como se muestra en la Figura 2, los residuos en el dominio semiconservado identificados como las posiciones 475-492 de la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N. Los residuos correspondientes en polimerasas TGO, KOD1, Pfu, MmS2 y RB69 se identifican en la Figura como verticalmente alineados y se consideran posicionalmente equivalentes, así como funcionalmente equivalentes, al correspondiente residuo en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N.

Las polimerasas alteradas descritas anteriormente en la presente memoria pueden comprender mutaciones por sustitución adicionales que son conocidas por potenciar uno o más aspectos de la actividad polimerasa en presencia de nucleótidos bloqueados 3' y/o en aplicaciones de secuenciación de ADN. Por ejemplo, en algunas realizaciones, además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender adicionalmente mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Leu408 y/o Tyr409 y/o Pro410 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N. Puede realizarse cualquiera de una variedad de mutaciones por sustitución en una o más posiciones en posiciones funcionalmente equivalentes a 408-410 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N que da como resultado una incorporación aumentada de nucleótidos bloqueados, como es conocido en la materia y ejemplificado por la divulgación de los documentos US 2006/0240439 y US 2006/0281109. Por ejemplo, las mutaciones por sustitución pueden comprender mutaciones por sustitución homólogas de Leu408Ala y/o Tyr409Ala y/o Pro410Ile en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N. En ciertas realizaciones, además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada comprende adicionalmente mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Ala485 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la polimerasa comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Ala485Leu o Ala485Val en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

En algunas realizaciones, además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender actividad exonucleasa reducida en comparación con una polimerasa de tipo silvestre. Puede realizarse cualquiera de una variedad de mutaciones por sustitución en una o más posiciones conocidas por dar como resultado una actividad exonucleasa reducida, como es conocido en la materia y ejemplificado por los materiales de los documentos US 2006/0240439 y US 2006/0281109. Por ejemplo, además de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender adicionalmente mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Asp141 y/o Glu143 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N.

Además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada comprende adicionalmente una mutación por sustitución por un aminoácido diferente en una posición funcionalmente equivalente a Cys223 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N, como es conocido en la materia y ejemplificado por los materiales incorporados del documento US 2006/0281109. Por ejemplo, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Cys223Ser en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

Además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender una o más mutaciones en las posiciones equivalentes a Thr514 y/o Ile521 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N, como es conocido en la materia y ejemplificado por la divulgación del documento PCT/US2013/031694. Por ejemplo, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Thr514Ala, Thr514Ser y/o Ile521Leu en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

Además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender una o más mutaciones en las posiciones equivalentes a Arg713 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N, como es conocido en la materia y ejemplificado por la divulgación de la patente de EE. UU. n.° 8.623.628. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Arg713Gly, Arg713Met o Arg713Ala en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

Además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender una o más mutaciones en las posiciones equivalentes a Arg743 y/o Lys705 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N, como es conocido en la materia y ejemplificado por la divulgación de la patente de EE. UU. n.° 8.623.628. Por ejemplo, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Arg743Ala y/o Lys705Ala en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

Además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender una o más mutaciones en las posiciones equivalentes a Lys477 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N, como es conocido en la materia y ejemplificado por la divulgación de la solicitud de EE. UU. n.° 62/018.470, presentada el 27 de junio de 2014 y titulada “POLIMERASAS MODIFICADAS PARA LA INCORPORACIÓN MEJORADA DE ANÁLOGOS DE NUCLEÓTIDOS”. Por ejemplo, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Lys477Met en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

Además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender una o más mutaciones por sustitución adicionales para retirar una metionina interna. Por ejemplo, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución por un aminoácido diferente en una posición funcionalmente equivalente a Met129 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N. La polimerasa alterada puede comprender una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Met129Ala en la secuencia aminoacídica de polimerasa 9°N.

Mutación de polimerasas

Se usan opcionalmente diversos tipos de mutagénesis en la presente divulgación, p. ej. para modificar las polimerasas para producir variantes, p.ej., de acuerdo con modelos de polimerasa y predicciones modélicas como se discuten anteriormente, o usando enfoques mutacionales aleatorios o semialeatorios. En general, puede usase cualquier procedimiento de mutagénesis disponible para elaborar mutantes de polimerasa. Tales procedimientos de mutagénesis incluyen opcionalmente la selección de ácidos nucleicos y polipéptidos mutantes para una o más actividades de interés (p. ej., pirofosforólisis reducida, recambio aumentado, p. ej., para un análogo de nucleótido dado). Los procedimientos que pueden usarse incluyen, pero sin limitación: mutagénesis dirigida a sitio, mutagénesis puntual aleatoria, recombinación homóloga in vitro o in vivo (transposición de ADN y PCR de superposición combinatoria), mutagénesis usando moldes que contienen uracilo, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, mutagénesis de ADN modificado con fosforotioato, mutagénesis que usa ADN dúplex con huecos, reparación de desapareamientos puntuales, mutagénesis que usa cepas hospedadoras deficientes en reparación, selección por restricción y purificación por restricción, mutagénesis de deleción, mutagénesis por síntesis génica total, PCR degenerada, reparación de rotura bicatenaria y muchas otras conocidas por especialistas en la materia. La polimerasa de partida para mutación puede ser cualquiera de las señaladas en la presente memoria, incluyendo mutantes de polimerasa disponibles tales como los identificados, p. ej., en los documentos US 2006/0240439 y US 2006/0281109.

Opcionalmente, la mutagénesis puede guiarse por la información conocida de una molécula de polimerasa de origen natural, o de una polimerasa conocida alterada o mutada (p. ej., usando una polimerasa mutante existente como se señala en las referencias anteriores), p. ej., secuencia, comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura cristalina y/o similares como se discute a anteriormente. Sin embargo, en otra clase de realizaciones, la modificación puede ser esencialmente aleatoria (p. ej., como en la transposición de ADN clásica o “familiar”, véase p. ej. Crameri et al. (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391: 288­ 291).

Se encuentra información adicional sobre formatos de mutación en: Sambrook et al., Molecular Cloning- A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplementado en 2011) ("Ausubel")) y PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990) ("Innis"). Las siguientes publicaciones y referencias citadas en ellas proporcionan detalles adicionales sobre formatos de mutación: Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455 (1993); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242: 240-245 (1988); Bordo y Argos (1991) Suggestions for "Safe" Residue Substitutions in Site-directed Mutagenesis 217:721-729; Botstein y Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229: 1193-1201 (1985); Carter et al., Improved oligonucleotide sitedirected mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Carter, Site directed mutagenesis, Biochem. J. 237: 1-7 (1986); Carter, Improved oligonucleotide directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57: 369-374 (1996); Eghtedarzadeh y Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Hayes (2002) Combining Computational and Experimental Screening for rapid Optimization of Protein Properties PNAS 99(25) 15926-15931; Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlín)) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441­ 9456 (1984); Kramer y Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154: 350-367 (1987); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38: 879-887 (1984); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Lorimer y Pastan Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995); Mandecki, Oligonucleotide-directed doublestrand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. 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Genet. 19: 423-462 (1985); Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749­ 8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34: 315-323 (1985); Zoller y Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M 13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500 (1982); Zoller y Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNAfragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Zoller y Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Clackson et al. (1991) "Making antibody fragments using phage display libraries" Nature 352: 624-628; Gibbs et al. (2001) "Degenerate oligonucleotide gene shuffling (DOGS): a method for enhancing the frequency of recombination with family shuffling" Gene 271: 13-20 y Hiraga and Arnold (2003) "General method for sequence-independent site-directed chimeragenesis: J. Mol. Biol. 330: 287-296. Pueden encontrarse detalles adicionales de muchos de los métodos anteriores en Methods in Enzymology volumen 154, que describe también controles útiles para resolución de problemas con diversos métodos de mutagénesis.

Elaboración y aislamiento de polimerasas recombinantes

Generalmente, los ácidos nucleicos que codifican una polimerasa como se presenta en la presente memoria pueden elaborarse por clonación, recombinación, síntesis in vitro, amplificación in vitro y/u otros métodos disponibles. Puede usarse una variedad de métodos recombinantes para expresar un vector de expresión que codifica una polimerasa como se presenta en la presente memoria. Los métodos de elaboración de ácidos nucleicos recombinantes, expresión y aislamiento de productos expresados son bien conocidos y se describen en la materia. Se describen en la presente memoria una serie de mutaciones ejemplares y combinaciones de mutaciones, así como estrategias para el diseño de mutaciones deseables. Se encuentran métodos para la elaboración y selección de mutaciones en el sitio activo de polimerasas, incluyendo para modificar los rasgos estéricos en o cerca del sitio activo para permitir un acceso mejorado por análogos de nucleótido anteriormente en la presente memoria y, p. ej., en los documentos WO 2007/076057 y PCT/US2007/022459.

Las referencias adicionales útiles para métodos de mutación, manipulación recombinante y de ácido nucleico in vitro (incluyendo clonación, expresión, PCR y similares) incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Kaufman et al. (2003) Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine 2a edición Ceske (ed) CRC Press (Kaufman) y The Nucleic Acid Protocols Handbook Ralph Rapley (ed) (2000) Cold Spring Harbor, Humana Press Inc (Rapley); Chen et al. (ed) PCR Cloning Protocols, 2a edición (Methods in Molecular Biology, volumen 192) Humana Press y en Viljoen et al. (2005) Molecular Diagnostic PCR Handbook Springer, ISBN 1402034032.

Además, están comercialmente disponibles una multitud de kits para la purificación de plásmidos u otros ácidos nucleicos relevantes de células (véanse, p. ej., EasyPrep™, FlexiPrep™ ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean™ de Stratagene y QlAprep™ de Qiagen). Cualquier ácido nucleico aislado y/o purificado puede manipularse adicionalmente para producir otros ácidos nucleicos, usarse para transfectar células, incorporarse a vectores relacionados para infectar organismos para expresión y/o similares. Los vectores de clonación típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación de transcripción y traducción y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico diana particular. Los vectores comprenden opcionalmente módulos de expresión genéricos que contienen al menos una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten la replicación del módulo en eucariotas o procariotas o ambos (p. ej., vectores lanzadera) y marcadores de selección para sistemas tanto procarióticos como eucarióticos. Los vectores son adecuados para replicación e integración en procariotas, eucariotas o ambos.

Otras referencias útiles, p. ej. para aislamiento y cultivo celular (p. ej., para aislamiento posterior de ácido nucleico) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3a edición Wiley-Liss, Nueva York y las referencias citadas en el mismo; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, N.Y.; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg Nueva York) y Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) Cr C Press, Boca Ratón, Fla.

Los ácidos nucleicos que codifican las polimerasas recombinantes divulgadas en la presente memoria son también un rasgo de realizaciones presentadas en la presente memoria. Un aminoácido particular puede estar codificado por múltiples codones, y ciertos sistemas de traducción (p. ej., células procarióticas o eucarióticas) exhiben a menudo sesgo de codón, p. ej., diferentes organismos prefieren a menudo uno de los varios codones sinónimos que codifican el mismo aminoácido. Como tales, los ácidos nucleicos presentados en la presente memoria están opcionalmente “optimizados de codón”, lo que significa que los ácidos nucleicos se sintetizan para incluir codones que son preferidos por el sistema de traducción particular que se está empleando para expresar la polimerasa. Por ejemplo, cuando es deseable expresar la polimerasa en una célula bacteriana (o incluso una cepa de bacterias particular), el ácido nucleico puede sintetizarse para incluir codones encontrados lo más frecuentemente en el genoma de esa célula bacteriana, para una expresión eficaz de la polimerasa. Puede emplearse una estrategia similar cuando es deseable expresar la polimerasa en una célula eucariótica, p. ej. el ácido nucleico puede incluir codones preferidos por esa célula eucariótica.

Son conocidos una variedad de métodos de aislamiento y detección de proteínas y pueden usarse para aislar polimerasas, p. ej. a partir de cultivos recombinantes de células que expresan las polimerasas recombinantes presentadas en la presente memoria. Son bien conocidos en la materia una variedad de métodos de aislamiento y detección de proteínas incluyendo, p. ej., aquellos expuestos en R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990); Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2a edición Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris y Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris y Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3a edición Springer Verlag, NY; Janson y Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, 2a edición Wiley-VCH, Ny y Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; y las referencias citadas en los mismos. Pueden encontrarse detalles adicionales respecto a los métodos de purificación y detección de proteínas en Satinder Ahuja ed., Handbook of Bioseparations, Academic Press (2000).

Métodos de uso

Las polimerasas alteradas presentadas en la presente memoria pueden usarse en un procedimiento de secuenciación tal como una técnica de secuenciación por síntesis (SBS). Brevemente, la SBS puede iniciarse poniendo en contacto los ácidos nucleicos diana con uno o más nucleótidos marcados, ADN polimerasa, etc. Aquellos rasgos en que se extiende un cebador usando el ácido nucleico diana como molde incorporarán un nucleótido marcado que puede detectarse. Opcionalmente, los nucleótidos marcados pueden incluir adicionalmente una propiedad de terminación reversible que termina la extensión de cebador adicional una vez se ha añadido un nucleótido a un cebador. Por ejemplo, puede añadirse un análogo de nucleótido que tiene un resto terminador reversible a un cebador de tal modo que la posterior extensión no pueda ocurrir hasta suministrar un agente desbloqueante para retirar el resto. Por tanto, para realizaciones que usan terminación reversible, puede suministrarse un agente de desbloqueo a la celda de flujo (antes o después de ocurrir la detección). Pueden llevarse a cabo lavados entre las diversas etapas de suministro. El ciclo puede repetirse n veces para extender el cebador en n nucleótidos, detectando así una secuencia de longitud n. Se describen procedimientos de SBS ejemplares, sistemas de fluidos y plataformas de detección que pueden adaptarse fácilmente para uso con una matriz producida por los métodos de la presente divulgación, por ejemplo, en Bentley et al., Nature 456: 53-59 (2008), los documentos WO 04/018497; WO 91/06678; WO 07/123744; patentes de EE. UU. n.° 7.057.026, 7.329.492, 7.211.414, 7.315.019 o 7.405.281 y la pub. de sol. de pat. de EE. UU. n.° 2008/0108082 A1.

Pueden usarse otros procedimientos de secuenciación que usan reacciones cíclicas, tales como pirosecuenciación. La pirosecuenciación detecta la liberación de pirofosfato inorgánico (PPi) a medida que se incorporan nucleótidos particulares a una hebra de ácido nucleico naciente (Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242 (1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al. Science 281 (5375), 363 (1998); patentes de EE. Uu . n.° 6.210.891, 6.258.568 y 6.274.320). En pirosecuenciación, puede detectarse el PPi liberado al convertirse en trifosfato de adenosina (ATP) por ATP sulfurilasa, y el ATP resultante puede detectarse por fotones producidos por luciferasa. Por tanto, la reacción de secuenciación puede monitorizarse mediante un sistema de detección de luminiscencia. Las fuentes de radiación de excitación usadas para sistemas basados en fluorescencia no son necesarias para los procedimientos de pirosecuenciación. Se describen sistemas de fluidos, detectores y procedimientos útiles que pueden usarse para aplicación de pirosecuenciación a matrices de la presente divulgación, por ejemplo, en la sol. de pat. WIPO n.° de serie PCT/US11/57111, pub. de sol. de pat. de EE. UU. n.° 2005/0191698 A1, patente de EE.UU. n.° 7.595.883 y patente de EE. UU. n.° 7.244.559.

Algunas realizaciones pueden utilizar métodos que implican la monitorización instantánea de la actividad ADN polimerasa. Por ejemplo, pueden detectarse incorporaciones de nucleótidos mediante interacciones de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre una polimerasa portadora de fluoróforo y nucleótidos marcados con Y-fosfato, o con guías de onda de modo cero. Se describen técnicas y reactivos para secuenciación basada en FRET, por ejemplo, en Levene et al. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist et al. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008) y Korlach et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008).

Algunas realizaciones de SBS incluyen la detección de un protón liberado tras la incorporación de un nucleótido a un producto de extensión. Por ejemplo, la secuenciación basada en la detección de protones liberados puede usar un detector eléctrico y técnicas asociadas que están comercialmente disponibles en Ion Torrent (Guilford, CT, una filial de Life Technologies) o métodos y sistemas de secuenciación descritos en las pub. de sol. de pat. de EE. UU. n.° 2009/0026082 A1, 2009/0127589 A1, 2010/0137143 A1 o 2010/0282617 A1.

Por consiguiente, se presentan en la presente memoria métodos para incorporar análogos de nucleótidos a ADN que comprenden permitir interaccionar los siguientes componentes: (i) una polimerasa alterada según cualquiera de las realizaciones anteriores; (ii) un molde de ADN y (iii) una solución de nucleótidos. En ciertas realizaciones, el molde de ADN comprende una matriz agrupada. En ciertas realizaciones, los nucleótidos se modifican en el hidroxilo de azúcar 3' e incluyen modificaciones en el hidroxilo de azúcar 3' de tal modo que el sustituyente sea de mayor tamaño que el grupo hidroxilo 3' de origen natural.

Comparación, identidad y homología de secuencia

Los términos “idéntico” o “porcentaje de identidad”, en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipéptido, hacen referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos aminoacídicos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima, medida usando uno de los algoritmos de comparación de secuencia descritos a continuación (u otros algoritmos disponibles para especialistas en la materia) o por inspección visual.

La frase “sustancialmente idéntico”, en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos (p. ej., ADN que codifican una polimerasa, o la secuencia aminoacídica de una polimerasa) hace referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90­ 95 %, aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99 % o más identidad de residuos nucleotídicos o aminoacídicos, cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima, medida usando un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual. Tales secuencias “sustancialmente idénticas” se considera típicamente que son “homólogas”, sin referencia a un ancestro real. Preferiblemente, la “identidad sustancial” existe en una región de la secuencia que es de al menos 50 residuos de longitud, más preferiblemente en una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y lo más preferiblemente las secuencias son sustancialmente idénticas en al menos aproximadamente 150 residuos, o en toda la longitud de las dos secuencias para comparar.

Las proteínas y/o secuencias de proteína son “homólogas” cuando derivan, natural o artificialmente, de una proteína o secuencia de proteína ancestral común. De forma similar, los ácidos nucleicos y/o secuencias de ácidos nucleicos son homólogos cuando derivan, natural o artificialmente, de un ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico ancestral común. La homología se infiere generalmente de la similitud de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o proteínas (o secuencias de los mismos). El porcentaje preciso de similitud entre secuencias que es útil para establecer homología varía con el ácido nucleico y la proteína en cuestión, pero se usa rutinariamente tan poco como un 25 % de similitud de secuencia en 50, 100, 150 o más residuos para establecer la homología. Pueden usarse también niveles mayores de similitud de secuencia, p. ej. 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % o más, para establecer la homología. Se describen en la presente memoria métodos para determinar los porcentajes de similitud de secuencia (p. ej., BLASTP y BLASTN usando parámetros por defecto) y están generalmente disponibles.

Para comparación de secuencia y determinación de homología, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencia, se meten las secuencias de prueba y referencia en un ordenador, se diseñan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se diseñan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia calcula entonces la identidad de secuencia porcentual para la secuencia o secuencias de prueba respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros de programa diseñados.

Puede realizarse un alineamiento óptimo de secuencias para comparación, p. ej., por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), por implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por inspección visual (véase en general Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., suplementado en 2004).

Es un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar la identidad de secuencia porcentual y similitud de secuencia el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El software para efectuar análisis BLAST está públicamente disponible en el National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar en primer lugar los pares de secuencia de alta puntuación (HSP), identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coinciden con o satisfacen alguna puntuación T de umbral evaluado positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. Se hace referencia a T como el umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al., supra). Estos aciertos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que los contengan. Los aciertos de palabra se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia a condición de que la puntuación de alineamiento acumulado pueda aumentar. Se calculan las puntuaciones acumuladas usando, para secuencias nucleotídicas, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre <0). Para secuencias aminoacídicas, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulada cae una cantidad X desde su valor máximo conseguido; la puntuación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa, o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T yX determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias nucleotídicas) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un corte de 100, M= 5, N= -4, y una comparación de ambas hebras. Para secuencias aminoacídicas, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915).

Además de calcular la identidad de secuencia porcentual, el algoritmo BLAST efectúa también un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej., Karlin y Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Es una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST la probabilidad de suma mínima (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que ocurra por casualidad una coincidencia entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma mínima en una comparación del ácido nucleico de prueba con al ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01 y lo más preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.

Ácidos nucleicos que codifican polimerasas alteradas

Se presentan adicionalmente en la presente memoria moléculas de ácido nucleico que codifican las enzimas polimerasas alteradas presentadas en la presente memoria. Para cualquier polimerasa alterada dada que sea una versión mutante de una polimerasa para la que sea conocida la secuencia aminoacídica, y preferiblemente también la secuencia nucleotídica de tipo silvestre que codifica la polimerasa, es posible obtener una secuencia nucleotídica que codifica el mutante según los principios básicos de biología molecular. Por ejemplo, dado que la secuencia nucleotídica de tipo silvestre que codifica la polimerasa 9°N es conocida, es posible deducir una secuencia nucleotídica que codifica cualquier versión mutante dada de 9°N que tenga una o más sustituciones aminoacídicas usando el código genético estándar. De forma similar, las secuencias nucleotídicas pueden derivarse fácilmente de versiones mutantes de otras polimerasas tales como, por ejemplo, Vent™, Pfu, Tsp JDF-3, Taq, etc. Pueden construirse entonces moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia nucleotídica requerida usando técnicas de biología molecular estándares conocidas en la materia.

De acuerdo con las realizaciones presentadas en la presente memoria, un ácido nucleico definido incluye no solo el ácido nucleico idéntico, sino también cualquier variación de bases menor incluyendo, en particular, sustituciones en casos que den como resultado un codón sinónimo (un codón diferente que especifica el mismo residuo aminoacídico) debido al código degenerado en sustituciones aminoacídicas conservativas. La expresión “secuencia de ácido nucleico” incluye también la secuencia complementaria de cualquier secuencia monocatenaria dada respecto a las variaciones de bases.

Las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria pueden incluirse también, ventajosamente, en un vector de expresión adecuado para expresar las proteínas polimerasas codificadas a partir de las mismas en un hospedador adecuado. La incorporación de ADN clonado a un vector de expresión adecuado para transformación posterior de dicha célula y selección posterior de las células transformadas es bien conocida por los especialistas en la materia como se proporciona en Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory.

Tal vector de expresión incluye un vector que tiene un ácido nucleico según las realizaciones presentadas en la presente memoria ligado operativamente con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de dichos fragmentos de ADN. La expresión “ ligado operativamente” hace referencia a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que los permite funcionar de la manera pretendida. Tales vectores pueden transformarse en una célula hospedadora adecuada para proporcionar la expresión de una proteína según las realizaciones presentadas en la presente memoria.

La molécula de ácido nucleico puede codificar una proteína madura o una proteína que tiene una prosecuencia, incluyendo codificar una secuencia líder en la preproteína que se escinde entonces por la célula hospedadora formando una proteína madura. Los vectores, por ejemplo, pueden ser vectores de plásmido, virus o fago proporcionados con un origen de replicación, y opcionalmente, un promotor para la expresión de dicho nucleótido, y opcionalmente, un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más marcadores seleccionables tales como, por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos.

Los elementos reguladores requeridos para expresión incluyen secuencias promotoras para unirse a ARN polimerasa y dirigir un nivel apropiado de iniciación de la transcripción y también secuencias de iniciación de la traducción para unión a ribosoma. Por ejemplo, un vector de expresión bacteriano puede incluir un promotor tal como el promotor lac y, para iniciación de la traducción, la secuencia de Shine-Dalgarno y el codón de inicio AUG. De forma similar, un vector de expresión eucariótico puede incluir un promotor heterólogo u homólogo para ARN polimerasa II, una señal de poliadenilación en 5', el codón de inicio AUG y un codón de terminación para el desprendimiento del ribosoma. Tales vectores pueden obtenerse comercialmente o ensamblarse a partir de las secuencias descritas mediante métodos bien conocidos en la materia.

La transcripción de ADN que codifica la polimerasa por eucariotas superiores puede optimizarse incluyendo una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN de acción en cis que actúan sobre un promotor aumentando el nivel de transcripción. Los vectores incluirán también generalmente orígenes de replicación además de los marcadores seleccionables.

Ejemplo 1

Métodos y condiciones de ensayo generales

Los siguientes párrafos describen las condiciones de ensayo generales usadas en los ejemplos presentados a continuación.

1. Clonación y expresión de polimerasas

Esta sección describe el enfoque usado para la clonación y expresión de los diversos mutantes de polimerasa usados en los Ejemplos siguientes.

Se efectuó la mutagénesis en el gen que codifica la secuencia génica de esqueleto de la polimerasa usando metodología de mutagénesis dirigida a sitio estándar. Para cada mutación realizada, se confirmó la secuencia apropiada de los genes mutados por secuenciación de la secuencia del gen clonado.

Se subclonaron los genes de polimerasa en un vector pET11a y se transformaron en células de expresión BL21 Star (DE3) de Invitrogen. Se cultivaron las células transformadas a 37 °C en matraces Fernbock de 2,8 l hasta alcanzar una DO600 de 0,8. Se indujo entonces la expresión de proteína mediante la adición de IPTG 1 mM, seguido de 3 horas de crecimiento adicional. Se centrifugaron entonces los cultivos a 7000 rpm durante 20 minutos. Se almacenaron los sedimentos celulares a -20 °C hasta purificación.

Se efectuó la lisis de células bacterianas resuspendiendo los cultivos congelados en tampón de lisis 10x p/v (Tris pH 7,5, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM). Se añadió inhibidor de proteasa libre de Ed TA (Roche) al sedimento celular resuspendido. Se efectuaron todas las etapas de lisis y purificación a 4 °C. Se pasó el cultivo resuspendido a través de un microfluidizador 4 veces para completar la lisis celular. Se centrifugó entonces el lisado a 20.000 rpm durante 20 minutos para retirar los desechos celulares. Se añadió polietilenimina (concentración final 0,5 %) al sobrenadante lentamente con agitación durante 45 minutos para precipitar ácido nucleico bacteriano. Se centrifugó el lisado a 20.000 rpm durante 20 minutos y se desechó el sedimento. Se precipitó entonces el lisado con sulfato de amonio usando dos volúmenes de (N H ^S O ⁴ saturado frío en H²Od estéril. Se centrifugó la proteína precipitada a 20.000 rpm durante 20 minutos. Se resuspendieron los sedimentos de proteína en 250 ml de tampón A (Tris 50 mM pH 7,5, KCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM). Se purificó entonces el lisado resuspendido usando una columna SP FastFlow (GE) de 5 ml preequilibrada en tampón A. Se eluyó la columna usando un gradiente de 50 ml de KCl 0,1 a 1 M. Se combinaron las fracciones de pico y se diluyeron con tampón C (Tris pH 7,5, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) hasta que la conductividad era igual a la del tampón D (Tris pH 7,5, KCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM). Se cargaron entonces las fracciones combinadas en una columna HiTrap Heparin Fastflow de 5 ml. Se eluyó entonces la polimerasa usando un gradiente de 100 ml de KCl 50 mM a 1 M. Se combinaron las fracciones de pico, se dializaron en tampón de almacenamiento (Tris 20 mM pH 7,5, KCl 300 mM, EDTA 0,1 mM, 50 % de glicerol) y se congelaron a -80 °C. 2. Análisis de retraso de fase/adelantamiento de fase

Esta sección describe el enfoque usado para analizar el rendimiento de los mutantes de polimerasa usados en los Ejemplos siguientes en un ensayo de secuenciación por síntesis.

Se usan experimentos de secuenciación para generar valores de retraso de fase y adelantamiento de fase. Se llevan a cabo los experimentos en un sistema MiSeq (Illumina, Inc., San Diego, CA), según las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, para cada polimerasa, se generó una mezcla de incorporación (IMX) separada y se efectuó una tanda de 150 ciclos usando un carril de celda de flujo diferente para cada IMX. Se usaron formulaciones de reactivo V3 MiSeq estándar, con la polimerasa estándar sustituida por la polimerasa que se está ensayando, a una concentración de 30 |jg/ml. El tiempo estándar para incubación de iMx en la celda de flujo se acortó a 6 segundos. Se elaboró la colección de ADN usada siguiendo el protocolo Nextera™ estándar (Illumina, Inc.) usando ADN genómico de E. coli. Se usó el software Illumina RTA para evaluar los niveles de retraso de fase y adelantamiento de fase.

Ejemplo 2

Identificación y cribado de mutantes de polimerasa 9°N para retraso de fase/adelantamiento de fase

Se efectúa un cribado de mutagénesis por saturación de residuos en el bolsillo bloqueado 3'. Se generan mutaciones en la secuencia de esqueleto de polimerasa 9°N modificada (SEQ ID NO: 31), se clonan, se expresan y se purifican como se describe en general en el Ejemplo 1.

Se criba en las polimerasas mutantes purificadas la actividad de retraso de fase/adelantamiento de fase como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Se compara la actividad de retraso de fase y adelantamiento de fase de los mutantes ensayados con la polimerasa de control que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 31.

Se resumen los resultados del análisis en la tabla siguiente. Como se muestra en la tabla, cada uno de los mutantes anteriores muestra mejoras inesperadas y significativas en uno o más del retraso de fase y adelantamiento de fase cuando se comparan con las polimerasas de control.

Ejemplo 3

Cribado de mutantes de polimerasa 9°N WT

Se generan mutaciones de una secuencia de esqueleto de polimerasa 9°N-7 (9°N) de tipo silvestre de Thermococcus sp. (SEQ ID NO: 10), se clonan y se expresan y purifican como se describe en general en el Ejemplo 1, produciendo enzimas polimerasas que tienen las secuencias aminoacídicas expuestas como SEQ ID NO: 11-12, como se describe en la tabla siguiente.

Se criba en las polimerasas mutantes purificadas la actividad de retraso de fase/adelantamiento de fase como se describe en general en el Ejemplo 1 y se compara con la polimerasa de control que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 10. Se muestra que aquellas polimerasas que tienen las siguientes mutaciones tienen actividad de retardo de fase y/o adelantamiento de fase mejorada en comparación con el control:

Ejemplo 4

Cribado de mutantes de expolimerasa 9°N

Se generan mutaciones en la secuencia de esqueleto de expolimerasa 9°N (SEQ ID NO: 13), se clonan, se expresan y se purifican como se describe en general en el Ejemplo 1, produciendo enzimas polimerasas que tienen las secuencias aminoacídicas expuestas como SEQ ID NO: 14-15.

Se criba en las polimerasas mutantes purificadas la actividad de retraso de fase/adelantamiento de fase como se describe en general anteriormente en el Ejemplo 1 y se compara con la polimerasa de control que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 13. Se muestra que aquellas polimerasas que tienen las siguientes mutaciones tienen actividad de retraso de fase/adelantamiento de fase mejoradas en comparación con el control

Ejemplo 5

Cribado de mutantes de polimerasa 9°N alterada

Se generan mutaciones en la secuencia de esqueleto de expolimerasa 9°N alterada (esqueleto seleccionado de las SEQ ID NO: 16, 27, 29 y 31), se clonan, se expresan y se purifican como se describe en general en el Ejemplo 1, produciendo enzimas polimerasas que tienen las secuencias aminoacídicas expuestas como SEQ ID NO: 17, 28, 30 y 32-40.

Se criba en las polimerasas mutantes purificadas la actividad de retraso de fase/adelantamiento de fase como se describe en general anteriormente en el Ejemplo 1 y se compara con la polimerasa de control que tiene la secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 16, 27, 29 y 31. Se muestra que aquellas polimerasas que tienen las siguientes mutaciones tienen actividad de retraso de fase/adelantamiento de fase mejorada en comparación con el control:

Ejemplo 6

Cribado de mutantes de exopolimerasa Pfu

Basándose en el análisis del alineamiento de secuencias con la secuencia de esqueleto de polimerasa 9°N (véase la Figura 1), se generan mutaciones específicas en la secuencia de esqueleto de exopolimerasa de Pyrococcus furiosus (Pfu) (SEQ ID NO: 18), se clonan, se expresan y se purifican como se describe en general en el Ejemplo 1, produciendo enzimas polimerasas que tienen las secuencias aminoacídicas expuestas como SEQ ID NO: 19-20.

Se criba en las polimerasas mutantes purificadas la actividad de retraso de fase/adelantamiento de fase como se describe en general anteriormente en el Ejemplo 1 y se compara con la polimerasa de control que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 18. Se muestra que aquellas polimerasas que tienen las siguientes mutaciones tienen actividad de retraso de fase/adelantamiento de fase mejoradas en comparación con el control:

Ejemplo 7

Cribado de mutantes de exopolimerasa KOD1

Basándose en el análisis del alineamiento de secuencias con la secuencia de esqueleto de polimerasa 9°N (véase la Figura 1), se generan mutaciones específicas en la secuencia de esqueleto de exopolimerasa Thermococcus kodakaraensis (KOD1) (SEQ ID NO: 21), se clonan, se expresan y se purifican como se describe en general en el Ejemplo 1, produciendo enzimas polimerasa que tienen las secuencias aminoacídicas expuestas como SEQ ID NO: 22-23.

Se criba en las polimerasas mutantes purificadas la actividad de retraso de fase/adelantamiento de fase como se describe en general anteriormente en el Ejemplo 1 y se compara con la polimerasa de control que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 21. Se muestra que aquellas polimerasas que tienen las siguientes mutaciones tienen actividad de retraso de fase/adelantamiento de fase mejoradas en comparación con el control:

Ejemplo 8

Cribado de mutantes de exopolimerasa MMS2

Basándose en el análisis del alineamiento de secuencias con la secuencia de esqueleto de polimerasa 9°N (véase la Figura 1), se identifican mutaciones específicas en la secuencia de esqueleto de exopolimerasa Methanococcus maripalidus (MMS2) (SEQ ID NO: 24) basándose en la homología en un alineamiento con polimerasa 9°N (véase la Figura 2). Se generan los mutantes, se clonan, se expresan y se purifican como se describe en general en el Ejemplo 1, produciendo enzimas polimerasa que tienen las secuencias aminoacídicas expuestas como SEQ ID NO: 25-26.

Se criba en las polimerasas mutantes purificadas la actividad de retraso de fase/adelantamiento de fase como se describe en general anteriormente en el Ejemplo 1 y se compara con la polimerasa de control que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 24. Se muestra que aquellas polimerasas que tienen las siguientes mutaciones tienen actividad de retraso de fase/adelantamiento de fase mejoradas en comparación con el control:

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una ADN polimerasa recombinante que comprende una secuencia aminoacídica que es al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, cuya ADN polimerasa recombinante comprende al menos una mutación por sustitución aminoacídica en una o más posiciones posicionalmente equivalentes a Lys476 y Thr590, en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N, en la que la mutación en la posición posicionalmente equivalente a Lys476 comprende una mutación por un aminoácido hidrófobo.

2. La ADN polimerasa recombinante de la reivindicación 1, en la que dicha mutación por sustitución en la posición posicionalmente equivalente a Lys476 comprende una mutación por Trp.

3. La ADN polimerasa recombinante de la reivindicación 1, en la que dicha mutación por sustitución en la posición posicionalmente equivalente a Thr590 comprende una mutación por un aminoácido no polar.

4. La ADN polimerasa recombinante de la reivindicación 1, en la que dicha mutación por sustitución en la posición posicionalmente equivalente a Thr590 comprende una mutación por Ile.

5. La ADN polimerasa recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la polimerasa alterada comprende adicionalmente mutaciones por sustitución en las posiciones posicionalmente equivalentes a Leu408, Tyr409, Pro410 o una combinación de las mismas, en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N.

6. La ADN polimerasa recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la polimerasa alterada comprende mutaciones por sustitución en posiciones posicionalmente equivalentes a Asp141, Glu143 o una combinación de las mismas en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N.

7. La ADN polimerasa recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la polimerasa alterada comprende adicionalmente mutaciones por sustitución en posiciones posicionalmente equivalentes a Ala485 en la secuencia aminoacídica de ADN polimerasa 9°N.

8. La ADN polimerasa recombinante de la reivindicación 1, en la que dicha mutación por sustitución comprende mutaciones en posiciones posicionalmente equivalentes a Lys 476 y Thr590 respecto a la SEQ ID NO: 10, y en la que la mutación en la posición posicionalmente equivalente a Lys476 comprende una mutación por Trp y la mutación en la posición posicionalmente equivalente a Thr590 comprende una mutación por Ile.

9. La ADN polimerasa recombinante de la reivindicación 1, en la que la secuencia aminoacídica es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 10.

10. La ADN polimerasa recombinante de la reivindicación 1, en la que la secuencia aminoacídica es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 10.

11. La ADN polimerasa recombinante de la reivindicación 1, en la que la secuencia aminoacídica es al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 10.