WO2005118815A1 - Ｄｎａポリメラーゼ活性を有するポリペプチド - Google Patents

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WO2005118815A1
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dna polymerase
dna
polypeptide
seq
amino acid
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PCT/JP2005/008711
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Yoshimi Sato
Kazue Nishiwaki
Nana Shimada
Shigekazu Hokazono
Takashi Uemori
Hiroyuki Mukai
Ikunoshin Kato
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Takara Bio Inc.
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    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/101—DNA polymerase

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide having high Fidelity DNA polymerase activity useful as a reagent for genetic engineering, a gene encoding the polypeptide, a method for producing the polypeptide, and a method for amplifying a nucleic acid using the polypeptide About.
  • DNA polymerase is an enzyme useful as a reagent for genetic engineering, and is widely used for DNA base sequence determination, labeling, site-directed mutagenesis, and the like.
  • PCR polymerase chain reaction
  • DNA polymerases can be broadly classified into four families based on their common amino acid sequences, of which family A (pol type I enzyme) and family B (a type enzyme) dominate. .
  • family A poly type I enzyme
  • family B a type enzyme
  • DNA polymerases belonging to each family have roughly similar biochemical properties, a detailed comparison reveals that the specificity, the incorporation of substrate analogs, the strength and speed of primer extension, It has different properties such as DNA synthesis mode, exonuclease activity, optimal reaction conditions such as temperature and pH, and sensitivity to inhibitors. Therefore, DNA polymerases having the most suitable properties among existing ones have been selected and used in accordance with experimental operations so far.
  • Pyrococcus furiosus (Pfu) -derived DNA polymerase is one of the most heat-resistant DNA polymerases, and is known as 3 ′ ⁇ 5′exo, which is known as proofreading activity. It has nuclease activity and shows high fidelity among thermostable enzymes.
  • the enzyme has a problem in that it takes a long time to be amplified when used for PCR and a long chain cannot be amplified because the processivity is low and the extension rate is low.
  • K ⁇ D DNA polymerase which has higher 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity than Pfu-derived DNA polymerase, has a high elongation rate, and has high processivity, is commercially available.
  • Patent Documents 6 to 7 and Non-Patent Document 1 Since the enzyme S is capable of performing high-accuracy PCR in a short time using this enzyme, the primers and amplification products are degraded by the strong S ' ⁇ 5' exonuclease activity, and the reaction conditions must be set. It has a problem that it is relatively difficult and is not suitable for amplification of a long chain.
  • KOD-Plus-DNA polymerase adds two types of monoclonal antibodies to KOD DNA polymerase and suppresses the polymerase activity at room temperature and the 3'-5'exonuclease activity, so that it can be heated without any special operations. Start PCR is possible.
  • the composition of the reaction buffer by optimizing the composition of the reaction buffer, the amplification efficiency and the ability to synthesize long-chain DNA have been improved as compared with the K ⁇ DNA polymerase while maintaining high fidelity and fidelity (eg, Patent Document 8).
  • Patent Document 8 there is a problem that the elongation rate of the enzyme is reduced to the same level as that of Pfu-derived DNA polymerase, which is considerably slower than KOD DNA polymerase.
  • KOD Dash DNA polymerase is a mixed-type DNA polymerase produced based on the method of Barnes et al. (See, for example, Patent Document 9 and Non-Patent Document 2).
  • the amplification efficiency and elongation are improved by mixing the modified KOD DNA polymerase lacking the 3'-5 'exonuclease activity at an optimal ratio (see, for example, Patent Document 10).
  • the elongation rate is as fast as KOD DNA polymerase.
  • Fidelity has a problem that the 3'-5 'exonuclease activity is relatively reduced, so that it is much lower than that of KOD DNA polymerase alone.
  • Patent Document 1 US Pat. No. 5,489,523
  • Patent Document 2 US Pat. No. 5,545,552
  • Patent Document 3 US Pat. No. 5,866,395
  • Patent Document 4 U.S. Pat.No. 6,489,150
  • Patent Document 5 US Pat. No. 5,986,633
  • Patent Document 6 US Patent No. 6054301
  • Patent Document 7 US Patent No. 6225065
  • Patent Document 8 US Patent Application Publication No. 2002/0076768
  • Patent Document 9 US Pat. No. 5,436,149
  • Patent Document 10 U.S. Patent No. 6008025
  • Non-Patent Document l Bames W.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, No. 6, p. 2216-2220 (1994)
  • Non-Patent Document 2 Takagi M., et al., Appl. Environ. Microbiol., Vol. 63, No. 11, p. 4504 -4510 (1997)
  • the present inventors have discovered a novel DNA polymerase-active polypeptide from the genus Thermococcus, which is a hyperthermophilic archaeon, having excellent properties not found in conventional DNA polymerases. . Further, the present inventors have found a method for producing the polypeptide by closing a gene encoding the polypeptide having the activity, thereby completing the present invention.
  • the first invention of the present invention is:
  • an amino acid sequence selected from the group consisting of The present invention relates to a polypeptide having an amino acid sequence in which the amino acid has been deleted, inserted, added, substituted, and has DNA polymerase activity.
  • the second invention of the present invention relates to a nucleic acid encoding the polypeptide of the first invention.
  • the nucleic acid according to the second invention of the present invention may be a nucleic acid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, 23 or 31 or a part thereof, or a nucleotide complementary to the nucleic acid.
  • a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising
  • It may be a nucleic acid encoding a polypeptide having NA polymerase activity.
  • a third invention of the present invention provides a process for culturing a cell capable of producing a polypeptide.
  • a fourth invention of the present invention relates to a method for amplifying a nucleic acid, comprising a step of amplifying a nucleic acid using a polypeptide, wherein the polypeptide is
  • the fifth invention of the present invention relates to a composition containing the polypeptide of the first invention of the present invention.
  • the sixth invention of the present invention relates to a kit containing the polypeptide of the first invention of the present invention.
  • a seventh invention of the present invention relates to an antibody that binds to the polypeptide of the first invention of the present invention.
  • a polypeptide having a high fidelity DNA polymerase activity, a gene encoding the polypeptide, and a polypeptide having the DNA polymerase activity which are useful in any of cloning, sequencing, and nucleic acid amplification, are produced.
  • a method is provided.
  • an amplification product having a low error rate can be obtained even when the number of cycles in PCR is large. Therefore, it is useful for analysis and identification of a target nucleic acid having a small copy number.
  • FIG. 1 is a view showing the relationship between DNA polymerase activity and reaction temperature.
  • ⁇ is Tks
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between DNA polymerase activity and pH.
  • ⁇ shows the results for Tks DNA polymerase
  • ⁇ shows the results for Tee DNA polymerase
  • ⁇ shows the results for Tsi DNA polymerase.
  • polypeptide having DNA polymerase activity refers to the incorporation of four types of deoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, and dTTP) according to the base sequence of type III DNA, A polypeptide that catalyzes the polymerization of a DNA strand complementary to type DNA.
  • the term "suitable for primer extension” means that it is excellent in its ability to synthesize DNA from a primer using a complex obtained by annealing a primer to single-stranded ⁇ -type DNA as a substrate.
  • high affinity for single-stranded DNA is mentioned.
  • DNA polymerases with high affinity for single-stranded DNA can be expected to show high sensitivity in nucleic acid amplification reactions. That is, it is useful in a nucleic acid amplification reaction from a ⁇ -type nucleic acid having a small copy number.
  • An index indicating the compatibility is, for example, the Km value for single-stranded DNA of M13 phage, and it is preferable that the Km value is not more than 2.5 / ig / ml.2 Og / ml It is more preferable that the ratio be 1.5 / ig / ml or less.
  • “high fidelity” means that the accuracy of base incorporation in a DNA synthesis reaction of a DNA polymerase is high.
  • the measurement method includes the method of Kunkel i. Biol. Chem. 1985 May 10; 260 (9): 5787-96.), The sequencing method, and the method of Cline et al. (Nucleic Acids Res. 1996 Sep 15; 24 (18 ): 3546-51.). Among them, the sequencing method is the most reliable.
  • PCR is performed with each DNA polymerase using the genomic DNA of Thermus thermophilus HB-8 as type III, and the amplified product is cloned into a vector PUC118.
  • nucleotide sequence of about 500 bp of the amplified fragment in the clone, confirm the number of bases considered to be in error, determine the% of bases in error with respect to the total number of sequencing bases, and evaluate the fidelity. it can.
  • the polypeptide having DNA polymerase activity of the present invention is a polypeptide which is more suitable for primer extension than Pfu-derived DNA polymerase and KOD-derived DNA polymerase, and which has excellent accuracy in DNA synthesis.
  • the polypeptide having the DNA polymerase activity of the present invention includes Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), a DNA polymerase derived from Pfu, which is a typical high fidelity heat-resistant DNA polymerase, K ⁇ D DNA polymerase, and KOD dash DNA polymerase. Compared with KOD plus DNA polymerase (both manufactured by Toyobo), it is superior in terms of the length of DNA that can be amplified in the PCR method and the fidelity and the reaction of the DNA.
  • the physicochemical properties of the DNA polymerase of the present invention are as follows.
  • the polypeptide having the DNA polymerase activity of the present invention is not particularly limited as long as it has the above-mentioned physicochemical properties.
  • the polypeptide having the DNA polymerase activity of the present invention is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, 24 or 32 in the sequence listing or a functional equivalent having substantially the same activity. It may be. Naturally occurring polypeptides may have deletions or insertions of amino acids in their amino acid sequences due to polymorphisms or mutations in the gene encoding them, or modification reactions in vivo and during purification of the produced polypeptides. It is known that some polypeptides exhibit physiological activities and biological activities substantially equivalent to those of polypeptides having no mutation, although mutations such as calcification and substitution may occur.
  • the number of mutated amino acids is not particularly limited as long as the polypeptide exhibits substantially the same physiological activity and biological activity, but it is one or more, for example, one or several, and more.
  • 1 to 10 mutations are exemplified. The same applies to the case where the above-described mutation is artificially introduced into the amino acid sequence of the polypeptide. In this case, it is possible to produce further various variants.
  • a polypeptide when produced by genetic engineering, it is often expressed as a fusion polypeptide.
  • an N-terminal peptide chain derived from another polypeptide may be added to the N-terminus to increase the expression level of the target polypeptide, or a suitable peptide chain (for example, N-terminal or C-terminal of the target polypeptide). Histidine-one tag, glutathione-one S-transferase, etc.) are added and expressed, and a carrier having affinity for this peptide chain is used to facilitate purification of the target polypeptide.
  • the DNA encoding the polypeptide having the DNA polymerase activity of the present invention includes a DNA containing all or a part of the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, 24 or 32 in the sequence listing, for example, And DNAs containing all or a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15, 23 or 31 in the sequence listing.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 24 or 32 one or more, for example, 1 to several amino acids, more specifically, 1 to 10 amino acids are deleted, inserted, added, or substituted.
  • examples also include a DNA consisting of a sequence and encoding a polypeptide having a function as the above DNA polymerase.
  • a base sequence IJ that can hybridize with a DNA consisting of a base sequence complementary to these DNAs under stringent conditions and encodes a polypeptide having a function as the DNA polymerase is also within the scope of the present invention. It is.
  • the ⁇ stringent conditions '' are, for example, 6 X SSC containing 0.5% SDS, 5 X Denhardt's, 100 x gZml denatured salmon sperm DNA together with the probe (1 X SSC is 0.15 M NaCl, 0.015M sodium citrate, showing ⁇ 7.0) at 68 ° C for 12-20 hours.
  • DNA hybridized to the probe can be detected, for example, after washing at 68 ° C. in 0.1 ⁇ SSC containing 0.5% SDS.
  • the gene of the present invention may include a sequence encoding a region called intin which is spontaneously cut out from the polypeptide after translation of the polypeptide.
  • DNAs containing such sequences are also included in the present invention, as long as they encode a polypeptide having DNA polymerase activity.
  • polypeptide having DNA polymerase activity is not particularly limited, but for example, a polypeptide having DNA polymerase activity exhibiting various physicochemical properties described above is preferable.
  • DNA containing a base sequence encoding an amino acid sequence described in the present specification will be explained. It is known that there are codons (combinations of three bases) that specify amino acids on the gene for each type of amino acid:! To 6 types. Therefore, a large number of DNAs encoding a certain amino acid sequence can exist depending on the amino acid sequence.
  • the polypeptide having DNA polymerase activity of the present invention is suitable for primer-extension in vitro.
  • a substrate in which a primer is annealed to a single-stranded DNA a substrate in which the HT primer of SEQ ID NO: 33 in the sequence listing is annealed to a single-stranded DNA of M13, the following M13 / HT Primer substrate, or primer extension
  • a type substrate when measuring DNA polymerase activity compared to the activated DNA (DNase I-treated calf thymus DNA) used for normal activity measurement. Activity is obtained.
  • elongation activity and the ratio of DNA polymerase activity (hereinafter sometimes referred to as uptake activity) measured using activated DNA as a substrate (extension activity / uptake activity)
  • uptake activity Is a known Pyrococcus furiosus-derived DNA polymerase (Pfu DNA polymerase, manufactured by Stratagene) ⁇ Thermus aquaticus-derived Taq DNA polymerase (TaKaRa Taq, manufactured by Takara Bio Inc.)
  • the polypeptide having the DNA polymerase activity of the present invention shows a higher value than KOD DNA polymerase (KOD DNA polymerase, manufactured by Toyobo).
  • the polypeptide having DNA polymerase activity of the present invention has a Km value of not more than 2 ⁇ g / ml for single-stranded DNA of M13 phage. It is shown to have high affinity for the substrate.
  • the polypeptide having the DNA polymerase activity of the present invention can be mass-produced, for example, from a culture of a strain of Tks, Tsi, or Tee, or from a transformant into which a gene encoding the polypeptide has been introduced. .
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be obtained using the genomic DNA of a microorganism producing the polypeptide of the present invention as a starting material.
  • the method for preparing the genomic DNA is not particularly limited, but includes, for example, a method of anaerobically culturing Thermococcus archaea at 85 ° C, crushing the grown cells, extracting the DNA, and purifying the DNA.
  • various methods used for gene cloning such as a method of cutting the obtained DNA with a restriction enzyme, can be performed by a known method. Details of the method can be found in Cold Spring Harbor Laboratory, 2001, J. Sam. Brookbrook, Sambrook) Horik, Molecular Cloning, Laboratory, Manuanore, 3rd Edition (Molecular Clomng, A Laboratory Manual).
  • the polypeptide having a DNA polymerase activity of the present invention is a nucleic acid encoding a polypeptide having a DNA polymerase activity, and is not particularly limited, for example, a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 15, 23 or 31 in the sequence listing
  • LB medium tryptone 10 g / liter, yeast extract 5 g / liter, By culturing in NaCI 5 g / liter, pH 7.2
  • the polypeptide is obtained from the above cultured cells by, for example, sonication, heat treatment, and cation exchange column, affinity carrier column, gel filtration column or anion exchange force. It can be obtained by performing chromatography using ram or the like.
  • polypeptide having DNA polymerase activity of the present invention exhibits about 85-90 daltons on SDS-PAGE.
  • the polypeptide having DNA polymerase activity of the present invention exhibits an optimum pH of 5.5 to 6.5 at 75 ° C in a Tris buffer. When the enzymatic activity of the DNA polymerase is measured at various temperatures, it shows high activity at 75 ° C to 85 ° C. In addition, the polypeptide having DNA polymerase activity of the present invention has high thermostability.
  • the polypeptide having a DNA polymerase activity of the present invention is accompanied by a 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity, and the exonuclease activity with respect to the DNA polymerase activity is high due to its strong activity.
  • Exceeds the activity ratio of Pfu DNA polymerase which is known to have very high accuracy of DNA synthesis.
  • the frequency of errors occurring during the DNA synthesis reaction measured for the polypeptide having the DNA polymerase activity of the present invention is lower than that of the Pfu-derived DNA polymerase.
  • the polypeptide having DNA polymerase activity of the present invention is characterized by being suitable for primer extension with high fidelity, and a method for accurately amplifying, analyzing, and identifying a target nucleic acid by using the polypeptide. And compositions and kits for the method are provided.
  • the DNA polymerase derived from Thermococcus kodakaensis K ⁇ D DNA polymerase, manufactured by Toyobo
  • K ⁇ D DNA polymerase manufactured by Toyobo
  • DNA polymerase of the present invention amplification of a 15-kilobase pair DNA fragment was performed by the enzyme alone without adding the enzyme. It is possible.
  • a conventional DNA polymerase ⁇ a composition containing a plurality of DNA polymerases for example, a composition and a kit containing KOD DNA polymerase, a composition and a kit containing KOD dash DNA polymerase, and a K ⁇ D plus Compositions and kits containing the polypeptide of the present invention are superior to compositions and kits containing DNA polymerase in that accurate amplification, analysis, and identification of target nucleic acids can be performed.
  • composition and kit include those containing the polypeptide having the DNA polymerase activity of the present invention, a buffer solution optimized for the polypeptide, four dNTPs, and a divalent cation. It may be exemplified, and may further include a primer set for amplifying and / or detecting a target nucleic acid.
  • the present invention provides an antibody that binds to the polypeptide of the present invention.
  • the antibody is not particularly limited as long as it has the ability to recognize and specifically bind to the polypeptide of the present invention, and may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody.
  • antibody fragments for example, Fab fragments and the like
  • single-chain antibodies having the same recognition characteristics as the above-mentioned antibodies are also included in the present invention.
  • the antibody of the present invention can be prepared by a known method, for example, a method described in Current Protocols in Immunology, published by John Wiley & Sons, Inc., iohn Wiely & Sons, Inc., 1992. Thus, it can be prepared by immunizing a mouse or a heron using the polypeptide of the present invention or a part thereof as an antigen. Furthermore, a monoclonal antibody can be prepared by preparing a hybridoma based on antibody-producing cells collected from the immunized animal according to a conventional method.
  • the above-mentioned antibodies can be used for detecting and purifying the polypeptide of the present invention and also for inhibiting the activity retained by the polypeptide, for example, DNA polymerase activity or 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease. can do.
  • Antibodies having the ability to suppress DNA polymerase activity are useful, for example, in PCR to suppress DNA elongation from non-specifically annealed primers at low temperatures before the start of the reaction.
  • an antibody having the ability to suppress 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity is useful, for example, in PCR to suppress the degradation of primer before the start of the reaction.
  • the activated DNA used for measuring the activity of the DNA polymerase of this example was prepared by the following method.
  • the sample whose activity is to be measured is mixed with a reaction solution for activity measurement (20 mM Tris-HCl buffer ⁇ 8.3, 10 mM potassium chloride, 6 mM ammonium sulfate, 2 mM magnesium chloride, 0.1% Triton X-100, 0.1% Triton X-100. 001% bovine serum albumin, 200 ⁇ ⁇ each dATP, dGTP, dCTP, 100 ⁇ M dTTP, 0.238 ⁇ M “” —Methyl TTP, 0.4 mg / ml activated salmon sperm DNA) in 50 xl, 74 The reaction was performed at ° C for 5 minutes.
  • Genomic DNA was prepared from Thermococcus (Thermococcus) sp.
  • 10 ml of the purchased culture was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes.
  • the obtained supernatant and the black layer at the interface between the supernatant and the precipitate were further centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes.
  • the precipitate was suspended in 0.8 ml of 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ 8.0), 0.16 ml of 500 mM EDTA (pH 8.0), and 0.08 ml of 10 mg / ml salted zizozyme.
  • An aqueous solution (manufactured by Nakara Tester Co.) was added and reacted at room temperature for 2 hours.
  • Oligonucleotides TPPolBF4, TPPolBF5, TT PolBR1 and TTPolBR4 described in SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing are stored on a DNA synthesizer based on the conserved amino acid sequences of various heat-resistant DNA polymerases. Synthesized.
  • PCR 250 ng of the genomic DNA derived from Thermococcus sp. PCR was performed in a volume of ⁇ by combining the primers.
  • DNA polymerase as Takara ExTaq (manufactured by Takara Bio Inc.) according to the attached protocol.PCR was performed at 94 ° C for 3 minutes, followed by 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes. The reaction was performed for 40 cycles, with each cycle being one cycle.
  • each reaction solution was treated with phenol, and then the primers were removed and the amplified DNA fragments were concentrated at the same time using Microcon 100 (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the concentrated 3kb TPPolBF4_TTPolBRl amplified fragment, 2kb TPPolBF4_TTPolBR4 amplified fragment, and 0.7kb TPPolBF5_TTPolBRl amplified fragment were subjected to direct sequencing, their nucleotide sequences were determined, and the amino acid sequence of various heat-resistant DNA polymerases was determined. And compared. As a result, Thermococcus sp. KS-1 DNA polymerase It was found to contain an in sequence.
  • Example 3- (1) Based on the nucleotide sequence obtained in Example 3- (1) above, a special oligonucleotide TksOl (SEQ ID NO: 5 in the sequence listing) for upstream cloning was synthesized. Further, 32 types of primers shown in Table 1 below were synthesized. The tag sequence in Table 1 is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • Thermococcus sp. KS-1 derived genomic DNA lng prepared in Example 2 was converted into type II, and 2 OmM tris-acetic acid was obtained by combining 1 Opmol of TksO 1 and each 1 Opmol of Table 1 with 32 kinds of primers.
  • Buffer ⁇ 8.5 ⁇ 5
  • 50 mM potassium acetate 3 mM magnesium acetate, 0 ⁇ 01% BSA, 300 / iM dNTP mixture each, 1.25 U Takara ExTaq DNA polymerase (Takara Bio Inc.) 50 PCR was performed in the ⁇ 1 reaction solution.
  • a 40-cycle reaction was performed in which 98 ° C for 10 seconds, 50 ° C for 10 seconds, and 72 ° C for 40 seconds were regarded as one cycle.
  • a portion of the obtained PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and a single-single band was selected.
  • the reaction solution was concentrated using a Microcon 100 (manufactured by Takara Bio Inc.) at the same time as removing the primers.
  • a sequence was performed to screen for fragments containing the upstream portion of the DNA polymerase.
  • the PCR amplified fragment Tks012G of about 1300 bp contained the upstream of the target DNA polymerase gene.
  • this fragment contains an intin sequence different from that of Example 3_ (1). I was able to confirm that it was rare.
  • a specific oligonucleotide Tks04 (SEQ ID NO: 7 in the sequence listing) was synthesized based on the sequence of Tks012G.
  • KS-1 genomic DNA derived from Thermococcus sp.
  • KS-1 prepared in Example 2
  • combining lOpmol Tks04 with each of the 32 primers listed in Table 1 of lOpmol in the above 50 ⁇ l reaction mixture PCR was performed.
  • the PCR conditions and the purification procedure were the same as those described above.
  • the obtained amplified fragment was subjected to a direct sequence, and a fragment containing DNA polymerase upstream was screened. As a result, it was found that the PCR amplified fragment Tks041B of about 1800 bp contained the vicinity of the start codon of the target DNA polymerase gene.
  • a specific oligonucleotide Tks02 (SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) for upstream cloning was synthesized.
  • 1 ng of the genomic DNA derived from Thermococcus sp. KS-1 prepared in Example 2 was subjected to PCR using a combination of lksmol Tks 02 and 32 types of primers described in Table 1 of each lOpmol.
  • the PCR conditions were the same as those described above.
  • a part of the obtained PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and an about 2500 bp DNA fragment of Tks022D was recovered therein.
  • the product was ligated to pUCl18 (manufactured by Takara Bio Inc.) digested with T4 DNA ligase (manufactured by Takara Bio Inc.), and Escherichia coli JM109 was transformed using the plasmid.
  • the transformant was further cultured to obtain a plasmid pTks022D into which a DNA fragment of about 2500 bp was inserted, and the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment was determined.
  • Thermococcus sp. KS _ 1 DNA polymerase has been found to contain the two places Intin sequences in the sequence.
  • a DNA polymerase gene from which the intin sequence had been removed was constructed. Based on the sequence obtained in Example 3 (3), oligonucleotides, TksNde, TkslEndBg, Tks2StaBg, Tks2EndBal, Tks3StaBal, and TksBgPs described in SEQ ID NOS: 9 to 14 in the sequence listing were synthesized.
  • Thermococcus sp.KS-1 prepared in Example 2 was used as a template, and 20 pmol of TksNde and 20 pmol of TkslEndBg (TksA), 20 pmol of Tks2St aBg and 20 pmol of Tks2EndBal (TksB), and 20 pmol of Tks3StaBal were used.
  • PCR was performed with a primer combination of 20 pmol of TksB gPs (TksC) in a volume of ⁇ .
  • TksC primer combination of 20 pmol of TksB gPs
  • TksA DNA fragment was digested with restriction enzymes Ndel and Bglll, and the TksD DNA fragment was digested with restriction enzymes Bglll and Pstl and then digested with restriction enzymes Ndel and Pstl.
  • the plasmid is named and designated as pTks59, and from May 14, 2004 (Hara Deposit Date), Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba East, Ibaraki, Japan) No. 6 (Zip Code 305-8566)), deposited as FER M BP-10312.
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of pTks59 obtained in Example 3 (4) was determined by the dideoxy method.
  • nucleotide sequence of this open reading frame is shown as SEQ ID NO: 15 in the sequence listing.
  • amino acid sequence of RNaseHII deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing.
  • Escherichia coli JM109 transformed with pTks59 was inoculated into 5 ml of LB (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride) medium containing 100 ⁇ g Zml of ampicillin.
  • LB 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride
  • ° Cultures 50 beta 1 for 6 hours C was inoculated 100 mu g / ml of ampicillin and ImM IPTG LB medium including 5 ml, and 1 ⁇ shake cultured at 37 ° C. After completion of the culture, the cells collected by centrifugation are suspended in a 36 / il sonication buffer (50 mM Tris-monohydrochloride ⁇ 80, 2 mM 2_mercaptoethanol, 10% glycerol) and sonicated. Hanged up.
  • a 36 / il sonication buffer 50 mM Tris-monohydrochloride ⁇ 80, 2 mM 2_mercaptoethanol
  • This crushed liquid was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes, and the obtained supernatant was subjected to a heat treatment at 80 ° C for 10 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged again at 12000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain a heat-treated supernatant.
  • the enzymatic activity was measured by the method described in Example 1 using the heat-treated supernatant obtained above, and as a result, DNA polymerase activity was confirmed.
  • the cells collected by centrifugation are suspended in 732 ml of buffer A (50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 2 mM EDTA, 2 mM dithiothreitol, ImM phenyl methanesulfonyl fluoride). It became cloudy and was sonicated. This crushed liquid was centrifuged at 12000 rpm for 30 minutes. Add ammonium sulfate (ammonium sulfate) to the resulting supernatant to a final concentration of 0.2M, heat-treat at 75 ° C for 15 minutes, leave at 0 ° C for 30 minutes, and again at 12000 rpm for 30 minutes Was centrifuged.
  • buffer A 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 2 mM EDTA, 2 mM dithiothreitol, ImM phenyl methanesulfonyl fluoride
  • the supernatant was subjected to nucleic acid removal treatment with polyethyleneimine and ammonium sulfate precipitation, followed by buffer B [50 mM Tris-hydrochloride buffer ( ⁇ 7.5), ImM EDTA, 10% glycerolone, ImM dithiothreitol, lmM [Phenylmethanesulfonyl fluoride]] Using 2 liters of the external solution, dialysis was performed twice for 2 hours and once for overnight.
  • buffer B 50 mM Tris-hydrochloride buffer ( ⁇ 7.5), ImM EDTA, 10% glycerolone, ImM dithiothreitol, lmM [Phenylmethanesulfonyl fluoride]
  • This fraction was subjected to dialysis for 2 hours using buffer D (20 mM Tris-HCl (pH 9.0), 0.2 ImM EDTA, 10% glycerol, 0.2% Tween 20, ImM dithiothreitol) 11 as an external solution. Once and overnight dialysis. 50 ml of the dialyzed enzyme solution was applied to Q-Sepharose (Pharmacia Biotech) equilibrated with buffer D, and eluted with a linear gradient of 0 to 300 mM NaCl using an FPLC system.
  • buffer D 20 mM Tris-HCl (pH 9.0), 0.2 ImM EDTA, 10% glycerol, 0.2% Tween 20, ImM dithiothreitol
  • the activity of the obtained Tks DNA polymerase preparation was measured by the method described in Example 1, and the DNA polymerase activity was confirmed.
  • Oligonucleotides TPPolBF1, TPPol BF5, TTPolBR1, and TTPolBR5 described in SEQ ID NOs: 17, 2, 3, and 18 in the Sequence Listing are stored based on the conserved amino acid sequences of various heat-resistant DNA polymerases. Synthesized.
  • PCR was performed with a volume of ⁇ . PCR conditions and purification procedures were performed in the same manner as described in Example 3_ (1). About 2 kb of TPPolBFl—TTPolBR obtained 1. Direct sequencing was performed for each amplified fragment of about 1 kb TPPolBFl-TTPolBR5 and about 0.8 kb TPPolBF5-TTPolBR1, and the nucleotide sequence was determined.
  • Example 4_ (1) Based on the nucleotide sequence obtained in Example 4_ (1) above, a specific oligonucleotide TceOl (SEQ ID NO: 19 in the sequence listing) for upstream cloning and an oligonucleotide Tce02 (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 20) was synthesized.
  • Example 3_ (2) the genomic DNA (1 ng) derived from the Thermococcus cellar prepared in Example 2 was transformed into ⁇ type, and the combination was performed using lOpmol of TceOl or Tceo2 and each lOpmol of Example 3_ (2) in combination with the 32 primers described in Table 1. PCR and purification operations were performed in the same manner as described in Example 3_ (2). The obtained amplification product was subjected to direct sequencing, and a fragment containing the upstream region of the target DNA polymerase was screened.
  • the PCR amplified fragment Tce013C of about 65 Obp contained the upstream of the DNA polymerase gene
  • the PCR amplified fragment Tce022F of about 650 bp contained the downstream of the DNA polymerase gene.
  • Example 4 Oligonucleotides TceNde and TceBgPs described in SEQ ID NOs: 21 and 22 in the sequence listing were synthesized based on the sequence obtained in step (2).
  • the genomic DNA 100 ng derived from Thermococcus cellar prepared in Example 2 was used as a ⁇ type, and 2 Opmol of TceNde and 20 pmol of TceBgPs were used as primers, and PCR was performed in a volume of 100 ⁇ l. PCR was performed according to the protocol attached with a pie mouth vest (manufactured by Takara Bio Inc.) as a DNA polymerase. One cycle at 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for two minutes. A cycle reaction was performed.
  • the obtained amplified DNA fragment of about 2.3 kb is digested with restriction enzymes Ndel and Bglll (both manufactured by Takara Bay), and the obtained DNA fragment is ligated with plasmid vector pTVl19Nd (Ncol site of pTVl19N to Ndel site).
  • the resulting plasmid was inserted between Ndel and BamHI to produce plasmid pTce19.
  • the plasmid was named and designated as pTcel9. Starting May 14, 2004 (Hara Deposit Date), the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Japan (Tsukuba East, Ibaraki Prefecture, Japan 1-1-1, 1-1) Deposited at Central No. 6 (mail number 305-8566)) as FERM BP-1031.
  • FERM BP-1031 Determination of base sequence of DNA fragment containing DNA polymerase gene
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of pTce19 was determined by the dideoxy method. When the results of the obtained nucleotide sequence were analyzed, an open reading frame thought to encode the target DNA polymerase was found. The nucleotide sequence of this open reading frame is shown as SEQ ID NO: 23 in the sequence listing. The amino acid sequence of the DNA polymerase deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 24 in the sequence listing.
  • Escherichia coli JM109 transformed with pTcel9 was cultured by the method described in Example 3_ (6), and the cells collected by centrifugation were suspended in 64 ⁇ l of a sonication buffer and subjected to sonication. This crushed liquid was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes, and the obtained supernatant was subjected to a heat treatment at 80 ° C for 10 minutes. Thereafter, centrifugation was again performed at 12000i "pm for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain a heat-treated supernatant.
  • the enzymatic activity of the heat-treated supernatant obtained above was measured by the method described in Example 1, and as a result, DNA polymerase activity was observed.
  • Escherichia coli JM109 transformed with the above pTcel 9 was cultured by the method described in Example 3- (7). Purification was carried out in the same manner as in Example 3- (7), using Heparin-Sepharose CL-6B (Pharmacia Biotech) until elution with a linear gradient of 0 to 700 mM KC1.
  • the eluted DNA polymerase fraction was further dialyzed twice for 2 hours and once for overnight using 1 liter of buffer C containing 0.3 M sodium chloride as an external solution. 95 ml of the dialyzed enzyme solution was applied to SuperdexG 200 (Pharmacia Biotech) equilibrated with buffer C containing 0.3 M sodium chloride, and eluted with buffer C containing 0.3 M sodium chloride.
  • the enzyme activity was measured by the method described in Example 1, and as a result, the DNA polymerase activity was confirmed in the Tee DNA polymerase preparation.
  • Oligonucleotides TPPolBFl, TPPolBF5, TTPolBRl described in SEQ ID NOs: 17, 2, 3, 4, and 18 in the Sequence Listing based on the conserved portions between the amino acid sequences of various thermostable DNA polymerases TTPolBR4 and TTPolBR5 were synthesized.
  • a primer combination of 50 pmol of TPPolBF1 and 50 pmol of TTPolBR4, 50 pmol of TPPolBF1 and 50 pmol of TTPolBR5, 50 pmol of TTPolBF5 and 50 pmol of TTPolBR5 The PCR was performed at a volume of 100 / il. PCR conditions and purification procedures were performed in the same manner as described in Example 3- (1).
  • the obtained amplified fragments of about 1.2 kb TPPolBFl-TTPolBR4, about 1 kb TPPolBFl-TTPolBR5, and about 2 kb TPPolBF5-TTPolBRl were subjected to direct sequencing to determine the nucleotide sequence. As a result, it was revealed that Thermococcus screen DNA polymerase contains an intin sequence.
  • Example 5_ (1) Based on the nucleotide sequence obtained in Example 5_ (1) above, a specific oligonucleotide TsiOl (SEQ ID NO: 25 in the sequence listing) for upstream cloning and an oligonucleotide Tsi06 (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 26) was synthesized.
  • Example 2 1 ng of Thermococcus squirt-derived genomic DNA prepared in Example 2 was subjected to PCR using a combination of 1 Opmol of TsiO1 or Tsi06 and 32 primers listed in Table 1 of each 1 Opmol. PCR conditions and purification procedure were performed in the same manner as in Example 3_ (2).
  • the amplified fragment obtained is subjected to direct sequencing, DNA polymerase Were screened for fragments containing As a result, it was found that the TsiOllA fragment of about 2900 bp contained the upstream of the DNA polymerase gene, and the Tsi065B fragment of about 400 bp contained the downstream of the DNA polymerase gene.
  • Thermococcus screen DNA polymerase contained one intin sequence. Therefore, a DNA polymerase gene from which the intin sequence had been removed was constructed.
  • oligonucleotides TsiNde, TsiA, TsiB and TsiBamPst represented by SEQ ID NOs: 27 to 30 in the sequence listing were synthesized based on the sequence obtained in Example 5- (2).
  • PCR was performed using a primer combination of 20 pmol of TksNde and 20 pmol of TsiB (Tsil) and 20 pmol of TsiA and 20 pmol of TsiBamPst (Tsill), using the genomic DNA 100 ng of Thermococcus squirt prepared in Example 2 as a ⁇ -type in a volume of ⁇ . Was done.
  • the PCR conditions were the same as in Example 5- (2), and Tsil of about 1.5 kb and Tsill DNA fragment of about 0.9 kb were obtained.
  • the obtained DNA fragment of about 2.4 kb was digested with restriction enzymes Ndel and BamHI, ligated with pTVl19Nd digested with Ndel and BamHI (the Ncol site of pTVl19N was converted to Ndel site), and plasmid pTsil6 Was built.
  • the plasmid is named and displayed as pTsil6, and since May 14, 2004 (the date of the original deposit), the Patent Organism Depositary, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 1-1-1 Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan 1 Deposited at Central No. 6 (Zip Code 305-8566) as FERM BP-10310.
  • the nucleotide sequence of the pTsil6-inserted DNA fragment obtained in Example 5_ (3) was determined by the dideoxy method. When the results of the obtained nucleotide sequences were analyzed, an open reading frame thought to encode DNA polymerase was found. The nucleotide sequence of this open reading frame is shown as SEQ ID NO: 31 in the sequence listing. The amino acid sequence of DNA polymerase deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 32 in the sequence listing. (5) Expression of Thermococcus chestnut DNA polymerase gene
  • Escherichia coli JM109 transformed with plasmid pTsil6 was cultured by the method described in Example 3- (6), and the cells collected by centrifugation were suspended in 52 ⁇ l of a sonication buffer and subjected to sonication. Was. This crushed liquid was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes, and the obtained supernatant was subjected to a heat treatment at 80 ° C for 10 minutes. Thereafter, centrifugation was again performed at 12000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain a heat-treated supernatant.
  • the enzymatic activity was measured by the method described in Example 1 in the heat-treated supernatant obtained above, and as a result, DNA polymerase activity was observed.
  • Escherichia coli JM109 transformed with the plasmid pTsil6 was cultured by the method described in Example 3_ (7). Purification was performed in the same manner as in Example 3_ (7).
  • the DNA polymerase thus obtained was used as a Tsi DNA polymerase preparation.
  • the activity was measured by the method described in Example 1, and as a result, the DNA polymerase activity was confirmed in the Tsi DNA polymerase preparation.
  • Tks, Tce and Tsi DNA polymerase were measured.
  • a commercially available KOD DNA polymerase manufactured by Toyobo was used.
  • an enzyme sample to be'll measuring the activity the ⁇ , (Amersham) 0 ⁇ ⁇ dNTP, 0. 238 ⁇ ⁇ "3 H" Methyl_TTP, K_ ⁇ D # 1 buffer containing ImM magnesium chloride (Toyobo
  • the reaction was carried out at 75 ° C. for 5 minutes at 50 ⁇ l. 40 ⁇ of the reaction solution was spotted on DE81 paper (manufactured by Whatman) and washed four times with 5% Na PO.
  • the DNA polymerase of the present invention can be used in terms of PCR detection sensitivity.
  • a polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used.
  • Type III was Thermomus thermophilus HB8 genomic DNA (Takara Bio Inc.).
  • C280ZRG34-F and R primers described in SEQ ID NOs: 34 and 35 in the sequence listing were used.
  • Fidelity was measured by the following method. That is, 10 ng of Thermus thermophilus HB8 genomic DNA was type III, and PCR was carried out in a volume of 50 ⁇ l in combination with the above-mentioned c280 / RG34-F and R primers. Since the region to be amplified by the above primer pair has a high GC content of 70%, DMSO was added to a concentration of 2%. When Tks, Tsi and KOD plus DNA polymerase were used, KOD plus buffer was used and used according to the attached protocol. When KOD DNA polymerase was used, K ⁇ D # 1 buffer was used and used according to the protocol attached to KOD DNA polymerase.
  • PCR Pyrobest DNA polymerase was performed according to the attached buffer and protocol.
  • the PCR conditions were as follows: after incubation at 96 ° C for 2 minutes, a 30-cycle reaction was performed with 98 ° C for 5 seconds and 68 ° C for 30 seconds as one cycle. After completion of the reaction, an equal volume of a 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) saturated phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixture (25: 24: 1, v / v) was added and mixed. Centrifugation (10000 X g) was performed twice for 2 minutes.
  • the resulting supernatant was mixed with a mixed solution of formaldehyde / isoamyl alcohol (24: 1, vZv), followed by centrifugation (10,000 ⁇ g) for 10 minutes.
  • the obtained supernatant was precipitated with ethanol and dissolved in 20 ⁇ l of H20 to obtain a DNA fragment of about 0.5 bp.
  • E. coli JM109 was transformed with 5 ⁇ l of the resulting solution.
  • Tks and Tsi DNA polymerases of the present invention had less mutation frequency than KOD, K ⁇ D plus, and Pyrobest DNA polymerase. These results revealed that KOD, K ⁇ ⁇ ⁇ D plus, and Pyrobest DNA polymerase are superior as cloning enzymes.
  • Type III was Thermomus thermophilus HB8 genomic DNA (Takara Bio Inc.).
  • C240ZRA18-F and R primers described in SEQ ID NOs: 36 and 37 in the sequence listing were used.
  • Tks The optimal temperatures of Tks, Tee and Tsi DNA polymerase were measured. As type 20, 20 ⁇ g active calf thymus DNA was used. The buffer attached to Pyrobest DNA polymerase was used as the buffer. The activity of DNA polymerase was measured by the following method.
  • FIG. 1 shows the relationship between the activity measured by the above activity measurement method and the reaction temperature.
  • the activity in the reaction at 85 ° C. is defined as 100%.
  • Tks, Tee, and Tsi DNA polymerase were activated calf thymus DN.
  • the optimal pH of Tks, Tee and Tsi DNA polymerase was measured. As type 10, 10 ⁇ g activated calf thymus DNA was used. The pH of the buffer at 75 ° C is pH 5.0.
  • an enzyme sample of which activity is to be measured 0.05U (calculated by the method for measuring the incorporation activity described in Example 6- (1)), the type II, the buffer, 10 mM KC1, 6 mM (NH 3) S
  • FIG. 2 shows the relationship between the activity measured by the above activity measurement method and the pH.
  • the activity at pH 6.0 75 ° C. is defined as 100%.
  • Tks, Tce and Tsi DNA polymerases had an optimal pH of 5.5 to 6.5 (75 ° C) when activated calf thymus DNA was used as type ⁇ . have.
  • a PCR reaction was performed using ⁇ -DNA as a ⁇ ⁇ -type.
  • the composition of the reaction mixture for Tks, Tee and Tsi DNA polymerases was the buffer attached to IX K ⁇ D plus DNA polymerase, 200 / iM dNTP, ImM (NH) SO, and the reaction mixture for K ⁇ D DNA polymerase.
  • the composition of the reaction solution was 1 x KOD DNA polymerase, buffer solution attached, 200 ⁇ ⁇ dNTP, lmM MgCl, lng / 50 l ⁇ -DNA (Takara Shuzo) 10 pmol / 50 / i l primer
  • primer lambda-1 and primer lambda_9B are shown in SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39 in the sequence listing, respectively.
  • 3 ⁇ l of the reaction mixture was subjected to agarose gel electrophoresis.
  • the amplified DNA fragment was confirmed by ⁇ mbromide staining. As a result, amplification of the DNA fragment was not observed in the case where KOD DNA polymerase was used.
  • Tks, Tee, and Tsi DNA polymerases have approximately 12 kilobase pairs with any DNA polymerase. Amplification of the DNA fragment was confirmed.
  • Tsi DNA polymerase preparation prepared in Example 6 800 ⁇ l of PBS was added to each of the 200 / ig (100 / il) products, and emulsified with 1 ml of Freund's “Complete” Agieban MDif co Lab.) To give an antigen preparation.
  • Each of these antigen preparations was aliquoted into four Balb / c mice (10-week-old female, manufactured by Nippon Tale) intraperitoneally.
  • an antigen preparation was prepared by adding PBS 900 / il and Rivi's adjuvant (manufactured by RIBI) to the same amount of the DNA polymerase preparation as described above, and divided equally into each mouse. A booster immunization was performed. Further, 6 weeks after the first antigen administration, an antigen preparation was prepared by adding 900 ⁇ l of PBS to the same amount of each DNA polymerase preparation as described above, and divided equally into mice of each group and intraperitoneally administered. The last immunization was performed.
  • Example 8- (1) Using a solution (5 ⁇ g / ml) of each DNA polymerase preparation used as an antigen in Example 8- (1), a 96-well plate coated with each DNA polymerase was prepared. From the cells obtained by the above cell fusion, a supernatant was collected from a well in which cell growth was observed, and an ELISA method was performed on the DNA polymerase-coated plate described above, and anti-DNA polymerase in the culture supernatant was obtained. The presence or absence of the antibody was tested. This assay was performed on more than 900 cell lines obtained using each DNA polymerase as an antigen. Strains (Tks DNA polymerase: 95 strains, Tee DNA polymerase: 103 strains, Tsi DNA polymerase: 61 strains) determined to produce antibodies by this operation were selected.
  • the selected cell line was cultured as an original cell line, and the inhibition of the polymerase activity of each DNA polymerase at 42 ° C was confirmed in the culture supernatant.
  • the inhibitory activity was measured by using anti-mouse IgG magnet beads (to which IgG was bound in the culture supernatant of each hybridoma).
  • Tks DNA polymerase 1 strain
  • Tee DNA polymerase 2 strains
  • Tsi DNA polymerase 2 strains
  • Tks DNA polymerase 1 strain
  • Tee DNA polymerase 2 strains
  • Tsi DNA polymerase 2 strains
  • the antibodies against Tks and Tee DNA polymerase were IgG2b type
  • the antibodies against Tsi DNA polymerase were IgGl type and G2b type.
  • a polypeptide having DNA polymerase activity suitable for primer extension and having high fidelity useful in any of cloning, sequencing and nucleic acid amplification, a gene encoding the polypeptide, and the DNA A method for producing a polypeptide having polymerase activity is provided.
  • the polypeptide having the DNA polymerase activity of the present invention for example, an amplification product having a low error rate can be obtained even when the number of cycles in PCR is large. Therefore, it is useful for analysis and identification of target nucleic acids having a low copy number.
  • SEQ ID No: l Designed oligonucleotide primer TPPolBF4 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
  • SEQ ID No: 2 Designed oligonucleotide primer TPPolBF5 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
  • SEQ ID No: 3 Designed oligonucleotide primer TTPolBRl to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
  • SEQ ID No: 4 Designed oligonucleotide primer TTPolBR4 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
  • SEQ ID No: 6 Designed oligonucleotide Tag sequence region to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
  • SEQ ID No: 17 Designed oligonucleotide primer TPPolBFl to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
  • SEQ ID No: 18 Designed oligonucleotide primer TTPolBR5 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
  • SEQ ID No: 40 Designed oligonucleotide primer lambda- 10D to amplify a DNA of bacteriophage lambda

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Abstract

　遺伝子工学用試薬として有用な高Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドの製造方法、さらに該ポリペプチドを用いた核酸の増幅方法。

Description

明 細 書
DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、遺伝子工学用試薬として有用な高 Fidelity DNAポリメラーゼ活性を 有するポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドの製造 方法、さらに該ポリペプチドを用いた核酸の増幅方法に関する。
背景技術
[0002] DNAポリメラーゼは遺伝子工学用試薬として有用な酵素であり、 DNA塩基配列決 定法、標識化、部位特異的変異導入法などに広く利用されている。また最近ではポリ メラーゼ チェーン リアクション（PCR)法の開発により、耐熱性 DNAポリメラーゼが 注目を集め、 PCR法に適した種々の DNAポリメラーゼが開発され、商品化されてい る。
現在知られている DNAポリメラーゼはそのアミノ酸配列の共通性から大きく 4つの ファミリーに分類することができ、中でもファミリー A (ポル I型酵素）とファミリー B ( a型 酵素）が大多数を占めている。それぞれのファミリーに属する DNAポリメラーゼは概 ね類似した生化学的特性を有しているが、詳細に比較すると個々の酵素によって基 質特異性、基質アナログの取込み、プライマー伸長性の強さ及び速度、 DNA合成 の様式、ェキソヌクレアーゼ活性の付随、温度、 pHなどの至適反応条件、また阻害 剤に対する感受性などについて異なる性質を有している。したがってこれまで実験操 作に応じてそれぞれ現存する中で最も適した性質を有する DNAポリメラーゼが選ば れ利用されている。
例えば、 Pyrococcus furiosus (Pfu)由来 DNAポリメラーゼ（例えば、特許文献 1 〜5参照）は、最も耐熱性の高い DNAポリメラーゼのひとつであり、校正（Proofread ing)活性として知られる 3'→5 'ェキソヌクレアーゼ活性を持ち、耐熱性酵素の中でも 高い Fidelityを示す。しかしながら当該酵素は、伸長速度が遅ぐ processivityが低 いため、 PCRに使用すると増幅に時間がかかり、また長鎖は増幅できないという問題 を有している。 [0003] また、最近では、 K〇D DNAポリメラーゼと呼ばれる、 Pfu由来 DNAポリメラーゼ よりも高い 3'→5 'ェキソヌクレアーゼ活性を持ち、伸長速度が速く processivityの高 レ、ポリメラーゼが市販されている。 （例えば、特許文献 6〜7、非特許文献 1参照）。当 該酵素を用いて正確性の高い PCRを短時間で行うことが可能である力 S、強い 3'→5' ェキソヌクレアーゼ活性により primerや増幅産物が分解されてしまうため反応の条件 設定が比較的難しぐまた長鎖の増幅には向いていないという問題を有している。
[0004] さらに、 KOD DNAポリメラーゼを改良した 2種の酵素も開発されている。その一 つである KOD— Plus— DNAポリメラーゼは、 KOD DNAポリメラーゼに 2種類の モノクローナル抗体を加え、常温下におけるポリメラーゼ活性、 3' _ 5'ェキソヌクレア ーゼ活性を抑えることにより特別な操作なしでホットスタート PCRが可能となっている 。また反応 Buffer組成を至適化することにより、高レ、 Fidelityはそのままで K〇D D NAポリメラーゼよりも増幅効率や長鎖長 DNAの合成能力が向上している（例えば、 特許文献 8)。しかしながら、当該酵素の伸長速度は KOD DNAポリメラーゼよりか なり遅ぐ Pfu由来 DNAポリメラーゼと同等程度にまで低下しているという問題を有し ている。
[0005] さらに、 KOD Dash DNAポリメラーゼは、 Barnesらの方法（例えば、特許文献 9 、非特許文献 2参照）に基づいて作られた混合型 DNAポリメラーゼであり、 KOD D NAポリメラーゼと、遺伝子操作によって 3'— 5'ェキソヌクレアーゼ活性を欠失させた 改変型 KOD DNAポリメラーゼを最適な割合で混合することにより、増幅効率、伸 長性が向上している（例えば、特許文献 10参照）。伸長速度も KOD DNAポリメラ ーゼと同様に速い。ただし Fidelityは 3'— 5'ェキソヌクレアーゼ活性が相対的に減 少していることから、 KOD DNAポリメラーゼ単独に比べて格段に低下しているとい う問題を有している。
[0006] 特許文献 1：米国特許第 5489523号明細書
特許文献 2：米国特許第 5545552号明細書
特許文献 3：米国特許第 5866395号明細書
特許文献 4 :米国特許第 6489150号明細書
特許文献 5：米国特許第 5948663号明細書 特許文献 6：米国特許第 6054301号明細書
特許文献 7：米国特許第 6225065号明細書
特許文献 8：米国特許出願公開第 2002/0076768号明細書
特許文献 9：米国特許第 5436149号明細書
特許文献 10 :米国特許第 6008025号明細書
非特許文献 l : Bames W. M.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91 , No. 6 , p. 2216 - 2220 (1994)
非特許文献 2 : Takagi M.，外 7名， Appl. Environ. Microbiol. , vol. 63, No. 11 , p. 4504 -4510 (1997)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の目的は、クローニング、シークェンシング、核酸増幅のいずれにおいても 有用な Fidelityの高い DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド並びに該ポリぺ プチドをコードする遺伝子を提供することにある。また、本発明の他の目的は、当該 D NAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法ならびに、該 DNAポリメラーゼ 活性を有するポリペプチドを用いた核酸の増幅方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは鋭意研究の結果、超好熱性古細菌である Thermococcus属からこ れまでの DNAポリメラーゼにはない優れた性質を有する新規の DNAポリメラーゼ活 性を有するポリペプチドを見出した。さらに、当該活性を有するポリペプチドをコード する遺伝子をクローユングして、該ポリペプチドの製造方法を見出し、本発明を完成 させた。
即ち、
本発明の第 1の発明は、
(a)配列表の配列番号 16に記載のアミノ酸配列、
(b)配列表の配列番号 24に記載のアミノ酸配列、又は
(c)配列表の配列番号 32に記載のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列中の 1ないしは数個 のアミノ酸が欠失、挿入、付カロ、置換したアミノ酸配列を有し、かつ DNAポリメラーゼ 活性を有するポリペプチドに関する。
[0009] 本発明の第 2の発明は、第 1の発明のポリペプチドをコードする核酸に関する。
本発明の第 2の発明の核酸は、配列表の配列番号 15、 23又は 31に記載の塩基 配列あるいはその一部を有する核酸であってもよぐ更には該核酸に相補的な塩基 酉己列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸であり、かつ D
NAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であってもよい。
[0010] 本発明の第 3の発明は、ポリペプチドを産生する能力を有する細胞を培養する工程
、および培養物から該ポリペプチドを採取する工程を包含するポリペプチドの製造方 法に関し、該ポリペプチドは
(a)配列表の配列番号 16に記載のアミノ酸配列、
(b)配列表の配列番号 24に記載のアミノ酸配列、又は
(c)配列表の配列番号 32に記載のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列中の 1ないしは数個 のアミノ酸が欠失、挿入、付カロ、置換したアミノ酸配列を有し、かつ DNAポリメラーゼ 活性を有する。
[0011] 本発明の第 4の発明は、ポリペプチドを用いて核酸を増幅する工程を包含する、核 酸の増幅方法に関し、該ポリペプチドは
(a)配列表の配列番号 16に記載のアミノ酸配列、
(b)配列表の配列番号 24に記載のアミノ酸配列、又は
(c)配列表の配列番号 32に記載のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列中の 1ないしは数個 のアミノ酸が欠失、揷入、付カロ、置換したアミノ酸配列を有し、かつ DNAポリメラーゼ 活性を有する。
[0012] 本発明の第 5の発明は、本発明の第 1の発明のポリペプチドを含有する組成物に 関する。
[0013] 本発明の第 6の発明は、本発明の第 1の発明のポリペプチドを含有するキットに関 する。 [0014] 本発明の第 7の発明は、本発明の第一の発明のポリペプチドに結合する抗体に関 する。
発明の効果
[0015] 本発明により、クローニング、シークェンシング、核酸増幅のいずれにおいても有用 な Fidelityの高い DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド並びに該ポリペプチド をコードする遺伝子ならびに当該 DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドの製造 方法が提供される。本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを用いるこ とにより、例えば、 PCRにおいて多サイクル数であっても、エラー率の少ない増幅産 物を得ることができる。従って、コピー数の少ない標的核酸の解析.同定において有 用である。
図面の簡単な説明
[0016] [図 1]DNAポリメラーゼの活性と反応温度との関係を示す図である。図中、◊は Tks
DNAポリメラーゼ、△は Tee DNAポリメラーゼ、〇は Tsi DNAポリメラーゼにつ いての結果を示す。
[図 2]DNAポリメラーゼの活性と pHとの関係を示す図である。図中、◊は Tks DNA ポリメラーゼ、△は Tee DNAポリメラーゼ、〇は Tsi DNAポリメラーゼについての 結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 本明細書において DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドとは、 4種類のデォ キシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP)を铸型 DNAの塩基配 列にしたがって取り込み、铸型 DNAに相補的な DNA鎖の重合を触媒するポリぺプ チドのことを言う。
[0018] 本明細書においてプライマー伸長に適しているとは、 1本鎖の铸型 DNAにプライ マーがアニーリングした複合体を基質としてプライマーから DNAを合成していく能力 におレ、て優れてレ、る事を言い、例えば一本鎖 DNAに対する親和性が高レ、事が挙げ られる。一本鎖 DNAに対する親和性が高い DNAポリメラーゼは、核酸増幅反応に おいて高い感度を示す事が期待できる。すなわち、コピー数の少ない铸型核酸から の核酸増幅反応において有用である。 DNAポリメラーゼの一本鎖 DNAに対する親 和性を示す指標としては、例えば Ml 3ファージの一本鎖 DNAに対する Km値が挙 げられ、該 Km値は 2· 5 /i g/ml以下である事が好ましぐ 2. O g/ml以下である ことがより好ましぐ 1. 5 /i g/ml以下であることが更に好ましい。
[0019] 本明細書において Fidelity (忠実度）が高いとは、 DNAポリメラーゼの DNA合成 反応における塩基取り込みの正確性が高いことを言う。その測定方法としては、 Kun kel法 i. Biol. Chem. 1985 May 10 ; 260 (9) : 5787— 96. )、シークェンシ ング法、 Clineらの方法（Nucleic Acids Res. 1996 Sep 15； 24 (18)： 3546 - 51. )などが例示される。その中でもシークェンシング法が最も信頼性が高い。本 発明を特に限定するものではないが例えば、 Thermus thermophilus HB— 8の ゲノム DNAを铸型として各 DNAポリメラーゼで PCRを行レ、、当該増幅産物をべクタ 一 PUC118にクローニング後、得られた複数クローン中の増幅断片約 500bpについ てその塩基配列を確認し、エラーと思われる塩基の数を確認し、全シークェンシング 塩基数に対するエラーの塩基数の％を求め、 Fidelityの評価を行う事ができる。
[0020] 以下、本発明を詳細に説明する。
(1)本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコ ードする遺伝子
本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、 Pfu由来 DNAポリメラー ゼ、 KOD由来 DNAポリメラーゼと比較してプライマー伸長に適した、さらに DNA合 成時の正確性に優れたポリペプチドである。また、本発明の DNAポリメラーゼ活性を 有するポリペプチドは、代表的な高 Fidelity耐熱性 DNAポリメラーゼである Pfu由来 DNAポリメラーゼの Pyrobest DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、 K〇D DNA ポリメラーゼ、 KOD dash DNAポリメラーゼ並びに KOD plus DNAポリメラーゼ (いずれも東洋紡社製）に比較し、 PCR法において増幅できる DNAの鎖長やその反 応の Fidelityとレ、う観点にぉレ、て優れてレ、る。
[0021] 本発明の DNAポリメラーゼの理化学的性質は、以下の通りである。
(ィ）分子量： SDS_ PAGE法により約 85— 90キロダルトンである。
(口）至適温度： 75°C〜85°C
(ハ）至適 pH : 5. 5〜6. 5 (75°C) [0022] 本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、上記理化学的性質を有 しているものであれば特に限定はされないが例えば、 Thermococcus sp. KS— 1 ( ^Λ 、 Tksと禾尔す)、 Thermococcus sicun (以 、 Tsiと禾尔す)、 Thermococcus celer (以下、 Teeと称す）から得ることができる。
[0023] 本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列表の配列番号 16、 2 4又は 32に示されるアミノ酸配列からなる力 \あるいはこれと実質的に同等の活性を 有する機能的同等物であってもよい。天然に存在するポリペプチドにはそれをコード する遺伝子の多形や変異の他、生成後のポリペプチドの生体内および精製中の修 飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、揷入、付カロ、置換等の変 異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の 生理学的活性、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造 的に差異があってもその機能や活性については大きな違いが認められない機能的 同等物も本発明に包含される。ここで変異したアミノ酸の数は、ポリペプチドが実質的 に同等の生理学的活性、生物学的活性を示すものであるかぎり特に限定されるもの ではないが、 1以上、例えば 1ないしは数個、より具体的には 1〜： 10個の変異（欠失、 挿入、付カロ、置換等）などが例示される。また、人為的にポリペプチドのアミノ酸配列 に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変 異体を作製することが可能である。
[0024] さらに、遺伝子工学的にポリペプチドの生産を行う際には融合ポリペプチドとして発 現させることがしばしば行われる。たとえば目的ポリペプチドの発現量を増加させるた めに N末端に他のポリペプチド由来の N末端ペプチド鎖を付加したり、 目的ポリぺプ チドの N末端、あるいは C末端に適当なペプチド鎖 (例えばヒスチジン一タグやグルタ チオン一 S—トランスフェラーゼ等）を付加して発現させ、このペプチド鎖に親和性を 持つ担体を使用することにより目的ポリペプチドの精製を容易にすることなどが行わ れている。したがって本発明の DNAポリメラーゼとは一部異なったアミノ酸配列を有 する DNAポリメラーゼであっても、それが本発明の DNAポリメラーゼと本質的に同 等の活性を示す限りにおいて、該酵素は「機能的同等物」として本発明の範囲内に 属するものである。 [0025] 本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNAとしては、 配列表の配列番号 16、 24又は 32に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の 全部又は一部を含む DNA、例えば、配列表の配列番号 15、 23又は 31に示される 塩基配列の全部又は一部を含む DNAが挙げられる。また、配列番号 16、 24又は 3 2のアミノ酸配列において、 1以上の例えば 1ないしは数個、より具体的には 1〜： 10個 のアミノ酸が欠失、揷入、付加または置換などされたアミノ酸配列からなり、かつ上記 DNAポリメラーゼとしての機能を有するポリペプチドをコードする DNAも挙げられる 。また、さらにこれらの DNAに相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条 件下でハイブリダィズ可能で、かつ上記 DNAポリメラーゼとしての機能を有するポリ ペプチドをコードする塩基配歹 IJも本発明の範囲内である。ここで、「ストリンジェントな 条件」とは、例えばプローブとともに 0. 5%SDS、 5 X Denhardt' s, 100 x gZml変 性サケ精子DNAを含む6 X SSC (1 X SSCは0. 15M NaCl、 0. 015Mクェン酸 ナトリウム、 ρΗ7· 0を示す）中、 68°Cにて 12〜20時間インキュベートする条件を言う 。プローブにハイブリダィズした DNAは、例えば 0. 5%SDSを含む 0. 1 X SSC中、 68°Cにて洗浄を行った後に検出する事ができる。
[0026] さらに、本発明の遺伝子は、ポリペプチドの翻訳後に自発的に前記ポリペプチドより 切り出されるインティンと呼ばれる領域をコードする配列を含む事がある。このような 配列を含む DNAも、 DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする限り、 本発明に包含される。
[0027] ここで、「DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド」とは、特に限定はされないが 例えば、前記に示された各種の理化学的性質を示す DNAポリメラーゼ活性を有す るポリペプチドが好ましい。
[0028] ここで本明細書に記載の「アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む DNA」なる用 語にっレ、て説明する。遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（3つの塩基の組み合わ せ）はアミノ酸の種類ごとに:!〜 6種類ずつが存在することが知られている。従って、あ るアミノ酸配列をコードする DNAは、そのアミノ酸配列にもよるが多数存在することが できる。
さらに、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは種 々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。たとえば遺伝子工学的なポ リペプチドの生産において、 目的のポリペプチドをコードする本来の遺伝子上で使用 されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合にはポリペプチドの 発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を 与えることなぐコドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、 目 的ポリペプチドの高発現を図ることが行われている（例えば、特公平 7— 102146号 公報)。このように特定のアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子は、人為的に作 製可能なことは言うまでもなぐ 自然界においても生成されうるものである。従って本 発明中に開示された塩基配列と同一の塩基配列を有する遺伝子ではなくても、それ が本発明中に開示されたアミノ酸配列をコードする限り該遺伝子は本発明に包含さ れるものである。
[0029] 本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、試験管内でのプライマ 一伸長に適している。例えば、一本鎖 DNAにプライマーがアニーリングした形の基 質（Ml 3の一本鎖 DNAに配列表の配列番号 33記載の HTプライマーがァニーリン グした基質、以下 M13/HT Primer基質、又はプライマー伸長型基質と称すること がある）を用いて DNAポリメラーゼ活性を測定した場合には、通常の活性測定に用 レ、られる活性化 DNA (DNase I処理仔牛胸腺 DNA)に比べて高レ、ヌクレオチド取 り込み活性が得られる。
[0030] なお、上記の M13/HT Primer基質を用いて測定された DNAポリメラーゼ活性
(以下、伸長活性と称する事がある）と活性化 DNAを基質として用いて測定された D NAポリメラーゼ活性 (以下、取込活性と称することがある）の比（伸長活性/取込活 性）は、既知のピロコッカス フリオサス由来 DNAポリメラーゼ（Pfu DNAポリメラー ゼ，ストラタジーン社製）ゃサーマス アクアティカス（Thermus aquaticus)由来の Taq DNAポリメラーゼ（TaKaRa Taq,タカラバイオ社製）、サーモコッカス コダ カラェンシス (Thermococcus kodakaraensis)由来の KOD DNAポリメラーゼ( KOD DNAポリメラーゼ，東洋紡社製）に比べて、本発明の DNAポリメラーゼ活性 を有するポリペプチドは高い値を示す。
[0031] 更に、上記の M13ZHT Primer基質を用いた反応系中に競合基質となる活性 化 DNAを加えた場合には、上記 3種の DNAポリメラーゼのプライマー伸長活性は 強く阻害されるのに対して、本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは より軽度の阻害しか受けず、該ポリペプチドがプライマー伸長型の基質に高い親和 性を持つことが示される
[0032] また、本願発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、 Ml 3ファージの 一本鎖 DNAに対する Km値が 2 μ g/ml以下であることからも、該ポリペプチドがプ ライマー伸長型の基質に高い親和性を持つことが示される。
[0033] (2)本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法
本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、 Tks、 Tsi、また は Teeの菌株培養物から、あるいは当該ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した 形質転換体から大量生産することが可能である。
[0034] 本発明のポリペプチドをコードする DNAの取得は、本発明のポリペプチドを生産す る微生物のゲノム DNAを出発材料として実施することができる。前記のゲノム DNA を調製する方法としては、特に限定はされないが例えば、 Thermococcus属古細菌 を、 85°Cで嫌気培養し、増殖した菌体を破砕して DNAを抽出、精製する方法が挙 げられる。また得られた DNAを制限酵素で切断する方法等遺伝子クローニングに使 用される種々の操作には公知の方法を用いる事ができ、当該方法の詳細は 2001年 コールドスプリングハーバー ラボラトリー発行、 J.サムブルックひ. Sambrook)ほ力 著、モレキュラー クローニング，ァ ラボラトリー マ二ユアノレ 第 3版（Molecular C lomng, A Laboratory Manual)に己載 れ飞レヽる。
[0035] 本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、 DNAポリメラーゼ活性を 有するポリペプチドをコードする核酸、特に限定はされないが例えば配列表の配列 番号 15、 23又は 31記載の塩基配列を有する核酸又はその一部が組み込まれた組 換えプラスミドで形質転換された形質転換体を適切な培養条件、例えば大腸菌を宿 主とする場合には、 LB培地（トリプトン 10g/リットル，酵母エキス 5g/リットル， NaCI 5g/リットル， pH7. 2)中で培養することにより、その菌体内に発現させることができ る。該ポリペプチドは上記の培養菌体より、たとえば超音波処理、熱処理、および陽 イオン交換カラム、ァフィ二ティ担体カラム、ゲル濾過カラムあるいは陰イオン交換力 ラムなどを用いたクロマトグラフィーを行うことにより、得ること力 Sできる。
このようにして得られた本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、 S DS— PAGE上で約 85— 90ダルトンを示す。
[0036] また、本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、トリス緩衝液中、 75 °Cにおいて pH5. 5〜6. 5の至適 pHを示す。また、該 DNAポリメラーゼの酵素活性 を種々の温度で測定した場合に 75°C〜85°Cで高い活性を示す。また、本発明の D NAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは高い熱安定性を有している。
[0037] さらに本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、 3 '→5 'ェキソヌク レアーゼ活性が付随しており、 DNAポリメラーゼ活性に対するェキソヌクレアーゼ活 性の強さは、その活性が強いために DNA合成の正確性が非常に高いことが知られ ている Pfu DNAポリメラーゼの活性比を越えている。また、本発明の DNAポリメラ ーゼ活性を有するポリペプチドについて測定された DNA合成反応中に起こる誤りの 頻度は、 Pfu由来 DNAポリメラーゼのものよりも低い。上記した種々の性質は本発明 の DNAポリメラーゼが PCR法などの遺伝子工学用試薬として非常に優れたものであ ることを示すものである。
[0038] (3)本発明の DNAポリメラーゼを用いた核酸の増幅方法、該方法のための組成物な らびにキット
本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは Fidelityが高ぐプライマ 一伸長に適しているという特徴を有し、当該ポリペプチドを用いることにより、標的核 酸の正確な増幅、解析、同定を行う方法、該方法のための組成物ならびにキットが提 供される。
[0039] 上記特徴により、本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを PCR法に 使用した場合には極めて優れた性能を示す。例えば、 PCR法に利用されるサーモコ ッカス コダカラエンシス由来の DNAポリメラーゼ（K〇D DNAポリメラーゼ、東洋紡 社製）は、単独では 6キロ塩基対以上の DNA断片を増幅することは困難であり、他の DNAポリメラーゼと組み合わせることによってのみ 15キロ塩基対以上の DNA断片 の増幅を行なうことができる。これに対して本発明の DNAポリメラーゼを使用した場 合には、他の酵素の添カ卩なしに該酵素単独で 15キロ塩基対の DNA断片の増幅が 可能である。
[0040] さらに、従来の DNAポリメラーゼゃ複数の DNAポリメラーゼを含有する組成物、例 えば KOD DNAポリメラーゼを含む組成物ならびにキット、また KOD dash DNA ポリメラーゼを含む組成物ならびにキット、さらに、 K〇D plus DNAポリメラーゼを 含む組成物ならびにキットに対しても、標的核酸の正確な増幅、解析、同定を行うこ とが出来る点で本発明のポリペプチドを含む組成物ならびにキットは優れている。
[0041] 上記の組成物及びキットとしては、本発明の DNAポリメラーゼ活性を有するポリべ プチド、該ポリペプチドに至適化された緩衝液、 4種の dNTP、及び 2価陽イオンを含 むものが例示され、更に標的核酸を増幅及び/又は検出する為のプライマーセット を含んでいても良い。
[0042] 本発明により、本発明のポリペプチドに結合する抗体が提供される。前記抗体は本 発明のポリペプチドを認識し、特異的に結合する能力を有するものであれば特に限 定はなぐポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよレ、。さらに、 前記抗体と同様の認識特性を有する抗体断片 (例えば Fabフラグメント等）、一本鎖 抗体等も本発明に包含される。
[0043] 本発明の抗体は公知の方法、例えば 1992年、ジョン.ワイリー &サンズ社 iohn Wiely & Sons, Inc. )発行、カレント'プロトコルズ'イン'ィムノロジー（Current Protcols in Immunology)に記載の方法により、本発明のポリペプチドまたはそ の一部を抗原としてマウスやゥサギを免疫することにより作製することができる。さらに 、常法にしたがって前記の免疫動物より採取した抗体産生細胞をもとにハイプリドー マを作製することにより、モノクローナル抗体を作製することもできる。
[0044] 上記の抗体は、本発明のポリペプチドの検出や精製に使用することができる他、該 ポリペプチドの保持する活性、例えば DNAポリメラーゼ活性や 3'→5 'ェキソヌクレア ーゼの阻害に使用することができる。 DNAポリメラーゼ活性を抑制する能力を有する 抗体は、例えば PCRにおいて、反応開始前の低温時に非特異的にアニーリングした プライマーからの DNA伸長の抑制に有用である。また、 3 '→5 'ェキソヌクレアーゼ 活性を抑制する能力を有する抗体は、例えば PCRにおいて、反応開始前のプライマ 一分解の抑制に有用である。 実施例
[0045] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例 に限定されるものではない。
[0046] 実施例 1
本実施例の DNAポリメラーゼの活性測定に使用する活性化 DNAは以下の方法 で調製した。
すなわち、サケ精子 DNA (シグマ社製）あるいは仔牛胸腺 DNA (ワージントン社製 )を DNasel処理によって活性化した。当該方法は、ハーバー アンド ロー社発行、 D. R. Davis編集の DNA polymerase from Escherichia coll 第 2り 3— 27り 頁（C. C.リチャードソン著）に記載の方法に基づくものである。
[0047] また、 DNAポリメラーゼの活性測定は、以下の方法で行なった。
すなわち、活性測定しょうとする試料を活性測定用反応液（20mM トリスー塩酸緩 衝液 ρΗ8· 3、 10mM 塩ィ匕カリウム、 6mM 硫酸アンモニゥム、 2mM 塩化マグ ネシゥム、 0. 1 %トライトン X— 100、 0. 001 %牛血清アルブミン、各 200 μ Μ dAT P、 dGTP、 dCTP、 100 μ M dTTP、 0. 238 μ M 「 」—Methyl TTP、 0. 4m g/ml活性型サケ精子 DNA) 50 x l中、 74°C、 5分間反応させた。
反応終了後、 2%Nappi (ナカライ社製）を含む 20%トリクロ口酢酸 (TCA)を 500 μ 1、 sheared DNAを 500 μ 1添加し、氷上で 15分以上放置した後、グラスフィルター (ワットマン社製）に捕集した。次に 5mlの 2。/0Nappiを含む 5。/0TCAで 7回洗浄した 後、エタノールで洗浄し、グラスフィルターを乾燥し、放射活性を液体シンチレーショ ンカウンターで測定した。上記の酵素活性測定方法によって 30分間に lOnmolの全 ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を酵素 1Uとした。
[0048] 実施例 2
サーモコッカス（Thermococcus) sp. KS _ 1株（JCM1 1816)、サーモコッカス セラー (Thermococcus celer、 JCM8558)、サーモコッカス シクリ (Thermococ cus siculi、 DSMZ12349)について以下の方法でゲノム DNAを調製した。
すなわち、購入した培養液 10mlを、 8000rpm、 10分間遠心分離した。得られた上 清および上清と沈殿の界面にある黒層をさらに 15000rpm、 10分間遠心後、得られ た沈殿に 0. 8mlの 20%ショ糖、 50mM トリス—塩酸緩衝液（ρΗ8· 0)に懸濁し、 0 . 16mlの 500mM EDTA(pH8. 0)、 0. 08mlの 10mg/ml塩ィ匕ジゾチーム（ナカ ライテスタ社製)水溶液を加えて、室温で 2時間反応させた。
反応終了後、この反応液に 6. 4mlの 150mM NaCl、 ImM EDTA、 20mM ト リス— HC1緩衝液（pH8. 0)、 0. 08mlの 20mg/mlプロティナーゼ K (タカラバイオ 社製）及び 0. 4mlの 10。/oラウリル硫酸ナトリウム水溶液をカ卩え、 37°Cで 1時間保温し た。次いでこれに等量の lOOmM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 0)飽和フエノール/ク 口口ホルム Zイソアミルアルコール混合液（25 : 24 : 1、 v/v)を加えて 10分間緩や力 ^ に混合した後、更に 10分間遠心（10000 X g)を 2回行った。遠心終了後、得られた 上清をエタノール沈殿後、 0. 1mlの TE緩衝液に溶解してゲノム DNA溶液を得た。
[0049] 実施例 3
(l) DNAポリメラーゼ遺伝子中央部のクローニング
様々な耐熱性 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の間で保存されてレ、る部分をもとに して配列表の配列番号 1〜4記載のオリゴヌクレオチド TPPolBF4、 TPPolBF5、 TT PolBRl並びに TTPolBR4を DNA合成機で合成した。
次に上記実施例 2で調製したサーモコッカス sp. KS— 1由来ゲノム DNA250ng を铸型にして、 50pmolの TPPolBF4と 50pmolの TTPolBRl、 50pmolの TPPolB F4と 50pmolの TTPolBR4、 50pmolの TPPolBF5と 50pmolの TTPolBRlのプラ イマ一の糸且み合わせで、 ΙΟΟ μ Ιの容量で PCRを行った。 PCRにおいて DNAポリメ ラーゼはタカラ ExTaq (タカラバイオ社製）を添付のプロトコールに従って用レ、、 PCR は 94°C、 3分間反応後、 94°C 30秒、 50°C 30秒、 72°C 2分を 1サイクルとする、 40サイクル反応を行った。
反応終了後、それぞれの反応液をフヱノール処理した後、マイクロコン— 100 (タカ ラバイオ社製）で、プライマーを除去すると同時に増幅 DNA断片の濃縮を行った。
[0050] 濃縮した 3kbの TPPolBF4_TTPolBRl増幅断片、 2kbの TPPolBF4_TTPol BR4増幅断片、 0. 7kb TPPolBF5_TTPolBRl増幅断片についてダイレクトシ 一クェンシングを行レ、塩基配列を決定し、様々な耐熱性 DNAポリメラーゼのアミノ酸 酉己列と比較した。その結果、サーモコッカス sp. KS— 1 DNAポリメラーゼがインテ イン配列を含むことが明らかになった。
[0051] (2) DNAポリメラーゼ遺伝子上流部分のクローニング
上記実施例 3—（1 )で得られた塩基配列をもとに上流をクローニングするための特 異的なオリゴヌクレオチド TksO l (配列表の配列番号 5)を合成した。さらに、下記表 1 に示す 32種類のプライマーを合成した。表 1中のタグ配列を配列表の配列番号 6に 示す。
[0052] [表 1]
5 J -タグ配列- - N N - S S S S S s S 3
( N ； G、 A、 T、 Cの ミ ソクス sは下記に示す塩基配列である。 )
番号 塩基配列 番号 塩基配列 番号 塩基配列
1 g c c c a a a 1 3 g c c g t a t 2 5 g t g g a c a
2 g c t c a t a 1 4 g g g a t t t 2 6 g t c c c a a
3 g t g g c g a 1 5 g t c a a g c 2 7 g c t g c t a
4 g a a a g c c 1 6 g c g t t a t 2 8 g g c g g g c
5 g a g g t a g 1 7 g g g c a a g 2 9 g c c g t c g
6 g c t t t t g 1 8 g a t c a t c 3 0 g a a c c g t
7 g t a t c c g 1 9 g t a g c g g 3 1 g t t c c a c
8 g g a c g g t 2 0 g c g t g c t 3 2 g g t g c a g
9 g c a a a a c 2 1 g c g t t c a
1 0 g a t c a t c 2 2 g g g c g a a
1 1 g t g c c g c 2 3 g t c t t c a
1 2 g c g g g c g 2 4 g g g t a a a
[0053] 実施例 2で調製したサーモコッカス sp. KS— 1由来ゲノム DNAlngを铸型にして 、 1 Opmolの TksO 1と各 1 Opmolの表 1記載 32種類のプライマーとの組み合わせで 2 OmM トリスー酢酸緩衝液（ρΗ8 · 5)、 50mM 酢酸カリウム、 3mM 酢酸マグネシ ゥム、 0 · 01 %BSA、各 300 /i M dNTP混合物、 1. 25Uのタカラ ExTaq DNAポ リメラーゼ (タカラバイオ社製）を含む 50 μ 1反応液中で PCRをおこなった。 PCRは 94 °C 3分インキュベートした後、 98°C 10秒、 50°C 10秒、 72°C 40秒を 1サイクノレと する、 40サイクル反応を行った。得られた PCR産物の一部をァガロース電気泳動し、 シングノレバンドになったものを選び出し、それらの反応液をマイクロコン一 100 (タカラ バイオ社製）で、プライマーを除去すると同時に濃縮し、ダイレクトシークェンスを行い 、 DNAポリメラーゼの上流部分を含む断片をスクリーニングした。その結果、約 1300 bpの PCR増幅断片 Tks012Gに目的の DNAポリメラーゼ遺伝子の上流が含まれて レ、ることがわかった。また、この断片に実施例 3 _ ( 1 )とは、異なるインティン配列が含 まれてレ、ることも確認できた。
[0054] さらに上流スタートコドン周辺をクローニングするために Tks012Gの配列をもとに特 異的なオリゴヌクレオチド Tks04 (配列表の配列番号 7)を合成した。実施例 2で調製 したサーモコッカス sp. KS— 1由来ゲノム DNAlngを錡型にして、 lOpmolの Tks 04と各 lOpmolの表 1記載 32種類のプライマーとの組み合わせで上記の 50 μ 1反応 液中で PCRをおこなった。 PCR条件及び精製操作は、上記条件と同様にした。得ら れた増幅断片のダイレクトシークェンスを行レ、、 DNAポリメラーゼの上流含む断片を スクリーニングした。その結果、約 1800bpの PCR増幅断片 Tks041Bに目的の D NAポリメラーゼ遺伝子のスタートコドン周辺が含まれていることがわかった。
[0055] (3) DNAポリメラーゼ遺伝子下流部分のクローニング
上記実施例 3—（1)で得た塩基配列をもとに上流をクローニングするための特異的 なオリゴヌクレオチド Tks02 (配列表の配列番号 8)を合成した。次に実施例 2で調製 したサーモコッカス sp. KS— 1由来ゲノム DNAlngを铸型にして、 lOpmolの Tks 02と各 lOpmolの表 1記載 32種類のプライマーとの組み合わせで PCRを行った。 P CR条件は前記条件と同様にして行った。得られた PCR産物の一部をァガロースゲ ノレ電気泳動し、その中の Tks022Dの約 2500bp DNA断片を回収し、 T4 DNA ポリメラーゼ (タカラバイオ社製）を用いて末端を平滑化した後、 Hindi (タカラバイオ 社製）で消化した pUCl 18 (タカラバイオ社製）に T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ社 製）を用いて連結し、該プラスミドを用いて大腸菌 JM109を形質転換した。さらに形 質転換体を培養し、約 2500bpの DNA断片が挿入されたプラスミド pTks022Dを得 、挿入された DNA断片の塩基配列を決定した。
[0056] (4) DNAポリメラーゼ発現させるためのプラスミドの構築
サーモコッカス sp. KS _ 1 DNAポリメラーゼが配列中に 2箇所インティン配列を 含むことが明らかになった。
そこで、インティン配列を除去した DNAポリメラーゼ遺伝子を構築した。 実施例 3— (3)で得られた配列をもとに配列表の配列番号 9〜： 14記載のオリゴヌク レオチド、 TksNde、 TkslEndBg、 Tks2StaBg、 Tks2EndBal、 Tks3StaBalおよ び TksBgPsを合成した。 次に実施例 2で調製したサーモコッカス sp. KS— 1由来ゲノム DNAlOOngを铸 型にして 20pmolの TksNdeと 20pmolの TkslEndBg (TksA)、 20pmolの Tks2St aBgと 20pmolの Tks2EndBal (TksB)、 20pmolの Tks3StaBalと 20pmolの TksB gPs (TksC)のプライマー組み合わせで、 ΙΟΟ μ Ιの容量で PCRを行った。 PCRにお いて DNAポリメラーゼは Pyrobest (タカラバイオ社製）を添付のプロトコールに従つ て用レヽ、 94。C 30禾少、 50°C 30禾少、 72°C 3分を 1サイクノレとする、 40サイクノレ反応 を行レヽ、約 1. 3kbの TksA、約 0. 3kbの TksB、約 0. 9kbの TksC 各 DNA増幅断 片を得た。さらに、同様の方法で上記 PCR反応液 TksB 1 μ 1と PCR反応液 TksC Ι μ ΐを ぜたものを鏡型にして、 20pmolの Tks2StaBgと 20pmolの TksBgPs (Tk sD)プライマーを用いて、 ΙΟΟ μ Ιの容量で上記条件で PCRを行レ、、約 1. 2kbの Tks D DNA増幅断片を得た。
得られた TksA DNA断片は制限酵素 Ndelと Bglllで、 TksD DNA断片は制限 酵素 Bglllと Pstlで消化した後、制限酵素 Ndelと Pstlで消化した pTV119Nd (pTV 119Nの Ncolサイトを Ndelサイトに変換したもの）と常法によりライゲーシヨンし、プラ スミド pTks59を構築した。当該プラスミドは、 pTks59と命名、表示され、平成 16年 5 月 14日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター ( 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305— 8566) )に FER M BP— 10312として寄託されている。
[0057] (5) DNAポリメラーゼ遺伝子を含む DNA断片の塩基配列の決定
実施例 3— (4)で得られた pTks59の挿入 DNA断片の塩基配列をジデォキシ法に よって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、 目的の DNAポリメラーゼをコードすると 考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフ レームの塩基配列を配列表の配列番号 15に示す。また、該塩基配列から推定される RNaseHIIのアミノ酸配列を配列表の配列番号 16に示す
[0058] (6)サーモコッカス sp. KS— 1 DNAポリメラーゼ遺伝子の発現
pTks59で形質転換された大腸菌 JM109を 100 μ gZmlのアンピシリンを含む 5m 1の LB (1%トリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%塩化ナトリウム）培地に植菌し、 37 °Cで 6時間した培養液 50 β 1を 100 μ g/mlのアンピシリンおよび ImM IPTGを含 む 5mlの LB培地に植菌し、 37°Cで 1晚振盪培養した。培養終了後、遠心分離によつ て集めた菌体を 36 /i lのソニケーシヨンバッファー（50mMトリス一塩酸 ρΗ8· 0、 2m M 2_メルカプトエタノール、 10%グリセロール）に懸濁し、超音波破砕機にかけた 。この破砕液を 12000rpmで 10分間の遠心分離を行レ、、得られた上清を 80°C、 10 分間の熱処理にかけた。その後、再度 12000rpmで 10分の遠心分離を行レ、、上清 を集め、熱処理上清液を得た。
上記で得られた熱処理上清液にっレ、て、実施例 1に記載の方法により酵素活性を 測定した結果、 DNAポリメラーゼ活性が確認できた。
(7)精製 DNAポリメラーゼ標品の調製
実施例 3_ (5)で得られたプラスミド PTks59で形質転換された大腸菌 JM109を 50 μ g/mlのアンピシリン、 0. 1%グルコースを含む 400mlLB培地に植菌し、 37°Cで ー晚振盪培養後、全量を 50 /i g/mlのアンピシリンを含む 20リットル LB培地に添カロ し、 37°Cで OD600力 . 0になるまで培養した。 OD600力 . 0になったら、最終濃 度 0. 2mMになるように IPTGを添加し、さらに 37°Cで 4時間培養した。培養終了後、 遠心分離によって集めた菌体を 732mlのバッファー A〔50mM トリス—塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 2mM EDTA、 2mM ジチオスレィトール、 ImM フエニルメタンスノレ フォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を 12000rpm で 30分間の遠心分離を行った。得られた上清に最終濃度 0. 2Mになるように硫酸ァ ンモニゥム（硫安）を添加し、 75°C、 15分間の熱処理にかけた後、 0°C 30分間放置 し、再度 12000rpmで 30分間の遠心分離を行った。さらに、上清をポリエチレンイミ ンによる除核酸処理、硫安沈殿を行った後、バッファー B〔50mM トリス一塩酸緩衝 液（ρΗ7. 5)、 ImM EDTA、 10%グリセローノレ、 ImM ジチオスレィトール、 lm M フヱニルメタンスルフォニルフルオライド〕 2リットルを外液として、 2時間の透析を 2 回、一晩の透析を 1回行なった。透析後の酵素液 200mlをバッファー Bで平衡化した ホスホセルロース P— 11カラム（ワットマン社製）に供し、 FPLCシステム（アマシャム フアルマシア バイオテク社製）を用いて 0〜500mM リン酸カリウム緩衝液（pH7. 5)直線濃度勾配により溶出した。 [0060] 溶出した DNAポリメラーゼ画分をバッファー C〔20mM トリス—塩酸緩衝液（pH7 . 5)、 0. ImM EDTA、 10%グリセロール、 0· 2%ツイーン 20、 ImM ジチオスレ ィトール〕 1リットルを外液として、 2時間の透析を 2回、一晩の透析を 1回行なった。透 析後の酵素液 100mlをバッファー Bで平衡化したへパリン—セファロース CL_ 6B ( フアルマシア フアルマシア バイオテク社製）に供し、 FPLCシステムを用いて。〜 7 OOmM KC1直線濃度勾配により溶出した。
この画分をバッファー D〔20mMトリス _HCl (pH9. 0)、0. ImM EDTA、 10% グリセロール、 0. 2%ツイーン 20、 ImMジチオスレィトール〕 11を外液として、 2時間 の透析を 2回、一晩の透析を 1回行なった。透析後の酵素液 50mlをバッファー Dで 平衡化した Q—セファロース（フアルマシア フアルマシア バイオテク社製）に供し、 FPLCシステムを用いて 0〜300mM NaCl直線濃度勾配により溶出した。
この画分を保存バッファー〔50mMトリス— HCl (pH8. 2)、0. ImM EDTA、 10 mM塩化ナトリウム、 0· 1 %ツイーン 20、 0. 1%ノニデット Ρ— 40、 ImMジチオスレィ トール、 50%グリセロール〕 1リットルを外液として、 2時間の透析を 2回、一晩の透析 を 1回行なった。こうして得られた DNAポリメラーゼを Tks DNAポリメラーゼ標品と した。
得られた Tks DNAポリメラーゼ標品を用いて、実施例 1で記載した方法で活性を 測定したところ、 DNAポリメラーゼ活性が確認できた。
[0061] 実施例 4
(l) DNAポリメラーゼ遺伝子中央部のクローニング
様々な耐熱性 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の間で保存されてレ、る部分をもとに して配列表の配列番号 17、 2、 3、 18記載のオリゴヌクレオチド TPPolBFl、 TPPol BF5、 TTPolBRl並びに TTPolBR5を合成した。
次に上記実施例 2で調製したサーモコッカス セラー由来ゲノム DNA250ngを铸 型にして、 50pmolの TPPolBFlと 50pmolの TTPolBRl、 50pmolの TPPolBFlと 50pmolの TTPolBR5、 50pmolの TPPolBF5と 50pmolの TTPolBRlのプライマ 一の組み合わせで、 ΙΟΟ μ Ιの容量で PCRを行った。 PCR条件並びに精製操作は 実施例 3_ (1)記載と同様にして行った。得られた約 2kbの TPPolBFl—TTPolBR 1、約 lkbの TPPolBFl— TTPolBR5並びに約 0· 8kbの TPPolBF5— TTPolBRl の各増幅断片についてダイレクトシークェンシングを行レ、、塩基配列を決定した。
[0062] (2) DNAポリメラーゼ遺伝子上流および下流部分のクローニング
上記実施例 4_ (1)で得た塩基配列をもとに上流をクローニングするための特異的な オリゴヌクレオチド TceOl (配列表の配列番号 19)および下流をクローユングするた めのオリゴヌクレオチド Tce02 (配列表の配列番号 20)を合成した。
次に実施例 2で調製したサーモコッカス セラー由来ゲノム DNAlngを铸型にして、 lOpmolの TceOlまたは Tceo2と各 lOpmolの実施例 3 _ (2)表 1記載の 32種類の プライマーとの組み合わせで、実施例 3_ (2)記載の方法と同様に PCRならびに精 製操作を行った。得られた増幅産物についてダイレクトシークェンシングを行い、 目 的の DNAポリメラーゼの上流領域を含む断片をスクリーニングした。その結果、約 65 Obpの PCR増幅断片 Tce013Cに DNAポリメラーゼ遺伝子の上流、約 650bpの PC R増幅断片 Tce022Fに DNAポリメラーゼ遺伝子の下流が含まれていることがわかつ た。
[0063] (3) DNAポリメラーゼ発現させるためのプラスミドの構築
実施例 4一（2)で得られた配列をもとに配列表の配列番号 21及び 22記載のオリゴ ヌクレオチド TceNdeおよび TceBgPsを合成した。
実施例 2で調製したサーモコッカス セラー由来ゲノム DNAlOOngを铸型にして 2 Opmolの TceNdeと 20pmolの TceBgPsをプライマーに用レ、、 100 μ 1の容量で PC Rを行なった。 PCRは、 DNAポリメラーゼとしてパイ口べスト（タカラバイオ社製）を添 付のプロトコールに従って用レ、、 94°C 30秒、 50°C 30秒、 72°C 2分を 1サイクノレ とする、 40サイクル反応を行った。得られた約 2. 3kbの DNA増幅断片を制限酵素 N del及び Bglll (ともにタカラバィォ社製）で消化し、得られた DNA断片をプラスミドべ クタ一 pTVl 19Nd (pTVl 19Nの Ncolサイトを Ndelサイトに変換したもの）の Ndel 及び BamHI間に組込み、プラスミド pTce 19を作製した。当該プラスミドは、 pTcel 9 と命名、表示され、平成 16年 5月 14日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合 研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵 便番号 305— 8566) )に FERM BP—10311として寄託されてレヽる。 [0064] (4) DNAポリメラーゼ遺伝子を含む DNA断片の塩基配列の決定
上記 pTce 19の挿入 DNA断片の塩基配列をジデォキシ法によって決定した。 得られた塩基配列の結果を解析したところ、 目的の DNAポリメラーゼをコードすると 考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフ レームの塩基配列を配列表の配列番号 23に示す。また、該塩基配列から推定される DNAポリメラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号 24に示す
[0065] (5)サーモコッカス セラー DNAポリメラーゼ遺伝子の発現
pTcel9で形質転換された大腸菌 JM109を実施例 3 _ (6)記載の方法で培養し、 遠心分離によって集めた菌体を 64 μ 1のソニケーシヨンバッファーに懸濁し、超音波 破砕機にかけた。この破砕液を 12000rpmで 10分間の遠心分離を行レ、、得られた 上清を 80°C、 10分間の熱処理にかけた。その後、再度 12000i"pmで 10分の遠心 分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。
上記得られた熱処理上清液について、実施例 1に記載の方法により酵素活性を測 定した結果、 DNAポリメラーゼ活性が認められた。
[0066] (6)精製 DNAポリメラーゼ標品の調製
上記 pTcel 9で形質転換された大腸菌 JM109を実施例 3— (7)記載の方法で培養 した。精製はへパリン一セファロース CL—6B (フアルマシア バイオテク社製）を用い て 0〜700mM KC1直線濃度勾配により溶出するまでは実施例 3—（7)と同様にし て行った。
溶出した DNAポリメラーゼ画分は、さらに 0. 3M 塩化ナトリウムを含むバッファー C 1リットルを外液として、 2時間の透析を 2回、一晩の透析を 1回行なった。透析後 の酵素液 95mlを 0. 3M塩化ナトリウムを含むバッファー Cで平衡化した SuperdexG 200 (フアルマシア バイオテク社製）に供し、 0. 3M塩化ナトリウムを含むバッファー Cで溶出した。
溶出した DNAポリメラーゼ画分をバッファー D 1リットルを外液として、 2時間の透 析を 2回、一晩の透析を 1回行なった。透析後の酵素液 45mlをバッファー Dで平衡 化した Q—セファロース（フアルマシア フアルマシア バイオテク社製）に供し、 FPL Cシステムを用いて 0〜300mM NaCl直線濃度勾配により溶出した。 この画分を保存バッファー 1リットルを外液として、 2時間の透析を 2回、一晩の透 析を 1回行なった。こうして得られた DNAポリメラーゼを Tee DNAポリメラーゼ標品 とした。
上記で得られた Tee DNAポリメラーゼ標品を用いて、実施例 1に記載した方法に より酵素活性を測定した結果、 Tee DNAポリメラーゼ標品に DNAポリメラーゼ活性 が確認、できた。
[0067] 実施例 5
(l) DNAポリメラーゼ遺伝子中央部のクローニング
様々な耐熱性 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の間で保存されてレ、る部分をもとに して配列表の配列番号 17、 2、 3、 4、 18記載のオリゴヌクレオチド TPPolBFl、 TPP olBF5、 TTPolBRl、 TTPolBR4並びに TTPolBR5を合成した。
次に実施例 2で調製したサーモコッカス スクリ由来ゲノム DNA250ngを錡型にし て、 50pmolの TPPolBFlと 50pmolの TTPolBR4、 50pmolの TPPolBFlと 50pm olの TTPolBR5、 50pmolの TPPolBF5と 50pmolの TTPolBRlのプライマーの組 み合わせで、 100 /i lの容量で PCRを行った。 PCR条件並びに精製操作は、実施例 3—（1)記載のものと同様にして行った。得られた約 1. 2kbの TPPolBFl—TTPol BR4、約 lkbの TPPolBFl— TTPolBR5、約 2kb TPPolBF5— TTPolBRlの各 増幅断片についてダイレクトシークェンシングを行い、塩基配列を決定した。その結 果、サーモコッカス スクリ DNAポリメラーゼがインティン配列を含むことが明らかに なった。
[0068] (2) DNAポリメラーゼ遺伝子上流および下流部分のクローニング
上記実施例 5_ (1)で得た塩基配列をもとに上流をクローニングするための特異的な オリゴヌクレオチド TsiOl (配列表の配列番号 25)および下流をクローニングするため のオリゴヌクレオチド Tsi06 (配列表の配列番号 26)を合成した。
次に実施例 2で調製したサーモコッカス スクリ由来ゲノム DNAlngを铸型にして、 1 Opmolの TsiO 1または Tsi06と各 1 Opmolの表 1記載 32種類のプライマーとの組み 合わせで PCRを行った。 PCR条件ならびに精製操作は実施例 3 _ (2)と同様にして 行った。得られた増幅断片は、ダイレクトシークェンシングを行レ、、 DNAポリメラーゼ の上流含む断片をスクリーニングした。その結果、約 2900bpの TsiOl lA断片に DN Aポリメラーゼ遺伝子の上流、約 400bpの Tsi065B断片に DNAポリメラーゼ遺伝子 の下流が含まれてレ、ることがわ力 た。
[0069] (3) DNAポリメラーゼ発現させるためのプラスミドの構築
サーモコッカス スクリ DNAポリメラーゼの配列中に 1箇所インティン配列を含む ことが明らかになった。そこで、インティン配列除去した DNAポリメラーゼ遺伝子を構 築した。
すなわち、実施例 5—（2)で得られた配列をもとに配列表の配列番号 27〜30記載 のオリゴヌクレオチド TsiNde、 TsiA, TsiBおよび TsiBamPstを合成した。
実施例 2で調製したサーモコッカス スクリ由来ゲノム DNAlOOngを铸型にして 20 pmolの TksNdeと 20pmolの TsiB (Tsil) 20pmolの TsiAと 20pmolの TsiBamPst ( Tsill)のプライマー組み合わせで、 ΙΟΟ μ Ιの容量で PCRを行った。 PCR条件は実 施例 5—（2)と同様にして行い、約 1 · 5kbの Tsil、約 0. 9kbの TsillDNA断片を得 た。さらに、同様の方法で上記 PCR反応液 Tsil 1 β 1と PCR反応液 Tsill 1 μ 1を混 ぜたものを铸型にして、 20pmolの TsiNdeと 20pmolの TsiBamPst)プライマーを用 いて、 100 /i lの容量で PCRを行レ、、約 2. 4kbの DNA断片を得た。
得られた約 2. 4kbの DNA断片は、制限酵素 Ndelと BamHIで消化した後、 Ndel と BamHIで消化した pTVl 19Nd (pTVl 19Nの Ncolサイトを Ndelサイトに変換した もの）とライゲーシヨンし、プラスミド pTsil6を構築した。当該プラスミドは、 pTsil6と 命名、表示され、平成 16年 5月 14日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研 究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便 番号 305— 8566) )に FERM BP— 10310として寄託されてレ、る。
[0070] (4) DNAポリメラーゼ遺伝子を含む DNA断片の塩基配列の決定
実施例 5_ (3)で得られた pTsil6の揷入 DNA断片の塩基配列をジデォキシ法に よって決定した。得られた塩基配列の結果を解析したところ、 DNAポリメラーゼをコ ードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリー デイングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 31に示す。また、該塩基配列から 推定される DNAポリメラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号 32に示す。 [0071] (5)サーモコッカス スクリ DNAポリメラーゼ遺伝子の発現
プラスミド pTsil 6で形質転換された大腸菌 JM109を実施例 3—（6)記載の方法で 培養し、遠心分離によって集めた菌体を 52 μ 1のソニケーシヨンバッファーに懸濁し、 超音波破砕機にかけた。この破砕液を 12000rpmで 10分間の遠心分離を行レ、、得 られた上清を 80°C、 10分間の熱処理にかけた。その後、再度 12000rpmで 10分の 遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。
上記で得られた熱処理上清液にっレ、て、実施例 1に記載の方法により酵素活性を 測定した結果、 DNAポリメラーゼ活性が認められた。
[0072] (6)精製 DNAポリメラーゼ標品の調製
プラスミド pTsil 6で形質転換された大腸菌 JM109を実施例 3 _ (7)記載の方法で 培養した。精製は実施例 3 _ (7)と同様にして行った。
こうして得られた DNAポリメラーゼを Tsi DNAポリメラーゼ標品とした。得られた T si DNAポリメラーゼ標品を用いて、実施例 1に記載されている方法で活性を測定し た結果、 Tsi DNAポリメラーゼ標品に DNAポリメラーゼ活性が確認できた。
[0073] 実施例 6
(1)各種 DNAポリメラーゼの取込および伸長活性
Tks、Tce及び Tsi DNAポリメラーゼの取込および伸長活性を測定した。対照とし て市販の KOD DNAポリメラーゼ (東洋紡社製）を用いた。
铸型として、取込活性を測定する場合は 1 /i g活性型仔牛胸腺 DNAを用いた。ま た、伸長活性を測定する場合は 1 μ gMl 3ファージの 1本鎖 DNAとこれに相補的な lpmolの、配列表の配列番号 33記載の HTプライマーをアニーリングさせたもの（M 13/HT Primer)を用いた。緩衝液は、 ImM 塩化マグネシウムを含む KOD # 1 バッファーを用いた。 DNAポリメラーゼの活性測定は、以下の方法で行った。
すなわち、活性を測定しょうとする酵素試料、上記錡型、 0 μ Μ dNTP、 0. 238 μ Μ 「3H」methyl_TTP (アマシャム社製）、 ImM 塩化マグネシウムを含む K〇 D # 1バッファー（東洋紡社製） 50 μ 1で、 75°C、 5分間反応させた。反応液のうち 40 μ ΐを DE81ペーパー（ワットマン社製）にスポットし、 5%Na POで 4回洗浄を行った
2 4
後に DE81ペーパー上に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターで測 定した。上記の酵素活性測定方法によって 30分間に lOnmolの dNMPを基質 DNA に取り込む酵素量を酵素 1Uとした。その結果を表 2に示す。表 2中、「取込」は铸型と なる核酸中のニック部位に対する取り込み能力を示し、「伸長」は铸型となる核酸にァ ニーリングしたプライマーからの伸長のための取り込み能力を示す。
[表 2]
Figure imgf000026_0001
[0075] 表 2に示したように Tks、 Tee及び Tsi DNAポリメラーゼは、 KOD # 1バッファー 中において铸型 DNAへの核酸の取り込みよりもプライマー伸長のための取り込みの 方が活性が高いことが確認できた。また、対照となる KOD DNAポリメラーゼと比較 しても、プライマー伸長のための取り込みが非常に高いことが確認できた。このことか ら本発明の DNAポリメラーゼは、プライマー伸長に非常に適していることが確認でき た。
[0076] (2) Ml 3の 1本鎖 DNAに対する親和性
Tks、 Tee及び Tsi DNAポリメラーゼの取込および Ml 3の 1本鎖 DNAポリメラー ゼに対する親和性を調べた。対照として、 KOD DNAポリメラーゼを用いた。
铸型として、様々な濃度の M13の 1本鎖 DNAを用いた。プライマーとしてこれに相 補的な lpmolの HTプライマーを使用した。緩衝液は ImM塩化マグネシウムを含む KOD # 1バッファーを用いた。 DNAポリメラーゼ活性測定は、上記実施例 6 _ (1) 記載の方法で測定した。その結果を表 3に示す。
[0077] [表 3]
ポリ メラーゼ K m ( μ g / m 1 )
T k s 1 . 0 4
T e e 0 . 9 1
T s i 1 . 3 3
K O D 2 . 6 5 [0078] 表 3に示したように本発明の Tks、 Tee及び Tsi DNAポリメラーゼは、 KOD DN
Aポリメラーゼより Ml 3の 1本鎖 DNAに対する親和性が非常に高いことが確認でき た。このことから本発明の DNAポリメラーゼは、 PCRの検出感度という観点において
KOD DNAポリメラーゼより優れてレ、ることが示唆された。
[0079] (3)Tks及び Tsi DNAポリメラーゼの Fidelity
Tks、 Tsi DNAポリメラーゼの Fidelityを調べた。対照として、 KOD DNAポリメ ラーゼ、 KOD plus DNAポリメラーゼ（いずれも東洋紡社製）及び Pyrobest DN
Aポリメラーゼ (タカラバイオ社製）を用いた。
铸型としてサーマス サーモフィラス HB8 ゲノム DNA (タカラバイオ社製）を使用 した。また、配列表の配列番号 34及び 35記載の C280ZRG34— F及び Rプライマ 一を使用した。
[0080] Fidelityの測定は、以下の方法で行った。すなわち、サーマス サーモフィラス H B8 ゲノム DNA 10ngを铸型にして、上記 c280/RG34— F及び Rプライマーとの 組み合わせ、 50 μ 1の容量で PCRを行った。上記プライマー対で増幅する領域は G C含量が 70%と高いため、 DMSOを濃度 2%となるよう添加した。 Tks、 Tsi並びに K OD plus DNAポリメラーゼを使用する場合は、 KOD plusバッファーを使用し、 その添付のプロトコールに従って用いた。また、 KOD DNAポリメラーゼを使用する 場合は、 K〇D # 1バッファーを使用し、 KOD DNAポリメラーゼ添付のプロトコール に従って用いた。さらに Pyrobest DNAポリメラーゼは、添付の緩衝液及びプロトコ ールに従って行った。 PCR条件は、 96°C 2分インキュベートした後、 98°C 5秒、 6 8°C 30秒を 1サイクルとした、 30サイクル反応を行った。反応終了後、等量の 100m M トリス—塩酸緩衝液（pH8. 0)飽和フヱノール/クロ口ホルム/イソァミルアルコ ール混合液（25： 24： 1、 v/v)を加えて混合した後、 10分間遠心（10000 X g)を 2 回行った。遠心終了後、得られた上清をクロ口ホルム/イソァミルアルコール混合液（ 24 : 1、 vZv)を加えて混合した後、 10分間遠心（10000 X g)を行った。得られた上 清をエタノール沈殿後、 20 μ ΐの H20に溶解して約 0. 5bpの DNA断片を得た。 8 〃1の約0. 5bpの DNA断片を TaKaRa BKL Kit (タカラバイオ社製）のプロトコ一 ルに従って処理した後、得られた溶液 5 μ 1で大腸菌 JM109を形質転換した。得られ た形質転換体を培養し、約 500bpの DNA断片が挿入されたクローン 12— 24クロー ンにつレ、て塩基配列を決定し、読み取った総塩基数に対する変異塩基数の比を求 め Fidelityとした。その結果を表 4に示す。
[表 4]
Figure imgf000028_0001
[0082] 表 4に示したように本発明の Tks及び Tsi DNAポリメラーゼは、 KOD、 K〇D plu s並びに Pyrobest DNAポリメラーゼのレ、ずれよりも変異の頻度が少なレ、ことが確認 できた。このこと力ら、 KOD、 K〇D plus並びに Pyrobest DNAポリメラーゼよりも クローニング用酵素として優れていることが明らかになった。
[0083] (4) Tks及び Tee DNAポリメラーゼの Fidelity
Tks及び Tee DNAポリメラーゼの Fidelityを調べた。対照として、 KOD DNAポ リメラーゼ、 KOD plus DNAポリメラーゼ（いずれも東洋紡社製）及び Pyrobest DNAポリメラーゼ (タカラバイオ社製）を用いた。
铸型としてサーマス サーモフィラス HB8 ゲノム DNA (タカラバイオ社製）を使用 した。また、配列表の配列番号 36及び 37記載の C240ZRA18— F及び Rプライマ 一を使用した。
[0084] Fidelityの測定は、サーマス サーモフィラス HB— 8 ゲノム DNA 10ngを铸型 にして、上記 TEMP10— F及び Rプライマーとの組み合わせ、 50 μ 1の容量で PCR を行った。上記プライマー対で増幅する領域の GC含量は 70%と高いため、 DMSO を濃度 2%となるよう添加した。緩衝液は、 K〇D # 1バッファーを使用し、その添付の プロトコールに従って用いた。 PCR条件及び Fidelityの算出方法は、上記実施例 6 一（3)記載の方法と同様にした。その結果を表 5に示す。
[0085] [表 5] 緩衝液 酵素名 変異の頻度
K O D # 1 T k s 0 . 0 0 0 %
T e e 0 . 0 0 0 %
K O D 0 . 0 6 4 %
[0086] 表 5に示したように本発明の Tks及び Tee DNAポリメラーゼは、 K〇Dよりも変異 の頻度が少ないことが確認できた。このこと力、らもクローニング用酵素として優れてい ることが明らかになった。
[0087] 実施例 7
(1)各種 DNAポリメラーゼの至適温度
Tks, Tee及び Tsi DNAポリメラーゼの至適温度を測定した。铸型としては 20 μ g 活性型仔牛胸腺 DNAを用いた。また、緩衝液としては Pyrobest DNAポリメラーゼ に添付のバッファーを用いた。 DNAポリメラーゼの活性測定は、以下の方法で行つ た。
まず、活性を測定しょうとする酵素試料 5mU (実施例 6— (1)に記載の取込活性の 測定方法により算出）、上記鍀型、 200 μ M dATP、 200 μ M dGTP、 200 μ Μ dCTP、 100 /i M dTTP、 0. 204 /i M 「3H」methyl— TTP (アマシャム社製）、 1 X Pyrobest DNAポリメラーゼに添付のバッファー（タカラバイオ社製）を含む計 50 / 1の反応液を調製した。次に、それぞれの酵素試料について、 65°C〜85°Cの所望 の温度で 5分間反応させた。反応液のうち 40 μ 1を DE81ペーパー（ワットマン社製） にスポットし、 5%Na POで 4回洗浄を行った後に DE81ペーパー上に残存する放
2 4
射活性を液体シンチレーシヨンカウンターで測定した。上記の活性測定方法で測定 された活性と反応温度との関係を図 1に示す。なお、図 1では、 85°Cでの反応におけ る活性を 100%としている。
[0088] 図 1に示したように、 Tks、 Tee及び Tsi DNAポリメラーゼは、活性型仔牛胸腺 DN
Aを铸型として用いた場合に 75°C〜85°Cの至適温度を持つ。
[0089] (2)各種 DNAポリメラーゼの至適 pH
Tks、 Tee及び Tsi DNAポリメラーゼの至適 pHを測定した。錡型としては 10 μ g 活性型仔牛胸腺 DNAを用いた。また、緩衝液としては、 75°Cにおける pHが pH5. 0
〜ρΗ8· 0の所望の値に調整された 120mM Tris— HClを用いた。 DNAポリメラー ゼの活性測定は、以下の方法で行った。
まず、活性を測定しょうとする酵素試料 0. 05U (実施例 6—（1 )に記載の取込活性 の測定方法により算出）、上記铸型、上記緩衝液、 10mM KC1、 6mM (NH ) S
4 2
O、 0. 1 % TritonX— 100、 0. 001 % BSA、 ImM MgCl、 40 μ M dNTP、
4 2
0. 204 μ Μ 「311」11^^1^1 _^? (ァマシャム社製）を含む計50 1の反応液を調 製した。次に、それぞれの酵素試料について、 75°Cで 5分間反応させた。反応液のう ち 40 μ ΐを DE81ペーパー（ワットマン社製）にスポットし、 5 %Na POで 4回洗浄を
2 4
行った後に DE81ペーパー上に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ 一で測定した。上記の活性測定方法で測定された活性と pHとの関係を図 2に示す。 なお、図 2では pH6. 0(75°C)における活性を 100%としている。
[0090] 図 2に示したように、 Tks、Tce及び Tsi DNAポリメラーゼは、活性型仔牛胸腺 DN Aを铸型として用いた場合に pH5. 5〜pH6. 5 ( 75°C)の至適 pHを持つ。
[0091] 実施例 8
本発明の DNAポリメラーゼの PCR反応における性能を、 K〇D DNAポリメラーゼ と比較するために、 λ— DNAを铸型とした PCR反応を行った。 Tks、 Tee及び Tsiの DNAポリメラーゼ用の反応液組成は I X K〇D plus DNAポリメラーゼに添付の緩 衝 ί夜、 200 /i M dNTP、 ImM (NH ) SOとし、 K〇D DNAポリメラーゼ用の反
4 2 4
応液組成は 1 X KOD DNAポリメラーゼに添付の緩衝液、 200 μ Μ dNTP、 lm M MgClとし、 lng/50 l λ— DNA (宝酒造社製） 10pmol/50 /i l プライマ
2
一 lambda— 1、 10pmol/50 /i 1 プライマー lambda— 9B、 0. 625U/50 M 1DN Aポリメラーゼを含む反応液 50 μ 1を調製した。
[0092] プライマー lambda— 1、およびプライマー lambda _ 9Bの塩基配列を配列表の配 列番号 38、および配列番号 39にそれぞれ示す。上記の反応液について 98°C、 10 秒〜 68°C、 10分を 1サイクルとした 30サイクルの PCR反応を行った後、反応液のう ちの 3 μ 1をァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染色によって増幅 された DNA断片を確認した。この結果、 KOD DNAポリメラーゼを用いたものでは DNA断片の増幅が認められなかった。これに対し、 Tks、 Tee及び TsiDNAポリメラ ーゼでは、いずれの DNAポリメラーゼを用いた場合においても、約 12キロ塩基対の DNA断片の増幅が確認された。
[0093] 次に、プライマーをプライマー lambda— 1、及びプライマー lambda— 10Dに変更 して実験を行った。プライマーえ 10Dの塩基配列を配列表の配列番号 40に示す。 上記同様の反応液組成で lng/50 μ 1 λ _DNA (宝酒造社製） 10pmol/50 μ 1 プライマー lambda— 1、 10pmol/50 x l プライマー lambda— 10d、 0. 625U/5 0 μ 1DNAポリメラーゼを含む反応液 50 μ 1を調製した。上記の反応液にっレ、て 98 °C、 10秒〜 68°C、 10分を 1サイクルとした 30サイクルの PCR反応を行った後、反応 液のうちの 3 μ 1をァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染色によつ て増幅された DNA断片を確認した。この結果、 KOD DNAポリメラーゼを用いたも のでは DNA断片の増幅が認められなかった。これに対し、 Tks、 Tee及び TsiDNA ポリメラーゼでは、いずれの DNAポリメラーゼを用いた場合においても、約 15キロ塩 基対の DNA断片の増幅が確認された。
[0094] 実施例 8
(1)マウスハイプリドーマ細胞系の作成
実施例 2で調製した Tks DNAポリメラーゼ標品 210 / g (100 / 1)、実施例 4で調 製した Tee DNAポリメラーゼ標品 210 μ g (100 μ 1)実施例 6で調製した Tsi DNA ポリメラーゼ標品 200 /i g (100 /i l)のそれぞれに PBS 800 μ 1をカ卩え、フロイント 'コ ンプリート'アジエバン MDif co Lab.社製） lmlと共にェマルジヨン化させ、抗原調 整物とした。これらの抗原調製物をそれぞれ Balb/cマウス（10週齢のメス、 日本タレ ァ製) 4匹ずつに等分して腹腔内投与した。この 2週間後と 5週間後に、前記と同量の DNAポリメラーゼ標品に PBS 900 /i l、リビ'アジュバント（RIBI社製）を加えた抗原 調製物を調製し、各マウスに等分して腹腔内投与し追加免疫を行った。さらに、初回 の抗原投与から 6週間後に、前記と同量の各 DNAポリメラーゼ標品に PBS 900 μ ΐ を加えた抗原調整物を作製し、各群のマウスに等分して腹腔内投与し、最終免疫し た。
[0095] 最終免疫の 3日後に免疫動物 2匹より脾臓を摘出し、 50%ポリエチレングリコール 存在下にて P3—X63—Ag8— Ulマウスエミローマ細胞と細胞融合した。得られた 細胞は 96ゥヱルプレート 10枚に分注して培養した。 [0096] (2)ハイブリドーマ細胞系のスクリーニング
実施例 8—（1)で抗原に用いた各 DNAポリメラーゼ標品の溶液（5 β g/ml)を使 用し、各 DNAポリメラーゼでコートされた 96ゥエルプレートを作製した。上記の細胞 融合で得られた細胞のうち、細胞の成育の見られたゥエルより上清を採取し、前記の DNAポリメラーゼコートプレート上で ELISA法を実施して培養上清中の抗 DNAポリ メラーゼ抗体の有無を検定した。各 DNAポリメラーゼを抗原として得られた、 900株 以上の細胞株についてこの検定を実施した。この操作により抗体の産生があると判 定された株（Tks DNAポリメラーゼ： 95株、 Tee DNAポリメラーゼ： 103株、 Tsi DN Aポリメラーゼ： 61株）を選択した。
[0097] 選択した細胞株を元株細胞として培養し、その培養上清について、各 DNAポリメラ ーゼの 42°Cにおけるポリメラーゼ活性の阻害を確認した。阻害活性の測定は、各ハ イブリドーマの培養上清中の IgGを結合させた抗マウス IgGマグネットビーズ（
Dynabeads M-280 Sheep anti-Mouse IgG,ダイナノレバイオテック社製）と DNAポリメ ラーゼとを室温で 10分間インキュベートした後、 42°Cで DNAポリメラーゼ活性を測 定し、 DNAポリメラーゼ単独での DNAポリメラーゼ活性測定結果と比較するという方 法で行った。その結果、 Tks DNAポリメラーゼ： 18株、 Tee DNAポリメラーゼ： 28株 、 Tsi DNAポリメラーゼ： 11株の培養上清で DNAポリメラーゼ活性の阻害が確認さ れた。これらの細胞株について、限界希釈法によりクローニングを実施した。
[0098] クローン化された細胞の培養上清について、各 DNAポリメラーゼの 42°Cにおける ポリメラーゼ活性の阻害を確認した。ポリメラーゼ活性を 95%以上阻害するハイブリド 一マクローン株として、 Tks DNAポリメラーゼ： 1株、 Tee DNAポリメラーゼ： 2株、 T si DNAポリメラーゼ： 2株が選択された。これらのハイプリドーマクローン株が産生す る抗体のアイソタイプを検討したところ、 Tks、 Tee DNAポリメラーゼに対する抗体は IgG2bタイプ、 Tsi DNAポリメラーゼに対する抗体は IgGlタイプと G2bタイプのもの であった。なお、これらのハイプリドーマの培養上清より調製した抗体を 94°C、 5分力口 熱した場合には DNAポリメラーゼを阻害する活性は完全に消失した。したがって、こ れらの抗体は低温時特異的に耐熱性 DNAポリメラーゼの活性を阻害できることが示 された。 産業上の利用可能性
[0099] 本発明により、クローニング、シークェンシング、核酸増幅のいずれにおいても有用 な Fidelityが高ぐプライマー伸長に適した DNAポリメラーゼ活性を有するポリぺプ チド並びに該ポリペプチドをコードする遺伝子ならびに当該 DNAポリメラーゼ活性を 有するポリペプチドの製造方法が提供される。本発明の DNAポリメラーゼ活性を有 するポリペプチドを用いることにより、例えば、 PCRにおいて多サイクル数であっても 、エラー率の少ない増幅産物を得ることができる。従って、コピー数の少ない標的核 酸の解析 '同定において有用である。
配列表フリーテキスト
[0100] SEQ ID No: l ; Designed oligonucleotide primer TPPolBF4 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:2; Designed oligonucleotide primer TPPolBF5 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:3; Designed oligonucleotide primer TTPolBRl to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:4; Designed oligonucleotide primer TTPolBR4 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:5; Designed oligonucleotide primer TksOl to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-l
SEQ ID No:6; Designed oligonucleotide Tag sequence region to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:7; Designed oligonucleotide primer Tks04 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-l
SEQ ID No:8; Designed oligonucleotide primer Tks02 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-l
SEQ ID No:9; Designed oligonucleotide primer TksNde to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-l
SEQ ID No: 10; Designed oligonucleotide primer TkslEndBg to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-l
SEQ ID No: 11 ; Designed oligonucleotide primer Tks2StaBg to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-l
SEQ ID No: 12; Designed oligonucleotide primer Tks2EndBal to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-l
SEQ ID No: 13; Designed oligonucleotide primer Tks3StaBal to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-l
SEQ ID No: 14; Designed oligonucleotide primer TksBgPs to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS—l
SEQ ID No: 17; Designed oligonucleotide primer TPPolBFl to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No: 18; Designed oligonucleotide primer TTPolBR5 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No: 19; Designed oligonucleotide primer TceOl to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer
SEQ ID No:20; Designed oligonucleotide primer Tce02 to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer
SEQ ID No:21 ; Designed oligonucleotide primer TceNde to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer
SEQ ID No:22; Designed oligonucleotide primer TceBgPs to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer
SEQ ID No:25; Designed oligonucleotide primer TsiOl to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:26; Designed oligonucleotide primer Tsi06 to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:27; Designed oligonucleotide primer TsiNde to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No :28; Designed oligonucleotide primer TsiA to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:29; Designed oligonucleotide primer TsiB to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:30; Designed oligonucleotide primer TsiBamPst to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:33; Designed oligonucleotide primer HT to amplify a genomic DNA of M13SEQ ID No:34; Designed oligonucleotide primer c280/RG34—F to amplify a genomic DNA of Thermus thermophilus HB - 8
SEQ ID No:35; Designed oligonucleotide primer c280/RG34 - R to amplify a genomic DNA of Thermus thermophilus HB - 8
SEQ ID No:36; Designed oligonucleotide primer c240/RA18 - F to amplify a genomic DNA of Thermus thermophilus HB - 8
SEQ ID No:37; Designed oligonucleotide primer c240/RA18_R to amplify a genomic DNA of Thermus thermophilus HB_8
SEQ ID No :38; Designed oligonucleotide primer lambda- 1 to amplify a DNA of bacteriophage lambda
SEQ ID No:39; Designed oligonucleotide primer lambda-9B to amplify a DNA of bacteriophage lambda
SEQ ID No:40; Designed oligonucleotide primer lambda- 10D to amplify a DNA of bacteriophage lambda

Claims

請求の範囲
[1] 以下の群より選択されるアミノ酸配歹 IJ、あるいは該アミノ酸配列中の 1ないしは数個 のアミノ酸が欠失、揷入、付カロ、置換したアミノ酸配列を有し、かつ DNAポリメラーゼ 活性を有するポリペプチド：
(a)配列表の配列番号 16に記載のアミノ酸配列；
(b)配列表の配列番号 24に記載のアミノ酸配列；又は
(c)配列表の配列番号 32に記載のアミノ酸配列。
[2] 請求項 1に記載のポリペプチドをコードする核酸。
[3] 配列表の配列番号 15、 23又は 31に記載の塩基配列あるいはその一部を有する 請求項 2記載の核酸。
[4] 請求項 3に記載の核酸に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件 下でハイブリダィズする核酸であって、かつ DNAポリメラーゼ活性を有するポリぺプ チドをコードする核酸。
[5] ポリペプチドを産生する能力を有する細胞を培養する工程、および培養物から該ポ リペプチドを採取する工程を包含するポリペプチドの製造方法であって、該ポリぺプ チドは以下からなる群より選択されるアミノ酸配歹 1J、あるいは該アミノ酸配列中の 1な レ、しは数個のアミノ酸が欠失、揷入、付カロ、置換したアミノ酸配列を有し、かつ DNA ポリメラーゼ活性を有する：
(a)配列表の配列番号 16に記載のアミノ酸 -配列；
(b)配列表の配列番号 24に記載のアミノ酸配列；又は
(c)配列表の配列番号 32に記載のアミノ酸配列。
[6] ポリペプチドを用いて核酸を増幅する工程を包含する、核酸の増幅方法であって、 該ポリペプチドは以下からなる群より選択されるアミノ酸配歹 1J、あるいは該アミノ酸配 列中の 1ないしは数個のアミノ酸が欠失、揷入、付加、置換したアミノ酸配列を有し、 かつ DNAポリメラーゼ活性を有する：
(a)配列表の配列番号 16に記載のアミノ酸配列；
(b)配列表の配列番号 24に記載のアミノ酸配列；又は
(c)配列表の配列番号 32に記載のアミノ酸配列。 請求項 1記載のポリペプチドを含有する核酸増幅用組成物。 請求項 1記載のポリペプチドを含有するキット。
請求項 1記載のポリペプチドに結合する抗体。
PCT/JP2005/008711 2004-06-04 2005-05-12 Ｄｎａポリメラーゼ活性を有するポリペプチド WO2005118815A1 (ja)

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