ES2969883T3

ES2969883T3 - ADN polimerasas para la incorporación eficiente y eficaz de dNTP metilados

Info

Publication number: ES2969883T3
Application number: ES19714567T
Authority: ES
Inventors: Keith Bauer; Barbara ECKERT
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2018-03-21
Filing date: 2019-03-21
Publication date: 2024-05-23
Anticipated expiration: 2039-03-21
Also published as: CN111868238B; EP3768832B1; JP7319990B2; EP3768832A1; JP2021516544A; CN111868238A; US20210032609A1; WO2019180137A1

Abstract

Se describen ADN polimerasas que tienen una capacidad mejorada para incorporar dNTP metilados, en relación con una polimerasa correspondiente no modificada. Las polimerasas son útiles en una variedad de métodos de extensión de cebadores descritos. También se describen composiciones relacionadas, que incluyen ácidos nucleicos recombinantes, vectores y células huésped, que son útiles, por ejemplo, para la producción de ADN polimerasas. Además se describen kits y mezclas de reacción que comprenden las ADN polimerasas mejoradas, así como métodos de extensión de cebadores utilizando las ADN polimerasas mejoradas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

ADN polimerasas para la incorporación eficiente y eficaz de dNTP metilados

Campo de la invención

La presente invención proporciona ADN polimerasas con eficacia mejorada en la incorporación de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) metilados, así como procedimientos para el uso de dichas polimerasas en diversas aplicaciones, incluyendo la extensión y amplificación de polinucleótidos de ácidos nucleicos. También se proporcionan kits que comprenden las ADN polimerasas con eficacia mejorada en la incorporación de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) metilados y mezclas de reacción de los mismos, así como ácidos nucleicos que codifican las ADN polimerasas.

Antecedentes de la invención

Las ADN polimerasas son responsables de la replicación y el mantenimiento del genoma, un papel que es fundamental para transmitir con exactitud la información genética de generación a generación. Las ADN polimerasas funcionan en las células como las enzimas responsables de la síntesis del ADN. Polimerizan los desoxirribonucleósidos trifosfato en presencia de un activador de metal, tal como Mg2+, en un orden dictado por el molde de ADN o molde de polinucleótidos que se copia.In vivo,las ADN polimerasas participan en un espectro de procedimientos de síntesis del ADN, incluyendo la replicación del ADN, reparación del ADN, recombinación y amplificación génica. Durante cada procedimiento de síntesis del ADN, el molde de ADN se copia una vez o, como máximo, unas pocas veces para producir réplicas idénticas. Por el contrario,in vitro,la replicación del ADN se puede repetir muchas veces, tal como, por ejemplo, durante la reacción en cadena de la polimerasa (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.683.202).

En los estudios iniciales con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se añadió la ADN polimerasa al inicio de cada tanda de replicación del ADN (véase la patente de EE. UU. n.° 4.683.202,supra).Posteriormente, se determinó que se podían obtener ADN polimerasas termoestables a partir de bacterias que crecen a temperaturas elevadas y que únicamente se necesita añadir estas enzimas una vez (véase las patentes de EE. UU. n.° 4.889.818 y 4.965.188). A las temperaturas elevadas usadas durante la PCR, estas enzimas no se inactivan irreversiblemente. Como resultado, se pueden llevar a cabo ciclos repetitivos de reacciones en cadena de la polimerasa sin añadir nuevas enzimas al inicio de cada procedimiento de adición de síntesis. Las ADN polimerasas, en particular las polimerasas termoestables, son la clave de un gran número de técnicas en estudios de ADN recombinante y en el diagnóstico médico de enfermedades. Para aplicaciones diagnósticas, en particular, una secuencia de ácido nucleico diana únicamente puede ser una pequeña porción del ADN o ARN en cuestión, de modo que puede resultar difícil detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana sin amplificación.

El patrón de plegamiento global de las ADN polimerasas se asemeja a la mano derecha humana y contiene tres subdominios distintos de la palma, dedos y pulgar. (Véase Beeseet al.,Science 260:352-355, 1993; Patel et al., Biochemistry 34:5351-5363, 1995). Mientras que la estructura de los subdominios de dedos y pulgar varían en gran medida entre polimerasas que difieren en tamaño y en funciones celulares, todos los subdominios catalíticos de la palma se pueden superponer. Por ejemplo, el motivo A, que interacciona con el dNTP entrante y estabiliza el estado de transición durante la catálisis química, se puede superponer con una desviación media de aproximadamente un A entre las ADN polimerasas de la familia pol a de mamíferos y pol I de procariotas (Wang et al., Cell 89:1087-1099, 1997). El motivo A comienza estructuralmente en una cadena p antiparalela que contiene residuos predominantemente hidrófobos y continúa hasta una hélice a. La secuencia de aminoácidos principal de los sitios activos de las ADN polimerasas está excepcionalmente conservada. Por ejemplo, en el caso del motivo A, se retiene la secuencia DYSQIELR (SEQ ID NO:6) en polimerasas de organismos separados por muchos millones de años de evolución, incluyendo, por ejemplo,Thermus aquaticus, Chlamydia trachomatisyEscherichia coli.

Además de estar bien conservado, también se ha demostrado que el sitio activo de las ADN polimerasas es relativamente mutable, puede acomodar determinadas sustituciones aminoacídicas sin reducir significativamente la actividad de ADN polimerasa. (Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.602.695). Dichas ADN polimerasas mutantes pueden ofrecer diversas ventajas selectivas, por ejemplo, en aplicaciones diagnósticas y de investigación que comprenden reacciones de síntesis de ácidos nucleicos.

Existen al menos dos etapas en el procedimiento enzimático de polimerización del ADN: (1) la incorporación del nucleótido entrante y (2) la extensión del nucleótido recién incorporado. En general, se considera la lealtad o "fidelidad" global de la ADN polimerasa como un conglomerado de estas dos actividades enzimáticas, pero las etapas son distintas. Una ADN polimerasa puede incorporar erróneamente el nucleótido entrante, pero, si no se extiende eficazmente, la velocidad de extensión disminuirá mucho y la formación del producto global sería mínima. De forma alternativa, es posible tener una ADN polimerasa que incorpore erróneamente el nucleótido entrante y fácilmente extienda erróneamente el emparejamiento erróneo recién formado. En este caso, la velocidad de extensión global sería alta, pero la fidelidad global sería baja. Un ejemplo de este tipo de enzima sería la ADN polimerasa ES112 (ADN polimerasa E683R Z05, véase el documento US 7.179.590) cuando se usa Mn2+ como el activador de ion de metal divalente. La enzima tiene una eficacia muy alta porque, a diferencia de las ADN polimerasas típicas que tienden a vacilar/bloquearse al encontrar un emparejamiento erróneo, la ADN polimerasa ES112 extiende fácilmente el emparejamiento erróneo. El fenotipo mostrado en ES112 es más pronunciado durante la etapa de RT, supuestamente a causa de los efectos estructurales del heterodúplex ARN/ADN frente al homodúplex ADN/a Dn . Un segundo ejemplo sería si la ADN polimerasa no incorpora erróneamente con facilidad (puede ser incluso menos probable incorporar erróneamente), pero sí tiene capacidad incrementada para extender erróneamente un emparejamiento erróneo. En este caso, no se altera significativamente la fidelidad para el producto global. En general, este tipo de enzima es más favorable para las reacciones de extensión que las características de ES112 en Mn2+ porque se mejora la fidelidad del producto. Sin embargo, este atributo se puede utilizar para permitir la extensión errónea de un cebador oligonucleotídico emparejado erróneamente, tal como sucede cuando un cebador oligonucleotídico de una secuencia única hibrida a una diana que tiene heterogeneidad de secuencia (por ejemplo, dianas víricas), pero la velocidad de incorporación errónea normal o más baja permite la finalización de la síntesis del ADN más allá del cebador oligonucleotídico original. Un ejemplo de este tipo de ADN polimerasa es la ADN polimerasa Z05 D580G (véase la publicación de patente de EE. UU. n.° 2009/0148891). Este tipo de actividad se denomina "tolerante al emparejamiento erróneo" porque es más tolerante a los emparejamientos erróneos en el cebador oligonucleotídico. Mientras que los ejemplos anteriores han analizado las reacciones de tipo de extensión del cebador, la actividad puede ser más significativa en reacciones tales como RT-PCR y PCR donde con frecuencia se produce nuevamente la extensión del cebador. Los datos sugieren que, mientras enzimas tales como Z05 D580G son más "tolerantes" a los emparejamientos erróneos, también tienen capacidad potenciada para extender los cebadores oligonucleotídicos que contienen bases modificadas (por ejemplo, bases modificadas con f-butilbencilo) o en presencia de tintes de unión a ADN tales como SYBR Green I (véase la publicación de patente de EE. UU. n.° 2009/028053).

La reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción (RT-PCR) es una técnica usada en muchas aplicaciones para detectar y/o cuantificar dianas de ARN mediante amplificación. Para poder amplificar dianas de ARN mediante PCR, en primer lugar es necesario retrotranscribir el molde de ARN en ADNc. Típicamente, los ensayos de RT-PCR dependen de una retrotranscriptasa no termoestable (ADN polimerasa dependiente de ARN), derivada de un organismo mesófilo, para la etapa de síntesis del ADNc inicial (RT). Se requiere una ADN polimerasa termoestable adicional para la amplificación del ADNc para tolerar las temperaturas elevadas requeridas para la desnaturalización del ácido nucleico en la PCR. Existen varios beneficios potenciales del uso de ADN polimerasas termoactivas o termoestables genomanipuladas para realizar una retrotranscripción más eficaz para los ensayos de RT-PCR. La actividad retrotranscriptasa incrementada acoplada con la capacidad de usar temperaturas de incubación de retrotranscripción más altas que permiten la relajación de la estructura secundaria del molde de ARN puede dar como resultado una sensibilidad del ensayo y una eficacia de síntesis del ADNc globales más altas. Una temperatura de incubación más alta también podría incrementar la especificidad reduciendo el falso cebado en la etapa de retrotranscripción. Las enzimas con una eficacia de retrotranscripción mejorada pueden simplificar el diseño del ensayo permitiendo una concentración enzimática y/o tiempos de incubación de RT reducidos. Cuando se usan dUTP y UNG, los productos de extensión no específicos que contienen dUMP que se forman durante las condiciones establecidas no restrictivas se degradan mediante UNG y no se pueden utilizar ni como cebadores ni como moldes. Cuando se usa una retrotranscriptasa no termoestable (ADN polimerasa dependiente de ARN) derivada de un organismo mesófilo, no es posible utilizar las metodologías de dUTP y UNG. (Myers, T.W. et al., Amplification of RNA: High Temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with Thermus thermophilus DNA Polymerase, in PCR Strategies, Innis, M.A., Gelfand, D.H. and Sninsky, J.J., Eds., Academic Press, San Diego, CA, 58-68, (1995)). Sin embargo, el uso de una ADN polimerasa termoactiva o termoestable de la invención para la etapa de retrotranscripción posibilita que la reacción sea completamente compatible con la utilización del sistema de prevención de transferencia dUTP/uracil-N-glicosilasa (UNG) (Longo et al., Use of Uracil DNA Glycosylase to Control Carry-over Contamination in Polymerase Chain Reactions. Gene 93:125-128, (1990)). Además de proporcionar un control de la contaminación por transferencia, el uso de dUTP y UNG proporciona un "inicio en caliente" para reducir la amplificación no específica (Innis y Gelfand 1999).

Los procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos, tales como la PCR, se realizan típicamente a altas temperaturas. Es conocido que, en la PCR, los ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación y extensión, a altas temperaturas, provocan una degradación significativa de los dNTP, principalmente por medio de la hidrólisis de los dNTP a difosfatos y, a continuación, a monofosfatos. Los estudios muestran que los dNTP que tienen una modificación del Y-fosfato (es decir, fosfato terminal) presentan una estabilidad mejorada a altas temperaturas (patente de EE. UU. n.° 7.452.698). Es decir, modificaciones, tales como la adición de un grupo metilo (es decir, dNTP metilado (me-dNTP)) evitan que tenga lugar la reacción de hidrólisis (patente de EE. UU. n.° 7.452.698). Por tanto, desde el punto de vista de la estabilidad a temperatura ambiente y a temperatura elevada, el uso de nucleótidos metilados (es decir, dNTP metilados) es favorable con respecto a los nucleótidos convencionales (es decir, dNTP). Por tanto, los dNTP estables serían una enorme ventaja y una mejora en la técnica. Sin embargo, en las reacciones de PCR de rutina, las polimerasas convencionales no incorporan dNTP metilados eficiente y eficazmente. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de composiciones y procedimientos para llevar a cabo reacciones de amplificación usando dNTP metilados más estables.

Breve sumario de la invención

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

En el presente documento se proporcionan ADN polimerasas que tienen actividades mejoradas, incluyendo la capacidad de incorporar eficiente y eficazmente dNTP metilados, con respecto a una polimerasa de control no modificada correspondiente (es decir, polimerasa original), procedimientos para preparar dichas ADN polimerasas y procedimientos para usar dichas ADN polimerasas.

En un aspecto, se proporciona una ADN polimerasa que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2 y que tiene una eficacia incrementada en la incorporación de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) metilados en comparación con una ADN polimerasa de control, en el que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO:2 es M y en el que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa, excepto que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO: 2 es I. En un modo de realización, la ADN polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, más en particular al menos un 98 % idéntica a SEQ ID NO:2. En algunos modos de realización, la ADN polimerasa y la ADN polimerasa de control comprenden una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, en particular al menos un 98 % idéntica a SEQ ID NO:2. En otro modo de realización, el aminoácido correspondiente a la posición 705 de SEQ ID NO:2 es cualquier secuencia de aminoácidos distinta de V. En otro modo de realización, la ADN polimerasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. Aún en otro modo de realización, el aminoácido correspondiente a la posición 705 de SEQ ID NO:2 es L. En otro modo de realización, la ADN polimerasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3. En otro modo de realización, la ADN polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, en particular al menos un 95 %, más en particular al menos un 98 % idéntica a SEQ ID NO:2, en el que el aminoácido correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO: 2 es M y en el que el aminoácido correspondiente a la posición 705 de SEQ ID NO:2 es L.

En otro aspecto, se proporciona un ácido nucleico recombinante que codifica una ADN polimerasa que tiene una eficacia incrementada en la incorporación de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) metilados en comparación con una ADN polimerasa de control, en el que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO:2 es M y en el que la a Dn polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa, excepto que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 640 de s Eq ID NO: 2 es I. En determinados modos de realización, el ácido nucleico recombinante codifica la ADN polimerasa descrita anteriormente.

En otro aspecto relacionado, se proporciona un vector de expresión que comprende el ácido nucleico recombinante que codifica una ADN polimerasa que tiene una eficacia incrementada en la incorporación de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) metilados en comparación con una ADN polimerasa de control, en el que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO:2 es M y en el que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa, excepto que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO: 2 es I. En determinados modos de realización, el vector de expresión comprende el ácido nucleico recombinante que codifica la ADN polimerasa descrita anteriormente.

En un aspecto adicional, se proporciona un kit para producir un cebador extendido que comprende al menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa que tiene una eficacia incrementada en la incorporación de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) metilados en comparación con una ADN polimerasa de control, en el que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO:2 es M y en el que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa, excepto que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO: 2 es I. En otro modo de realización, el kit comprende además uno o más recipientes adicionales seleccionados del grupo que consiste en: (a) un recipiente que proporciona un cebador hibridable, en condiciones de extensión del cebador, a un molde de polinucleótido predeterminado; (b) un recipiente que proporciona dNTP; y (c) un recipiente que proporciona un tampón adecuado para la extensión del cebador. En otro modo de realización, los dNTP son dNTP metilados. En determinados modos de realización, la ADN polimerasa es la ADN polimerasa descrita anteriormente.

En otro aspecto, se proporciona una mezcla de reacción que comprende una ADN polimerasa que tiene una eficacia incrementada en la incorporación de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) metilados en comparación con una ADN polimerasa de control, en la que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO:2 es M y en la que la<a>D<n>polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa, excepto que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 640 de s Eq ID NO: 2 es I, al menos un cebador, un molde de polinucleótido y dNTP. En un modo de realización relacionado, el molde de polinucleótido es ARN. En otro modo de realización, el molde de polinucleótido es ADN.

En otro modo de realización, la mezcla de reacción comprende además Mg2+. En determinados modos de realización, la ADN polimerasa es la ADN polimerasa descrita anteriormente. En otro modo de realización, la mezcla de reacción comprende además una segunda ADN polimerasa termoestable. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para llevar a cabo la extensión del cebador, que comprende: poner en contacto una ADN polimerasa con un cebador, un molde de polinucleótido y dNTP, en condiciones adecuadas para la extensión del cebador, produciendo de este modo un cebador extendido, en el que la ADN polimerasa incorpora dNTP metilados con eficacia incrementada en comparación con una ADN polimerasa de control, en el que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO:2 es M y en el que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa, excepto que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO: 2 es I. En un modo de realización, la ADN polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, más en particular al menos un 98 % idéntica a SEQ ID NO:2. En algunos modos de realización, la ADN polimerasa y la ADN polimerasa de control comprenden una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, en particular al menos un 98 % idéntica a SEQ ID NO:2. En otro modo de realización, el aminoácido correspondiente a la posición 705 de SEQ ID NO:2 es cualquier secuencia de aminoácidos distinta de V. En otro modo de realización, la ADN polimerasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. Aún en otro modo de realización, el aminoácido correspondiente a la posición 705 de SEQ ID NO:2 es L. En otro modo de realización, la ADN polimerasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3. En determinados modos de realización, la ADN polimerasa es la ADN polimerasa descrita anteriormente.

Diversas ADN polimerasas son susceptibles de mutación como se describe anteriormente. Son en particular adecuadas las polimerasas termoestables, incluyendo polimerasas termoestables naturales de diversas especies de bacterias termófilas, así como polimerasas termoestables sintéticas derivadas de dichas enzimas naturales mediante sustitución, inserción o deleción de aminoácidos u otra modificación. Por tanto, también se divulga que la polimerasa es una ADN polimerasa termoestable. Las formas no modificadas ejemplares de polimerasa incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa CS5, CS6, Z05 o Z05D o una ADN polimerasa funcional que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la misma. Otras polimerasas no modificadas incluyen, por ejemplo, ADN polimerasas de cualquiera de las siguientes especies de bacterias termófilas (o una ADN polimerasa funcional que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con dicha polimerasa):Thermotoga marítima;Thermus aquaticus; Thermus thermophilus; Thermus flavus; Thermus filiformis; Thermussp. sps17; Thermus sp. Z05;Thermotoga neopolitana; Thermosipho africanus; Thermus caldophilus, Deinococcus radiodurans, Bacillus stearothermophilusoBacillus caldotenax.Las polimerasas adecuadas también incluyen aquellas que tienen actividad retrotranscriptasa (RT) y/o la capacidad de incorporar nucleótidos no convencionales, tales como ribonucleótidos u otros nucleótidos modificados en 2'.

También se divulga que la ADN polimerasa es una ADN polimerasa termoactiva. Mientras que las ADN polimerasas termoestables que poseen actividad de retrotranscripción eficaz son en particular adecuadas para realizar RT-PCR, especialmente RT-PCR de enzima única, las ADN polimerasas termoactivas, pero no termoestables, que poseen actividad de retrotranscripción eficaz también son susceptibles de mutación. Por ejemplo, el atributo de incorporar eficiente y eficazmente dNTP metilados es útil para la etapa de RT en una RT-PCR y no es necesario realizar esta etapa a temperaturas que inactivarían una ADN polimerasa termoactiva pero no termoestable. Tras la etapa de RT, para realizar la etapa de amplificación por PCR se podría añadir una ADN polimerasa termoestable o podría estar ya incluida en la mezcla de reacción. Por ejemplo, se puede combinar la ADN polimerasa mejorada descrita en el presente documento con una segunda ADN polimerasa termoestable antes de la etapa de RT en un tampón adecuado para la extensión y amplificación de moldes de ADN y ARN, como se describe en los ejemplos. Ejemplos de ADN polimerasas termoestables adecuadas se describen en las patentes de EE. UU. n.° 4.889.818, 5.773.258 y 5.677.152. En el presente documento, la segunda ADN polimerasa termoestable puede ser la ADN polimerasa AmpliTaq® (desoxinucleósido trifosfato: ADN desoxinucleotidiltransferasa, E.C.2.7.7.7). La segunda ADN polimerasa termoestable puede ser una polimerasa termoestable inactivada reversiblemente, como se describe a continuación. En el presente documento, la polimerasa termoestable inactivada reversiblemente puede ser la ADN polimerasa AmpliTaq Gold® (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE. UU.). Esta segunda metodología se beneficiaría especialmente del uso de una ADN polimerasa termoestable modificada químicamente (u otra tecnología HotStart para inactivar la ADN polimerasa termoestable), de modo que no sea completamente activa durante la etapa de Rt. Un ejemplo de una ADN polimerasa termoactiva pero no termoestable que posee actividad de retrotranscripción eficaz es la ADN polimerasa deCarboxydothermus hydrogenoformans(Chy). Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 6.468.775, 6.399.320, 8.945.882, 9.441.269 y la publicación de patente de EE. UU. n.° 2017/0029792.

También se divulga que la ADN polimerasa deriva de una especieThermus.Por tanto, la ADN polimerasa puede tener al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una polimerasa seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una ADN polimerasa Z05 deThermussp. (Z05) (SEQ ID NO: 1);

(b) una ADN polimerasa deThermus aquaticus(Taq);

(c) una ADN polimerasa deThermus filiformis(Tfi);

(d) una ADN polimerasa deThermus flavus(Tfl);

(e) una ADN polimerasa deThermus sp. sps17(Sps17);

(f) una ADN polimerasa deThermus thermophilus(Tth); y

(g) una ADN polimerasa deThermus caldophilus(Tca).

Las polimerasas mutantes o mejoradas pueden incluir otras modificaciones no sustitutivas. Una de dichas modificaciones es una modificación covalente reversible térmicamente que inactiva la enzima, pero que se invierte para activar la enzima tras la incubación a una temperatura elevada, tal como una temperatura usada típicamente para la extensión de polinucleótidos. Los reactivos ejemplares para dichas modificaciones reversibles térmicamente se describen en las patentes de EE. UU. n.° 5.773.258 y 5.677.152.

La actividad retrotranscriptasa se puede determinar realizando amplificación por RT-PCR en tiempo real y detección de un transcrito del virus de la hepatitis C (VHC) generado a partir de las primeras 800 bases de la 5'LTR del genotipo Ib del VHC en pSP64 poli(A) (Promega). Dos o más mezclas de reacción pueden tener números valorados de copias del transcrito del virus de la hepatitis C (VHC) (por ejemplo, valoraciones 1:5, valoraciones 1:10, por ejemplo, 10.000 copias, 1000 copias, 100 copias, 10 copias, 1 copia, 0 copias en varias mezclas de reacción). La capacidad de retrotranscriptasa de una polimerasa de la invención se puede comparar con la capacidad de retrotranscriptasa de una polimerasa de referencia (por ejemplo, una polimerasa natural, no modificada o de control) durante una unidad de tiempo preseleccionada, como se describe en el presente documento. Las polimerasas con capacidad de retrotranscriptasa mejorada amplificarán el transcrito con mayor eficacia o requerirán un número menor de ciclos de PCR para amplificar el transcrito (es decir, presentan un valor de Cp más bajo, como se calcula en el presente documento), en comparación con una polimerasa natural o no modificada. Además, las polimerasas con función de RT mejorada también pueden tener replicación mejorada de moldes de ARN largos (por ejemplo, al menos 500 o 1000 o 2000 o 5000 o más nucleótidos de longitud). La eficacia de retrotranscriptasa mejorada también puede incluir un tiempo de retrotranscripción más corto en comparación con una polimerasa de control. Por tanto, las polimerasas con eficacia de retrotranscriptasa incrementada pueden retrotranscribir un molde de ARN más rápidamente que una polimerasa de control o de referencia.

En diversos otros aspectos, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico recombinante que codifica una ADN polimerasa mutante o mejorada como se describe en el presente documento, un vector que comprende el ácido nucleico recombinante y una célula huésped transformada con el vector. En el presente documento, el vector puede ser un vector de expresión. Las células huésped que comprenden dichos vectores de expresión son útiles en procedimientos para producir la polimerasa mutante o mejorada cultivando las células huésped en condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico recombinante. Las polimerasas pueden estar contenidas en kits y/o mezclas de reacción. Los modos de realización de los ácidos nucleicos recombinantes, células huésped, vectores, vectores de expresión, mezclas de reacción y kits son como se describe anteriormente y en el presente documento.

Aún en otro aspecto, se proporciona un procedimiento para llevar a cabo la extensión de polinucleótidos. En general, el procedimiento incluye poner en contacto una ADN polimerasa que tiene una capacidad mejorada para incorporar eficiente y eficazmente dNTP metilados con un cebador, un molde de polinucleótido y nucleósidos trifosfato (es decir, dNTP metilados) en condiciones adecuadas para la extensión del cebador, produciendo de este modo un cebador extendido. Por ejemplo, el molde de polinucleótido puede ser un molde de ARN o ADN. Los nucleósidos trifosfato pueden incluir nucleótidos no convencionales, tales como, por ejemplo, ribonucleótidos y/o nucleótidos marcados, y, por supuesto, dNTP metilados. Los nucleósidos trifosfato pueden incluir dATP (2'-desoxiadenosina 5'-trifosfato), dCTP (2'-desoxicitidina 5'-trifosfato), dGTP (2'-desoxiguanosina 5'-trifosfato), dTTP (2'-desoxitimidina 5'-trifosfato), dITP (2-desoxiinosina 5'-trifosfato) y/o dUTP (2'-desoxiuridina 5'-trifosfato). Los dNTP metilados pueden incluir dATP metilado, dCTP metilado, dGTP metilado, DTTP metilado, ITP metilado y/o dUTP metilado. Además, el cebador y/o el molde pueden incluir uno o más análogos de nucleótidos. En algunas variaciones, el procedimiento de extensión de polinucleótidos es un procedimiento para la amplificación de polinucleótidos que incluye poner en contacto la ADN polimerasa mutante o mejorada con un par de cebadores, el molde de polinucleótido y los nucleósidos trifosfato en condiciones adecuadas para la amplificación del polinucleótido. La reacción de extensión de polinucleótidos puede ser, por ejemplo, PCR, extensión isotérmica o secuenciación (por ejemplo, la reacción de secuenciación 454). El molde de polinucleótido puede ser de cualquier tipo de muestra biológica.

También se proporciona un kit útil en dicho procedimiento de extensión de polinucleótidos. En general, el kit incluye al menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa mutante o mejorada como se describe en el presente documento. En el presente documento, el kit puede incluir además uno o más recipientes adicionales que proporcionan uno o más reactivos adicionales. Por ejemplo, en variaciones específicas, el uno o más recipientes adicionales proporcionan nucleósidos trifosfato; un tampón adecuado para la extensión de polinucleótidos; y/o uno o más polinucleótidos de sonda o cebador, hibridables, en condiciones de extensión de polinucleótidos, a un molde de polinucleótido predeterminado. El molde de polinucleótido puede ser de cualquier tipo de muestra biológica.

Se proporcionan además mezclas de reacción que comprenden las polimerasas divulgadas en el presente documento. Las mezclas de reacción también pueden contener un ácido nucleico molde (ADN y/o ARN), uno o más polinucleótidos de sonda o cebador, nucleósidos trifosfato (incluyendo, por ejemplo, desoxirribonucleósidos trifosfato, ribonucleósidos trifosfato, nucleósidos trifosfato marcados, nucleósidos trifosfato no convencionales), tampones, sales, marcas (por ejemplo, fluoróforos). En el presente documento, las mezclas de reacción pueden comprender un quelante de hierro o un tinte púrpura. Las mezclas de reacción pueden comprender hemoglobina o un producto de degradación de hemoglobina. Por ejemplo, los productos de degradación de hemoglobina incluyen productos de descomposición de hemo, tales como hemina, hematina, hematoforina y bilirrubina. Las mezclas de reacción también pueden comprender heparina o una sal de la misma. Opcionalmente, la mezcla de reacción comprende un tinte intercalante (incluyendo pero sin limitarse a los descritos anteriormente o en otra parte en el presente documento). La mezcla de reacción puede contener un ácido nucleico molde que está aislado de la sangre. En el presente documento, el ácido nucleico molde puede ser ARN y la mezcla de reacción comprende heparina o una sal de la misma.

También se divulga que la mezcla de reacción comprende dos o más polimerasas. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede comprender una ADN polimerasa mejorada que tiene una eficacia de retrotranscripción incrementada (por ejemplo, actividad incrementada en la extensión de un molde de ARN) como se describe en el presente documento, y otra polimerasa que tiene actividad polimerasa dependiente de ADN. La mezcla de reacción también puede comprender una combinación de una ADN polimerasa mejorada que tiene una eficacia de retrotranscripción incrementada como se describe en el presente documento y una segunda polimerasa dependiente de ADN termoestable. La segunda polimerasa dependiente de ADN termoestable puede ser una polimerasa modificada reversiblemente como se describe anteriormente, de modo que la enzima sea inactiva a temperaturas adecuadas para la etapa de retrotranscripción, pero sea activa en condiciones adecuadas, por ejemplo, a temperaturas elevadas de aproximadamente 90 °C a 100 °C durante un periodo de tiempo de hasta aproximadamente 12 minutos. Las condiciones adecuadas para la activación de una polimerasa termoestable inactivada reversiblemente se proporcionan, por ejemplo, en una reacción de PCR de inicio en caliente (HotStart), como se describe en los ejemplos. Los ejemplos de segundas polimerasas dependientes de ADN termoestable adecuadas se describen en las patentes de Ee . UU. n.° 5.773,258 y 5.677.152.

Definiciones

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque esencialmente se puede usar cualquier procedimiento y material similares a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas de la presente invención, solo se describen procedimientos y materiales ejemplares. Para los propósitos de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.

Los términos "un", "una" y "el/la" incluyen referentes al plural, a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.

Un "aminoácido" se refiere a cualquier unidad monomérica que se puede incorporar en un péptido, polipéptido o proteína. Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido" incluye los siguientes veinte aminoácidos alfa naturales o genéticamente codificados: alanina (Ala o A), arginina (Arg o R), asparagina (Asn o N), ácido aspártico (Asp o D), cisteína (Cys o C), glutamina (Gln o Q), ácido glutámico (Glu o E), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (Ile o I), leucina (Leu o L), lisina (Lys o K), metionina (Met o M), fenilalanina (Phe o F), prolina (Pro o P), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), triptófano (Trp o W), tirosina (Tyr o Y) y valina (Val o V). En los casos en que los residuos "X" no están definidos, estos se deben definir como "cualquier aminoácido". Las estructuras de estos veinte aminoácidos naturales se muestran, por ejemplo, en Stryer et al., Biochemistry, 5.a ed., Freeman and Company (2002). También se pueden codificar genéticamente aminoácidos adicionales, tales como selenocisteína y pirrolisina (Stadtman (1996) "Selenocysteine", Annu Rev Biochem 65:83-100 e Ibba et al. (2002) "Genetic code: introducing pyrrolysine", Curr Biol. 12(13):R464-R466). El término "aminoácido" también incluye aminoácidos no naturales, aminoácidos modificados (por ejemplo, que tienen cadenas principales y/o cadenas laterales modificadas) y análogos de aminoácidos. Véase, por ejemplo, Zhang et al. (2004) "Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887, Anderson et al. (2004) "An expanded genetic code with a functional quadruplet codon" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571, Ikeda et al. (2003) "Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo", Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699-706, Chin et al. (2003) "An Expanded Eukaryotic Genetic Code", Science 301(5635):964-967, James et al. (2001) "Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues", Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991, Kohrer et al. (2001) "Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315, Bacher et al. (2001) "Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue", J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, Hamano-Takaku et al. (2000) "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine", J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328, y Budisa et al. (2001) "Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids", Protein Sci. 10(7):1281-1292.

Como ilustración adicional, un aminoácido es típicamente un ácido orgánico que incluye un grupo amino sustituido o no sustituido, un grupo carboxi sustituido o no sustituido y una o más cadenas laterales o grupos, o análogos de cualquiera de estos grupos. Las cadenas laterales ejemplares incluyen, por ejemplo, tiol, seleno, sulfonilo, alquilo, arilo, acilo, ceto, acido, hidroxilo, hidracina, ciano, halo, hidracida, alquenilo, alquinilo, éter, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterociclo, enona, imina, aldehído, éster, tioácido, hidroxilamina o cualquier combinación de estos grupos. Otros aminoácidos representativos incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos que comprenden reticuladores fotoactivables, aminoácidos de unión a metal, aminoácidos con marcado de espín, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos que contienen metal, aminoácidos con grupos funcionales novedosos, aminoácidos que interaccionan covalente o no covalentemente con otras moléculas, aminoácidos fotoenmascarados y/o fotoisomérizables, aminoácidos radiactivos, aminoácidos que comprenden biotina o un análogo de biotina, aminoácidos glucosilados, aminoácidos modificados con otros carbohidratos, aminoácidos que comprenden polietilenglicol o poliéter, aminoácidos sustituidos con átomos pesados, aminoácidos químicamente escindibles y/o fotoescindibles, aminoácidos que contienen glúcido unido a carbono, aminoácidos activos en oxidorreducción, aminoácidos que contienen aminotioácidos y aminoácidos que comprenden uno o más restos tóxicos.

El término "muestra biológica" engloba una variedad de tipos de muestras obtenidos de un organismo y que se pueden usar en un ensayo de supervisión o diagnóstico. El término engloba orina, sedimento de orina, sangre, saliva y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejidos sólidos, tales como una muestra de biopsia o cultivos tisulares o células derivadas de los mismos y la descendencia de los mismos. El término engloba muestras que se hayan manipulado de cualquier manera después de su adquisición, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización, sedimentación o enriquecimiento para determinados componentes. El término engloba una muestra clínica y también incluye células en cultivo celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, líquidos biológicos y muestras de tejidos.

El término "mutante", en el contexto de las ADN polimerasas de la presente invención, significa un polipéptido, típicamente recombinante, que comprende una o más sustituciones aminoacídicas con respecto a una ADN polimerasa funcional correspondiente.

El término "forma no modificada", en el contexto de una polimerasa mutante, es un término usado en el presente documento para los propósitos de definir una ADN polimerasa mutante de la presente invención: el término "forma no modificada" o "forma original" se refiere a una ADN polimerasa funcional que tiene la secuencia de aminoácidos de la polimerasa mutante, excepto en una o más posiciones de aminoácidos especificadas como caracterizadoras de la polimerasa mutante. Por tanto, la referencia a una ADN polimerasa mutante en términos de (a) su forma no modificada y (b) una o más sustituciones aminoacídicas especificadas significa que, con excepción de la(s) sustitución/sustituciones aminoacídicas especificada(s), la polimerasa mutante tiene de otro modo una secuencia de aminoácidos idéntica a la forma no modificada en el motivo especificado. La "polimerasa no modificada" (y, por lo tanto, también la forma modificada que tiene una capacidad mejorada para incorporar dNTP metilados) puede contener mutaciones adicionales para proporcionar la funcionalidad deseada, por ejemplo, eficacia de transcriptasa mejorada, tolerancia de emparejamientos erróneos, velocidad de extensión; tolerancia mejorada de los inhibidores de polimerasas y de RT; y/o incorporación mejorada de didesoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, análogos de ribonucleótidos, nucleótidos marcados con tintes, modulación de la actividad nucleasa 5', modulación de la actividad nucleasa 3' (o de corrección de errores) o similares. En consecuencia, en la realización de la presente invención como se describe en el presente documento, se predetermina la forma no modificada de una ADN polimerasa. La forma no modificada de una ADN polimerasa puede ser, por ejemplo, una ADN polimerasa natural o una ADN polimerasa que ya se ha modificado intencionadamente. Una forma no modificada de la polimerasa es preferentemente una ADN polimerasa termoestable, tal como ADN polimerasas de diversas bacterias termófilas, así como variantes funcionales de las mismas que tienen una identidad de secuencia sustancial con respecto a una polimerasa termoestable natural. Dichas variantes pueden incluir, por ejemplo, ADN polimerasas quiméricas, tales como, por ejemplo, las ADN polimerasas quiméricas descritas en las patentes de EE. UU. n.° 6.228.628 y 7.148.049. En determinados modos de realización, la forma no modificada de una polimerasa tiene actividad retrotranscriptasa (RT). El término "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima que es estable con respecto al calor, es resistente al calor y retiene suficiente actividad para efectuar reacciones de extensión de polinucleótido posteriores y no se desnaturaliza (inactiva) de forma irreversible cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleicos bicatenarios. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización de ácidos nucleicos son bien conocidas en la técnica y se ejemplifican, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 4.683.202, 4.683.195 y 4.965.188. Como se usa en el presente documento, una polimerasa termoestable es adecuada para su uso en una reacción de ciclos de temperatura, tal como la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"). La desnaturalización irreversible para los propósitos en el presente documento se refiere a la pérdida permanente y completa de actividad enzimática. Para una polimerasa termoestable, la actividad enzimática se refiere a la catálisis de la combinación de los nucleótidos de manera apropiada para formar productos de extensión de polinucleótido que sean complementarios a una hebra de ácido nucleico molde. Las ADN polimerasas termoestables de bacterias termófilas incluyen, por ejemplo, ADN polimerasas deThermotoga marítima, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Thermus filiformis,especie sps17 deThermus,especie Z05 deThermus(por ejemplo, polimerasa Z05D),Thermus caldophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga neopolitanayThermosipho africanuss.

El término "termoactiva" se refiere a una enzima que mantiene las propiedades catalíticas a las temperaturas usadas comúnmente para las etapas de retrotranscripción o hibridación/extensión en reacciones de RT-PCR y/o PCR (es decir, 45-80 °C). Las enzimas termoestables son aquellas que no se inactivan o desnaturalizan irreversiblemente cuando se someten a las elevadas temperaturas necesarias para la desnaturalización de ácidos nucleicos. Las enzimas termoactivas pueden o no ser termoestables. Las ADN polimerasas termoactivas pueden ser dependientes de ADN o ARN de especies termófilas o de especies mesófilas incluyendo, pero sin limitarse a,Escherichia coli,los virus de la leucemia murina de Moloney y los virus de la mioblastosis aviar.

Como se usa en el presente documento, una proteína "quimérica" se refiere a una proteína cuya secuencia de aminoácidos representa un producto de fusión de subsecuencias de las secuencias de aminoácidos de al menos dos proteínas distintas. Una proteína quimérica no se produce típicamente mediante manipulación directa de secuencias de aminoácidos, sino que, más bien, se expresa a partir de un gen "quimérico" que codifica la secuencia de aminoácidos quimérica. En determinados modos de realización, por ejemplo, una forma no modificada de una ADN polimerasa mutante de la presente invención es una proteína quimérica que consiste en una región aminoterminal (N terminal) derivada de una ADN polimerasa de una especie Thermus y una región carboxiterminal (C terminal) derivada de ADN polimerasa de Tma. La región N terminal se refiere a una región que se extiende desde el extremo N (posición de aminoácido 1) hacia un aminoácido interno. De forma similar, la región C terminal se refiere a una región que se extiende desde un aminoácido interno hacia el extremo C.

El término "aptámero" se refiere a un ADN monocatenario que reconoce y se une a ADN polimerasa e inhibe eficazmente la actividad polimerasa como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.693.502. El uso de aptámero y dUTP/UNG en la RT-PCR también se analiza, por ejemplo, en Smith, E.S. et al., (Amplification of RNA: High-temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated Thermostable DNA Polymerase, en PCR Primer: A Laboratory Manual, 2.a edición, Dieffenbach, C.W. y Dveksler, G.S., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 211-219, (2003)).

En el contexto de las ADN polimerasas mutantes, la "correspondencia" con otra secuencia (por ejemplo, regiones, fragmentos, posiciones de aminoácidos o nucleótidos, o similares) se basa en la convención de numeración de acuerdo con el número de posición de aminoácidos o nucleótidos y, a continuación, en la alineación de las secuencias de una manera que maximice el porcentaje de identidad de secuencia. Un aminoácido "correspondiente a la posición [X] de [secuencia específica]" se refiere a un aminoácido en un polipéptido de interés que se alinea con el aminoácido equivalente de una secuencia especificada. En general, como se describe en el presente documento, el aminoácido correspondiente a una posición de una polimerasa se puede determinar usando un algoritmo de alineación, tal como BLAST, como se describe a continuación. Puesto que no todas las posiciones dentro de una "región correspondiente" dada necesitan ser idénticas, las posiciones de no emparejamiento dentro de una región correspondiente se pueden considerar "posiciones correspondientes". En consecuencia, como se usa en el presente documento, la referencia a una "posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido [X]" de una ADN polimerasa especificada se refiere a posiciones equivalentes, basadas en la alineación, en otras ADN polimerasas y familias y homólogos estructurales. En algunos modos de realización de la presente invención, la "correspondencia" de las posiciones de aminoácidos se determina con respecto a una región de la polimerasa que comprende uno o más motivos.

"Recombinante", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que se ha modificado intencionadamente por procedimientos recombinantes. El término "ácido nucleico recombinante" en el presente documento significa un ácido nucleico, formado originalmentein vitro,en general, por la manipulación de un ácido nucleico por endonucleasas de restricción, en una forma que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Por tanto, tanto un ácido nucleico para ADN polimerasa mutante aislada, en forma lineal, como un vector de expresión formadoin vitrouniendo moléculas de ADN que no están unidas normalmente se consideran recombinantes para los propósitos de la presente invención. Se entiende que una vez que se prepara un ácido nucleico recombinante y se reintroduce en una célula huésped, se replicará de forma no recombinante, es decir, usando la maquinaria celularin vivode la célula huésped en lugar de manipulacionesin vitro; sin embargo, dichos ácidos nucleicos, una vez producidos de forma recombinante, aunque posteriormente se repliquen de forma no recombinante, todavía se consideran recombinantes para los propósitos de la invención. Una "proteína recombinante" es una proteína preparada usando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se representa anteriormente.

Un ácido nucleico se "enlaza de forma funcional" cuando se dispone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador se enlaza de forma funcional a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma se enlaza de forma funcional a una secuencia codificante si se sitúa para facilitar la traducción.

El término "célula huésped" se refiere tanto a organismos procariotas y eucariotas unicelulares (por ejemplo, bacterias, levaduras y actinomicetos) como a células individuales disociadas de plantas o animales de orden superior cuando crecen en cultivo celular.

El término "vector" se refiere a un fragmento de ADN, típicamente bicatenario, que puede tener insertado en él un fragmento de ADN exógeno. El vector puede ser, por ejemplo, de origen plasmídico. Los vectores contienen secuencias de polinucleótido de "replicón" que facilitan la replicación autónoma del vector en una célula huésped. Se define ADN exógeno como<a>D<n>heterólogo, que es ADN no encontrado de forma natural en la célula huésped, que, por ejemplo, replica la molécula del vector, codifica un marcador seleccionable o cribable o codifica un transgén. El vector se usa para transportar el ADN exógeno o heterólogo hasta una célula huésped adecuada. Una vez en la célula huésped, el vector se puede replicar independientemente de o coincidiendo con el ADN cromosómico del huésped, y se pueden generar varias copias del vector y su ADN insertado. Además, el vector también puede contener los elementos necesarios que permiten la transcripción del ADN insertado en una molécula de ARNm o de otro modo provocar la replicación del ADN insertado en múltiples copias de ARN. Algunos vectores de expresión contienen adicionalmente elementos de secuencia contiguos al ADN insertado que incrementan la semivida del ARNm expresado y/o permiten la traducción del ARNm en una molécula de proteína. Por tanto, se pueden sintetizar rápidamente muchas moléculas de ARNm y polipéptido codificadas por el ADN insertado.

El término "nucleótido", además de referirse a los monómeros de ribonucleótido o desoxirribonucleótido naturales, se entenderá que en el presente documento que se refiere a variantes estructurales relacionadas del mismo, incluyendo derivados y análogos, que son funcionalmente equivalentes con respecto al contexto particular en el que se usa el nucleótido (por ejemplo, hibridación a una base complementaria), a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.

El término "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a un polímero que se puede corresponder con un polímero de ácido nucleico de ribosa (ARN) o ácido nucleico de desoxirribosa (ADN), o un análogo del mismo. Esto incluye polímeros de nucleótidos, tales como ARN y ADN, así como formas sintéticas, formas modificadas (por ejemplo, modificadas química o bioquímicamente) de los mismos y polímeros mixtos (por ejemplo, que incluyen tanto subunidades de ADN como de ARN). Las modificaciones ejemplares incluyen metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos y similares), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), intercalantes (por ejemplo, acridina, soraleno y similares), quelantes, alquilantes y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa y similares). También se incluyen moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en su capacidad de unirse a una secuencia designada por medio de enlaces de hidrógeno y otras interacciones químicas. Típicamente, los monómeros de nucleótido se enlazan por medio de enlaces fosfodiéster, aunque las formas sintéticas de ácidos nucleicos pueden comprender otros enlaces (por ejemplo, ácidos peptidonucleicos como se describe en Nielsenet al.(Science 254:1497-1500, 1991). Por ejemplo, un ácido nucleico puede ser o puede incluir un cromosoma o segmento cromosómico, un vector (por ejemplo, un vector de expresión), un casete de expresión, un polímero de ARN o ADN no marcado, el producto de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un oligonucleótido, una sonda y un cebador. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, monocatenario, bicatenario o tricatenario y no está limitado a ninguna longitud particular. A menos que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico particular opcionalmente comprende o codifica secuencias complementarias, además de cualquier secuencia indicada explícitamente.

El término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico que incluye al menos dos unidades monoméricas de ácido nucleico (por ejemplo, nucleótidos). Un oligonucleótido incluye típicamente de aproximadamente seis a aproximadamente 175 unidades monoméricas de ácido nucleico, más típicamente de aproximadamente ocho a aproximadamente 100 unidades monoméricas de ácido nucleico, y todavía más típicamente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 unidades monoméricas de ácido nucleico (por ejemplo, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35 o más unidades monoméricas de ácido nucleico). El tamaño exacto de un oligonucleótido dependerá de muchos factores, incluyendo el uso o función final del oligonucleótido. Los oligonucleótidos se preparan opcionalmente mediante cualquier procedimiento adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, aislamiento de una secuencia existente o natural, replicación o amplificación del<a>D<n>, retrotranscripción, clonación y digestión de restricción de secuencias apropiadas, o síntesis química directa mediante un procedimiento tal como el procedimiento de fosfotriéster de Narang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979); el procedimiento de fosfodiéster de Brown et al.

(Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979); el procedimiento de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (Tetrahedron Lett.

22:1859-1862, 1981); el procedimiento de triéster de Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981); procedimientos de síntesis automatizados; o el procedimiento de soporte sólido de la patente de EE. UU. n.° 4.458.066 u otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. El término "cebador" como se usa en el presente documento se refiere a un polinucleótido que puede actuar como un punto de iniciación de la síntesis de ácidos nucleicos dirigida por molde cuando se dispone en condiciones en las que se inicia la extensión de polinucleótidos (por ejemplo, en condiciones que comprenden la presencia de nucleósidos trifosfato requeridos (como dicta el molde que se copia) y una polimerasa en un tampón apropiado y a una temperatura o ciclo(s) de temperatura adecuados (por ejemplo, como en una reacción en cadena de la polimerasa)). Para ilustrar adicionalmente, también se pueden usar los cebadores en una variedad de otros procedimientos de síntesis mediados por oligonucleótidos, incluyendo como iniciadores de la síntesis de ARNde novoy procedimientos relacionados con la transcripciónin vitro(por ejemplo, amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) amplificación mediada por transcripción (TMA), etc.). Un cebador es típicamente un oligonucleótido monocatenario (por ejemplo, oligodesoxirribonucleótido). La longitud apropiada de un cebador depende del uso previsto del cebador, pero típicamente varía de 6 a 40 nucleótidos, más típicamente de 15 a 35 nucleótidos. Las moléculas de cebador cortas requieren, en general, temperaturas más frescas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Un cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde, sino que debe ser suficientemente complementario para hibridarse con un molde para que se produzca la elongación del cebador. En determinados modos de realización, el término "par de cebadores" significa un conjunto de cebadores que incluye un cebador en sentido 5' (a veces llamado "directo") que hibrida con el complemento del extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico que se va a amplificar y un cebador en antisentido 3' (a veces llamado "inverso") que hibrida con el extremo 3' de la secuencia que se va a amplificar (por ejemplo, si la secuencia diana se expresa como ARN o es un ARN). Un cebador se puede marcar, si se desea, incorporando un marcador detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen 32P, tintes fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (como se usan comúnmente en ensayos ELISA), biotina o haptenos y proteínas para los que están disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales.

El término "convencional" o "natural" cuando se refiere a bases de ácidos nucleicos, nucleósidos trifosfato o nucleótidos se refiere a aquellos que se producen naturalmente en el polinucleótido que se describe (es decir, para el ADN estos son dATP, dGTp dCTp y dTTP). Adicionalmente, con frecuencia se utilizan dITP y 7-desazadGTP en lugar de dGTP y se puede utilizar 7-desaza-dATP en lugar de dATP en reacciones de síntesis de ADNin vitro,tales como secuenciación. Conjuntamente, estos se pueden denominar dNTP.

El término "no convencional" o "modificado" cuando se refiere a una base, nucleósido o nucleótido de ácido nucleico incluye modificación, derivaciones o análogos de bases, nucleósidos o nucleótidos convencionales que se producen naturalmente en un polinucleótido particular. Un ejemplo de una base de ácido nucleico no convencional o modificada incluye dNTP metilados, en los que un grupo metilo está unido al dNTP. Uno cualquiera o más de los grupos a-, p- o Y-fosfato se pueden modificar con uno o más grupos metilo. En un modo de realización preferente, el dNTP metilado tiene un grupo metilo añadido al grupo Y-fosfato. Determinados nucleótidos no convencionales están modificados en la posición 2' del glúcido ribosa en comparación con los dNTP convencionales. Por tanto, aunque para el ARN los nucleótidos naturales son ribonucleótidos (es decir, ATP, GTP, CTP, UTP, conjuntamente rNTP), dado que estos nucleótidos tienen un grupo hidroxilo en la posición 2' del glúcido que, en comparación, está ausente en los dNTP, como se usa en el presente documento, los ribonucleótidos son nucleótidos no convencionales como sustratos para las ADN polimerasas. Como se usa en el presente documento, los nucleótidos no convencionales incluyen, pero no se limitan a, compuestos usados como finalizadores para la secuenciación de ácidos nucleicos. Los compuestos finalizadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los compuestos que tienen una estructura 2',3'-didesoxi y se denominan didesoxinucleósidos trifosfato. Los didesoxinucleósidos trifosfato ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP se denominan conjuntamente ddNTP. Los ejemplos adicionales de compuestos finalizadores incluyen análogos 2'-PO4 de ribonucleótidos (véase por ejemplo, las publicaciones de solicitudes de patente de EE. UU. n.° 2005/0037991 y 2005/0037398). Otros nucleótidos no convencionales incluyen fosforotioato dNTP ([a-S]dNTP), 5'-[a-borano]-dNTP, [a]-metilfosfonato dNTP y ribonucleósidos trifosfato (rNTP). Las bases no convencionales se pueden marcar con isótopos radiactivos, tales como 32P, 33P o 35S; marcadores fluorescentes; marcadores quimioluminiscentes; marcadores bioluminiscentes; marcadores con hapteno tales como biotina; o marcadores enzimáticos tales como estreptavidina o avidina. Los marcadores fluorescentes pueden incluir tintes que están cargados negativamente, tales como tintes de la familia de la fluoresceína, o tintes que tienen carga neutra, tales como tintes de la familia de la rodamina, o tintes que están cargados positivamente, tales como tintes de la familia de la cianina. Por ejemplo, los tintes de la familia de la fluoresceína incluyen FAM, HEX, TET, JOE, NAN y ZOE. Los tintes de la familia de la rodamina incluyen Texas Red, ROX, R110, R6G y TAMRA. Diversos tintes o nucleótidos marcados con FAM, HEX, TET, JOE, Na N, ZOE, ROX, R110, R6G, Texas Red y TAMRA se comercializan por Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA) o Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR). Los tintes de la familia de la cianina incluyen Cy2, Cy3, Cy5 y Cy7, y se comercializan por GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra).

Como se usa en el presente documento, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación, en la que la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se produce el residuo de aminoácido o la base de ácido nucleico idénticos en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas entre el número total de posiciones existentes en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia.

Los términos "idéntico" o "identidad" en porcentaje en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Las secuencias son "sustancialmente idénticas" entre sí si tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales (por ejemplo, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad en una región especificada) cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación o región designada medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. Estas definiciones también se refieren al complemento de una secuencia problema. Opcionalmente, la identidad existe en una región que es de al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, o más típicamente en una región que es de 100 a 500 o de 1000 o más nucleótidos de longitud.

Los términos "similitud" o "similitud en porcentaje", en el contexto de dos o más secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos que son iguales o bien similares como se define por una sustitución aminoacídica conservadora (por ejemplo, un 60 % de similitud, opcionalmente un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % similar en una región determinada) cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación o región designada medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. Las secuencias son "sustancialmente similares" entre sí si son al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 % o al menos un 55 % similares entre sí. Opcionalmente, esto existe de forma similar en una región que es de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, o más típicamente en una región que es de al menos aproximadamente 100 a 500 o de 1000 o más aminoácidos de longitud.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias problema. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias problema y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Comúnmente se usan parámetros de programa predeterminados o se pueden designar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula las similitudes o identidades de secuencia en porcentaje para las secuencias problema con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, incluye la referencia a un segmento de uno cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en de 20 a 600, normalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más normalmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en las que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alineen óptimamente. Los procedimientos de alineación de secuencias para su comparación son bien conocidos en la técnica. Se puede llevar a cabo la alineación óptima de secuencias para su comparación, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1970), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology (suplemento de 1995)).

Los ejemplos de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y de similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977), y Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990), respectivamente. El programa informático para realizar análisis por BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica en primer lugar identificar pares de secuencias de puntuación alta (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coincidan o bien satisfagan alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando están alineadas con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de palabras de vecindad (Altschulet al.,supra). Estos resultados iniciales de palabras de vecindad actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que los contengan. Los resultados positivos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia mientras se pueda incrementar la puntuación de alineación acumulada. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos emparejados, siempre >0) y N (puntuación de penalización para los residuos de emparejamiento erróneo, siempre <0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de los resultados positivos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulada cae en la cantidad X desde su valor máximo logrado; la puntuación acumulada pasa a ser cero o inferior debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valores por defecto una longitud de palabra de 3 y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) usa alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca por casualidad un emparejamiento entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico problema con respecto al ácido nucleico de referencia es menos de aproximadamente 0,2, típicamente menos de aproximadamente 0,01 y más típicamente menos de aproximadamente 0,001.

El término "valor de Cp" o valor de "punto de corte" se refiere a un valor que permite la cuantificación de ácidos nucleicos diana de entrada. Se puede determinar el valor de Cp de acuerdo con el procedimiento del máximo de la segunda derivada (Van Luu-The, et al., "Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction", BioTechniques, vol. 38, n.° 2, febrero de 2005, pp. 287-293). En el procedimiento de la segunda derivada, un Cp corresponde al primer pico de una curva de segunda derivada. Este pico corresponde al comienzo de una fase semilogarítmica. El procedimiento de la segunda derivada calcula un valor de la segunda derivada de la curva de intensidad de fluorescencia en tiempo real y solo se obtiene un valor. El procedimiento de Cp original se basa en una aproximación diferenciable definida localmente de los valores de intensidad, por ejemplo, por una función polinómica. A continuación, se computa la tercera derivada. El valor de Cp es la raíz más pequeña de la tercera derivada. También se puede determinar el Cp usando el procedimiento de punto de ajuste, en el que se determina el Cp por la intersección de una paralela a la línea umbral en la región semilogarítmica (Van Luu-The, et al., BioTechniques, vol. 38, n.° 2, febrero de 2005, pp. 287-293). El valor de Cp proporcionado por el instrumento LightCycler ofrecido por Roche por cálculo de acuerdo con el procedimiento del máximo de la segunda derivada.

El término "eficacia de la PCR" se refiere a una indicación de la eficacia de amplificación de ciclo a ciclo. Se calcula la eficacia de la PCR para cada condición usando la ecuación: % de eficacia de la PCR = (10('pendiente)-1) x 100, en la que la pendiente se calculó por regresión lineal con el logaritmo del número de copias representado en el eje de ordenadas y Cp representado en el eje de abscisas. Se puede medir la eficacia de la pCr usando un molde de cebador emparejado perfectamente o emparejado erróneamente.

El término "velocidad de extensión de ácido nucleico" se refiere a la velocidad a la que un biocatalizador (por ejemplo, una enzima, tal como una polimerasa, ligasa o similar) extiende un ácido nucleico (por ejemplo, un cebador u otro oligonucleótido) de una manera independiente de molde o dependiente de molde acoplando (por ejemplo, covalentemente) uno o más nucleótidos al ácido nucleico. Como ilustración, determinadas ADN polimerasas mutantes descritas en el presente documento tienen velocidades de extensión de ácido nucleico mejoradas con respecto a formas no modificadas de dichas ADN polimerasas, de modo que pueden extender cebadores a velocidades más altas que estas formas no modificadas en un conjunto dado de condiciones de reacción.

El término "tolerancia de los inhibidores de polimerasas y de RT" se refiere a la capacidad de una polimerasa para mantener la actividad (actividad polimerasa o de retrotranscripción) en presencia de una cantidad de un inhibidor que inhibiría la actividad polimerasa o actividad de retrotranscripción de una polimerasa de control. En algunos modos de realización, la polimerasa mejorada puede tener actividad polimerasa o de retrotranscripción en presencia de una cantidad del inhibidor que eliminaría esencialmente la actividad de la polimerasa de control.

El término "desoxirribonucleósido trifosfato" o "dNTP" es un término genérico que se refiere a los desoxirribonucleótidos, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dITP y/o dUTP. Los nucleósidos trifosfato que contienen desoxirribosa se denominan dNTP, y toman el prefijo desoxi- en sus nombres y d- minúscula en sus abreviaturas: desoxiadenosina trifosfato (dATP), desoxiguanosina trifosfato (dGTP), desoxicitidina trifosfato (dCTP), desoxitimidina trifosfato (dTTP), desoxiinosina trifosfato (dITP) y desoxiuridina trifosfato (dUTP). Los dNTP son los componentes básicos para la replicación del ADN (pierden dos de los grupos fosfato en el procedimiento de incorporación). Cada dNTP está formado por un grupo fosfato, un glúcido desoxirribosa y una base nitrogenada. La estructura de doble hélice del ADN está compuesta de dNTP, de manera muy parecida a las unidades monoméricas de un polímero.

El término "cebadores alquilados" se refiere a oligonucleótidos en los que se han modificado una o más de las bases mediante la adición de un grupo alquilo. El uso de los cebadores modificados de la invención da como resultado una reducción en la amplificación no específica, especialmente de la formación de dímeros de cebador, y/o un incremento concomitante del rendimiento de la diana deseada con respecto a una amplificación llevada a cabo con cebadores no modificados (véase la patente de EE. UU. n.° 6.001.611).

Los términos "dNTP metilado" o "me-dNTP" se refieren a cualquier desoxirribonucleósido trifosfato o dNTP que tiene uno o más grupos metilo añadidos. Los ejemplos incluyen dATP metilado, dCTP metilado, dGTP metilado y dTTP metilado. Se pueden añadir uno o más grupos metilo a uno o más de cualquiera de los grupos a-, p- o Y-fosfato encontrados en los dNTP. En un ejemplo particular, los dNTP metilados son de modo que el grupo Y-fosfato terminal de cada dNTP se modifica con un grupo metilo, lo que proporciona un componente de dNTP más estable para su uso en reacciones de amplificación, tales como PCR, en comparación con los dNTP convencionales no metilados. En tal caso, cuando se usa un dNTP metilado que tiene un grupo metilo en el grupo y-fosfato, dado que el grupo metilo está en el grupo y-fosfato, el grupo metilo no se incorpora al amplicón durante la fase de extensión de la PCR porque el grupo Y-fosfato se escinde como pirofosfato. De esta manera, se emplea un componente más estable sin interferir con la reacción de PCR.

Los términos "dNTP fluorado", "fluoro-dNTP", "F-dNTP" o "f-dNTP" se refieren a cualquier desoxirribonucleósido trifosfato o dNTP que se haya fluorado en uno de los grupos fosfato. Los ejemplos incluyen fluoro-dATP, fluorodCTP, fluoro-dGTP, fluoro-dTTP y fluoro-dUTP. El átomo de flúor puede reemplazar un oxígeno en uno de cualquiera de los grupos a-, p- o Y-fosfato encontrados en los dNTP. En un ejemplo particular, los fluoro-dNTP son de modo que el grupo Y-fosfato terminal de cada dNTP está fluorado, lo que proporciona un componente de dNTP más estable para su uso en reacciones de amplificación, tales como PCR, en comparación con los dNTP convencionales no modificados.

La expresión "sonda de nucleasa 5'" se refiere a un oligonucleótido que comprende al menos un resto de marcaje emisor de luz y que se usa en una reacción de nucleasa 5' para lograr la detección de ácidos nucleicos diana. En algunos modos de realización, por ejemplo, una sonda de nucleasa 5' incluye únicamente un único resto emisor de luz (por ejemplo, un tinte fluorescente, etc.). En determinados modos de realización, las sondas de nucleasa 5' incluyen regiones de autocomplementariedad, de modo que las sondas pueden formar estructuras de horquilla en condiciones seleccionadas. Como ilustración adicional, en algunos modos de realización una sonda de nucleasa 5' comprende al menos dos restos de marcaje y emite radiación de intensidad incrementada, después de que uno de los dos marcadores se haya escindido o separado de otro modo del oligonucleótido. En determinados modos de realización, se marca una sonda de nucleasa 5' con dos tintes fluorescentes diferentes, por ejemplo, un tinte indicador de extremo 5' y el resto o tinte extintor de extremo 3'. En algunos modos de realización, las sondas de nucleasa 5' se marcan en una o más posiciones distintas de, o además de, las posiciones de los extremos. Cuando la sonda está intacta, típicamente se produce transferencia de energía entre los dos fluoróforos, de modo que la emisión fluorescente del tinte indicador se extingue al menos en parte. Durante un etapa de extensión de una reacción en cadena de la polimerasa, por ejemplo, se escinde una sonda de nucleasa 5' unida a un ácido nucleico molde mediante la actividad nucleasa 5' a 3' de, por ejemplo, una polimerasaTaqu otra polimerasa que tenga esta actividad, de modo que la emisión fluorescente del tinte indicador ya no se extingue. También se describen sondas de nucleasa 5' ejemplares, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 5.210.015, 5.994.056 y 6.171.785. En otros modos de realización, se puede marcar una sonda de nucleasa 5' con dos o más tintes indicadores diferentes y un resto o tinte extintor de extremo 3'.

El término "FRET" o "transferencia de energía por resonancia de fluorescencia" o "transferencia de energía por resonancia de Forster" se refiere a una transferencia de energía entre al menos dos cromóforos, un cromóforo donante y un cromóforo aceptor (denominado extintor). El donante típicamente transfiere la energía al aceptor cuando se excita el donante por radiación de luz con una longitud de onda adecuada. El aceptor típicamente reemite la energía transferida en forma de radiación de luz con una longitud de onda diferente. Cuando el aceptor es un extintor "oscuro", disipa la energía transferida en una forma distinta de la luz. Que un fluoróforo particular actúe como donante o aceptor depende de las propiedades del otro miembro del par de FRET. Los pares donante-aceptor usados comúnmente incluyen el par FAM-TAMRA. Los extintores usados comúnmente son DABCYL y TAMRA. Los extintores oscuros usados comúnmente incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), lowa Black™ (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, lowa) y BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).

Breve descripción de los dibujos

Lafigura 1muestra datos de PCR en tiempo real que demuestran un rendimiento mejorado de Z05D-F2 con dNTP metilados o dNTP fluorados.

Lafigura 2muestra datos de PCR en tiempo real que comparan la incorporación de dNTP metilados a diferentes concentraciones. La incorporación de dNTP regulares 1 mM por el Z05D original se muestra como punto de referencia y base de comparación.

Lafigura 3muestra la estructura cristalina del fragmento Klenow de la ADN polimerasa Taq en el complejo ternario con molde y ddCTP (código de acceso a PDB 4N5S). La ADN polimerasa Taq se usa como modelo para Z05D. Los residuos I638 y V703 (I640 y V705) correspondientes están marcados.

Lafigura 4muestra datos de PCR en tiempo real que comparan la incorporación de dNTP regulares no modificados o dNTP metilados por el Z05D original (SEQ ID NO:2), Z05D-F2 (SEQ ID NO:3) y los mutantes únicos Z05D-I640M (SEQ ID NO:4) y Z05D-V705L (SEQ ID NO:5).

Lafigura 5muestra datos de RT-PCR que comparan la incorporación de dNTP metilados por el Z05D original (SEQ ID NO:2), Z05D-F2 (SEQ ID NO:3) y los mutantes únicos Z05D-I640M (SEQ ID NO:4) y Z05D-V705L (SEQ ID NO:5). Se usó una transcripción de p-catenina como molde de ARN con cebador alquilado y dNTP metilados (a 1 mM o 2 mM). Los datos de Z05D con dNTP regulares (no modificados) se mostraron como punto de referencia.

Descripción detallada

La presente invención proporciona ADN polimerasas mejoradas en las que se han mutado uno o más aminoácidos del dominio de polimerasa con respecto a una ADN polimerasa no modificada. Las ADN polimerasas de la invención son enzimas activas que tienen una capacidad mejorada para incorporar eficiente y eficazmente dNTP metilados, con respecto a la forma no modificada de la polimerasa.

Las ADN polimerasas que incorporan dNTP metilados más eficiente y eficazmente son útiles, por ejemplo, en una variedad de aplicaciones que implican ensayos que emplean RT-PCR para detectar y/o cuantificar dianas de ARN. Por lo tanto, las ADN polimerasas son útiles en una variedad de aplicaciones que implican la extensión de polinucleótidos, así como la retrotranscripción o amplificación de moldes de polinucleótido, incluyendo, por ejemplo, aplicaciones en estudios de ADN recombinante y en el diagnóstico médico de enfermedades.

En algunos modos de realización, una polimerasa de la invención es una polimerasa quimérica, es decir, que comprende regiones polipeptídicas de dos o más enzimas. Los ejemplos de dichas ADN polimerasas quiméricas se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 6.228.628. Son en particular adecuadas las ADN polimerasas quiméricas de la familia CS, que incluyen las polimerasas CS5 y CS6 y variantes de las mismas que tienen una identidad o similitud de secuencia de aminoácidos sustancial (típicamente al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos y más típicamente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos). Las ADN polimerasas CS5 y CS6 son enzimas quiméricas derivadas de las ADN polimerasas deThermussp. Z05 yThermotoga marítima (Tma).Comprenden el dominio de nucleasa 5' N terminal de la enzima deThermusy los dominios de polimerasa y exonucleasa 3'-5' C terminales de la enzima deTma.Estas enzimas tienen actividad retrotranscriptasa eficaz, pueden extender cebadores que contienen análogos de nucleótidos y pueden incorporar alfa-fosforotioato dNTP, dUTP, dITP y también dNTP marcados con tintes de la familia de fluoresceína y cianina. Las polimerasas CS5 y CS6 también son enzimas de PCR activadas por Mg2+ eficaces. Las polimerasas quiméricas CS5 y CS6 se describen adicionalmente, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.148.049.

En algunos modos de realización, las sustituciones aminoacídicas son sustituciones de un solo aminoácido. Las ADN polimerasas proporcionadas en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones aminoacídicas en el sitio activo con respecto a la polimerasa no modificada. Las sustituciones aminoacídicas en estas posiciones confieren una capacidad mejorada para incorporar dNTP metilados, proporcionando una ADN polimerasa mutante con una capacidad mejorada para incorporar dNTP metilados con respecto a la polimerasa no modificada. En algunos modos de realización, el aminoácido en la posición 640 y/o 705 de Z05D se sustituye por un aminoácido que no corresponde a la secuencia natural de Z05D. En determinados modos de realización, el aminoácido en la posición 640 de Z05D se sustituye por metionina (Met o M) y/o el aminoácido en la posición 705 de Z05D se sustituye por leucina (Leu o L). Se puede(n) determinar otra(s) sustitución/sustituciones aminoacídicas adecuada(s) en uno o más de los sitios identificados usando, por ejemplo, procedimientos conocidos de mutagénesis dirigida y determinación del rendimiento de extensión de polinucleótidos en ensayos descritos adicionalmente en el presente documento o de otro modo conocidos por expertos en la técnica.

En algunos modos de realización, la polimerasa de la invención comprende la SEQ ID NO:3 y comprende además uno o más cambios de aminoácidos adicionales (por ejemplo, mediante deleción, adición o sustitución aminoacídica) en comparación con una polimerasa natural.

En algunos modos de realización, dichas polimerasas variantes funcionales típicamente tendrán una identidad o similitud de secuencia sustancial con la polimerasa natural, típicamente al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos y más típicamente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%o 99%de identidad de secuencia de aminoácidos.

Se puede(n) determinar otra(s) sustitución/sustituciones aminoacídicas adecuada(s) en uno o más de los sitios identificados usando, por ejemplo, procedimientos conocidos de mutagénesis dirigida y determinación del rendimiento de extensión de polinucleótidos en ensayos descritos adicionalmente en el presente documento o de otro modo conocidos por expertos en la técnica, por ejemplo, las sustituciones aminoacídicas descritas en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2009/0148891 y 2009/0280539.

En algunos modos de realización, la ADN polimerasa de la presente invención se deriva de la ADN polimerasa Z05 deTermo sp.(SEQ ID NO:1) o una variante de la misma (por ejemplo, que porta la mutación D580G, como Z05D (SEQ ID NO:2) o similar). Por tanto, en determinadas variaciones de la invención, la polimerasa mutante comprende al menos una sustitución aminoacídica, con respecto a una ADN polimerasa Z05D deThermus sp.(o una ADN polimerasa que es sustancialmente idéntica, por ejemplo, al menos aproximadamente un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % idéntica a la s Eq iD nO:2), en la posición 640 y/o la posición 705. En determinados modos de realización, el aminoácido en la posición 640 de SEQ ID NO:2 es metionina (Met o M) (es decir, SEQ ID NO:3 o 4). En determinados modos de realización, el aminoácido en la posición 705 de SEQ ID NO:2 es leucina (Leu o L) (es decir, SEQ ID NO:3 o 5). Los mutantes ejemplares de la ADN polimerasa Z05 deTermo sp.incluyen aquellos que comprenden la sustitución aminoacídica D580G (es decir, Z05D (SEQ ID NO:2)). En algunos modos de realización, la ADN polimerasa Z05 deThermus sp.mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos de aminoácidos D580G e I640M (SEQ ID NO:4). En algunos modos de realización, la ADN polimerasa Z05 deThermus sp.mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos de aminoácidos D580G y V705L (SEQ ID NO:5). En algunos modos de realización, la ADN polimerasa Z05 deThermussp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos de aminoácidos D580G, I640M y V705L (SEQ ID NO:3). En determinados modos de realización, la ADN polimerasa Z05 deThermus sp.mutante comprende, por ejemplo, una o más sustituciones de residuos de aminoácidos seleccionadas de D580G, I640M y/o V705L (SEQ ID NO:3-5).

Se demostró previamente que las sustituciones en el aminoácido correspondiente a la posición 580 de SEQ ID NO:1 (Z05), que se conoce como Z05D (SEQ ID NO:2), pueden dar como resultado ADN polimerasas que tienen actividad polimerasa mejorada, incluyendo, por ejemplo, velocidades de extensión, eficiencia de retrotranscripción y/o capacidad de amplificación mejoradas (véanse las patentes de EE. UU. n.° 8.962.293 y 9.102.924; y la publicación de patente de EE. UU. n.° US 2016-0024548). Por tanto, se espera que las polimerasas mejoradas que comprenden sustituciones en el aminoácido correspondiente a la posición 580 de SEQ ID NO:1 (Z05) descritas en el presente documento también tengan las propiedades mejoradas descritas anteriormente.

Además de las mutaciones y sustituciones descritas en el presente documento, las ADN polimerasas de la presente invención también pueden incluir otras modificaciones no sustitutivas. Dichas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, modificaciones covalentes conocidas en la técnica para conferir una ventaja adicional en aplicaciones que comprenden extensión de polinucleótidos. Por ejemplo, una de dichas modificaciones es una modificación covalente reversible térmicamente que inactiva la enzima, pero que se invierte para activar la enzima tras la incubación a una temperatura elevada, tal como una temperatura usada típicamente para la extensión de polinucleótidos. Los reactivos ejemplares para dichas modificaciones reversibles térmicamente se describen en las patentes de EE. UU. n.° 5.773.258 y 5.677.152.

Las ADN polimerasas de la presente invención se pueden construir mutando las secuencias de ADN que codifican la polimerasa no modificada correspondiente (por ejemplo, una polimerasa natural o una variante correspondiente de la que deriva la polimerasa de la invención), tal como usando técnicas denominadas comúnmente mutagénesis dirigida. Las moléculas de ácido nucleico que codifican la forma no modificada de la polimerasa se pueden mutar mediante una diversidad de técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocidas por un experto en la técnica. (Véase, por ejemplo, PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand, and J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA) en el capítulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T J. White eds., Academic Press, NY, 1990).

A modo de ejemplo no limitante, se puede emplear el sistema de dos cebadores, utilizado en el kit de mutagénesis dirigida a sitio por transformador de Clontech, para introducir mutantes dirigidos en un polinucleótido que codifica una forma no modificada de la polimerasa. Después de la desnaturalización del plásmido diana en este sistema, se hibridan simultáneamente dos cebadores al plásmido; uno de estos cebadores contiene la mutación dirigida deseada, el otro contiene una mutación en otro punto del plásmido que da como resultado la eliminación de un sitio de restricción. A continuación, se lleva a cabo la síntesis de la segunda hebra, enlazando firmemente estas dos mutaciones, y los plásmidos resultantes se transforman en una cepa mutS deE. coli.Se aísla el ADN plasmídico de las bacterias transformadas, se restringe con la enzima de restricción pertinente (linealizando de este modo los plásmidos no mutados) y, a continuación, se retransforma enE. coli.Este sistema permite la generación de mutaciones directamente en un plásmido de expresión, sin la necesidad de subclonar o generar fagémidos monocatenarios. El firme enlace de las dos mutaciones y la linealización posterior de los plásmidos no mutados dan como resultado una eficacia de mutación alta y permiten un cribado mínimo. Después de la síntesis del cebador de sitio de restricción inicial, este procedimiento requiere el uso de únicamente un nuevo tipo de cebador por cada sitio de mutación. En lugar de preparar cada mutante posicional por separado, se puede sintetizar un conjunto de cebadores oligonucleotídicos "de diseño degenerado" para introducir simultáneamente todas las mutaciones deseadas en un sitio dado. Se pueden cribar los transformantes mediante secuenciación del ADN plasmídico a través de la región mutagenizada para identificar y clasificar clones mutantes. A continuación, se puede restringir y analizar mediante electroforesis cada ADN mutante, tal como, por ejemplo, en un gel de potenciación de la detección de mutaciones (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ), para confirmar que no se han producido otras alteraciones en la secuencia (mediante comparación por desplazamiento de banda con respecto al control no mutagenizado). De forma alternativa, se puede secuenciar toda la región de ADN para confirmar que no se ha producido ningún acontecimiento mutacional adicional fuera de la región diana.

Las ADN polimerasas con más de un aminoácido sustituido se pueden generar de diversas maneras. En el caso de aminoácidos localizados cerca entre sí en la cadena polipeptídica, se pueden mutar simultáneamente usando un oligonucleótido que codifique todas las sustituciones aminoacídicas deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos se localizan a cierta distancia entre sí (separados por más de diez aminoácidos, por ejemplo), es más difícil generar un único oligonucleótido que codifique todos los cambios deseados. En su lugar, se puede emplear uno de dos procedimientos alternativos. En el primer procedimiento se genera un oligonucleótido separado para cada aminoácido que se va a sustituir. A continuación, se hibridan simultáneamente los oligonucleótidos al ADN molde monocatenario, y la segunda hebra de ADN que se sintetiza a partir del molde codificará todas las sustituciones aminoacídicas deseadas. Un procedimiento alternativo implica dos o más rondas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera ronda es como se describe para los mutantes únicos: se usa ADN que codifica la polimerasa no modificada para el molde, se hibrida un oligonucleótido que codifica la(s) primera(s) sustitución/sustituciones aminoacídicas deseada(s) a este molde, y, a continuación, se genera la molécula de ADN heterodúplex. La segunda ronda de mutagénesis utiliza el ADN mutado producido en la primera ronda de mutagénesis como molde. Por tanto, este molde ya contiene una o más mutaciones. El oligonucleótido que codifica la(s) sustitución/sustituciones aminoacídicas deseada(s) adicional(es) se hibrida a continuación a este molde, y la hebra de ADN resultante codifica ahora mutaciones tanto de la primera como de la segunda ronda de mutagénesis. Se puede usar este ADN resultante como molde en una tercera ronda de mutagénesis, y así sucesivamente. De forma alternativa, se puede utilizar el procedimiento de mutagénesis de sitio múltiple de Seyfang & Jin (Anal. Biochem. 324:285-291. 2004).

En consecuencia, también se proporcionan ácidos nucleicos recombinantes que codifican cualquiera de las ADN polimerasas de la presente invención. Usando un ácido nucleico de la presente invención, que codifica una ADN polimerasa, se pueden preparar una variedad de vectores. En la práctica de la invención se puede usar cualquier vector que contenga secuencias de control y replicón que deriven de una especie compatible con la célula huésped. En general, los vectores de expresión incluyen regiones de ácido nucleico reguladoras transcripcionalesy traduccionales enlazadas de forma funcional al ácido nucleico que codifica la ADN polimerasa. El término "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante enlazada de forma funcional en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de unión a ribosoma. Además, el vector puede contener un elemento retrorregulador positivo (pRE) para potenciar la semivida del ARNm transcrito (véase Gelfandet al.,patente de EE. UU. n.° 4.666.848). Las regiones de ácido nucleico reguladoras transcripcionales y traduccionales serán, en general, apropiadas para la célula huésped usada para expresar la polimerasa. En la técnica se conocen numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas para una variedad de células huésped. En general, las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales pueden incluir, por ejemplo, secuencias promotoras, sitios de unión ribosómicos, secuencias de inicio y parada transcripcionales, secuencias de inicio y parada traduccionales y secuencias potenciadoras o activadoras. En modos de realización típicos, las secuencias reguladoras incluyen un promotor y secuencias de inicio y parada transcripcionales. Los vectores también incluyen típicamente una región de policonector que contiene varios sitios de restricción para la inserción de ADN exógeno. En determinados modos de realización se usan "señales de fusión" para facilitar la purificación y, si se desea, la retirada posterior de la secuencia de etiqueta/señal, por ejemplo, la "etiqueta His". Sin embargo, en general, estas son innecesarias cuando se purifica una proteína termoactiva y/o termoestable de un huésped mesófilo (por ejemplo,E. coli)donde se puede emplear una "etapa de calor". La construcción de vectores adecuados que contienen ADN que codifica secuencias de replicación, secuencias reguladoras, genes de selección de fenotipo y la polimerasa de interés se preparan usando procedimientos de ADN recombinante estándar. Los plásmidos aislados, vectores víricos y fragmentos de ADN se escinden, adaptan y ligan entre sí en un orden específico para generar los vectores deseados, como es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, 2.a ed. 1989)).

En determinados modos de realización, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células huésped transformadas. Los genes de selección son bien conocidos en la técnica y variarán con la célula huésped usada. Los genes de selección adecuados pueden incluir, por ejemplo, genes que codifican la resistencia a tetraciclina y/o ampicilina, que posibilita que las células transformadas con estos vectores crezcan en presencia de estos antibióticos.

En un aspecto de la presente invención, se puede introducir un ácido nucleico que codifica una ADN polimerasa en una célula, ya sea solo o en combinación con un vector. Por "introducir en" o equivalentes gramaticales en el presente documento se quiere decir que los ácidos nucleicos entran en las células de una manera adecuada para la posterior integración, amplificación y/o expresión del ácido nucleico. El procedimiento de introducción está dictado en gran medida por el tipo de célula seleccionada como diana. Los procedimientos ejemplares incluyen precipitación con CaPO4, fusión de liposomas, LIPOFECTIN®, electroporación, infección vírica y similares.

En algunos modos de realización, típicamente se usan procariotas como células huésped para las etapas de clonación iniciales de la presente invención. Son en particular útiles para la producción rápida de grandes cantidades de ADN, para la producción de moldes de ADN monocatenario usados para la mutagénesis dirigida, para cribar simultáneamente muchos mutantes y para la secuenciación de ADN de los mutantes generados. Las células huésped procariotas adecuadas incluyen la cepa 94 deE. coliK12 (ATCC n.° 31.446), la cepa W3110 deE. coli(ATCC n.° 27.325), la cepa DG116 deE. coliK12 (ATCC n.° 53.606),E. coliX1776 (ATCC n.° 31.537) yE. coliB; sin embargo, se pueden usar como huéspedes todas de muchas otras cepas deE. coli,tales como HB101, JM101, NM522, NM538, NM539, y muchas otras especies y géneros de procariotas, que incluyen bacilos tales comoBacillus subtilis,otras enterobacterias tales comoSalmonella typhimuriumoSerratia marcesansy diversas especies dePseudomonas.Las células huésped procarióticas u otras células huésped con paredes celulares rígidas se transforman típicamente usando el procedimiento de cloruro de calcio como se describe en la sección 1.82 de Sambrooket al, supra.De forma alternativa, se puede usar electroporación para la transformación de estas células. Las técnicas de transformación de procariotas se exponen, por ejemplo, en Dower, en Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990); Hanahan et al., Meth. Enzymol., 204:63, 1991. Los plásmidos usados típicamente para la transformación deE. coliincluyen pBR322, pUCI8, pUCI9, pUCIl8, pUC119 y Bluescript M13, todos los cuales se describen en las secciones 1.12-1.20 de Sambrooket al, supra.Sin embargo, también están disponibles muchos otros vectores adecuados.

Las ADN polimerasas de la presente invención se producen típicamente cultivando una célula huésped transformada con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica la ADN polimerasa, en las condiciones apropiadas para inducir o provocar la expresión de la ADN polimerasa. Los procedimientos de cultivo de células huésped transformadas en condiciones adecuadas para la expresión de proteínas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrooket al, supra).Las células huésped adecuadas para la producción de las polimerasas a partir de vectores plasmídicos que contienen promotor pL lambda incluyen la cepa DG116 deE. coli(ATCC n.° 53606) (véase la patente de e E. UU. n.° 5.079.352 y Lawyer, F.C.et al.,PCR Methods and Applications 2:275-87, 1993). Después de la expresión, la polimerasa se puede recoger y aislar. Los procedimientos para purificar la ADN polimerasa termoestable se describen, por ejemplo, en Lawyeret al, supra.Una vez purificada, se puede someter a prueba la capacidad de las ADN polimerasas para tener eficacia de RT mejorada y tolerancia de emparejamientos erróneos, velocidad de extensión y/o tolerancia de los inhibidores de polimerasas y de RT incrementadas (por ejemplo, como se describe en los ejemplos).

Las ADN polimerasas mejoradas de la presente invención se pueden usar para cualquier propósito en el que dicha actividad enzimática sea necesaria o deseada. En consecuencia, en otro aspecto de la invención, se proporcionan procedimientos de extensión de polinucleótidos (por ejemplo, PCR) usando las polimerasas. Las condiciones adecuadas para la extensión de polinucleótidos son conocidas en la técnica (Véase, por ejemplo, Sambrooket al., supra.Véase también Ausubelet al.,Short Protocols in Molecular Biology (4.a ed., John Wiley & Sons 1999). En general, un cebador se hibrida a un ácido nucleico diana para formar un complejo cebadormolde. El complejo cebador-molde se pone en contacto con la ADN polimerasa y nucleósidos trifosfato en un ambiente adecuado para permitir la adición de uno o más nucleótidos al extremo 3' del cebador, produciendo de este modo un cebador extendido complementario al ácido nucleico diana. El cebador puede incluir, por ejemplo, uno o más análogos de nucleótidos. Además, los nucleósidos trifosfato pueden ser nucleótidos convencionales, nucleótidos no convencionales (por ejemplo, ribonucleótidos o nucleótidos marcados) o una mezcla de los mismos. En algunas variaciones, la reacción de extensión de polinucleótidos comprende la amplificación de un ácido nucleico diana. También son conocidas en la técnica condiciones adecuadas para la amplificación de ácidos nucleicos usando una ADN polimerasa y un par de cebadores (por ejemplo, procedimientos de amplificación por PCR). (Véase, por ejemplo, Sambrooket al., supra;Ausubelet al., supra;PCR Applications: Protocols for Functional Genomics (Innis et al. eds., Academic Press 1999). En otros modos de realización no mutuamente excluyentes, la reacción de extensión de polinucleótidos comprende la retrotranscripción de un molde de ARN (por ejemplo, RT-PCR). En algunos modos de realización, las polimerasas mejoradas encuentran uso en secuenciación 454 (Margulies, M et al. 2005, Nature, 437, 376-380). Opcionalmente, la reacción de extensión del cebador comprende un inhibidor real o potencial de una polimerasa de referencia o no modificada. Por ejemplo, el inhibidor puede inhibir la velocidad de extensión de ácido nucleico y/o la eficacia de retrotranscripción de una polimerasa de referencia o no modificada (de control). En algunos modos de realización, el inhibidor es hemoglobina o un producto de degradación de la misma. Por ejemplo, en algunos modos de realización, el producto de degradación de hemoglobina es un producto de descomposición de hemo, tal como hemina, hematoporfirina o bilirrubina. En algunos modos de realización, el inhibidor es un quelante de hierro o un pigmento púrpura. En otros modos de realización, el inhibidor es heparina. En determinados modos de realización, el inhibidor es un tinte intercalante. En determinados modos de realización, el inhibidor es melanina, que se ha descrito como inhibidor de polimerasas. Véase, por ejemplo, Ekhardt, et al., Biochem Biophys Res Commun. 271(3):726-30 (2000).

Se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invención para extender moldes en presencia de moldes de polinucleótido aislados de muestras que comprenden inhibidores de polimerasas, por ejemplo, tales como sangre. Por ejemplo, se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invención para extender moldes en presencia de hemoglobina, un componente principal de la sangre, o en presencia de un producto de degradación de hemoglobina. La hemoglobina se puede degradar en diversos productos de descomposición de hemo, tales como hemina, hematina, hematoporfirina y bilirrubina. Por tanto, en determinados modos de realización, se pueden usar ADN polimerasas de la presente invención para extender moldes en presencia de productos de degradación de hemoglobina, incluyendo, pero sin limitarse a, hemina, hematina, hematoporfirina y bilirrubina. En determinados modos de realización, el producto de degradación de hemoglobina es hemina. En algunos modos de realización, se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invención para extender moldes en presencia de hemina aproximadamente de 0,5 a 20,0|jM, aproximadamente de 0,5 a 10,0|jM, aproximadamente de 0,5 a 5.0<j>M, aproximadamente de 1,0 a 10,0<j>M, aproximadamente de 1,0 a 5,0<j>M, aproximadamente de 2,0 a 5.0 j M o aproximadamente de 2,0 a 3,0 j M. En otros modos de realización, se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invención para extender moldes en presencia de hemina al menos aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 4,0, 5,0, 10,0, 20,0 o más de 20 j M. Los productos de descomposición de hemoglobina incluyen quelantes de hierro y pigmentos púrpura. Por tanto, en algunos modos de realización, se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invención para extender moldes en presencia de quelantes de hierro y/o pigmentos púrpura. En otros modos de realización, se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invención para extender moldes en presencia de cantidades de productos de degradación de hemoglobina que inhibirían la extensión del mismo molde por una ADN polimerasa de referencia o de control.

Se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invención para extender moldes en presencia de heparina. La heparina está presente comúnmente como un anticoagulante en muestras aisladas de sangre. En algunos modos de realización, se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invención para extender moldes en presencia de aproximadamente de 1,0 a 400 ng/jl, de 1,0 a 300 ng/jl, de 1,0 a 200 ng/jl, de 5,0 a 400 ng/jl, de 5.0 a 300 ng/jl, de 5,0 a 200 ng/jl, de 10,0 a 400 ng/jl, de 10,0 a 300 ng/jl o de 10,0 a 200 ng/jl de heparina. En algunos modos de realización, se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invención para extender moldes en presencia de al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ng/|jl o más de 400 ng/pl de heparina. En otros modos de realización, se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invención para extender moldes en presencia de cantidades de heparina que inhibirían la extensión del mismo molde por una ADN polimerasa de referencia o de control.

En algunos modos de realización, se usa una polimerasa mejorada de la invención en una reacción de retrotranscripción. En algunos modos de realización, se lleva a cabo la reacción de retrotranscripción en una mezcla que contenga el molde de ARN, uno o más cebadores y una ADN polimerasa termoestable de la invención. La mezcla de reacción contiene típicamente los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTP) estándar (o versiones metiladas de los dNTP) y un tampón que contiene un catión divalente y un catión monovalente. Los cationes ejemplares incluyen, por ejemplo, Mg2+, aunque otros cationes, tales como Mn2+ o Co2+, pueden activar ADN polimerasas. En otros modos de realización, se lleva a cabo la reacción de retrotranscripción con una ADN polimerasa termoactiva de la invención. En modos de realización particulares, la polimerasa mejorada de la invención permite una amplificación más eficaz de moldes de ARN sin comprometer la amplificación eficaz de un molde de ADN en presencia de Mn2+ o Mg2+, como se describe en los ejemplos.

En algunos modos de realización, la polimerasa mejorada tiene capacidad mejorada para incorporar dNTP metilados más estables, en comparación con la polimerasa de control. No se apreció previamente que las sustituciones en el aminoácido correspondiente a las posiciones 640 y/o 705 de Z05D (SEQ ID NO:2) pudieran dar como resultado la capacidad de incorporar dNTP metilados. Por tanto, en algunos modos de realización, las ADN polimerasas que tienen una sustitución de Ile (I) por Met (M) en el aminoácido correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO:2 y/o una sustitución de Val (V) por leucina (L) en el aminoácido correspondiente a la posición 705 de SEQ ID NO:2 podría dar como resultado una capacidad mejorada para incorporar dNTP metilados. En algunos modos de realización, la ADN polimerasa que tiene una capacidad mejorada para incorporar dNTP metilados más estables, en comparación con la polimerasa de control, comprende una sustitución de Ile (I) por Met (M) en el aminoácido correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO:2 y/o una sustitución de Val (V) por Leu (L) en el aminoácido correspondiente a la posición 705 de SEQ ID NO:2, y tiene al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las SEQ ID NO:1-5.

Los ácidos nucleicos diana pueden proceder de una fuente biológica o sintética. La diana puede ser, por ejemplo, ADN o ARN. En general, cuando se generen amplicones, los amplicones estarán compuestos de ADN, aunque también se pueden incorporar ribonucleótidos o nucleótidos sintéticos en el amplicón. Cuando se desea detectar un ARN, el procedimiento de amplificación implica típicamente el uso de retrotranscripción, incluyendo, por ejemplo, PCR con retrotranscripción (RT-PCR).

Las secuencias diana específicas pueden incluir, por ejemplo, ácidos nucleicos víricos (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (<v>H<b>), (citomegalovirus (CMV), parvovirus B19, virus de Epstein-Barr, virus de la hepatitis C (VHC), papilomavirus humano (VPH), virus de la encefalitis japonesa (VEJ), virus del Nilo Occidental (VNO), virus de la encefalitis de San Luis (VESL), virus de la encefalitis del valle de Murray y virus Kunjin), ácidos nucleicos bacterianos (por ejemplo, S.aureus, Neisseria meningitidis, Plasmodium falciparum, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachomatis),micobacterias, ácidos nucleicos fúngicos o ácidos nucleicos de animales o plantas. En algunos modos de realización, los ácidos nucleicos diana son ácidos nucleicos de animales (por ejemplo, humanos) o derivan de una muestra animal (por ejemplo, humana) (es decir, pueden estar presentes ácidos nucleicos de organismos víricos o de otros patógenos en una muestra de una biopsia animal, muestra de sangre, muestra de orina, muestra fecal, saliva, etc.). En algunos modos de realización, los ácidos nucleicos diana son, por ejemplo, regiones genéticas humanas que pueden incluir variantes asociadas con la enfermedad (por ejemplo, cáncer, diabetes, etc.). Debido a que, en algunos modos de realización, las polimerasas de la invención tienen tolerancia de emparejamientos erróneos, dichas enzimas pueden ser en particular útiles, por ejemplo, donde una diversidad de secuencias relacionadas podría estar en una secuencia diana. Como ejemplo, se puede usar la invención para detectar patógenos víricos, donde los patógenos víricos tienen suficiente variación en sus genomas para hacer difícil o imposible diseñar un conjunto único o pequeño de cebadores que amplifiquen la mayoría o todos los genomas víricos posibles o en marcadores genéticos de cáncer o de otras enfermedades donde se sabe o es probable que se produzca una variación en la secuencia.

Otros procedimientos para detectar productos de extensión o productos de amplificación que usan las polimerasas mejoradas descritas en el presente documento incluyen el uso de tintes de unión a nucleótidos bicatenarios fluorescentes o tintes intercalantes de nucleótidos bicatenarios fluorescentes. Los ejemplos de tintes de unión a ADN bicatenario fluorescentes incluyen SYBR-green (Molecular Probes). Se pueden usar los tintes de unión a ADN bicatenario junto con el análisis de curvas de fusión para medir productos de extensión del cebador y/o productos de amplificación. Se puede realizar el análisis de curvas de fusión en un instrumento de PCR en tiempo real, tal como el instrumento ABI 5700/7000 (formato de 96 pocillos) o ABI 7900 (formato de 384 pocillos) con programa informático integrado (SDS 2.1). De forma alternativa, se puede realizar el análisis de curvas de fusión como un análisis de punto final. Los procedimientos ejemplares de análisis de puntos de fusión se describen en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2006/0172324.

En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan kits para su uso en procedimientos de extensión del cebador descritos en el presente documento. En algunos modos de realización, el kit se compartimenta para facilitar su uso y contiene al menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa mejorada de acuerdo con la presente invención. También se pueden incluir uno o más recipientes adicionales que proporcionan un reactivo o reactivos adicionales. En algunos modos de realización, el kit también puede incluir un tubo, recipiente o unidad de extracción sanguínea que comprende heparina o una sal de la misma, o libera heparina a la solución. La unidad de extracción sanguínea puede ser un tubo heparinizado. Dichos recipientes adicionales pueden incluir cualquier reactivo u otros elementos reconocidos por el experto en la técnica para su uso en procedimientos de extensión del cebador de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente, incluyendo reactivos para su uso, por ejemplo, en procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR, RT-PCR), procedimientos de secuenciación de ADN o procedimientos de marcaje de ADN. Por ejemplo, en determinados modos de realización, el kit incluye además un recipiente que proporciona un cebador de sentido 5' hibridable, en condiciones de extensión de cebador, a un molde de polinucleótido predeterminado, o un par de cebadores que comprende el cebador en sentido 5' y un cebador en antisentido 3' correspondiente. En otras variaciones no mutuamente excluyentes, el kit incluye uno o más recipientes que proporcionan nucleósidos trifosfato (convencionales y/o no convencionales). En modos de realización específicos, el kit incluye alfafosforotioato dNTP, dUTP, dlTP, y/o dNTP marcados, tales como, por ejemplo, dNTP marcados con tintes de la familia de fluoresceína y cianina o dNTP metilados. Todavía en otros modos de realización no mutuamente excluyentes, el kit incluye uno o más recipientes que proporcionan un tampón adecuado para una reacción de extensión de cebador.

En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan mezclas de reacción que comprenden las polimerasas con capacidad mejorada para incorporar dNTP metilados, como se describe en el presente documento. Las mezclas de reacción pueden comprender además reactivos para su uso, por ejemplo, en procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR, RT-PCR), procedimientos de secuenciación de ADN o procedimientos de marcaje de ADN. Por ejemplo, en determinados modos de realización, las mezclas de reacción comprenden un tampón adecuado para una reacción de extensión del cebador. Las mezclas de reacción también pueden contener un ácido nucleico molde (ADN y/o ARN), uno o más polinucleótidos cebadores o de sonda, nucleósidos trifosfato (incluyendo, por ejemplo, desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos marcados, nucleótidos no convencionales, dNTP metilados), sales (por ejemplo, Mn2+, Mg2+), marcadores (por ejemplo, fluoróforos). En algunos modos de realización, las mezclas de reacción contienen un cebador de sentido 5' hibridable, en condiciones de extensión de cebador, a un molde de polinucleótido predeterminado, o un par de cebadores que comprende el cebador en sentido 5' y un cebador en antisentido 3' correspondiente. En algunos modos de realización, las mezclas de reacción contienen alfa-fosforotioato dNTP, dUTP, dITP, y/o dNTP marcados, tales como, por ejemplo, dNTP marcados con tintes de la familia de fluoresceína o cianina, y/o dNTP metilados. En algunos modos de realización, las mezclas de reacción comprenden un quelante de hierro o un tinte púrpura. En determinados modos de realización, las mezclas de reacción comprenden hemoglobina o un producto de degradación de la hemoglobina. Por ejemplo, en determinados modos de realización, los productos de degradación de hemoglobina incluyen productos de descomposición de hemo, tales como hemina, hematina, hematoforina y bilirrubina. En otros modos de realización, las mezclas de reacción comprenden heparina o una sal de la misma. En determinados modos de realización, la mezcla de reacción contiene un ácido nucleico molde que se aísla de la sangre. En otros modos de realización, el ácido nucleico molde es ARN y la mezcla de reacción comprende heparina o una sal de la misma.

En algunos modos de realización, la mezcla de reacción comprende dos o más polimerasas. Por ejemplo, en algunos modos de realización, la mezcla de reacción comprende una primera ADN polimerasa que tiene eficacia de retrotranscriptasa incrementada en comparación con una polimerasa de control y una segunda ADN polimerasa que tiene actividad polimerasa dependiente de ADN. La segunda ADN polimerasa puede ser una polimerasa natural o no modificada, o puede ser una polimerasa mejorada que tiene actividad polimerasa dependiente de ADN incrementada. Dichas mezclas de reacción son útiles para la amplificación de moldes de ARN (por ejemplo, RT-PCR) proporcionando tanto una polimerasa que tiene actividad retrotranscriptasa incrementada como una polimerasa que tiene actividad polimerasa dependiente de ADN.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.

Ejemplo 1: Identificación de la polimerasa modificada

La polimerasa modificada se basó en un mutante conocido de la polimerasa Z05 natural (SEQ ID NO:1), conocida como Z05D (SEQ ID NO:2, descrita en la patente de EE. UU. n.° 8.962.293). El mutante Z05D tiene el aminoácido ácido aspártico (D) en la posición 580 reemplazado por el aminoácido glicina (G) (es decir, Z05D es una polimerasa Z05D con una mutación D580G) (SEQ ID NO:2). La polimerasa modificada de la invención es conocida como "mutante F2 de Z05" o ("Z05D-F2") (SEQ ID NO:3). El mutante F2 de Z05D se encontró en una colección generada mediante PCR propensa a errores, usando un cribado basado en PCR que usa dNTP metilados y cebadores alquilados. Z05D-F2 se expresó y purificó a mayor escala (500 ml) y se confirmó la incorporación de dNTP metilados por Z05D-F2 en un ensayo de PCR, como se muestra en la figura 1. Las secuencias de las diversas polimerasas empleadas se representan en la tabla 1 a continuación.

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�� Para todos los experimentos de PCR descritos en estos ejemplos, los cebadores usados tenían la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:7 y 8, la sonda usada tenía la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:9 y el molde usado tenía la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:10, como se muestra a continuación en la tabla 2, a continuación.

Tabla 2

Mientras que el Z05D original (SEQ ID NO:2) no incorpora dNTP metilados, Z05D-F2 (SEQ ID NO:3) realizó con éxito la PCR usando dNTP 1 mM en condiciones estándar del cobas 6800/8800. Las condiciones se muestran en la tabla 3 a continuación.

Tabla 3

Sin embargo, se observó un retraso de aproximadamente 6 ciclos cuando se usó Z05D-F2 y dNTP metilados en comparación con la referencia con Z05D original y dNTP regulares (es decir, dNTP no metilados). Además de los dNTP metilados, también se sometieron a prueba dNTP fluorados (F-dNTP) como otra alternativa estable candidata que también evitaría posiblemente la hidrólisis de nucleótidos. Sin embargo, Z05D-F2 incorporó F-dNTP con una eficacia muy baja (Cp > 40). Incluso el incremento de la concentración de F-dNTP no dio como resultado una mejora significativa del rendimiento de la PCR. Por el contrario, el incremento de la concentración de dNTP metilados en la mezcla maestra a 2 mM mejoró la eficacia de la PCR, y el valor de Cp determinado fue idéntico al valor de Cp para la Z05D original y los nucleótidos no modificados en condiciones estándar, como se muestra en la figura 2.

Ejemplo 2: Polimerasas modificadas que incorporan dNTP modificados

La variante Z05D-F2 alberga dos sustituciones aminoacídicas: I640M y V705L (SEQ ID NO:3), como se muestra en la figura 3. Se realizó una deconvolución de las dos sustituciones aminoacídicas y se evaluaron las variantes de un solo aminoácido con respecto a su incorporación de dNTP metilados. Por lo tanto, se generaron, se expresaron y se purificaron las variantes de un solo aminoácido Z05D-I640M (SEQ ID NO:4) y Z05D-V705L (SEQ ID NO:5) mediante mutagénesis dirigida. Se evaluó el rendimiento de la PCR de las variantes de un solo aminoácido, el mutante doble F2 (SEQ ID NO:3) y la proteína Z05D original (SEQ ID NO:2) usando dNTP no modificados regulares, dNTP metilados y F-dNTP, como se muestra en las figuras 4A y 4B. Se sometieron a prueba concentraciones iguales de variantes de Z05D usando un molde de ADN con cebadores alquilados en la mezcla maestra (mostrados en la tabla 3 anterior). Con dNTP regulares, el mutante único Z05D-V705L (SEQ ID NO:5) muestra el mismo rendimiento que el Z05D original (SEQ ID NO:2), mientras que tanto el mutante doble Z05D-F2 (SEQ ID NO:3) como el mutante único Z05D-I640M (SEQ ID NO:4) muestran un valor de Cp retrasado y una señal de fluorescencia más baja. Por otra parte, Z05D-F2 (SEQ ID NO:3) y Z05D-I640M (SEQ ID NO:4) son las únicas variantes que admiten PCR con dNTP metilados. Tomados conjuntamente, estos datos sugieren que I640M es la sustitución aminoacídica fundamental para la incorporación de dNTP metilados. De forma interesante, Z05D-I640M (SEQ ID NO:4) muestra un retraso de 5 ciclos en comparación con el mutante doble de Z05D (Z05D-F2, SEQ ID NO:3). Esto sugiere que, si bien la sustitución aminoacídica V705L no promueve la PCR con dNTP metilados por sí sola, la sustitución aminoacídica V705L da como resultado un incremento en la eficacia de la PCR con nucleótidos modificados en el mutante doble Z05D-F2 (SEQ ID NO:3). Los dNTP fluorados (F-dNTP) no se incorporan en absoluto o solo lo hacen con una eficacia muy baja por las diferentes proteínas (datos no mostrados).

Ejemplo 3: Incorporación de dNTP metilados por polimerasa modificada en un ensayo de VIH

Para emplear dNTP metilados como una alternativa de nucleótido estable en un ensayo, tal como un ensayo de VIH para el sistema cobas® Liat®, los dNTP metilados y Z05D-F2 (SEQ ID NO:3) necesitan promover la RT-PCR. Por lo tanto, para someter esto a prueba, se realizó RT-PCR usando un transcrito de p-catenina como molde de ARN con cebador alquilado y dNTP metilados 1 mM o 2 mM. En comparación, se realizó en paralelo una reacción usando Z05D original (SEQ ID NO:2) y nucleótidos no modificados. Los resultados se presentan en la figura 5. Como se esperaba, el mutante único Z05D-V705L (SEQ ID NO:5) no mostró ninguna curva de crecimiento, y el mutante único Z05D-I640M (SEQ ID NO:4) solo admitió RT-PCR con una concentración incrementada de dNTP metilados. El mutante doble, Z05D-F2 (SEQ ID NO:3), realizó con éxito la RT-PCR a una concentración de dNTP metilados de 1 mM y 2 mM, pero los valores de Cp se retrasaron en ~9 y ~4 ciclos, respectivamente en estas condiciones de mezcla maestra. Para optimizar el rendimiento de RT-PCR, otros componentes de la mezcla maestra (por ejemplo, iones de metal, concentración de sal) pueden requerir ajustes.

Claims

REIVINDICACIONES

1.Una ADN polimerasa que tiene al menos un 90%de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2 y que tiene una eficacia incrementada en la incorporación de desoxinudeótidos trifosfato (dNTP) metilados en comparación con una ADN polimerasa de control, en la que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO:2 es M y en la que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa, excepto que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 640 de SEQ ID NO: 2 es I.

2.La ADN polimerasa de la reivindicación 1, en la que el aminoácido correspondiente a la posición 705 de SEQ ID NO:2 es cualquier secuencia de aminoácidos distinta de V.

3.La ADN polimerasa de la reivindicación 2, en la que el aminoácido correspondiente a la posición 705 de SEQ ID NO:2 es L.

4.La ADN polimerasa de la reivindicación 1, en la que la ADN polimerasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

5.La ADN polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la ADN polimerasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3.

6.Un ácido nucleico recombinante que codifica la ADN polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7.Un vector que comprende el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 6.

8.Un kit para producir un cebador extendido que comprende al menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9.El kit de la reivindicación 8 que comprende además uno o más recipientes adicionales seleccionados del grupo que consiste en:

(a) un recipiente que proporciona un cebador hibridable, en condiciones de extensión del cebador, a un molde de polinucleótido predeterminado;

(b) un recipiente que proporciona dNTP; y

(c) un recipiente que proporciona un tampón adecuado para la extensión del cebador.

10.El kit de la reivindicación 9, en el que los dNTP son dNTP metilados.

11.Una mezcla de reacción que comprende una ADN polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, al menos un cebador, un molde de polinucleótido y dNTP.

12.La mezcla de reacción de la reivindicación 11, en la que el molde de polinucleótido es ARN o ADN.

13.La mezcla de reacción de la reivindicación 11 o 12, que comprende además Mg2+.

14.La mezcla de reacción de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende además una segunda ADN polimerasa termoestable.

15.Un procedimiento para llevar a cabo la extensión del cebador, que comprende:

poner en contacto una ADN polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 con un cebador, un molde de polinucleótido y nucleósidos trifosfato en condiciones adecuadas para la extensión del cebador, produciendo de este modo un cebador extendido.