ES2624406T3 - ADN polimerasas con actividad mejorada - Google Patents

Abstract

Una ADN polimerasa que tiene eficacia de transcriptasa inversa incrementada en comparación con una ADN polimerasa de control, en la que la ADN polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 y en la que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 763 de la SEQ ID NO: 1 es T, el aminoácido correspondiente a la posición 709 de la SEQ ID NO: 1 es K y el aminoácido correspondiente a la posición 580 de la SEQ ID NO: 1 es G, y en la que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto en que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 763 de la SEQ ID NO: 1 es M.

Description

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DESCRIPCION

ADN polimerasas con actividad mejorada Campo de la invencion

La presente invencion proporciona ADN polimerasas con actividades mejoradas, incluyendo eficacia de transcriptasa inversa incrementada, asi como el uso de dichas polimerasas en diversas aplicaciones, incluyendo la extension y amplificacion de polinucleotidos de acidos nucleicos.

Antecedentes de la invencion

Las ADN polimerasas son responsables de la replicacion y mantenimiento del genoma, un papel que es fundamental para transmitir con precision la informacion genetica de generacion a generacion. Las aDn polimerasas funcionan en las celulas como las enzimas responsables de la sintesis del ADN. Polimerizan los desoxirribonucleosidos trifosfato en presencia de un activador de metal, tal como Mg2+, en un orden dictado por el molde de ADN o molde de polinucleotidos que se copia. In vivo, las ADN polimerasas participan en un espectro de procesos de sintesis del ADN, incluyendo la replicacion del ADN, reparacion del ADN, recombinacion y amplificacion genica. Durante cada proceso de sintesis del ADN, el molde de ADN se copia una vez o, como maximo, unas pocas veces para producir replicas identicas. Por el contrario, in vitro, la replicacion del ADN se puede repetir muchas veces, tal como, por ejemplo, durante la reaccion en cadena de la polimerasa (vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.683.202).

En los estudios iniciales con la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), se anadio la ADN polimerasa al inicio de cada tanda de replicacion del ADN (vease la patente de Ee. UU. n.° 4.683.202, supra). Posteriormente, se determino que se podian obtener ADN polimerasas termoestables a partir de bacterias que crecen a temperaturas elevadas y que unicamente se necesita anadir estas enzimas una vez (vease la patente de EE. UU. n.° 4.889.818 y la patente de EE. UU. n.° 4.965.188). A las temperaturas elevadas usadas durante la PCR, estas enzimas no se inactivan irreversiblemente. Como resultado, se pueden llevar a cabo ciclos repetitivos de reacciones en cadena de la polimerasa sin anadir nuevas enzimas al inicio de cada proceso de adicion de sintesis. Las ADN polimerasas, particularmente las polimerasas termoestables, son la clave de un gran numero de tecnicas en estudios de ADN recombinante y en el diagnostico medico de la enfermedad. Para aplicaciones diagnosticas, en particular, una secuencia de acidos nucleicos diana unicamente puede ser una pequena porcion del ADN o ARN en cuestion, de modo que puede ser dificil detectar la presencia de una secuencia de acidos nucleicos diana sin amplificacion.

El patron de plegamiento global de las ADN polimerasas se asemeja a la mano derecha humana y contiene tres subdominios distintos de la palma, dedos y pulgar. (Vease Beese et al., Science 260:352-355, 1993); Patel et al., Biochemistry 34:5351-5363, 1995). Mientras que la estructura de los subdominios de dedos y pulgar varian en gran medida entre polimerasas que difieren en tamano y en funciones celulares, todos los subdominios cataliticos de la palma se pueden superponer. Por ejemplo, el motivo A, que interacciona con el dNTP de entrada y estabiliza el estado de transicion^ durante la catalisis quimica, se puede superponer con una desviacion media de aproximadamente un A entre las ADN polimerasas de la familia pol a de mamiferos y pol I de procariotas (Wang et al., Cell 89:1087-1099, 1997). El motivo A comienza estructuralmente en una cadena p antiparalela que contiene predominantemente residuos hidrofobos y continua en una helice a. La secuencia de aminoacidos primaria de los sitios activos de la ADN polimerasa esta excepcionalmente conservada. Por ejemplo, en el caso del motivo A, se retiene la secuencia DYSQIELR (SEQ ID NO:22) en polimerasas de organismos separados por muchos millones de anos de evolucion, incluyendo, por ejemplo, Thermus aquaticus, Chlamydia trachomatis y Escherichia coli.

Ademas de estar bien conservado, tambien se ha demostrado que el sitio activo de las ADN polimerasas es relativamente mutable, puede acomodar determinadas sustituciones de aminoacidos sin reducir significativamente la actividad de la ADN polimerasa (vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.602.695). Dichas ADN polimerasas mutantes pueden ofrecer diversas ventajas selectivas, por ejemplo, en aplicaciones diagnosticas y de investigacion que comprenden reacciones de sintesis de acidos nucleicos.

Existen al menos dos etapas en el proceso enzimatico de la polimerizacion del ADN; 1) la incorporacion del nucleotido de entrada y 2) la extension del nucleotido recien incorporado. Generalmente se considera la fidelidad global o "fidelidad" de la ADN polimerasa como un conglomerado de estas dos actividades enzimaticas, pero las etapas son distintas. Una ADN polimerasa puede incorporar erroneamente el nucleotido de entrada, pero, si no se extiende eficazmente, la velocidad de extension disminuira gravemente y la formacion del producto global sera minima. De manera alternativa, es posible tener una ADN polimerasa que incorpore erroneamente el nucleotido de entrada y facilmente extienda erroneamente el emparejamiento erroneo recien formado. En este caso, la velocidad de extension global seria alta, pero la fidelidad global seria baja. Un ejemplo de este tipo de enzima seria la ADN polimerasa ES112 (ADN polimerasa E683R Z05, vease el documento US 7.179.590) cuando se usa Mn2+ como el activador de ion de metal divalente. La enzima tiene una eficacia muy alta porque, a diferencia de las ADN polimerasas tipicas que tienden a vacilar/bloquearse al encontrar un emparejamiento erroneo, la ADN polimerasa ES112 extiende facilmente el emparejamiento erroneo. El fenotipo mostrado en ES112 es mas pronunciado durante la etapa de RT, supuestamente a causa de los efectos estructurales del heteroduplex ARN/ADN frente al

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homoduplex ADN/ADN. Un segundo ejemplo seria si la ADN polimerasa facilmente no incorpora erroneamente (puede ser incluso menos probable incorporar erroneamente), pero si tiene capacidad incrementada para extender erroneamente un emparejamiento erroneo. En este caso, no se altera significativamente la fidelidad para el producto global. En general, este tipo de enzima es mas favorable para las reacciones de extension que las caracteristicas de ES112 en Mn2+ porque se mejora la fidelidad del producto. Sin embargo, se puede utilizar este atributo para permitir la extension erronea de un cebador oligonucleotidico emparejado erroneamente, tal como cuando un cebador oligonucleotidico de una secuencia unica se hibrida a una diana que tiene heterogeneidad de secuencia (por ejemplo, dianas viricas), pero la velocidad de incorporacion erronea normal o mas baja permite la finalizacion de la sintesis del ADN mas alla del cebador oligonucleotidico original. Un ejemplo de este tipo de ADN polimerasa es la ADN polimerasa Z05 D580G (vease la publicacion de patente de EE. Uu. n.° 2009/0148891). Este tipo de actividad se denomina "tolerante al emparejamiento erroneo" a causa de que es mas tolerante a los emparejamientos erroneos en el cebador oligonucleotidico. Mientras que los ejemplos anteriores han analizado las reacciones de tipo de extension del cebador, la actividad puede ser mas significativa en reacciones tales como RT-PCR y PCR donde con frecuencia se produce nuevamente la extension del cebador. Los datos sugieren que mientras las enzimas, tales como Z05 D580G, son mas “tolerantes” a los emparejamientos erroneos, tambien tienen capacidad potenciada para extender los cebadores oligonucleotidicos que contienen bases modificadas (por ejemplo, bases modificadas con t- butilbencilo) o en presencia de tintes de union a ADN, tales como SYBR Green I (vease la publicacion de patente n.° 2009/028053).

La reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa (RT-PCR) es una tecnica usada en muchas aplicaciones para detectar y/o cuantificar dianas de ARN mediante amplificacion. A fin de amplificar dianas de ARN mediante PCR, en primer lugar es necesario transcribir de manera inversa el molde de ARN en ADNc. Tipicamente, los ensayos por RT-PCR dependen de una transcriptasa inversa no termoestable (ADN polimerasa dependiente de ARN), derivada de un organismo mesofilo, para la etapa de sintesis ADNc inicial (RT). Se requiere una ADN polimerasa termoestable adicional para la amplificacion del ADNc para tolerar las temperaturas elevadas requeridas para la desnaturalizacion del acido nucleico en la PCR. Existen varios beneficios potenciales de usar ADN polimerasas termoactivas o termoestables generadas para realizar una transcripcion inversa mas eficaz para los ensayos por RT-PCR. La actividad de transcriptasa inversa incrementada acoplada con la capacidad de usar temperaturas de incubacion de transcripcion inversa mas altas que permiten la relajacion de la estructura secundaria del molde de ARN puede dar como resultado sensibilidad del ensayo y eficacia de sintesis del ADNc global mas altas. Una temperatura de incubacion mas alta tambien podria incrementar la especificidad reduciendo el falso cebado en la etapa de transcripcion inversa. Las enzimas con eficacia de transcripcion inversa mejorada pueden simplificar el diseno del ensayo permitiendo una concentracion enzimatica y/o tiempos de incubacion de RT reducidos. Cuando se usan dUTP y UNG, los productos de extension no especificos que contienen dUMP que se forman durante las condiciones establecidas no restrictivas se degradan mediante UNG y no se pueden utilizar ni como cebadores ni como moldes. Cuando se usa una transcriptasa inversa no termoestable (ADN polimerasa dependiente de ARN) derivada de un organismo mesofilo, no es posible utilizar las metodologias de dUTP y UNG. (Myers, T.W. et al., Amplification of RNA: High Temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with Thermus thermophilus DNA Polymerase, in PCR Strategies, Innis, M.A., Gelfand, D.H., y Sninsky, J.J., Eds., Academic Press, San Diego, CA, 58-68, (1995)). Sin embargo, el uso de una ADN polimerasa termoactiva o termoestable de la invencion para la etapa de transcripcion inversa posibilita que la reaccion sea completamente compatible con la utilizacion del sistema de prevencion de transferencia de dUTP/uracil-N-glicosilasa (UNG) (Longo et al., Use of Uracil DNA Glycosylase to Control Carry-over Contamination in Polymerase Chain Reactions. Gene 93:125-128, (1990). Ademas de proporcionar un control de la contaminacion por transferencia, el uso de dUTP y UNG proporciona un "inicio en caliente" para reducir la amplificacion no especifica (Innis y Gelfand 1999).

Breve sumario de la invencion

En el presente documento se proporcionan ADN polimerasas que tienen actividades mejoradas, incluyendo eficacia de transcriptasa inversa incrementada en relacion con una polimerasa de control no modificada correspondiente, y procedimientos para preparar y usar dichas ADN polimerasas. En algunos modos de realizacion, la ADN polimerasa mejorada tiene eficacia de transcriptasa inversa incrementada en comparacion con una ADN polimerasa de control. En algunos modos de realizacion, la ADN polimerasa mejorada tiene la misma actividad de polimerasa dependiente de ADN o sustancialmente similar en comparacion con una ADN polimerasa de control.

En un aspecto, la invencion se refiere a una ADN polimerasa que tiene eficacia de transcriptasa inversa incrementada en comparacion con una ADN polimerasa de control, en la que la ADN polimerasa comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 % identica a la SEQ ID NO: 1 y en la que el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 es T, el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es K y el aminoacido correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 es G y en la que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoacidos que la ADN polimerasa excepto en que el aminoacido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 es M. Tambien se divulga que la ADN polimerasa mejorada comprende una secuencia de aminoacidos que es sustancialmente identica (por ejemplo, al menos aproximadamente un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %) a la SEQ ID NO: 1, en la que el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de M o I.

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Tambien se divulga que el aminoacido correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de D. Tambien se divulga que el aminoacido correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo que consiste en L, G, T, Q, A, S, N, R y K. Tambien se divulga que el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de I. Tambien se divulga que el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo que consiste en K, R, S, G y A. Tambien se divulga que el aminoacido correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de D y el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de I. Tambien se divulga que el aminoacido correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo que consiste en L, G, T, Q, A, S, N, R y K y el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo que consiste en K, R, S, G y A. Tambien se divulga que el aminoacido correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 es G y el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es K. En algunos modos de realizacion, la ADN polimerasa tiene la misma actividad de polimerasa dependiente de ADN o sustancialmente similar en comparacion con la ADN polimerasa de control. Tambien se divulga que la ADN polimerasa tiene eficacia de transcriptasa inversa incrementada sin una disminucion sustancial de la actividad de polimerasa dependiente de ADN en comparacion con una ADN polimerasa de control, en la que el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO:1 es cualquier aminoacido distinto de M o I, y el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de I y en la que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoacidos que la ADN polimerasa excepto en que el aminoacido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 es M o I y el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es I.

Tambien se divulga que la ADN polimerasa mejorada comprende una secuencia de aminoacidos que es sustancialmente identica (por ejemplo, al menos aproximadamente un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % identica) a la SEQ ID NO: 1, en la que el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de D o E. Tambien se divulga que el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de D. Tambien se divulga que el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo que consiste en L, G, T, Q, A, S, N, R y K. Tambien se divulga que el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 es G.

Tambien se divulga que la ADN polimerasa mejorada comprende una secuencia de aminoacidos que es sustancialmente identica (por ejemplo, al menos aproximadamente un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %) a la SEQ ID NO: 1, en la que el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de I. Tambien se divulga que el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo que consiste en K, R, S, G y A. Tambien se divulga que el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es K.

Tambien se divulga que la ADN polimerasa mejorada comprende una secuencia de aminoacidos que es sustancialmente identica (por ejemplo, al menos aproximadamente un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % identica) a la SEQ ID NO: 1, en la que el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de M o I, el aminoacido correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de D y el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de I.

Tambien se divulga que la ADN polimerasa mejorada tiene eficacia de transcriptasa inversa incrementada, opcionalmente sin una disminucion sustancial en la actividad de polimerasa dependiente de ADN, en comparacion con una ADN polimerasa de control, en la que el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de M o I, y el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de I, y en la que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoacidos que la ADN polimerasa excepto en que el aminoacido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 es M o I, y el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es I. De esta manera, el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 es T y el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es K. Tambien se divulga que la ADN polimerasa mejorada comprende adicionalmente una sustitucion de aminoacido en el aminoacido correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1. De esta manera, el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de M o I, el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de I y el aminoacido correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoacido distinto de D o E. Tambien se divulga que el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 es T, el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es K y el aminoacido correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 es G.

Diversas ADN polimerasas son susceptibles de mutacion de acuerdo con la presente invencion. Son particularmente

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adecuadas las polimerasas termoestables, incluyendo polimerasas termoestables naturales de diversas especies de bacterias termofilas, asi como polimerasas termoestables sinteticas derivadas de dichas enzimas naturales mediante delecion, insercion o sustitucion de aminoacidos u otra modificacion. De esta manera, en algunos modos de realizacion, la polimerasa es una ADN polimerasa termoestable. Las formas no modificadas ejemplares de polimerasa incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa Z05, CS6, CS5 o una ADN polimerasa funcional que tenga al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoacidos con la misma. En determinados modos de realizacion, la ADN polimerasa funcional tiene al menos un 80 %, mas preferentemente un 90 %, mas preferentemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoacidos con la misma. Otras polimerasas no modificadas incluyen, por ejemplo, ADN polimerasas de cualquiera de las siguientes especies de bacterias termofilas (o una ADN polimerasa funcional que tenga al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoacidos con dicha polimerasa): Thermotoga maritima; Thermus aquaticus; Thermus thermophilus; Thermus flavus; Thermus filiformis; Thermus sp. sps17; Thermus sp. Z05; Thermotoga neopolitana; Thermosipho africanus; Thermus caldophilus, Deinococcus radiodurans, Bacillus stearothermophilus o Bacillus caldotenax. En determinados modos de realizacion, la ADN polimerasa funcional tiene al menos un 80 %, mas preferentemente un 90 %, mas preferentemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoacidos con estas polimerasas. Las polimerasas adecuadas tambien incluyen las que tienen actividad de transcriptasa inversa (RT) y/o la capacidad de incorporar nucleotidos no convencionales, tales como ribonucleotidos u otros nucleotidos modificados en 2'.

En algunos modos de realizacion, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa termoactiva. Mientras que las ADN polimerasas termoestables que poseen actividad de transcripcion inversa eficaz son particularmente adecuadas para realizar RT-PCR, especialmente RT-PCR de enzima unica, las ADN polimerasas termoactivas, pero no termoestables, que poseen actividad de transcripcion inversa eficaz tambien son susceptibles de mutacion de acuerdo con la presente invencion. Por ejemplo, los atributos de eficacia de transcriptasa inversa incrementada, tolerancia al emparejamiento erroneo, velocidad de extension y/o tolerancia de los inhibidores de RT son utiles para la etapa de RT en una RT-PCR y este etapa no se necesita realizar a temperaturas que inactivaran una ADN polimerasa termoactiva, pero no termoestable. Tras la etapa de RT, se podria anadir o bien ya podria estar incluida en la mezcla de reaccion una ADN polimerasa termoestable para realizar la etapa de amplificacion por PCR. Por ejemplo, se puede combinar la ADN polimerasa mejorada descrita en el presente documento con una segunda ADN polimerasa termoestable antes de la etapa de RT en un tampon adecuado para la extension y amplificacion de moldes ADN y ARN, como se describe en los ejemplos. Los ejemplos de ADN polimerasas termoestables adecuadas se describen en la patente de EE. UU. n.° 4.889.818 y en las patentes de EE. UU. n.os 5.773.258 y 5.677.152. La segunda ADN polimerasa termoestable puede ser aDn polimerasa de AmpliTaq® (desoxinucleosido trifosfato: ADN desoxinucleotidiltransferasa, E.C.2.7.7.7). La segunda ADN polimerasa termoestable puede ser una polimerasa termoestable inactivada reversiblemente, como se describe a continuacion. La polimerasa termoestable inactivada reversiblemente puede ser ADN polimerasa de AmpliTaq Gold® (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EE. UU.). Esta segunda metodologia se beneficiaria especialmente usando una ADN polimerasa termoestable modificada quimicamente (u otra tecnologia HotStart para inactivar la ADN polimerasa termoestable) de modo que no sea completamente activa durante la etapa de RT. Un ejemplo de una ADN polimerasa termoactiva, pero no termoestable, que posee actividad de transcripcion inversa eficaz es la ADN polimerasa de Carboxydothermus hydrogenoformans (Chy; SEQ ID NO:39). Vease, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.468.775 y 6.399.320.

Tambien se divulga que la ADN polimerasa deriva de una especie Thermus. De esta manera, la ADN polimerasa tiene al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % (al menos un 80 %, preferentemente al menos un 90 % o preferentemente al menos un 95 %) de identidad de secuencia de aminoacidos con respecto a una polimerasa seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (Z05) (SEQ ID NO: 1);

(b) una ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) (SEQ ID NO: 2);

(c) una ADN polimerasa de Thermus filiformis (Tfi) (SEQ ID NO: 3);

(d) una ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfl) (SEQ ID NO: 4);

(e) una ADN polimerasa sps17 de Thermus sp. (Sps17) (SEQ ID NO: 5);

(f) una ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth) (SEQ ID NO: 6); y

(g) una ADN polimerasa de Thermus caldophilus (Tca) (SEQ ID NO: 7).

Tambien se divulga que la ADN polimerasa deriva de una especie Carboxydothermus. De esta manera, la ADN polimerasa tiene al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % (al menos un 80 %, preferentemente al menos un 90 % o

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preferentemente al menos un 95 %) de identidad de secuencia de aminoacidos con respecto a una ADN polimerasa de Carboxydothermus hydrogenoformans(Chy) (SEQ ID NO:39).

Tambien se divulga que la ADN polimerasa es una ADN polimerasa de Thermotoga o deriva de una especie Thermotoga. Por ejemplo, la ADN polimerasa tiene al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % (al menos un 80 %, preferentemente al menos un 90 % o preferentemente al menos un 95 %) de identidad de secuencia de aminoacidos con respecto a una polimerasa seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una ADN polimerasa de Thermotoga maritima (Tma) (SEQ ID NO: 34);

(b) una ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana (Tne) (SEQ ID NO: 35);

Tambien se divulga que la ADN polimerasa tiene al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % (al menos un 80 %, preferentemente al menos un 90 % o preferentemente al menos un 95 %) de identidad de secuencia de aminoacidos con respecto a la SEQ ID NO:1. Tambien se divulga que la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (Z05) (es decir, SEQ ID NO: 1), y el aminoacido en la posicion 763 es cualquier aminoacido distinto de M. Por ejemplo, el aminoacido en la posicion 763 se selecciona de G, A, V, R, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, L, I o H. La ADN polimerasa puede ser una ADN polimerasa Z05 y el aminoacido en la posicion 763 puede ser T. La ADN polimerasa puede ser una ADN polimerasa Z05 que comprenda adicionalmente una sustitucion en la posicion 580 y el aminoacido en la posicion 580 puede ser cualquier aminoacido distinto de D o E. La ADN polimerasa puede ser una ADN polimerasa Z05 y el aminoacido en la posicion 580 puede ser cualquier aminoacido distinto de D. La ADN polimerasa puede ser una ADN polimerasa Z05 y el aminoacido en la posicion 580 se puede seleccionar del grupo que consiste en L, G, T, Q, A, S, N, R y K. La aDn polimerasa puede ser una ADN polimerasa Z05 y el aminoacido en la posicion 580 puede ser G. La ADN polimerasa puede ser una ADN polimerasa Z05 que comprenda adicionalmente una sustitucion en la posicion 709 y el aminoacido en la posicion 709 puede ser cualquier aminoacido distinto de I. La ADN polimerasa puede ser una ADN polimerasa Z05, y el aminoacido en la posicion 709 se puede seleccionar del grupo que consiste en K, R, S, G, y A. La ADN polimerasa puede ser una ADN polimerasa Z05 y el aminoacido en la posicion 709 puede ser K.

La ADN polimerasa de control puede ser una polimerasa Z05, Z05 D580G o Z05 D580G 1709K.

Las polimerasas mutantes o mejoradas pueden incluir otras modificaciones no sustitutivas. Una de dichas modificaciones es una modificacion covalente reversible termicamente que inactiva la enzima, pero que se invierte para activar la enzima tras la incubacion a una temperatura elevada, tal como una temperatura usada tipicamente para la extension de polinucleotidos. Los reactivos ejemplares para dichas modificaciones reversibles termicamente se describen en las patentes de EE. UU. n.os 5.773.258 y 5.677.152.

La actividad de transcriptasa inversa se puede determinar realizando amplificacion por RT-PCR en tiempo real y deteccion de un transcrito del virus de la hepatitis C (VHC) generado a partir de las primeras 800 bases de la 5’NTR del genotipo Ib del VHC en pSP64 poli(A) (Promega). Dos o mas mezclas de reaccion pueden tener numeros valorados de copias del transcrito del virus de la hepatitis C (VHC) (por ejemplo, valoraciones 1:5, valoraciones 1:10, por ejemplo, 10.000 copias, 1000 copias, 100 copias, 10 copias, 0 copias en varias mezclas de reaccion). Se puede comparar la capacidad de transcriptasa inversa de una polimerasa de la invencion con la capacidad de transcriptasa inversa de una polimerasa de referencia (por ejemplo, una polimerasa de control, no modificada o natural), durante una unidad de tiempo preseleccionada, como se describe en el presente documento. Las polimerasas con capacidad de transcriptasa inversa mejorada amplifican el transcrito con mayor eficacia o requieren un numero mas bajo de ciclos de PCR para amplificar el transcrito (es decir, presentan un valor de Pc mas bajo, como se calcula en el presente documento), en comparacion con una polimerasa natural o no modificada. Ademas, las polimerasas con funcion de RT mejorada tambien tienen replicacion mejorada de moldes de ARN largos (por ejemplo, al menos 500 o 1000 o 2000 o 5000 o mas nucleotidos de largo). La eficacia de transcriptasa inversa mejorada puede incluir un tiempo de transcripcion inversa mas corto en comparacion con una polimerasa de control. De esta manera, las polimerasas con eficacia de transcriptasa inversa incrementada transcriben de manera inversa un molde de ARN mas rapidamente que una polimerasa de control o de referencia.

En diversos otros aspectos, la presente invencion proporciona un acido nucleico recombinante que codifica una ADN polimerasa mutante o mejorada de la invencion, un vector que comprende el acido nucleico recombinante y una celula huesped transformada con el vector. En determinados modos de realizacion, el vector es un vector de expresion. Las celulas huesped que comprenden dichos vectores de expresion son utiles en los procedimientos de la invencion para producir la polimerasa mutante o mejorada cultivando las celulas huesped en condiciones adecuadas para la expresion del acido nucleico recombinante. Las polimerasas de la invencion pueden estar contenidas en kits y/o mezclas de reaccion. Los aspectos de los acidos nucleicos recombinantes, celulas huesped, vectores, vectores de expresion, mezclas de reaccion y kits son como se describe anteriormente y en el presente documento.

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En aun otro aspecto, se proporciona un procedimiento para llevar a cabo la extension de polinucleotidos. El procedimiento incluye generalmente poner en contacto una ADN polimerasa que tenga eficacia de transcriptasa inversa incrementada, tolerancia al emparejamiento erroneo, velocidad de extension y/o tolerancia de los inhibidores de la polimerasa y RT de la invencion con un cebador, un molde de polinucleotido y nucleosidos trifosfato en condiciones adecuadas para la extension del cebador, produciendo de este modo un cebador extendido. En determinados modos de realizacion las condiciones adecuadas para la extension comprenden Mg2+. Por ejemplo, el molde de polinucleotido puede ser un molde de ARN o ADN. Los nucleotidos trifosfato pueden incluir nucleotidos no convencionales, tales como, por ejemplo, ribonucleotidos y/o nucleotidos marcados. Ademas, el cebador y/o molde puede incluir uno o mas analogos de nucleotidos. En algunas variaciones, el procedimiento de extension de polinucleotidos es un procedimiento para la amplificacion de polinucleotidos que incluye poner en contacto la ADN polimerasa mutante o mejorada con un par de cebadores, el molde de polinucleotido y los nucleosidos trifosfato en condiciones adecuadas para la amplificacion del polinucleotido. La reaccion de extension de polinucleotidos puede ser, por ejemplo, PCR, extension isotermica o secuenciacion (por ejemplo, la reaccion de secuenciacion 454). El molde de polinucleotido puede ser de cualquier tipo de muestra biologica.

Opcionalmente, la reaccion de extension del cebador comprende un inhibidor real o potencial de una polimerasa de referencia o no modificada. El inhibidor puede inhibir la velocidad de extension de acidos nucleicos y/o la eficacia de transcripcion inversa de una polimerasa de referencia o no modificada (de control). El inhibidor puede ser hemoglobina, o un producto de degradacion de la misma. Por ejemplo, el producto de degradacion de hemoglobina es un producto de descomposicion de hemo, tal como hemina, hematoporfirina o bilirrubina. El inhibidor puede ser un quelante de hierro o un pigmento purpura. El inhibidor puede ser heparina o melanina. El inhibidor puede ser un tinte intercalante. En el presente documento, el tinte intercalante puede ser [2-[N-bis-(3-dimetilaminopropil)-amino]-4- [2,3-dihidro-3-metil-(benzo-1,3-tiazol-2-il)-metiliden]-1-fenil-quinolinio]+. El tinte intercalante puede ser [2-[N-(3- dimetilaminopropil)-N-propilamino]-4-[2,3-dihidro-3-metil-(benzo-1,3-tiazol-2-il)-metiliden]-1 -fenil-quinolinio]+. El tinte intercalante puede no ser [2-[N-(3-dimetilaminopropil)-N-propilamino]-4-[2,3-dihidro-3-metil-(benzo-1,3-tiazol-2-il)- metiliden]-1-fenil-quinolinio]+. Las condiciones adecuadas para la extension pueden comprender Mg++. Las condiciones adecuadas para la extension pueden comprender Mn++.

La presente invencion tambien proporciona un kit util en dicho procedimiento de extension de polinucleotidos. El kit incluye al menos un recipiente que proporciona la ADN polimerasa mejorada de acuerdo con la invencion. En determinados modos de realizacion, el kit incluye adicionalmente uno o mas recipientes adicionales que proporcionan uno o mas reactivos adicionales. Por ejemplo, en variaciones especificas, uno o mas recipientes adicionales proporcionan nucleosidos trifosfato; un tampon adecuado para la extension de polinucleotidos; y/o uno o mas polinucleotidos de sonda o cebador, hibridables, en condiciones de extension de polinucleotidos, a un molde de polinucleotido predeterminado. El molde de polinucleotido puede ser de cualquier tipo de muestra biologica.

Se proporcionan adicionalmente mezclas de reaccion que comprenden las polimerasas de la invencion. Las mezclas de reaccion tambien pueden contener un acido nucleico molde (ADN y/o ARN), uno o mas polinucleotidos de sonda o cebador, nucleosidos trifosfato (incluyendo, por ejemplo, desoxirribonucleosidos trifosfato, ribonucleosidos trifosfato, nucleosidos trifosfato marcados, nucleosidos trifosfato no convencionales), tampones, sales, marcas (por ejemplo, fluoroforos). La mezcla de reaccion puede comprender adicionalmente Mg2+. Las mezclas de reaccion pueden comprender un quelante de hierro o un tinte purpura. Las mezclas de reaccion pueden comprender hemoglobina o un producto de degradacion de hemoglobina. Por ejemplo, los productos de degradacion de hemoglobina incluyen productos de descomposicion de hemo, tales como hemina, hematina, hematoforina y bilirrubina. Las mezclas de reaccion pueden comprender heparina o una sal de la misma. Opcionalmente, la mezcla de reaccion puede comprender un tinte intercalante (incluyendo pero no limitado a los descritos anteriormente o en otra parte en el presente documento). La mezcla de reaccion puede contener un acido nucleico molde que se aisla de la sangre. El acido nucleico molde puede ser ARN y la mezcla de reaccion puede comprender heparina o una sal de la misma.

La mezcla de reaccion puede comprender dos o mas polimerasas. Por ejemplo, la mezcla de reaccion puede comprender una ADN polimerasa mejorada que tenga eficacia de transcripcion inversa incrementada (por ejemplo, actividad incrementada que extiende un molde de ARN) como se describe en el presente documento, y otra polimerasa que tenga actividad de polimerasa dependiente de ADN. La mezcla de reaccion puede comprender una combinacion de una ADN polimerasa mejorada que tiene eficacia de transcripcion inversa incrementada como se describe en el presente documento y una segunda polimerasa dependiente de ADN termoestable. La segunda polimerasa dependiente de ADN termoestable puede ser una polimerasa modificada reversiblemente como se describe anteriormente, de tal manera que la enzima sea inactiva a temperaturas adecuadas para la etapa de transcripcion inversa, pero sea activa en condiciones adecuadas, por ejemplo, a temperaturas elevadas de aproximadamente 90 °C a 100 °C durante un periodo de tiempo de hasta aproximadamente 12 minutos. Las condiciones adecuadas para la activacion de una polimerasa termoestable inactivada reversiblemente se proporcionan, por ejemplo, en una reaccion de PCR de inicio en caliente, como se describe en los ejemplos. Los ejemplos de segundas polimerasas dependientes de ADN termoestable adecuadas se describen en las patentes de EE. UU. n.os 5.773,258 y 5.677.152, supra.

Definiciones

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A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comunmente por un experto en la tecnica a la que pertenece la presente invencion. Aunque se puede usar esencialmente cualquier procedimiento y material similar a los descritos en el presente documento, en la practica o pruebas de la presente invencion, unicamente se describen procedimientos y materiales ejemplares. Para los propositos de la presente invencion, se definen a continuacion los siguientes terminos.

Los terminos “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes al plural a menos que el contexto indique claramente de otro modo.

Un "aminoacido" se refiere a cualquier unidad monomerica que se puede incorporar en un peptido, polipeptido o proteina. Como se usa en el presente documento, el termino “aminoacido” incluye los siguientes veinte aminoacidos alfa naturales o geneticamente codificados: alanina (Ala o A), arginina (Arg o R), asparagina (Asn o N), acido aspartico (Asp o D), cisteina (Cys o C), glutamina (Gln o Q), acido glutamico (Glu o E), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (Ile o I), leucina (Leu o L), lisina (Lys o K), metionina (Met o M), fenilalanina (Phe o F), 5 prolina (Pro o P), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), triptofano (Trp o W), tirosina (Tyr o Y) y valina (Val o V). En los casos en que los residuos “X” no estan definidos, estos se deben definir como “cualquier aminoacido”.Las estructuras de estos veinte aminoacidos naturales se muestran, por ejemplo, en Stryer et al., Biochemistry, 5.° ed., Freeman and Company (2002).

Los aminoacidos adicionales, tales como selenocisteina y pirrolisina, tambien se pueden codificar geneticamente (Stadtman (1996) “Selenocysteine,” Annu Rev Biochem. 65:83-100 e Ibba et al. (2002) “Genetic code: introducing pyrrolysine,” Curr Biol. 12(13):R464-R466). El termino aminoacido tambien incluye aminoacidos no naturales, aminoacidos modificados (por ejemplo, que tienen cadenas principales y/o cadenas laterales modificadas) y analogos de aminoacidos. Vease, por ejemplo, Zhang et al. (2004) “Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887, Anderson et al. (2004) “An expanded genetic code with a functional quadruplet codon” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (20):7566-7571, Ikeda et al. (2003) “Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo," Protein Eng. Pes. Sel. 16(9):699-706, Chin et al. (2003) “An Expanded Eukaryotic Genetic Code,” Science 301(5635):964-967, James et al. (2001) “Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues,” Protein Eng. Pes. Sel. 14(12):983-991, Kohrer et al. (2001) “Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25): 14310-14315, Bacher et al. (2001) “Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue,” J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, Hamano-Takaku et al. (2000) “A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine,” J. Biol. Chem. 275(51 ):40324-40328, y Budisa et al. (2001) “Proteins with (betaj-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids,” Protein Sci. 10(7):1281 -1292.

Para ilustrar adicionalmente, un aminoacido es tipicamente un acido organico que incluye un grupo amino sustituido o no sustituido, un grupo carboxi sustituido o no sustituido y una o mas cadenas laterales o grupos, o analogos de cualquiera de estos grupos. Las cadenas laterales ejemplares incluyen, por ejemplo, tiol, seleno, sulfonilo, alquilo, arilo, acilo, ceto, azido, hidroxilo, hidracina, ciano, halo, hidracida, alquenilo, alquinilo, eter, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterociclico, enona, imina, aldehido, ester, tioacido, hidroxilamina o cualquier combinacion de estos grupos. Otros aminoacidos representativos incluyen, pero no estan limitados a, aminoacidos que comprenden reticuladores fotoactivables, aminoacidos de union a metal, aminoacidos con marcaje de espin, aminoacidos fluorescentes, aminoacidos que contienen metal, aminoacidos con grupos funcionales novedosos, aminoacidos que interaccionan covalente o no covalentemente con otras moleculas, aminoacidos fotoenmascarados y/o fotoisomerizables, aminoacidos radiactivos, aminoacidos que comprenden biotina o un analogo de biotina, aminoacidos glucosilados, otros aminoacidos modificados con hidrato de carbono, aminoacidos que comprenden polietilenglicol o polieter, aminoacidos sustituidos con atomos pesados, aminoacidos quimicamente escindibles y/o fotoescindibles, aminoacidos que contienen azucar de enlace a carbono, aminoacidos activos en oxidorreduccion, aminotioacidos que contienen aminoacidos y aminoacidos que comprenden uno o mas restos toxicos.

El termino "muestra biologica" abarca una variedad de tipos de muestras obtenidos de un organismo y se pueden usar en un ensayo de supervision o diagnostico. El termino abarca orina, sedimento de orina, sangre, saliva y otras muestras liquidas de origen biologico, muestras de tejidos solidos, tales como una muestra de biopsia o cultivos tisulares o celulas derivadas de los mismos y la descendencia de los mismos. El termino abarca muestras que se han manipulado de cualquier manera despues de su adquisicion, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilizacion, sedimentacion o enriquecimiento para determinados componentes. El termino abarca una muestra clinica y tambien incluye celulas en cultivo celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluidos biologicos y muestras de tejidos.

El termino "mutante", en el contexto de las ADN polimerasas de la presente invencion, significa un polipeptido, tipicamente recombinante, que comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en relacion con una ADN

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polimerasa funcional correspondiente.

El termino “forma no modificada”, en el contexto de una polimerasa mutante, es un termino usado en el presente documento para los propositos de definir una ADN polimerasa mutante de la presente invencion: el termino “forma no modificada” se refiere a una ADN polimerasa funcional que tiene la secuencia de aminoacidos de la polimerasa mutante, excepto en una o mas posiciones de aminoacidos especificada(s) como que caracterizan la polimerasa mutante. De esta manera, la referencia a una ADN polimerasa mutante en terminos de (a) su forma no modificada y (b) una o mas sustituciones de aminoacidos especificadas significa que, con excepcion de la(s) sustitucion/sustituciones de aminoacidos especificada(s), la polimerasa mutante de otro modo tiene una secuencia de aminoacidos identica a la forma no modificada en el motivo especificado. La "polimerasa no modificada" (y, por lo tanto, tambien la forma modificada que tiene eficacia de transcriptasa inversa incrementada, tolerancia al emparejamiento erroneo, velocidad de extension y/o tolerancia de los inhibidores de la polimerasa y RT) puede contener mutaciones adicionales para proporcionar la funcionalidad deseada, por ejemplo, incorporacion mejorada de didesoxirribonucleotidos, ribonucleotidos, analogos de ribonucleotidos, nucleotidos marcados con tinte, actividad de 5'-nucleasa moduladora, actividad de 3'-nucleasa moduladora (o correccion de errores) o similares. Por consiguiente, al llevar a cabo la presente invencion como se describe en el presente documento, se predetermina la forma no modificada de una ADN polimerasa. La forma no modificada de una ADN polimerasa puede ser, por ejemplo, una ADN polimerasa natural o una ADN polimerasa que ya se ha modificado intencionalmente. Una forma no modificada de la polimerasa es preferentemente una ADN polimerasa termoestable, tal como ADN polimerasas de diversas bacterias termofilas, asi como variantes funcionales de la misma que tienen identidad de secuencia sustancial con respecto a una polimerasa termoestable natural. Dichas variantes pueden incluir, por ejemplo, ADN polimerasas quimericas, tales como, por ejemplo, las ADN polimerasas quimericas descritas en las patentes de EE. UU. n.os 6.228.628 y 7.148.049. En determinados modos de realizacion, la forma no modificada de una polimerasa tiene actividad de transcriptasa inversa (RT).

El termino "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima que es estable frente al calor, es resistente al calor y retiene suficiente actividad para efectuar reacciones de extension de polinucleotidos posteriores y no se desnaturaliza irreversiblemente (inactiva) cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalizacion de los acidos nucleicos bicatenarios. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalizacion de acidos nucleicos se conocen bien en la tecnica y se ejemplifican, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.os 4.683.202, 4.683.195 y 4.965.188. Como se usa en el presente documento, una polimerasa termoestable es adecuada para su uso en una reaccion de ciclos de temperatura, tal como la reaccion en cadena de la polimerasa ("PCR"). La desnaturalizacion irreversible para los propositos del presente documento se refiere a la perdida permanente y completa de actividad enzimatica. Para una polimerasa termoestable, la actividad enzimatica se refiere a la catalisis de la combinacion de los nucleotidos de manera apropiada para formar productos de extension de polinucleotidos que sean complementarios a una cadena de acido nucleico molde. Las ADN polimerasas termoestables de bacterias termofilas incluyen, por ejemplo, ADN polimerasas de Thermotoga maritima, Thermus aquations, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Thermus filiformis, especie Thermus sps17, especie Thermus Z05, Thermus caldophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga neopolitana y Thermosipho africanus.

El termino "termoactiva" se refiere a una enzima que mantiene las propiedades cataliticas a temperaturas usadas comunmente para la transcripcion inversa o etapas de hibridacion/extension en reacciones de RT-PCR y/o PCR (es decir, 45-80 °C). Las enzimas termoestables son las que no estan irreversiblemente inactivadas o desnaturalizadas cuando se someten a temperaturas elevadas necesarias para la desnaturalizacion de acidos nucleicos. Las enzimas termoactivas pueden o no puede ser termoestables. Las ADN polimerasas termoactivas pueden ser ADN o ARN dependiente de especies termofilas o de especies mesofilas incluyendo, pero no limitadas a, Escherichia coli, los virus de la leucemia murina de Moloney y los virus de la mieloblastosis aviar.

Como se usa en el presente documento, una proteina "quimerica" se refiere a una proteina cuya secuencia de aminoacidos representa un producto de fusion de subsecuencias de las secuencias de aminoacidos de al menos dos proteinas distintas. Tipicamente no se produce una proteina quimerica mediante manipulacion directa de secuencias de aminoacidos, sino que, mas bien, se expresa a partir de un gen "quimerico" que codifica la secuencia de aminoacidos quimerica. Por ejemplo, una forma no modificada de una ADN polimerasa mutante como se divulga en el presente documento es una proteina quimerica que consiste en una region de extremo aminico (extremo N) derivada de una ADN polimerasa de una especie Thermus y una region de extremo carboxilico (extremo C) derivada de ADN polimerasa de Tma. La region de extremo N se refiere a una region que se extiende desde el extremo N (posicion de aminoacido 1) a un aminoacido interno. De manera similar, la region de extremo C se refiere a una region que se extiende desde un aminoacido interno al extremo C.

El termino "aptamero" se refiere a un ADN monocatenario que reconoce y se une a ADN polimerasa e inhibe eficazmente la actividad de polimerasa como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.693.502. El uso de aptamero y dUTP/UNG en RT-PCR tambien se analiza, por ejemplo, en Smith, E.S. et al., (Amplification of RNA: High-temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated Thermostable DNA Polymerase, in PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Dieffenbach, C.W. y Dveksler, G.S., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 211-219, (2003)).

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En el contexto de las ADN polimerasas mutantes, la "correspondencia" con otra secuencia (por ejemplo, regiones, fragmentos, posiciones de aminoacidos o nucleotidos, o similares) se basa en la convencion de numeracion de acuerdo con el numero de posicion de aminoacidos o nucleotidos y, a continuacion, alineacion de la secuencias de una manera que maximice el porcentaje de identidad de secuencia. Un aminoacido "correspondiente a la posicion [X] de [secuencia especifica]" se refiere a un aminoacido en un polipeptido de interes que se alinea con el aminoacido equivalente de una secuencia especificada. Generalmente, como se describe en el presente documento, se puede determinar el aminoacido correspondiente a una posicion de una polimerasa usando un algoritmo de alineacion, tal como BLAST como se describe a continuacion. Puesto que no todas las posiciones en una "region correspondiente" dada necesitan ser identicas, las posiciones de no emparejamiento en una region correspondiente se pueden considerar como "posiciones correspondientes". Por consiguiente, como se usa en el presente documento, la referencia a una "posicion de aminoacido correspondiente a la posicion de aminoacido [X]" de una ADN polimerasa especificada se refiere a posiciones equivalentes, basadas en la alineacion, en otras ADN polimerasas y familias y homologos estructurales. En algunos modos de realizacion de la presente invencion, se determina la "correspondencia" de posiciones de aminoacidos con respecto a una region de la polimerasa que

comprende uno o mas motivos de las SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 39. Cuando una

secuencia de polipeptidos de polimerasa difiere de las SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 39 (por ejemplo, por cambios en aminoacidos o adicion o delecion de aminoacidos), puede ser que una mutacion particular asociada con una actividad mejorada como se analiza en el presente documento no este en el mismo numero de posicion que esta en las SEQ iD NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 39. Por ejemplo, esto se ilustra en la tabla 1.

"Recombinante", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de aminoacidos o una

secuencia de nucleotidos que se ha modificado intencionalmente mediante procedimientos recombinantes. El

termino “acido nucleico recombinante” en el presente documento significa un acido nucleico, formado originalmente in vitro, en general, mediante la manipulacion de un acido nucleico por endonucleasas de restriccion, en una forma que no se encuentra normalmente en la naturaleza. De esta manera, un acido nucleico de ADN polimerasa mutante aislado, en una forma lineal, o un vector de expresion formado in vitro ligando moleculas de ADN que no estan unidas normalmente se consideran ambos recombinantes para los propositos de la presente invencion. Se entiende que una vez que se prepara un acido nucleico recombinante y se reintroduce en una celula huesped, se replica de manera no recombinante, es decir, usando la maquinaria celular in vivo de la celula huesped en lugar de las manipulaciones in vitro; sin embargo, dichos acidos nucleicos, una vez producidos de manera recombinante, aunque se replican de manera no recombinante posteriormente, todavia se consideran recombinantes para los propositos de la invencion. Una "proteina recombinante" es una proteina preparada usando tecnicas recombinantes, es decir a traves de la expresion de un acido nucleico recombinante como se representa anteriormente.

Un acido nucleico se "enlaza de manera funcional" cuando se dispone en una relacion funcional con otra secuencia de acidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o potenciador se enlaza de manera funcional a una secuencia codificante si afecta a la transcripcion de la secuencia; o un sitio de union a ribosoma se enlaza de manera funcional a una secuencia codificante si se posiciona para facilitar la traduccion.

El termino "celula huesped" se refiere tanto a los organismos eucariotas (por ejemplo, bacterias, levaduras y actinomicetos) como procariotas unicelulares y celulas sueltas de animales o plantas de orden superior cuando se cultivan en cultivo celular.

El termino "vector" se refiere a una porcion de ADN, tipicamente bicatenario, que puede tener insertada en la misma una porcion de ADN exogeno. Por ejemplo, el vector puede ser de origen plasmidico. Los vectores contienen secuencias de polinucleotidos de "replicon" que facilitan la replicacion autonoma del vector en una celula huesped. El ADN exogeno se define como ADN heterogeno, que es ADN no encontrado naturalmente en la celula huesped, que, por ejemplo, replica la molecula del vector, codifica un marcador seleccionable o cribable o codifica un transgen. El vector se usa para transportar el ADN exogeno o heterogeno en una celula huesped adecuada. Una vez en la celula huesped, el vector se puede replicar independientemente o coincidiendo con el ADN cromosomico del huesped y se pueden generar varias copias del vector y su ADN insertado. Ademas, el vector tambien puede contener los elementos necesarios que permiten la transcripcion del ADN insertado en una molecula de ARNm o de otro modo provocar la replicacion del ADN insertado en multiples copias de ARN. Algunos vectores de expresion contienen adicionalmente elementos de secuencia adyacentes al ADN insertado que incrementan la semivida del ARNm expresado y/o permiten la traduccion del ARNm en una molecula de proteina. De esta manera, se pueden sintetizar rapidamente muchas moleculas de ARNm y polipeptido codificadas por el ADN insertado.

El termino "nucleotido", ademas de hacer referencia a los monomeros de desoxirribonucleotido o ribonucleotido naturales, se entendera que en el presente documento se refiere a variantes estructurales relacionadas del mismo, incluyendo derivados y analogos, que sean funcionalmente equivalentes con respecto al contexto particular en el que se usa el nucleotido (por ejemplo, hibridacion a una base complementaria), a menos que el contexto indique claramente de otro modo.

El termino “acido nucleico” o “polinucleotido” se refiere a un polimero que se puede corresponder a un polimero de

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acido nucleico de ribosa (ARN) o acido nucleico de desoxirribosa (ADN), o un analogo del mismo. Esto incluye polimeros de nucleotidos, tales como ARN y ADN, asi como formas sinteticas, formas modificadas (por ejemplo, modificadas quimica o bioquimicamente) de los mismos y polimeros mixtos (por ejemplo, que incluyen tanto subunidades de ADN como ARN). Las modificaciones ejemplares incluyen metilacion, sustitucion de uno o mas de los nucleotidos naturales con un analogo, modificaciones internucleotidicas, tales como enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriesteres, fosfoamidatos, carbamatos y similares), restos pendientes (por ejemplo, polipeptidos) intercalantes (por ejemplo, acridina, soraleno y similares), quelantes, alquilantes y enlaces modificados (por ejemplo, acidos nucleicos anomericos alfa y similares). Tambien se incluyen moleculas sinteticas que imitan a los polinucleotidos en su capacidad para unirse a una secuencia designada por medio de enlaces de hidrogeno y otras interacciones quimicas. Tipicamente, los monomeros de nucleotido se enlazan por medio de enlaces fosfodiester, aunque las formas sinteticas de acidos nucleicos pueden comprender otros enlaces (por ejemplo, acidos nucleicos peptidicos como se describe en Nielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991). Por ejemplo, un acido nucleico puede ser o puede incluir un segmento cromosomico o de cromosoma, un vector (por ejemplo, un vector de expresion), un casete de expresion, un polimero de ARN o ADN desnudo, el producto de una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), un oligonucleotido, una sonda y un cebador. Por ejemplo, un acido nucleico puede ser monocatenario, bicatenario o tricatenario y no esta limitado a ninguna longitud particular. A menos que se indique de otro modo, una secuencia de acidos nucleicos particular opcionalmente comprende o codifica secuencias complementarias, ademas de cualquier secuencia indicada explicitamente.

El termino "oligonucleotido" se refiere a un acido nucleico que incluye al menos dos unidades monomericas de acido nucleico (por ejemplo, nucleotidos). Un oligonucleotido incluye tipicamente desde aproximadamente seis a aproximadamente 175 unidades monomericas de acido nucleico, mas tipicamente desde aproximadamente ocho a aproximadamente 100 unidades monomericas de acido nucleico, y todavia mas tipicamente desde aproximadamente 10 a aproximadamente 50 unidades monomericas de acido nucleico (por ejemplo, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35 o mas unidades monomericas de acido nucleico). El tamano exacto de un oligonucleotido depende de muchos factores, incluyendo el uso o funcion final del oligonucleotido. Los oligonucleotidos se preparan opcionalmente mediante cualquier procedimiento adecuado, incluyendo, pero no limitado a, aislamiento de una secuencia existente o natural, replicacion o amplificacion del ADN, transcripcion inversa, clonacion y digestion de restriccion de secuencias apropiadas, o sintesis quimica directa mediante un procedimiento tal como el procedimiento de fosfotriester de Narang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979); el procedimiento de fosfodiester de Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979); el procedimiento de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981); el procedimiento de triester de Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981); procedimientos de sintesis automatizados; o el procedimiento de soporte solido de la patente de EE. UU. n.° 4.458.066 u otros procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica.

El termino “cebador” como se usa en el presente documento se refiere a un polinucleotido que puede actuar como un punto de iniciacion de la sintesis de acidos nucleicos dirigida por molde cuando se dispone en condiciones en las que se inicia la extension de polinucleotidos (por ejemplo, en condiciones que comprenden la presencia de nucleosidos trifosfato requeridos (como se dicta por el molde que se copia) y una polimerasa en un tampon apropiado y a una temperatura adecuada o ciclo(s) de temperatura (por ejemplo, como en una reaccion en cadena de la polimerasa)). Para ilustrar adicionalmente, tambien se pueden usar los cebadores en una variedad de otros procedimientos de sintesis mediados por oligonucleotidos, incluyendo como iniciadores de la sintesis de ARN de novo y procedimientos relacionados con la transcripcion in vitro (por ejemplo, amplificacion basada en secuencias de acidos nucleicos (NASBA) amplificacion mediada por transcripcion (TMA), etc.). Un cebador es tipicamente un oligonucleotido monocatenario (por ejemplo, oligodesoxirribonucleotido). La longitud apropiada de un cebador depende del uso pretendido del cebador, pero tipicamente varia desde 6 a 40 nucleotidos, mas tipicamente desde 15 a 35 nucleotidos. Las moleculas de cebador cortas generalmente requieren temperaturas mas frias para formar complejos hibridos suficientemente estables con el molde. Un cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde pero debe ser suficientemente complementaria para hibridarse con un molde para que se produzca la elongacion del cebador. El termino "par de cebadores" puede significar un conjunto de cebadores que incluye un cebador en sentido 5’ (a veces llamado "directo") que se hibrida con el complemento del extremo 5' de la secuencia de acidos nucleicos que se va a amplificar y un cebador en antisentido 3' (a veces llamado "inverso") que se hibrida con el extremo 3’ de la secuencia que se va a amplificar (por ejemplo, si la secuencia diana se expresa como ARN o es un ARN). Un cebador se puede marcar, si se desea, incorporando una marca detectable mediante medios espectroscopicos, fotoquimicos, bioquimicos, inmunoquimicos o quimicos. Por ejemplo, los marcadores utiles incluyen 32P, tintes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (usadas comunmente en ensayos ELISA), biotina o haptenos y proteinas para los que estan disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales.

El termino “convencional” o “natural” cuando se hace referencia a bases de acidos nucleicos, nucleosidos trifosfato o nucleotidos se refiere a los que se producen naturalmente en el polinucleotido que se describe (es decir, para el ADN estos son dATP, dGTP, dCTP y dTTP). Adicionalmente, con frecuencia se utilizan dITP y 7-deaza-dGTP en lugar de dGTP y se puede utilizar 7-deaza-dATP en lugar de dATP en reacciones de sintesis de ADN in vitro, tales como secuenciacion. Colectivamente, estos se pueden denominar dNTP.

El termino "no convencional" o "modificado" cuando se refiere a una base de acidos nucleicos, nucleosido o

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nucleotido incluye modificacion, derivaciones o analogos de bases, nucleosidos o nucleotidos convencionales que se producen naturalmente en un polinucleotido particular. Determinados nucleotidos no convencionales se modifican en la posicion 2' del azucar ribosa en comparacion con los dNTP convencionales. De esta manera, aunque para el ARN los nucleotidos naturales son ribonucleotidos (es decir, ATP, GTP, CTP, UTP, colectivamente rNTP), puesto que estos nucleotidos tienen un grupo hidroxilo en la posicion 2' del azucar, que, en comparacion, esta ausente en los dNTP, como se usa en el presente documento, los ribonucleotidos son nucleotidos no convencionales como sustratos para las ADN polimerasas. Como se usa en el presente documento, los nucleotidos no convencionales incluyen, pero no estan limitados a, compuestos usados como terminadores para la secuenciacion de acidos nucleicos. Los compuestos terminadores ejemplares incluyen, pero no estan limitados a, los compuestos que tienen una estructura 2',3' didesoxi y se denominan didesoxinucleosidos trifosfato. Los didesoxinucleosidos trifosfato ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP se denominan colectivamente ddNTP. Los ejemplos adicionales de compuestos terminadores incluyen analogos de 2'-PO4 de ribonucleotidos (vease, por ejemplo la solicitud de EE. Uu. n.os 2005/0037991 y 2005/0037398). Otros nucleotidos no convencionales incluyen dNTP de fosforotioato ([a-S]dNTP), 5’-[a-borano]-dNTP, dNTP de [a]-metilfosfonato y ribonucleosidos trifosfato (rNTP). Las bases no convencionales se pueden marcar con isotopos radiactivos, tales como 32P, 33P o 35S; marcadores fluorescentes; marcadores quimioluminiscentes; marcadores bioluminiscentes; marcadores con hapteno, tales como biotina; o marcadores enzimaticos, tales como estreptavidina o avidina. Los marcadores fluorescentes pueden incluir tintes que estan cargados negativamente, tales como tintes de la familia de fluoresceina, o tintes que son de carga neutra, tales como tintes de la familia de rodamina o tintes que estan cargados positivamente, tales como tintes de la familia de cianina. Por ejemplo, los tintes de la familia de fluoresceina incluyen FAM, HEX, TET, JOE, NAN y ZOE. Los tintes de la familia de rodamina incluyen Texas Red, ROX, R110, R6G y TAMRA. Diversos tintes o nucleotidos marcados con FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, Texas Red y TAMRA estan comercializados por Perkin- Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA) o Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR). Los tintes de la familia de cianina incluyen Cy2, Cy3, Cy5 y Cy7 y estan comercializados por GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra).

Como se usa en el presente documento, se determina el "porcentaje de identidad de secuencia" comparando dos secuencias alineadas optimamente sobre una ventana de comparacion, en la que la porcion de la secuencia en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineacion optima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el numero de posiciones en las que se produce el residuo de aminoacidos o base de acidos nucleicos en ambas secuencias para producir el numero de posiciones emparejadas, dividiendo el numero de posiciones emparejadas por el numero total de posiciones en la ventana de comparacion y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

Los terminos “identico” o “identidad” en porcentaje en el contexto de dos o mas acidos nucleicos o secuencias de polipeptidos se refieren a dos o mas secuencias o subsecuencias que son la misma.

Las secuencias son "sustancialmente identicas" entre si si tienen un porcentaje especificado de nucleotidos o residuos de aminoacidos que son iguales (por ejemplo, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad sobre una region especificada)), cuando se comparan y alinean para una correspondencia maxima sobre una ventana de comparacion o region designada medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparacion de secuencias o mediante alineacion manual e inspeccion visual. Estas definiciones tambien se refieren al complemento de una secuencia de prueba. Opcionalmente, la identidad existe sobre una region que es de al menos aproximadamente 50 nucleotidos de longitud, o mas tipicamente sobre una region que es de 100 a 500 o 1000 o mas nucleotidos de longitud.

Los terminos "similitud” o "similitud en porcentaje", en el contexto de dos o mas secuencias de polipeptidos, se refieren a dos o mas secuencias o subsecuencias que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoacidos que son iguales o bien similares como se define por una sustitucion de aminoacidos conservadora (por ejemplo, un 60 % de similitud, opcionalmente un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % similar sobre una region determinada) cuando se comparan y alinean para una correspondencia maxima sobre una ventana de comparacion o region designada medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparacion de secuencias o mediante alineacion manual e inspeccion visual. Las secuencias tambien son “sustancialmente similares” entre si si son al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 % o al menos un 55 % similares entre si. Opcionalmente, esto existe de manera similar sobre una region que es de al menos aproximadamente 50 aminoacidos de longitud, o mas tipicamente sobre una region que es de al menos aproximadamente 100 a 500 o 1000 o mas aminoacidos de longitud.

Para la comparacion de secuencias, tipicamente una secuencia actua como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parametros de programa de algoritmo de secuencias. Se usan comunmente parametros de programa predeterminados o se pueden designar parametros alternativos. A continuacion, el algoritmo de comparacion de secuencias calcula las similitudes o identidades de secuencia en porcentaje para las secuencias de

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prueba en relacion con la secuencia de referenda, basandose en los parametros del programa.

Una "ventana de comparacion", como se usa en el presente documento, incluye la referencia a un segmento de uno cualquiera del numero de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en desde 20 a 600, habitualmente aproximadamente 50 a aproximadamente 200, mas habitualmente aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en las que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo numero de posiciones contiguas despues de que las dos secuencias esten alineadas optimamente. Los procedimientos de alineacion de secuencias para comparacion se conocen bien en la tecnica. Se puede llevar a cabo la alineacion optima de secuencias para comparacion, por ejemplo, mediante el algoritmo de homologia local de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1970), mediante el algoritmo de alineacion con homologia de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), mediante la busqueda del procedimiento de similitud de Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante alineacion manual e inspeccion visual (vease, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (suplemento de 1995)).

Los ejemplos de un algoritmo que es adecuado para determinar la identidad de secuencia en porcentaje y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389402, 1977), y Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990), respectivamente. El programa informatico para realizar analisis por BLAST esta disponible publicamente a traves del National Center for Biotechnology Information (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica en primer lugar identificar pares de secuencias de puntuacion alta (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o bien satisfacen alguna puntuacion umbral de valor positivo T cuando estan alineadas con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de puntuacion de palabras de vecindad (Altschul et al., supra). Estos resultados de palabras de vecindad iniciales actuan como semillas para iniciar busquedas para encontrar HSP mas largas que los contienen. Los resultados de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como se pueda incrementar la alineacion acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleotidos, los parametros M (puntuacion de recompensa para un par de residuos emparejados, siempre > 0) y N (puntuacion de penalizacion para los residuos de emparejamiento erroneo, siempre < 0). Para secuencias de aminoacidos, se usa una matriz de puntuacion para calcular la puntuacion acumulativa. La extension de los resultados de palabras en cada direccion se detiene cuando: la puntuacion de alineacion acumulativa cae en la cantidad X desde su valor maximo logrado; la puntuacion acumulativa se desplaza a cero o por debajo, debido a la acumulacion de una o mas alineaciones de residuos de puntuacion negativa; o se alcanza el final de cada secuencia. Los parametros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineacion. El programa BLASTN (para secuencias de nucleotidos) usa como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M=5, N=-4 y una comparacion de ambas cadenas. Para secuencias de aminoacidos, el programa BLASTP usa como valores por defecto una longitud de palabra de 3, y la expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparacion de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST tambien realiza un analisis estadistico de la similitud entre dos secuencias (vease, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma mas pequena (P(N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad por la que se produciria por casualidad un emparejamiento entre dos secuencias de aminoacidos o nucleotidos. Por ejemplo, un acido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma mas pequena en una comparacion del acido nucleico de prueba con respecto al acido nucleico de referencia es menos de aproximadamente 0,2, tipicamente menos de aproximadamente 0,01 y mas tipicamente menos de aproximadamente 0,001.

El termino ''eficacia de transcripcion inversa'' se refiere a la fraccion de moleculas de ARN que se transcriben de manera inversa como ADNc en una reaccion de transcripcion inversa dada. En determinados modos de realizacion, las ADN polimerasas mutantes de la invencion tienen eficacias de transcripcion inversa mejoradas en relacion con las formas no modificadas de estas ADN polimerasas. Es decir, estas ADN polimerasas mutantes transcriben de manera inversa una fraccion mas alta de moldes de ARN que sus formas no modificadas en un conjunto particular de condiciones de reaccion. Sin estar limitada por la teoria, la capacidad de una ADN polimerasa mutante descrita en el presente documento para transcribir de manera inversa una fraccion mas alta de moldes de ARN se puede deber a una actividad de transcripcion inversa incrementada, por ejemplo, una velocidad de incorporacion de nucleotidos incrementada y/o procesividad incrementada de la enzima. Por ejemplo, se puede medir la eficacia de transcripcion inversa midiendo el punto de corte (Pc) de una reaccion de PCR usando un molde de ARN y comparando el valor de Pc con un valor de Pc de una reaccion de control en la que se amplifica un molde de ADN de la misma secuencia (excepto en que los U se reemplazan por T), en la que las amplificaciones de ARN y ADN usan un conjunto de cebadores comun y la misma polimerasa, por ejemplo, como se describe en los ejemplos. Una polimerasa de prueba tiene eficacia de RT mejorada cuando la polimerasa de prueba tiene un valor de Pc disminuido en comparacion con una polimerasa de control cuando se usa ARN como molde, pero tiene un valor de Pc sustancialmente sin cambios en relacion con la polimerasa de control cuando se usa ADN como molde. En algunos modos de realizacion, una polimerasa de la invencion tiene una eficacia de RT mejorada, de tal manera que

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el Pc es al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o mas unidades menos que la polimerasa de control correspondiente en el molde de ARN.

La eficacia de RT mejorada de una polimerasa de prueba se puede medir como se describe en los ejemplos.

El termino "tolerancia al emparejamiento erroneo" se refiere a la capacidad de una polimerasa para tolerar una secuencia que contiene emparejamiento erroneo al extender un acido nucleico (por ejemplo, un cebador u otro oligonucleotido) de una manera dependiente de molde acoplando (por ejemplo, covalentemente) uno o mas nucleotidos al acido nucleico. El termino “tolerancia al emparejamiento erroneo en 3’” se refiere a la capacidad de una polimerasa para tolerar una secuencia (practicamente complementaria) que contiene emparejamiento erroneo donde el acido nucleico que se va a extender (por ejemplo, un cebador u otro oligonucleotido) tiene un emparejamiento erroneo con su molde en el nucleotido de extremo 3’ del cebador. Los emparejamientos erroneos con respecto al molde tambien se pueden localizar en el penultimo nucleotido en 3' del cebador, o en otra posicion en la secuencia del cebador.

La expresion "discriminacion por emparejamiento erroneo" se refiere a la capacidad de una polimerasa para distinguir una secuencia completamente complementaria de una secuencia que contiene emparejamiento erroneo al extender un acido nucleico (por ejemplo, un cebador u otro oligonucleotido) de una manera dependiente de molde acoplando (por ejemplo, covalentemente) uno o mas nucleotidos al acido nucleico. El termino "discriminacion por emparejamiento erroneo en 3'" se refiere a la capacidad de una polimerasa para distinguir una secuencia completamente complementaria de una secuencia (practicamente complementaria) que contiene emparejamiento erroneo donde el acido nucleico que se va a extender (por ejemplo, un cebador u otro oligonucleotido) tiene un emparejamiento erroneo en el extremo 3' del acido nucleico en comparacion con el molde al que se hibrida el acido nucleico. El termino "emparejamiento erroneo" se refiere a la existencia de uno o mas apareamientos erroneos de bases (u "oposiciones de bases no complementarias") en un tramo de, de otro modo, secuencias formadoras de duplex complementarias (o potencialmente formadoras de duplex).

El termino “valor de Pc” o valor de “punto de corte” se refiere a un valor que permite la cuantificacion de acidos nucleicos diana de entrada. Se puede determinar el valor de Pc de acuerdo con el procedimiento del maximo de la segunda derivada (Van Luu-The, et al., “Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction,” BioTechniques, vol. 38, n.° 2, febrero de 2005, pp. 287293). En el procedimiento de la segunda derivada, un Pc corresponde al primer maximo de una segunda curva derivada. Este maximo corresponde al comienzo de una fase semilogaritmica. El procedimiento de la segunda derivada calcula un valor de segunda derivada de la curva de intensidad de fluorescencia en tiempo real, y unicamente se obtiene un valor. El procedimiento de Pc original se basa en una aproximacion diferenciable definida localmente de los valores de intensidad, por ejemplo, mediante una funcion polinomica. A continuacion, se computa la tercera derivada. El valor de Pc es la raiz mas pequena de la tercera derivada. Tambien se puede determinar el Pc usando el procedimiento de punto de ajuste, en el que se determina el Pc mediante la interseccion de una paralela a la linea umbral en la region semilogaritmica (Van Luu-The, et al., BioTechniques, vol. 38, n.° 2, febrero de 2005, pp. 287-293). El valor de Pc proporcionado por el instrumento LightCycler ofrecido por Roche mediante calculo de acuerdo con el procedimiento del maximo de la segunda derivada.

El termino "eficacia de la PCR" se refiere a una indicacion de la eficacia de amplificacion de ciclo a ciclo. La eficacia de la PCR se calcula para cada condicion usando la ecuacion: % de eficacia de la PCR = (10(-pendiente)-i) x 100, en la que la pendiente se calculo mediante regresion lineal con el logaritmo del numero de copias representado en el eje y, y el Pc representado en el eje x. Se puede medir la eficacia de la PCR usando un molde de cebador emparejado o emparejado erroneamente.

El termino "velocidad de extension de acidos nucleicos" se refiere a la velocidad en la que un biocatalizador (por ejemplo, una enzima, tal como una polimerasa, ligasa o similar) extiende un acido nucleico (por ejemplo, un cebador u otro oligonucleotido) de una manera independiente de molde o dependiente de molde acoplando (por ejemplo, covalentemente) uno o mas nucleotidos al acido nucleico. Para ilustrar, determinadas ADN polimerasas mutantes descritas en el presente documento tienen velocidades de extension de acidos nucleicos mejoradas en relacion con formas no modificadas de estas ADN polimerasas, de tal manera que pueden extender cebadores a velocidades mas altas que estas formas no modificadas en un conjunto dado de condiciones de reaccion.

El termino “tolerancia de los inhibidores de la polimerasa y RT” se refiere a la capacidad de una polimerasa para mantener la actividad (actividad de polimerasa o de transcripcion inversa) en presencia de una cantidad de un inhibidor que inhibiria la actividad de polimerasa o actividad de transcripcion inversa de una polimerasa de control. En algunos modos de realizacion, la polimerasa mejorada puede tener actividad de polimerasa o de transcripcion inversa en presencia de una cantidad del inhibidor que eliminaria esencialmente la actividad de polimerasa de control.

El termino “sonda de 5'-nucleasa” se refiere a un oligonucleotido que comprende al menos un resto de marcaje emisor de luz y que se usa en una reaccion de 5'-nucleasa para efectuar la deteccion de acidos nucleicos diana. En algunos modos de realizacion, por ejemplo, una sonda de 5'-nucleasa incluye unicamente un unico resto emisor de

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luz (por ejemplo, un tinte fluorescente, etc.). En determinados modos de realizacion, las sondas de 5'-nucleasa incluyen regiones de autocomplementariedad, de tal manera que las sondas pueden formar estructuras de horquilla en condiciones seleccionadas. Para ilustrar adicionalmente, en algunos modos de realizacion una sonda de 5'- nucleasa comprende al menos dos restos de marcaje y emite radiacion de intensidad incrementada, despues de una de las dos marcas se escinde o, de otro modo, se separa del oligonucleotido. En determinados modos de realizacion, se marca una sonda de 5'-nucleasa con dos tintes fluorescentes diferentes, por ejemplo, un tinte indicador de extremo 5’ y el resto o tinte extintor de extremo 3'. En algunos modos de realizacion, las sondas de 5'- nucleasa se marcan en una o mas posiciones distintas de, o ademas de, posiciones de extremo. Cuando la sonda esta intacta, la transferencia de energia se produce tipicamente entre los dos fluoroforos, de tal manera que la emision fluorescente del tinte indicador se extingue al menos en parte. Durante una etapa de extension de una reaccion en cadena de la polimerasa, por ejemplo, se escinde una sonda de 5'-nucleasa unida a un acido nucleico molde mediante la actividad de nucleasa de 5’ a 3’ de, por ejemplo, una Taq polimerasa u otra polimerasa que tenga esta actividad, de tal manera que la emision fluorescente del tinte indicador ya no se extingue. Las sondas de 5'- nucleasa ejemplares tambien se describen, por ejemplo, en la patente de Ee. UU. n.° 5.210.015, la patente de EE. UU. n.° 5.994.056 y la patente de EE. UU. n.° 6.171.785. En otros modos de realizacion, se puede marcar una sonda de 5'-nucleasa con dos o mas tintes indicadores diferentes y un resto o tinte extintor de extremo 3'.

El termino “FRET” o “transferencia de energia por resonancia de fluorescencia” o “transferencia de energia por resonancia de Forster” se refiere a una transferencia de energia entre al menos dos cromoforos, un cromoforo donante y un cromoforo aceptor (denominado extintor). El donante transfiere tipicamente la energia al aceptor cuando se excita el donante mediante radiacion de luz con una longitud de onda adecuada. El aceptor reemite tipicamente la energia transferida en forma de radiacion de luz con una longitud de onda diferente. Cuando el aceptor es un extintor “de oscuridad”, disipa la energia transferida en una forma distinta de la luz. Si un fluoroforo particular actua como un donante o un aceptor depende de las propiedades del otro miembro del par de FRET. Los pares donante-aceptor usados comunmente incluyen el par FAM-TAMRA. Los extintores usados comunmente son DABCYL y TAMRA. Los extintores de oscuridad usados comunmente incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™ (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa) y BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 representa una alineacion de secuencias de aminoacidos de una region del dominio de polimerasa de ADN polimerasas ejemplares de diversas especies de bacterias: especie Thermus Z05 (Z05) (SEQ ID NO: 12), Thermus aquaticus (Taq) (SEQ ID NO: 13), Thermus filiformus (Tfi) (SEQ ID NO: 14), Thermus flavus (Tfl) (SEQ ID NO: 15), especie Thermus sps17 (Sps17) (SEQ ID NO: 16), Thermus thermophilus (Tth) (SEQ ID NO: 17), Thermus caldophilus (Tca) (SEQ ID NO: 18), Thermotoga maritima (Tma) (SEQ ID NO:19), Thermotoga neopolitana (Tne) (SEQ iD NO: 20), Thermosipho africanus (Taf) (SEQ ID nO: 21), Deinococcus radiodurans (Dra) (seQ ID NO: 23), Bacillus stearothermophilus (Bst) (SEQ ID NO: 24) y Bacillus caldotenax (Bca) (SEQ ID NO: 25). Ademas, las regiones de polipeptidos mostradas comprenden el motivo aminoacidico D-X1-X2-K-X3-A-M-X4-X5-X6-X7- X8-X9-L (SEQ ID NO:26), cuyas posiciones variables se definen adicionalmente en el presente documento. Este motivo esta resaltado en negrita para cada secuencia de polimerasa. Las posiciones de aminoacidos susceptibles de mutacion se indican con un asterisco (*). Los huecos en las alineaciones se indican con un punto (.).

La figura 2 proporciona identidades de secuencia entre las siguientes enzimas ADN polimerasa I: ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (Z05); ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq); ADN polimerasa de Thermus filiformis (Tfi); ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfl); ADN polimerasa de Thermus sp. sps17 (Sps17); ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth); ADN polimerasa de Thermus caldophilus (Tea); ADN polimerasa de Deinococcus radiodurans (Dra); ADN polimerasa de Thermotoga maritima (Tma); ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana (Tne); ADN polimerasa de Thermosipho africanus (Taf); ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus (Bst); y ADN polimerasa de Bacillus caldotenax (Bca). (A) Identidades de secuencia sobre toda la enzima polimerasa I (correspondiente a los aminoacidos 1-834 de Z05); y (B) identidades de secuencia sobre el subdominio de polimerasa correspondiente a los aminoacidos 420-834 de Z05.

La figura 3 proporciona identidades de secuencia entre diversas enzimas ADN polimerasa I de Thermus sp: ADN polimerasa Z05 deThermus sp. (Z05); ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq); ADN polimerasa de Thermus filiformis (Tfi); ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfl); ADN polimerasa de Thermus sp. sps17 (Sps17); ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth); y ADN polimerasa de Thermus caldophilus (Tea). (A) Identidades de secuencia sobre toda la enzima polimerasa I (correspondiente a los aminoacidos 1-834 de Z05); y (B) identidades de secuencia sobre el subdominio de polimerasa correspondiente a los aminoacidos 420-834 de Z05.

Descripcion detallada

La presente invencion proporciona ADN polimerasas mejoradas en las que se han mutado uno o mas aminoacidos en el dominio de polimerasa en relacion con una ADN polimerasa funcional. Las ADN polimerasas de la invencion son enzimas activas que tienen eficacia de transcriptasa inversa incrementada (por ejemplo, en presencia de cationes divalentes de Mn2+ y Mg2+) en relacion con la forma no modificada de la polimerasa. Tambien pueden tener

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tolerancia al emparejamiento erroneo, velocidad de extension y tolerancia de los inhibidores de la polimerasa y RT incrementadas. Se pueden usar las ADN polimerasas mutantes en concentraciones mas bajas para un rendimiento superior o equivalente como enzimas precursoras. Las ADN polimerasas mutantes pueden tener eficacia de transcriptasa inversa incrementada mientras que retienen sustancialmente la misma actividad de polimerasa dependiente de ADN en relacion con una polimerasa no modificada o de control. La invencion se expone en las reivindicaciones adjuntas a esta descripcion.

Las ADN polimerasas que realizan mas eficazmente la transcripcion inversa son utiles, por ejemplo, en una variedad de aplicaciones que implican ensayos que emplean RT-PCR para detectar y/o cuantificar dianas de ARN. Por lo tanto, las ADN polimerasas son utiles en una variedad de aplicaciones que implican la extension de polinucleotidos, asi como la transcripcion inversa o amplificacion de moldes de polinucleotido, que incluyen, por ejemplo, aplicaciones en estudios de ADN recombinante y en el diagnostico medico de la enfermedad. Las ADN polimerasas mutantes tambien son particularmente utiles, debido a su tolerancia para los emparejamientos erroneos, para detectar dianas que posiblemente tienen secuencias variables (por ejemplo, dianas viricas, o marcadores geneticos de cancer y otras enfermedades).

En el presente documento se divulgan ADN polimerasas que se pueden caracterizar por tener el siguiente motivo: Asp-X1-X2-Lys-X3-Ala-Met-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Leu

(tambien denominado en el presente documento en el codigo de una letra D-X1-X2-K-X3-A-M-X4-X5-X6-X7-X8-X9- L) (SEQ ID NO:8); en el que:

X1 es Leu (L) o Ile (I);

X2 es cualquier aminoacido distinto de Met (M) o Ile (I);

X3 es Leu (L), Ile (I) o Lys (K);

X4 es Val (V) o Ile (I);

X5 es Lys (K), Arg (R), Glu (E), Asp (D), Asn (N) o Gin (Q);

X6 es Leu (L) o Ile (I);

X7 es Phe (F), Asp (D), His (H), Ser (S) o Asn (N);

X8 es Pro (P), Arg (R), Glu (E), Asn (N), Val (V) o Ala (A);

X9 es His (H), Arg (R), Glu (E) o Gin (Q).

En el presente documento, X2 se puede seleccionar de G, A, V, R, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, L o H. Tambien se divulgan ADN polimerasas que se pueden caracterizar por tener el siguiente motivo:

Asp-Leu-X2-Lys-Leu-Ala-Met-Val-X5-Leu-Phe-Pro-X9-Leu

(tambien denominado en el presente documento en el codigo de una letra D-L-X2-K-L-A-M-V-X5-L-F-P-X9-L) (SEQ ID NO: 9); en el que:

X2 es cualquier aminoacido distinto de Met (M);

X5 es Lys (K) o Arg (R);

X9 es His (H) o Arg (R).

Tambien se divulgan ADN polimerasas que se pueden caracterizar por tener el siguiente motivo:

Asp-Leu-X2-Lys- Leu-Ala-Met-Val-Lys-Leu-Phe-Pro-His-Leu

(tambien denominado en el presente documento en el codigo de una letra D-L-X2-K-L-A-M-V-K-L-F-P-H-L) (SEQ ID NO: 10); en el que: X2 es cualquier aminoacido distinto de Met (M).

Tambien se divulgan ADN polimerasas que se pueden caracterizar por tener el siguiente motivo:

Asp-Leu-X2-Lys-Leu-Ala-Met-Val-Lys-Leu-Phe-Pro-His-Leu (tambien denominado en el presente documento en el codigo de una letra D-L-X2-K-L-A-M-V-K-L-F-P-H-L) (SEQ ID NO: 11); en el que:

X2 es Thr (T).

Tambien se divulgan las ADN polimerasas que se pueden caracterizar por tener los motivos anteriores (por ejemplo, las SEQ ID NO: 8, 9, 10 y 11), opcionalmente en combinacion con motivos adicionales descritos a continuacion. Por ejemplo, la ADN polimerasa comprende adicionalmente el motivo de la SEQ ID NO: 29 y/o la SEQ ID NO: 38.

Este motivo esta presente en el dominio de los "dedos" (L helice alfa) de muchas ADN polimerasas dependientes de ADN de tipo A de la de la familia, particularmente ADN polimerasas termoestables de bacterias termofilas (Li et al., EMBO J. 17:7514-7525, 1998). Por ejemplo, la figura 1 muestra una alineacion de secuencias de aminoacidos de una region del dominio de los “dedos” de las ADN polimerasas de diversas especies de bacterias: Bacillus caldotenax, Bacillus stearothermophilus, Deinococcus radiodurans, Thermosipho africanus, Thermotoga maritima, Thermotoga neopolitana, Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus filiformus, Thermus flavus, Thermus sp. Sps17, Thermus sp. Z05 y Thermus thermophilus. Como se muestra, la secuencia natural correspondiente al motivo anterior esta presente en cada una de estas polimerasas, indicando una funcion conservada de esta region de la

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polimerasa. La figura 2 proporciona identidades de secuencia entre estas ADN polimerasas.

Por consiguiente, la divulgacion proporciona una polimerasa que comprende la SEQ ID NO:8, 9, 10 u 11, que tiene actividad y/o caracteristicas mejoradas descritas en el presente documento, y en la que la ADN polimerasa es de otro modo una ADN polimerasa natural, tal como, por ejemplo, una polimerasa de cualquiera de las especies de bacterias termofilas enumeradas anteriormente o es sustancialmente identica a dicha ADN polimerasa natural. Por ejemplo, la polimerasa de la invencion puede comprender la SEQ ID NO: 8, 9, 10 u 11 y es al menos un 80 %, 85 %,

90 % o 95 % identica a la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37, o 39. En una variacion, la forma no

modificada de la polimerasa es de una especie del genero Thermus. Tambien se divulga que la polimerasa no modificada es de una especie termofila distinta de Thermus, por ejemplo, Thermotoga. La secuencia de aminoacidos y acidos nucleicos completa para numerosas ADN polimerasas termoestables esta disponible. Las secuencias de cada una de Thermus aquaticus (Taq) (SEQ ID NO:2), Thermus thermophilus (Tth) (SEQ ID NO:6), especie Thermus Z05 (SEQ ID NO:1), especie Thermus sps17 (SeQ ID NO:5), Thermotoga maritima (Tma) (SeQ ID NO:34) y Thermosipho africanus (Taf) (SEQ ID NO:33) se han publicado en la publicacion de patente Internacional PCT n.° WO 92/06200. La secuencia para la ADN polimerasa de Thermus flavus (SEQ ID NO:4) se ha publicado en Akhmetzjanov y Vakhitov (Nucleic Acids Research 20:5839, 1992). La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Thermus caldophilus (SEQ ID NO:7) se encuentra en el n.° de acceso a EMBL/GenBank U62584. La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Thermus filiformis se puede recuperar del n.° 42380 del deposito de ATCC usando, por ejemplo, los procedimientos proporcionados en la patente de EE. UU. n.° 4.889.818, asi como la

informacion de secuencia proporcionada en la tabla 1. La secuencia de la ADN polimerasa de Thermotoga

neapolitana (SEQ ID NO: 35) es del n.° de acceso a la base de datos de la patente de GeneSeq R98144 y el documento de PCT WO 97/09451. La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Bacillus caldotenax (SEQ ID NO: 37) se describe, por ejemplo, en Uemori et al. (J Biochem (Tokyo) 113(3):401 -410, 1993; vease tambien el n.° de acceso a la base de datos de Swiss-Prot Q04957 y los n.os de acceso a GenBank D12982 y BAA02361). Tambien se describen ejemplos de formas no modificadas de ADN polimerasas que se pueden modificar como se describe en el presente documento, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.os 6.228.628;

6.346.379; 7.030.220; 6.881.559; 6.794.177; 6.468.775 y la patente de EE. UU. n.os 7.148.049; 7.179.590;

7.410.782; 7.378.262. Tambien se proporcionan secuencias de polimerasas de longitud completa en el listado de secuencias.

Tambien son susceptibles de las mutaciones descritas en el presente documento ADN polimerasas funcionales que se han modificado previamente (por ejemplo, mediante delecion, adicion o sustitucion de aminoacidos). Dichas polimerasas modificadas funcionales retienen el motivo aminoacidico de la SEQ ID NO: 8 (o un motivo de la SEQ ID NO: 9, 10 u 11) y opcionalmente el motivo aminoacidico de la SEQ ID NO: 38. De esta manera, las ADN polimerasas no modificadas adecuadas tambien incluyen variantes funcionales de polimerasas naturales. Dichas variantes tienen tipicamente una similitud o identidad de secuencia sustancial con respecto a la polimerasa natural, tipicamente al menos un 80 % de identidad de secuencia y mas tipicamente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia.

Una polimerasa, ademas de tener un dominio de polimerasa que comprende las SEQ ID NO: 8, 9, 10 u 11, puede comprender tambien un dominio de nucleasa (por ejemplo, correspondiente a las posiciones 1 a 291 de Z05).

Una polimerasa puede ser una polimerasa quimerica, es decir, que comprende regiones de polipeptidos de dos o mas enzimas. Los ejemplos de dichas ADN polimerasas quimericas se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 6.228.628. Son particularmente adecuadas las ADN polimerasas de la familia CS quimericas, que incluyen las polimerasas CS5 (SEQ ID NO: 27) y CS6 (SEQ ID NO: 28) y variantes de las mismas que tienen similitud o identidad de secuencia de aminoacidos sustancial con respecto a la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28 (tipicamente al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoacidos y mas tipicamente al menos un 90 %,

91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoacidos) y, de esta manera, se pueden modificar para contener la SEQ ID NO: 8. Las ADN polimerasas CS5 y CS6 son enzimas quimericas derivadas de las ADN polimerasas de Thermus sp. Z05 y Thermotoga maritima (Tma). Comprenden el dominio de 5'-nucleasa de extremo N de la enzima de Thermus y los dominios de polimerasa y 3'-5' exonucleasa de extremo C de la enzima de Tma. Estas enzimas tienen actividad de transcriptasa inversa eficaz, pueden extender cebadores que contienen analogos de nucleotidos y pueden incorporar dNTP de alfa-fosforotioato, dUTP, dITP y tambien dNTP marcados de la familia de los tintes de fluoresceina y cianina. Las polimerasas CS5 y CS6 tambien son enzimas de PCR activadas por Mg2+ eficaces. Las polimerasas quimericas CS5 y CS6 se describen adicionalmente, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.148.049.

Las sustituciones de aminoacidos pueden ser sustituciones de aminoacidos unicos. Las ADN polimerasas proporcionadas en la presente invencion pueden comprender una o mas sustituciones de aminoacidos en el sitio activo en relacion con la polimerasa no modificada. La(s) sustitucion/sustituciones de aminoacidos puede(n) comprender al menos la posicion X2 del motivo expuesto en la SEQ ID NO: 8 (o un motivo de la SEQ ID NO: 9, 10 u 11). La sustitucion de aminoacidos en esta posicion confiere eficacia de transcriptasa inversa incrementada, tolerancia al emparejamiento erroneo, velocidad de extension y/o tolerancia de los inhibidores de la polimerasa y RT, produciendo una aDn polimerasa mutante con una eficacia de transcriptasa inversa incrementada, tolerancia al emparejamiento erroneo, velocidad de extension y/o tolerancia de los inhibidores de la polimerasa y RT en relacion

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con la polimerasa no modificada. Tipicamente, el aminoacido en la posicion X 2 esta sustituido con un aminoacido que no se corresponde con la secuencia natural en el motivo expuesto en la SEQ ID NO: 8 (o un motivo de la SEQ ID NO: 9, 10 u 11). De esta manera, tipicamente, el aminoacido en la posicion X2, si esta sustituido, no es Met (M) o Ile (I), ya que se producen M o I en esta posicion en polimerasas naturales. Vease, por ejemplo, la figura 1. Las sustituciones de aminoacidos pueden incluir G, A, V, R, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, L o H en la posicion X2. Las sustituciones de aminoacidos pueden incluir treonina (T) en la posicion X2. Se puede(n) determinar otra(s) sustitucion/sustituciones de aminoacidos adecuada(s) en uno o mas de los sitios identificados usando, por ejemplo, procedimientos conocidos de mutagenesis dirigida a sitio y determinacion del rendimiento de extension de polinucleotidos en ensayos descritos adicionalmente en el presente documento o, de otro modo, conocidos por expertos en la tecnica.

La polimerasa divulgada en el presente documento puede comprender la SEQ ID NO: 8, 9, 10 u 11 y puede comprender adicionalmente uno o mas cambios de aminoacidos adicionales (por ejemplo, mediante delecion, adicion o sustitucion de aminoacidos) en comparacion con una polimerasa natural. Dichas polimerasas retienen el motivo aminoacidico de la SEQ ID NO: 8 (o un motivo de la SEQ ID NO: 9, 10 u 11) y comprenden adicionalmente el motivo aminoacidico de la SEQ ID NO: 38 (correspondiente a la mutacion D580X de Z05 (SEQ ID NO:1)) como sigue:

Thr-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser-X7-X8-Pro-Asn-Leu-Gln-Asn (tambien denominado en el presente documento en el codigo de una letra T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N) (SEQ ID NO:38); en el que X7 es Ser (S) o Thr (T); y

X8 es cualquier aminoacido distinto de Asp (D) o Glu (E)

La mutacion caracterizada por la SEQ ID NO: 38 se analiza en mas detalle, por ejemplo, en la publicacion de patente de EE. UU. n.° 2009/0148891. Dichas polimerasas de variantes funcionales tienen tipicamente una similitud o identidad de secuencia sustancial con respecto a la polimerasa natural (por ejemplo, la SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 39), tipicamente al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoacidos y mas tipicamente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoacidos.

Tambien se divulgan polimerasas que comprenden la SEQ ID NO: 8, 9, 10 u 11 y que comprenden adicionalmente el motivo aminoacidico de la SEQ ID NO: 29 (correspondiente a la mutacion 1709X de Z05 (SEQ ID NO:1)) como sigue:

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-Gly-Tyr-Val-X14-Thr-Leu

(tambien denominado en el presente documento en el codigo de una letra X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12- X13-G-Y-V-X14-T-L) (SEQ ID NO:29); en el que

XI es Ala (A), Asp (D), Ser (S), Glu (E), Arg (R) o Gin (Q);

X2 es Trp (W) o Tyr (Y);

X3 es cualquier aminoacido distinto de Ile (I), Leu (L) o Met (M);

X4 es Glu (E), Ala (A), Gln (Q), Lys (K), Asn (N) o Asp (D);

X5 es Lys (K), Gly (G), Arg (R), Gin (Q), Hes (H) o Asn (N);

X6 es Thr (T), Val (V), Met (M) o Ile (I);

X7 es Leu (L), Val (V) o Lys (K);

X8 es Glu (E), Ser (S), Ala (A), Asp (D) o Gin (Q);

X9 es Glu (E) o Phe (F);

X10 es Gly (G) o Ala (A);

XII es Arg (R) o Lys (K);

X12 es Lys (K), Arg (R), Glu (E), Thr (T) o Gln (Q);

X13 es Arg (R), Lys (k) o His (H); y X14 es Glu (E), Arg (R) o Thr (T).

Dichas polimerasas de variantes funcionales tendran tipicamente una similitud o identidad de secuencia sustancial con respecto a la polimerasa natural (por ejemplo, la SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 39), tipicamente al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoacidos y mas tipicamente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoacidos.

Tambien se divulgan ADN polimerasas que comprenden una sustitucion de aminoacidos en la posicion X2 (por ejemplo, como en un motivo seleccionado de la SEQ ID NO: 8, 9, 10 u 11) y que comprenden una sustitucion de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 29.

En el presente documento, se puede sustituir el aminoacido en la posicion X2 con un aminoacido como se expone en la SEQ ID NO: 8, 9, 10 u 11, y el aminoacido en la posicion X8 (de la SEQ ID NO: 38) se sustituye con un aminoacido como se expone en la SEQ ID NO: 38. De esta manera, el aminoacido en la posicion X2 puede ser cualquier aminoacido distinto de Met (M) o Ile (I) y el aminoacido en la posicion X8 puede ser cualquier aminoacido

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distinto de Asp (D) o Glu (E). Las sustituciones de aminoacidos pueden incluir leucina (L), glicina (G), treonina (T), glutamina (Q), alanina (A), serina (S), asparagina (N), arginina (R) y lisina (K) en la posicion Xe de la SEQ ID NO: 38. Las sustituciones de aminoacidos pueden incluir independientemente treonina (T) en la posicion X2 de la SEQ ID NO: 8, 9, 10 u 11 y glicina (G) en la posicion Xe de la SEQ ID NO: 38.

Se puede sustituir el aminoacido en la posicion X2 con un aminoacido como se expone en la SEQ ID NO: 8, 9, 10 u 11, y se puede sustituir el aminoacido en la posicion X3 con un aminoacido como se expone en la SEQ ID NO: 29. De esta manera, el aminoacido en la posicion X2 puede ser cualquier aminoacido distinto de Met (M) o Ile (I) y el aminoacido en la posicion X3 puede ser cualquier aminoacido distinto de Ile (I), Leu (L) o Met (M). Las sustituciones de aminoacidos pueden incluir lisina (K), arginina (R), serina (S), glicina (G) o alanina (A) en la posicion X3 de la SEQ ID NO: 29. En determinados modos de realizacion, las sustituciones de aminoacidos incluyen independientemente treonina (T) en la posicion X2 de la SEQ ID NO: 8, 9, 10 u 11, y lisina (K) en la posicion X3 de la SEQ ID NO: 29.

Se puede(n) determinar otra(s) sustitucion/sustituciones de aminoacidos adecuada(s) en uno o mas de los sitios identificados usando, por ejemplo, procedimientos conocidos de mutagenesis dirigida a sitio y determinacion del rendimiento de extension de polinucleotidos en ensayos descritos adicionalmente en el presente documento o, de otro modo, conocidos por expertos en la tecnica, por ejemplo, sustituciones de aminoacidos descritas en la publicacion de solicitud de patente de EE. UU. n.os 2009/0148891 y 2009/0280539.

Debido a que varia la longitud precisa de las ADN polimerasas, las posiciones de aminoacidos precisas correspondientes a cada una de X2 (SEQ ID NO:8), X8 (SEQ ID NO:38) y X3 (SEQ ID NO:29) pueden variar dependiendo de la polimerasa mutante particular usada. Los programas de alineacion de secuencias de aminoacidos y acidos nucleicos estan facilmente disponibles (veanse, por ejemplo, los que se hace referencia supra) y, dados los motivos particulares identificados en el presente documento, sirven para ayudar a la identificacion de los aminoacidos exactos (y codones correspondientes) para la modificacion de acuerdo con la presente invencion. Las posiciones correspondientes a cada una de X2, X8 y X3 se muestran en la tabla 1 para ADN polimerasas termoestables y ADN polimerasas termoestables quimericas representativas de especies termofilas ejemplares.

Tabla 1: Posiciones de aminoacidos correspondientes a las posiciones del motivo X2 (por ejemplo, de

las SEQ ID NO: 8, 9, 10 y 11), Xa (de la SEQ ID NO: 38) y X3 (de la SEQ ID NO: 29) en polimerasas ejemplares.

Oraanismo o secuencia auimerica

Posicion de aminoacidos

Consenso (SEQ ID NO:)

X2 X8 (de la SEQ ID NO:38) X3 (de la SEQ ID NO:29)

T. thermophilus (6)

763 580 709

T. caldophilus (7)

763 580 709

T. sp. Z05 (1)

763 580 709

T. aquaticus (2)

761 578 707

T.flavus (4)

760 577 706

T. filiformis (3)

759 576 705

T. sp. Sps17 (5)

759 576 705

T. maritima (34)

824 640 770

T. neapolitana (35)

824 640 770

T. africanus (33)

823 639 769

B. caldotenax (37)

805 621 751

B. stearothermophilus (36)

804 620 750

CS5 (27)

824 640 770

CS6 (28)

824 640 770

La ADN polimerasa puede derivar de Thermus sp. La ADN polimerasa Z05 (SEQ ID NO: 1) o una variante de la misma (por ejemplo, que porta la mutacion D580G o similar). Como se hace referencia anteriormente, en la ADN

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polimerasa Z05 de Thermus sp., la posicion X2 corresponde a metionina (M) en la posicion 763; la posicion Xe corresponde a aspartato (D) en la posicion 580 y la posicion X3 corresponde a isoleucina (I) en la posicion 709. La polimerasa mutante puede comprender al menos una sustitucion de aminoacidos, en relacion con una ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (o una ADN polimerasa que es sustancialmente identica, por ejemplo, al menos aproximadamente un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % identica a la SEQ iD NO: 1), en la posicion M763, la posicion D580 y/o la posicion 1709. De esta manera, tipicamente, el aminoacido en la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 no es M. El aminoacido en la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1, se puede seleccionar de G, A, V, R, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, L, I o H. El residuo de aminoacidos en la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 es T en la invencion. Los residuos de aminoacidos en la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 se pueden seleccionar de leucina (L), glicina (G), treonina (T), glutamina (Q), alanina (A), serina (S), asparagina (N), arginina (R) y lisina (K). El residuo de aminoacidos en la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 es glicina (G) en la invencion. Adicionalmente, el aminoacido en la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 no es I. Tambien se divulga que el aminoacido en la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 se selecciona de G, A, V, R, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, L, M o H. En el presente documento, el aminoacido en la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 puede ser K, R, S, G o A. El aminoacido en la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es K en la invencion.

Los mutantes de ADN polimerasa Z05 de Thermus sp ejemplares incluyen los que comprenden la(s) sustitucion/sustituciones de aminoacidos M763T, y/o I709K (o I709R, I709S, I709G, I709A), y/o D580G. La aDn polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende por ejemplo, las sustituciones de residuos de aminoacidos M763T y D580G. En algunos modos de realizacion, la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos de aminoacidos M763T y I709K. En algunos modos de realizacion, la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos de aminoacidos M763T, I709K y D580G. La ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo las sustituciones de residuos de aminoacidos seleccionadas independientemente de M763T, I709K y/o D580G.

Se ha mostrado previamente que las sustituciones en el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 descritas anteriormente puede dar como resultado ADN polimerasas que tienen eficacia de transcripcion inversa mejorada (es decir, incrementada) actividad de RT-PCR incrementada (por ejemplo, amplificacion mas eficaz de un molde de ARN sin comprometer la eficacia de la PCR en un molde de ADN), eficacia de RT-PCR incrementada en presencia de Mg2+, actividad de transcriptasa inversa incrementada en presencia de inhibidores (por ejemplo, productos de descomposicion de hemoglobina, tales como hemina y/o heparina), velocidad de extension incrementada y tolerancia al emparejamiento erroneo en 3' mejorada en comparacion con una polimerasa de control. Vease la solicitud de patente de EE. UU. n.° 13/443.721, presentada el 10 de abril de 2012. De esta manera, se espera que las polimerasas mejoradas que comprenden sustituciones en el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 descritas en el presente documento tambien tengan las propiedades mejoradas descritas anteriormente.

Ademas de las mutaciones y sustituciones descritas en el presente documento, las ADN polimerasas de la presente invencion tambien pueden incluir otra(s) modificacion/modificaciones no sustitutivas. Dichas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, modificaciones covalentes conocidas en la tecnica para conferir una ventaja adicional en aplicaciones que comprenden extension de polinucleotidos. Por ejemplo, una de dichas modificaciones es una modificacion covalente reversible termicamente que inactiva la enzima, pero que se invierte para activar la enzima tras la incubacion a una temperatura elevada, tal como una temperatura usada tipicamente para la extension de polinucleotidos. Los reactivos ejemplares para dichas modificaciones reversibles termicamente se describen en las patentes de EE. UU. n.os 5.773.258 y 5.677.152.

Las ADN polimerasas de la presente invencion se pueden construir mutando las secuencias de ADN que codifican la polimerasa no modificada correspondiente (por ejemplo, una polimerasa natural o una variante correspondiente de la que deriva la polimerasa de la invencion), tal como usando tecnicas denominadas comunmente mutagenesis dirigida a sitio. Las moleculas de acido nucleico que codifican la forma no modificada de la polimerasa se pueden mutar mediante una diversidad de tecnicas de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocidas por un experto en la tecnica. (Vease, por ejemplo, PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand, y J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA) en el capitulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, y T. J. white eds., Academic Press, NY, 1990).

A modo de ejemplo no limitante, se pueden emplear los dos sistemas de cebadores, utilizados en el kit de mutagenesis dirigida a sitio por transformador de Clontech, para introducir mutantes dirigidos a sitio en un polinucleotido que codifica una forma no modificada de la polimerasa. Despues de la desnaturalizacion del plasmido diana en este sistema, se hibridan simultaneamente dos cebadores al plasmido; uno de estos cebadores contiene la mutacion dirigida a sitio deseada, el otro contiene una mutacion en otro punto en el plasmido que da como resultado la eliminacion de un sitio de restriccion. A continuacion, se lleva a cabo la sintesis de la segunda cadena, enlazando firmemente estas dos mutaciones, y los plasmidos resultantes se transforman en una cepa mutS de E. Coli El ADN plasmidico se aisla de las bacterias transformadas, se restringe con la enzima de restriccion pertinente (linealizando de este modo los plasmidos no mutados), y, a continuacion, se retransforma en E. coli. Este sistema permite la generacion de mutaciones directamente en un plasmido de expresion, sin la necesidad de subclonar o generar fagemidos monocatenarios. El firme enlace de las dos mutaciones y la linealizacion posterior de los plasmidos no

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mutados dan como resultado una eficacia de mutacion alta y permiten un cribado minimo. Despues de la sintesis del cebador de sitio de restriccion inicial, este procedimiento requiere el uso de unicamente un nuevo tipo de cebador por sitio de mutacion. En lugar de preparar cada mutante posicional por separado, se puede sintetizar un conjunto de cebadores oligonucleotidicos "degenerados disenados" a fin de introducir simultaneamente todas las mutaciones deseadas en un sitio dado. Los transformantes se pueden cribar mediante secuenciacion del ADN plasmidico a traves de la region mutagenizada para identificar y clasificar clones mutantes. A continuacion, cada ADN mutante se puede restringir y analizar mediante electroforesis, tal como, por ejemplo, en un gel de potenciacion de la deteccion de mutaciones (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) para confirmar que no se han producido otras alteraciones en la secuencia (mediante comparacion por desplazamiento de banda con respecto al control no mutado). De manera alternativa, se puede secuenciar toda la region de ADN para confirmar que no se ha producido ningun acontecimiento mutacional adicional fuera de la region diana.

Las ADN polimerasas con mas de un aminoacido sustituido se pueden generar de diversas maneras. En el caso de aminoacidos localizados cerca entre si en la cadena polipeptidica, se pueden mutar simultaneamente usando un oligonucleotido que codifica todas las sustituciones de aminoacidos deseadas. Sin embargo, si los aminoacidos se localizan a cierta distancia entre si (separados en mas de diez aminoacidos, por ejemplo) es mas dificil generar un unico oligonucleotido que codifique todos los cambios deseados. En su lugar, se puede emplear uno de dos procedimientos alternativos. En el primer procedimiento, se genera un oligonucleotido separado para cada aminoacido que se va a sustituir. A continuacion, se hibridan simultaneamente los oligonucleotidos al ADN molde monocatenario y la segunda cadena de ADN que se sintetiza a partir del molde codifica todas las sustituciones de aminoacidos deseadas. Un procedimiento alternativo implica dos o mas rondas de mutagenesis para producir el mutante deseado. La primera tanda es como se describe para los mutantes unicos: se usa el ADN que codifica la polimerasa no modificada para el molde, se hibrida un oligonucleotido que codifica la(s) primera(s) sustitucion/sustituciones de aminoacidos deseada(s) a este molde, y, a continuacion, se genera la molecula de ADN de heteroduplex. La segunda tanda de mutagenesis utiliza el ADN mutado producido en la primera tanda de mutagenesis como molde. De esta manera, este molde ya contiene una o mas mutaciones. A continuacion, se hibrida el oligonucleotido que codifica la(s) sustitucion/sustituciones de aminoacidos deseada(s) adicional(es) a este molde y la cadena de ADN resultante codifica ahora mutaciones tanto de la primera como de la segunda tandas de mutagenesis. Este ADN resultante se puede usar como un molde en una tercera tanda de mutagenesis, y asi sucesivamente. De manera alternativa, se puede utilizar el procedimiento de mutagenesis de sitio multiple de Seyfang & Jin (Anal. Biochem. 324:285-291.2004).

Por consiguiente, tambien se proporcionan acidos nucleicos recombinantes que codifican cualquiera de las ADN polimerasas de la presente invencion. Usando un acido nucleico de la presente invencion, que codifica una ADN polimerasa, se pueden preparar una variedad de vectores. Se puede usar cualquier vector que contenga replicon y secuencias de control que deriven de una especie compatible con la celula huesped en la practica de la invencion. Generalmente, los vectores de expresion incluyen regiones de acido nucleico reguladoras transcripcionales y traduccionales enlazadas de manera funcional al acido nucleico que codifica la ADN polimerasa. El termino "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresion de una secuencia codificante enlazada de manera funcional en un organismo huesped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de union a ribosoma. Ademas, el vector puede contener un elemento retrorregulador positivo (PRE) para potenciar la semivida del ARNm transcrito (vease la patente de EE. UU. n.° 4.666.848). Las regiones de acido nucleico reguladoras transcripcionales y traduccionales generalmente son apropiadas para la celula huesped usada para expresar la polimerasa. En la tecnica se conocen numerosos tipos de vectores de expresion apropiados y secuencias reguladoras adecuadas para una variedad de celulas huesped. En general, las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales pueden incluir, por ejemplo, secuencias promotoras, sitios de union ribosomicos, secuencias de inicio y parada transcripcionales, secuencias de inicio y parada traduccionales y secuencias potenciadoras o activadoras. En modos de realizacion tipicos, las secuencias reguladoras incluyen un promotor y secuencias de inicio y parada transcripcionales. Los vectores tambien incluyen tipicamente una region de polienlazador que contiene varios sitios de restriccion para la insercion de ADN exogeno. En determinados modos de realizacion, se usan "senales de fusion" para facilitar la purificacion y, si se desea, la retirada posterior de la secuencia etiqueta/senal, por ejemplo, la "etiqueta His". Sin embargo, generalmente son innecesarias cuando se purifica una proteina termoactiva y/o termoestable de un huesped mesofilo (por ejemplo, E. coli) donde se puede emplear una "etapa de calor". La construccion de vectores adecuados que contienen ADN que codifica secuencias de replicacion, secuencias reguladoras, genes de seleccion de fenotipo y la polimerasa de interes se preparan usando procedimientos de ADN recombinante estandar. Los plasmidos aislados, vectores viricos y fragmentos de ADN se escinden, adaptan y ligan entre si en un orden especifico para generar los vectores deseados, como se conoce bien en la tecnica (vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, 2.° ed. 1989)).

El vector de expresion puede contener un gen marcador seleccionable para permitir la seleccion de celulas huesped transformadas. Los genes de seleccion se conocen bien en la tecnica y varian con la celula huesped usada. Los genes de seleccion adecuados pueden incluir, por ejemplo, genes que codifican la resistencia a tetraciclina y/o ampicilina, que posibilita que las celulas transformadas con estos vectores crezcan en presencia de estos antibioticos.

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Se puede introducir un acido nucleico que codifica una ADN polimerasa en una celula, ya sea solo o en combinacion con un vector. Por "introducir en" o equivalentes gramaticales en el presente documento significa que los acidos nucleicos entran en las celulas de una manera adecuada para la posterior integracion, amplificacion y/o expresion del acido nucleico. El procedimiento de introduccion esta dictado en gran medida por el tipo de celula seleccionada como diana. Los procedimientos ejemplares incluyen la precipitacion con CaPC>4, fusion de liposomas, LIPOFECTIN®, electroporacion, infeccion virica y similares.

Se pueden usar tipicamente procariotas como celulas huesped para las etapas de clonacion iniciales. Son particularmente utiles para la produccion rapida de grandes cantidades de ADN, para la produccion de moldes de ADN monocatenario usados para la mutagenesis dirigida a sitio, para cribar simultaneamente muchos mutantes y para la secuenciacion de ADN de los mutantes generados. Las celulas huesped procariotas adecuadas incluyen la cepa 94 de E. coli K12 (ATCC n.° 31,446), la cepa W3110 de E. coli (ATCC n.° 27.325), la cepa DG116 de E. coli K12 (ATCC n.° 53.606), E. coli X1776 (AtCc n.° 31.537) y E. coli B; sin embargo, se pueden usar como huespedes todas de muchas otras cepas de E. coli, tales como HB101, JM101, NM522, NM538, NM539 y muchas otras especies y generos de procariotas, que incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, otras enterobacterias como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans y diversas especies de Pseudomonas. Las celulas huesped procarioticas u otras celulas huesped con paredes celulares rigidas se transforman tipicamente usando el procedimiento de cloruro de calcio como se describe en la seccion 1.82 de Sambrook et al, supra. De manera alternativa, se puede usar electroporacion para la transformacion de estas celulas. Las tecnicas de transformacion de procariota se exponen, por ejemplo, en Dower, in Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990); Hanahan et al., Meth. Enzymol., 204:63, 1991. Los plasmidos usados tipicamente para la transformacion de E. coli incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, Puc119 y Bluescript M13, todos los cuales se describen en las secciones 1.12-1.20 de Sambrook et al, supra. Sin embargo, tambien estan disponibles muchos otros vectores adecuados.

Las ADN polimerasas de la presente invencion se producen tipicamente cultivando una celula huesped transformada con un vector de expresion que contiene un acido nucleico que codifica la ADN polimerasa, en las condiciones apropiadas para inducir o provocar la expresion de la ADN polimerasa. Los procedimientos de cultivo de celulas huesped transformadas en condiciones adecuadas para la expresion de proteinas se conocen bien en la tecnica (vease, por ejemplo, Sambrook et al, supra). Las celulas huesped adecuadas para la produccion de las polimerasas a partir de vectores plasmidicos que contienen promotor pL lambda incluyen la cepa DG116 de E. coli (ATCC n.° 53606) (vease la patente de EE. Uu. n.° 5.079.352 y Lawyer, F.C. et al, PcR Methods and Applications 2:275-87, 1993). Despues de la expresion, la polimerasa se puede recoger y aislar. Los procedimientos para purificar la ADN polimerasa termoestable se describen, por ejemplo, en Lawyer et al, supra. Una vez purificada, se puede someter a prueba la capacidad de las ADN polimerasas para tener eficacia de RT mejorada, tolerancia al emparejamiento erroneo incrementada, velocidad de extension y/o tolerancia de los inhibidores de la polimerasa y RT (por ejemplo, como se describe en los ejemplos).

Se pueden usar las ADN polimerasas mejoradas de la presente invencion para cualquier proposito en el que dicha actividad enzimatica sea necesaria o deseada. Por consiguiente, en otro aspecto de la invencion, se proporcionan procedimientos de extension de polinucleotidos (por ejemplo, PCR) usando las polimerasas. Las condiciones adecuadas para la extension de polinucleotidos se conocen en la tecnica. (Vease, por ejemplo, Sambrook et al., supra. Vease tambien Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4.° ed., John Wiley & Sons 1999). Generalmente, se hibrida un cebador, es decir, se hibrida a un acido nucleico diana para formar un complejo cebador-molde. El complejo cebador-molde se pone en contacto con la ADN polimerasa y nucleosidos trifosfato en un ambiente adecuado para permitir la adicion de uno o mas nucleotidos al extremo 3' del cebador, produciendo de este modo un cebador extendido complementario al acido nucleico diana. El cebador puede incluir, por ejemplo, uno o mas analogos de nucleotidos. Ademas, los nucleosidos trifosfato pueden ser nucleotidos convencionales, nucleotidos no convencionales (por ejemplo, ribonucleotidos o nucleotidos marcados), o una mezcla de los mismos. En algunas variaciones, la reaccion de extension de polinucleotidos comprende la amplificacion de un acido nucleico diana. Tambien son conocidas en la tecnica condiciones adecuadas para la amplificacion de acidos nucleicos usando una ADN polimerasa y un par de cebadores (por ejemplo, procedimientos de amplificacion por PCR). (Vease, por ejemplo, Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra; PCR Applications: Protocols for Functional Genomics (Innis et al. eds., Academic Press 1999). En otros modos de realizacion no mutuamente exclusivos, la reaccion de extension de polinucleotidos comprende la transcripcion inversa de un molde de ARN (por ejemplo, RT- PCR). En algunos modos de realizacion, las polimerasas mejoradas encuentran uso en secuenciacion 454 (Margulies, M et al. 2005, Nature, 437, 376-380).

Opcionalmente, la reaccion de extension del cebador comprende un inhibidor real o potencial de una polimerasa de referencia o no modificada. Por ejemplo, el inhibidor puede inhibir la velocidad de extension de acidos nucleicos y/o la eficacia de transcripcion inversa de una polimerasa de referencia o no modificada (de control). En el presente documento, el inhibidor puede ser hemoglobina, o un producto de degradacion de la misma. Por ejemplo, el producto de degradacion de hemoglobina puede ser un producto de descomposicion de hemo, tal como hemina, hematoporfirina o bilirrubina. El inhibidor puede ser un quelante de hierro o un pigmento purpura. El inhibidor puede ser heparina. El inhibidor puede ser un tinte intercalante. El inhibidor puede ser melanina, que se ha descrito como un inhibidor de la polimerasa. Vease, por ejemplo, Ekhardt, et al, Biochem Biophys Res Commun. 271(3):726-30

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(2000).

Se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invencion para extender moldes en presencia de moldes de polinucleotido aislados de muestras que comprenden inhibidores de la polimerasa, por ejemplo, tales como sangre. Por ejemplo, se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invencion para extender moldes en presencia de hemoglobina, un componente principal de la sangre, o en presencia de un producto de degradacion de hemoglobina. La hemoglobina puede degradarse en diversos productos de descomposicion de hemo, tales como hemina, hematina, hematoporfirina y bilirrubina. De esta manera, se pueden usar ADN polimerasas de la presente invencion para extender moldes en presencia de productos de degradacion de hemoglobina, incluyendo, pero no limitados a, hemina, hematina, hematoporfirina y bilirrubina. En el presente documento, el producto de degradacion de hemoglobina puede ser hemina. Se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invencion para extender moldes en presencia de hemina aproximadamente 0,5 a 20,0 pM, aproximadamente 0,5 a 10,0 pM, aproximadamente 0,5 a 5,0 pM, aproximadamente 1,0 a 10,0 pM, aproximadamente 1,0 a 5,0 pM, aproximadamente

2.0 a 5,0 pM o aproximadamente 2,0 a 3,0 pM. Se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invencion para extender moldes en presencia de al menos hemina aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 4,0, 5,0, 10,0, 20,0 o mayor de 20 pM. Los productos de descomposicion de hemoglobina incluyen quelantes de hierro y pigmentos purpura. De esta manera, se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invencion para extender moldes en presencia de quelantes de hierro y/o pigmentos purpura. Se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invencion para extender moldes en presencia de cantidades de productos de degradacion de hemoglobina que inhiben la extension del mismo molde mediante una ADN polimerasa de referencia o de control.

Se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invencion para extender moldes en presencia de heparina. La heparina esta presente comunmente como un anticoagulante en muestras aisladas de sangre. Se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invencion para extender moldes en presencia de aproximadamente 1,0 a 400 ng/pl,

1.0 a 300 ng/pl, 1,0 a 200 ng/pl, 5,0 a 400 ng/pl, 5,0 a 300 ng/pl, 5,0 a 200 ng/pl, 10,0 a 400 ng/pl, 10,0 a 300 ng/pl o

10.0 a 200 ng/pl de heparina. Se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invencion para extender moldes en presencia de al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ng/pl o mayor de 400 ng/pl de heparina. Se pueden usar las ADN polimerasas de la presente invencion para extender moldes en presencia de cantidades de heparina que inhiben la extension del mismo molde mediante una ADN polimerasa de referencia o de control.

Se puede usar una polimerasa mejorada de la invencion en una reaccion de transcripcion inversa. La reaccion de transcripcion inversa se puede llevar a cabo en una mezcla que contiene el molde de ARN, uno o mas cebadores y una aDn polimerasa termoestable de la invencion. La mezcla de reaccion contiene tipicamente los cuatro desoxirribonucleosidos trifosfato estandar (dNTP) y un tampon que contiene un cation divalente y un cation monovalente. Los cationes ejemplares incluyen, por ejemplo, Mg2+, aunque otros cationes, tales como Mn2+ o Co2+ pueden activar ADN polimerasas. La reaccion de transcripcion inversa se puede llevar a cabo con una ADN polimerasa termoactiva de la invencion. La polimerasa mejorada de la invencion puede permitir una amplificacion mas eficaz de moldes de ARN sin comprometer la amplificacion eficaz de un molde de ADn en presencia de Mn2+o Mg2+, como se describe en los ejemplos.

La polimerasa mejorada puede tener una eficacia de transcripcion inversa incrementada en comparacion con una polimerasa de control. No se aprecio previamente que las sustituciones en el aminoacido correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 pudieran dar como resultado una mayor eficacia de RT. De esta manera, las ADN polimerasas que tienen una sustitucion Met (M) a Thr (T) o una sustitucion Ile (I) a Thr (T), en el aminoacido

correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 pueden tener eficacia de RT incrementada. La ADN

polimerasa que tiene una eficacia de transcripcion inversa incrementada puede comprender una sustitucion de Met (M) a Thr (T), o una sustitucion de Ile (I) a Thr (T), en el aminoacido correspondiente a la posicion 763 de la

SEQ ID NO: 1, y puede tener al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %,

91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia de aminoacidos con respecto a las SEQ ID NO: 1-7, 32-37 o 39.

La polimerasa mejorada puede tener eficacia de transcripcion inversa incrementada usando un molde de ARN sin una disminucion sustancial de la actividad de polimerasa usando un molde de ADN. De esta manera, la ADN polimerasa mejorada puede tener una eficacia de RT incrementada sin una disminucion sustancial de la actividad de polimerasa dependiente de ADN cuando se compara con una polimerasa de control. La ADN polimerasa mejorada descrita en el presente documento puede tener actividad de polimerasa dependiente de ADN que sea sustancialmente la misma que una polimerasa de control. De esta manera, en algunos modos de realizacion, la ADN polimerasa mejorada descrita en el presente documento tiene actividad de polimerasa dependiente de ADN que es al menos aproximadamente un 90 % de la actividad de una polimerasa de control, por ejemplo, al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % o mas de la actividad de una polimerasa de control. La actividad de polimerasa dependiente de ADN se puede medir, por ejemplo, amplificando un molde de ADN y determinando los valores de Pc como se describe en el presente documento. De esta manera, la ADN polimerasa puede tener una eficacia de RT mejorada medida como un valor de Pc disminuido en comparacion con una polimerasa de control cuando se usa ARN como molde, pero puede tener un valor de Pc sustancialmente sin

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cambios en relacion con la polimerasa de control cuando se usa ADN como molde. Por ejemplo, cuando se amplifica un molde de ADN, la ADN polimerasa mejorada puede tener un valor de Pc que difiere en menos de 1,0, menos de 0,5, menos de 0,4, menos de 0,3, menos de 0,2 o menos de 0,1 en comparacion con una polimerasa de control. La actividad de polimerasa dependiente de ADN se puede determinar como se describe en los ejemplos.

Una polimerasa mejorada de la invencion puede incrementar la eficacia de transcripcion inversa reduciendo el tiempo de reaccion requerido para extender un molde de ARN. Por ejemplo, una polimerasa mejorada descrita en el presente documento puede acortar significativamente el tiempo de reaccion requerido para transcribir ARN a ADNc en comparacion con una polimerasa de control, incrementando de este modo la eficacia de transcriptasa inversa. Sin estar limitada por la teoria, la polimerasa mejorada puede incrementar la eficacia de RT, por ejemplo, incrementando la actividad de la enzima sobre un molde de ARN, tal como incrementando la velocidad de incorporacion de nucleotidos y/o incrementando la procesabilidad de la polimerasa, acortando eficazmente de este modo el tiempo de extension de un molde de ARN o poblacion de moldes de ARN. Los tiempos de reaccion para la etapa RT inicial son tipicamente del orden de 30 minutos o mas a 65 grados C cuando se usa una polimerasa no modificada o de control. De esta manera, la polimerasa mejorada puede transcribir un molde de ARN en ADNc en menos de aproximadamente 30 minutos, menos de aproximadamente 20 minutos, menos de aproximadamente 10 minutos, menos de aproximadamente 8 minutos, menos de aproximadamente 5 minutos, menos de aproximadamente

4 minutos, menos de aproximadamente 3 minutos o menos de aproximadamente 2 minutos a 65 grados C. La polimerasa mejorada puede transcribir un molde de ARN derivado del transcrito JP2-5 del virus de la hepatitis C (VHC), que contiene las primeras 800 bases de la 5’NTR del genotipo Ib del VHC, en ADNc en menos tiempo o mas rapido que una polimerasa de control. Por ejemplo, la polimerasa mejorada puede transcribir 240 bases del molde de ARN de JP2-5 del VHC en ADNc de longitud completa en aproximadamente 15 segundos menos, 30 segundos menos, un minuto menos, dos minutos menos, 3 minutos menos, 4 minutos menos, 5 minutos menos o aproximadamente 10 minutos menos que una polimerasa de control en identicas condiciones de reaccion. En algunos modos de realizacion, la polimerasa mejorada puede transcribir 240 bases del molde de ARN de JP2-5 del VHC en ADNc de longitud completa mas rapido que una polimerasa de control, por ejemplo, aproximadamente

5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 45 segundos o 60 segundos o mas mas rapido que una polimerasa de control en identicas condiciones de reaccion. Las condiciones de reaccion pueden ser las descritas en los ejemplos. Se puede poner en contacto una polimerasa mejorada descrita en el presente documento con un molde de ARN a 65 grados C durante aproximadamente 2 minutos en la mezcla de reaccion descrita anteriormente. La etapa de extension se puede seguir de amplificacion por PCR del molde extendido, como se describe en los ejemplos.

La actividad de RT mas eficaz en ADN polimerasas termoestables se ha logrado usando Mn2+ como el activador de iones de metal divalentes. Sin embargo, se conoce bien que cuando esta presente Mn2+ en las reacciones la fidelidad de las ADN polimerasas es mas baja. A menos se este tratando de generar mutaciones, generalmente se favorece mantener una fidelidad mas alta. Afortunadamente, la mayoria de las aplicaciones convencionales de secuenciacion, PCR y RT-PCR, no requieren condiciones de alta fidelidad porque los sistemas de deteccion generalmente buscan una poblacion de productos.

Con la llegada de la siguiente generacion de secuenciacion, PCR digital, etc., la fidelidad del producto es mas importante y los procedimientos que permiten una sintesis de ADN de fidelidad mas alta son criticos. El logro de una actividad de RT eficaz usando Mg2+ como activador de iones de metal divalentes es una excelente manera de incrementar sustancialmente la fidelidad de la ADN polimerasa y permitir una copia mas fiable de la diana de acido nucleico. Por consiguiente, la polimerasa mejorada de la invencion puede permitir una extension y/o amplificacion eficaces de moldes de ARN usando Mg2+ como activador de iones de metal divalentes, como se describe en los ejemplos.

Debido a que las polimerasas descritas en el presente documento tambien pueden tener tolerancia al emparejamiento erroneo incrementada, las polimerasas encuentran uso en procedimientos en los que es probable la variacion del molde diana y, no obstante, se desea que el molde aun se amplifique independientemente de la variacion en el molde diana. Un ejemplo de dichos moldes puede incluir, por ejemplo, secuencias viricas, bacterianas o patogenas. Puede ser deseable determinar simplemente si un sujeto (humano o animal no humano) tiene una infeccion virica u otra infeccion, independientemente de la variante virica precisa que ha infectado al sujeto. Como ejemplo, se puede usar un par de cebadores para amplificar el VHC usando una polimerasa de la invencion y detectando la presencia del VHC incluso si el virus particular que infecta al sujeto tiene una mutacion que da como resultado un emparejamiento erroneo en el sitio de hibridacion del cebador.

Los acidos nucleicos diana pueden proceder de una fuente biologica o sintetica. La diana puede ser, por ejemplo, ADN o ARN. Generalmente, cuando se generan amplicones, los amplicones se componen de ADN, aunque tambien se pueden incorporar ribonucleotidos o nucleotidos sinteticos en el amplicon. Cuando se desea detectar un ARN, el procedimiento de amplificacion implica tipicamente el uso de transcripcion inversa, incluyendo, por ejemplo, PCR de transcripcion inversa (RT-PCR).

Las secuencias diana especificas pueden incluir, por ejemplo, acidos nucleicos viricos (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), (citomegalovirus (CMV), parvovirus B19, virus de

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Epstein-Barr, virus de la hepatitis C (VHC), virus del papiloma humano (VPH), virus de la encefalitis japonesa (VEJ), virus del Nilo Occidental (VNO), virus de la encefalitis de San Luis (VESL), virus de la encefalitis del valle de Murray y el virus Kunjin), acidos nucleicos bacterianos (por ejemplo, S. aureus, Neisseria meningitidis, Plasmodium falciparum, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachomatis), micobacterias, acidos nucleicos fungicos o acidos nucleicos de animales o plantas. Los acidos nucleicos diana pueden ser acidos nucleicos de animales (por ejemplo, humanos) o pueden derivar de una muestra animal (por ejemplo, humana) (es decir, pueden estar presentes acidos nucleicos de organismos viricos u otros patogenos una muestra de una biopsia animal, muestra de sangre, muestra de orina, muestra fecal, saliva, etc.). Los acidos nucleicos diana, por ejemplo, son regiones geneticas humanas que pueden incluir variantes asociadas con enfermedad (por ejemplo, cancer, diabetes, etc.). Debido a que las polimerasas de la invencion pueden tener tolerancia al emparejamiento erroneo, dichas enzimas pueden ser particularmente utiles, por ejemplo, donde una diversidad de secuencias relacionadas puede estar en una secuencia diana. Como ejemplo, se puede usar la invencion para detectar patogenos viricos, donde los patogenos viricos tienen suficiente variacion en sus genomas para hacer dificil o imposible disenar un conjunto unico o pequeno de cebadores que amplifiquen la mayoria o todos los genomas viricos posibles o en cancer u otros marcadores geneticos de enfermedades en los que se sabe o es probable que se produzca una variacion en la secuencia.

Otros procedimientos para detectar productos de extension o productos de amplificacion que usan las polimerasas mejoradas descritas en la presente invencion incluyen el uso de tintes de union a nucleotidos bicatenarios fluorescentes o tintes intercalantes de nucleotidos bicatenarios fluorescentes. Los ejemplos de tintes de union a ADN bicatenario fluorescentes incluyen SYBR-verde (Molecular Probes). Se pueden usar los tintes de union a ADN bicatenario junto con el analisis de curvas de fusion para medir productos de extension del cebador y/o productos de amplificacion. El analisis de curvas de fusion se puede realizar en un instrumento de PCR en tiempo real, tal como el instrumento ABI 5700/7000 (formato de 96 pocillos) o ABI 7900 (384 pocillos) con programa informatico integrado (SDS 2.1). De manera alternativa, el analisis de curvas de fusion se puede realizar como un analisis de criterio de valoracion. Los procedimientos ejemplares de analisis de puntos de fusion se describen en la publicacion de patente de EE. UU. n.2 2006/0172324.

En otro aspecto de la presente invencion, se proporcionan kits para su uso en procedimientos de extension del cebador descritos en el presente documento. En el presente documento, el kit puede compartimentarse para facilitar su uso y contiene al menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa mejorada de acuerdo con la presente invencion. Tambien se pueden incluir uno o mas recipientes adicionales que proporcionan un reactivo(s) adicional(es). El kit tambien puede incluir un tubo de extraccion sanguinea, recipiente o unidad que comprenda heparina o una sal de la misma, o libera heparina en solucion. La unidad de extraccion sanguinea puede ser un tubo heparinizado. Dichos recipientes adicionales pueden incluir cualquier reactivo u otros elementos reconocidos por el experto en la tecnica para su uso en procedimientos de extension del cebador de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente, incluyendo reactivos para su uso, por ejemplo, en procedimientos de amplificacion de acidos nucleicos (por ejemplo, PCR, RT-PCR), procedimientos de secuenciacion de ADN o procedimientos de marcaje de ADN. Por ejemplo, el kit puede incluir adicionalmente un recipiente que proporciona un cebador en sentido 5’ hibridable, en condiciones de extension del cebador, a un molde de polinucleotido predeterminado, o un par de cebadores que comprende el cebador en sentido 5' y un cebador antisentido en 3’ correspondiente. El kit puede incluir uno o mas recipientes que proporcionan nucleosidos trifosfato (convencionales y/o no convencionales). Mas especificamente, el kit puede incluir dNTP de alfa-fosforotioato, dUTP, dITP, y/o dNTP marcados, tales como, por ejemplo, dNTP de la familia de los tintes de fluoresceina y cianina. El kit tambien puede incluir uno o mas recipientes que proporcionan un tampon adecuado para una reaccion de extension del cebador.

En otro aspecto de la presente invencion, se proporcionan mezclas de reaccion que comprenden las polimerasas con eficacia de transcriptasa inversa incrementada, tolerancia al emparejamiento erroneo, velocidad de extension y/o tolerancia de los inhibidores de la polimerasa y RT como se describe en el presente documento. Las mezclas de reaccion pueden comprender adicionalmente reactivos para su uso, por ejemplo, en procedimientos de amplificacion de acidos nucleicos (por ejemplo, PCR, RT-PCR), procedimientos de secuenciacion de ADN o procedimientos de marcaje de ADN. Por ejemplo, las mezclas de reaccion pueden comprender un tampon adecuado para una reaccion de extension del cebador. Las mezclas de reaccion tambien pueden contener un acido nucleico molde (ADN y/o ARN), uno o mas polinucleotidos de sonda o cebadores, nucleosidos trifosfato (incluyendo, por ejemplo, desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos, nucleotidos marcados, nucleotidos no convencionales), sales (por ejemplo,), marcas (por ejemplo, fluoroforos). Las mezclas de reaccion pueden contener un cebador en sentido 5’ hibridable, en condiciones de extension del cebador, a un molde de polinucleotido predeterminado, o un par de cebadores que comprende el cebador en sentido 5' y un cebador antisentido en 3’ correspondiente. Las mezclas de reaccion pueden contener dNTP de alfa-fosforotioato, dUTP, dITP, y/o dNTP marcados, tales como, por ejemplo, dNTP de la familia de los tintes de fluoresceina y cianina Las mezclas de reaccion pueden comprender un quelante de hierro o un tinte purpura. Las mezclas de reaccion pueden comprender hemoglobina o un producto de degradacion de hemoglobina. Por ejemplo, los productos de degradacion de hemoglobina pueden incluir productos de descomposicion de hemo, tales como hemina, hematina, hematofisis y bilirrubina. Las mezclas de reaccion pueden comprender heparina o una sal de la misma. La mezcla de reaccion puede contener un acido nucleico molde que se aisla de la sangre. El acido nucleico molde puede ser ARN y la mezcla de reaccion puede comprender heparina o una sal de la misma.

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La mezcla de reaccion puede comprender dos o mas polimerasas. Por ejemplo, la mezcla de reaccion puede comprender una primera ADN polimerasa que tenga eficacia de transcriptasa inversa incrementada en comparacion con una polimerasa de control y una segunda ADN polimerasa que tenga actividad de polimerasa dependiente de ADN. La segunda ADN polimerasa puede ser una polimerasa natural o no modificada, o puede ser una polimerasa mejorada que tenga actividad de polimerasa dependiente de ADN incrementada. Dichas mezclas de reaccion son utiles para la amplificacion de moldes de ARN (por ejemplo, RT-PCR) proporcionando tanto una polimerasa que tiene actividad de transcriptasa inversa incrementada como un polimero que tiene actividad de polimerasa dependiente de ADN.

Ejemplos

Se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar, pero no para limitar la invencion reivindicada.

Ejemplo 1: generacion de genotecas

En resumen, las etapas en este procedimiento de cribado incluyen la generacion de genotecas, expresion y purificacion parcial de las enzimas mutantes, cribado de las enzimas frente a las propiedades deseadas, secuenciacion de ADN, purificacion de clones y caracterizacion adicional de mutantes candidates seleccionados. Cada una de estas etapas se describe mas adelante.

Generacion de genotecas de clones: Se sometio un acido nucleico que codificaba el dominio de polimerasa de la ADN polimerasa D580GI709K Z05 a PCR propensa a errores (mutagenica) entre los sitios de restriccion Blp I y Bgl II de un plasmido que incluia esta secuencia de acido nucleico. Los cebadores usados para esto se dan a continuacion:

Cebador directo: 5'- CTACCTCCTGGACCCCTCCAA-3' (SEQ ID NO:30); y cebador inverso: 5'- ATAACCAACTGGTAGTGGCGTGTAA-3' (SEQ ID NO:31)

Se realizo la PCR usando una concentracion de Mg2+ de 1,8 mM a fin de generar una genoteca con una velocidad de mutacion deseada. Las condiciones del tampon fueron bicina 50 mM pH 8,2, KOAc 115 mM, glicerol al 8 % p/v y 0,2 mM de cada dNTP. Se uso una enzima de PCR de inicio en caliente GeneAmp® AccuRT a 0,15 U/pl. Comenzando con 5x105copias de ADN plasmidico D580GI709K Z05 linealizado por volumen de reaccion de 50 pl, se desnaturalizaron las reacciones usando una temperatura de 94 0C durante 60 segundos, a continuacion, se realizaron 30 ciclos de amplificacion, usando una temperatura de desnaturalizacion de 94 0C durante 15 segundos, una temperatura de hibridacion de 60 0C durante 15 segundos, una temperatura de extension de 72 0C durante 120 segundos y seguido de una extension final a una temperatura de 72 0C durante 5 minutos.

El amplicon resultante se purifico con un kit de purificacion de PCR QIAquick (Qiagen, Inc., Valencia, CA, EE. UU.) y se corto con Blp I y Bgl II, y, a continuacion, se repurifico con un kit de purificacion de PCR QIAquick. Se preparo un plasmido de vector D580GI709K Z05 cortando con las mismas dos enzimas de restriccion y tratando con fosfatasa alcalina, recombinante (RAS, n.° cat 03359123001) y se purifico con un kit de purificacion de PCR QIAquick. El vector de corte y el inserto mutado se mezclaron en una proporcion de 1:3 y se trataron con ADN ligasa T4 durante 5 minutos a temperatura ambiente (NEB Quick Ligation™ Kit). Las ligaciones se purificaron con un kit de purificacion de PCR QIAquick y se transformaron en una cepa huesped de E. coli mediante electroporacion.

Se sembraron en placas alicuotas de los cultivos expresados en medio selectivo de ampicilina a fin de determinar el numero de transformantes unicos en cada transformacion. Las transformaciones se agruparon y almacenaron a - 70 0C hasta -80 0C en presencia de glicerol como crioprotector.

A continuacion, la genoteca se extendio en placas de agar selectivas a ampicilina de gran formato. Las colonias individuales se transfirieron a placas de 384 pocillos que contenian 2X de caldo Luria con ampicilina y glicerol al 10 % p/v usando un colector automatico de colonias (QPix2, Genetix Ltd). Estas placas se incubaron durante la noche a 30 °C para permitir que los cultivos crecieran y, a continuacion, se almacenaron a -70 °C a -80 °C. El glicerol anadido al 2X de caldo Luria era lo suficientemente bajo para permitir el crecimiento del cultivo y aun lo suficientemente alto para proporcionar crioproteccion. Se prepararon diversos miles de colonias de esta manera para su uso posterior.

Preparacion de la genoteca de extractos parte 1—fermentacion: A partir de las genotecas de clones descritas anteriormente, se preparo una genoteca correspondiente de extractos parcialmente purificados adecuados para propositos de cribado. La primera etapa de este procedimiento fue preparar cultivos de expresion a pequena escala de cada clon. Estos cultivos se cultivaron en un formato de 96 pocillos; por lo tanto, habia 4 placas de cultivo de expresion para cada placa de la genoteca de 384 pocillos. Se transfirieron 0,5 pl desde cada pocillo de la placa de la genoteca de clones a un pocillo de una placa de siembra de 96 pocillos, que contenia 1150 pl de medio A (vease la tabla 3 a continuacion). Esta placa de siembra se agito durante la noche a 1150 rpm a 30 °C, en un agitador/incubador de placas iEMS (ThermoElectron). A continuacion, estos cultivos de siembra se usaron para

inocular el mismo medio, esta vez inoculando 20pl en 250 pl de medio A en placas de 96 pocillos de formato grande (Nunc n.° 267334). Estas placas se incubaron durante la noche a 37 0C con agitacion. El plasmido de expresion contenia elementos de control transcripcionales, que permiten la expresion a 37 °C, pero no a 30 °C. Despues de la incubacion durante la noche, los cultivos expresaron la proteina del clon en tipicamente un 1-10 % de la proteina 5 celular total. Las celulas de estos cultivos se recogieron mediante centrifugacion. Estas celulas se congelaron (20 °C) o bien se procesaron inmediatamente, como se describe a continuacion.

Tabla 2: Medio A (esterilizado con filtro antes de su uso)

Componente

Concentration

MgS04.7H20

0,2 g/l

Acido cftrico.H2O

2 g/l

K2HP04

10 g/l

NaNH4P04.4H20

3,5 g/l

MgS04

2 mM

Acidos casamino

2,5 g/l

Glucosa

2 g/l

Tiamina.HCl

10 mg/l

Ampicilina

100 mg/l

10

Preparation de la genoteca de extractos parte 2—extraction: Los sedimentos celulares de la etapa de fermentacion se resuspendieron en 25 pl de tampon de lisis (tabla 3 a continuacion) y se transfirieron a placas de termociclador de 384 pocillos y se sellaron. Observese que el tampon contenia lisozima para ayudar en la lisis celular y DNasa para retirar el ADN del extracto. Para lisar las celulas, las placas se incubaron a 37 °C durante 15 15 minutos, se congelaron durante la noche a -20 °C y se incubaron de nuevo a 37 °C durante 15 minutos. Se

anadio sulfato de amonio (1,5 pL de una solucion 2 M) y las placas se incubaron a 75 0C durante 15 minutos a fin de precipitar e inactivar proteinas contaminantes, incluyendo las nucleasas anadidas de manera exogena. Las placas se centrifugaron a 3000 x g durante 15 minutos a 4 0C y los sobrenadantes se transfirieron a una placa de termociclador de 384 pocillos nueva. Estas placas de extracto se congelaron a -20 °C para su uso posterior en 20 cribados. Cada pocillo contenia aproximadamente 0,5-3 pM de la enzima polimerasa de la genoteca mutante.

Tabla 3. Tampon de lisis

Componente

Concentracion o porcentaje

Tris pH 7.5

50 mM

EDTA

1 mM

MgCl2

6 mM

Tween 20

0,5 % v/v

Lisozima (de polvo)

1 mg/ml

DNasa I

0,05 unidades/pl

25 Ejemplo 2: Identificacion de ADN polimerasas mutantes con eficacia de transcripcion inversa mejorada

Cribado de genotecas de extractos para una eficacia de transcripcion inversa mejorada: La genoteca de extractos se cribo comparando los valores de Pc (punto de corte) de las curvas de crecimiento generadas mediante la actividad de 5'-nucleasa fluorescente (TaqMan) de extractos enzimaticos en bruto en un sistema de RT-PCR a

partir de la amplificacion de un amplicon de 240 pares de bases del transcrito JP2-5 del virus de la hepatitis C (VHC), que contenfa las primeras 800 bases de la 5’NTR del genotipo Ib del VHC en pSP64 poli(A) (Promega).

Las reacciones se llevaron a cabo en el termociclador cinetico LC 480 de Roche en formato de 384 pocillos, 5 conteniendo cada pocillo 3 pl de un extracto enzimatico unico diluido 10 veces con tampon que contenfa Tris-HCl 20 mM, pH 8, KCl 100 mM, EDTA 0,1 mM y Tween-20 al 0,1 % anadido a 12 pl de mezcla madre de RT-PCR descrita en la tabla 4). Las condiciones de termociclado fueron: 2 minutos a 50 0C (etapa de "UNG"); 2 minutos a 65 0C (etapa de "RT"); 5 ciclos de 94 0C durante 15 segundos seguido de 62 0C durante 30 segundos; y 45 ciclos de 91 0C durante 15 segundos seguido de 62 0C durante 30 segundos.

10

Tabla 4

Componente

Concentracion

Tricina pH 8.3

50 mM

KOAc

60 mM

Glicerol

5 % (v/v)

DMSO

2 % (v/v)

Cebador1

200 nM

Cebador 2

200 nM

Sonda de TaqMan

100 nM

Aptamero

200 nM

dATP

200 pM

dCTP

200 pM

dGTP

200 pM

dUTP

400 pM

UNG

2 unidades/pl

ARN diana

6666 copias/pL

Mg(OAc)2

2 mM

Aproximadamente 5000 clones se cribaron usando el protocolo anterior. Se seleccionaron 40 clones del grupo 15 original para cribar de nuevo basandose en los valores de punto de corte (Pc) mas tempranos y valores de meseta fluorescente por encima de un corte arbitrario calculado mediante el procedimiento de cuantificacion absoluta/maximo de la segunda derivada. Los pocillos de cultivo correspondientes a los extractos superiores se muestrearon en medio de cultivo reciente y se cultivaron nuevamente para producir nuevas placas de cultivo que contenfan los mejores mutantes, asf como una serie de cultivos de D580G_I709K Z05 precursores que se usarfan 20 para controles comparativos. A continuacion, se usaron estas placas de cultivo para preparar nuevos extractos en bruto que se cribaron de nuevo con el mismo ARN diana y condiciones como se describe previamente para el cribado original. La tabla 5 muestra los valores de Pc promedio obtenidos a partir del incremento de senales fluorescentes debido a la hidrolisis en 5' de una sonda marcada con FAM. Los resultados muestran que el clon 0691- D20 amplifica la diana de ARN con una eficacia mas alta a la del precursor D580G_I709K Z05.

25

Tabla 5

Clon

Pc promedio

0691-D20

20,9

5

10

15

20

25

30

D580G I709K Z05

28,0

La secuencia de ADN de la region mutada del gen de polimerasa se secuencio para determinar la(s) mutacion/mutaciones de cambio de aminoacidos que estaba(n) presente(s) en cualquier clon unico. Los resultados de secuenciacion revelaron que la polimerasa expresada por el clon 0691-D20 llevaba la mutacion M763T, ademas de las mutaciones D580G e I709K precursoras. El clon 0691-D20 se eligio para pruebas adicionales, de modo que la proteina polimerasa mutante se expreso en cultivo en matraz, se purifico hasta la homogeneidad y se cuantifico.

Uso del mutante D580G_I709K Z05 en RT-PCR basada en Mg2+: El mutante purificado D580G_I709K_M763T Z05 se comparo con el D580G_I709K Z05 precursor en RT-PCR basada en Mg2+ TaqMan. La transcripcion inversa y las eficacias de PCR se midieron comparando los valores de Pc de las amplificaciones del transcrito de ARN JP2-5 y del plasmido lineal de ADN pJP2-5 digeridos con la endonucleasa de restriccion EcoRI. Los oligonucleotidos y las condiciones de mezcla madre (tabla 4) fueron los mismos que se usaron en el cribado original. Cada reaccion tenia 100.000 copias de ARN de transcrito JP2-5, 100.000 copias de ADN plasmidico lineal de pJP2-5 o bien 1000 copias de ADN plasmidico lineal de pJP2-5. Se amplificaron todas las dianas con el cebador 1 y cebador 2, como se describe anteriormente, en reacciones por duplicado para generar un amplicon de 240 pares de bases. Todas las reacciones se realizaron en el termociclador Light Cycler 480 de Roche con un volumen de reaccion de 15 pl. Se calcularon los puntos de corte (Pc) mediante el procedimiento de cuantificacion absoluta/maximo de la segunda derivada y se promediaron. Las amplificaciones se llevaron a cabo usando un intervalo de concentraciones de ADN polimerasa desde 5 nM-40 nM. Las condiciones de termociclado fueron: 2 minutos a 50 0C (etapa de "UNG"); 2 minutos a 65 0C (etapa de "RT"); 5 ciclos de 94 0C durante 15 segundos seguido de 62 0C durante 30 segundos; y 45 ciclos de 91 0C durante 15 segundos seguido de 62 0C durante 30 segundos. La tabla 6 muestra los valores de Pc obtenidos a partir del incremento de senales fluorescentes debido a la escision de la sonda TaqMan en una condicion enzimatica a 20 nM.

Tabla 6

Enzima

Pc de 10° Pc de 105 Pc de 103

copias de ARN copias de ADN copias de ADN

D580G_I709K Z05

28,7 18,8 25,7

D580G_I709K_M763T Z05

20,6 18,9 25,8

Los resultados indican que D580G_I709K_M763T Z05 mutante permite una amplificacion mas eficaz de la diana de ARN sin comprometer la eficacia de la PCR en una diana de ADN, en comparacion con la enzima precursora D580G_I709K.

Se entiende que los ejemplos y modos de realizacion descritos en el presente documento son unicamente para propositos ilustrativos y que se sugeriran diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos a expertos en la tecnica.

10

15

20

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> F. Hoffmann-La Roche AG Roche Diagnostics GmbH

<120> ADN polimerasas con actividad mejorada

< 130> 31275 WO-HS

<150> US 61/736.737 <151>

<160> 39

<170> FastSEQ para Windows version 4.0

<210> 1

<211> 834

<212> PRT

<213> Thermus sp.

<220>

<223> ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (Z05)

<400> 1

Met 1

Lys Ala Met Leu 5 Pro Leu Phe

Val

Asp Gly His 20 His Leu Ala Tyr

Leu

Thr Thr 35 Ser Arg Gly Glu Pro 40

Lys

Ser 50 Leu Leu Lys Ala Leu 55

Lys

Val 65

Val Phe Asp Ala Lys 70 Ala Pro

Ala

Tyr Lys Ala Gly 85 Arg Ala Pro

Leu

Ala Leu lie 100 Lys Glu Leu Val

Glu

Val Pro 115 Gly Phe Glu Ala Asp 120

Lys

Ala 130 Glu Arg Glu Gly Tyr 135 Glu

Asp 145

Leu Tyr Gin Leu Val 150 Ser Asp

Gly

His Leu He Thr 165 Pro Glu Trp

Pro

Glu Gin Trp 180 Val Asp Phe Arg

Asn

Leu Pro 195 Gly Val Lys Gly lie 200

Leu

Lys 210 Glu Trp Gly Ser Leu 215 Glu

Val 225

Lys Pro Glu Ser Val 230 Arg Glu

Leu

Lys Leu Ser Leu 245 Glu Leu Ser

Glu

Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg

Glu

Pro 10 Lys Gly Arg Val Leu 15 Leu

Arg 25

Thr Phe Phe Ala Leu 30 Lys Gly

Val

Gin Ala Val Tyr 45 Gly Phe Ala

Glu

Asp Gly Tyr 60 Lys Ala Val Phe

Ser

Phe Arg 75 His Glu Ala Tyr Glu 80

Thr

Pro 90 Glu Asp Phe Pro Arg 95 Gin

Asp 105

Leu Leu Gly Phe Thr 110 Arg Leu

Asp

Val Leu Ala Thr 125 Leu Ala Lys

Val

Arg lie Leu 140 Thr Ala Asp Arg

Arg

Val Ala 155 Val Leu His Pro Glu 160

Leu

Trp 170 Glu Lys Tyr Gly Leu 175 Lys

Ala 185

Leu Val Gly Asp Pro 190 Ser Asp

Gly

Glu Lys Thr Ala 205 Leu Lys Leu

Asn

lie Leu Lys 220 Asn Leu Asp Arg

Arg

lie Lys 235 Ala His Leu Glu Asp 240

Arg

Val 250 Arg Ser Asp Leu Pro 255 Leu

Glu

Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Una ADN polimerasa que tiene eficacia de transcriptasa inversa incrementada en comparacion con una ADN polimerasa de control, en la que la ADN polimerasa comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 % identica a la SEQ ID NO: 1 y en la que el aminoacido de la ADN polimerasa correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 es T, el aminoacido correspondiente a la posicion 709 de la SEQ ID NO: 1 es K y el aminoacido correspondiente a la posicion 580 de la SEQ ID NO: 1 es G, y en la que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoacidos que la ADN polimerasa excepto en que el aminoacido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posicion 763 de la SEQ ID NO: 1 es M.
2. 2. La ADN polimerasa de la reivindicacion 1, en la que la ADN polimerasa tiene la misma actividad de polimerasa dependiente de ADN o sustancialmente similar en comparacion con la ADN polimerasa de control.
3. 3. Un acido nucleico recombinante que codifica la ADN polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.
4. 4. Un vector de expresion que comprende el acido nucleico recombinante de la reivindicacion 3.
5. 5. Una celula huesped que comprende el vector de expresion de la reivindicacion 4.
6. 6. Un procedimiento de produccion de una ADN polimerasa, comprendiendo dicho procedimiento:

   cultivar la celula huesped de la reivindicacion 5 en condiciones adecuadas para la expresion del acido nucleico que codifica la ADN polimerasa.
7. 7. Un procedimiento para llevar a cabo la extension del cebador, que comprende:

   poner en contacto una ADN polimerasa como en una de las reivindicaciones 1 o 2 con un cebador, un molde de polinucleotido y nucleosidos trifosfato en condiciones adecuadas para la extension del cebador, produciendo de este modo un cebador extendido.
8. 8. Un kit para producir un cebador extendido, que comprende:

   al menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa como en una de las reivindicaciones 1 o 2.
9. 9. El kit de acuerdo con la reivindicacion 8, que comprende adicionalmente uno o mas recipientes adicionales seleccionados del grupo que consiste en:

   (a) un recipiente que proporciona un cebador hibridable, en condiciones de extension del cebador, a un molde de polinucleotido predeterminado;

   (b) un recipiente que proporciona nucleosidos trifosfato; y

   (c) un recipiente que proporciona un tampon adecuado para la extension del cebador.
10. 10. Una mezcla de reaccion que comprende una ADN polimerasa como en una de las reivindicaciones 1 o 2, al menos un cebador, un molde de polinucleotido y nucleosidos trifosfato.
11. 11. La mezcla de reaccion de la reivindicacion 10, que comprende adicionalmente una segunda ADN polimerasa termoestable.

    Z05

    RMAFNMPVQGTAA D L M

    Taq

    RMAFNMPVQGTAA D L M

    Tfi

    RMAFNMPVQGTAA D L M

    Tfl

    RMAFNMPVQGTAA D L M

    Spsl7

    RMAFNMPVQGTAA D L M

    Tth

    RMAFNMPVQGTAA D L M

    Tea

    RMAFNMPVQGTAA D L M

    Tma

    RIAINTPIQGTAA D I I

    Tne

    RIAINTPIQGTAA D I I

    Taf

    RIAVNTPIQGTAA D I I

    Dra

    RLAYNMPIQGTAA D I M

    Bst

    RTAMNT PIQGSAA D I I

    Bca

    RMAMNT PIQGSAA D D I X! I X

    Figura 1

    KL

    AM V K L FP H L REM..GARML (SEQ ID NO:12)

    KL

    AM V K L FP R L EEM..GARML (SEQ ID NO:13)

    KL

    AM V K L FP R L RPL..GVRIL (SEQ ID NO:14)

    KL

    AM V R L FP R L QELGAR..ML (SEQ ID NO:15)

    KL

    AM V K L FP R L RPL..GVRIL (SEQ ID NO:16)

    KL

    AM V K L FP R L REM..GARML (SEQ ID NO:17)

    KL

    AM V K L FP R L REMGAR..ML (SEQ ID NO:18)

    KL

    AM I E I DR E L KERKMRSKMI (SEQ ID NO:19)

    KL

    AM I D I DE E L RKRNMKSRMI (SEQ ID NO:2 0)

    KI

    AM I N I HN R L KKENLRSKMI (SEQ ID NO:21)

    KL

    AM V Q L DP Q L DAIGAR..ML (SEQ ID NO:2 3)

    KK

    AM I D L SV R L REERLQARLL (SEQ ID NO:2 4)

    KK

    AM I D L NA R L KEERLQARLL (SEQ ID NO:2 5)

    KX3

    AM X4X5 x6 X7XSX g Xj (SEQ ID NO:2 6)

    FIGURA 2

    A.

    Identidades tie secuencia sobre toda la enzima polimerasa I (correspondiente a los amlnoacidos 1-834 de Z05)

    Nombre

    ZOS Taq Tfi Tfl Spsl7 Tth Tea Dra Tma Tne Taf Bst Bca

    Z05

    0,864 0,833 0,859 0,839 0,962 0,958 0,459 0,374 0,368 0,359 0,407 0,408

    Taq

    0,864 0,831 0,854 0,836 0,872 0,864 0,468 0,382 0,368 0,351 0,397 0,397

    Tfi

    0,833 0,831 0,82 0,991 0,829 0,824 0,45 0,371 0,375 0,353 0,405 0,397

    Tfl

    0,859 0,854 0,82 0,824 0,853 0,848 0,462 0,381 0,374 0,356 0,397 0,398

    Spsl7

    0,839 0,836 0,991 0,824 0,835 0,83 0,452 0,375 0,377 0,355 0,407 0,399

    Tth

    0,962 0,872 0,829 0,853 0,835 0,989 0,463 0,373 0,367 0,358 0,406 0,406

    Tea

    0,958 0,864 0,824 0,848 0,83 0,989 0,46 0,371 0,365 0,356 0,404 0,404

    Dra

    0,459 0,468 0,45 0,462 0,452 0,463 0,46 0,334 0,325 0,314 0,338 0,339

    Tina

    0,374 0,382 0,371 0,381 0,375 0,373 0,371 0,334 0,854 0,567 0,37 0,377

    Tiie

    0,368 0,368 0,375 0,374 0,377 0,367 0,365 0,325 0,854 0,558 0,377 0,376

    Taf

    0,359 0,351 0,353 0,356 0,355 0,358 0,356 0,314 0,567 0,558 0,356 0,364

    Bst

    0,407 0,397 0,405 0,397 0,407 0,406 0,404 0,338 0,37 0,377 0,356 0,881

    Bca

    0,408 0,397 0,397 0,398 0,399 0,406 0,404 0,339 0,377 0,376 0,364 0,881

    B.

    Identidades de secuencia sobre el subdominio de polimerasa unicamente (correspondiente a los aminoacidos 420-834 de Z05)

    Nombre

    ZOS Taq Tfi Til Spsl7 Tth Tea Dra Tma Tne Taf Bst Bca

    Z05

    0,901 0,845 0,891 0,845 0,975 0,973 0,563 0,483 0,478 0,44 0,498 0,49

    Taq

    0,901 0,879 0,901 0,877 0,906 0,901 0,561 0,488 0,473 0,44 0,503 0,495

    Tfi

    0,845 0,879 0,857 0,997 0,853 0,853 0,566 0,495 0,49 0,449 0,512 0,49

    Til

    0,891 0,901 0,857 0,855 0,889 0,889 0,571 0,492 0,48 0,444 0,494 0,485

    Spsl7

    0,845 0,877 0,997 0,855 0,853 0,853 0,566 0,495 0,49 0,449 0,512 0,49

    Tth

    0,975 0,906 0,853 0,889 0,853 0,99 0,563 0,478 0,473 0,437 0,496 0,488

    Tea

    0,973 0,901 0,853 0,889 0,853 0,99 0,563 0,478 0,473 0,437 0,496 0,488

    Dra

    0,563 0,561 0,566 0,571 0,566 0,563 0,563 0,45 0,448 0,426 0,474 0,454

    Tma

    0,483 0,488 0,495 0,492 0,495 0,478 0,478 0,45 0,883 0,622 0,474 0,475

    Tne

    0,478 0,473 0,49 0,48 0,49 0,473 0,473 0,448 0,883 0,615 0,476 0,473

    Taf

    0,44 0,44 0,449 0,444 0,449 0,437 0,437 0,426 0,622 0,615 0,46 0,473

    Bst

    0,498 0,503 0,512 0,494 0,512 0,496 0,496 0,474 0,474 0,476 0,46 0,898

    Bca

    0,49 0,495 0,49 0,485 0,49 0,488 0,488 0,454 0,475 0,473 0,473 0,898

    FIGURA 3

    A. Identidades de secuencia sobre toda la enzima polimerasa I (correspondiente a los aminoacidos 1-834 de Z05)

    Nombre

    Z05 Tth Tfi Tfl Tea Taq Spsl7

    Z05

    0,962 0,833 0,859 0,958 0,864 0,839

    Tth

    0,962 0,829 0,853 0,989 0,872 0,835

    Tfi

    0,833 0,829 0,82 0,824 0,831 0,991

    Tfl

    0,859 0,853 0,82 0,848 0,854 0,824

    Tea

    0,958 0,989 0,824 0,848 0,864 0,83

    Taq

    0,864 0,872 0,831 0,854 0,864 0,836

    Spsl7

    0,839 0,835 0,991 0,824 0,83 0,836

    B. Identidades de secuencia sobre el subdominio de polimerasa unicamente (correspondiente a los aminoacidos 420-834 de Z05)

    Nombre

    Z05 Tth Tfi Tfl Tea Taq Spsl7

    Z05

    0,975 0,845 0,891 0,973 0,901 0,845

    Tth

    0,975 0,853 0,889 0,99 0,906 0,853

    Tfi

    0,845 0,853 0,857 0,853 0,879 0,997

    Tfl

    0,891 0,889 0,857 0,889 0,901 0,855

    Tea

    0,973 0,99 0,853 0,889 0,901 0,853

    Taq

    0,901 0,906 0,879 0,901 0,901 0,877

    Spsl7

    0,845 0,853 0,997 0,855 0,853 0,877