CN109652500A - 快速检测和筛选能聚合特殊构造dNTP的DNA聚合酶的方法 - Google Patents

快速检测和筛选能聚合特殊构造dNTP的DNA聚合酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了快速检测和筛选能聚合特殊构造dNTP的DNA聚合酶的方法。本发明提供了种检测待测DNA聚合酶能否聚合特定结构dNTP的方法，包括如下步骤：1)制备一段单链DNA分子和与其互补的杂交单链；所述单链DNA分子中从5‘至3’方向上包括依次排列的相邻的碱基乙和碱基甲；2)将所述单链DNA分子、所述杂交单链、所述特定结构dNTP和待测DNA聚合酶放在体系里进行DNA聚合反应，检测是否能成功聚合。本发明的检测方法具有如下优点：适用范围广、无污染、可行性、通量灵活，高通量。

Description

快速检测和筛选能聚合特殊构造dNTP的DNA聚合酶的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种快速检测和筛选能聚合特殊构造dNTP的DNA聚合酶的方法。
背景技术
随着测序技术的不断发展，所使用的dNTP结构被不断的改造：边合成边测序技术使用的dNTP的3'-OH被可切除的阻断基团封闭，且碱基上还加入了一个可切除的荧光基团；PacBio的单分子测序使用的dNTP是3'-OH自由但5'-磷酸基团修饰有荧光基团；还有些新型的dNTP分子在继续被开发和应用于测序技术中。这些都要求DNA聚合酶也需进行相应的改变才能继续行使聚合功能。实际上，DNA聚合酶已经是测序技术中的一个决定性的因素。因此针对不同种类的特殊构造dNTP,需要开发出一种快速简单的从大量的突变体中筛选出合适的DNA聚合酶的方法。
现有技术主要用于检测或筛选对自然dNTP进行聚合的DNA聚合酶，而对应用于测序技术中的结构特殊的dNTP的应用非常有限，只能用于能聚合3'-羟基自由且没有荧光标记的dNTP的DNA聚合酶的筛选，不能用于聚合3'-羟基连接有修饰基团或有荧光标记dNTP的DNA聚合酶的筛选，因为3'-羟基不自由的dNTP不能被连续的聚合产生可被检测的双链DNA，而有荧光标记的dNTP会影响picogreen染料与底物结合产生的荧光，导致检测结果不准确。
由于特殊构造的dNTP是随着测序技术的发展而快速发展和应用的,目前对可用于聚合特殊构造的dNTP的DNA聚合酶的筛选方法并不完善。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测待测DNA聚合酶能否聚合特定结构dNTP的方法，包括如下步骤：
1)制备一段单链DNA分子和与其互补的杂交单链；
所述单链DNA分子中从5‘至3’方向上包括依次排列的相邻的碱基乙和碱基甲，所述杂交单链与所述单链DNA分子互补时还需满足如下条件：所述杂交单链3'末端的核苷酸与所述单链DNA分子上的碱基甲互补，所述碱基乙与待聚合特定结构dNTP互补；
2)将所述单链DNA分子、所述杂交单链、所述特定结构dNTP和待测DNA聚合酶放在体系里进行DNA聚合反应，并且以所述单链DNA分子作为延伸模板，检测是否能成功聚合，若能成功聚合，则待测DNA聚合酶能聚合特定结构dNTP，若不能成功聚合，则待测DNA聚合酶不能聚合特定结构dNTP。
上述特定结构dNTP为荧光修饰dNTP、无荧光修饰且3’端阻断dNTP或无荧光修饰且3’端自由dNTP；
上述方法中，所述检测是否能成功聚合的方法如下：
(1)当所述特定结构dNTP为荧光修饰dNTP，若聚合反应有荧光信号，则所述待测DNA聚合酶能聚合所述荧光修饰dNTP；
若聚合反应无荧光信号，则所述待测DNA聚合酶不能聚合所述荧光修饰dNTP；
所述聚合反应的信号越强，说明待测DNA聚合酶对荧光修饰dNTP的聚合能力越强。
(2)当所述特定结构dNTP为无荧光修饰且3’端自由dNTP，向聚合反应后的体系中加入带有荧光的另一dNTP和已知能聚合所述另一dNTP且无外切活性的聚合酶，进行二次聚合反应，检测二次聚合反应的荧光信号，若二次聚合反应有荧光信号，则所述待测DNA聚合酶能聚合该所述无荧光修饰且3’端自由dNTP；
若二次聚合反应无荧光信号，则所述待测DNA聚合酶不能聚合该所述无荧光修饰且3’端自由dNTP；
所述聚合反应的信号越强，说明待测DNA聚合酶对无荧光修饰且3’羟基自由dNTP的聚合能力越强。
所述带有荧光的另一dNTP与所述单链DNA分子中的碱基丙互补配对，所述碱基丙位于所述碱基乙的上游且与所述碱基乙相邻；碱基丙和碱基乙不同；
(3)当所述特定结构dNTP为无荧光修饰且3’端阻断dNTP，向聚合反应后的体系中加入带有荧光的另一dNTP和已知能聚合该另一dNTP且无外切活性的聚合酶，进行二次聚合反应，检测二次聚合反应的荧光信号，若二次聚合反应无荧光信号，则所述待测DNA聚合酶能聚合该所述无荧光修饰且3’端阻断dNTP；
若二次聚合反应有荧光信号，则所述待测DNA聚合酶不能聚合该所述无荧光修饰且3’端阻断dNTP；
所述聚合反应的荧光信号越弱，说明待测DNA聚合酶对无荧光修饰且3’端阻断dNTP的dNTP的聚合能力越强。
所述带有荧光的另一dNTP与所述单链DNA分子中的所述碱基乙互补配对。
用于检测核酸聚合的化学反应中，按上述方法选用聚合特定结构dNTP的待测DNA聚合酶若为多个，则选取聚合能力最强的待测DNA聚合酶；
或用于核酸聚合的化学反应(如测序或者文库构建)中，按上述方法选用聚合特定结构dNTP的待测DNA聚合酶，其中，有荧光信号的判断标准优选为大于阴性对照信号值的10倍或者大于阳性对照信号值的70％。
阴性对照为无DNA聚合酶的体系；
阳性对照为已知可以聚合特定dNTP的DNA聚合酶的体系。
上述方法中，所述聚合反应均在固定相上完成；
或，所述固定相具体为芯片。
上述方法中，所述无外切活性的聚合酶为无3'-5’外切活性且高度保守的DNA聚合酶。
上述方法中，所述单链DNA分子大小为10-200nt，优选为15-150nt，更优选为20-100nt。
上述方法中，所述特定结构dNTP中的dNTP为如下中至少一种：dATP、dTTP或dUTP、dCTP和dGTP；
若特定结构dNTP为多种dNTP，则制备多条杂交单链，且一种特定结构dNTP对应一条杂交单链。
上述的方法中的所述单链DNA分子和所述杂交单链在检测待测DNA聚合酶能否聚合特定结构dNTP中的应用也是本发明保护的范围。
上述的方法中的所述单链DNA分子、所述杂交单链、所述已知能聚合另一dNTP且无外切活性的聚合酶和所述带有荧光的另一dNTP在检测待测DNA聚合酶能否聚合特定结构dNTP中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述特定结构dNTP为荧光修饰dNTP、无荧光修饰且3’端阻断dNTP或无荧光修饰且3’端自由dNTP；
或所述dNTP为如下中至少一种：dATP、dTTP或dUTP、dCTP和dGTP。
本发明另一个目的是提供一种检测待测DNA聚合酶能否聚合特定结构dNTP的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述方法中的单链DNA分子和杂交单链。
上述荧光修饰dNTP为是指荧光基团连接在dNTP的碱基上,或3’-羟基上，即经过DNA聚合酶的聚合之后，荧光基团不会脱落。
上述无荧光修饰且3’羟基自由dNTP，是指dNTP的3’羟基没有被修饰，也没被阻断，且经过DNA聚合酶的聚合之后，此dNTP连接到DNA链的3’端并且没有荧光基团连接在此dNTP的任何位置上，且经过DNA聚合酶的聚合后，3’羟基端仍可继续聚合下一个脱氧核苷酸，此类dNTP的碱基上可以有非荧光的修饰，磷酸基团上也可以有荧光或非荧光的修饰，经过DNA聚合酶的聚合后磷酸基团上带的荧光或非荧光修饰会被去掉，不会出现在聚合形成的DNA双链上。
上述对于无荧光修饰的且3'端被阻断的dNTP,指dNTP的3’羟基被阻断，被DNA聚合酶聚合到DNA双链中后，其3’羟基端不能继续聚合下一个碱基；且此类dNTP的碱基上可以有非荧光的修饰，此类dNTP的磷酸基团上可以有荧光或非荧光的修饰，经过DNA聚合酶的聚合后磷酸基团上带的荧光或非荧光修饰会被去掉，不会出现在聚合形成的DNA双链上。
本发明设计了一种用于快速筛选能聚合特殊构造的DNA聚合酶方法，也可用于检测DNA聚合酶对特殊构造dNTP的聚合能力。对于荧光修饰dNTP，采用一步法进行筛选：即设计一段已知序列的核酸,和与之互补配对且下一位碱基分别是A、C、G、T的四组引物杂交,用待筛选的DNA聚合酶聚合一个碱基，通过检测四种碱基的荧光强度快速筛选能聚合这种dNTP的DNA聚合酶；对于无荧光修饰的dNTP,采用两步法进行筛选,即设计一段已知序列的核酸,和与之互补配对且下一位碱基分别是A、C、G、T的四组引物杂交,用待筛选的DNA聚合酶聚合一个碱基，然后用另一个无外切活性且高度保守的DNA聚合酶聚合一个带荧光的dNTP,通过检测第二个碱基的荧光强度判断待筛选的DNA聚合酶对特殊构造的dNTP的聚合能力。对于无荧光修饰且3’羟基自由dNTP(两步法1),第二步加入的带荧光的dNTP应与引物后的第二位碱基匹配,信号越强说明待测的DNA聚合酶的聚合效果越好；对于无荧光修饰的且3'端被阻断的dNTP(两步法2)，第二步加入的带荧光的dNTP应与引物后的第一位碱基匹配，信号越弱说明待测的DNA聚合酶的聚合效果越好。
本发明的实验证明，本发明的检测方法具有如下优点：
1)适用范围广：可用于3'阻断和不阻断，有荧光标记和无荧光标记等特殊构造dNTP的筛选；
2)无污染：使用荧光作为检测信号，避免了放射性污染；
3)可行性：对模板底物结构或序列没有特殊要求，可直接用于筛选，易于实现；
4)通量灵活，高通量：本技术可以直接利用微量96孔或384孔板直接进行筛选测试实验，并可根据筛选量同时进行多块板实验，且实验结果可直接使用，无需对数据进行额外的处理。
附图说明
图1为聚合有荧光修饰的dNTP的DNA聚合酶的筛选(一步法)。
图2为聚合无荧光修饰且3'羟基自由的dNTP(两步法1)的DNA聚合酶的筛选。
图3为聚合无荧光修饰且3'羟基阻断的dNTP(两步法2)的DNA聚合酶的筛选。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、检测聚合特殊构造dNTP的DNA聚合酶的方法的建立
本发明使用固定在固相上的核酸序列，如装载在芯片上的DNB或使用链霉亲和素和生物素固定的核酸序列或使用其他方法固定在芯片上的核酸序列。
一、检测用于聚合荧光修饰dNTP的DNA聚合酶的方法
荧光修饰dNTP是指荧光基团连接在dNTP的碱基上或3’-羟基上，即经过DNA聚合酶的聚合之后，荧光基团不会脱落，采用如下一步法检测能与该荧光修饰dNTP发生聚合的DNA聚合酶(图1所示)，具体如下：
一步法，具体如下：
1、制备10-200nt的单链DNA分子和与其互补杂交单链；
10-200nt的单链DNA分子优选为15-150nt的单链DNA分子，更优选的，20-100nt的单链DNA分子；
所述单链DNA分子中从5‘至3’方向上包括依次排列的相邻的碱基乙和碱基甲，所述杂交单链与所述单链DNA分子互补时还需满足如下条件：所述杂交单链3'末端的核苷酸与所述单链DNA分子上的碱基甲互补，所述碱基乙与所述特定结构dNTP互补；
特定结构dNTP特定结构dNTP为特定结构dATP、特定结构dTTP或特定结构dUTP、特定结构dCTP和特定结构dGTP中至少一种，
所述杂交单链为1条或2条或3条或4条，每一条所述杂交单链对应一种所述特定结构dNTP。
2、聚合反应
将上述单链DNA分子、上述杂交单链、荧光修饰的dNTP和待测DNA聚合酶，在反应体系中进行DNA聚合反应，洗掉未聚合的dNTP,用BGIseq1000(芯片上固定时)或酶标仪(磁珠上固定时)检测聚合反应荧光信号，
若聚合反应有荧光信号，则所述待测DNA聚合酶能聚合所述荧光修饰dNTP；
若聚合反应无荧光信号，则所述待测DNA聚合酶不能聚合所述荧光修饰dNTP；
所述聚合反应的信号越强，说明待测DNA聚合酶对荧光修饰dNTP的聚合能力越强。
二、检测用于聚合无荧光修饰且3’羟基自由dNTP的DNA聚合酶的方法
无荧光修饰且3’羟基自由dNTP，是指dNTP的3’羟基没有被修饰，也没被阻断，且经过DNA聚合酶的聚合之后，此dNTP连接到DNA链的3’端并且没有荧光基团连接在此dNTP的任何位置上，且经过DNA聚合酶的聚合后，3’羟基端仍可继续聚合下一个脱氧核苷酸，此类dNTP的碱基上可以有非荧光的修饰，磷酸基团上也可以有荧光或非荧光的修饰，经过DNA聚合酶的聚合后磷酸基团上带的非荧光修饰会被去掉，不会出现在聚合形成的DNA双链上。
采用如下两步法检测能聚合该无荧光修饰且3’羟基自由dNTP的DNA聚合酶(图2所示)，具体如下：
1、制备10-200nt的单链DNA分子和与其互补杂交单链；
10-200nt的单链DNA分子优选为15-150nt的单链DNA分子，更优选的，20-100nt的单链DNA分子；
所述单链DNA分子中从5‘至3’方向上包括依次排列的相邻的碱基乙和碱基甲，所述杂交单链与所述单链DNA分子互补时还需满足如下条件：所述杂交单链3'末端的核苷酸与所述单链DNA分子上的碱基甲互补，所述碱基乙与所述特定结构dNTP互补；
所述特定结构dNTP为特定结构dATP、特定结构dTTP或特定结构dUTP、特定结构dCTP和特定结构dGTP中至少一种，
所述杂交单链为1条或2条或3条或4条，每一条所述杂交单链对应一种所述特定结构dNTP；
带有荧光的另一dNTP为商品化的、碱基上有荧光修饰的、3’羟基自由的dNTP,这类dNTP可被Taq DNA聚合酶聚合。
带有荧光的另一dNTP与所述单链DNA分子中的碱基丙互补配对，所述碱基丙位于所述碱基乙的上游且与所述碱基乙相邻；碱基丙和碱基乙不同。
2、聚合反应
1)将上述单链DNA分子、杂交单链、无荧光修饰且3’羟基自由dNTP和待测DNA聚合酶，进聚合反应，得到第一次聚合反应产物；
2)向第一次聚合反应产物中加入带有荧光的另一dNTP和已知能聚合该另一dNTP无3’-5’外切活性且高度保守的DNA聚合酶进行第二次聚合反应，检测第二次聚合反应荧光信号，
若二次聚合反应有荧光信号，则所述待测DNA聚合酶能聚合该所述无荧光修饰且3’端自由dNTP；
若二次聚合反应无荧光信号，则所述待测DNA聚合酶不能聚合该所述无荧光修饰且3’端自由dNTP；
所述聚合反应的信号越强，说明待测DNA聚合酶对无荧光修饰且3’羟基自由dNTP的聚合能力越强。
三、对于无荧光修饰的且3'端被阻断的dNTP
对于无荧光修饰的且3'端被阻断的dNTP,指dNTP的3’羟基被阻断，被DNA聚合酶聚合到DNA双链中后，其3’羟基端不能继续聚合下一个碱基；且此类dNTP的碱基上可以有非荧光的修饰，此类dNTP的磷酸基团上可以有荧光或非荧光的修饰，经过DNA聚合酶的聚合后磷酸基团上带的荧光或非荧光修饰会被去掉，不会出现在聚合形成的DNA双链上。
采用如下两步法检测能与该对于无荧光修饰的且3'端被阻断的dNTP发生聚合的DNA聚合酶(图3所示)，具体如下：
1、制备10-200nt的单链DNA分子和与其互补4条杂交单链；
10-200nt的单链DNA分子优选为15-150nt的单链DNA分子，更优选的，20-100nt的单链DNA分子；
所述单链DNA分子中从5‘至3’方向上包括依次排列的相邻的碱基乙和碱基甲，所述杂交单链与所述单链DNA分子互补时还需满足如下条件：所述杂交单链3'末端的核苷酸与所述单链DNA分子上的碱基甲互补，所述碱基乙与所述特定结构dNTP互补；
所述特定结构dNTP为特定结构dATP、特定结构dTTP或特定结构dUTP、特定结构dCTP和特定结构dGTP中至少一种，
所述杂交单链为1条或2条或3条或4条，每一条所述杂交单链对应一种所述特定结构dNTP；
带有荧光的另一dNTP为商品化的碱基上有荧光修饰、且可被Taq DNA聚合酶聚合的dNTP,如PerkinElmer公司的产品dATP-Cy3等。
所述带有荧光的另一dNTP与所述单链DNA分子中的所述碱基乙互补配对。
2、聚合反应
1)将上述单链DNA分子、杂交单链、无荧光修饰且3'端被阻断的dNTP和待测DNA聚合酶，进行聚合反应，得到第一次聚合反应产物；
2)向第一次聚合反应产物中加入带有荧光的另一dNTP和已知能聚合该另一dNTP且无3’-5’外切活性且高度保守的DNA聚合酶进行第二次聚合反应，检测第二次聚合反应荧光信号，
若二次聚合反应无荧光信号，则所述待测DNA聚合酶能聚合该所述无荧光修饰且3’端阻断dNTP；
若二次聚合反应有荧光信号，则所述待测DNA聚合酶不能聚合该所述无荧光修饰且3’端阻断dNTP；
所述聚合反应的信号越弱，说明待测DNA聚合酶对无荧光修饰且3’端阻断dNTP的dNTP的聚合能力越强。
实施例2、检测用于聚合荧光修饰dNTP的DNA聚合酶的方法
本实施例是在固定在芯片上的核酸序列上进行。
本实施例采用的器材：Bgiseq1000测序仪(BGI)，测序芯片(BGI)，VWR加热板，PCR仪，PCR八连管。
本实施例使用的试剂如下表1所示。
表1 试剂和芯片
1、单链DNA分子和与其互补杂交单链
按照实施例1一中的方法设计合成45nt的单链DNA分子。
45nt的单链DNA分子如下：
5Biotin-AAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGGAGTTGCAT(序列1)。特定结构dNTP为如下四种：
荧光修饰dNTP为dATP-Cy3，碱基甲和碱基乙分别为序列1第13位和第12位，对应的杂交单链名称为153_CTaC；
荧光修饰dNTP为dUTP-TexRd，碱基甲和碱基乙分别为序列1第18位和第17位，对应的杂交单链名称为153_CAtG；
荧光修饰dNTP为dCTP-FITC，碱基甲和碱基乙分别为序列1第12位和第11位，对应的杂交单链名称为153_TAcG；
荧光修饰dNTP为dGTP-Cy5，碱基甲和碱基乙分别为序列1第22位和第21位，对应的杂交单链名称为153_ACgA。
杂交单链序列如下表2所示：
表2 杂交单链
杂交单链名称 杂交单链序列
153_ACgA ATGCAACTCCTTGGCTCACAGAAC(序列2)
153_CAtG CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACA(序列3)
153_TAcG CTTGGCTCACAGAACGACATGGCTA(序列4)
153_CTaC CTTGGCTCACAGAACGACATGGCT(序列5)
2、聚合反应
1)单链DNA固定在芯片表面：
(1)订购如下5’端修饰了Biotin的单链DNA分子，其核酸序列为序列6：
5Biotin-AAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGGAGTTGCAT
将上述的5’端修饰了Biotin的DNA与链霉亲和素的磁珠结合，并将此结合有单链DNA分子的磁珠装载在芯片(见表1)上，得到固定有单链DNA分子的芯片。
2)杂交并聚合
按表3配置以下DNA聚合酶混合液。
表3 DNA聚合酶混合液
将表2中的四种引物分别用1xTE buffer充分溶解至100uM，并用5XSSC稀释至4uM，放于冰上待用；
将上述12个DNA聚合酶混合液分别加入对应的四种不同的杂交单链杂交，得到12种反应试剂，设置如下表4所示：
表4
反应池 杂交单链
测试_1 153_CAtG
测试_2 153_ACgA
测试_3 153_TAcG
测试_4 153_CTaC
阴性对照_1 153_CAtG
阴性对照_2 153_ACgA
阴性对照_3 153_TAcG
阴性对照_4 153_CTaC
阳性对照_1 153_CAtG
阳性对照_2 153_ACgA
阳性对照_3 153_TAcG
阳性对照_4 153_CTaC
按照下表5的顺序，依次向12个反应池中分别加入各个反应试剂：
表5
用Bgiseq1000测序仪(BGI)检测，结果如表6所示，
表6
结果显示：测试1-测试4的信号都已经远远大于阴性对照组信号，且已经达到阳性对照信号值的90％以上，说明Klenow Fragment(3'→5'exo-)对PerkinElmer购买的dATP-Cy3、dUTP-TexRd、dCTP-FITC和dGTP-Cy5的聚合活性很强。
实施例3、检测用于聚合无荧光修饰的且3'端自由的dNTP的DNA聚合酶的方法
本实施例是在固定在芯片上的核酸序列上进行。
本实施例使用的试剂如下表7所示。
表7 试剂
1、制备单链DNA分子和与其互补杂交单链
按照实施例1的二的方法设计合成45nt的单链DNA分子：
45nt的单链DNA分子如下：
5’-BiotinAAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGGAGTTGCAT(序列1)。
杂交单链序列如下153_CAtG：CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACA(序列3)
荧光修饰dNTP为dGTP-Cy5，碱基甲、碱基乙和碱基丙分别为序列1的第18、17和16位。
2、聚合反应
1)固定芯片
方法与实施例2相同，得到固定有单链DNA分子的芯片。
2)杂交并聚合
将153_CAtG用1xTE buffer充分溶解至100uM，并用5XSSC稀释至4uM，放于冰上待用；按表8配置4个DNA聚合酶混合液I，按照表9配置DNA聚合酶混合液II。
表8
表9
试剂 体积(μL) 终浓度
水 34.5
10×Standard Taq buffer 5 1X
5U/μL Taq DNA聚合酶 0.5 0.05U/ul
10μM dGTP-Cy5 10 2μM
总量 50
按照表10的顺序依次加入各个试剂，并按照相应的温度和时间进行孵育：
表10
注：1x buffer 1和1x buffer 2分别是相对应使用的DNA聚合酶的1x反应缓冲液。
结果及分析：
表11
用Bgiseq1000测序仪(BGI)检测，结果显示：phi29DNA聚合酶聚合5-[(3-Indolyl)propionamide-N-allyl]-2’-deoxyuridine-5’-Triphosphate(修饰的dUTP)之后，再使用Taq DNApolymerase聚合dGTP-Cy5信号值-背景值大于阴性对照，说明phi29DNApolymerase可以聚合5-[(3-Indolyl)propionamide-N-allyl]-2’-deoxyuridine-5’-Triphosphate，但是与阳性对照的信号值相比，只有阳性对照组信号的12％，说明phi29DNApolymerase对5-[(3-Indolyl)propionamide-N-allyl]-2’-deoxyuridine-5’-Triphosphate的聚合活性不强；
而使用Therminator DNA polymerase聚合5-[(3-Indolyl)propionamide-N-allyl]-2’-deoxyuridine-5’-Triphosphate之后再用Taq DNA polymerase聚合dGTP-Cy5信号值差值接近20000，已经远远超过阴性对照组的信号，且超过阳性对照组信号的83％；说明Therminator DNA polymerase聚合5-[(3-Indolyl)propionamide-N-allyl]-2’-deoxyuridine-5’-Triphosphate的活性很强。
实施例4、检测用于对于无荧光修饰的且3'端被阻断的dNTP的DNA聚合酶的方法本实施例是在固定在芯片上的核酸序列上进行。
本实施例使用的试剂如下表12所示。
表12 试剂
1、制备单链DNA分子和与其互补杂交单链
按照实施例1的三的方法设计合成45nt的单链DNA分子：
5’-BiotinAAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGGAGTTGCAT(序列1)。
杂交单链序列：153_CAtG：CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACA(序列3)
荧光修饰dNTP’为dUTP-TexRd，碱基甲和碱基乙分别为序列1的第18、和17位。
2、聚合反应
1)固定芯片
与实施例2相同，得到固定有单链DNA分子的芯片。
2)杂交并聚合
将153_CAtG用1xTE buffer充分溶解至100uM，并用5XSSC稀释至4uM，放于冰上待用；按表12配置2个DNA聚合酶混合液I，按照表13配置DNA聚合酶混合液II。
表13
表14
试剂 体积(μL) 终浓度
水 34.5
10×Standard Taq buffer 5 1X
5U/μL Taq DNA聚合酶 0.5 0.05U/ul
10μM dUTP-TexRd 10 2μM
总量 50
按照表15的顺序依次加入各个试剂，并按照相应的温度和时间进行孵育：
表15
注：1x buffer 1和1x buffer 2分别是相对应使用的DNA聚合酶的1x反应缓冲液。
结果及分析：
表16
用Bgiseq1000测序仪(BGI)检测，结果显示：phi29DNA聚合酶的信号值超过了88％的阴性对照的信号，说明只有约12％的3’-azido-dTTP被phi29聚合，phi29对3’-azido-dTTP的聚合活性很弱，因为有超过88％的位置没有被聚合上3’-azido-dTTP，则引物的3’羟基端没有加上3’-azido-dTTP，3’羟基还是自由的，当第二步使用Taq DNA聚合酶聚合dUTP-TexRd时，可以将dUTP-TexRd聚合上并检测到信号；而Therminator DNA polymerase聚合3’-azido-dTTP的活性很高，因为Therminator DNA polymerase将3’-azido-dTTP聚合到引物的3’羟基端后，引物的3’羟基端被3’-azido-dTTP阻断，不能进一步聚合下一个碱基，且由于3’-azido-dTTP把待聚合碱基的位置占据，导致第二步使用Taq DNA聚合酶聚合dUTP-TexRd时只有约9％被聚合到指定位置，所以检测到的信号越低，说明第一步DNA聚合酶聚合上的3’-azido-dTTP多，聚合活性越强。
序列表
<110>深圳华大生命科学研究院
<120>快速检测和筛选能聚合特殊构造dNTP的DNA聚合酶的方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
aagtcggatc gtagccatgt cgttctgtga gccaaggagt tgcat 45
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
atgcaactcc ttggctcaca gaac 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
caactccttg gctcacagaa cgaca 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
cttggctcac agaacgacat ggcta 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
cttggctcac agaacgacat ggct 24

Claims (10)

1.一种检测待测DNA聚合酶能否聚合特定结构dNTP的方法，包括如下步骤：
1)制备一段单链DNA分子和与其互补的杂交单链；
所述单链DNA分子中从5‘至3’方向上包括相邻排列的碱基乙和碱基甲，所述杂交单链与所述单链DNA分子互补时还需满足如下条件：所述杂交单链3'末端的核苷酸与所述单链DNA分子上的碱基甲互补，所述碱基乙与待聚合特定结构dNTP互补；
2)将所述单链DNA分子、所述杂交单链、所述特定结构dNTP和待测DNA聚合酶混合进行DNA聚合反应，并且以所述单链DNA分子作为延伸模板，检测是否能成功聚合，若能成功聚合，则所述待测DNA聚合酶能聚合所述特定结构dNTP，若不能成功聚合，则所述待测DNA聚合酶不能聚合所述特定结构dNTP。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述检测是否能成功聚合的方法如下：
(1)当所述特定结构dNTP为荧光修饰dNTP，若聚合反应有荧光信号，则所述待测DNA聚合酶能聚合所述荧光修饰dNTP；
(2)当所述特定结构dNTP为无荧光修饰且3’端自由dNTP，向聚合反应后的体系中加入带有荧光的另一dNTP和已知能聚合该另一dNTP且无外切活性的聚合酶，进行二次聚合反应，检测二次聚合反应的荧光信号，若二次聚合反应有荧光信号，则所述待测DNA聚合酶能聚合该所述无荧光修饰且3’端自由dNTP；
所述带有荧光的另一dNTP与所述单链DNA分子中的碱基丙互补配对，所述碱基丙位于所述碱基乙的上游且与所述碱基乙相邻，且所述碱基丙和所述碱基乙不同；
(3)当所述特定结构dNTP为无荧光修饰且3’端阻断dNTP，向聚合反应后的体系中加入带有荧光的另一dNTP和已知能聚合该另一dNTP且无外切活性的聚合酶，进行二次聚合反应，检测二次聚合反应的荧光信号，若二次聚合反应无荧光信号，则所述待测DNA聚合酶能聚合该所述无荧光修饰且3’端阻断dNTP；
所述带有荧光的另一dNTP与所述单链DNA分子中的所述碱基乙互补配对。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述聚合反应均在固定相上完成；
或，所述固定相具体为芯片。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：
所述无外切活性的聚合酶为无3'-5’外切活性且高度保守的DNA聚合酶。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：
所述单链DNA分子大小为10-200nt，优选为15-150nt，更优选为20-100nt。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：
所述特定结构dNTP中的dNTP为如下中至少一种：dATP、dTTP或dUTP、dCTP和dGTP；
若特定结构dNTP为多种dNTP，则制备多条杂交单链，且一种特定结构dNTP对应一条杂交单链。
7.权利要求1-6中任一所述的方法中的所述单链DNA分子、所述杂交单链、所述已知能聚合另一dNTP且无外切活性的聚合酶和所述带有荧光的另一dNTP在检测待测DNA聚合酶能否聚合特定结构dNTP中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述特定结构dNTP为荧光修饰dNTP、无荧光修饰且3’端阻断dNTP或无荧光修饰且3’端自由dNTP。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：
所述dNTP为如下中至少一种：dATP、dTTP或dUTP、dCTP和dGTP。
10.一种检测待测DNA聚合酶能否聚合特定结构dNTP的试剂盒，包括权利要求1-6中任一所述的方法中所述单链DNA分子、所述杂交单链、所述特定结构dNTP和所述已知能聚合另一dNTP且无外切活性的聚合酶。
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