JP2003088367A - Ｄｎａ分析方法及びｄｎａ分析装置並びに反応流路部品 - Google Patents

Ｄｎａ分析方法及びｄｎａ分析装置並びに反応流路部品

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JP2003088367A
JP2003088367A JP2001282887A JP2001282887A JP2003088367A JP 2003088367 A JP2003088367 A JP 2003088367A JP 2001282887 A JP2001282887 A JP 2001282887A JP 2001282887 A JP2001282887 A JP 2001282887A JP 2003088367 A JP2003088367 A JP 2003088367A
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JP2001282887A
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Hisao Inami
久雄 稲波
Yasuhiko Sasaki
康彦 佐々木
Akira Miyake
亮 三宅
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Hitachi Ltd
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Hitachi Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、塩基配列の分析時間の短縮及び分析
の簡便化、低コスト化が可能なＤＮＡ分析方法及びＤＮ
Ａ分析装置を提供する。 【解決手段】プライマーが結合したＤＮＡサンプルに、
４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：ｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を順次加えて
いき、ｄＮＴＰがＤＮＡサンプルに結合した時のプライ
マーの伸長を順次検出することによりＤＮＡの配列を１
塩基単位で決定する方法において、前記ｄＮＴＰにそれ
ぞれ蛍光色素を標識してから、前記ＤＮＡサンプルに前
記４種の蛍光標識ｄＮＴＰのいずれかを順次添加・反応
させ、次にｄＮＴＰを分解する試薬を前記ＤＮＡサンプ
ルに添加することにより、前記添加された蛍光標識ｄＮ
ＴＰのうち未反応の蛍光標識ｄＮＴＰを分解・洗浄した
後、前記ＤＮＡサンプルに光を照射し、前記ＤＮＡサン
プルに結合した前記蛍光標識ｄＮＴＰから発する蛍光を
検出することにより、前記添加されたｄＮＴＰが前記Ｄ
ＮＡサンプルに結合し、プライマーが伸長したか否かを
分析するＤＮＡ分析方法及びＤＮＡ分析装置。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ（デオキシ
リボ核酸）の塩基配列決定を行うＤＮＡ分析方法及びＤ
ＮＡ分析装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】ゲノム解析を中心に、ＤＮＡの塩基配列
決定の高効率化のニーズが高まっている。従来のＤＮＡ
分析方法の一つとして、プライマーが結合したＤＮＡサ
ンプルのプライマー以降の塩基配列を分析する手法がＰ
ＣＴＷＯ９８／２８４４０号に開示されている。具体的
には、ＤＮＡサンプルを構成する４種の塩基、すなわち
アデニン(Ａ)、シトシン(Ｃ)、グアニン(Ｇ)、チミン
(Ｔ)に対して、それぞれ相補性を有する４種のデオキシ
ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、すなわちデオキシ
チミン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシグアニジン三リ
ン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシトシン三リン酸（ｄＣＴ
Ｐ）、デオキシアデニン三リン酸（ｄＡＴＰ）を前記Ｄ
ＮＡサンプルに順次加え、その都度結合の有無を検出す
ることにより、ＤＮＡサンプルのプライマー以降の塩基
配列を１塩基単位で読み取る分析方法である。
【０００３】この方法では、前記ｄＮＴＰが前記ＤＮＡ
サンプルに結合した時のプライマーの伸長に伴い、前記
ｄＮＴＰからピロリン酸（ＰＰi）が遊離する。
【０００４】 (ＤＮＡ)n＋dＮＴＰ→(ＤＮＡ)n+1＋ＰＰi …(1) ＰＰiはアデノシン三リン酸スルフリラーゼ（ＡＴＰス
ルフリラーゼ）の存在下、アデノシン５’-ホスホ硫酸
（ＡＰＳ）と反応することで、アデノシン三リン酸（Ａ
ＴＰ）へと変換される。
【０００５】 ＰＰi＋ＡＰＳ→ＡＴＰ＋ＳＯ4 2- …(2) 生成したＡＴＰの濃度は、以下のルシフェリン-ルシフ
ェラーゼ発光反応により検出される。
【０００６】 ＡＴＰ＋luciferin＋Ｏ2→ ＡＭＰ＋ＰＰi＋oxyluciferin＋ＣＯ2＋光…(3) なお、未反応の前記ｄＮＴＰと余剰ＡＴＰは、アピラー
ゼ等の核酸分解酵素により分解される。
【０００７】 ｄＮＴＰ→dＮＴＰ＋ＰＰi→dＮＭＰ＋ＰＰi …(4) ＡＴＰ→ＡＤＰ＋ＰＰi→ＡＭＰ＋ＰＰi …(5)
【０００８】また、蛍光標識法によるＤＮＡの自動シー
クエンシングは公知であって、例えば、特開２００１−
８６９２号には複数種類の蛍光体がＤＮＡ鎖に結合され
るＤＮＡ断片試料であり、少なくとも一種類の励起され
た蛍光体からのエネルギーの移動により他の種類の蛍光
体から発する蛍光の波長によってＤＮＡ断片試料が識別
できることの開示がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】上記の従来技術は、反
応行程；前記反応式(1)〜(5)及び使用する試薬の種類が
多いため、試薬調整が煩雑で、試薬濃度の経時変化によ
る発光信号に乱れが生じ、分析コストが高い原因となっ
ている。また、未反応物質（ｄＮＴＰ）及び中間生成物
（ＡＴＰ）の分解（反応式(4)、(5)）に長時間を要し分
析時間が長くかかること、試薬の使用量を微量にすると
検出物質の十分な発光量が得られない問題があった。
【００１０】本発明は、反応行程を短縮して試薬の種類
及び使用量の低減が可能なＤＮＡ分析方法及びＤＮＡ分
析装置を提供する。
【００１１】また、本発明は、未反応物質及び中間生成
物の分解時間を短縮して塩基配列の分析時間を短縮でき
るＤＮＡ分析方法及びＤＮＡ分析装置を提供する。
【００１２】更に、本発明は、検出物質の発光量を増大
させ分析を簡便化できるＤＮＡ分析方法及びＤＮＡ分析
装置を提供する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成する本発
明の要旨は次のとおりである。 ［１］ プライマーが結合したＤＮＡサンプルに、４種
のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を順次加え、前
記ｄＮＴＰが前記ＤＮＡサンプルに結合した時のプライ
マーの伸長を順次検出してＤＮＡの配列を１塩基単位で
決定する方法において、前記４種のｄＮＴＰにそれぞれ
蛍光色素を標識（以下、蛍光標識ｄＮＴＰという）する
手順、前記ＤＮＡサンプルに前記４種の蛍光標識ｄＮＴ
Ｐのいずれかを順次添加・反応させる手順、次にｄＮＴ
Ｐを分解する試薬を前記ＤＮＡサンプルに添加すること
により、前記添加された蛍光標識ｄＮＴＰのうち未反応
の蛍光標識ｄＮＴＰを分解・洗浄する手順、前記ＤＮＡ
サンプルに光を照射し、前記ＤＮＡサンプルに結合した
前記蛍光標識ｄＮＴＰから発する蛍光を検出する手順、
を含むＤＮＡ分析方法である。
【００１４】［２］ プライマーを伸長させる酵素と、
未反応ｄＮＴＰを分解する試薬と、pＨを一定に保つ働
きをもつ緩衝液を含む混合試薬に、４種の蛍光標識ｄＮ
ＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）の
いずれかを加えて混合し、該混合液の前記混合試薬と前
記蛍光標識ｄＮＴＰを、プライマーが結合したＤＮＡサ
ンプルが保持された反応流路内に供給して前記ＤＮＡサ
ンプルと反応させる第１の手順と、前記混合試薬を前記
反応流路に流して未反応のｄＮＴＰを分解・洗浄する第
２の手順と、前記ＤＮＡサンプルに光を照射し、蛍光の
有無を検出して、前記供給された蛍光標識ｄＮＴＰが前
記ＤＮＡサンプルに結合し、プライマーが伸長したか否
かを分析する第３の手順を有し、前記第１〜３の手順を
前記４種の蛍光標識ｄＮＴＰについて順次繰り返すＤＮ
Ａ分析方法である。
【００１５】そして、前記項［１］又は［２］におい
て、４種のｄＮＴＰが同一の蛍光色素により標識されて
いることが好ましい。
【００１６】更に、前記項［２］において、４種の蛍光
標識ｄＮＴＰを、「ｄＡＴＰとｄＣＴＰ」或いは「ｄＡ
ＴＰとｄＧＴＰ」から成る第１のグループと、「ｄＴＴ
ＰとｄＧＴＰ」或いは「ｄＴＴＰとｄＣＴＰ」からなる
第２のグループに分け、前記グループ内の２種のｄＮＴ
Ｐを異なる蛍光色素で標識した後、一方のグループの２
種の蛍光標識ｄＮＴＰと混合試薬を反応流路内でそれぞ
れ混合して、前記第１〜３の手順を順次繰り返し、次に
他方のグループの２種の蛍光標識ｄＮＴＰを用いて、前
記と同様に第１〜３の手順を順次繰り返すＤＮＡ分析方
法である。前記の第３の手順で、前記ＤＮＡサンプルに
２種の波長の光を照射することが好ましい。
【００１７】更に、上記の項［１］又は項［２］におい
て、蛍光色素がｄＮＴＰの塩基に標識されていることこ
とが好ましい。
【００１８】また、前記項［２］において、プライマー
を伸長させる酵素は、TaqＤＮＡポリメラーゼ、TthＤＮ
Ａポリメラーゼ、VentＤＮＡポリメラーゼ、サーモシー
ケナーゼのいずれかであり、未反応ｄＮＴＰを分解する
試薬は、ＡＴＰジホスファーゼ、ＡＴＰピロホスファー
ゼのいずれかであり、また緩衝液は、トリス-塩酸、Ｍg
Ｃl2とディチオスレイトールの混合液であることが好ま
しい。更に、前記混合試薬は酸化剤を含むことが好まし
い。
【００１９】［３］ プライマーを伸長させる酵素と、
未反応ｄＮＴＰの分解試薬と、ｐＨを一定に保つ働きを
もつ緩衝液を含む混合試薬に、４類の蛍光標識ｄＮＴＰ
（蛍光標識ｄＡＴＰ、蛍光標識ｄＣＴＰ、蛍光標識ｄＧ
ＴＰ及び蛍光標識ｄＴＴＰ）のいずれかを加えて両者を
反応流路内で混合し、該混合液の前記混合試薬と前記４
種の蛍光標識ｄＮＴＰを、プライマーが結合したＤＮＡ
サンプルと反応流路内で反応させる手順を４種の蛍光標
識ｄＮＴＰについて順次繰り返すための第１の手段と、
前記混合試薬と前記蛍光標識ｄＮＴＰを前記ＤＮＡサン
プルに反応流路内で反応させた後、前記混合試薬を前記
反応流路に流して、反応流路内に残留する前記未反応ｄ
ＮＴＰを分解・洗浄するための第２の手段と、前記混合
試薬と前記蛍光標識ｄＮＴＰを前記ＤＮＡサンプルに反
応流路内で接触、反応させ、次に前記混合試薬を前記反
応流路に流して、反応流路内に残留する前記未反応ｄＮ
ＴＰを分解・洗浄した後、前記ＤＮＡサンプルに励起光
を照射し、蛍光を検出する第３の手段と、を備えたＤＮ
Ａ分析装置である。
【００２０】［４］ プライマーを伸長させる酵素と、
未反応ｄＮＴＰの分解試薬と、pＨを一定に保つ働きを
もつ緩衝液とを含む混合試薬を保管する混合試薬槽と、
４種の蛍光標識ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ）のそれぞれを個別に保管する４つの蛍
光標識ｄＮＴＰ槽と、前記混合試薬槽に接続された反応
流路と、該反応流路と前記４つの蛍光標識ｄＮＴＰ槽と
をそれぞれ接続する４本の蛍光標識ｄＮＴＰ流路と、前
記各槽に保管された流体を前記反応流路にそれぞれ供給
するポンプと、前記反応流路に設けられＤＮＡサンプル
が固定された反応部と、前記反応流路の下流側に設けら
れ混合試薬或いは蛍光標識ｄＮＴＰを排出するための排
出口と、前記反応流路における、前記ＤＮＡサンプルと
前記蛍光標識ｄＮＴＰとの結合を検出する蛍光検出部と
を備えているＤＮＡ分析装置である。
【００２１】前記項[３]又は［４］において、反応部
は、アミノ基がコーティングされたガラス板にＤＮＡサ
ンプルが固定されたものであることが好ましい。また、
反応部は複数に区画されたガラス板に異なるＤＮＡサン
プルが固定されていることが好ましく、反応流路に対し
脱着可能に構成されていることが好ましい。
【００２２】［５］ プライマーが結合したＤＮＡサン
プルに、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ）を順次加え、前記ｄＮＴＰが前記ＤＮ
Ａサンプルに結合した時のプライマーの伸長を順次検出
してＤＮＡの配列を１塩基単位で決定するＤＮＡ分析方
法において、前記４種のｄＮＴＰにそれぞれ発光色素を
標識してから、前記ＤＮＡサンプルに前記４種の光標識
ｄＮＴＰを順次添加して反応させ、次にｄＮＴＰの分解
試薬を前記ＤＮＡサンプルに添加することにより、前記
添加された光標識ｄＮＴＰのうち未反応の光標識ｄＮＴ
Ｐを分解・洗浄した後、前記ＤＮＡサンプルに光を照射
し、前記ＤＮＡサンプルに結合した前記光標識ｄＮＴＰ
の発光を検出するＤＮＡ分析方法である。
【００２３】［６］ プライマーを伸長させる酵素と、
未反応ｄＮＴＰの分解試薬と、緩衝液とを含む混合試薬
に、４種の光標識ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰ）のいずれかを加えて混合し、該混合
液の前記混合試薬と前記光標識ｄＮＴＰを前記ＤＮＡサ
ンプルが保持された反応流路内に供給して接触させ反応
させる第１の手順と、前記混合試薬を前記反応流路に流
して未反応のｄＮＴＰを分解・洗浄する第２の手順と、
前記ＤＮＡサンプルに光を照射し、発光の有無を検出す
る第３の手順とを有し、前記の第１〜３手順を前記４種
の光標識ｄＮＴＰについて繰り返すＤＮＡ分析方法であ
る。
【００２４】［７］ プライマーを伸長させる酵素と、
未反応ｄＮＴＰの分解試薬と、緩衝液を含む混合試薬
に、４類の光標識ｄＮＴＰ（光標識ｄＡＴＰ、光標識ｄ
ＣＴＰ、光標識ｄＧＴＰ及び光標識ｄＴＴＰ）のいずれ
かを加えて両者を反応流路内で混合し、該混合液の前記
混合試薬と前記４種の光標識ｄＮＴＰを、プライマーが
結合したＤＮＡサンプルと反応流路内で反応させる手順
を４種の光標識ｄＮＴＰについて順次繰り返すための第
１の手段と、前記混合試薬と前記光標識ｄＮＴＰを前記
ＤＮＡサンプルに反応流路内で反応させた後、前記混合
試薬を前記反応流路に流して、反応流路内に残留する前
記未反応ｄＮＴＰを分解・洗浄するための第２の手段
と、前記混合試薬と前記光標識ｄＮＴＰを前記ＤＮＡサ
ンプルに反応流路内で接触、反応させ、次に前記混合試
薬を前記反応流路に流して、反応流路内に残留する前記
未反応ｄＮＴＰを分解・洗浄した後、前記ＤＮＡサンプ
ルに励起光を照射し、発光を検出する第３の手段と、を
備えるＤＮＡ分析装置である。
【００２５】［８］ シリコン基板上に、少なくとも１
本の反応流路を有し、該反応流路は蛍光標識ｄＡＴＰ注
入口、蛍光標識ｄＣＴＰ注入口、蛍光標識ｄＴＴＰ注入
口、蛍光標識ｄＧＴＰ注入口を介して前記４種類の蛍光
標識ｄＮＴＰ注入口に対応する蛍光標識ｄＡＴＰ流路、
蛍光標識ｄＣＴＰ流路、蛍光標識ｄＴＴＰ流路、蛍光標
識ｄＧＴＰ流路に連通しており、更に、前記４種類の蛍
光標識ｄＮＴＰ注入口の下流側にＤＮＡサンプルと前記
４種の蛍光標識ｄＮＴＰを順次添加して反応させる反応
部及び排出口を有する反応流路部品である。
【００２６】前記項［８］において、反応流路は断面形
状が幅０．１〜５ｍｍ、深さ０．０５〜０．５ｍｍであ
り、流路長が１０〜１００ｍｍ、流路内容積が１００μ
Ｌ以下であることが好ましく、蛍光標識ｄＮＴＰ流路の
断面形状が幅０．５ｍｍ、深さ０．２ｍｍであり、流路
長が１０ｍｍ、流路内容積が１μＬであることが好まし
い。また、前記の反応部はガラス板の表面にアミノ基を
有するコーティング層を介してＤＮＡサンプルが固定さ
れ、前記ガラス板により反応流路を覆う構造であること
が好ましい。
【００２７】［９］ ＤＮＡ分析の蛍光標識に用いる蛍
光色素に応じて波長選択が可能な励起光源、該励起光源
が発した励起光を点光源に絞るピンホール部Ａ、前記励
起光を反射するダイクロイックミラー、該ダイクロイッ
クミラーを反射した光を反応部に収束する焦点レンズ、
前記収束された励起光の照射によりＤＮＡサンプルと４
種の蛍光標識ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰ）のいずれかを順次添加して反応させる反
応部、該反応部から励起された蛍光を前記ダイクロイッ
クミラーを透過させたのち該蛍光の特定の領域の周波数
にカットするバンドパスフィルター、前記励起光の焦点
以外の位置から発せられた蛍光を遮断するピンホール部
Ｂ、及び該ピンホール部Ｂを透過した蛍光を検出する検
出器を有するＤＮＡ分析装置である。
【００２８】
【発明の実施の形態】以下、同一の蛍光色素により標識
された４種のｄＮＴＰを使用する場合の実施例を、図１
を用いて説明する。図１は、分析方法の手順を示すフロ
ーチャート図である。
【００２９】［実施例１］初めに、ＤＮＡサンプルを作
成する。塩基配列を分析したい一本鎖ＤＮＡサンプル
に、塩基数１５〜２０のプライマーを加え、９５℃で５
分間アニールした後に室温で３０分間静置する。これに
より、一本鎖ＤＮＡサンプルとプライマーは結合する。
この時結合しなかったプライマーは洗浄して流す（ステ
ップ１０１）。
【００３０】次いで、プライマー伸長酵素とｄＮＴＰ分
解試薬を混合した試薬を調整する。プライマー伸長酵素
としては、TaqＤＮＡポリメラーゼ、TthＤＮＡポリメラ
ーゼ、VentＤＮＡポリメラーゼ、サーモシーケナーゼの
いずれかを用いることができる。 またｄＮＴＰ分解試
薬としては、ＡＴＰジホスファーゼ、ＡＴＰピロホスフ
ァーゼのいずれかを用いることができる。
【００３１】更に、プライマーの伸長が円滑に進むよう
に混合試薬に緩衝液を付加することが好ましい。該緩衝
液としては、pＨ緩衝液としてのトリス-塩酸等、プライ
マーの伸長反応の基質となる錯体（ｄＮＴＰとＭg2+）
を作成するためのＭgＣl2、酵素タンパク質を酸化変性
から保護するためのディチオスレイトールを混合して用
いることが好ましい（ステップ１０２）。
【００３２】次に、４種類のデオキシヌクレオチド三リ
ン酸：ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄ
ＴＴＰ）に同一の蛍光色素を標識する。
【００３３】本発明では４種類のｄＮＴＰを同時に加え
ることがなく順次加えていくため、それぞれのｄＮＴＰ
を色で識別する必要がない。蛍光色素が１種類であるか
ら励起波長も1種類で済み、蛍光の検出を容易にでき
る。
【００３４】蛍光色素としては、Ｃｙ３（アマシャム・
ファルマシア・バイオテク株式会社製）、Ｃｙ５（アマ
シャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製）、フル
オレセインイソチオシアネート、ローダミン、テキサス
レッド等を用いることができる。蛍光色素をｄＮＴＰに
標識する方法は特に限定されるものではないが、例えば
アミノ基導入試薬としてのエチレンジアミンをｄＮＴＰ
の塩基に結合させる方法がある。一例としてｄＮＴＰが
ｄＣＴＰの場合の反応式を以下に示す。
【００３５】
【化１】
【００３６】ｄＣＴＰの塩基に結合したエチレンジアミ
ンの先端のアミノ基は活性であり、カルボキシル基と反
応する。上記の蛍光色素は官能基としてカルボキシル基
を有するので、ｄＣＴＰに容易に標識することができる
（ステップ１０３）。
【００３７】次いで、ＤＮＡサンプルに混合試薬と1種
類の蛍光標識ｄＮＴＰ，例えば蛍光標識ｄＡＴＰ（dＡ
ＴＰ-fluore）を加える。混合試薬を触媒として蛍光標
識ｄＡＴＰがＤＮＡサンプルに結合した時、プライマー
は伸長する（ステップ１０４）。
【００３８】 (ＤＮＡ)n＋dＡＴＰ-fluore→(ＤＮＡ)n+1-fluore＋ＰＰi …(6) このあと、結合しなかった蛍光標識ｄＡＴＰを混合試薬
により分解・洗浄する（ステップ１０５）。
【００３９】 ｄＡＴＰ→dＡＤＰ＋ＰＰi→dＡＭＰ＋ＰＰI …(7) こうしてＤＮＡサンプルに蛍光標識ｄＡＴＰが結合した
場合、蛍光色素の励起光をＤＮＡサンプルに照射するこ
とで、蛍光を検出することができる。例えば蛍光色素と
してＣｙ３を用いた場合、最大励起波長が５５０ｎｍの
励起光を照射することで、波長が５７０ｎｍの蛍光を検
出できる。
【００４０】本実施例によれば反応行程を従来の５（反
応式(1)〜(5)）から２（反応式(6)〜(7)）に短縮できる
ために、試薬の使用量を大幅に低減できる。
【００４１】また、従来技術のルシフェリン-ルシフェ
ラーゼ発光反応では、試薬を微量化すると検出物質の発
光量が充分でなかったが、本実施例によれば検出する蛍
光強度は励起光の強度に依存するため、発光量を励起光
の強度で増大することができ、従来よりも少ない試薬の
使用量で発光の検出を容易に行うことができる。
【００４２】蛍光強度If(λ,θ)は次式より求めること
ができる。 If(λ,θ)＝(1-η)Ie(λ)Cφ(θ)ε(λ) （式中の、If(λ,θ)は蛍光強度、Ieは励起光強度、η
は散乱定数、λは励起光波長、Cは蛍光色素濃度、φは
量子収率、εは吸光係数である。）
【００４３】蛍光色素の退色速度は励起光の強度に伴い
増加することから、励起光の強度を強め、蛍光色素が退
色するのに要する時間を短くすることで分析時間が短縮
される。また、混合試薬に予め酸化剤を添加することで
蛍光色素の酸化が促進され、蛍光色素の退色時間は短く
なる。蛍光色素が完全に退色しない状況で発光信号のベ
ースラインの上昇を考慮して分析することができる（ス
テップ１０６）。
【００４４】次に、ＤＮＡサンプルに混合試薬と蛍光標
識ｄＣＴＰを加える。混合試薬を触媒として蛍光標識ｄ
ＣＴＰがＤＮＡサンプルに結合した時、プライマーは伸
長する（ステップ１０７）。
【００４５】次に、結合しなかった蛍光標識ｄＣＴＰ
を、混合試薬により分解・洗浄する（ステップ１０
８）。
【００４６】上記により、ＤＮＡサンプルに蛍光標識ｄ
ＣＴＰが結合した場合、蛍光色素の励起光をＤＮＡサン
プルに照射して、蛍光を検出できる。（ステップ１０
９）。
【００４７】更に、ＤＮＡサンプルに混合試薬と蛍光標
識ｄＴＴＰを加える。混合試薬を触媒として蛍光標識ｄ
ＴＴＰがＤＮＡサンプルに結合した時、プライマーは伸
長する（ステップ１１０）。
【００４８】この後、結合しなかった蛍光標識ｄＴＴＰ
を混合試薬により分解・洗浄する（ステップ１１１）。
【００４９】上記により、ＤＮＡサンプルに蛍光標識ｄ
ＴＴＰが結合した場合、蛍光色素の励起光をＤＮＡサン
プルに照射することで、蛍光を検出することができる
（ステップ１１２）。
【００５０】最後に、ＤＮＡサンプルに混合試薬と蛍光
標識ｄＧＴＰを加える。混合試薬を触媒として蛍光標識
ｄＧＴＰがＤＮＡサンプルに結合した時、プライマーは
伸長する（ステップ１１３）。
【００５１】この後、結合しなかった蛍光標識ｄＧＴＰ
を混合試薬により分解・洗浄する（ステップ１１４）。
【００５２】上記により、ＤＮＡサンプルに蛍光標識ｄ
ＧＴＰが結合した場合、蛍光色素の励起光を前記ＤＮＡ
サンプルに照射して、蛍光を検出できる（ステップ１１
５）。
【００５３】以上の行程を、４種類の蛍光標識ｄＮＴＰ
について繰り返して、ＤＮＡサンプルの配列を一塩基ず
つ決定する（ステップ１１６）。 なお、蛍光標識ｄＡ
ＴＰと蛍光標識ｄＴＴＰ、或いは蛍光標識ｄＣＴＰと蛍
光標識ｄＧＴＰはそれぞれ結合する可能性があり、上述
のように蛍光標識ｄＡＴＰと蛍光標識ｄＴＴＰ、或いは
蛍光標識ｄＣＴＰと蛍光標識ｄＧＴＰが連続しない順序
で蛍光標識ｄＮＴＰを反応させるのが望ましい。これに
より各蛍光標識ｄＮＴＰ間の汚染を防止して、蛍光標識
ｄＮＴＰとＤＮＡサンプルとの確実な結合を図ることが
できる。
【００５４】次に、ＤＮＡサンプルと蛍光標識ｄＮＴＰ
との具体的な結合について、図２を用いて説明する。図
２は、ＤＮＡサンプルと蛍光標識ｄＮＴＰとの結合を示
す模式図である。
【００５５】ＤＮＡサンプル２０１は、一本鎖ＤＮＡサ
ンプル２０２と、この一本鎖ＤＮＡサンプル２０２に結
合しているプライマー２０３とから成っている。該ＤＮ
Ａサンプル２０１の初期状態は、図２(a)に示すよう
に、一本鎖ＤＮＡサンプル２０２にプライマー２０３が
結合し、一本鎖ＤＮＡサンプル２０２のプライマー２０
３以降の塩基配列がわからない場合の例である。なお、
塩基配列の記号は、Ａ:アデニン、Ｇ:グアニン、Ｃ:シ
トシン、Ｔ:チミンである。
【００５６】この初期状態で、混合試薬の存在下、蛍光
標識ｄＡＴＰ２１１を添加すると、図２(b)に示される
ように、ＤＮＡサンプル２０１と蛍光標識ｄＡＴＰ２１
１が結合する。そして、未反応の蛍光標識ｄＡＴＰ２１
１を混合試薬により分解・洗浄する。その後、結合した
蛍光標識ｄＡＴＰ２１１に励起光を照射して、1塩基分
の蛍光強度を計測する。
【００５７】次に、混合試薬の存在下、蛍光標識ｄＣＴ
Ｐ２１２を添加すると、図２(C)に示すように、ＤＮＡ
サンプル２０１と蛍光標識ｄＣＴＰ２１２が結合しな
い。そして、未反応の蛍光標識ｄＣＴＰ２１２を混合試
薬２１０により分解・洗浄する。励起光を照射しても蛍
光は計測されない。
【００５８】更に、混合試薬の存在下、蛍光標識ｄＴＴ
Ｐ２１３を添加すると、図２(d)に示すように、ＤＮＡ
サンプル２０１と２つの蛍光標識ｄＴＴＰ２１３が続け
て結合する。そして、未反応の蛍光標識ｄＴＴＰ２１３
を混合試薬２１０により分解・洗浄する。その後、結合
した蛍光標識ｄＴＴＰ２１３に励起光を照射して、２塩
基分の蛍光強度を計測する。
【００５９】最後に、混合試薬の存在下、蛍光標識ｄＧ
ＴＰ２１４を添加すると、図２(e)に示すように、ＤＮ
Ａサンプル２０１と蛍光標識ｄＧＴＰ２１４が結合す
る。そして、未反応の蛍光標識ｄＧＴＰ２１４を混合試
薬２１０により分解・洗浄する。その後、結合した蛍光
標識ｄＧＴＰ２１４に励起光を照射して、1塩基分の蛍
光強度を計測する。
【００６０】以上の行程により、計測した蛍光強度のプ
ロファイルは蛍光標識ｄＡＴＰ２１１で１塩基分、蛍光
標識ｄＴＴＰ２１３で２塩基分、蛍光標識ｄＧＴＰ２１
４で１塩基分の順序であるから、ＤＮＡサンプル２０１
のプライマー２０３以降の塩基配列がＴＡＡＣであるこ
とが分析される。
【００６１】次に、本実施例のＤＮＡ分析装置を図３、
図４、図５、図６及び図７を用いて説明する。図３はＤ
ＮＡ分析装置の全体を示す構成図、図４は反応流路の詳
細図、図５は反応部の断面図、図６はポンプの断面図、
図７は検出部の詳細図である。
【００６２】ＤＮＡ分析装置は、プライマー伸長酵素と
ｄＮＴＰ分解試薬と緩衝液とから構成される混合試薬２
１０を保管する混合試薬槽３００と、４種の蛍光標識ｄ
ＮＴＰ、すなわち蛍光標識ｄＡＴＰ２１１、蛍光標識ｄ
ＣＴＰ２１２、蛍光標識ｄＴＴＰ２１３、蛍光標識ｄＧ
ＴＰ２１４をそれぞれ保管する４つの蛍光標識ｄＮＴＰ
槽、即ち、蛍光標識ｄＡＴＰ槽３０１、蛍光標識ｄＣＴ
Ｐ槽３０２、蛍光標識ｄＴＴＰ槽３０３、蛍光標識ｄＧ
ＴＰ槽３０４と、反応流路３１０と、各蛍光標識ｄＮＴ
Ｐ槽（３０１〜３０４）と反応流路３１０とを結ぶ４本
の蛍光標識ｄＮＴＰ流路、すなわち蛍光標識ｄＡＴＰ流
路３１１、蛍光標識ｄＣＴＰ流路３１２、蛍光標識ｄＴ
ＴＰ流路３１３、蛍光標識ｄＧＴＰ流路３１４と、混合
試薬２１０を混合試薬槽３００から吸引して反応流路３
１０に吐出する混合試薬ポンプ３２０と、各蛍光標識ｄ
ＮＴＰ（２１１〜２１４）を各蛍光標識ｄＮＴＰ槽（３
０１〜３０４）から吸引して反応流路３１０に吐出する
４つの蛍光標識ｄＮＴＰポンプ、すなわち蛍光標識ｄＡ
ＴＰポンプ３２１、蛍光標識ｄＣＴＰポンプ３２２、蛍
光標識ｄＴＴＰポンプ３２３、蛍光標識ｄＧＴＰポンプ
３２４と、ＤＮＡサンプル２０１が固定された反応部３
３０と、励起光源３７０と検出器３７５等から成ってい
る。
【００６３】シリコン製の反応流路３１０は、８０ｍｍ
×８０ｍｍ程度のシリコン基板上に、マイクロファブリ
ケーションを用いて制作されている。流路の途中に４つ
の蛍光標識ｄＮＴＰ注入口、すなわち蛍光標識ｄＡＴＰ
注入口３４１、蛍光標識ｄＣＴＰ注入口３４２、蛍光標
識ｄＴＴＰ注入口３４３、蛍光標識ｄＧＴＰ注入口３４
４を有している。ここで、蛍光標識ｄＡＴＰ注入口３４
１、蛍光標識ｄＣＴＰ注入口３４２、蛍光標識ｄＴＴＰ
注入口３４３、蛍光標識ｄＧＴＰ注入口３４４はそれぞ
れ、蛍光標識ｄＡＴＰ流路３１１、蛍光標識ｄＣＴＰ流
路３１２、蛍光標識ｄＴＴＰ流路３１３、蛍光標識ｄＧ
ＴＰ流路３１４に連通している。更に、反応流路３１０
は、蛍光標識ｄＮＴＰ注入口（３４１〜３４４）の下流
側で、排出口３５０との間に位置する反応部３３０を有
している。
【００６４】ここで、反応流路３１０は断面形状が幅１
ｍｍ、深さ０．２ｍｍであり、流路長が５０ｍｍ、流路
内容積が１０μＬである。また、蛍光標識ｄNTP流路
（３１１〜３１４）は断面形状が幅０．５ｍｍ、深さ
０．２ｍｍであり、流路長が１０ｍｍ、流路内容積が１
μＬである。更には、混合試薬槽３００及び蛍光標識ｄ
ＮＴＰ槽（３０１〜３０４）の直径は１０ｍｍ、深さが
１０ｍｍ、容積が７８５μＬである。また、ｄＮＴＰ注
入口（３４１〜３４４）と反応部３３０との間隔は１０
〜３０ｍｍである。
【００６５】図５に示すように反応部３３０はＤＮＡサ
ンプル２０１が固定されたガラス板３３１を支持してい
る。そして、天井部分をカットした反応流路３１０を覆
う構造となっている。該反応部３３０は分析対象のＤＮ
Ａサンプル２０１毎に脱着可能であるため、サンプル間
の汚染を確実に防ぎ、ＤＮＡサンプル２０１の交換を容
易に行うことができる。
【００６６】ここで、ガラス板３３１へのＤＮＡサンプ
ル２０１の固定方法について述べる。まず、ガラス板３
３１にアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）を
添加し、１２０〜１６０℃程度でベークすると、ガラス
板３３１の表面にアミノ基が固定される。次に、アミノ
基がコーティングされたガラス板３３１にＤＮＡサンプ
ル２０１を塗布し、ガラス板３３１を恒温恒湿槽に入れ
て、３７℃、湿度９０％で１時間保温する。その後、Ｕ
Ｖクロスリンカーを用いて６０mＪ/ｃｍ2の紫外線をガ
ラス板３３１に照射して、ＤＮＡサンプル２０１はガラ
ス板３３１に強固に固定される。
【００６７】混合試薬ポンプ３２０及び４つの蛍光標識
ｄＮＴＰポンプ（３２１〜３２４）は、図６に示すよう
に厚さ１．５ｍｍ程度のシリコン製容積型ポンプであ
り、マイクロファブリケーションにより吸入口３６１、
吐出口３６２、ダイアフラム３６３、ポンプ室３６４、
吸入弁３６５及び吐出弁３６６等の加工が施されてい
る。ポンプの駆動は、外部のアクチュエーター３６７で
ダイアフラム３６３を変形させることにより行う。すな
わち、ダイアフラム３６３が上方に膨らんだ時はポンプ
室３６４の内部が減圧されるため、吐出弁３６６が閉じ
て吸入弁３６５が開き、吸入口３６１からポンプ室３６
４に液体が吸入される。次に、ダイアフラム３６３が下
方に凹むとポンプ室３６４の内部が加圧されるため、吸
入弁３６５が閉じて吐出弁３６６が開き、吐出口３６２
からポンプ室３６４の外部へと液体が吐出される。
【００６８】次に、検出部について図７を用いて説明す
る。励起光源３７０は使用する蛍光色素に応じて選択す
る。例えば、最大励起波長が５５０ｎｍのＣｙ３或いは
５７８ｎｍのローダミン、５９４ｎｍのテキサスレッド
に対してはＨe-Ｎeレーザーが使用でき、最大励起波長
が４９４ｎｍのフルオレセインイソチオシアネートには
アルゴンレーザーを使用できる。また最大励起波長が６
４９ｎｍのＣｙ５を用いる場合には超高圧水銀ランプが
使用できる。
【００６９】励起光源３７０より発した励起光３８０
は、ピンホール３７１で絞られ点光源の状態になる。ダ
イクロイックミラー３７２を反射した励起光３８０は焦
点レンズ３７３により収束され、反応部３３０に照射さ
れる。反応部３３０において励起された蛍光３８１はダ
イクロイックミラー３７２を透過したのち、バンドパス
フィルター３７４に達する。蛍光３８１の周波数は、バ
ンドパスフィルター３７４により特定の領域のみにカッ
トされる。そして、励起光３８０の焦点以外の位置から
発せられた蛍光がピンホール３７１により遮断されたの
ち、蛍光３８１はＣＣＤカメラ等の検出器３７５により
検出される。
【００７０】次に、ＤＮＡ分析装置の動作手順を図３を
用いて説明する。まず、混合試薬ポンプ３２０を駆動し
て、反応流路３１０の内部を混合試薬２１０で充填す
る。この状態で、蛍光標識ｄＡＴＰポンプ３２１を一定
時間（本実施例では１ｓ）駆動することにより、蛍光標
識ｄＡＴＰ２１１が蛍光標識ｄＡＴＰ槽３０１から蛍光
標識ｄＡＴＰ流路３１１を通って反応流路３１０に一定
量（本実施例では０．５μL）注入され、混合試薬２１
０と混合される。混合試薬２１０と蛍光標識ｄＡＴＰ３
１１の混合液は、流速２．５ｍｍ/ｓで反応部３３０に
達した後、この混合液は反応部３３０に固定されたＤＮ
Ａサンプル２０１と反応する。次に、混合試薬ポンプ３
２０を一定時間（本実施例では５ｓ）駆動することによ
り、混合試薬２１０が一定量（本実施例では２．５μ
Ｌ）反応流路３１０に注入され、この混合試薬２１０は
反応部３３０に残留した未反応の蛍光標識ｄＡＴＰ２１
１を分解・洗浄して排出口３５０へと排出する。そして
未反応の蛍光標識ｄＡＴＰ２１１の排出後、反応部３３
０に励起光３８０を照射し、蛍光３８１の検出を行うこ
とで、蛍光標識ｄＡＴＰ２１１の結合の有無が計測され
る。以下、蛍光標識ｄＣＴＰ２１２、蛍光標識ｄＴＴＰ
２１３、蛍光標識ｄＧＴＰ２１４についても同様の操作
を繰り返すことで、ＤＮＡサンプル２０１の塩基配列が
分析される。
【００７１】本実施例によれば装置がフロー式であるた
め、未反応の蛍光標識ｄＮＴＰが反応部３３０に長時間
滞留し、迷光することはない。また装置がフロー式であ
るため、混合試薬２１０により分解・洗浄された未反応
の蛍光標識ｄＮＴＰが反応部３３０に滞留することなく
排出される。よって、未反応の蛍光標識ｄＮＴＰの分解
・洗浄時間が大幅に短縮され、分析時間の短縮が可能で
ある。なお、本実施例では励起光源を仕様するため、従
来技術に比べて検出部は少し大きくなるが、実質センサ
ーシステムの大きさだけと考えてよく、コンパクトな装
置を提供できる。
【００７２】［実施例２］図８を用いて、２種類の蛍光
色素を使用しｄＮＴＰを２種類ずつ検出する場合につい
て説明する。図８は分析方法の手順を示すフローチャー
ト図である。なお、装置構成は実施例１と同様である。
【００７３】ＤＮＡサンプル２０１の作成及び混合試薬
２１０の調整手順、即ち、ステップ１２１〜１２２は、
図１のステップ１０１〜１０２と同じである。
【００７４】次に、４種の蛍光標識ｄＮＴＰを、「ｄＡ
ＴＰとｄＣＴＰ」或いは「ｄＡＴＰとｄＧＴＰ」から成
る第１のグループと、「ｄＴＴＰとｄＧＴＰ」あるいは
「ｄＴＴＰとｄＣＴＰ」からなる第２のグループに分け
る。
【００７５】蛍光標識ｄＡＴＰ２１１と蛍光標識ｄＴＴ
Ｐ２１３、或いは蛍光標識ｄＣＴＰ２１２と蛍光標識ｄ
ＧＴＰ２１４とはそれぞれ結合する可能性があるため同
一グループにしない。
【００７６】そして、同一グループ内の蛍光標識ｄＮＴ
Ｐを異なる２種の蛍光色素で標識する。蛍光色素とし
て、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセインイソチオシアネー
ト、ローダミン、テキサスレッド等を組み合わせて用い
ることができる（ステップ１２３）。
【００７７】使用する試薬の調整が済んだら、ＤＮＡサ
ンプル２０１に混合試薬２１０と第１グループの一方の
蛍光標識ｄＮＴＰ（例えば蛍光標識ｄＡＴＰ２１１）を
加える。混合試薬２１０を触媒として蛍光標識ｄＡＴＰ
２１１がＤＮＡサンプル２０１に結合した時、プライマ
ー２０３は伸長する（ステップ１２４）。
【００７８】さらに、第一グループのもう一方の蛍光標
識ｄＮＴＰ（例えば蛍光標識ｄＣＴＰ２１２）を加え、
同様の反応を進行させる（ステップ１２５）。
【００７９】この後、結合しなかった２種の蛍光標識ｄ
ＮＴＰを、混合試薬２１０により分解・洗浄する（ステ
ップ１２６）。
【００８０】こうしてＤＮＡサンプル２０１に蛍光標識
ｄＮＴＰが結合した場合、２種の蛍光色素の励起光３８
０をＤＮＡサンプル２０１に照射して、それぞれ異なる
波長の蛍光３８１を検出できる。例えば、最大励起波長
が５５０ｎｍのCy3と５７８ｎｍのローダミンを蛍光色
素として選択した場合、励起光源３７０としてＨe-Ｎe
レーザーを使用し、レーザー顕微鏡などの検出器３７５
を用いて、Ｃｙ３とローダミン由来の蛍光を分離して検
出できる。
【００８１】また、最大励起波長が大きく異なる２種の
蛍光色素を使用した場合、２種の波長の励起光３８０を
照射して、2種の蛍光の検出を確実にできる（ステップ
１２７）。
【００８２】次に、ＤＮＡサンプル２０１に混合試薬２
１０と第２グループの一方の蛍光標識ｄＮＴＰ（例えば
蛍光標識ｄＴＴＰ２１３）を加える。混合試薬２１０を
触媒として蛍光標識ｄＴＴＰ２１１がＤＮＡサンプル２
０１に結合した時、プライマー２０３は伸長する（ステ
ップ１２８）。
【００８３】更に、同一グループのもう一方の蛍光標識
ｄＮＴＰ（例えば蛍光標識ｄＧＴＰ２１４）を加え、同
様の反応を進行させる（ステップ１２９）。
【００８４】この後、結合しなかった２種の蛍光標識ｄ
ＮＴＰを混合試薬２１０により分解・洗浄する（ステッ
プ１３０）。
【００８５】こうしてＤＮＡサンプル２０１に蛍光標識
ｄＮＴＰが結合した場合、２種の蛍光色素の励起光３８
０をＤＮＡサンプル２０１に照射することで、それぞれ
異なる波長の蛍光３８１を検出することができる（ステ
ップ１３１）。
【００８６】以上の行程を、２つのグループについて繰
り返し、ＤＮＡサンプル２０１の塩基配列を決定できる
（ステップ１３２）。
【００８７】本実施例では、蛍光色素を２種類用いる
が、最大励起波長の近い組み合わせを選択することで励
起光源３７０と検出器３７５は１つで済むことから、コ
ンパクトな装置を提供できる。
【００８８】図８に示す本実施例の分析方法は、図１に
示す実施例１の分析方法よりも洗浄行程が少なく分析時
間を更に短縮できる。
【００８９】［実施例３］実施例１及び実施例２と基本
構成は同一であるが、実施例1及び２では、反応部３３
０に設けたガラス板３３１に１種類のＤＮＡサンプル２
０１を固定したが、本実施例ではガラス板３３１を複数
に区画し、それぞれのコンパートメントに異なるＤＮＡ
サンプル２０１をスポットして固定することにより、多
種のＤＮＡサンプル２０１を同時に配列決定することが
できる。
【００９０】［実施例４］実施例１〜３の装置がフロー
式であるが、本発明においてはフロー方式に特定されな
い。例えば、バッチ式の反応槽を使用した場合について
説明する。
【００９１】まず、ガラス容器の内側底部にＤＮＡサン
プル２０１を固定する。次に、プライマーを伸長させる
酵素と、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬と、pＨを一定
に保つ働きをもつ緩衝液を含む混合試薬２１０と、４種
類の蛍光標識ｄＮＴＰ（蛍光標識ｄＡＴＰ、蛍光標識ｄ
ＣＴＰ、蛍光標識ｄＧＴＰ及び蛍光標識ｄＴＴＰ）のい
ずれかを、ＤＮＡサンプル２０１が固定されたガラス容
器に加えてＤＮＡサンプル２０１と反応させた後、ガラ
ス容器内の試薬を全て排出する。
【００９２】次に、ＤＮＡサンプル２０１が固定された
ガラス容器に混合試薬２１０を加え、ガラス容器内に残
留する未反応の蛍光標識dＮＴＰを分解・洗浄した後、
混合試薬２１０をガラス容器から排出する。最後に、ガ
ラス容器底部のＤＮＡサンプル２０１に対して、ガラス
容器下側から励起光を照射し、蛍光の検出を行うこと
で、前記実施例と同様にＤＮＡサンプル２０１の塩基配
列を決定することができる。
【００９３】
【発明の効果】本発明によれば、dＮＴＰに蛍光色素を
標識したので、dＮＴＰとＤＮＡサンプルの結合及びそ
れに伴うプライマー伸長の有無を、ＤＮＡサンプルに結
合した蛍光標識ｄＮＴＰから発する蛍光の検出で分析で
き、反応行程を短縮して試薬の使用量を低減できる。
【００９４】また、検出する蛍光の強度は励起光の強度
に依存するため、発光量を励起光の強度で増大すること
ができ、少ない試料の使用量で分析を簡便にできる。
【００９５】また、本発明によれば、装置をフロー式と
することによって、混合試薬により分解・洗浄された未
反応の蛍光標識ｄＮＴＰを反応部に滞留させることなく
排出できるような構成とでき、未反応の蛍光標識ｄＮＴ
Ｐの分解・洗浄時間を短縮して塩基配列の分析時間を短
縮できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の実施例１の分析手順を示すフローチ
ャート図である。
【図２】 図１のＤＮＡサンプルと蛍光標識ｄＮＴＰと
の結合状態を示す模式図である。
【図３】 図１の装置構成の一例を示す斜視図である。
【図４】 図３の反応流路部分の構成を拡大した斜視図
である。
【図５】 図３、４の反応部の構成を示す断面図であ
る。
【図６】 図３のポンプの構成を示す断面図である。
【図７】 図３の検出部の構成を示す構成図である。
【図８】 本発明の実施例２の分析手順を示すフローチ
ャート図である。
【符号の説明】
２０１…ＤＮＡサンプル、２０２…一本鎖ＤＮＡサンプ
ル、２０３…プライマー、２１０…混合試薬、２１１…
蛍光標識ｄＡＴＰ、２１２…蛍光標識ｄＣＴＰ、２１３
…蛍光標識ｄＴＴＰ、２１４…蛍光標識ｄＧＴＰ、３０
０…混合試薬槽、３０１…蛍光標識ｄＡＴＰ槽、３０２
…蛍光標識ｄＣＴＰ槽、３０３…蛍光標識ｄＴＴＰ槽、
３０４…蛍光標識ＧＴＰ槽、３１０…反応流路、３１１
…蛍光標識ｄＡＴＰ流路、３１２…蛍光標識ｄＣＴＰ流
路、３１３…蛍光標識ｄＴＴＰ流路、３１４…蛍光標識
ｄＧＴＰ流路、３２０…混合試薬ポンプ、３２１…蛍光
標識ｄＡＴＰポンプ、３２２…蛍光標識ｄＣＴＰポン
プ、３２３…蛍光標識ｄＴＴＰポンプ、３２４…蛍光標
識ｄＧＴＰポンプ、３３０…反応部、３３１…ガラス
板、３４１…蛍光標識ｄＡＴＰ注入口、３４２…蛍光標
識ｄＣＴＰ注入口、３４３…蛍光標識ｄＴＴＰ注入口、
３４４…蛍光標識ｄＧＴＰ従来技術注入口、３５０…排
出口、３６１…吸入口、３６２…吐出口、３６３…ダイ
アフラム、３６４…ポンプ室、３６５…吸入弁、３６６
…吐出弁、３６７…アクチュエーター、３７０…励起光
源、３７１…ピンホール、３７２…ダイクロイックミラ
ー、３７３…焦点レンズ、３７４…バンドパスフィルタ
ー、３７５…検出器、３８０…励起光、３８１…蛍光。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 33/53 33/58 Ａ 33/58 37/00 １０１ 37/00 １０１ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 三宅 亮 茨城県土浦市神立町502番地 株式会社日 立製作所機械研究所内 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 AA04 BA16 CA04 DA02 EA01 GA07 GB21 HA01 HA09 JA03 KA02 KA05 KA09 LA03 MA01 2G045 AA35 BA13 BB03 BB14 BB51 DA12 DA13 FA12 FA16 FB01 FB02 FB07 FB12 JA07 4B024 AA11 AA20 CA01 HA08 HA14 HA19 4B029 AA07 AA23 DG06 FA10 FA15 4B063 QA13 QQ42 QR08 QR13 QR62 QS25 QS34 QX02

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】プライマーが結合したＤＮＡサンプルに、
    ４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：ｄＡ
    ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を順次加え、
    前記ｄＮＴＰが前記ＤＮＡサンプルに結合した時のプラ
    イマーの伸長を順次検出してＤＮＡの配列を１塩基単位
    で決定する方法において、前記４種のｄＮＴＰにそれぞ
    れ蛍光色素を標識（以下、蛍光標識ｄＮＴＰという）す
    る手順、前記ＤＮＡサンプルに前記４種の蛍光標識ｄＮ
    ＴＰのいずれかを順次添加・反応させる手順、次にｄＮ
    ＴＰを分解する試薬を前記ＤＮＡサンプルに添加するこ
    とにより前記添加された蛍光標識ｄＮＴＰのうち未反応
    の蛍光標識ｄＮＴＰを分解・洗浄する手順、前記ＤＮＡ
    サンプルに光を照射し、前記ＤＮＡサンプルに結合した
    前記蛍光標識ｄＮＴＰから発する蛍光を検出する手順、
    を含むことを特徴とするＤＮＡ分析方法。
  2. 【請求項２】プライマーを伸長させる酵素と、未反応ｄ
    ＮＴＰを分解する試薬と、pＨを一定に保つ働きをもつ
    緩衝液を含む混合試薬に、４種の蛍光標識ｄＮＴＰ（ｄ
    ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）のいずれか
    を加えて混合し、該混合液の前記混合試薬と前記蛍光標
    識ｄＮＴＰを、プライマーが結合したＤＮＡサンプルが
    保持された反応流路内に供給して前記ＤＮＡサンプルと
    反応させる第１の手順と、 前記混合試薬を前記反応流路に流して未反応のｄＮＴＰ
    を分解・洗浄する第２の手順と、 前記ＤＮＡサンプルに光を照射し、蛍光の有無を検出し
    て、前記供給された蛍光標識ｄＮＴＰが前記ＤＮＡサン
    プルに結合し、プライマーが伸長したか否かを分析する
    第３の手順を有し、 前記第１〜３の手順を前記４種の蛍光標識ｄＮＴＰにつ
    いて順次繰り返すことを特徴とするＤＮＡ分析方法。
  3. 【請求項３】請求項１又は２において、４種のｄＮＴＰ
    が同一の蛍光色素により標識されていることを特徴とす
    るＤＮＡ分析方法。
  4. 【請求項４】請求項２において、４種の蛍光標識ｄＮＴ
    Ｐを、「ｄＡＴＰとｄＣＴＰ」或いは「ｄＡＴＰとｄＧ
    ＴＰ」から成る第１のグループと、「ｄＴＴＰとｄＧＴ
    Ｐ」或いは「ｄＴＴＰとｄＣＴＰ」からなる第２のグル
    ープに分け、前記グループ内の２種のｄＮＴＰを異なる
    蛍光色素で標識した後、一方のグループの２種の蛍光標
    識ｄＮＴＰと混合試薬を反応流路内でそれぞれ混合し
    て、前記第１〜３の手順を順次繰り返し、次に他方のグ
    ループの２種の蛍光標識ｄＮＴＰを用いて、前記と同様
    に第１〜３の手順を順次繰り返すことを特徴とするＤＮ
    Ａ分析方法。
  5. 【請求項５】請求項４において、第３の手順で、前記Ｄ
    ＮＡサンプルに２種の波長の光を照射することを特徴と
    するＤＮＡ分析方法。
  6. 【請求項６】請求項１〜５のいずれかにおいて、蛍光色
    素がｄＮＴＰの塩基に標識されていることを特徴とする
    ＤＮＡ分析方法。
  7. 【請求項７】請求項２において、プライマーを伸長させ
    る酵素は、TaqＤＮＡポリメラーゼ、TthＤＮＡポリメラ
    ーゼ、VentＤＮＡポリメラーゼ、サーモシーケナーゼの
    いずれかであり、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬は、Ａ
    ＴＰジホスファーゼ、ＡＴＰピロホスファーゼのいずれ
    かであり、また緩衝液は、トリス-塩酸、ＭgＣl2とディ
    チオスレイトールの混合液であることを特徴とするＤＮ
    Ａ分析方法。
  8. 【請求項８】請求項２において、前記混合試薬は酸化剤
    を含むことを特徴とするＤＮＡ分析方法。
  9. 【請求項９】プライマーを伸長させる酵素と、未反応ｄ
    ＮＴＰの分解試薬と、ｐＨを一定に保つ働きをもつ緩衝
    液を含む混合試薬に、４類の蛍光標識ｄＮＴＰ（蛍光標
    識ｄＡＴＰ、蛍光標識ｄＣＴＰ、蛍光標識ｄＧＴＰ及び
    蛍光標識ｄＴＴＰ）のいずれかを加えて両者を反応流路
    内で混合し、該混合液の前記混合試薬と前記４種の蛍光
    標識ｄＮＴＰを、プライマーが結合したＤＮＡサンプル
    と反応流路内で反応させる手順を４種の蛍光標識ｄＮＴ
    Ｐについて順次繰り返すための第１の手段と、 前記混合試薬と前記蛍光標識ｄＮＴＰを前記ＤＮＡサン
    プルに反応流路内で反応させた後、前記混合試薬を前記
    反応流路に流して、反応流路内に残留する前記未反応ｄ
    ＮＴＰを分解・洗浄するための第２の手段と、 前記混合試薬と前記蛍光標識ｄＮＴＰを前記ＤＮＡサン
    プルに反応流路内で接触、反応させ、次に前記混合試薬
    を前記反応流路に流して、反応流路内に残留する前記未
    反応ｄＮＴＰを分解・洗浄した後、前記ＤＮＡサンプル
    に励起光を照射し、蛍光を検出する第３の手段と、を備
    えることを特徴とするＤＮＡ分析装置。
  10. 【請求項１０】プライマーを伸長させる酵素と、未反応
    ｄＮＴＰの分解試薬と、pＨを一定に保つ働きをもつ緩
    衝液とを含む混合試薬を保管する混合試薬槽と、４種の
    蛍光標識ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及び
    ｄＴＴＰ）のそれぞれを個別に保管する４つの蛍光標識
    ｄＮＴＰ槽と、前記混合試薬槽に接続された反応流路
    と、該反応流路と前記４つの蛍光標識ｄＮＴＰ槽とをそ
    れぞれ接続する４本の蛍光標識ｄＮＴＰ流路と、前記各
    槽に保管された流体を前記反応流路にそれぞれ供給する
    ポンプと、前記反応流路に設けられＤＮＡサンプルが固
    定された反応部と、前記反応流路の下流側に設けられ混
    合試薬或いは蛍光標識ｄＮＴＰを排出するための排出口
    と、前記反応流路における、前記ＤＮＡサンプルと前記
    蛍光標識ｄＮＴＰとの結合を検出する蛍光検出部とを備
    えていることを特徴とするＤＮＡ分析装置。
  11. 【請求項１１】請求項９又は１０において、前記反応部
    は、アミノ基がコーティングされたガラス板にＤＮＡサ
    ンプルが固定されたものであることを特徴とするＤＮＡ
    分析装置。
  12. 【請求項１２】請求項１１において、反応部は複数に区
    画されたガラス板に異なるＤＮＡサンプルが固定されて
    いることを特徴とするＤＮＡ分析装置。
  13. 【請求項１３】請求項９〜１２のいずれかにおいて、反
    応部は反応流路に対し脱着可能に構成されていることを
    特徴とするＤＮＡ分析装置。
  14. 【請求項１４】プライマーが結合したＤＮＡサンプル
    に、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
    びｄＴＴＰ）を順次加え、前記ｄＮＴＰが前記ＤＮＡサ
    ンプルに結合した時のプライマーの伸長を順次検出して
    ＤＮＡの配列を１塩基単位で決定するＤＮＡ分析方法に
    おいて、前記４種のｄＮＴＰにそれぞれ発光色素を標識
    してから、前記ＤＮＡサンプルに前記４種の光標識ｄＮ
    ＴＰを順次添加して反応させ、次にｄＮＴＰの分解試薬
    を前記ＤＮＡサンプルに添加することにより、前記添加
    された光標識ｄＮＴＰのうち未反応の光標識ｄＮＴＰを
    分解・洗浄した後、前記ＤＮＡサンプルに光を照射し、
    前記ＤＮＡサンプルに結合した前記光標識ｄＮＴＰの発
    光を検出することを特徴とするＤＮＡ分析方法。
  15. 【請求項１５】プライマーを伸長させる酵素と、未反応
    ｄＮＴＰの分解試薬と、緩衝液とを含む混合試薬に、４
    種の光標識ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
    びｄＴＴＰ）のいずれかを加えて混合し、該混合液の前
    記混合試薬と前記光標識ｄＮＴＰを前記ＤＮＡサンプル
    が保持された反応流路内に供給して接触させ反応させる
    第１の手順と、前記混合試薬を前記反応流路に流して未
    反応のｄＮＴＰを分解・洗浄する第２の手順と、前記Ｄ
    ＮＡサンプルに光を照射し、発光の有無を検出する第３
    の手順とを有し、前記の第１〜３手順を前記４種の光標
    識ｄＮＴＰについて繰り返すことを特徴とするＤＮＡ分
    析方法。
  16. 【請求項１６】プライマーを伸長させる酵素と、未反応
    ｄＮＴＰの分解試薬と、緩衝液を含む混合試薬に、４類
    の光標識ｄＮＴＰ（光標識ｄＡＴＰ、光標識ｄＣＴＰ、
    光標識ｄＧＴＰ及び光標識ｄＴＴＰ）のいずれかを加え
    て両者を反応流路内で混合し、該混合液の前記混合試薬
    と前記４種の光標識ｄＮＴＰを、プライマーが結合した
    ＤＮＡサンプルと反応流路内で反応させる手順を４種の
    光標識ｄＮＴＰについて順次繰り返すための第１の手段
    と、 前記混合試薬と前記光標識ｄＮＴＰを前記ＤＮＡサンプ
    ルに反応流路内で反応させた後、前記混合試薬を前記反
    応流路に流して、反応流路内に残留する前記未反応ｄＮ
    ＴＰを分解・洗浄するための第２の手段と、 前記混合試薬と前記光標識ｄＮＴＰを前記ＤＮＡサンプ
    ルに反応流路内で接触、反応させ、次に前記混合試薬を
    前記反応流路に流して、反応流路内に残留する前記未反
    応ｄＮＴＰを分解・洗浄した後、前記ＤＮＡサンプルに
    励起光を照射し、光を検出する第３の手段と、を備える
    ことを特徴とするＤＮＡ分析装置。
  17. 【請求項１７】シリコン基板上に、少なくとも１本の反
    応流路を有し、該反応流路は蛍光標識ｄＡＴＰ注入口、
    蛍光標識ｄＣＴＰ注入口、蛍光標識ｄＴＴＰ注入口、蛍
    光標識ｄＧＴＰ注入口を介して前記４種類の蛍光標識ｄ
    ＮＴＰ注入口に対応する蛍光標識ｄＡＴＰ流路、蛍光標
    識ｄＣＴＰ流路、蛍光標識ｄＴＴＰ流路、蛍光標識ｄＧ
    ＴＰ流路に連通しており、更に、前記４種類の蛍光標識
    ｄＮＴＰ注入口の下流側にＤＮＡサンプルと前記４種の
    蛍光標識ｄＮＴＰを順次添加して反応させる反応部及び
    排出口を有することを特徴とする反応流路部品。
  18. 【請求項１８】請求項１７において、反応流路は断面形
    状が幅０．１〜５ｍｍ、深さ０．０５〜０．５ｍｍであ
    り、流路長が１０〜１００ｍｍ、流路内容積が１００μ
    ｌ以下であることを特徴とする反応流路部品。
  19. 【請求項１９】請求項１７において、反応流路は蛍光標
    識ｄＮＴＰ流路の断面形状が幅０．５ｍｍ、深さ０．２
    ｍｍであり、流路長が１０ｍｍ、流路内容積が１μｌで
    あることを特徴とする反応流路部品。
  20. 【請求項２０】請求項１７において、サンプルと４反応
    部はガラス板の表面にアミノ基を有するコーティング層
    を介してＤＮＡサンプルが固定され、前記ガラス板によ
    り反応流路を覆う構造であることを特徴とする反応流路
    部品。
  21. 【請求項２１】ＤＮＡ分析の蛍光標識に用いる蛍光色素
    に応じて波長選択が可能な励起光源、該励起光源が発し
    た励起光を点光源に絞るピンホール部Ａ、前記励起光を
    反射するダイクロイックミラー、該ダイクロイックミラ
    ーを反射した光を反応部に収束する焦点レンズ、前記収
    束された励起光の照射によりＤＮＡ種の蛍光標識ｄＮＴ
    Ｐ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）のい
    ずれかを順次添加して反応させる反応部、該反応部から
    励起された蛍光を前記ダイクロイックミラーを透過させ
    たのち該蛍光の特定の領域の周波数にカットするバンド
    パスフィルター、前記励起光の焦点以外の位置から発せ
    られた蛍光を遮断するピンホール部Ｂ、及び該ピンホー
    ル部Ｂを透過した蛍光を検出する検出器を有することを
    特徴とするＤＮＡ分析装置。
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