JP4727109B2 - 核酸を配列決定する方法 - Google Patents
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Description
(発明の分野)
本発明は、核酸配列決定方法および装置に関連する。
【0002】
(発明の背景)
多くの疾患が特定のDNA配列と関連性を持っている。多くの場合、疾患状態に関連するDNA配列が非−患者において対応するDNA配列と異なることを示すために、そのようなDNA配列をDNA配列多型と呼ぶ。DNA配列多型には、例えば、第二の配列と比較して、ある配列においてヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。特定のDNA配列多型の例は、ヒトゲノムのある特定位置にある5’−ATGG−3’配列と比較した場合の、5’−ATCG−3’である。前者配列の第一の「G」ヌクレオチドが後者配列でヌクレオチド「C」に置換されている。後者配列は、特定の疾患状態に関係するもので、一方前者は非−疾患状態の個体において見出される。従って、ヌクレオチド配列5’−ATCG−3’の存在は、その個体が特定疾患を持つことを示す。この特定タイプの配列多型は、その配列の相違が1個のヌクレオチドでの変化によるということから、一ヌクレオチド他型、またはSNPとして公知である。
【0003】
従って、DNA一塩基変化のような小さな変化の迅速な検出を可能にする技術は、遺伝的解析を利用するためには重要な方法論である。ヒトゲノムの大きさは30億塩基対のオーダーというように大きいため、多型を同定する技術は、潜在的に大きい核酸群中で多型を含む配列を特異的に同定するために十分に感度が高くなければならない。
【0004】
典型的に、個体からDNAを単離し、例えばDNAを制限酵素で消化し、および/または単離DNAにおいて配列の一部を増幅するなど、単離DNAを処理することによりDNA配列多型解析を行う。次に、処理したDNAに対して、特定の配列が存在するか否かを決定するためにさらに解析を行う。
【0005】
通常使用されるDNA解析手順には、電気泳動が含まれる。電気泳動を行う際に通常適用するものには、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動が含まれる。ゲルにDNA配列を挿入またはロードし、電場をかける。DNAは同一の負電荷を帯びているため、配列の長さ、3次元立体配座および電場をかける際のゲルマトリックス比との相互作用を含む性質に基づいてゲル上を移動する。殆どの適用において、小さなDNA分子ほど、大きな断片よりも速くゲルを移動する。電気泳動を十分な時間行った後、最初のDNA配列群中のDNA分子は、それらの持つ相対的大きさに従って分離される。
【0006】
次に、様々な検出方法を使用して特定のDNA分子が検出され得る。ある適用に対して、特定DNA分子に結合した放射活性標識など、検出可能なタグの存在により特定のDNA配列を同定する。
【0007】
電気泳動を基にした分離解析は、多数の核酸試料に対する特定の配列多型検出を目的とした、迅速で、経済的、および正確な解析が所望される場合に用いる方法としては、あまり望ましいとは言えない。例えば、電気泳動を基にした解析は、多量のインプットDNAが必要とされ得る。さらに、多数の試料を処理する場合、電気泳動を基にした核酸解析は労力を要する。さらに、これらの技術においては、相当の額に上り得るコストで、電気泳動前に調製しなければならない同一のDNA分子試料が必要とされ得る。
【0008】
最近、自動化電気泳動システムが利用可能となっている。しかしながら、高いスループットを有する比較的コスト効率のよいユニットを必要とする臨床での配列決定等に適用する場合、電気泳動は不適当であり得る。従って、配列決定のための電気泳動不要である方法の必要性が大きい。多くの適用に関して、DNA配列解析と組み合わせて電気泳動が用いられている。
【0009】
電気泳動を基にした配列決定の代替法のいくつかが記述されている。これらには、走査型トンネル電子顕微鏡、ハイブリダイゼーションによる配列決定および一分子検出法が含まれる。
【0010】
電気泳動を基にした分離に対する別の代替法は、固体基板解析を基にした核酸解析である。これらの方法は、典型的に、固体支持体の異なる場所に付着させた多数の核酸プローブを用いるものである。これらの固体支持体には、例えば、ガラス面、プラスティックマイクロタイタープレート、プラスティックシート、薄ポリマー、または半導体が含まれ得る。そのプローブは、例えば、吸着または共有結合的に支持体に結合し得る。または、マイクロカプセルに入れて取り込まれるか、あるいは基板膜またはフィルム中に取り込まれ得る。
【0011】
基板を基にした核酸解析には、固体支持体に結合しているプローブのアレイに対して、特定の配列多型を含むことが分かっているか、または疑いがある試料核酸の適用が含まれ得る。核酸群中のその核酸を、もし存在するならば、基板に結合した相補的配列とハイブリダイゼーションさせることが可能である。次いで、ハイブリダイゼーションしている核酸配列を検出ステップにて検出する。
【0012】
固体支持体マトリックスを基にしたハイブリダイゼーションおよび配列決定方法は、試料DNA濃度が高いことが要求され得、核酸試料の固定化オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション速度論が相対的に遅いことによる妨害が起こり得る。多くの場合、少量の鋳型DNAのみが利用可能で、標的核酸配列が高濃度であることが望ましくあり得る。従って、基板を基にした検出解析には、多くの場合、標的核酸のコピーまたは標的核酸における配列の一部を増幅するステップが含まれる。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を基にした方法は、例えば、溶液中で数オーダーの程度で少量のプローブ標的を増加させ得る。しかしながら、増幅DNAが固体支持体マトリックスの表面上に固定化されないことから、固相アプローチにPCRを組み入れることは困難であり得る。
【0013】
固相を基にした配列多型検出が記載されてきた。その例は、固相原理に基づいた「ミニ−配列決定」プロトコールで、Hultmanら、1988.Nucl.Acid.Res.17:4937−4946;Syvanenら、1990.Genomics 8:684−692に記載されている。この研究において、放射性標識ヌクレオチド取り込みが測定され、ヒトアポリポタンパク質E遺伝子の3つの対立遺伝子多型の解析に使用される。しかしながら、そのような放射活性法は、通常の臨床適用にはあまり適切ではなく、そのため、迅速なDNA配列解析のための単純で、高感度の非放射活性方法の開発がまた、大きな関心である。
【0014】
(発明の要旨)
本発明は、部分的に、固体基板に結合した核酸の配列を決定するための高感度な方法および核酸配列解析に役立つ新規な基板の発見に基づく。
【0015】
従って、1つの局面において、本発明は、核酸を解析するための基板を含む。この基板は、一つ以上の核酸配列を結合した光ファイバー面を含む。光ファイバー面は、例えば、光ファイバー開口部の半球状エッチングなどのように空洞化され得る。この基板は、さらに、一つ以上の面にプライマーが結合している束状化した複数の光ファイバー面を含み得る。
【0016】
別の局面において、本発明は、核酸配列を解析するための装置を含む。この装置は、試薬送達チャンバー(例えば、灌流チャンバー)(ここで、このチャンバーは核酸基板を含む)、灌流チャンバーと連絡するコンジット、灌流チャンバーと連絡するイメージングシステム(例えば光ファイバーシステム)、およびイメージングシステムと連絡するデータ回収システムを含み得る。基板は平坦基板であり得る。他の実施形態において、この基板はその末端に結合された核酸配列を有する前述の光ファイバー面であり得る。
【0017】
さらなる局面において、本発明は、核酸配列を決定する方法を含む。この方法は、開始アンカープライマー環状鋳型複合体の提供、および複合体のポリメラーゼとの結合、および環状鋳型の連結した直鎖状相補的コピーを生成するために必要なヌクレオチドが含まれる。延長アンカープライマー−環状鋳型複合体は溶液中で生成され得、次いで固体面に連結され得る。あるいは、一つ以上の核酸アンカープライマーは、固体支持体に連結され得、次いで複数の環状核酸鋳型にアニールされ得る。次に、連結された核酸アンカープライマーは、一本鎖環状鋳型とアニールされ、開始プライマー−環状鋳型複合体を生じる。
【0018】
開始配列決定プライマー−環状核酸鋳型複合体を得るために、配列決定プライマーは環状核酸鋳型とアニールされる。配列決定プライマーのアニールは、延長アンカープライマーの固体基板との結合の前または後に行われ得る。配列決定生成物および配列決定反応副生成物(例えば、無機ピロホスフェート)を生成させるために、この配列プライマーは、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三ホスフェートを用いて伸長される。所定のヌクレオチドがプライマーに取り込まれている場合、その配列決定反応副生成物が生成され、次いで同定され、これによって核酸配列が決定する。所定のヌクレオチドが配列決定プライマーに複数回取り込まれている場合(例えば、連結核酸鋳型が複数の同一ヌクレオチドを有する場合)、取り込まれたヌクレオチド数を決定するために、配列決定反応副生成物の量または濃度が測定される。必要ならば、さらなる所定のヌクレオチド三ホスフェートが添加され得(例えば、連続的に)、そしてそれぞれの反応と関連する配列副生成物の存在または非存在が決定され得る。
【0019】
なおさらなる局面において、本発明は、光ファイバー面基板(例えば、上記で議論された固体基板)に連結した複数のアンカープライマーに連結した1つ以上の核酸アンカープライマーの提供による核酸配列決定法を含む。
【0020】
本明細書中で記載される装置および方法の様々な実施形態において、固体基板は、約10μm〜約200μm、50μm〜約150μm、100μm〜約150μm、または150μm離れている2つ以上の固定されているプライマーを含む。固体支持体マトリックスは、固体支持体に共有結合している複数のパッドを含み得る。パッドの表面積は、例えば10μm2であり得、1つ以上のパッドが、互いに約50μm〜約150μmの範囲の距離で離れ得る。
【0021】
好ましい実施形態において、少なくとも環状核酸鋳型の部分は一本鎖DNAである。環状核酸鋳型は、例えば、ゲノムDNAまたはRNA、またはそのcDNAコピーであり得る。環状核酸は、例えば10〜10,000または10〜1,000、10〜200、10〜100、10〜50、あるいは20〜40ヌクレオチド長であり得る。
【0022】
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応により核酸群における1つ以上の環状核酸の複数のコピーが産生される。他の実施形態において、アニールした環状核酸鋳型の一本鎖コンカテマーを生成するために、ローリングサークル増幅(RCA)により開始環状鋳型が伸長される。必要ならば、この鋳型は、ローリングサークル増幅により増幅され、そして開始コンカテマー鋳型を生成させるために一本鎖コンカテマーとリバースプライマーをアニールさせ、そしてコンカテマー鋳型の複数コピーを産生するためにポリメラーゼ酵素と開始コンカテマー鋳型を結合させることによって、さらに増幅される。なおさらなる実施形態において、その鋳型は、PCRおよびRCA−増幅の組み合わせによって伸長され得る。
【0023】
好ましい実施形態において、解析する配列決定副生成物はピロホスフェートである。検出された副生成物としてピロホスフェートが使用される場合、開始配列決定プライマーの伸長においてポリメラーゼによる利用のための好ましいヌクレオチド三ホスフェートは、dATPアナログ(例えば、α−チオATP)である。
【0024】
好ましくは、ATPを形成するために十分な条件下で配列決定副生成物をATPスルフリラーゼと接触させることにより、ピロホスフェートが検出される。次に、例えば、ATPとの反応で検出可能な生成物を生じる酵素を用いて、ATPが検出され得る。ATP検出に好ましい酵素はルシフェラーゼである。必要ならば、本明細書中の様々な反応物の添加の間に洗浄バッファーが使用され得る。好ましくは、例えば配列決定プライマーを伸長するために使用した未反応dNTPを除去するために、アピラーゼが使用される。洗浄バッファーは、必要に応じてアピラーゼを含み得る。
【0025】
本明細書中で使用される反応物および酵素(例えば、ATPスルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびアピラーゼ)は、固体面に結合され得る。
【0026】
アンカープライマー配列は、例えば固体支持体に結合したアビジン基を経由して固体支持体とアンカープライマーを連結し得るビオチン基を含み得る。いくつかの実施形態において、アンカープライマーは、ビオチン−ウシ血清アルブミン(BSA)部分と結合体化する。ビオチン−BSA部分は、固体支持体上でアビジン−ビオチン基と連結され得る。必要であれば、アンカープライマー上のビオチン−BSA部分は、シラン存在下で固体支持体上のBSA基と連結され得る。
【0027】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、少なくとも1つの光ファイバーを含むる。
【0028】
本発明はまた、細胞中に存在するmRNA転写物濃度を追跡(profile)する方法を提供する。転写物の同一性は、その3’末端の配列(同一の3’配列を持つスプライシング変異体間で区別するために、さらなる断片が使用され得る)によって決定され得る。一回の作動で10,000部位を有する配列決定装置が、1:10,000以上の濃度で存在するmRNA種を決定し得る。複数回の作動または複数のデバイスは、限度を容易に1:100,000または1:1,000,000にまで拡張し得る。検出限界が1:10,000〜1:100,000の範囲であるマイクロアレイハイブリダイゼーションなどのような最新の技術よりも、この性能は優れている。
【0029】
さらなる実施形態において、RNA合成副生成物を使用して増幅された核酸の配列が決定され得る。この実施形態において、環状核酸鋳型ライブラリーに存在するプロモーター配列からRNA転写物が産生される。適切なプロモーター部位およびその同種のRNAポリメラーゼは、E.coli由来のRNAポリメラーゼ、バクテリオファージT3由来のRNAポリメラーゼ、バクテリオファージT7由来のRNAポリメラーゼ、バクテリオファージSP6由来のRNAポリメラーゼ、ブロモウイルス、トバモウイルス、トンブスウイルス、レンチウイルス、C型肝炎様ウイルスおよびピコマウイルスのウイルス属由来のRNAポリメラーゼを含む。RNA転写物の配列を決定するために、所定のNTP、つまりATP、CTP、GTPまたはUTPをRNAポリメラーゼ存在下で鋳型とインキュベーションする。本明細書で考察される酵素的検出を用いてPPiの存在についてのアッセイによって、新生RNA鎖への試験NTPの取り込みが決定され得る。
【0030】
本発明の1つ以上の実施形態の開示は、下記の記述で明らかになる。本発明の実施または試験において、本明細書中で記述されている方法および物質と同様のまたは同等の任意の方法および物質が使用され得るが、好ましい方法および物質を記述する。この記載および特許請求の範囲から、本発明の他の特色、目的および長所が明らかとなる。本明細書および添付の特許請求の範囲において、その状況が明らかに他のように示さない限り、単数形には複数の指示物が含まれる。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、この発明が属する分野の当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。他に特別に述べない限り、本明細書中で用いたかまたは考慮された技術は、当業者に既知の標準的方法である。実施形態の例は、例示の目的のみである。この明細書中で引用される全ての特許および刊行物は、参考として援用される。
【0031】
(発明の詳細な説明)
本発明は、引き続く分析(例えば、配列決定)のための核酸配列を調製する方法、ならびに核酸の配列決定のための方法および装置を提供する。
【0032】
本明細書中で記載される方法は、標的核酸に相補的な1つ以上のコピーを含む核酸に共有結合する複数のアンカープライマーを含む固体基板アレイを作製する、試料調製プロセスを含む。共有結合したアンカープライマーおよび標的核酸の1つ以上のコピーの形成は、好ましくは、環状核酸の相補的領域へのアンカープライマーのアニール、次いで環状核酸と相補的な配列の1つ以上のコピーを含む核酸形成をもたらすための、ポリメラーゼを用いたアニール済みアンカープライマーの伸長によって生じる。
【0033】
固体基板へのアンカープライマーの結合は、アニール済みアンカープライマーの伸長前、その間、またはそれに続いて起こり得る。従って、1つの実施形態において、アンカープライマーを標的核酸とアニールさせポリメラーゼ存在下で伸長させた後、1つ以上のアンカープライマーが固体基板に連結される。あるいは、第二の実施形態において、アンカープライマーがまず標的核酸とアニールされ、アニール済みアンカープライマーの3’OH末端がポリメラーゼで伸長される。次に、伸長されたアンカープライマーが、固体面に連結される。アンカープライマー配列を変化させることにより、核酸群の中に存在する別個の標的核酸を特異的に増幅させることが可能である。
【0034】
標的核酸における配列は、多くの方法で同定され得る。好ましくは、配列決定プライマーは、増幅された核酸とアニールされ、そして配列決定生成物を生成するために使用される。配列生成物のヌクレオチド配列が次に決定され、それにより核酸の決定が可能となる。
【0035】
本明細書中で記述している本方法および装置によって、まず核酸をクローニングする必要なく核酸配列情報の決定が可能になる。さらに、本方法は非常に感度が高く、初めの核酸群中に数コピーしか存在しない鋳型核酸のヌクレオチド配列決定に使用し得る。
【0036】
記述する本方法および装置は、一般的に、任意の特定核酸配列の同定を目的とした任意の適用に対して有用である。例えば、本方法によって、一ヌクレオチド多型(SNP)、ある一つの染色体上で複数のSNPまたは他の多型を持つハプロタイプ、および転写特性の同定が可能となる。他の用途には、その試料からの遺伝子発現特性を決定する目的で任意の発生段階または環境状態の単一の細胞、組織全体、生物からcDNA配列を得るためだけでなく、一次配列を確認または引き出すために、または特定の突然変異クローンをランダム突然変異誘発スクリーニングから単離するために、人工DNA構成物の配列を決定することが挙げられる。さらに、本方法により、任意の源から単離された任意の大きさのPCR産物および/またはクローン化DNA断片の配列決定が可能になる。
【0037】
酵素、放射線または化学処理(例えばクロマチンの部分的DNase処理)に対するその異なる感受性を利用した高次DNA構造を調べる解析技術により生じたDNA断片の配列決定、または、ポリメラーゼにより認識される有効塩基としてメチル−シトシンをチミン(または他のヌクレオチド)に置換する化学物質による前処理をして、または前処理なしである組織から生じた配列を比較することによりDNAのメチル化状態を決定するためにも本発明の本方法をまた使用し得る。さらに、一次配列レベルにおいて、発生段階または加齢の進行中に起こる細胞の生理的変化をアッセイするために、本発明の方法を使用し得る。
【0038】
(核酸配列決定法)
(アンカープライマーの構造)
一般的にアンカープライマーには、1つのストーク領域と少なくとも2つの相接するアダプター領域が含まれる。ストーク領域はアンカープライマーの5’末端に存在し、アンカープライマーを固体基板に結合させるヌクレオチド領域が含まれる。
【0039】
一般的にアンカープライマーには、核酸配列群中の一つ以上のメンバーに存在する相補的配列とハイブリダイズする領域が含まれる。ある実施形態において、アンカープライマーには、標的核酸配列の別々の末端にライゲーションされた相補的領域とハイブリダイズする二つの隣接する領域が含まれる。この実施形態を図1で説明する。より詳細な考察を下記で行う。
【0040】
ある実施形態において、アンカープライマーのアダプター領域は、第二の核酸配列に存在する配列の非−相接領域と相補的である。それぞれのアダプター領域は、例えば、一つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いた消化により生じた断片のそれぞれの末端と相同的であり得る。その断片には、例えば、配列多型が含まれていることが分かっている、または疑わしい配列が含まれ得る。
【0041】
別の実施例において、アンカープライマーには、標的核酸配列のギャップ領域、すなわち、一つ以上のヌクレオチドの欠失により非相接的である領域、と相同性のある二つのアダプター領域が含まれ得る。これらの配列を持つアダプター領域を使用する場合、ギャップ配列に相当する一列に並んだオリゴヌクレオチドを、鋳型核酸分子群とともに、アンカープライマーとアニールさせ得る。
【0042】
アンカープライマーには、必要に応じて、例えば一つ以上の制限酵素認識部位、RNAポリメラーゼ結合部位(例えばT7プロモーター部位)などのさらなるエレメントが含まれ得る。
【0043】
一つ以上のアダプター領域には、例えば制限酵素認識部位または、例えば既知の遺伝子に存在する配列など、同定されたDNA配列に存在する配列が含まれ得る。一つ以上のアダプター領域にはまた、フランク配列多型として知られている配列も含まれ得る。配列多型には、二つの、その他の点では同一の核酸配列の間で配列の相違をもたらすヌクレオチド置換、挿入、欠失または他の再編成が含まれる。配列多型の例は、一ヌクレオチド多型(SNP)である。
【0044】
(固体支持体に対するアンカープライマーの結合)
一般的に、塩基対合可能な任意の核酸をアンカープライマーとして使用し得る。ある実施形態において、アンカープライマーはオリゴヌクレオチドである。本明細書中で利用する場合に、オリゴヌクレオチドなる用語には、モノマー−モノマー相互作用の通常のパターンで標的ポリヌクレオチドに特異的に結合可能な、天然の線状オリゴマーまたは改変モノマーまたは結合(例えばデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、そのアノマー型、ペプチド核酸(PNAs)など)が含まれる。これらの型の相互作用には、例えば、Watson−Click型の塩基対合、塩基スタッキング、Hoogsteenまたは逆−Hoogsteen型の塩基対合などが含まれ得る。一般的に、大きさの範囲が例えば3〜200、8〜150、10〜100、20〜80または25〜50のモノマー単位のオリゴヌクレオチドを形成するために、ホスフェートジエステル結合、またはそのアナログによりモノマーを結合させる。オリゴヌクレオチドが文字の配列で示されている時はいつでも、本明細書中で他に言及しない限り、ヌクレオチドは、左から右に5’→3’の方向を向いており、“A”なる文字はデオキシアデノシンを示し、“T”なる文字はチミジン、“C”なる文字はデオキシシトシン、および“G”なる文字はデオキシグアノシンを示すと理解される。本発明のオリゴヌクレオチドには、非天然ヌクレオチドアナログが含まれ得る。しかしながら、例えば、酵素によるプロセシングが必要である場合などには、生物学的機能を維持するためには天然に存在するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが一般的に必要とされる。
【0045】
支持体面がプライマーを安定的に結合可能で核酸配列の検出が可能である限り、固体支持体物質として任意の物質を使用し得る。固体支持体物質は、平坦であるかまたは空洞(例えば、光ファイバーの空洞化末端において)であり得る。ある実施形態において、固体支持体は、例えばガラスなど光学的に透明である。
【0046】
固体支持体の上または中に存在させるためにアンカープライマーを固体支持体に結合させ得る。ある実施形態において、複数のアンカープライマーを固体支持体に結合させ、それらをアレイ中に一定の間隔で配置する。プライマー間の間隔は好適には、検出前に配列決定反応生成物が拡散する平方自乗平均距離、または検出システムの光学解像度のどちらかより大きい。これら両方については下記で詳述する。固体支持体上のプライマー間の距離は、例えば10〜400μm、50〜150μm、100−150μmまたは150μmであり得る。
【0047】
光学的に透明な固体支持体における結合部位のアレイを、例えば、米国特許第5,5143,854号、第5,445,934号、第5,744,305号および第5,800,992号;Cheeら、Science 274:610−614(1996);Fodorら、Nature 364:555−556(1993);Fodorら、Science 251:767−773(1991);Gushinら、Anal.Biochem.250:203−211(1997);Kinositaら、Cell 93:21−24(1998);Kato−Yamadaら、J.Biol.Chem.273:19375−19377(1998);およびYasudaら、Cell 93:1117−1124(1998)で記述されている接着技術などで説明されているように、電子集積回路を構築する時に通常使用されているリトグラフィック技術を用いて構築し得る。フォトリトグラフィーおよび電子ビームリトグラフィーにより、改変生体分子(例えば蛋白質または核酸)の結合を可能にする結合基のついた固体支持体または基板を増感する。例えば、Service,Science283:27−28(1999);Rai−Choudhury、HANDBOOK OF MICROLITHOGRAPHY,MICROMACHINING,AND MICROFABRICATION(マイクロリトグラフィー、マイクロマシーニング、マイクロファブリケーションハンドブック),VOLUME I:MICROLITHOGRAPHY,VOLUME PM39,SPIE Press(1997)を参照すること。あるいは、Zasadzinskiら、Science263:1726−1733(1994)で記述しているような薄膜技術を使用して、増感部位のアレイを生成し得る。これらの特許および出版物の全ての内容をそのまま参考として援用する。
【0048】
増感部位の固体基板にアンカープライマーを結合させる。結合したプライマーを含む固体基板の領域はアンカーパッドである。従って、固体支持体における増感状態を規定することにより、アンカーパッドのアレイまたはマトリックスの形成が可能となる。アンカーパッドは、例えば固体支持体上に均等に一定間隔を保ってエッチングされた小さな直径のスポットであり得る。
【0049】
共有結合または非共有結合相互作用を経由してアンカープライマーを固体支持体に結合させ得る。一般的に、当該分野で認識される任意の結合を使用し得る。当該分野で一般的なそのような結合の例には、任意の適切な金属(例えば、Co2+、Ni2+)−ヘキサヒスチジン複合体、例えばNEUTRAVIDINTM改変アビジン(Pierce Chemicals,Rockford,IL)などのビオチン結合蛋白質、ストレプトアビジン/ビオチン、アビジン/ビオチン、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)/グルタチオン、モノクローナル抗体/抗原、およびマルトース結合蛋白質/マルトース、およびプルロニックカップリング技術が含まれる。0,1、または複数の分子がそれぞれの増感部位に結合するように、適切なタグを含む試料を増感基板とインキュベーションする。
【0050】
一つのビオチン−(ストレプト)アビジンを基にしたアンカー法では、固体面で乾燥させた光活性化し得るビオチンアナログの薄層を使用する(HengsakulおよびCass,1996.Biocongjugate Chem.7:249−254)。次に、活性化ビオチンの規定エリアを生成させるために、ビオチンアナログを、マスクを通して白色光に曝露する。次にアビジン(またはストレプトアビジン)を添加し、活性化ビオチンとの結合を行う。アビジンは、ビオチン−(ストレプト)アビジン結合を通してビオチン化オリゴヌクレオチドを“アンカーする”ために利用可能な遊離ビオチン結合部位を保持している。
【0051】
あるいは、光−切断性保護基を保持するビオチン誘導体で固体支持体にアンカープライマーを結合させ得る。この部分は共有結合で、例えば、ガラス面などの固体支持体に結合しているウシ血清アルブミン(BSA)と結合している。PirrungおよびHuang,1996.Bioconjugate Chem.7:317−321を参照すること。次いで、規定照射エリア内で活性化ビオチンを生成させるためにマスクを使用する。次に、アビジンを照射エリアに局在させ、続いてビオチン化DNAをBSA−ビオチン−アビジン−ビオチン結合で結合させ得る。必要であれば、規定領域に結合しているBSAが局在するようにパターン化され得る二酸化ケイ素シラン面上の自己組織化単層にシランの中間層を置く。例えば、Mooneyら、1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:12287−12291を参照すること。
【0052】
プルロニックに基づいた結合において、最初に、プルロニック化合物としても公知のポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシドトリブロック共重合体の末端にアンカープライマーを結合させる。アンカープライマーを固体基板に結合させるためにプルロニック部分を使用し得る。
【0053】
疎水性面とポリプロピレンオキシドとの間の反応により、疎水性面に対してプルロニックが結合する。残りのポリエチレンオキシド基は表面に伸長し、それにより親水性環境を生成する。ヘキサヒスチジンタグ付きアンカープライマーの結合を可能にするために、ポリエチレンオキシド鎖の末端にニトリロトリ酢酸(NTA)を共役させ得る。その他の実施形態において、ピリジルジスルフィド(PDS)をポリエチレン鎖の末端に共役させ、ジスルフィド結合を介したチオール化アンカープライマーの結合を可能にさせ得る。1つの実施形態において、プルロニックF108(BASF Corp.)を結合に使用する。
【0054】
固体支持体上のそれぞれの増感部位は、潜在的に複数のアンカープライマーと結合可能である。従って、それぞれのアンカーパッドには、一つ以上のアンカープライマーが含まれ得る。一個の生産的反応中心のみを持つパッド数(例えば、伸長反応後に、アンカープライマーから伸長した一つの配列のみを持つパッド数)を最大化することが好適である。このことは、(i)表面全体を洗浄したビオチン化アンカープライマーの希釈率を変化させること;(ii)ビオチン化プライマーをアビジン面と接触させるインキュベーション時間を変化させること;または、(iii)概して、配列決定鋳型を生成させるためにそれぞれのパッドのただ一つのプライマーのみを伸長させるように、開裂環または閉鎖環状鋳型濃度を変化させること、が含まれるがこれらに限らない技術により行われ得る。
【0055】
いくつかの実施形態において、それぞれ個々のパッドには、ただ一つの結合アンカープライマーが含まれる。概して、唯一つのアンカープライマーがそれぞれのパッドに置かれるように、固体支持体上で選択したアンカープライマーに対する限界希釈法を行うことにより、唯一つのアンカープライマーを持つパッドを生成し得る。例えば、ポワソン分布モデルを利用してパッドに適用すべきアンカープライマーの濃度を計算し得る。
【0056】
一つのアンカープライマーを含む反応パッド数を最大化するために、アンカープライマー濃度の範囲または環状鋳型濃度の範囲を変化させるように連続希釈実験を行う。プライマーの高度希釈濃度において、プライマーおよび同じパッドに結合する環状鋳型は互いに独立し、ポワソン分布により任意の一つのパッドで伸長したアンカープライマー数が特徴付けられる。実際に伸長させるプライマー数は多様であるが、最高で37%のパッドが一個の伸長アンカープライマー(一個のアンカーオリゴヌクレオチドを持つパッド数)を持つ。この数は次のようにして獲得し得る。
【0057】
Npをパッド上の平均アンカープライマー数とし、fをアンカープライマーが環状鋳型で伸長する確率とする。次に、パッドあたりの平均伸長アンカープライマー数はNpfであり、量aとして規定する。実際に伸長するプライマー数は多様である。低濃度限界において、プライマーおよび同じパッドに結合する環状鋳型は互いに独立で、ポワソン分布P(n)は任意のパッドでn回伸長するアンカープライマー数を特徴付ける。この分布を、P(n)=(an/n!)exp(−a)(ここで、P(1)=a exp(−a))により数学的に規定し得る。a=1に対して、確率P(1)が最大値 exp(−1)であるとすると、37%のパッドが一個の伸長アンカープライマーを持つことになる。
【0058】
1に最も近似するNpf値を見出すためにアンカープライマー濃度および環状鋳型濃度の範囲を連続的に調べ得る。この分布を最適にする好適な方法は、複数アンカープライマーをそれぞれの反応パッド上に置くことが可能ではあるが、配列決定鋳型を生成するために、概してそれぞれのパッド上の唯一つのプライマーのみが伸長されるように環状鋳型の限界希釈法を用いる。
【0059】
あるいは、低濃度アンカープライマーでは、最大一個のアンカープライマーがそれぞれの反応パッドと結合するようである。それぞれのプライマーが伸長され得るように高濃度環状鋳型を使用し得る。
【0060】
反応パッドを平坦または光ファイバーアレイ(FORA)上に並べる場合、個々のパッドを一辺10μmにし、隣接するパッドとの間を100μm空ける。従って、1cmの面に、合計およそ10,000個のマイクロリアクターが置かれ、ポワソン分布によると、およそ3,700個のマイクロリアクターが一個のアンカープライマーを含むことになる。特定の実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドを固体支持体に結合させた後、表面上に残っている未使用アビジン結合部位に結合させるために例えばビオチン化などの改変を施した酵素を置く。
【0061】
他の実施形態において、複数のアンカープライマーを任意の一つの個々のパッドにアレイ状に結合させる。限界希釈の複数環状核酸鋳型(詳細については下記)を、概してそれぞれのパッド上の唯一つのプライマーを核酸鋳型とハイブリダイズさせるように固定化したアンカープライマーとハイブリダイズさせ得る。使用すべきライブラリー濃度を、例えば希釈およびポワソン分布モデルを利用して計算し得る。
【0062】
(一本鎖環状鋳型のライブラリー)
複数の核酸鋳型、例えば核酸ライブラリーは一般に、開裂環状または閉鎖環状核酸分子を含む。「閉鎖環」は、共有結合的に閉鎖した環状核酸分子、例えば環状DNAまたはRNA分子である。「開裂環」は、5’ホスフェート基および3’ヒドロキシル基を有する、直鎖状一本鎖核酸分子である。いくつかの実施形態では、開裂環をインサイチュで直鎖状二本鎖核酸分子から形成する。所定の開裂環状核酸分子の末端を、DNAリガーゼによって連結し得る。開裂環状分子の5’および3’末端の配列は、2番目の核酸分子、例えばアンカープライマーのアダプター領域における隣接するヌクレオチドの2つの領域、または2番目のDNA分子においてほぼ隣接した2つの領域と相補的である。従って、開裂環状分子の末端を、DNAリガーゼによって連結し得るか、またはギャップを埋める反応(gap−filling reaction)においてDNAポリメラーゼによって伸長し得る。開裂環は、Lizardi、米国特許第5,854,033号において詳しく記載されている。例えば、開裂環をアンカープライマーにアニールした後、開裂環を、DNAリガーゼ(DNAのために)またはRNAリガーゼの存在下で閉鎖環へ変換し得る。
【0063】
もし望ましいなら、核酸鋳型はパッドロックプローブ(padlock probe)として提供され得る。パッドロックプローブは、各末端に位置する標的相補的な配列を含み、そしてリンカー配列によって分けられる直鎖状オリゴヌクレオチドである。リンカーを、例えば物理的に剪断された、または制限エンドヌクレアーゼによって消化された、核酸配列ライブラリーのメンバーの末端と連結し得る。標的配列とのハイブリダイゼーション時、プローブの2つの末端が並列になり、次いで、それらを酵素的連結によって結合し得る。リンカーを、物理的に剪断された、または制限エンドヌクレアーゼによって消化された、核酸配列のライブラリーメンバーの末端と連結し得る。
【0064】
これら直鎖状オリゴヌクレオチドの5’および3’末端領域を、特定の標的配列鎖においてお互いに隣接して塩基対を形成するように設計し、従って直鎖状オリゴヌクレオチドの末端は、標的配列とのハイブリダイゼーションによって並列になる。この並列は、2つのプローブセグメントが(もし適切にハイブリダイズしたなら)酵素的連結(例えばT4DNAリガーゼによって)によって共有結合し、従ってプローブを、特定の標的配列につながれた環状閉鎖分子に変換することを可能にする(例えばNilssonら、1994.Science 265:2085−2088を参照のこと)。得られたプローブは、遺伝子配列改変体に対するその特異性および選択性のために(例えばLizardiら、1998.Nat.Genet.19:225−232;Nilssonら、1997.Nat.Genet.16:252−255を参照のこと)、および得られた反応産物が特定の標的配列に局在化したままであるという事実のために、多くの遺伝子配列の同時分析に適切である。さらに、多くの異なるプローブの分子内連結は、複合PCR(プライマーの非コグネイト対が不適切な増幅産物を生じさせ得る)に基づく方法論より、非特異的交差反応性の影響を受けにくいと期待される(例えばLandegrenおよびNilsson、1997.Ann.Med.29:585−590を参照のこと)。
【0065】
開始ライブラリーは、それが、もしライブラリー中に存在するなら、アンカープライマー配列に対するアニールに利用可能な、またはアニールに利用可能にし得る領域を含む限り、一本鎖または二本鎖のいずれでもあり得る。ローリングサークル増幅のための鋳型として使用する場合、アンカープライマーの伸長の鋳型として作用するために、二本鎖鋳型の領域を、少なくとも一時的に一本鎖にする必要がある。
【0066】
ライブラリー鋳型は、アンカープライマーに相補的な1つ以上の領域を含むがこれに限らない複数の要素を含み得る。例えば、鋳型ライブラリーは、配列決定プライマーに相補的な領域、制御ヌクレオチド領域、および続いて特徴付けされる配列決定鋳型を含む挿入配列を含み得る。下記でより詳しく説明するように、制御ヌクレオチド領域を、副産物の量と組み込まれたヌクレオチド数との間の関係を較正するために使用する。本明細書中で使用する場合、「相補鎖」という用語は、特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズして、適合した二本鎖を形成し得るヌクレオチド配列を指す。
【0067】
1つの実施形態では、ライブラリー鋳型は:(i)アンカープライマーに相補的な2つの別々の領域、(ii)配列決定プライマーに相同的な1つの領域、(iii)1つの任意のコントロールヌクレオチド領域、(iv)配列決定される、例えば30−500、50−200、または60−100ヌクレオチドの挿入配列を含む。もちろん、鋳型はこれらの特徴の2、3、または4つ全てを含み得る。
【0068】
鋳型核酸を、核酸の任意の供給源、例えば任意の細胞、組織、または生物から構築し得、そして任意の当分野で認められた(art−recognized)技術によって産生し得る。適切な方法は、例えばゲノムDNAの超音波処理、および1つ以上の制限エンドヌクレアーゼ(RE)によって消化して、最初の核酸分子の集団から望ましい範囲の長さの断片を産生することを含む。好ましくは、1つ以上の制限酵素は、別々の4塩基認識配列を有する。そのような酵素の例としては、例えばSau3A1、MspI、およびTaq1が挙げられる。好ましくは、その酵素を、対応する制限酵素の認識配列を含む領域を有するアンカープライマーと組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、アンカープライマーの1つまたは両方のアダプター領域が、公知の制限酵素認識配列に隣接するさらなる配列を有し、それによって目的の特定の制限断片のアンカープライマーの捕獲またはこのプライマーへのアニールを可能にする。
【0069】
他の実施形態では、制限酵素をIIS型制限酵素と共に使用する。
【0070】
あるいは、鋳型ライブラリーを、RNA、例えばメッセンジャーRNA(mRNA)から相補DNA(cDNA)を産生することによって作製し得る。もし望ましいなら、cDNAライブラリーを、さらに制限エンドヌクレアーゼで処理して、特定のRNA、内部断片、または単離RNAの3’末端を含む断片に特徴的な3’末端を得ることができる。アンカープライマーのアダプター領域は、鋳型ライブラリーに存在すると考えられる目的の配列、例えば、エンドヌクレアーゼ消化によって産生された断片中の公知のまたは予測される配列多型に相補的であり得る。
【0071】
1つの実施形態では、インデックスオリゴヌクレオチドを鋳型ライブラリーメンバーに結合させて、続いて鋳型核酸と、鋳型核酸が得られた核酸集団の相関を示すことを可能にし得る。例えば、開始DNA集団の1つ以上の試料を、以前に開示した方法(例えば制限酵素消化、超音波処理)のいずれかを用いて別々に断片化し得る。各試料に特異的なインデックスオリゴヌクレオチド配列を、断片化集団のメンバーの末端に結合、例えば連結させる。インデックスオリゴヌクレオチドは、環化、増幅、および任意で配列決定の領域として作用し得、このインデックスオリゴヌクレオチドは、それが得られた開始試料を同定するために核酸を指標化、またはコードするためにそれを使用することを可能にする。
【0072】
複数の区別できるインデックスプライマーで作製された別々の鋳型ライブラリーを、続く反応のために共に混合し得る。ライブラリーメンバーの配列の決定は、インデックスオリゴヌクレオチドに対応する配列の同定を可能にする。この情報に基づいて、任意の所定の断片の起源を推測し得る。
【0073】
(プライマー−鋳型核酸複合体のアニールおよび増幅)
核酸ライブラリーを、認められた技術を用いてアンカープライマー配列にアニールさせる(例えばHatchら、1999.Genet.Anal.Biomol.Engineer.15:35−40;Kool、米国特許第5,714,320号およびLizardi、米国特許第5,854,033号を参照のこと)。一般的に、アンカープライマー配列のアダプター領域と鋳型ライブラリーに存在する配列との間で、特異的な、すなわち完全なまたはほぼ完全な相補性を形成する限り、アンカープライマーを鋳型核酸配列へアニールさせる任意の手順が適切である。
【0074】
多くのインビトロ核酸増幅技術を、アンカープライマー配列を伸長するために利用し得る。増幅DNAの大きさは、好ましくはアンカーパッド(anchor pad)の大きさより小さく、かつアンカーパッド間の距離よりも小さい。
【0075】
典型的には、ポリメラーゼ、例えばDNA指向性DNAポリメラーゼまたはRNA指向性DNAポリメラーゼ、および1、2、3または4つの型のヌクレオチド3ホスフェート、および任意で補助結合タンパク質の存在下で増幅を行う。一般的に、それが3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠いている限り、プライム化した3’−OH基を伸長できる任意のポリメラーゼを使用し得る。適切なポリメラーゼとしては、例えば、Bacillus stearothermophilus、Thermus acquaticus、Pyrococcus furiosis、Thermococcus litoralis、およびThermus thermophilus、バクテリオファージT4およびT7、ならびにE.coli DNAポリメラーゼIクレノウ断片由来のDNAポリメラーゼが挙げられる。適切なRNA指向性DNAポリメラーゼとしては、例えば鳥類骨髄芽球症ウイルス由来の逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素、およびヒト免疫不全ウイルス−Iの逆転写酵素が挙げられる。
【0076】
多くのインビトロ核酸増幅技術が記載された。これらの増幅方法論は、以下の方法に区別され得る:(i)温度の循環を必要とするもの−ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えばSaikiら、1995.Science 230:1350−1354を参照のこと)、リガーゼ連鎖反応(例えばBarany、1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189−193;Barringerら、1990.Gene 89:117−122を参照のこと)、および転写に基づく増幅(例えばKwohら、1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173−1177を参照のこと)、ならびに(ii)等温増幅システム−自立配列複製(例えばGuatelliら、1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874−1878を参照のこと);QBレプリカ−ゼシステム(例えばLizardiら、1988.BioTechnology 6:1197−1202を参照のこと);鎖置換増幅(Nucleic Acids Res.1992年4月11日;20(7):1691−6);およびPNAS 1992年1月1日;89(1):392−6;およびNASBA J Virol Methods 1991年12月;35(3):273−86で記載された方法。
【0077】
等温増幅はまた、ローリングサークルに基づく増幅(RCA)を含む。RCAは、例えばKool、米国特許第5,714,320号およびLizardi、米国特許第5,854,033号;Hatchら、1999.Genet.Anal.Biomol.Engineer.15:35−40で議論されている。RCAの結果は、アンカープライマーの3’末端から伸長した(そして従って固体支持体マトリックスに結合した)一本鎖DNAであり、そしてプライマー配列にアニールした環状鋳型の複数のコピーを含むコンカテマーを含む。典型的には、それぞれ例えば約30−500、50−200、または60−100ヌクレオチドの大きさの範囲を有する、1,000から10,000以上の環状鋳型のコピーを、RCAで得ることができる。
【0078】
環状核酸分子のアンカープライマーへのアニール後の、RCA増幅の産物を、図1Aに図式的に示す。環状鋳型核酸102を、表面106にその5’末端で結合し、そして伸長に利用可能なフリーの3’OHを有するアンカープライマー104にアニールする。環状鋳型核酸102は、アンカープライマー104における配列の領域に相補的な、2つのアダプター領域108および110を含む。挿入物112および下記で記載される配列決定反応で使用する配列決定プライマーに相同的な領域114も、環状鋳型核酸102に含まれる。
【0079】
アニール時に、アンカープライマー104のフリーの3’−OHを、鋳型核酸102中の配列を用いて伸長し得る。アンカープライマー102を、各反復でアンカープライマーから伸長する配列に、環状鋳型核酸に相補的な配列を付加しながら、鋳型にそって複数回伸長し得る。4回の反復、または4周期のローリングサークル複製を、伸長したアンカープライマー増幅産物114として図1Aに示す。アンカープライマーの伸長は、基質106に共有結合した、または別の方法で物理的に結合した増幅産物を産生する。
【0080】
環状鋳型およびアンカープライマーのさらなる実施形態を、図1B−1Fにより詳しく示す。図1Bは、連結時に、アンカープライマーの伸長の鋳型として働き得る、アニールした開裂環直鎖状基質を示す。配列5’−TCgTgTgAggTCTCAgCATCTTATgTATATTTACTTCTATTCTCAgTTgCCTAAgCTgCAgCCA−3’(配列番号1)を有する鋳型分子を、5’末端にビオチンリンカー、および配列5’−gACCTCACACgATggCTgCAgCTT−3’(配列番号2)を有するアンカープライマーにアニールさせる。鋳型のアニールは、鋳型分子の5’および3’末端の並置を引き起こす。アンカープライマーの3’OHを、環状鋳型を用いて伸長し得る。
【0081】
単一ヌクレオチド多型同定のための環状鋳型およびアンカープライマーの使用を、図1Cに示す。配列5’−gACCTCACACgATggCTgCAgCTT−3’(配列番号3)を有する包括的アンカープライマーを示す。アンカープライマーは、配列5’−TTTATATgTATTCTACgACTCTggAgTgTgCTACCgACgTCgAAtCCgTTgACTCTTATCTTCA−3’(配列番号4)を有するSNPプローブとアニールする。今度はSNPプローブが、配列5’−CTAgCTCgTACATATAAATgAAgATAAgATCCTg−3’(配列番号5)を有する遺伝子のSNPを含む領域にハイブリダイズする。多型を含む核酸配列のSNPプローブ複合体へのハイブリダイゼーションは、続くSNPプローブの連結および環化を可能にする。図1Cに示すように、多型部位の領域で隣接するように5’および3’末端がゲノム領域にアニールするように、SNPプローブを設計する。環化SNPプローブを続いて、本明細書中で記載された方法を用いて伸長および配列決定し得る。多型を欠く核酸は、SNPプローブの5’および3’末端の並列を引き起こすようにハイブリダイズしない。この場合、SNPプローブは、続く伸長に必要な環状基質を形成するように連結できない。
【0082】
図1Dは、環状鋳型分子を伴ったギャップオリゴヌクレオチドの使用を説明する。配列5’−gACCTCACACgAgTAgCATggCTgCAgCTT−3’(配列番号6)を有するアンカープライマーを、ビオチンリンカーによって表面に結合させる。配列5’−TCgTgTgAggTCTCAgCATCTTATgTATATTTACTTCTATTCTCAgTTgCCTAAgCTgCAgCCA−3’(配列番号7)を有する鋳型分子を、アンカープライマーにアニールさせて、二本鎖領域に隣接した、アンカープライマーの部分的な一本鎖、またはギャップ領域を生じさせる。配列5’−TgCTAC−3’を有するギャップ分子を、次いでアンカープライマーにアニールさせる。ギャップオリゴヌクレオチドの両端の、鋳型分子への連結は、ローリングサークル増幅のための鋳型として作用し得る環状核酸分子の形成を引き起こす。
【0083】
ポリメラーゼによるDNA複製の間に産生される環状オリゴヌクレオチドは、鋳型と複製開始部位との間の関係に依存する。二本鎖DNA鋳型では、決定的な特徴は、鋳型が天然で直鎖状かまたは環状か、および複製開始部位(すなわち複製「フォーク」)が両方のDNA鎖の合成に参加しているかまたは一方だけかを含む。従来の二本鎖DNA複製では、複製フォークは、新しいDNA鎖が合成される部位として扱われる。しかし、直鎖状分子では(一方向または二方向いずれで複製されるにせよ)、複製フォークの動きは、特定の型の構造モチーフを産生する。鋳型が環状であるなら、複製分子の1つの潜在的な空間的配向は、θ構造の形式をとる。
【0084】
あるいは、二本鎖分子の複製が起点から開始する場合にRCAが起こり得る。続いて、ニックが鎖の一方を開裂させ、そしてニックによって産生されたフリーの3’末端ヒドロキシル部分が、DNAポリメラーゼの作用によって伸長される。新しく合成された鎖は、最後にもとの親DNA鎖を置換する。複製点が環状鋳型鎖を「回転している」ように見え得ること、そして理論的には永遠にそれが持続し得ることから、この前述の複製の型は、ローリングサークル複製(RCR)として公知である。進行するにつれて、複製フォークは前のパートナーに対して外側DNA鎖を伸長する。さらに、新しく合成されたDNA鎖はもとの鋳型に共有結合しているので、置換された鎖はもとのゲノム配列(例えば遺伝子または他の目的の配列)をその5’末端に有する。ローリングサークル複製では、もとのゲノム配列の後に、もとの鋳型配列に相補的な任意の数の「複製ユニット」が続く。ここで各複製ユニットは、上記のもとの鋳型配列の回転を連続することによって合成される。従って、続く各回転は、前の複製サイクルで合成されたDNAを置換する。
【0085】
インビボで、ローリングサイクル複製は、いくつかの生物学的システムにおいて利用される。例えば、いくつかのバクテリオファージのゲノムは一本鎖環状DNAである。複製の間、環状DNAはまず二本鎖形態に変換され、それが次いで前述のローリングサークル複製メカニズムによって複製される。置換された末端は、切断およびファージ粒子に挿入され得る一連のゲノムユニットを産生する。さらに、ローリングサークルの置換された一本鎖は、相補的DNA鎖の合成によって二本鎖DNAに変換され得る。この合成を、特定のファージDNAの成熟に必要なコンカテマー二本鎖分子を産生するために使用し得る。例えば、これは、λバクテリオファージが成熟する主な経路を提供する。ローリングサークル複製はまた、インビボで、Xenopus卵母細胞において増幅rDNAを産生するために使用され、そしてこの事実は、なぜ増幅rDNAが多数の同一反復ユニットからなるのかを説明するのに役立ち得る。この場合、単一のゲノム反復ユニットが、ローリングサークルに変換される。置換された末端は、次いで二本鎖DNAに変換され、それは続いて環から切断され、その結果増幅rDNAの環を産生するように2つの末端が結合され得る。
【0086】
RCA反応の使用によって、環状化分子に相補的な多くのタンデムコピーを示す鎖を産生し得る。例えば、最近、ヒトゲノムDNAサンプルにおいて単一コピー遺伝子を検出するために、RCAが利用され、インビトロで環状化パッドロックプローブ(padlock probe)の等温カスケード増幅反応を得た(Lizardiら、1998.Nat.Genet.19:225−232を参照のこと)。それに加えて、RCAはまた、固相に基づくアッセイにおいて単一のDNA分子を検出するために利用されたが、この技術をインサイチュハイブリダイゼーションに適用した時問題が生じた(Lizardiら、1998.Nat.Genet.19:225−232を参照のこと)。
【0087】
所望の場合、上昇した温度で、例えば37℃、42℃、45℃、50℃、60℃、または70℃より高い温度で、RCAを行い得る。さらに、RCAを、まずはより低い温度で、例えば室温で行い、そして次いで上昇した温度に移行させ得る。上昇した温度のRCAは、好ましくは熱安定性の核酸ポリメラーゼならびに上昇した温度で安定におよび特異的にアニールし得るプライマーを用いて行う。
【0088】
RCAをまた、天然に存在しないヌクレオチド、例えばペプチド核酸を用いて行い得る。さらに、RCAを、一本鎖結合タンパク質のような補助タンパク質の存在下で行い得る。
【0089】
ローリングサークル増幅(RCA)と呼ばれる、固体支持体に固定化された短いDNA分子を増幅する方法の開発が、最近文献に記載された(例えば、Hatchら、1999.固体表面上に固定化されたDNAのローリングサークル増幅および複合変異検出に対するその適用。Genet.Anal.Biomol.Engineer.15:35−40;Zhangら、1998.標的特異的、ライゲーション依存性環状プローブの増幅。Gene 211:277−85;Banerら、1998.ローリングサークル複製によるパッドロックプローブのシグナル増幅。Nucl.Acids Res.26:5073−5078;Liuら、1995.ローリングサークルDNA合成:DNAポリメラーゼの効率的な鋳型としての小さな環状オリゴヌクレオチド。J.Am.Chem.Soc.118:1587−1594;FireおよびXu、1995.短いDNA環のローリング複製。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4641−4645;Nilssonら、1994.パッドロックプローブ:局在化DNA検出のためのオリゴヌクレオチドの環状化。Science 265:2085−2088を参照のこと)。RCAは、ハイブリダイゼーションおよびDNAリガーゼ反応によって特定のDNA配列を標的とする。次いで、環状産物を続いてローリングサークル複製反応での鋳型として使用する。
【0090】
DNAポリメラーゼによって進められるローリングサークル増幅(RCA)は、等温条件下で、直線的か幾何学的のいずれかの速度論で、環状化オリゴヌクレオチドプローブを複製し得る。2つのプライマーの存在下で(1つはDNAの+鎖に、そして他方は−鎖にハイブリダイズする)、複雑なパターンのDNA鎖置換が後に続き、それは短い時間(すなわち90分未満)に各環の1×109またはそれ以上のコピーを産生する能力を有し、ヒトゲノム内の単一点変異を検出することを可能にする。単一のプライマーを使用して、RCAは、数分で共有結合的に閉鎖した環の、数百のランダムに連結したコピーを産生する。固体支持体マトリックスに結合している場合、DNA産物は合成部位に結合したままであり、そこで標識され、濃縮され、そして点光源(point light source)として画像化され得る。例えば、RCAシグナルを産生し得る直線状オリゴヌクレオチドプローブを、ガラス表面に共有結合させた。これらのプローブによって産生されるシグナルの色は、特定の標的に向けられた連結反応の結果に依存して、標的の対立遺伝子状態を示す。RCAは数百万の個々のプローブ分子を計測し、そして分類することが可能であるので、それはまれな体細胞変異の分析に特に敏感に反応し得る。RCAはまた、細胞学的な調製物中で単一コピー遺伝子に結合したパッドロックプローブの検出に有望である。
【0091】
さらに、固相RCA方法論がまた、溶液中の成分を検出する効果的な方法を提供するために開発された。まず、認識工程を使用して、表面に結合した環状鋳型と二本鎖を形成するDNAプライマーからなる複合体を産生する。次いでポリメラーゼ酵素を使用して、結合した複合体を増幅する。RCAは、下記でより詳しく記載する方法を含む検出方法を用いて、強いシグナルを提供するために増幅される小さなDNAプローブを使用する。
【0092】
等温増幅システムの他の例は、例えば(i)自立配列複製(例えばGuatelliら、1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874−1878を参照のこと)、(ii)QBレプリカ−ゼシステム(例えばLizardiら、1988.BioTechnology 6:1197−1202を参照のこと)、および(iii)核酸配列に基づく増幅(NASBATM;Kievitsら、1991.J.Virol.Methods 35:273−286を参照のこと)を含む。
【0093】
(配列産物のヌクレオチド配列の決定)
上記で記載したような核酸鋳型の増幅は、アンカープライマーに共有結合的に連結された鋳型核酸配列の複数のコピーを生じる。1つの実施形態では、配列産物の領域を、鋳型核酸の領域に配列決定プライマーをアニールさせ次いで配列決定プライマーをDNAポリメラーゼおよび公知のヌクレオチド3ホスフェート、すなわちdATP、dCTP、dGTP、dTTP、またはこれらヌクレオチドの1つのアナログと接触させることによって決定する。下記で記載するように、配列反応副産物を検出することによって配列を決定し得る。
【0094】
配列プライマーは、それが増幅核酸鋳型の領域に特異的にアニールできる限り、あらゆる長さまたは塩基成分であり得る。それが増幅鋳型核酸の領域を特異的にプライム化できる限り、配列決定プライマーに特定の構造は必要でない。好ましくは、配列決定プライマーは、特徴付けされる配列とアンカープライマーにハイブリダイズ可能な配列との間にある鋳型の領域に相補的である。配列決定プライマーをDNAポリメラーゼによって伸長して、配列産物を形成する。1つ以上の型のヌクレオチド3ホスフェート、および所望の場合、補助結合タンパク質の存在下で伸長を行う。
【0095】
dNTPの組み込みを、好ましくは配列決定副産物の存在をアッセイすることによって決定する。好ましい実施形態では、配列決定産物のヌクレオチド配列を、NTPが伸長配列プライマーに組み込まれる時にヌクレオチド3ホスフェート(dNTP)から放出される無機ピロホスフェート(PPi)を測定することによって決定する。PyrosequencingTM技術(PyroSequencing AB、Stockholm、Sweden)と呼ばれる、この配列決定方法は、溶液中(液相)または固相技術として行い得る。PPiに基づく配列決定方法は、一般的に、例えばWO9813523A1、Ronaghiら、1996.Anal.Biochem.242:84−89、およびRonaghiら、1998.Science 281:363−365(1998)に記載されている。PPi配列決定のこれらの開示は、本明細書中でその全体を参考文献として組み込まれる。
【0096】
これらの条件下で放出されるピロホスフェートを、(例えばルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光の産生によって)酵素的に検出し得る。そのような方法は、電気泳動の必要性および潜在的に危険な放射性標識の使用を避けながら、ヌクレオチドが所定の標的位置で同定されること、およびDNAが簡単にそして迅速に配列決定されることを可能にする。
【0097】
PPiを、多くの異なる方法論で検出し得、そして様々な酵素的方法が以前に記載された(例えばReevesら、1969.Anal.Biochem.28:282−287;Guilloryら、1971.Anal.Biochem.39:170−180;Johnsonら、1968.Anal.Biochem.15:273;Cookら、1978.Anal.Biochem.91:557−565;およびDrakeら、1979.Anal.Biochem.94:117−120を参照のこと)。
【0098】
ポリメラーゼによるdNTPの組み込みの結果として放出されたPPiを、例えばATPスルフリラーゼを用いてATPに変換し得る。この酵素は、硫黄代謝に関与していると同定された。硫黄は、還元形態および酸化形態もいずれでも、植物および動物の成長に必須のミネラル栄養素である(例えばSchmidtおよびJager、1992.Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.43:325−349を参照のこと)。植物および微生物のいずれにおいても、硫酸塩の活発な取り込みの後に硫化物への還元が起こる。硫黄は、利用可能な細胞還元剤に比べて非常に低い酸化/還元ポテンシャルを有するので、同化の最初の工程は、ATP依存性反応によるその活性化を必要とする(例えばLeyh、1993.Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.28:515−542を参照のこと)。ATPスルフリラーゼ(ATP:硫酸アデニリルトランスフェラーゼ;EG2.7.7.4)は、無機硫酸塩(SO4 -2)の代謝において最初の反応を触媒する(例えばRobbinsおよびLipmann、1958.J.Biol.Chem.233:686−690;HawesおよびNicholas、1973.Biochem.J.133:541−550を参照のこと)。この反応において、SO4 -2は、アデノシン5’−ホスホ硫酸(APS)に活性化される。
【0099】
ATPスルフリラーゼは、Saccharomyces cerevisiae(例えばHawesおよびNicholas、1973.Biochem.J.133:541−550を参照のこと);Penicillium chrysogenum(例えばRenostoら、1990.J.Biol.Chem.265:10300−10308を参照のこと);ラット肝臓(例えばYuら、1989.Arch.Biochem.Biophys.269:165−174を参照のこと);および植物(例えばShawおよびAnderson、1972.Biochem.J.127:237−247;Osslundら、1982.Plant Physiol.70:39−45を参照のこと)のようないくつかの供給源から高度に精製された。さらに、ATPスルフリラーゼ遺伝子は、原核生物(例えばLeyhら、1992.J.Biol.Chem.267:10405−10410;SchwedockおよびLong、1989.Mol.Plant Microbe Interaction 2:181−194;LaueおよびNelson、1994.J.Bacteriol.176:3723−3729を参照のこと);真核生物(例えばCherestら、1987.Mol.Gen.Genet.210:307−313;MountainおよびKorch、1991.Yeast 7:873−880;Fosterら、1994.J.Biol.Chem.269:19777−19786を参照のこと);植物(例えばLeustekら、1994.Plant Physiol.105:897−90216を参照のこと);および動物(例えばLiら、1995.J.Biol.Chem.270:29453−29459を参照のこと)からクローニングされた。その酵素は、特定の供給源に依存するホモオリゴマーまたはヘテロダイマーである(例えばLeyhおよびSuo、1992.J.Biol.Chem.267:542−545を参照のこと)。
【0100】
いくつかの実施形態では、熱安定性のスルフリラーゼを使用する。熱安定性のスルフリラーゼは、例えばArchaeoglobusまたはPyrococcus sppから得ることができる。熱安定性スルフリラーゼの配列は、データベース受託番号028606、受託番号Q9YCR4、および受託番号P56863で入手可能である。
【0101】
ATPスルフリラーゼは、多くの異なる適用、例えば高濃度のATPにおけるADPの生物発光検出(例えばSchultzら、1993.Anal.Biochem.215:302−304を参照のこと);DNAポリメラーゼ活性の持続モニタリング(例えばNyrbn、1987.Anal.Biochem.167:235−238を参照のこと);およびDNA配列決定(例えばRonaghiら、1996.Anal.Biochem.242:84−89;Ronaghiら、1998.Science 281:363−365;Ronaghiら、1998.Anal.Biochem.267:65−71を参照のこと)に使用された。
【0102】
順方向ATPスルフリラーゼ反応の検出のために、いくつかのアッセイが開発された。比色定量モリブドリシスアッセイは、ホスフェート検出に基づいており(例えばWilsonおよびBandurski、1958.J.Biol.Chem.233:975−981を参照のこと)、一方持続分光測光モリブドリシス(molybdolysis)アッセイは、NADH酸化の検出に基づく(例えばSeubertら、1983.Arch.Biochem.Biophys.225:679−691;Seubertら、1985.Arch.Biochem.Biophys.240:509−523を参照のこと)。後者のアッセイは、いくつかの検出酵素の存在を必要とする。さらに、いくつかの放射活性アッセイも文献に記載された(例えばDaleyら、1986.Anal.Biochem.157:385−395を参照のこと)。例えば、1つのアッセイは32P標識ATPから放出される32PPiの検出に基づいており(例えばSeubertら、1985.Arch.Biochem.Biophys.240:509−523を参照のこと)、および別のものは35Sの[35S]標識APSへの組み込みに基づいており(このアッセイはまた、結合酵素として精製APSキナーゼを必要とする;例えばSeubertら、1983.Arch.Biochem.Biophys.225:679−691を参照のこと);そして3番目の反応は[35S]標識APSからの35SO4 -2の放出に依存する(例えばDaleyら、1986.Anal.Biochem.157:385−395を参照のこと)。
【0103】
逆向きATPスルフリラーゼ反応の検出のために、持続分光測光アッセイ(例えばSegelら、1987.Methods Enzymol.143:334−349を参照のこと);生物発光アッセイ(例えばBalharryおよびNicholas、1971.Anal.Biochem.40:1−17を参照のこと);35SO4 -2放出アッセイ(例えばSeubertら、1985.Arch.Biochem.Biophys.240:509−523を参照のこと);および32PPi組み込みアッセイ(例えばOsslundら、1982.Plant Physiol.70:39−45を参照のこと)が以前に記載された。
【0104】
ATPスルフリラーゼによって産生されたATPを、酵素反応を用いて加水分解し、光を産生し得る。発光化学反応(すなわち化学発光)および生物学的反応(すなわち生物発光)は、様々な代謝物の高感度測定のために、分析生化学において広く使用されている。生物発光反応において、発光にいたる化学反応は酵素によって触媒される。例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼシステムは、ATPの特異的アッセイを可能にし、そして細菌ルシフェラーゼ−酸化還元酵素システムを、NAD(P)Hのモニタリングに使用し得る。いずれのシステムも、ATPまたはNAD(P)Hの産生または利用を含む、組み合わせた反応によって、多くの物質の分析に拡大された(例えばKricka、1991.化学発光および生物発光技術。Clin.Chem.37:1472−1281を参照のこと)。
【0105】
新しい試薬の開発は、ATP(例えばLundin、1982.Luminescent Assays(Raven Press、New York)中のホタルルシフェラーゼの適用を参照のこと)またはNAD(P)H(例えばLovgrenら、細菌発光によるNADH変換反応の持続モニタリング。J.Appl.Biochem.4:103−111を参照のこと)の濃度に比例する安定な発光を得ることを可能にした。そのような安定な発光試薬を用いて、終点アッセイを行うこと、および公知の量のATPまたはNAD(P)Hを加えることによって個々のアッセイそれぞれを較正することが可能である。それに加えて、安定な発光システムはまた、ATPまたはNAD(P)H変換システムの持続モニタリングを可能にする。
【0106】
ATPを光に変換する適当な酵素は、ルシフェラーゼ、例えば昆虫ルシフェラーゼを含む。ルシフェラーゼは、触媒の最終産物として光を産生する。最もよく知られた発光酵素は、ホタル、Photinus pyralis(Coleoptera)のものである。対応する遺伝子が、細菌(例えばde Wetら、1985.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:7870−7873を参照のこと)、および植物(例えばOwら、1986.Science 234:856−859を参照のこと)、および昆虫(例えばJhaら、1990.FEBS Lett.274:24−26を参照のこと)および哺乳動物細胞(例えばde Wetら、1987.Mol.Cell.Biol.7:725−7373;Kellerら、1987.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3264−3268を参照のこと)でクローニングおよび発現された。それに加えて、ジャマイカコメツキムシPyroplorus plagiophihalamus(Coleoptera)由来の多くのルシフェラーゼ遺伝子が最近クローニングされ、そして一部特徴付けされた(例えばWoodら、1989.J.Biolumin.Chemilumin.4:289−301;Woodら、1989.Science 244:700−702を参照のこと)。別々のルシフェラーゼが、時々異なる波長の光を産生し得、それは異なる波長における発光の同時モニタリングを可能にし得る。よって、これら前述の特徴は独特であり、そして現在のリポーターシステムの利用に関して新しい面を加える。
【0107】
ホタルルシフェラーゼは、ルシフェリン、アデノシン5’−3ホスフェート(ATP)、マグネシウムイオン、および酸素の存在下で生物発光を触媒し、0.88の量子収量を生じる(例えばMcElroyおよびSelinger、1960.Arch.Biochem.Biophys.88:136−145を参照のこと)。ホタルルシフェラーゼ生物発光反応を、約1×10-13Mの検出限界を有するATPの検出のアッセイとして利用し得る(例えばLeach、1981.J.Appl.Biochem.3:473−517を参照のこと)。それに加えて、ルシフェラーゼ媒介検出システムの全体の感受性および簡便性の程度は、ホタルルシフェラーゼに基づくバイオセンサーの開発にかなりの興味を引いた(例えばGreenおよびKricka、1984.Talanta 31:173−176;Blumら、1989.J.Biolumin.Chemilumin.4:543−550を参照のこと)。
【0108】
上記で記載した酵素を用いて、配列プライマーをポリメラーゼおよび公知のdNTPに曝露する。もしdNTPがプライマー配列の3’末端に組み込まれる場合、dNTPは切断され、そしてPPi分子が放出される。次いでPPiはATPスルフリラーゼによってATPに変換される。好ましくは、ATPスルフリラーゼは、PPiの変換がPPiに関して一次の速度論で進行するように、十分高い濃度で存在する。ルシフェラーゼの存在下で、ATPは加水分解されて光子を産生する。好ましくは、ATP→ADP+PO4 3-+光子(光)という反応がATPに関して一次の速度論で進行するように、反応混合物中にルシフェラーゼが十分な濃度で存在する。光子を、下記で記載する方法および装置を用いて測定し得る。
【0109】
ほとんどの適用に関して、拡散性の配列決定試薬、例えば組み込まれなかったdNTPを、洗浄緩衝液で洗浄することが望ましい。ピロホスフェート配列決定で使用されるあらゆる洗浄緩衝液を使用し得る。
【0110】
いくつかの実施形態では、配列決定反応中の反応物濃度は、0.2mlの緩衝液中、1pmolのDNA、3pmolのポリメラーゼ、40pmolのdNTPを含む。Ronaghiら、Anal.Biochem.242:84−89(1996)を参照のこと。
【0111】
配列決定反応を、所望する場合4つの前もって決定したヌクレオチドのそれぞれを用いて行い得る。「完全な」サイクルは、一般的に、前もって決定した順序で、連続的にヌクレオチドdATP、dGTP、dCTP、およびdTTP(またはdUTP)それぞれの配列決定試薬を投与する工程を含む。組み込まれなかったdNTPを、各ヌクレオチド追加の間に洗い去る。あるいは、組み込まれなかったdNTPを、アピラーゼによって分解する(下記を参照のこと)。望ましい量の配列産物の配列が得られるまで、サイクルを望ましいだけ反復する。いくつかの実施形態では、約10〜1,000、10〜100、10〜75、20〜50、または約30ヌクレオチドの配列情報が、1つのアニールした配列決定プライマーの伸長から得られる。
【0112】
ルシフェラーゼは、光子の放出を伴ってdATPを直接加水分解し得る。加水分解はdATPの伸長配列決定プライマーへの組み込みとは独立に起こるので、これは擬陽性シグナルを生じる。この問題を避けるために、DNAに組み込まれるdATPアナログを使用し得る。すなわち、それはDNAポリメラーゼの基質であるが、ルシフェラーゼの基質ではない。そのようなアナログの1つはα−チオ−dATPである。従って、α−チオ−dATPの使用は、dATPが成長している核酸鎖に組み込まれることなく加水分解されたときに起こり得る擬似光子産生を回避する。
【0113】
典型的には、PPiに基づく検出は、コントロールヌクレオチドを、配列決定プライマーの追加直後に配列決定反応混合物に加えた後放出される光を測定することによって較正される。これは、反応条件の標準化を可能にする。2つまたはそれ以上の同じヌクレオチドの連続的な組み込みは、発光量の対応する増加によって明らかとなる。従って、コントロールヌクレオチドに比べて発光が2倍に増加することは、2つの連続したdNTPの伸長プライマーへの組み込みを明らかにする。
【0114】
所望の場合、配列決定反応混合物中に残っている、組み込まれなかったあらゆるdNTPの分解を促進するために、アピラーゼを固体支持体の表面に「ぬらす」または「流す」ことができる。アピラーゼによる処理時に、あらゆる残留反応物は、続くdNTPインキュベーションおよび光子検出工程のために、洗浄して除去される。あるいは、アピラーゼを固体支持体に結合し得る。
【0115】
支持体が平坦である場合、好ましくは、ピロホスフェート配列決定反応は、1つの光学的に透過性の固体支持体表面および光学的に透過性のカバーを含む、薄い反応チャンバ中で起こる。次いで配列決定試薬を、基質の表面に流すことによって送達し得る。支持体が平坦でない場合、固体支持体をあらゆる所定の試薬の槽に浸すことによって、試薬を送達し得る。
【0116】
支持体が空洞のあるアレイの形態、例えば光ファイバー反応アレイ(FORA)の末端である場合、試薬の適当な送達方法は、例えば流れ、スプレー、エレクトロスプレー、インクジェット送達、スタンプ、超音波噴霧(Sonotek Corp.、Milton、NY)、およびローリングを含む。好ましくは、全ての試薬溶液は、蒸発を最小限にするために10−20%のエチレングリコールを含む。スプレーを使用する場合、工業型スプレーノズル(Spraying Systems,Co.、Wheaton、IL)、またはCAMAG TLC Sprayer(Camag Scientific Inc.、Wilmington、NC)のような、薄層クロマトグラフィー(TLC)で使用される噴霧器によって産生される均一な薄い層で、試薬をFORA表面に送達する。これらの噴霧器は、0.3から10μmのサイズの範囲で、試薬をエアロゾルスプレー粒子に霧状にする。
【0117】
タンパク質およびDNA溶液のエレクトロスプレー沈着(ESD)は、現在これらの分子の質量分光分析のためにイオンを産生するために使用されている。静電気力の制御下で、荷電エレクトロスプレー産物のFORA基質の特定の領域への沈着が示唆される。ES沈着タンパク質およびDNAは、それぞれ特異的に抗体に結合する、およびDNAプローブにマッチする能力を保持することも示され、ESDで作成したマトリックスのDot Immuno−Binding(DIB)およびDNAハイブリダイゼーションアッセイにおける使用を可能にする。(Morozov VN、Morozova TY:生物学的および生物学的に活性な物質の、モノ−およびマルチコンポーネントマイクロアレイの大量生産方法としてのエレクトロスプレー沈着。Anal.Chem.1999年8月1日;71(15):3110−7)
文献に記載されたように、タンパク質溶液および他の生物高分子に対して、インクジェット送達が適用可能である(例えばRoda A、Guardigli M、Russo C、Pasini P、Baraldini M、伝統的なインクジェットプリンターを用いたタンパク質マイクロ沈着。Biotechniques 2000年3月;28(3):492−6)。それはまた、例えばMicroFab Technologies,Inc.(Plano、TX)から市販される。
【0118】
あるいは、試薬溶液を、リトグラフィーに似た方法でFORA表面に送達し得る。ローラー(スタンプ;親水性の材料を使用するべきである)をまず、湿ったスポンジを有するリザーバー中で、試薬の層で覆い、そして次いでFORA表面に転がす(押し付ける)。
【0119】
連続的な試薬送達工程は、好ましくは洗浄工程によって分けられる。例えば高流れ噴霧器を含む、またはFORA表面上の液体の流れによる、上記で記載した方法を用いて、これらの洗浄を行い得る。
【0120】
様々な実施形態で、反応のいくつかの成分を固定化するが、他の成分を溶液中で提供する。例えば、いくつかの実施形態で、ピロホスフェート配列決定反応で利用する酵素(例えばスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ)を、所望の場合、固体支持体に固定化し得る。同様に、ピロホスフェート配列決定反応で利用する1つ以上の酵素、例えばスルフリラーゼ、ルシフェラーゼを、光ファイバー反応アレイの末端に固定化し得る。反応の他の成分、例えばポリメラーゼ(クレノウ断片のような)、核酸鋳型、およびヌクレオチドを、流れ、スプレー、またはローリングによって加え得る。まださらなる実施形態では、配列決定反応で使用する1つ以上の試薬を、ビーズ上で送達する。
【0121】
いくつかの実施形態では、伸長反応の間に、試薬を分配およびFORA表面上の反応容器を密封する拡張可能で可撓性の膜を用いて試薬を分配する。試薬を、FORA表面または柔軟な膜のいずれかにスプレーまたはロールし得る。次いで柔軟な膜を、迅速に拡張する、または物理的にFORAの近くに移動させるかのいずれかをされ得、それによってPPiがウェルからウェルへ拡散できないようにウェルを密封し得る。好ましくは、最大のシグナルが産生されることを可能にするために、反応開始から適当な時間後にデータ取得を行う。
【0122】
伸長アンカープライマー中の配列をまた、配列副産物を検出すること以外の配列決定方法を用いて同定し得る。例えば、標識ヌクレオチドまたは他のヌクレオチドアナログの組み込みを測定することによって配列決定を行い得る。これらの方法を、蛍光または電気化学発光に基づく方法と組み合わせて使用し得る。
【0123】
あるいは、3’炭素に標識を有するジデオキシヌクレオチドを用いて、配列副産物を産生し得る。好ましくは、標識は切断されて3’ヒドロキシル基を現す。この方法において、所定のヌクレオチドの追加は陽性または陰性として計測され、そして各試験で1つの塩基が決定される。この実施形態で、固相酵素は必要でなく、そして複数の測定を行い得る。
【0124】
別の実施形態では、伸長アンカープライマー産物の正体を、標識デオキシヌクレオチドを用いて決定する。標識デオキシヌクレオチドは、例えば蛍光ヌクレオチドであり得る。好ましくは、蛍光ヌクレオチドを、レーザー照射の後に検出し得る。好ましくは、蛍光標識は、長時間の曝露には安定でない。もし望ましいなら、蛍光シグナルを消光、例えば光退色して、次の塩基を加える前にシグナルをバックグラウンドレベルに戻し得る。好ましい電気化学発光標識は、ルテニウム−tris−bi−ピリジルである。
【0125】
ルシフェラーゼを固定化する場合、好ましくは、それはアンカープライマーから50μm未満である。
【0126】
ルシフェラーゼによって産生される光子を、様々な検出装置、例えば光電子増倍管、電荷結合ディスプレー(CCD)、CMOS、吸光度計、限界計、電荷注入デバイス(CID)、または他の固体状態検出器、および本明細書中で記載した装置を用いて定量し得る。好ましい実施形態では、放出された光子の定量を、融合した光ファイバーのバンドルに取り付けたCCDカメラの使用によって達成する。別の好ましい実施形態では、放出された光子の定量を、マイクロチャネルプレート増強装置に取り付けたCCDカメラの使用によって達成する。CCD検出器は、例えばBronksら、1995.Anal.Chem.65:2750−2757で記載されている。
【0127】
代表的なCCDシステムは、Lockheed−Martin LM485 CCDチップおよび各ファイバーの直径が6〜8μmの1−1光ファイバーコネクター(バンドル)を有するSpectral Instruments,Inc.(Tucson、AZ)シリーズ600 4−ポートカメラである。このシステムは、4096×4096、または1600万より多いピクセル、および10%〜>40%の範囲の量子効率を有する。従って、波長に依存して、CCDセンサーに画像化された光子の40%ほどが、検出可能な電子に変換される。
【0128】
(核酸を配列決定する装置)
本発明において提供されるものはまた、核酸を配列決定する装置である。いくつかの実施形態において、この装置は、平坦基板に取りつけられたアンカープライマーを含む。核酸配列情報は、平坦基板に取り付けられた従来のオプティクスまたは光ファイバーベースのシステムを使用して検出され得る。他の実施形態において、装置は、光ファイバーアレイの末端に取り付けられたアンカープライマーを含む。これらの実施形態において、配列情報は、この光ファイバーアレイの末端から直接得られ得る。
【0129】
(核酸を配列決定する装置)
核酸を配列決定する装置を、図2に例示する。この装置は、取り外し可能な灌流チャンバ220と連絡して入口導管200を含む。この入口導管200は、複数のチューブ202〜212を介して配列決定試薬の流入を可能にし、その導管は、複数の配列決定分配試薬容器214〜224とそれぞれ連絡する。
【0130】
試薬は、積極的な流れを導くために加圧システムまたはポンプのいずれかを使用して導管200を介して灌流チャンバ220に導入される。典型的に、試薬の流速は、0.100ml〜連続流れ(洗浄のため)の容量で0.05ml/分〜50ml/分(例えば、1ml/分〜50ml/分)である。バルブは、コンピューター制御下にあって、ヌクレオチド、および試薬のサイクリングを洗浄可能にする。配列決定試薬(例えば、ポリメラーゼ)は、ヌクレオチドと前もって混合されるか、または流れに加えられるかのいずれかであり得る。マニホールドは、灌流チャンバへフィードするため6つのチューブ202〜212を一緒にして1つにする。従って、いくつかの試薬送達ポートは、灌流チャンバへのアクセスを可能にする。例えば、このポートの1つは、水性の配列決定試薬の投入を可能にするため利用され得るが、一方、別のポートは、これらの試薬(および任意の反応性産物)が灌流チャンバから回収されるのを可能にする。
【0131】
灌流チャンバ200は、複数のアンカープライマーが取り付けられた基板を含む。この基板は、束ねられた光ファイバーアレイの末端に形成されるアンカーパッドにおいて固定された1つ以上のプライマーを含む平坦基板であり得る。後者の基板表面は、以下により詳細に考察される。
【0132】
灌流チャンバは、水溶液において増幅された核酸上で必要とされる配列決定試薬の均一線形流れを可能にし、そしてこれらの試薬の迅速なおよび完全な交換を可能にする。従って、この灌流チャンバは、ピロホスフェートベースの配列決定反応を行うのに適切である。この灌流チャンバはまた、アンカープライマーを調製するため、および増幅反応(例えば、本明細書中に記載されるRCA反応)を行うために使用され得る。
【0133】
固体支持体は、従来のオプティカルまたは光ファイバーバンドルにつながったCCDシステムを含む画像化システム230に光学的に連結される。1つの実施形態において、灌流チャンバ基板は、水性界面の近くで産生される光が、基板またはチャンバの外側に直接送達されるような光ファイバーアレイウェーハを含む。CCDシステムが、光ファイバーコネクターを含む場合、画像化は、そのコネクターと直接接触するように灌流チャンバ基板を配置することで達成され得る。あるいは、従来のオプティカルは、(例えば、1−1倍率高開口数レンズシステムを使用することによって)光を光ファイバー基板の外側から直接CCDセンサーへ画像化するために使用され得る。基板が、光ファイバー連結を備えない場合、レンズシステムはまた、上記に記載されるように使用され得、その場合、基板または灌流チャンバカバーのいずれかは、光学的に透明である。代表的なCCD画像化システムは、上記に記載されている。
【0134】
画像化システム230は、基板表面上のリアクターから光を収集するために使用される。例えば、光は、当該分野で公知の高感度低ノイズ装置を使用してCCD上で画像化され得る。光ファイバーベースの画像化のため、カバースリップ内に直接光ファイバーを組み込むことが好ましい。
【0135】
画像化システムは、コンピューター制御およびデータ収集システム240に連結される。一般的に、任意の一般的に入手可能なハードウェアおよびソフトウェアパッケージが、使用され得る。コンピューター制御およびデータ収集システムはまた、試薬送達を制御するため導管200に連結される。
【0136】
本発明の灌流チャンバの例を、図3に例示する。灌流チャンバは、統制な上側のスライドおよび下側のスライドを備える密封された区画を含む。基板表面の表面上での溶液の線形流れを可能にするよう、そして試薬の迅速な交換を可能にするように設計される。従って、例えば、この灌流チャンバは、ピロホスフェート配列決定反応を実行するのに適切である。灌流チャンバを横切る層流は、チャンバの幅を減少させそして長さを増大することによって最適化され得る。
【0137】
灌流チャンバは、準備されている間は好ましくは画像化システムから取り外され、そして配列決定分析を行う場合にのみ画像化システムに配置される。
【0138】
1つの実施形態において、固体支持体(すなわち、DNAチップまたはガラススライド)は、金属ハウジングまたはプラスチックハウジングによって適所に保持され、この固体支持体の交換を可能にするために組み立てられそして分解され得る。
【0139】
灌流チャンバの下側の固体支持体は、反応中心アレイおよび(伝統的な光学ベースの焦点システムについては)高開口数対物レンズを所持し、高開口数対物レンズは、CCD画像化システム上に反応中心アレイの画像の焦点をあわせるために使用する。
【0140】
ピロホスフェート配列決定反応によって生成された光子は、光子が焦点デバイス(例えば、光学レンズまたは光ファイバー)を通過する場合のみCCDに捕獲され、そしてCCDエレメント上に集束する。しかし、放射された光子は、全ての方向に等しく逃げるはずである。平坦アレイ(例えば、DNAチップ)を利用する場合、その後の「捕獲」および定量を最大にするために、平坦固体支持体で速やかに光子を収集することが好ましい。これは、以下:(i)カバースリップと伝統的な光学レンズもしくは光ファイバーバンドルとの間で光学液浸オイルを利用する工程または、好ましくは(ii)カバースリップ自体に光ファイバーを直接組み込む工程のいずれかによって達成される。同様に、薄い、光学的に透明な平坦表面を使用する場合、光ファイバーバンドルはまた、裏表面に対して配置され得、反応/灌流チャンバの全体の深さを介して「画像化する」必要はなくなる。
1つの局面において、本発明は、複数の分析を処理する装置であって、該装置は、以下: 核酸分子をその上に配置した、複数の空洞表面を含む基板を中に配置した流れチャンバ;処理試薬を1つ以上のリザーバーから該流れチャンバへ送達し、それによって複数の微小粒子に固定された分析物が該試薬に曝される流体手段;および該複数の各微小粒子から光学シグナルの配列を検出し、該配列の各光学シグナルが処理試薬とそれに固定される該分析物との間の相互作用の指標である検出手段、ここで該検出手段が該空洞表面と連絡する検出手段を含む前記装置を具体化する。検出手段は、各々のデジタル画像における各々の該微小粒子から前記光学シグナルを相関付けて、配列を形成させるためのシグナル追跡手段をさらに含んでよい。シグナル追跡手段はCCDカメラを含んでよく、そして分析物はDNAを含んでよい。
【0141】
(連結されたアンカープライマーを有する光ファイバー基板アレイ)
いくつかの実施形態において、固体支持体は、配列反応副産物を検出および送達するために使用される光ファイバーのバンドルに結合される。バンドル中の光ファイバーの総数は、配列決定反応に利用される個々のアレイの数に合わせるように変えられ得る。バンドルに組み込まれた光ファイバーの数は、1:1の画像化を可能にするようにCCDに合うように(すなわち、約60mm×60mm)設計される。光ファイバーの所望の数は、最初にバンドルの中に融合され、その末端は切断されており、そして必要とする厚さ(例えば、1.5mm)の「ウェーハ」を形成するように磨かれている。生じた光ファイバーウェーハは、ガラス表面の取り扱い特性と同様の取り扱い特性を持つ。個々のファイバーは、任意のサイズの直径(例えば、3μm〜100μm)であり得る。
【0142】
いくつかの実施形態において、2つの光ファイバーバンドルが、使用される:第1のバンドルは、CCDセンサー(ファイバーバンドルまたはコネクターまたは固体支持体)に直接取りつけられ、そして第2のバンドルは、灌流チャンバ基板(ウェーハまたは基板)として使用される。この場合、2つは、直接接触するように、必要に応じて光学連結流体を使用して、CCDセンサー上で反応中心を画像化するために配置される。バンドルの全体のサイズは、灌流チャンバ内で所望の試薬(流れ)特性を維持しながらCCDの有用な面積を最適化するように選択される。従って、15μmピクセルで4096×4096ピクセルのCCDアレイに対しては、ファイバーバンドルは、約60mm×60mmであるように、または約90mmの直径を有するように選択される。ウェーハは、CCD面積の使用を最大にするためにわずかに大きくてもよく、代表的な顕微鏡スライドの様式(25mm×75mm)に合わせるためにわずかに小さくてもよい。バンドル中の個々のファイバーの直径は、当該分野の技術水準の制約内で、単一の反応が単一のCCDピクセル上で画像化される確率を最大にするように選択される。3〜100μmの範囲で任意の直径を使用し得るが、代表的な直径は、ファイバーバンドルについては6〜8μm、ウェーハについては6〜50μmである。ファイバーバンドルは、CCDカメラ製造業者から市販される。ウェーハは、Incom,Inc.(Charlton,MA)から得られ得、そして大きな光ファイバーの融合体から切断され、そして磨かれ、可能であれば0.5mm〜5mmの厚みであるが、代表的には2mmの厚みである。ウェーハは、窓ガラスまたはガラス顕微鏡スライドと同様の取り扱い特性を有する。
【0143】
他の実施形態において、平坦支持体は、省略され、そしてアンカープライマーは、光ファイバーの末端に直接連結される。好ましくは、アンカープライマーは、図4に略図的に示されるように空洞化された末端に取り付けられる。末端は、光ファイバー材料にくぼみを形成するため、例えば、酸で処理される。ここでこのくぼみは、個々の光ファイバーの直径の約2分の1倍〜このファイバーの直径の2〜3倍までの深さの範囲である。
【0144】
空洞は、不定量の時間、酸バス内に光ファイバーウェーハの片面を配置することによってこのファイバーの末端に導入され得る。時間の量は、所望される反応空洞全体の深さに依存して変わり得る(例えば、Waltら、1996.Anal.Chem.70:1888を参照のこと)。光ファイバーのバンドルの末端にエッチングされた空洞に分子を取りつける(および取りつけられた分子を検出する)いくつかの方法が、当該分野で公知である。例えば、Michaelら、Anal.Chem.70:1242−1248(1998);Fergusonら、Nature Biotechnology 14:1681−1684(1996);HealeyおよびWalt、Anal.Chem.69:2213−2216(1997)を参照のこと。反応性部位のパターンはまた、平坦支持体上の反応性パッドのパターンの産生に使用されたフォトリソグラフィック技術と同様の技術を使用してマイクロウェルに作成され得る。Healeyら、Science 269:1078−1080(1995);MunkholmおよびWalt、Anal.Chem.58:1427−1430(1986)、およびBronkら、Anal.Chem.67:2750−2757(1995)を参照のこと。
【0145】
光ファイバーウェーハの反対側(すなわち、エッチングされていない側)は、第2の光ファイバーバンドルに光学連結(例えば、液浸オイルまたは他の光学結合流体によって)し得るように高度に磨かれている。この第2の光ファイバーバンドルは、反応チャンバを含む光学ウェーハの直径に正確に合い、そして第2の光ファイバーバンドルの取りつけられたCCD画像化システムまたはカメラへの、ピロホスフェート配列決定反応によって産生された光子の送達のための導管として作用する。
【0146】
光ファイバーウェーハの表面は、好ましくは配列決定反応におけるその使用を容易にするようにコートされる。コートされた表面は、好ましくは光学的に透明であり、取りつけられたタンパク質および核酸の簡単な化学的改変を可能にし、そして固定化されたタンパク質の活性に悪影響を及ぼさない。さらに、表面は、好ましくは高分子の非特異的吸収を最小にし、そして連結された高分子(例えば、取りつけられた核酸およびタンパク質)の安定性を増大させる。
【0147】
アレイをコートするのに適切な材料は、例えばプラスチック(例えば、ポリスチレン)を含む。プラスチックは、好ましくはスピンコートまたはスパッター(0.1μmの厚み)され得る。アレイをコートする別の材料は、長鎖チオールアルカンの吸着された自己組み立て単層と共に金層(例えば、24金、0.1μmの厚み)を含む。次いで、ビオチンは、表面に共有結合的に連結され、そしてビオチン結合タンパク質(例えば、ストレプトアビジン)で飽和にされる。
【0148】
コーティング材料は、さらにアンカープライマーを基板に取りつけるため使用されるシステムを含み得る。有機シラン試薬(アミノ基、スルフヒドリル基またはカルボキシル基を介するタンパク質の直接共有結合連合を可能にする)はまた、アレイをコートするため使用され得る。さらなるコーティング基板は、光反応リンカー(例えば、光ビオチン)を含む(Amosら、「Biomaterial Surface Modification Using Photochemical Coupling Technology」Encyclopedic Handbook of Biomaterials and Bioengineering,Part A:Materials,Wiseら(編)、New York、Marcel Dekker、pp.895926、1995)。
【0149】
さらなるコーティング材料は、好ましくは表面にまたは重合後共有結合的に取りつけられたポリマー鎖に直接重合する親水性のポリマーゲル(ポリアクリルアミド、ポリサッカライド)(Hjerten,J.,J.Chromatogr.347,191(1985);Novotny,M.,Anal.Chem.62,2478(1990))、およびポリスチレンまたはシラン化されたガラス表面のいずれかに(Hoら、Langmuir 14:3889−94,1998)、および受動的に吸着されたビオチン結合タンパク質の層に特異的に吸着されるプルロニック(pluronic)ポリマー(3ブロックコポリマー、例えば、F−108としてまた公知のPPO−PEO−PPO)を含む。
【0150】
さらに、任意の上記材料は、金属キレート化基(例えば、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、五座キレート剤)で誘導体化され得、この金属キレート化基は、6×Hisタグ化されたタンパク質および核酸を結合する。
【0151】
好ましい実施形態において、融合された光ファイバーバンドル/ウェーハを産生するために利用される個々の光ファイバーは、光画像化システムにおいて利用される光ファイバーの直径(例えば、3μm)よりも直径が大きい(例えば、6μm〜12μm)。従って、いくつかの光画像化ファイバーは、単一反応部位を画像化するために利用され得る。
【0152】
エッチングされた半球状のジオメトリーは、隣接したアンカーパッドから放出されたPPiからのバックグランドシグナルを減少させる。「チップ」ベースのジオメトリーの使用(ここでは、必要とされる配列決定試薬が、固体支持体マトリックス(すなわち、アンカーパッド)の表面上を「流れる」)とは対照的に、酸エッチングされた光ファイバーウェーハの実施形態において種々の配列決定試薬の送達は、酸エッチングされた空洞を、dNTP/APS/スルフリラーゼ試薬へ、次いで引き続き任意の残留dNTPの分解を容易にするアピラーゼ試薬へと交互に液浸によって行われる。
【0153】
(ピロホスフェート配列決定反応の最適化の基礎をなす数学的解析)
理論による束縛を望まないが、反応条件の最適化は、以下の解析を基礎とする仮定を使用して行われ得ると、考えられる。
【0154】
固相ピロホスフェート配列決定は、最初は、固相技術と生物発光を利用する合成による配列決定技術を併用することによって開発された(例えば、Ronaghiら、1996.Real−time DNA Sequencing using detection of pyrophosphate release.Anal.Biochem.242:84−89を参照のこと)。固相方法論において、固定化されたプライム化DNA鎖は、DNAポリメラーゼ、ATPスルフリラーゼおよびルシフェラーゼと共にインキュベートされる。中間洗浄工程と伴う段階的なヌクレオチド付加によって、連続的な重合化の事象が、引き続いて起こり得る。S/N比は、システムにおけるα−チオdATPの使用によって増大する。このdATPアナログは、DNAポリメラーゼによって効率的に組み込まれるが、ルシフェラーゼの基質としては働かない。このことは、バックグランドの蛍光を減少させ、そして実時間での配列決定反応の実行を容易にする。これらの初期の研究において、固体支持体としてストレプトアビジンでコートされた磁性ビーズを使用するPCR産物の配列決定が、提供された。しかし、各ヌクレオチドと酵素の添加との間に実行される洗浄中のビーズの損失が、この技術を短い配列に限定することが、見出された。
【0155】
現在、ピロホスフェート配列決定方法論は、単一DNA配列決定鋳型の多数の同一コピーからDNA配列を確かめるために合理的に十分確立された歴史を有する(例えば、Ronaghiら、1996.Real−Time DNA Sequencing Using Detection of Pyrophosphate Release,Anal.Biochem.242:84−89;Nyrenら、Method of Sequencing DNA,特許WO9813523A1(1998年4月2日発行;1997年9月26日出願);Ronaghiら、1998.A Sequencing Method Based on Real−Time Pyrophosphate Science 281:363−365(1998)を参照のこと)。ピロホスフェート(PPi)生成反応は、生物発光に基づく非常に高感度の技術によってモニターされ得る(例えば、Nyrenら、1996.pp.466−496(Proc.9th Inter.Symp.Biolumin.Chemilumin.を参照のこと)。これらの生物発光アッセイは、異なる核酸改変反応において放出されるPPiの検出に依存する。これらのアッセイにおいて、産生されたPPiは、続いて、ATPスルフリラーゼによってATPへ変換され、そしてATP産生は、ルシフェラーゼによって連続的にモニターされる。例えば、ポリメラーゼ媒介反応において、ヌクレオチドが、ポリメラーゼによって合成されている成長中の核酸鎖に組み込まれる場合、PPiが、産生される。一般的に、DNAポリメラーゼは、ピロホスフェート配列決定反応中にPPiを産生するため利用されるが(例えば、Ronaghiら、1998.Doctoral Dissertation,The Royal Institute of Technology,Dept.of Biochemistry(Stockholm,Sweden)を参照のこと)、重合現象に続いて逆転写酵素(例えば、Karamohamamedら、1996.pp.319−329(Proc.9th Inter.Symp.Biolumin.Chemilumin.)を参照のこと)またはRNAポリメラーゼ(例えば、Karamohamamedら、1998.BioTechniques 24:302−306を参照のこと)を使用することもまた、可能である。
【0156】
例えば、生物発光プライマー伸長アッセイは、3’末端での単一ヌクレオチドミスマッチを試験するために利用された(例えば、Nyrenら、1997.Anal.Biochem.244:367−373を参照のこと)。ファージプロモーターは、代表的には、少なくとも1つの任意プライマー上に結合され、そして増幅に続いて、転写ユニットが、得られ得、次いでRNAポリメラーゼによる段階的伸長に供される。次いで、転写媒介PPi放出は、生物発光アッセイ(例えば、ATPスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ)によって検出され得る。このストラテジーを使用することによって、追加の特異的な配列決定プライマーを用いることなく2本鎖DNAを配列決定することが、可能でありそうである。一連の「ラン−オフ」アッセイにおいて、T7ファージRNAポリメラーゼによる伸長が、試験され、そしてかなり遅いことが見出された(例えば、Kwokら、1990.Nucl.Acids Res.18:999−1005を参照のこと)。3’ミスマッチ末端の後の続く正しい天然のデオキシヌクレオチドに対するα−チオヌクレオチドアナログの置換は、重合化速度を5倍〜13倍減少させ得る。しかし、2〜3の塩基の組み込み後は、DNA合成の速度は、通常の鋳型/プライマーに対して観察される速度に匹敵する。
【0157】
この技術による単一塩基検出は、システムへのアピラーゼの組み込みによって改良さた。アピラーゼは、NTP加水分解を触媒し、そしてヌクレオチド濃度をDNAポリメラーゼのKmよりはるかに下に低下させる。アピラーゼの使用は、ミスマッチされた塩基との接触に際してさらなる伸長を最小化し、それによってデータ解析を単純化する。上記技術は、変異検出および単一ヌクレオチド多形性(SNP)分析の領域における適用において迅速な実時間分析を提供する。
【0158】
ピロホスフェート配列決定システムは、DNA合成をモニターするためにいくつかの酵素により順次触媒される反応を使用する。安定性、特異性、感受性、KMおよびKCATなどの酵素特性は、システムの最適実行に重要である。ピロホスフェート配列決定システムにおいて、検出酵素(すなわち、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼ)の活性は、一般に、配列決定反応の間一定のままであり、そして高量の産物によって非常にわずかだけ阻害される(例えば、Ronaghiら、1998.Doctoral Dissertation,The Royal Institute of Technology,Dept.of Biochemistry(Stockholm,Sweden)を参照のこと)。スルフリラーゼは、約2.0秒でPPiをATPへ変換し、そしてルシフェラーゼによる光の生成は、0.2秒未満で起こる。最も重大な反応は、DNA重合およびヌクレオチドの分解である。ピロホスフェート配列決定方法論に利用される酵素を特徴付ける定数値を、以下に列挙する:
【0159】
【表1】
これらの4つの反応に関与する酵素は、同じ基質について競合する。従って、基質濃度の変化は共役する。初期反応は、鎖延長のためのポリメラーゼ/DNA複合体へのdNTPの結合である。この工程を迅速にするため、ヌクレオチド三ホスフェート濃度は、DNAポリメラーゼのKMより高くなければならない。しかし、ヌクレオチド三ホスフェートの濃度が、高すぎる場合、より低いポリメラーゼ忠実度が、観察され得る(例えば、Clineら、1996,PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerase.Nucl.Acids Res.24:3546−3551を参照のこと)。濃度の適切な範囲は、ミス取り込み(misincorporationのKM(これは通常はるかに高い)によって確立される(例えば、Capsonら、1992.Kinetic characterization of the polymerase and exonuclease activity of the gene 43 protein of bacteriophage T4.Biochemistry 31:10984−10994を参照のこと)。非常に高い忠実度は、固有のエキソヌクレアーゼ活性をもつポリメラーゼの使用によって達成され得るが、それらの使用はまた、プライマー分解が起こり得るという不利益を保有する。
【0160】
DNAポリメラーゼIのKlenow断片(Klenow)のエキソヌクレアーゼ活性は、低いが、プライマーの3’末端は、ヌクレオチド三ホスフェートの非存在下でのより長いインキュベーションで分解され得る(例えば、Ronaghiら、1998.Doctoral Dissertation,The Royal Institute of Technology,Dept.of Biochemistry(Stockholm,Sweden)を参照のこと)。忠実度は、エキソヌクレアーゼ活性なしに維持される。なぜなら、重合工程における誘導適合結合メカニズムが、正しいdNTPに対して非常に効率的な選択性を提供するからである。1×105〜1×106の忠実度が、報告された(例えば、Wongら、1991.An induced−fit kinetic mechanism for DNA replication fidelity.Biochemistry 30:526−537を参照のこと)。ピロホスフェート配列決定において、エキソ−Klenow または Sequence(登録商標)などのエキソヌクレアーゼ−欠損(エキソ−)ポリメラーゼは、高い忠実度を有することが確認された。
【0161】
本発明のピロホスフェート配列決定方法論における空間的な制約および時間的な制約のための推定が計算された。ここで、本システムは、総容量5μlのために約50μmの高さで、1cm2の面積を有する。時間的制約に関して、反応のカスケードに関与する分子種は、最初に規定される。ここで:
N=表面に取り付けられたDNA
PPi=放出されたピロホスフェート分子
ATP=ピロホスフェートから産生されたATP
L=ルシフェラーゼによって放出された光。
【0162】
N(0)は、ヌクレオチドが付加されていないDNAであり、N(1)は、1ヌクレオチドが付加されており、N(2)は、2ヌクレオチドをが付加されているなどとさらに特定される。分子種の濃度に関する擬似一次速度定数は:
N(n)→N(n+1)+PPi kN
PPi→ATP kP
ATP→L kA
である。
【0163】
さらに、PPiに対する拡散定数DPおよびATPに対する拡散定数DAもまた、特定されなければならない。これらの値は、希釈水溶液中の生体分子に対する以下の例示的拡散定数から推定され得る(Weisiger,1997.Impact of Extracellular and Intracellular Diffusion on Hepatic Uptake Kinetics Department of Medicine and the Liver Center,University of California,San Francisco,California,USA,dickw@itsa.ucsf.edu,http://dickw.uscf.edu/papers/goresky97/chapter.htmlを参照のこと)。
【0164】
【表2】
ここで、オリジナル文献1は:Longsworth,1954.Temperature dependence of diffusion in aqueous solution,J.Phys.Chem.58:770−773;オリジナル文献2は:Gaigalasら、1992.Diffusion of Bovin serum albumin in aqueous solution,J.Phys.Chem.96:2355−2359;およびオリジナル文献3は:Cheng,1993.Quantitation of non−English diffusion behavior of water in biological tissues by proton NMR diffusion imaging:Synthetic image calculations,Magnet.Reson.Imaging 11:569−583である。
【0165】
PPiの拡散定数を推定するために、次の例示値が、利用され得る(CRC Handbook of Chemistry and Physics,1983.(W.E.Weast.編)CRC Press Inc.,Boca Raton,FLを参照のこと):
【0166】
【表3】
PPiの分子量は、174amuである。前述の例示値に基づけば、PPiに対して約0.7×10-5cm2/秒の拡散定数が、予想される。
【0167】
3つのピロホスフェート配列決定反応を触媒する酵素は、ほぼMichaelis−Menten速度論に近似していると考えられる(例えば、Stryer,1988.Biochemistry,W.H.Freeman and Company,New Yorkを参照のこと)。これは、以下に記述され得る:
KM=[E][S]/[ES]、
速度=Vmax[S]/(KM+[S])、
Vmax=Kturnover[ET]
ここで[S]は、基質濃度であり、[E]は、遊離酵素の濃度であり、[ES]は、酵素基質複合体の濃度であり、そして[ET]は、酵素の総濃度=[E]+[ES]である。
【0168】
反応時間は、論文に記載される溶液相ピロホスフェートベース配列決定と少なくとも同程度に速いことが好ましい。基質が産物に変換される速度は、
−d[S]/dt=Kturnover[ET][S]/(KM+[S])である。
【0169】
基質の有効な濃度は、複製されたDNA分子のサイズ(最大(10μm)3)、およびコピーの数(約10,000)から推定され得、約17nMの濃度になる。これは、前述した酵素に対するKMよりも小さく、それによって速度は、
−d[S]/dt=(Kturnover/KM)[ET][S]と推定され得る。
【0170】
従って、擬似一次速度論を用いて、基質消失の反応速度定数は、所定の酵素に対する定数KturnoverおよびKMならびに[ET]に依存する。従って、論文において報告された同じ酵素濃度を使用することは、同様の速度を生ずる。
【0171】
ピロホスフェート配列決定反応における第1の工程(すなわち、新しいヌクレオチドの組み込みとPPiの放出)は、ここで詳細に検討される。好ましい反応条件は:0.2mlの緩衝液中1pmol DNA、3pmolポリメラーゼ、40pmol dNTPである。上記の好ましい反応条件下で、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片に対するヌクレオチド取り込みのためのKMは、0.2μMであり、そしてSequenase2.0TM(US Biochemicals,Cleaveland,OH)のためのKMは、0.4μMであり、そして1塩基の完全な取り込みは、15nMのポリメラーゼ濃度を用いて0.2秒未満である(例えば、Ronaghiら、1996.Real−Time DNA Sequencing Using Detection of Pyrophosphate Release,Anal.Biochem.242:84−89を参照のこと)。
【0172】
5μlの反応容量には、それぞれ10,000の配列決定プライマー部位を有する合計10,000のアンカープライマー、すなわち1×108の総伸長部位=0.17fmolが存在する。論文において以前に公開された結果は、ポリメラーゼが、反応混合物中に3倍豊富に、すなわち0.5fmolで存在するはずであることを示唆する。従って、ポリメラーゼの最終濃度は、0.1nMである。これらの反応条件は、本発明の実施において容易に得られることに、注意すべきである。
【0173】
以前に述べたように、ヌクレオチド付加反応に必要とされる時間は、1ヌクレオチド当たり0.2秒より大きくない。従って、反応を合計T秒間進行させる場合、ヌクレオチド付加は、(T/0.2)の同一ヌクレオチドまでの伸長部(stretch)が、そのポリメラーゼの作用により完全に充填されるに十分に迅速であるはずである。以下に考察されるように、ピロホスフェート配列決定反応の律速段階は、完了するために合計約2秒を必要とするスルフリラーゼ反応である。従って、スルフリラーゼ反応を完了させる総反応時間は、ポリメラーゼが10の同一ヌクレオチドの伸長部を「充填」し得るに十分であるべきである。ランダムDNA種において、10以上の同一ヌクレオチドの領域は、1ヌクレオチド当たり約4-10の確率(約1×10-6)で起こることが示された。本発明の好ましい実施形態におけるアンカープライマーから伸長された10,000配列(それぞれは、少なくとも30nt.そして好ましくは100nt.伸張されている)中に10の同一ヌクレオチドの並びがおよそ1つ存在すると予測される。従って、同一ヌクレオチドの並びは、本発明の実施において困難を提起するはずがないと結論し得る。
【0174】
生じるDNA分子の全体サイズは、好ましくは、固定パッドのサイズ(すなわち10μm)より小さく、そして個々の固定パッド間の距離(すなわち100μm)よりも小さくなければならない。合計Nヌクレオチドを有する1本鎖DNAコンカテマーの回転半径は、以下の等式によって数学的に推定され得る:半径=b(N/N0)0.6、ここで、bは、持続長さであり、そしてN0は、1持続長さあたりのヌクレオチドの数であり;べき指数0.6は、自己回避ウォーク(self−avoiding walk)の特性を示している(例えば、Doi,1986.The Theory of Polymer Dynamics(Clarendon Press,New York);Flory,1953.Principles of Polymer Chemistry(Cornell University Press,New York)を参照のこと)。例として、1本鎖DNAを使用すると、bは、4nmであり、そしてN0は、13.6nt.である(例えば、Grosberg,1994.Statistical Physics of Macromolecules(AIP Press,New York)を参照のこと)。100マーの10,000コピーの使用では、N=1×106であり、回転半径は3.3μmである。
【0175】
スルフリラーゼ反応は、ここで詳細に考察される。アデノシン5’−ホスホ硫酸(APS)およびPPiからのATPの生成時間は、2秒未満であると推定された(例えば、NyrenおよびLundin,1985.Anal.Biochem.151:504−509を参照のこと)。0.2ml緩衝液における1pmol PPi(5nM)について報告された反応条件は、0.3U/mlATPスルフリラーゼ(ATP:硫酸アデニリルトランスフェラーゼ;Prod.No.A8957;Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)および5μM APSである(例えば、Ronaghiら、1996.Real−Time DNA Sequencing Using Detection of Pyrophosphate Release,Anal.Biochem.242:84−89を参照のこと)。スルフリラーゼに対するメーカーの情報(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)は、1mgタンパク質あたり5〜20単位(すなわち、1単位は、30℃、pH8.0で1分当たりにAPSおよびPPiから1.0μmoleのATPを産生する)の活性を報告し、他方で別の文献に、その比活性は、140単位/mgとして報告された(Karamohamedら、1999.Purification,and Luminometric Analysis of Recombinant Saccharomyces cerevisiae MET3 Adenosine Triphosphate Sulfurylase Expressed in Escherichia coli,Prot.Express.Purification 15:381−388を参照のこと)。本発明の実施において利用される反応条件は、前述の参考文献において報告された反応条件と同様であるという事実から、アッセイ中のスルフリラーゼ濃度は、4.6nMと推定された。従って、半最大速度では、[APS]=0.5μMおよび[PPi]=7μMである。
【0176】
本発明で利用される反応条件において、[PPi]は、5μl中約0.17fmol、または0.03nMである。酵素に結合されたPPiの割合は、[E]/KMであり、ここで[E]は、遊離酵素の濃度である。この酵素濃度は、PPi濃度よりもずっと大きいため、総酵素濃度のみが、この計算に使用され得る。酵素に結合されたPPiの割合は、4.6nM/7μM=7×10-4であることが見出された。従って、PPiは、ATPへ変換される前にそのほとんどの時間を自由拡散に費やすと結論される。
【0177】
各PPiが反応する平均時間は、1/kP=2秒である。PPiが各方向に拡散する平均平方距離は、約2DP/kPまたは2.8×103μm2である。各方向におけるRMS距離は、53μmである。この値は、個々のアンカープライマーのそれぞれが、50μmよりも離れなければならず、または1つのアンカーから放出されるPPiが、次へ拡散し、そして検出され得ることを示している。
【0178】
上述の現象を説明するために使用され得る別の方法は、第2のアンカーパッドで産生され、その後第1のアンカーパッドの位置に拡散するPPiの量に対する、第1のアンカーパッドで産生された第1のアンカーパッド上のPPiの量を推定することである。これらの2つの量が大きさにおいてそれぞれに近づく場合、バックグランドのシグナルから「真の」シグナルを識別することが難しくなる。これは、aをアンカーパッドの半径として、1/b2をアンカーパッドの密度として定義することで数学的に記述され得る。先に公開されたデータに基づいて、aは、10μmにほぼ等しく、そしてbは、100μmにほぼ等しい。第1のアンカーパッド上に存在するPPiの量は、以下:
exp(−kPt)[1−exp(−a2/2DPt)]によって記述され、そして第2のアンカーパッド上に存在するPPiの量は、以下:
(1/3)exp(−kPt)[pa2/b2]exp(−b2/2DPt)によって数学的に近似され得る。前係数1/3は、DNA配列の1/4が1ヌクレオチドを取り込み、次いでこれらの1/4が第2のヌクレオチドを取り込むなどを仮定し、従って一連の合計が1/3である。2DPtが、b2とほぼ等しくなる場合、第1のアンカーパッド上および第2のアンカーパッド上のPPiの量は、大きさが似てくる。従って、分子が拡散するRMS距離が、隣接アンカーパッド間の距離と等いことが示される。従って、本発明の実施において利用されるアッセイ条件に基づけば、アンカーパッドは、約50μmよりも近くに配置されてはならず、そして好ましくは、少なくともさらに3倍(すなわち、150μm)隔てられている。
【0179】
前述の知見は、アンカーパッドの表面密度に制限を設けるが、多くの異なるアプローチの使用によって、アンカーパッドの全表面密度を増加させると同時に距離要求を減らすことは可能である。1つのアプローチは、初期光だけを検出することであるが、これは特に多くの連続する同一ヌクレオチドを有するDNA配列からのシグナルを損失する不利益がある。
【0180】
アンカーパッド間の距離を減らすための第2のアプローチは、反応混合物中のスルフリラーゼの濃度を増加させることである。反応速度kPは、スルフリラーゼ濃度に正比例し、そして拡散距離は、kP -1/2に比例する。従って、スルフリラーゼ酵素濃度が、4倍の係数で増加した場合、同時に個々のアンカーパッド間の距離は、2倍の係数で減少し得る。
【0181】
第3のアプローチは、スルフリラーゼをアンカーパッドの表面に結合することによってスルフリラーゼの有効濃度を増加させることである(本明細書中に記載される他の酵素のためまた働く)。アンカーパッドは、配列決定反応の中心を囲む立方体の表面の1つの壁として近似され得る。このパッドについて10μm×10μmの表面を仮定すると、1μMの濃度を生成するためにパッドに結合された分子の数は、約600,000分子である。
【0182】
アッセイにおけるスルフリラーゼ濃度は、5nMと推定される。この有効濃度に達するために結合された分子の数は、約3,000分子である。従って、より多くの酵素分子を結合することで、より大きな有効濃度が、達成される。例えば、10,000分子が、1アンカーパッド当たり結合され得る。
【0183】
前に推定されたように、各スルフリラーゼ分子は、表面上で65nm2の総面積を占める。従って、表面に合計10,000のスルフリラーゼ酵素分子を固定する(すなわち、その結果放出された10,000のPPiに等しくする)ためには、1.7μm2を必要とする。この値は、10μm×10μmのアンカーパッド上の利用可能な表面積のわずか約2%である。従って、酵素濃度は、より高い値へ容易に増加し得る。
【0184】
個々のアンカーパッド間の距離を減少させ得る第4のアプローチは、水ベースのピロホスフェート配列決定試薬(例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール(PEG)など)の粘性を増加させる1つ以上の薬剤を利用して、PPiが拡散するためにかかる時間を著しく増加させることである。しかし、これらの薬剤はまた、同時に、配列決定反応中の他の非固定成分の拡散時間を増加させ、従って全体の反応速度論を緩慢にさせる。従って、これらの薬剤の使用はまた、配列決定反応自体を化学的に妨げるように機能し得る。
【0185】
個々のアンカーパッド間の距離を減少させ得る第5の好ましい方法論は、放出されたPPiが側方に拡散することを物理的に防ぐ空間的ジオメトリーにおいてピロホスフェート配列決定反応を行うことである。例えば、光ファイバーバンドルの末端を酸エッチィングすることによって作成される均一な空洞は、そのようなPPiの側方拡散を防ぐため利用され得る(Michaelら、1998.Randomly Ordered Addressable High−Density Optical Sensor Arrays,Anal.Chem.70:1242−1248を参照のこと)。この実施形態において、重要な変数は、PPiが高さhの空洞を抜け出すための総拡散時間を含み、ここでhは、エッチングされた空洞の深さである。この拡散時間は、式:2DPt=h2を利用して計算され得る。前述した計算における本発明の好ましいピロホスフェート配列決定反応条件の使用によって、配列決定反応が空洞からのPPiの完全な拡散の前に終了するよう進行するためには、深さ50μmの空洞が、必要とされることが示され得る。さらに、この型のジオメトリーは、隣接するアンカープライマーから放出されたPPiからバックグランドシグナルを同時に減少させるというさらなる利点を有する。「チップ」ベースジオメトリー(ここでは、必要とされる配列決定試薬は、固体支持体マトリックス(すなわち、アンカーパッド)の表面上を流される)の使用とは対照的に、酸エッチングされた光ファイバーバンドルの実施形態における種々の配列決定試薬の送達は、酸エッチングされた空洞をdNTP/APS/スルフリラーゼ試薬へ交互に、次いで、その後に残留dNTPの分解を容易にするためアピラーゼ試薬への浸漬することによって実施される。
【0186】
その後、一旦ATPが、本発明の好ましい反応条件の使用によって形成されると、反応時間(1/kA)は、0.2秒であることが示された。この反応時間は、PPiが自由に拡散する時間よりはるかに低いため、本発明において利用されるアッセイジオメトリーおよび条件に関する前述の結論を何も有意には変更しない。
【0187】
バックグランドの光の生成を弱めるため、ルシフェラーゼをDNA配列決定鋳型の領域に(例えば、固定化または結合によって)「局在させる」ことが、好ましい。PPi分子がATPを形成する前に拡散し得る距離によって描かれる領域に、ルシフェラーゼを局在させることが最も好ましい。ルシフェラーゼを固体支持体マトリックスに結合する方法は、文献において周知である(例えば、Wangら、1997.Specific Immobilization of Firefly Luciferase through a Biotin Carboxyl Carrier Protein Domain,Analytical Biochem.246:133−139を参照のこと)。従って、2秒間の拡散時間の間、ルシフェラーゼは、DNA鎖の50μmの距離内に固定される。しかし、拡散時間を減少させ、そしてルシフェラーゼ結合に必要とされる表面積をさらに限定することが好ましいということに注意するべきである。
【0188】
結合に必要なルシフェラーゼの濃度を測定するため、ルシフェラーゼが0.1μm ATPに対して10mVの応答を与える濃度で使用されるという以前に、公開された条件は、利用された(Ronaghiら、1996.Real−Time DNA Sequencing Using Detection of Pyrophosphate Release,Analytical Biochem.242:84−89を参照のこと)。より具体的には、0.2ml反応容量において、2ngのルシフェラーゼが0.1μM ATPに対して10mVの応答を与えることは文献から公知である(KaramohamedおよびNyren,1999.Real−Time Detection and Quantification of Adenosine Triphosphate Sulfurylase Activity by a Bioluminometric Approach,Analytical Biochem.271:81−85を参照のこと)。従って、0.2mlの総反応容量内の20ngのルシフェラーゼの濃度が、これらの以前に公開された文献の条件を再現するため必要とされる。本発明の個々のアンカーパッドのそれぞれの周りの10μm立方体の容量において、1×10-16gのルシフェラーゼ濃度を必要とし、そしてルシフェラーゼの71kDの分子量に基づいて、この濃度は約1,000ルシフェラーゼ分子と等しい。上述したように、ルシフェラーゼの表面積は、50nm2と計算された。従って、ルシフェラーゼ分子が、ビオチン化され、そしてアンカーパッドに結合されると仮定すると、1,000分子は、0.05μm2の総面積を占める。これらの計算から、各アンカーパッド領域の面積は100μm2であるので、多量のルシフェラーゼ分子が、アンカーパッドに結合され得ることは、容易に明白となる。
【0189】
再び、以前に文献に公開された結果に基づいて、配列決定するには、各ヌクレオチドにつき、全部で約3秒かかる(すなわち、ヌクレオチドを付加するために0.5秒;ATPを作成するために2秒;蛍光を得るために0.2秒)。従って、1ヌクレオチド当たり約60秒のサイクル時間が、合理的であり、1配列決定鋳型あたり30ヌクレオチドの情報を産生するためには、1実験あたり約30分を必要とする。
【0190】
前述の配列決定方法論(すなわち、ポリメラーゼ→PPi→スルフリラーゼ→ATP→ルシフェラーゼ→光カスケード)に対する代替の実施形態において、ヌクレオチドを成長中のDNA鎖に組み込む場合、光を発生させる能力を有するポリメラーゼが、(例えば、タンパク質融合の使用などにより)開発され得る。さらなる別の代替の実施形態において、配列決定反応においてPPiの生成を直接測定するセンサーが、開発され得る。PPiの生成が、周囲の緩衝液の電位を変化させるので、生成されたPPiの濃度を測定するためにこの変化が測定され較正され得る。
【0191】
前述のように、ピロホスフェート配列決定反応におけるヌクレオチド配列へのdNTPのポリメラーゼ媒介組み込みは、無機ピロホスフェート(PPi)部分の放出を引き起こし、この無機ピロホスフェート部分は、次いでルシフェラーゼによる触媒作用を介して光子(すなわち、光)の放出を引き起こす。ピロホスフェート配列決定反応によって生成された光子は、その後、種々の方法論(光電子増倍管、CCD、吸光光度計、照度計などを含むが、これらに限定されない)によって、「捕獲」および定量され得る。
【0192】
ピロホスフェート配列決定反応によって産生された光子は、集束デバイス(例えば、光学レンズまたは光ファイバー)を通過し、そしてCCDエレメント上に集められる場合にだけ、CCDによって捕獲される。捕獲されたこれらの光子の割合は、次の計算によって推定され得る。第1に、放射された光子を焦点に集めるレンズは、固体表面(すなわち、DNAチップまたはエッチングされた光ファイバーウェル)の表面から距離r(ここでr=1cm)にあり、そして光子が、アレイエレメント上に集められるためには直径b(面積=πb2/4)(ここでb=100μm)の領域を通過しなければならないと、仮定する。放射された光子は、全ての方向に等しく逃れるべきであることもまた、注意すべきである。距離rで、光子は、4πr2と等しい面積上に散らばる。従って、レンズを通過する光子の割合は、以下によって記述される:(1/2)[1−(1+b2/4r2)1/2]。rの値が、bの値よりもずっと大きい場合、レンズを通過する割合は、以下によって記述される:b2/16r2。前述したrおよびbの値に対して、光子のこの割合は、6×10-6である。
【0193】
各ヌクレオチド付加に対して、約10,000PPi分子が、産生されると予想され、そして全てが、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼによって変換される場合、これらのPPiは、約1×104光子の放射を生じる。平坦アレイ(例えば、DNAチップ)を利用する場合、続く光子の「捕獲」および定量を最大にするために、平坦固体支持体(例えば、カバースリップ)の直近で光子を収集することが好ましい。これは、以下:(i)カバースリップと伝統的な光学レンズまたは光ファイバーバンドルとの間に光学液浸オイルを使用すること、または好ましくは、(ii)光ファイバーを直接カバースリップ自体に組み込むことのいずれかによって成し遂げられ得る。前述した計算(この場合、b=100μmおよびr=50μm)を実施して、収集された割合は、0.15であることが見出された、これは約1×103個の光子の捕獲に等しい。この値は、適正シグナルを提供するには十分である。
【0194】
次の実施例は、本発明の例示のためであって、本発明を限定することを意味しない。
【0195】
(実施例1.空洞化末端光ファイバーアレイに連結されたアンカープライマーの構築)
薄いウェーハ光ファイバーアレイの末端は、Healeyら、Anal.Chem.69:2213−2216(1997)によって記載されるように末端を酸に挿入することによって空洞化した。
【0196】
光活性化可能ビオチンアナログの薄層を、HengsakulおよびCass(Biocongjugate Chem.7:249−254,1996)に記載のように空洞化表面上で乾燥させ、そして規定されたパッドまたは活性ビオチンの領域を作成するためにマスクを通して白色光に曝す。次に、アビジンを加え、そしてビオチンに結合させる。次いで、ビオチン化オリゴヌクレオチドを加える。アビジンは、ビオチン−アビジン−ビオチン連結を介してビオチン化オリゴヌクレオチドを固定化し得る遊離ビオチン結合部位を有する。
【0197】
パッドは、100μmの間隔で片面に約10μmである。パッドの約37%が、1つの固定されたプライマーを含むようにオリゴヌクレオチドを、付加する。1cm表面上に10,000パッドが置かれる。これは、単一アンカープライマーを有する約3700パッドを生じる。スルフリラーゼ、アピラーゼおよびルシフェラーゼもまた、ビオチン−アビジンを使用して空洞基板に取りつけられる。
【0198】
(実施例2.環状核酸ライブラリーのメンバーのアニールおよび増幅)
開環ライブラリー鋳型のライブラリーを、70bp Sau3A1−MspI断片上に単一ヌクレオチド多形性を含むと疑われる核酸の集団から調製する。鋳型は、アンカープライマーに相補的なアダプター、配列決定プライマーに相補的な領域、および特徴付けられるべき挿入配列を含む。ライブラリーを、ゲノムDNAを消化するSau3A1およびMspIを使用して産生する。インサート(約65〜75ヌクレオチド)を選択し、そしてアダプターオリゴヌクレオチド(12ヌクレオチド長)に連結する。アダプターオリゴヌクレオチドは、実施例1に記載の基板表面に連結したアンカープライマーの配列に相補的な配列を有する。
【0199】
ライブラリーを、アンカープライマーのアレイにアニールする。DNAポリメラーゼをdNTPと共に加え、アンカープライマーを伸張させるためローリングサークル複製を使用する。環状鋳型の多数のコピーの連接である、なお固体支持体に固定化された1本鎖DNAを生じる。百ヌクレオチドサイズの範囲に10,000コピー以上の環状鋳型。
【0200】
(実施例3.光ファイバー基板の末端に連結された核酸の配列分析)
実施例2に記載するような増幅した核酸を含む光ファイバーアレイウェーハを、灌流チャンバ内に配置し、そして光ファイバーアレイのバンドルに取りつける。そのアレイ自身を、16,000,000ピクセルCCDカメラに連結する。配列決定プライマーを、灌流チャンバへ送達し、そして増幅した配列をアニールさせる。
【0201】
配列決定プライマーは、図1に示すように、多形性を有すると疑われるインサート中へ伸長するDNA合成をプライム化する。まず、灌流チャンバ内へ洗浄溶液、DNAポリメラーゼ、そしてdTTP、dGTP、dCTP、またはαdATP(dATPアナログ)の1つを順次送達することによって配列決定プライマーを、伸長させる。末端に取りつけたスルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびアピラーゼは、配列決定反応の1部として遊離されたPPiを検出可能な光へ変換する。存在するアピラーゼは、未反応のdNTPを分解する。光は、代表的には、画像化ファイバーバンドルに連結されたCCDカメラによって3秒間(1〜100秒ではあるが、例えば、2〜10秒もまた、適切である)収集され、その後、過剰ヌクレオチドおよび副産物を除去するためにさらなる洗浄溶液を灌流チャンバへ加える。次いで、次のヌクレオチドをポリメラーゼと共に加え、それによってこのサイクルを繰り返す。
【0202】
洗浄中、収集した光画像を、CCDカメラからコンピューターへ移す。光放射を、コンピューターによって分析し、対応するdNTPが、伸長された配列プライマーへ組み込まれたかどうかを測定するため使用する。dNTPおよびピロホスフェート配列決定試薬の添加を、疑われる多形性を含むインサート領域の配列が得られるまで繰り返す。必要に応じて、配列決定プライマーを、ウェーハに結合する前に、増幅された配列にアニールする。
【0203】
(実施例4.ローリングサークル増幅を使用して産生された縦列反復鋳型の配列分析)
配列5’−gAC CTC ACA CgA Tgg CTg CAg CTT−3’(配列番号2)を有するプライマーを、配列5’−TCg TgT gAg gTC TCA gCA TCT TAT gTA TAT TTA CTT CTA TTC TCA gTT gCC TAA gCT gCA gCC A−3’(配列番号8)を有する88ヌクレオチド鋳型分子へアニールした。鋳型のプライマーへのアニールは、鋳型分子の5’末端および3’末端の並置状態を生じた。アニールした鋳型を、リガーゼに曝した。リガーゼは、鋳型の5’末端および3’末端の連結を生じて環状分子を産生した。
【0204】
アニールしたプライマーを、37℃、12時間のローリングサークル増幅においてクレノウ断片およびヌクレオチドを使用して伸長させた。産物を、SPRIビーズ(Seradyne,Indianapolis,IN)を使用して精製した。ローリングサークル増幅は、環状鋳型配列に相補的な配列の縦列反復の形成を生じた。
【0205】
伸長された配列の縦列反復産物を、配列5’−AAgCTgCAgCCATCgTgTgAgg−3’(配列番号8)を有する配列決定プライマーをアニールし、そしてアニールしたプライマーを、1Mベタインの存在下でET terminator chemistry(Amersham−Pharmacia)を使用して95℃、1分、20秒、60℃のサイクルに交互に40回供することにより同定した。
【0206】
次いで、配列決定産物を、1/5容量に希釈し、G−50 Sephadexカラム上で精製した後、直鎖ポリアクリルアミドと共にMegaBACE配列決定システム(Amersham−Pharmacia)に注入した。
【0207】
配列決定分析の通電クロマトグラフィーを、図5に示す。軌跡は、88塩基対環状鋳型分子の多数コピーが縦列に生じること、およびこれらのコピーがDNA配列決定反応において検出され得ることを示す。
【0208】
(他の実施形態)
本発明は、本発明の詳細な説明と共に記述されているが、その詳細な説明は、本発明の範囲を例示することを意図されるのであって、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定されることを、理解するべきである。他の局面、利点および改変は、本願発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1A〜Dは、アンカープライマーを用いたローリングサークルを基にした増幅の略図である。
【図2】 図2は、本発明による配列決定装置の図面である。
【図3】 図3は、本発明による灌流チャンバーの図面である。
【図4】 図4は、本発明の空洞化された光ファイバー末端の図面である。
【図5】 図5は、ローリングサークル増幅を用いて生成されたコンカテマー鋳型の配列出力の追跡である。
Claims (20)
- 核酸を分析するための基板であって、該基板が以下のものを含む:
複数の個々の光ファイバーの融合したバンドルから形成される空洞光ファイバーウェーハであって、各個々の光ファイバーは3から100μmの直径を有し、ウェーハは上面と底面を含み、上面は少なくとも10,000の部位を含み、ここで、該部位は空洞光ファイバーウェーハの上面内にエッチングされ、そして上面と底面間のウェーハの厚さは0.5mmから5.0mmであり、各部位の深さは、個々の光ファイバーの直径の2分の1から個々の光ファイバーの直径の3倍におよび、そして空洞ウェーハの上面上の複数の部位はその中に核酸を有する、上記空洞光ファイバーウェーハ;および、
空洞ウェーハの上面上の部位内の複数のビーズであって、それらに結合するスルフリラーゼを有する、複数のビーズ。 - 核酸が部位上、またはビーズ上に固定化されている、請求項1の基板。
- 空洞光ファイバーウェーハ中の各個々の光ファイバーの直径が6−50μmである、請求項1の基板。
- 空洞光ファイバーウェーハの上面が10μmから200μm離れている2つ以上の核酸を含む、請求項1の基板。
- 空洞光ファイバーウェーハの上面が50μmから150μm離れている2つ以上の核酸を含む、請求項1の基板。
- 空洞光ファイバーウェーハの上面が、分離した領域に104以上の核酸配列を含む、請求項1の基板。
- 空洞光ファイバーウェーハの上面が、分離した領域に105以上の核酸配列を含む、請求項1の基板。
- 基板が、空洞光ファイバー面と反対側に磨かれた光ファイバー面を有し、そして磨かれた面が第二の光ファイバーに光学連結を可能にする、請求項1の基板。
- 核酸がDNAである、請求項1の基板。
- ルシフェラーゼが固定化されたビーズをさらに含む、請求項1の基板。
- 複数の核酸を処理する装置であって、該装置は以下のものを含む:
複数の個々の光ファイバーの第一の融合したバンドルから形成される空洞光ファイバーウェーハを中に配置した流れチャンバであって、各個々の光ファイバーは3から100μmの直径を有し、ウェーハは上面と底面を含み、底面は光ファイバーの第二の融合したバンドルに光学連結を可能にするように高度に磨かれており、そして上面は少なくとも10,000の部位を有し、ここで、該部位は空洞光ファイバーウェーハの上面内にエッチングされ、そして上面と底面間のウェーハの厚さは0.5mmから5.0mmであり、各部位の深さは、個々の光ファイバーの直径の2分の1から個々の光ファイバーの直径の3倍におよび、そして空洞ウェーハの上面上の複数の部位はその中に核酸を有する、上記流れチャンバ;
空洞ウェーハの上面上の部位内の複数のビーズであって、それらに結合するスルフリラーゼを有する、複数のビーズ;
ヌクレオチド3リン酸を連続的に送達することを含む、追加のピロホスフェート配列決定試薬を1つ以上のリザーバーから該流れチャンバへ送達し、それにより光ファイバーウェーハの上面上の部位内の核酸を上記の追加の試薬に曝するための流体手段;および、
各部位からの光学シグナルを検出する検出手段であって、当該検出手段は上記部位と連絡し、各光学シグナルは上記の追加の試薬と上記の部位中の核酸との反応の指標である、上記検出手段。 - 空洞光ファイバーウェーハ内の各個々の光ファイバーの直径が6−50μmである、請求項11の装置。
- 検出手段がCCDカメラである、請求項12の装置。
- 核酸がDNAである、請求項11の装置。
- ルシフェラーゼが結合したビーズをさらに含む、請求項11の装置。
- 核酸が部位上に、またはビーズ上に固定化されている、請求項11の装置。
- 空洞光ファイバーウェーハの上面が10μmから200μm離れている2つ以上の核酸を含む、請求項11の装置。
- 空洞光ファイバーウェーハの上面が10μmから150μm離れている2つ以上の核酸を含む、請求項11の装置。
- 空洞光ファイバーウェーハの上面が、分離した領域に104以上の核酸配列を含む、請求項11の装置。
- 空洞光ファイバーウェーハの上面が、分離した領域に105以上の核酸配列を含む、請求項11の装置。
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