CN101802218A - 在核酸测序中用于自适应试剂控制的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了用于自适应试剂控制方法的实施方案，所述方法包括a)将第一浓度的酶试剂引入到含有反应底物的反应环境中，其中所述酶试剂和反应底物是测序过程的组成部分；b)测定所述反应环境中第一浓度酶试剂的活性水平，其中所述活性水平包括所述酶试剂与反应底物之间反应的可检测产物；c)用所检测到的第一浓度的活性水平来确定最佳浓度；和d)在所述反应环境中使用所述酶试剂的最佳浓度实施测序过程，其中所述测序过程包括一系列重复的测序反应。

Description

在核酸测序中用于自适应试剂控制的系统和方法
相关申请
本申请涉及申请日为2007年6月28日的美国临时专利申请顺序号60/946,743(名称为“System and Method for Adaptive Reagent Controlin Nucleic Acid Sequencing(在核酸测序中用于自适应试剂控制的系统和方法)”)并要求保护其优先权，所述专利申请通过引用全部结合到本文中，用于所有目的。
发明领域
本发明涉及分子生物学领域和一种或多种自适应试剂控制方法和元件(adaptive reagent control method and element)。更具体地讲，本发明涉及用于核酸测序过程的一种或多种酶试剂浓度的活性测定和动态调节，以优化性能并提高所述试剂和过程的效率。此外，本发明还涉及能自动化检测并调节试剂浓度的仪器装置。
发明背景
已知本领域有许多“测序”技术可应用于本文所描述的本发明，例如基于本领域普通技术人员公知的采用末端终止和大小分离技术的所谓Sanger测序法的技术。另一类高效的测序技术包括“合成测序(Sequencing-by-synthesis)”技术(SBS)。SBS技术通常用于测定核酸样品中一种或多种分子的特征(identity)或核酸组成。比起先前所采用的测序技术而言，SBS技术具有许多想要的优势。例如，与现有技术相比，SBS的实施方案能够进行所谓的高通量测序，产生大容量高品质的序列信息，而且费用低廉。另一个优势包括以大规模平行方式从多个模板分子同时产生序列信息。换句话说，可在一个过程中对来自一种或多种样品的多个核酸分子同时进行测序。
SBS方法的典型实施方案包括逐步合成与其核苷酸序列组成有待确定的模板核酸分子互补的单链多核苷酸分子。例如，SBS技术的操作通常是通过在相应序列位置上将单个核酸(也称为核苷酸)种类加到与模板分子的核酸种类互补的新生多核苷酸分子上而进行的。通常采用本领域已知的各种方法来检测新生分子上添加的核酸种类，这样的方法包括但不限于焦磷酸测序法或荧光检测法，例如使用可逆终止子或能量转移标记(包括荧光共振能量转移染料(FRET))的方法。通常，循环进行该过程，直到合成与模板互补的完全(即代表全部序列位置)或所需序列长度。
此外，如上所述的SBS的许多实施方案都能够以大规模平行方式进行测序操作。例如，可使用能自动进行制备和/或测序方法相关的一个或多个步骤或操作的仪器装置，来完成SBS方法的一些实施方案。某些仪器采用例如具有孔的板或其它类型的微型反应器配置的元件，这类元件能够在各孔或各微型反应器中同时进行反应。SBS技术以及用于大规模平行测序的系统和方法的其它实例可参见美国专利号6,274,320、6,258,568、6,210,891、7,211,390、7,244,559、7,264,929、7,335,762和7,323,305，其各自通过引用全部结合到本文中，用于所有目的；以及美国专利申请顺序号11/195,254，其通过引用全部结合到本文中，用于所有目的。
可以理解，SBS的典型实施方案对过程步骤或组成中所用的不同元件相关的参数差异是敏感的，这些差异例如酶促过程步骤中催化活性的不同水平。因此，通常在SBS的实施方案中最好采用提高一个或多个过程步骤或组成的效率的策略或方法。例如，通常可以理解，在下一循环利用不同核苷酸种类启动后续延伸反应之前，前一延伸循环中所利用的特定核苷酸种类的所有分子都应当被除去和/或使之失活。如果前一循环的核苷酸种类仍残留在用不同核苷酸种类的当前循环中，则某些残留核苷酸种类分子就有可能掺入到新生分子中。残留核苷酸种类分子的掺入将会被错误地翻译成当前循环中掺入的核苷酸种类。在本实例中，不想要的核苷酸种类分子的掺入可造成延后效应(carry forward effect)，这在下文有更详细介绍。因此，最好是采用一种或多种方法来确保残留核苷酸种类的分子以及其它不想要的反应产物或试剂被完全除去或失活。
特别有效并可用于SBS方法的一种方法就是用“腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)”来洗涤反应容器或底物区。相关领域普通技术人员都懂得腺苷三磷酸双磷酸酶是一种具有多种特性的酶，包括降解核苷三磷酸、二磷酸、ATP和PPi(焦磷酸(pyrophosphate))。在SBS实施方案中使用腺苷三磷酸双磷酸酶，仅仅简单地洗涤就能显著地提高对过量和不想要的核苷酸种类、试剂和反应产物的去除。例如，在每次反应循环结束时，都可用腺苷三磷酸双磷酸酶来“洗涤”或使之“流过”包含一个或多个反应区的固体支持物表面，从而促进对测序反应混合物中的任何残留的、未掺入的核苷酸种类分子的降解。腺苷三磷酸双磷酸酶还可用于降解前一循环所产生的ATP，因此能“灭掉”前一循环反应所产生的光。
在一个除去残留腺苷三磷酸双磷酸酶和反应产物的快速洗涤步骤之后，可以开始用不同核苷酸种类进行下一反应循环。在某些实施方案中，可将腺苷三磷酸双磷酸酶结合在固体或可移动的固体支持物上。腺苷三磷酸双磷酸酶的使用和由此使用带来的优势的其它实例可参见美国专利顺序号7,323,305(名称为“Methods of amplifying andsequencing nucleic acids(核酸的扩增和测序方法)”)，其通过引用全部结合到本文中，用于所有目的。
在典型的实施方案中，使用腺苷三磷酸双磷酸酶的正确浓度以避免不良效应是至关重要的。例如，如果腺苷三磷酸双磷酸酶的浓度太高的话，结果可包括后续循环中想要的核苷酸种类也被降解。换句话说，因为浓度太高，未反应的腺苷三磷酸双磷酸酶在反应循环开始时仍然存在，而这反过来又会降解本轮所加入的核苷酸种类分子。这样过量的腺苷三磷酸双磷酸酶活性造成了“不完全延伸”效应。另一方面，如果腺苷三磷酸双磷酸酶的浓度或活性太低的话，结果可包括前一循环的某一部分核苷酸种类或某一百分比的核苷酸种类仍存在于当前循环中。如上所述，腺苷三磷酸双磷酸酶活性低下或缺失会造成“延后”效应。因此，在本实例中，通常最好是测定腺苷三磷酸双磷酸酶活性，以便能调节其浓度，在反应中达到最佳活性水平。
如上所述，延后效应和不完全延伸效应可能是非最佳腺苷三磷酸双磷酸酶浓度或活性的结果，而且是要考虑的两个重要的错误来源。例如，在样品的每一扩增群体(即与自核酸分子模板扩增的拷贝基本相同的群体)中的一小部分模板核酸分子失去或放弃与该群体中其余模板核酸分子的时相同步性(也就是说，这部分模板分子相关的反应或超前或落后于在对该群体的测序反应循环中其它模板分子所针对的序列位置)。在本实例中，反应不能将一种或多种核苷酸种类适当地掺入到一个或多个新生分子中、以将序列延伸一位，这导致每个后续反应都在时相上落后于其余群体序列位置的序列位置上或在其外面的序列位置上开始进行。这样的效应在本文中就称为“不完全延伸”(incomplete extension，IE)。或者，通过在时相上超前于其余群体序列位置的序列位置上或在其外面的序列位置上掺入一种或多种核苷酸种类的新生分子的不完全延伸，在本文中就称为“延后”(carry forward，CF)。CF和IE的合并效应在本文中就称为CAFIE。时相同步错误及其校正方法的进一步描述可参见PCT申请顺序号US2007/004187(名称为“System and Method for Correcting Primer Extension Errors inNucleic Acid Sequence Data(用于校正核酸序列数据中引物延伸错误的系统和方法)”，申请日为2007年2月15日)，其通过引用全部结合到本文中，用于所有目的。
因此，非常有利的是，使用测定和调节腺苷三磷酸双磷酸酶浓度以及SBS方法和过程中其它重要试剂浓度的方法。尤其有用的是用不同仪器进行自动化实施方案，其中更希望能够动态测定酶或试剂的浓度或有效性，其中可以适应性地调节所述酶或试剂的浓度，以满足系统检测的需要。
发明概述
本发明的实施方案涉及对核酸序列的测定。更具体地讲，本发明的实施方案涉及对通过SBS进行核酸测序时所获取的数据进行错误校正的方法和系统。
描述了用于自适应试剂控制方法的一个实施方案，包括a)将第一浓度的酶试剂引入到含有反应底物的反应环境中，其中酶试剂和反应底物是测序过程的组成部分；b)测定反应环境中第一浓度酶试剂的活性水平，其中活性水平包括酶试剂与反应底物之间反应的可检测产物；c)用所检测到的第一浓度的活性水平来确定最佳浓度；和d)在反应环境中使用酶试剂的最佳浓度实施测序过程，其中测序过程包括一系列重复的测序反应。
在某些实施过程中，该方法也包括在步骤d)之前，用最佳浓度作为第一浓度来重复步骤a)和b)；和用所检测到的活性水平来证实酶试剂的最佳浓度。另外，该方法还可包括将第二浓度和第三浓度的酶试剂引入到含有反应底物的反应环境中；测定反应环境中第二浓度和第三浓度的酶试剂的活性水平；和用所检测到的第一、第二和第三浓度的活性水平来确定最佳浓度。
也描述了核酸测序系统的一个实施方案，包括流动槽(flow cell)、阀门和检测器，其中流动槽包括用于实施测序过程(包含一系列重复的测序反应)的反应环境；阀门将第一浓度酶试剂引入到含有反应底物的反应环境中，其中酶试剂和反应底物是测序过程的组成部分；检测器检测反应环境中第一浓度的酶试剂的活性水平，其中活性水平包括酶试剂与反应底物之间反应的可检测产物；其中阀门在响应所检测到的活性水平时，给反应环境提供酶试剂的最佳浓度。
在某些实施过程中，系统还包括储存有可执行代码的计算机，其中可执行代码执行以下步骤：为阀门提供指令控制，以将第一浓度的酶试剂和反应底物引入到反应环境中；接收来自检测器的所检测到的第一浓度的活性水平；用所检测到的第一浓度的活性水平来确定最佳浓度；和为阀门提供指令控制，以提供最佳浓度。
以上实施方案和实施过程不一定是彼此包含或彼此排斥的，可以按任何不矛盾的方式和其它可能方式来组合，无论它们是否彼此相关地存在于相同或不同实施方案或实施过程中。对一个实施方案或实施过程的描述不得视为是对其它实施方案和/或实施过程的限制。同样，在本说明书其它地方所描述的任何一个或多个功能、步骤、操作或技术，在替代的实施过程中，可以与发明概述中所描述的任何一个或多个功能、步骤、操作或技术相结合。因此，上述实施方案和实施过程是说明性的而非限制性的。
附图简述
根据以下发明详述并结合附图，将会更清楚地理解上述特征和更多特征。在附图中，同样的参考数字表示同样的结构、元件或方法步骤，而参考数字最左边的一位数字表示该参考元件首次出现时的图号(例如，元件160首次出现在图1)。然而，所有这些约定都视为是典型的或说明性的，而非限制性的。
图1是测序仪器的一个实施方案的功能性框图，所述仪器包括在计算机控制下用于处理反应底物的光控子系统和流控子系统；
图2是图1用于处理反应底物的光控子系统和流控子系统的一个实施方案的功能性框图；
图3是简化图，表示所测得的酶试剂的多个样品活性水平的差异；
图4A和图4B是简化图，表示酶活性试验的一个实施方案，使用试验分子显示没有错误的测序循环与具有引入错误的测序循环之间的差异；和
图5是简化图，表示被测信号与酶试剂浓度之间关系的一个实施方案。
发明详述
正如下文将要更详细描述的，本发明的实施方案包括用于测序反应的试剂浓度的自适应控制的系统和方法。此外，本发明还包括在测序过程之前和/或测序过程期间，对试剂浓度或活性进行动态地测定并对浓度进行调节，致使试剂活性在测序过程的最佳范围之内。
a.概要
术语“流程图(flowgram)”和“热解图(pyrogram)”在本文中可互换使用，通常是指通过SBS方法所得到的序列数据的图表。
此外，本文所用的术语“读数(read)”或“序列读数(sequence read)”通常是指得自单一核酸模板分子或模板核酸分子的基本相同的多个拷贝的群体的完整序列数据。
本文所用的术语“循环(run)”或“测序循环(sequencing run)”通常是指在一个或多个模板核酸分子的测序操作中进行的一系列测序反应。
本文所用的术语“流动(flow)”通常是指将溶液加入到含有模板核酸分子的环境中的一系列循环或重复循环，其中溶液可包含用于加到新生分子上的核苷酸种类或用于降低由上一轮循环核苷酸种类所引起的残留或噪声效应的其它试剂(例如缓冲剂或酶)。
本文所用的术语“流动循环(flow cycle)”通常是指序贯系列的流动，其中在循环期间核苷酸种类流动一次(即流动循环可包括按T、A、C、G核苷酸种类的顺序序贯加入，尽管其它顺序组合也可认为是该定义的组成部分)。通常，流动循环是重复循环，具有从循环到循环的相同流动顺序。
本文所用的术语“读长(read length)”通常是指能可靠测序的模板分子长度的上限。有许多因素可以影响系统和/或过程的读长，包括但不限于模板核酸分子中GC含量的程度。
本文所用的术语“试验片段”或“TF”通常是指可用于质量控制、标定或其它相关目的的已知序列组成的核酸元件。
“新生分子”通常是指通过模板依赖性DNA聚合酶并掺入与模板分子中相应核苷酸种类互补的核苷酸种类而延伸的DNA链。
术语“模板核酸”、“模板分子”、“靶核酸”或“靶分子”通常是指作为测序反应对象的核酸分子，从这样的测序反应中可获取序列数据或信息。
本文所用的术语“核苷酸种类(nucleotide specie)”一般是指通常掺入到新生核酸分子中的包括嘌呤(腺嘌呤、鸟嘌呤)和嘧啶(胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶)在内的核酸单体本身。
本文所用的术语“单体重复序列”或“均聚物”通常是指包含相同核苷酸种类(即重复核苷酸种类)的两个或更多个序列位置。
本文所用的术语“均匀延伸”通常是指在反应中基本相同的模板分子群体的各成员均匀地进行同一延伸步骤的延伸反应的关系或时相。
本文所用的术语“完全效率(completion efficiency)”通常是指在给定流动期间适当延伸的新生分子的百分率。
本文所用的术语“不完全延伸率”通常是指不能适当延伸的新生分子数量与所有新生分子数量的比率。
本文所用的术语“基因组文库”或“鸟枪文库(shotgun library)”通常是指源自和/或代表一个生物体或个体的完整基因组(即基因组的所有区域)的分子集合。
本文所用的术语“扩增子”通常是指所选定的扩增产物，例如由聚合酶链式反应技术或连接酶链式反应技术产生的那些。
本文所用的术语“密匙(keypass)”或“密匙作图(keypass mapping)”通常是指在已知位置上与模板核酸分子相关的核酸“关键元件(keyelement)”(即通常包含在连接衔接子元件中)，其包含用作质量控制参考的已知序列组成，用于从模板分子产生序列数据。如果它在正确位置上包含与关键元件相关的已知序列组成的话，这样的序列数据就通过质量控制。
本文所用的术语“钝端”或“钝端的”通常是指末端以一对互补核苷酸碱基种类为端点的线状双链核酸分子，其中一对钝端通常容许彼此连接。
涉及样品的制备和处理、序列数据的产生和序列数据的分析的系统和方法的某些示例性的实施方案，一般性地描述如下，其中部分或全部都适用于本发明的实施方案。特别描述了用于模板核酸分子的制备、模板分子的扩增、靶特异性扩增子和/或基因组文库的产生、测序方法和仪器装置的系统和方法以及计算机系统的示例性实施方案。
在典型的实施方案中，来自实验或诊断样品的核酸分子必须从其原始状态制备和处理成为适用于高通量测序的模板分子。处理方法可因用途不同而异，产生具有不同特性的模板分子。例如，在高通量测序的某些实施方案中，优选产生模板分子，其序列或读长至少是用特定测序方法可精确产生序列数据的长度。在本实例中，长度可包括的范围约为25-30碱基对、约50-100碱基对、约200-300碱基对或约350-500碱基对，或适用于特定测序用途的其它长度。在某些实施方案中，用本领域普通技术人员已知的各种方法，使来自样品(例如基因组样品)的核酸片段化。在优选的实施方案中，随机打断(即并非为具体序列或区域选择)核酸的方法可包括喷雾法(nebulization method)或超声处理法。然而，可以理解，片段化的其它方法(例如用限制性核酸内切酶进行消化)也可用于片段化目的。同样在本实例中，一些处理方法可采用本领域已知的大小选择方法，以选择性分离出所需长度的核酸片段。
同样，在某些实施方案中，最好将额外功能性元件与每个模板核酸分子相关联。这些元件可用于各种不同功能，包括但不限于用于扩增和/或测序方法的引物序列、质量控制元件、编码不同关联(例如与来源样品或患者样品相关联)的独特标识符、或者其它功能性元件。例如，某些实施方案可涉及引物序列元件或包含用于扩增和/或测序的引物序列的互补序列组成的区域。此外，同样的元件可用于所谓的“链选择”和将核酸分子固定到固相基底上。在本实例中，两组引物序列区(在下文中称为引物序列A和引物序列B)可用于链选择，其中仅选择具有一拷贝引物序列A和一拷贝引物序列B的单链并且包含在所制备的样品中。同样的引物序列区可用于扩增和固定化方法，其中，例如引物序列B可固定在固体基底上，而扩增产物就在其上延伸。
用于样品处理片段化、链选择和添加功能性元件和衔接子的其它实例可参见美国专利申请顺序号10/767,894(名称为“Method forpreparing single-stranded DNA libraries(单链DNA文库的制备方法)”，申请日为2004年1月28日)；美国临时专利申请顺序号61/031,779(名称为“System and Method for Improved Processing of Nucleic Acids forProduction of Sequencable Libraries(改进的用于产生可测序文库的核酸处理系统和方法)”，申请日为2008年2月27日)；和代理公司卷号21465-529001 US(名称为“System and Method for Identification ofIndividual Samples from a Multiplex Mixture(从多重混合物中识别个别样品的系统和方法)”，申请日为2008年5月29日)，所述文献各自通过引用全部结合到本文中，用于所有目的。
描述了进行模板核酸分子的扩增以产生基本相同拷贝的群体的系统和方法的各种实例。对本领域普通技术人员显而易见的是，最好在SBS的某些实施方案中，产生每种核酸元件的许多拷贝，当一种或多种核苷酸种类掺入到与模板分子拷贝相关的各新生分子中时就可产生更强的信号。本领域有许多已知技术用于产生核酸分子的拷贝，例如用细菌载体进行扩增、“滚环”复制(参见美国专利号6,274,320和7,211,390，通过引用结合到上文中)和聚合酶链式反应(PCR)方法，这些技术中的每一个都适用于本发明。一种特别适用于高通量应用的PCR技术包括乳液PCR(emulsion PCR，emPCRTM)方法。
乳液PCR方法的典型实施方案包括产生两种不混溶物质的稳定乳液，产生水性微滴(aqueous droplet)，而反应可发生在其中。具体地讲，可用于PCR方法的乳液的水性微滴可包含第一流体，例如悬浮于或分散于另一流体(例如油基流体)内的所谓不连续相的水基流体。此外，一些乳液的实施方案可使用起到稳定乳液作用的表面活性剂，这样的乳液尤其可用于特定的处理方法，例如PCR。表面活性剂的某些实施方案包括非离子型表面活性剂，例如脱水山梨醇单油酸酯(也称为SpanTM 80)、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(也称为TweenTM 80)，或者在某些优选的实施方案中，二甲硅油共聚醇(也称为
Figure G2008800225718D00111
EM90)、聚硅氧烷、聚烷基聚醚共聚物、聚甘油酯、泊洛沙姆和PVP/十六烷共聚物(也称为Unimer U-151)，或者在更优选的实施方案中为高分子量硅酮聚醚/环戊硅氧烷(也称为DC 5225C，可得自Dow Corning公司)。
乳液微滴也可称为区室(compartment)、微胶囊、微型反应器、微环境或相关领域常用的其它名称。水性微滴的大小范围取决于乳液成分的构成或组合、其中所含内容物和所用的形成技术。所述乳液创建微环境，在其中可进行化学反应，例如PCR。例如，模板核酸和进行所需PCR反应所需的所有试剂可包在胶囊中，并在乳液微滴中进行化学分离。在某些实施方案中，可使用额外表面活性剂或其它稳定剂，以提高上述微滴的额外的稳定性。可用微滴来执行PCR方法中典型的热循环操作，以扩增包入胶囊内的核酸模板，从而产生含有许多基本相同拷贝的模板核酸的群体。在某些实施方案中，微滴内的群体可称为“克隆分离的”、“区室化的”、“隐蔽的”“胶囊化的”或“定域的”群体。同样在本实例中，所述微滴的某些或全部都可将用于附着模板或其它类型核酸、试剂、标记或其它目标分子的固体基底(例如小珠)进一步包入胶囊内。
可用于本发明的乳液的实施方案可包括能够以大规模平行方式进行所述化学反应的非常高密度的微滴或微胶囊。用于扩增的乳液及其在测序应用中的用途的其它实例可参见美国专利申请顺序号10/861,930；10/866,392；10/767,899；11/045,678，其各自通过引用全部结合到本文中，用于所有目的。
同样，描述了产生靶特异性扩增子用于测序的示例性实施方案，包括使用一系列核酸引物，自含靶核酸样品扩增所选择的一个或多个靶区域。此外，样品可包含已知或怀疑含有序列变体的核酸分子群体，引物可用于扩增并洞察有关样品中序列变体的分布情况。
例如，可以进行这样的方法：即通过对核酸样品中多个等位基因的特异性扩增和测序来鉴定序列变体。首先用一对PCR引物扩增核酸，该引物经设计用于扩增目标区域的周围区域或核酸群体的常见区段。然后，在单独的反应容器(例如上述基于乳液的容器)中，分别进一步扩增各PCR反应产物(扩增子)。对所得扩增子(在本文称为第二扩增子)(所得的每个扩增子都来自第一扩增子群体的一个成员)进行测序，并用来自不同乳液PCR扩增子的序列的集合来测定等位频率(allelic frequency)。
所描述的靶特异性扩增和测序方法的某些优势包括高于先前获取的灵敏度水平。此外，用高通量测序仪器装置的实施方案，例如使用454生命科学公司(454 Life Sciences Corporation)提供的
Figure G2008800225718D00121
阵列的实施方案，所述方法可用于在每一轮或每次实验中对超过100,000个或超过300,000个不同拷贝的等位基因进行测序。同样，所述方法提供低冗余度等位基因的检测灵敏度，这样的等位基因可占等位基因变异体的1％以下。这些方法的另一优势包括产生包含所分析区域的序列的数据。重要的是，对于所分析基因座的序列，并不一定要预先有所了解。
用于测序的靶特异性扩增子的其它实例可参见美国专利申请顺序号11/104,781(名称为“Methods for determining sequence variantsusing ultra-deep sequencing(用ultra-deep测序法测定序列变体的方法)”，申请日为2005年4月12日)，其通过引用全部结合到本文中，用于所有目的。
此外，测序的实施方案可包括Sanger型技术，通常称为杂交测序(SBH)或掺入测序(SBI)的技术，其可包括所谓的polony测序技术；纳米孔(nanopore)、波导和其它单分子检测技术；或可逆终止子技术。如上所述，一项优选的技术可包括合成测序法。例如，某些SBS实施方案对核酸模板的基本相同拷贝群体进行测序，并且通常使用经设计用于退火到样品模板分子的预定互补位置上的一种或多种寡核苷酸引物、或者与模板分子连接的一种或多种衔接子(adaptor)。在核酸聚合酶存在下，引物/模板复合物与核苷酸种类同时存在。如果核苷酸种类与直接靠近寡核苷酸引物3’端的样品模板分子相应序列位置的核酸种类互补的话，则聚合酶将会用该核苷酸种类来延伸引物。或者，在某些实施方案中，引物/模板复合物与多种目标核苷酸种类(通常是A、G、C和T)同时存在，而与直接靠近寡核苷酸引物3’端的样品模板分子的相应序列位置互补的核苷酸种类就会掺入进去。在每个所述实施方案中，核苷酸种类可经化学封闭(例如在3’-O位)，以防进一步延伸，而且在下一轮合成之前需要解除封闭。还可以理解，将核苷酸种类加到新生分子末端的过程与上述加到引物末端的过程基本相同。
如上所述，可以用本领域已知的各种方法来检测核苷酸种类的掺入，例如通过检测焦磷酸(PPi)的释放(实例参见美国专利号6,210,891、6,258,568和6,828,100，其各自通过引用全部结合到本文中，用于所有目的)或通过与核苷酸结合的可检测标记。可检测标记的一些实例包括但不限于质量标签(mass tag)和荧光标记或化学发光标记。在典型的实施方案中，未掺入核苷酸例如经洗涤去除掉。此外，在某些实施方案中，未掺入核苷酸可经酶促降解，例如用本文所述的腺苷三磷酸双磷酸酶降解。在使用可检测标记的实施方案中，在下一合成循环之前，通常必须使其失活(例如通过化学裂解或光漂白)。如上所述，模板/聚合酶复合物的下一序列位置就可被另一核苷酸种类、或多个目标核苷酸种类来查询(query)。核苷酸添加、延伸、信号获取和洗涤的重复循环，结果就能测定模板链的核苷酸序列。继续本实例，通常在任一测序反应中可以同时分析很多或大量的基本相同的模板分子(例如103、104、105、106或107分子)，以便得到用于可靠检测的足够强的信号。
另外，在某些实施方案中，最好通过使用所谓的“末端对读(paired-end)”测序策略来提高读长容量和测序过程的质量。例如，测序方法的某些实施方案对产生高质量和可靠读数的分子总长度具有限制。换句话说，根据所用测序实施方案的不同，可靠读长的序列位置总数不超过25个、50个、100个或150个碱基。末端对读测序策略通过对分子两端(有时称为“标签(tag)”端)分别测序来提供可靠读长，所述分子包含在两端通过接头序列与中间连接的原始模板核酸分子片段。模板片段的原始位置关系是已知的，因此来自序列读数的数据可重新组合为具有更长的高质量读长的单一读数。末端对读测序实施方案的更多实例可参见美国专利申请顺序号11/448,462(名称为“Paired end sequencing(末端对读测序法)”，申请日为2006年6月6日)和美国临时专利申请顺序号61/026,319(名称为“Paired end sequencing(末端对读测序法)”，申请日为2008年2月5日)，其各自通过引用全部结合到本文中，用于所有目的。
可完成部分或所有上述方法的SBS仪器的一些实例可包括一种或多种检测装置例如电荷耦合装置(即CCD照相机)、微观流体室(microfluidics chamber)或流动槽、反应基底和/或泵和流量阀门(flowvalve)。以基于焦磷酸的测序为例，仪器的实施方案可使用产生固有低水平背景噪声的化学发光检测策略。
在某些实施方案中，用于测序的反应基底可包括经酸蚀刻而得到成百上千个非常小的孔洞的纤维光学面板构成的所谓
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阵列(也称为板)，每个这样的小孔可容纳大量的基本相同的模板分子。在某些实施方案中，可将基本相同模板分子的各群体分配到固体基底(例如小珠)上，其各自可分配到一个这样的孔中。例如，仪器可包括用于将流体试剂提供给PTP板固定器(holder)的试剂递送元件，以及能够收集从PTP板各孔中发出的光的光子的CCD型检测装置。进行SBS型测序和焦磷酸测序的仪器和方法的更多实例可参见美国专利号7,323,305和美国专利申请顺序号11/195,254，其通过引用结合到上文。
另外，可采用自动化进行一种或多种样品制备过程(例如上述emPCRTM过程)的系统和方法。例如，自动化系统可用于提供产生emPCR过程所用乳液的有效溶液，进行PCR热循环操作并富集成功制备的核酸分子群体，用于测序。自动化样品制备系统的实例可参见美国专利申请顺序号11/045,678(名称为“Nucleic acid amplificationwith continuous flow emulsion(用连续流动乳液的核酸扩增法)”，申请日为2005年1月28日)，其通过引用全部结合到本文中，用于所有目的。
同样，本发明所述实施方案的系统和方法可包括使用计算机可读介质进行一些设计、分析或其它操作，这样的介质存储有用于在计算机系统上执行的指令。例如，在下文中详细描述了处理所检测信号和/或分析用SBS系统和方法产生的数据的一些实施方案，其中处理和分析实施方案是在计算机系统上执行的。
用于本发明的计算机系统的一个示例性实施方案可包括任何类型的计算机平台，例如工作站、个人计算机、服务器或任何其它现有或未来的计算机。计算机通常包括已知部件，例如处理器、操作系统、系统存储器、记忆存储装置(memory storage device)、输入-输出控制器、输入-输出装置和显示器。相关领域普通技术人员将会理解，有许多可能的计算机配置和部件，并且还可包括高速存储器、数据备份单元和许多其它装置。
显示器可包括提供可视信息的显示器，这样的信息通常逻辑地和/或物理地组织成为像素阵列。也可包括界面控制器，其中可包括任何不同的已知或未来的软件程序，用于提供输入和输出界面。例如，界面可包括所谓的“图形用户界面(Graphical User Interfaces，通常称为GUI)”，其可为用户提供一种或多种图像显示。使用相关领域普通技术人员已知的选择或输入方式，界面通常能够接受用户输入。
在相同或替代实施方案中，在计算机上的应用可使用包括所谓“命令行界面”(通常称为CLI)在内的界面。CLI通常提供基于应用与用户间相互作用的文本。通常，命令行界面通过显示器以文本行形式显示输出并接收输入。例如，某些执行过程可包括所谓的“命令行解释程序(shell)”例如相关领域普通技术人员已知的Unix命令行解释程序(Unix Shell)，或使用面向对象型程序体系结构的Microsoft WindowsPowershell，例如Microsoft.NET框架。
相关领域普通技术人员将会知道，界面可包括一种或多种GUI、CLI或其组合。
处理器可包括市售处理器，例如CoreTM 2、
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或
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处理器(由Intel Corporation(因特尔公司)制造)、
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处理器(由Sun Microsystems公司制造)、AthalonTM或OpteronTM处理器(由AMD公司制造)，或者它可以是可用的或将来可用的其它处理器中的一种。处理器的某些实施方案可包括所谓的多核处理器(Multi-core processor)和/或能够按照单核或多核配置来使用并行处理技术。例如，多核体系结构通常包括两个或更多个处理器“执行核心”。在本实例中，每个执行核心可作为独立处理器，能够对多线进行并行处理。另外，相关领域普通技术人员将会知道，处理器通常可配置在所谓的32或64比特的体系结构或者目前已知的或未来将开发的其它体系结构配置中。
处理器通常执行操作系统，例如微软公司的型操作系统(例如
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XP或Windows
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)；苹果计算机公司的MacOS X操作系统(例如Mac OS X v10.5“Leopard”或“Snow Leopard”操作系统)；可得自众多卖主或所谓的开放源码(open source)的
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或Linux型操作系统；另一操作系统或未来的操作系统；或其某些组合。操作系统以众所周知的方式连接固件和硬件，并有助于处理器协调和执行用各种编程语言写成的不同计算机程序的功能。操作系统，通常与处理器协同作用，能协调和执行计算机其它部件的功能。操作系统也提供目录的编制、输入-输出控制、文件和数据管理、存储管理和通信控制及相关服务，所有这一切都根据已知技术来进行。
系统存储器可包括各种已知或未来记忆存储装置的任何一种。实例包括任何通常可得的随机存取存储器(RAM)、磁介质(例如固定硬盘或磁带)、光学介质(例如读写光盘)或其它记忆存储装置。记忆存储装置可包括各种已知或未来装置中的任一种，包括光盘驱动器、磁带驱动器、移动硬盘驱动器、USB或闪存驱动器(flash drive)或软盘驱动器。这些类型的记忆存储装置通常从程序存储介质(未显示)中读出和/或写入，这些介质分别是例如光盘、磁带、移动硬盘、USB或闪存驱动器或软盘。任何这些程序存储介质或者目前使用的或今后开发的其它介质，都可认为是计算机程序产品。可以理解，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序(也称为计算机控制逻辑)通常存储在系统存储器和/或与记忆存储装置连接的程序存储装置中。
在某些实施方案中，描述了计算机程序产品，包括其中存储具有控制逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)的计算机可用介质。控制逻辑，当由处理器执行时，使处理器行使本文所述的功能。在其它实施方案中，某些功能主要在硬件中执行，使用例如硬件设备(hardwarestate machine)。执行并完成本文所述功能的硬件设备(hardware statemachine)是相关领域技术人员显而易见的。
输入-输出控制器可包括用于接收和处理用户(无论是人还是机器，无论是局域还是远程)信息的各种已知装置中的任一种。这样的装置包括例如调制解调卡、无线卡、网络接口卡、声卡或用于各种已知输入装置的任一种的其它类型的控制器。输出控制器可包括用于各种已知显示器的任一种的控制器，这类显示器用于给用户(无论是人还是机器，无论是局域还是远程)提供信息。在本文所述的实施方案中，计算机的功能性元件通过系统总线进行相互通信。计算机的某些实施方案可利用网络或其它类型的远程通信而与某些功能性部件进行通信。
相关领域技术人员显而易见的是，仪器控制和/或数据处理上的应用，如果在软件中执行的话，可加载(load)到系统存储器和/或记忆存储装置中并由此来执行。仪器控制和/或数据处理上的所有或部分应用也可驻存于只读存储器或记忆存储装置的类似装置，这些装置无需通过输入-输出控制器来先加载仪器控制和/或数据处理上的应用。相关领域技术人员将会知道，仪器控制和/或数据处理上的应用或其部分，可按已知方式，通过处理器加载到系统存储器或高速缓冲存储器或这两者上，以便执行。
计算机也可包括保存在系统存储器中一个或多个文库文件、实验数据文件和互联网用户(internet client)。例如，实验数据可包括一个或多个实验或测定的相关数据，例如所检测到的信号值，或一个或多个SBS实验或过程相关的其它数值。另外，互联网用户可包括能够利用网络而接入另一计算机上的远程服务的应用并且包括例如所谓的“网络浏览器(Web Browser)”。在本实例中，一些常用的网络浏览器包括
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Intemet Explorer 7(得自微软公司)、Mozilla
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2(得自Mozilla Corporation)、Safari 1.2(得自苹果计算机公司)或本领域目前已知的或未来即将开发的其它类型的网络浏览器。同样，在相同或其它实施方案中，互联网用户可包括专业化的软件应用，或者可以是这类专业化软件应用的一个组成部分，这类专业化软件应用能够通过诸如针对SBS应用的数据处理应用的网络接入远程信息。
网络可包括本领域普通技术人员众所周知的许多不同类型的网络的一种或多种。例如，网络可包括局域网或广域网，其采用通常称为TCP/IP协议套件进行通信。网络可包括通常称为互联网的由相互连接的计算机网络构成的全球网络系统，或包括各种内部网架构。相关领域普通技术人员也将理解，网络环境中的某些用户可能宁愿采用所谓的“防火墙”(有时也称为信息包过滤器(Packet Filter)或边界保护装置(Border Protection Device))来控制信息从硬件和/或软件系统流入或流出。例如，防火墙可包括硬件或软件元件组分或其某些组合，并且通常可设计为由用户(例如网络管理员等)设置安全规则。
b.本发明的实施方案
如上所述，本发明包括用于测定与一种或多种酶试剂相关的活性水平并动态调节一种或多种所测酶试剂浓度以提供明显优化的试剂活性水平的方法。具体地讲，本发明可用于减少因某些过程步骤中不想要的核苷酸种类水平所致的延后和不完全延伸效应引起的序列数据中的引入错误，并用于调整来自测序过程的可检测信号输出程度。
本发明的某些实施方案可用作标定多种测序仪器和/或不同测序循环之间的信号输出的工具。同样，可降低过高或过低信号变动以及“信号释放(signal bleed)”效应(即来自一轮循环的信号如此之高，使得信号持续并释放到下一轮循环，或者在某些情况下在同一轮或下一轮循环中释放到邻近孔或反应位置)。在某些实施方案中，信号变动和/或释放的标定和降低允许更短的一轮循环时间，通过流动而导致更频繁和有效循环(即更短的流动循环)。例如，通常最好是每次掺入事件的信号输出都在可接受范围内，使得输出在仪器之间和测序循环之间更容易作出比较，并能提高数据质量和可靠性。
通常，可使用能自动进行测定和调节的一个或多个过程步骤的一种或多种仪器元件。例如，可用自动进行和实现某些或全部过程步骤的仪器装置来完成测序方法的实施方案。图1提供了测序仪器100的说明性实例，该仪器包括光控子系统110和流控子系统120。用于进行测序和自适应控制过程的测序仪器100的实施方案可包括流控子系统120中的不同流控部件，光控子系统110中的不同光控部件，以及图1或图2未显示的其它部件，包括用于某些功能的局部控制的微处理器和/或微控制器。此外，如图1所示，测序仪器100可与一个或多个外部计算机部件(例如计算机130)操作性连接，其可例如执行系统软件或固件例如应用程序135，为一个或多个部件和/或某些数据分析功能提供指令控制。在本实例中，测序仪器100和/或计算机130可包括以上概述的实施方案的部分或全部部件和特性。
流控子系统120的实施方案可包括不同部件，例如流体贮存器(fluid reservoir)201、流体贮存器203、流体贮存器205、流体贮存器207和流体贮存器209，每个可容纳一定体积的试剂或流体，用于测序反应程序中发生的过程步骤。例如，贮存器201-209可包括瓶(bottle)、烧瓶(flask)、管、杯或其它流体密封容器，均可容纳一定体积的试剂，例如各核苷酸种类(即A、C、G、T或U)；特定的酶，例如腺苷三磷酸双磷酸酶、硫酸化酶、萤光素酶、焦磷酸酶或其它酶；可包括ATP或焦磷酸在内的试验液或标定液；底物；酶的增强剂或抑制剂；缓冲液或洗涤液，其可包括含抗衡离子(即Ca2+或Mg2+)的那些和/或优选的PH、水和/或者漂白液、碘液或其它消毒液的稀释液；或测序过程或其制备中要用的其它流体。流控子系统120的实施方案也可包括一个或多个废液贮存器240，用于收集和贮存那些用过而不能再利用的流体。可以理解，贮存器240的多个实施方案可用于不相容的或混合起来有危险的流体，或者用于通常优选分别存放的流体。
而且，各贮存器201-209的流体与多通阀200都是连通的。多通阀是本领域技术人员公知的并可得自各供应商，例如SMC Corporationof Indianapolis，Indiana。在图2的实例中，多通阀200能打开和关闭，以选择性地允许指定体积的流体从贮存器201-209流向流动槽250。开关周期称为“脉冲宽度”，通常以打开阀门所花费的时间单位来度量(即可以按毫秒计或按其它类似测定来计)。在某些情况下，引入一种流体相关的脉冲宽度可以与引入另一流体同时发生，其中这两种流体可混合在一起。此外，多通阀200能够同时调节贮存器201-209中的一个或多个的流速。在本实例中，可调节的流速或脉冲宽度时限允许精确控制试剂的浓度和稀释度。例如，用于控制试剂的10倍稀释度的一个可能方法就可完成如下：即通过打开贮存器201-209中的一个而使其流出，其脉冲宽度等于过程步骤中允许流过流动槽250的所有试剂总时间的1/10。在某些实施方案中，阀门200可按间隔进行“脉冲调制”(即较短脉冲宽度的开关间隔)，以提供更好的稀释均匀度。
一些替代实施方案也可包括通过阀门200控制流速，即通过调节阀门200开启程度。换句话说，阀门200开启范围可以自打开一小部分至完全打开，其中流速取决于开启程度。可以理解，最好是已准确知道贮存器201-209内一种或多种试剂的浓度。还最好是贮存器201-209内的试剂浓度高于测序过程所需的浓度(在某些情况下明显更高)，因此允许稀释并容易控制最终浓度。
相关领域普通技术人员也将会理解，流控子系统120是示例性的，而且其它部件可包括在典型的流控子系统中。例如，某些实施方案可包括能测量贮存器内流体体积的传感器，和/或正确或预期的流体存在于贮存器201-209中或流过阀门200。传感器可包括一种或多种传感器的组合，例如电导率传感器、光传感器(即光密度)、声传感器(即超声密度)或PH传感器。子系统实施方案中的一些典型的流控部件也可包括阀门、管道、泵(即蠕动泵)、加热/冷却元件(即加热槽)或本领域常用的其它元件。
图2还显示了光控子系统110相关部件，包括流动槽250、反应基底105和检测器260。例如，流动槽250的流体与反应环境基底105的第一表面是连通的，该反应环境基底105在某些实施方案中包括装有基本相同的模板核酸分子的许多群体的PTP板的孔。因此引入到流动槽250的流体与基底105和模板核酸分子接触。同样，在某些实施方案中，在流动槽250内可建立所谓的“对流性”流动，用于有效引入和从基底105中去除试剂。测序实施方案中对流性流动的实例及其优势可参见美国专利申请顺序号10/191,438、11/016,942、11/217,194，其通过引用全部结合到本文中，用于所有目的。另外，如上所述，检测器260可包括CCD照相机、光电倍增管(PMT)或本领域普通技术人员已知的其它光学检测装置的实施方案。优选的是检测器260与反应基底105表面具有光通信，使得测序反应产生的光发送到检测器260。也可以理解，在某些实施方案中，流动槽250和反应环境基底105是同一元件，其中流动槽250可包括一个或多个内表面，起到基底105的作用。
如上所述，本发明的实施方案动态地控制递送给反应环境的一种或多种酶试剂的浓度，其可包括例如通过多通阀200控制浓度并递送到反应环境基底105。例如，计算机130可包括存储在系统存储器中用于执行的应用程序135，其为动态浓度调节提供指令控制。在某些实施方案中，应用程序135也接收输入，用于计算浓度调节，确定所需调节来执行，并为测序仪器100的一个或多个元件(例如用于定时控制阀门200的微控制器元件)提供指令控制。在本实例中，应用程序135可用一种或多种酶试剂的起始浓度值来启动测序过程并按照预定时间间隔来调整浓度(即可使用开环型机制，用于预定稀释概况)或响应所测变化，其中在测序循环期间可连续或周期性检测试剂浓度(即可使用闭环型反馈控制机制，用于所测试剂活性)。
相关领域普通技术人员将会知道，酶试剂不同实施方案的有效性或活性因不同原因而异，例如批与批之间的差异、制造商之间的差异、随时间而降解(即货架寿命)、环境效应(即温度、湿度等)和其它已知或未知效应。因此，通常最好是根据(至少部分根据)其活性水平来调节反应中的酶试剂浓度。相关领域普通技术人员将会知道，通常酶活性按酶单位(U)计，其中一个单位(1U)等于在1分钟内催化1微摩尔底物转化的酶量。有时用于酶活性的另一计量单位称为开特(katal)。也应当知道，某些环境条件(例如温度和pH)会影响酶的催化速率，当在测序过程中测定和使用酶试剂时，通常最好量化和/或控制这些条件。重要的是，本文所用的术语酶试剂的“浓度”是指每单位体积酶试剂的活性水平(通常计量单位可包括U/ml)。
如上概述，某些酶的催化活性水平随时间而下降，在某些情况下导致基本丧失催化活性。这样的活性损失率取决于各种因素，包括贮存条件和酶的种类，其中特别困难的是在不直接测定的情况下，预测改变率。此外，某些测序过程可能需要延长时间来执行完整的一轮循环，而其中某些试剂(例如腺苷三磷酸双磷酸酶)可能对某些环境条件尤其敏感，这样再加上要延长时间，就会特别麻烦。在某些实施方案中，用户101可能不知道催化活性损失，而本文所述的自适应控制则可避免包括整个实验的灾难性损失在内的后果。
图3提供在所有样品设定浓度相同时，不同样品的腺苷三磷酸双磷酸酶活性的所测差异的说明性实例。每份所测样品的脉冲宽度(即体积)相同，但各自却测得具有实测相对信号水平明显不同，因而活性水平也明显不同。在本实例中，用下述振幅测量方法，测定酶样品305A、305B和305C各自的“实测相对信号”，并找到与各份样品酶活性水平的关系。重要的是，显然，所测13份不同样品的活性水平明显不同，因此各份酶样品对测序过程的影响部分地取决于活性水平。
普通技术人员也可以理解，所测酶试剂活性取决于(至少部分取决于)与所述酶试剂相互作用的一种或多种其它试剂的浓度，所述其它试剂例如包括底物、增强剂或抑制剂。例如，用于钝化核苷酸种类的腺苷三磷酸双磷酸酶的所需浓度部分地取决于流动槽250和/或反应基底105的反应环境中所述核苷酸种类的浓度。换句话说，如果核苷酸种类的浓度偏高或偏低，腺苷三磷酸双磷酸酶所需活性的浓度也应当同样偏高或偏低。同样，在某些实施方案中，反应环境可包括减少扩散或流动性的复杂情况。在这类情况下，最好调节腺苷三磷酸双磷酸酶浓度以解决这类复杂情况。
如上所述，本发明的实施方案包括测定作为测序过程组成部分的一种或多种酶试剂的活性。例如，本发明的某些实施方案测定用于测序过程的一种或多种酶试剂的活性，即通过使用酶试剂，进行一个或多个试验反应并测定反应结果，以测定酶活性水平并因此而调节酶浓度。相关领域普通技术人员将会知道，酶活性的测定方法至少部分取决于酶的种类以及其它因素。同样，对于不同酶试剂，测定可不同，而且在某些情况下，在与酶试剂相互作用的大量试剂存在时，测定方法可提供对酶试剂活性的指示。在某些实施方案中，优选控制酶试剂活性，即通过调节各种互作试剂中的一种或多种的浓度或环境条件。例如，可用PH调节腺苷三磷酸双磷酸酶的活性水平，其中对于最佳腺苷三磷酸双磷酸酶活性而言，优选PH约6.5。因此，通过使用更高或更低PH可降低腺苷三磷酸双磷酸酶活性，其中差异程度涉及活性降低的程度。也可理解，在测序过程中最好使用对其它酶或步骤而言的最佳PH水平。在本实例中，在测序过程中可采用PH约7.8，这对聚合酶的表现而言是最好的。在这种情况下，通常优选用测序过程的优选PH，测定并调节腺苷三磷酸双磷酸酶活性。
或者，在使用测序系统100实施测序过程的某些实施方案中，可改变环境条件以适应不同酶的最佳范围。例如，当洗涤步骤中包含腺苷三磷酸双磷酸酶以去除过量核苷酸种类和ATP时，因为处理步骤的连续性，缓冲液可与腺苷三磷酸双磷酸酶一起使用，其PH能使腺苷三磷酸双磷酸酶活性水平最佳化。然后，在下一个核苷酸掺入步骤中使用聚合酶，可使用具有对聚合酶而言的最佳PH条件的不同缓冲液，以便使聚合酶活性最佳化。另外，每种最佳缓冲液可包括对于每种酶而言的优选抗衡离子，例如对于腺苷三磷酸双磷酸酶缓冲液而言的Ca2+和对于聚合酶缓冲液而言的Mg2+。
腺苷三磷酸双磷酸酶测定技术的一个实施方案可称为“时相测定(Phase Measurement)”，其采用经设计用于通过亚适量腺苷三磷酸双磷酸酶浓度来放大引入错误的特别的试验分子。具体地讲，通过测序仪器100容易测定上述低腺苷三磷酸双磷酸酶浓度的延后效应，而且也容易找到与酶的相对催化活性之间的关系。例如，试验分子可包括核苷酸种类的序列组成，其包括：GCGCCCCCCCC(SEQ ID NO 1)。重要的是，试验分子包括在最少量流动循环中产生可检测错误的序列组成。在本实例中，因为试验分子的准确序列是已知的并且仅含C和G核苷酸种类，可采用特定测序方案，仅加入C和G核苷酸种类。仅用2种核苷酸种类，节约使用试剂，并避免与反应环境中存在的以A或T核苷酸种类为开头的样品分子发生反应。例如，与各基本相同模板分子连接的衔接子元件在第一序列位置上、或在某些实施方案中的若干第一序列位置(即可包括范围为2-10的序列位置)上可包含A或T核苷酸种类。因此，使用具有G和C核苷酸种类组成的试验分子，可用于在模板分子存在时不破坏序列数据。此外，在试验方案中可改变腺苷三磷酸双磷酸酶的浓度以产生放大效应，提供基线，以按需要逐渐增加或降低浓度。例如，所用的腺苷三磷酸双磷酸酶浓度采用的脉冲宽度是测序过程常用的“正常”或最佳浓度的1/10，从而在所得序列数据中产生引入的延后错误。重要的是，即使腺苷三磷酸双磷酸酶浓度比标准浓度低，也很容易测定系统中腺苷三磷酸双磷酸酶的催化活性并计算腺苷三磷酸双磷酸酶的稀释度，以达到用于测序循环的所需浓度。
没有任何预计自本实例的试验分子产生的引入延后错误的示例性流程图参见图4A，其中信号水平407与种类流动(specie flow)405中的试验分子的序列组成密切相关。换句话说，信号水平407的数值为1.0代表包括试验分子中的一个核苷酸种类的头3个序列位置的序列组成。数值8.0代表试验分子中随后序列位置的一组8个均聚物。
继续上述实例，使用低腺苷三磷酸双磷酸酶浓度并假定对反应底物的简单洗涤不足以除去上一轮的所有核苷酸种类，由试验分子得到的序列数据产生可检测的延后错误。图4B显示对于种类流动(speciesflow)405，试验分子的可能的延后错误效应的实例。加粗的虚线表示对于每个种类流动405而言，具有延后错误的信号水平407。例如，在低腺苷三磷酸双磷酸酶浓度时，在第2轮加入C核苷酸种类期间，反应环境中还存有第1轮加入的残留G核苷酸种类，导致这两种核苷酸种类都掺入(即在试验分子的第2位C和第3位G序列位置上掺入，以及可能在第4-8位C位置上掺入)，从而产生来自这两种掺入的光以及被测信号水平的可检测的增加。可检测的增加可表示第2轮加入中存在的残留G核苷酸种类的数量，并且与腺苷三磷酸双磷酸酶的活性水平有关(即低浓度不能降解所有G核苷酸分子)。在第3轮加时效应进一步放大，其中在第3轮期间，反应环境中有来自第2轮加入的残留C核苷酸种类并导致类似的可检测的延后效应结果。最终，必要时可使用第4轮加入的C种类并显示出来自延后效应的信号可检测性地减少，这表明来自上一轮的C核苷酸种类的预延伸。换句话说，因为上一轮循环的延后延伸，在第4轮期间，有更少的试验分子处于加入的C核苷酸种类的时相(或时相同步)，因此更少的掺入事件导致检测信号比起延后错误不存在时预期的要低。可以理解，在本实例中，所测信号值仍然比上一轮更亮，这可用于鉴定含试验分子的孔。
用于测定腺苷三磷酸双磷酸酶活性的另一技术在本文中称为“振幅测定(Amplitude Measurement)”。振幅测定与时相测定(phasemeasurement)方法相比具有某些优势，因为不需要特别的试验分子，振幅测量可用ATP作为反应底物，这样就不会影响到测序过程的其它步骤。此外，振幅测量技术采用单一流动(simple flow)算法和信号处理方法(无需应用程序135来执行孔寻找算法(well finding algorithm))。另外，振幅测量更适用于频繁测定，而不会带来时相错误的风险(即通过在测量期间添加dNTP种类，其可掺入到与模板核酸分子相连的新生链中)，而且对其它来源的背景错误较不敏感。
如上所述，振幅测量的某些实施方案使用腺苷三磷酸双磷酸酶将腺苷三磷酸底物(通常称为ATP)转化为腺苷二磷酸(通常称为ADP)的特性，在焦磷酸测序过程中使其功能性失活。通常认为ATP在细胞代谢中对能量转移是至关重要的，而且是基础反应底物，用于由萤光素酶催化萤光素而产生光作为一种反应产物。也可理解，萤光素和萤光素酶通常用于焦磷酸测序方法，当核苷酸种类掺入时，最终导致光的产生。因此，在萤光素和萤光素酶存在下，容易测定腺苷三磷酸双磷酸酶能够水解/降解ATP的效率，即通过使用系统100的光检测能力来测定光输出。在某些实施方案中，其它反应底物也可用于替代ATP，包括其它核苷三磷酸(即CTP、GTP或TTP)、核糖核苷酸或脱氧核苷酸(例如脱氧核苷三磷酸，dNTP)。然而可以理解，对于时相测定技术而言，通过聚合酶向上述新生链掺入dNTP是有风险的，因而对于某些应用而言并不理想。
在采用振幅测量的测序过程的某些实施方案中，最好对测序反应所用的每种dNTP种类都测定腺苷三磷酸双磷酸酶活性。如本发明说明书中其它地方所提及的，腺苷三磷酸双磷酸酶在洗涤过程中可用于降解ATP和dNTP种类，其中腺苷三磷酸双磷酸酶活性因不同dNTP种类而异。例如，可使用测定技术，分别测试过量浓度的每种dNTP种类与有限浓度的ATP。因此，dNTP作为ATP的竞争物，与ATP竞争腺苷三磷酸双磷酸酶，并且可以测定腺苷三磷酸双磷酸酶降解每种核苷酸种类的效率。然后，在用相应核苷酸种类进行的每一轮之后，可使用针对每种核苷酸种类的最佳腺苷三磷酸双磷酸酶的浓度。
振幅测量的第一实施方案包括将一定浓度的腺苷三磷酸双磷酸酶和一定浓度的ATP反应底物同时引入到反应环境中，测定作为反应产物的光输出，找到所测输出与酶活性水平的关系。在所述实施方案中，腺苷三磷酸双磷酸酶活性并不依赖于反应环境中的ATP底物浓度，其中对于ATP，反应处于“第一顺序”。然而，通常最好还是使用已知ATP浓度。在仪器100的某些实施方案中，反应环境中萤光素、萤光素酶和硫酸化酶的浓度与测序过程所需浓度相比是过量的，其中过量浓度对其它相互作用或过程没有有害效应。事实上，过量浓度的萤光素、萤光素酶和硫酸化酶可用于抵消萤光素酶或硫酸化酶可能的低催化活性效应(本发明的方法也用来测定萤光素酶和/或硫酸化酶活性，正如下文将要详述的那样)。因此，在抑制效应不存在时，当将ATP反应底物引入到反应环境中时，其将会与萤光素和萤光素酶反应并导致光的产生。在此同时，腺苷三磷酸双磷酸酶通过将ATP转化为ADP，而起到抑制光产生效应。因此，加入ATP而产生光的量反映了腺苷三磷酸双磷酸酶的活性和ATP向ADP转化的效率。例如，多通阀200可测定并向流动槽250中引入所需浓度的腺苷三磷酸双磷酸酶和ATP。在本实例中，可将腺苷三磷酸双磷酸酶和ATP试剂作为混合流体或系列稀释流体，平行引入到流动槽250中(即按照先加入腺苷三磷酸双磷酸酶、再加入ATP的顺序或反之亦然)。继续本实例，一旦将腺苷三磷酸双磷酸酶引入到流动槽250中时，立即起到将ATP转化为ADP的作用，由ATP与萤光素酶接触时产生的光，可得到可检测的活性率。
图5提供将不同腺苷三磷酸双磷酸酶浓度与ATP反应底物输入到反应环境后所检测到的相对信号之间的关系的说明性实例。图5也显示设置点(set point)信号水平505和酶浓度515，表明用于测序过程的所需水平。重要的是，被测相对信号与腺苷三磷酸双磷酸酶浓度之间的关系是线性关系，因此能够容易地测定出对腺苷三磷酸双磷酸酶储液的调节，以达到所需活性水平的浓度。例如，可通过被测数据点510来绘制回归线，显示线性关系。同样，在本实例中，酶浓度515的最佳浓度包括0.95U/ml的数值。
振幅测量的第二实施方案可包括将一定浓度的腺苷三磷酸双磷酸酶和一定浓度的焦磷酸反应底物同时或序贯引入到反应环境中。硫酸化酶催化焦磷酸产生ATP作为反应产物，因此可如上所述地测定腺苷三磷酸双磷酸酶的活性。用焦磷酸作为试验底物或反应底物的一个可能的障碍在仪器100和用焦磷酸酶降解过量焦磷酸的方法的实施方案中可能会经历(即在反应环境中可用于流动的和/或固定在固相珠子基底上)。因此，焦磷酸酶活性可破坏对腺苷三磷酸双磷酸酶活性的测定。然而，可用本文所述的实施方案来进行焦磷酸酶活性的测定(即通过在腺苷三磷酸双磷酸酶不存在时，用焦磷酸酶作为竞争物流过焦磷酸一段时间，以建立评价焦磷酸和焦磷酸酶活性的基线)。此外，由焦磷酸流动产生的ATP可以是区域特异性的，因为当通过阀门200引入时，它存在于产生部位而不是广泛分布。在测序过程中使用焦磷酸酶的实施方案的实例可参见美国临时专利申请顺序号61/026,547(名称“System and Method for Improved Signal Detection in Nucleic AcidSequencing(核酸测序中用于信号检测改进的系统和方法)”，申请日为2008年2月6日)，其通过引用全部结合到本文中，用于所有目的。
也可理解，使用竞争性反应底物也可进行其它酶试剂(例如萤光素酶和硫酸化酶)浓度的测定和自适应控制的实施方案。例如，信号输出的差异可能是因为(至少部分因为)萤光素、萤光素酶或硫酸化酶的活性或浓度水平的不同(也可包括空间效应，其中局部区域可具有较高或较低浓度)以及模板分子的浓度和分布的不同。在本实例中，测序仪器100的某些实施方案可使用置入反应孔内的珠子上结合的萤光素酶和硫酸化酶，以及基本相同的模板分子群体，其也可分配在一个或多个珠子上。珠子的排列可产生所谓的“分层效应(layering effect)”。本文所用的术语分层效应通常是指底物、试剂、靶标等在局部分布上的差异，这样的差异可能是在反应环境中分布这些材料所用的工艺所导致的结果。结果可包括一种或多种酶浓度的彼此局部差异或模板分子群体的局部差异或其某些组合。
除了调节特定酶试剂的脉冲宽度之外，控制系统增益和标定的一个实施方案包括使用调节酶活性水平的所谓“抑制剂”。本文所用的术语“抑制剂”通常是指互作分子之间的关系，其中一种分子即抑制剂对另一种分子的活性产生负面影响。在本发明中，最好调节硫酸化酶和萤光素酶的活性，这对反应级联而言是至关重要的，其在响应核苷酸种类的掺入和焦磷酸的释放时导致产生光。例如，可通过多通阀200，将萤光素酶的一种抑制剂(例如CAPMBT)引入到流动槽250和反应基底105的反应环境中。在某些实施方案中，在应用程序135的控制之下，在响应所测的来自一个或多个掺入事件的光输出时加入抑制剂。可按多种方式来测量光输出，例如测量来自包括关键序列在内的具有已知组成的序列或上述试验分子的输出。此外，可如上所述地测定来自ATP的流动或焦磷酸的流动的光输出，其也可用于测定测序循环期间可能发生的所谓的“信号衰减”或“信号下降”。处于应用程序135控制之下的多通阀200可加入合适浓度的抑制剂，达到所需的酶活性水平。在某些实施方案中，该过程也可重复进行，其中可进行后续几轮检测和标定，直至达到所需结果。
控制系统增益和标定的另一实施方案包括调节一种或多种“底物”试剂，其中可用底物数量或浓度的增加会导致信号输出的增加。例如，来自如上所述ATP的流动或焦磷酸的流动的光输出可用于调节包括D-萤光素和/或APS在内的底物相关活性。如上所述对于系统增益控制，使用抑制剂，处于应用程序135控制之下的多通阀200可加入合适浓度的底物，以达到所需活性水平。又一实施方案可包括调节某些组合中的部分或所有如上所述的酶、抑制剂或底物。
再一实施方案可包括用环境条件例如PH来调节酶的活性水平。对于各种酶而言，与酶活性的最佳PH水平相比，酶活性水平可取决于(至少部分取决于)反应环境中PH水平的关系。重要的是要注意，对于其最佳条件而言，不同酶的活性水平通常各不相同，最好可以在亚适量条件下使用一种或多种酶，但是可用更高浓度或体积来补偿。例如，腺苷三磷酸双磷酸酶活性的最佳PH可包括PH值6.5，而聚合酶的最佳PH可包括PH值为7.8。
如上所述，本发明的元件涉及在核酸测序过程中对一种或多种酶试剂的自适应控制。通常，本发明的实施方案包括在测序循环开始之前或在测序循环的同时(在测序循环期间按照正常间隔)来测定一种或多种酶试剂的活性，在测序循环期间一直进行监测，或其某些组合。在某些实施方案中，最好进行多种测定，以确保测定的统计学意义并控制测定和/或标定过程中以及暂时改变系统条件时的错误。进行多种测定，可用于确定具有统计学意义的测定，以达到更准确地调节酶试剂最终浓度的目的。例如，测定过程可包括以3种不同的腺苷三磷酸双磷酸酶体积(通过脉冲宽度来测定)的一系列腺苷三磷酸双磷酸酶以及ATP反应底物的流动，并对每一次流动测定的光的信号输出。ATP的浓度不必准确，但可包括的浓度约为0.875μM。在本实例中，该系列包括腺苷三磷酸双磷酸酶的3次流动，各次以3种脉冲宽度，包括83ms(预期浓度约为0.0079U/ml)、138ms(预期浓度约为0.0131U/ml)和201ms(预期浓度为约0.019U/ml)。将各次流动的每种脉冲宽度的被测相对信号进行平均，并通过求出的平均点来绘制回归线，用于求出校正系数。调节腺苷三磷酸双磷酸酶浓度之后，可用调节后的浓度来重复该过程，以证实调节是准确的。
如上所述，在测定步骤之后，用试剂、或增强剂、抑制剂或与所述试剂相互作用的底物的浓度或稀释度来调节一种或多种酶试剂活性。可用“开环”或“闭环”策略进行调节，调节反应环境中的酶试剂浓度或者通过操纵反应环境(即温度、流速、PH等)中的一个或多个参数或条件。本文所用的术语“开环”通常是指不响应反馈的固定的预定设置。本文所用的术语“闭环”通常是指反馈控制系统，其中响应所测参数来修改调节量。开环和闭环调节策略在不同实施方案中各有各的优势。例如，两种常见类型的实施方案包括所谓的信号衰减补偿和腺苷三磷酸双磷酸酶补偿。
例如，在用信号衰减的校正或补偿的实施方案中，使用开环调节策略的优势包括通过降低抑制剂浓度和/或提高上述底物的浓度而增加光的产生，来增加信号输出量。此外，在用腺苷三磷酸双磷酸酶活性的校正或补偿的实施方案中，使用开环调节策略的优势包括提高浓度以抵消催化活性的降解，或积累时相同步错误。同样，优势还包括降低浓度以抵消聚合酶的损失或聚合酶的活性。在本实例中，开环策略是有利的，因为这两种实施方案包括稳定性和/或预测性水平，其中在测序循环期间可能发生明显的或不可预测的变化。此外，所述优势提高了数据质量和可比性，其中最好的是在测序循环期间数据的一致性。
继续本实例，在使用信号衰减和腺苷三磷酸双磷酸酶的校正或补偿的实施方案中，使用闭环调节策略的优势包括更精细的调节，以产生更高质量和更可靠的数据。同样，在预测性和/或稳定性的水平比所需阈值更低的实施方案中，优选闭环调节策略。
同样如上所述，一种或多种酶催化活性水平可取决于(至少部分取决于)反应环境中的条件。例如，腺苷三磷酸双磷酸酶的降解速率可以是温度依赖型的，当温度升高时降解速率也随之提高。结果可包括腺苷三磷酸双磷酸酶浓度不可预测地下降，导致延后错误的增加。或者，更低的温度可使降解速率放慢并允许过量浓度的腺苷三磷酸双磷酸酶增加，导致不完全延伸错误的增加。在本实例中，温度可在仪器100内进行测定并在应用程序135控制之下进行调节，以将表现维持在所需参数内。温度也可用于调节腺苷三磷酸双磷酸酶活性，以解决如上所述的其它活性效应。
实施例1-对自适应腺苷三磷酸双磷酸酶过程的验证
用于测定腺苷三磷酸双磷酸酶活性、确定脉冲宽度校正系数的过程验证需要达到预定腺苷三磷酸双磷酸酶活性，并通过校正系数来调节腺苷三磷酸双磷酸酶脉冲。
腺苷三磷酸双磷酸酶活性方法：腺苷三磷酸双磷酸酶可降解的ATP量可通过孔内酶活性来测定；
校正系数方法：需要脉冲宽度的倍增因子，以得到预定腺苷三磷酸双磷酸酶活性；
相对信号方法：腺苷三磷酸双磷酸酶活性的检测。将由ATP和腺苷三磷酸双磷酸酶浓度的脉冲产生的信号与仅由ATP产生的信号进行校正；和
设定值方法：所需预定相对信号。这是相对信号，校正系数应当校正所测量的腺苷三磷酸双磷酸酶的脉冲宽度。
编写进行腺苷三磷酸双磷酸酶活性测定流程的脚本(script)。进行校正系数的计算，然后用于标称腺苷三磷酸双磷酸酶活性测定流程，以测定校正系数的准确度。在标准脚本中，校正系数在洗涤核心程序(washing kernel)中用于腺苷三磷酸双磷酸酶脉冲。该脚本称为“测定-调节-再测定”脚本。它进行腺苷三磷酸双磷酸酶测定流程，调节腺苷三磷酸双磷酸酶脉冲宽度，然后在调整的脉冲下，再测定3次腺苷三磷酸双磷酸酶活性。这3次测定的平均值作为测定调节因子准确度的度量。
进行了以下试验：
  试验编号   描述   说明/试验   结果(平均值±SD)
1   对FLX293的试验，用标准腺苷三磷酸双磷酸酶浓度   校正的腺苷三磷酸双磷酸酶脉冲宽度所产生的相对信号中的相对错误并且设定值为0.79   2.17％±2.98％1.48％±0.68％其中去掉一个重测流动异常值
2   对FLX312的试验，用标准腺苷三磷酸双磷酸酶浓度   校正的腺苷三磷酸双磷酸酶脉冲宽度所产生的相对信号中的相对错误并且设定值为0.79 1.57％±0.3％
3   对FLX284的试验，用增加10％的腺苷三磷酸双磷酸酶浓度   校正的腺苷三磷酸双磷酸酶脉冲宽度所产生的相对信号中的相对错误并且设定值为0.79 2.66％±1.22％
4   对Rig1的试验，用减少10％的腺苷三磷酸双磷酸酶浓度   校正的腺苷三磷酸双磷酸酶脉冲宽度所产生的相对信号中的相对错误并且设定值为0.79   2.15％±1.80％1.83％±1.18％其中去掉一个重测流动异常值
注意，从腺苷三磷酸双磷酸酶脉冲向相对信号的典型转化为～0.002cnt/ms。使用138ms测定脉冲作为我们的标称浓度，从重测值中x％相对错误向相对腺苷三磷酸双磷酸酶浓度错误的转化是(x/100*0.79)/(.002*138)，设定值为0.79。例如，相对信号为1.48％的相对错误(试验1)表明腺苷三磷酸双磷酸酶浓度错误为4.24％。
试验1的结果显示如下。过程验证了测定仅来自ATP图像的目标区的算法能力，其是用于计算腺苷三磷酸双磷酸酶测定和校正系数的区域。
算法测定每一加载道(loaded lane)的中心和宽度并选择内部目标区。“测定-调节-再测定”循环进行6次，6次重测核心程序的每次都包括3次重复。这3次重测步骤的平均值作为目标度量。
aaLog.txt是仪器产生的自适应腺苷三磷酸双磷酸酶结果的汇总表并且包括在运行目录(run directory)内。该日志归纳了上述信息和第一次“测定-调节-再测定”循环的数据，并且加以注释以便更清楚。
nPixelsUnderDCOffset＝3988(0.023770％)        确定图像是否需要DC补偿
adjusting dc offset
found 2 regions
region 0：center＝1511，width＝798
region 1：center＝2548，width＝820            目标区发现结果
range 0：start＝1245，end＝1777
range 1：start＝2282，end＝2814
process image block...
found 1 cal points
3 samples at 172.755524，average＝0.836458    在进行任何改动之前取3次测量结果
not enough cal points(1)
process image block...
found 3 cal points
4 samples at 82.644630，average＝0.915227     第一循环腺苷三磷酸双磷酸酶的测量
4 samples at 137.931030，average＝0.786803    结果
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found 3 cal points
4 samples at 82.644630，average＝0.915227
4 samples at 137.931030，average＝0.786803
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0：x＝82.644630，y＝0.936956
1：x＝137.931030，y＝0.804354
2：x＝200.000000，y＝0.690772
3：x＝82.644630，y＝0.942456
4：x＝137.931030，y＝0.807885
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6：x＝82.644630，y＝0.915674
7：x＝137.931030，y＝0.772797
8：x＝200.000000，y＝0.675789
9：x＝82.644630，y＝0.865824
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11：x＝200.000000，y＝0.685462
y＝-0.001926431*x+1.066854(raw)
found 3 cal points
4 samples at 82.644630，average＝0.915227
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calPoint 82.644630 has 48 points
initial cv＝0.035133
cv trimmed 48 original values to 48       拒绝离群数据。这可归于流动异
sd trimmed 48 original values to 47       常、气泡等
calPoint 137.931030 has 48 points
initial cv＝0.037847
cv trimmed 48 original values to 48
sd trimmed 48 original values to 45
calPoint 200.000000 has 48 points
initial cv＝0.020899
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sd trimmed 48 original values to 46
y＝-0.001951383*x+1.071890(trimmed)       根据腺苷三磷酸双磷酸酶测定来
found 3 cal points                        计算回归线
47 samples at 82.644630，average＝0.916581，lineFit＝0.910619
45 samples at 137.931030，average＝0.790962，lineFit＝0.802734
46 samples at 200.000000，average＝0.687038，lineFit＝0.681614
calSetPoint＝0.790000
pulseWidthAtSetpoint＝144.456635
adjust＝1.046787                          计算校正系数
maximumPulseWidth＝151
nominalPulseWidth＝116.119
minimumPulseWidth＝60
e2motf＝-22.000000
newApyraseWashPulseWidth＝122.581         计算新的重测脉冲宽度
adjusted pulse width is 123
changing micro′s pulse width to 123      脉冲宽度由微秒改变成毫秒(ms)
MsgType＝108，Index＝21，Pulse＝123
SCRIPT_PULSE_WIDTH_NOTIFY msg received
MsgType＝204，Index＝21，Pulse＝123
process image block...
found 1 cal points
3 samples at 172.755524，average＝0.829998   3次重测流动的平均值
在4次试验(24个总“重测”值)中，在90％置信度时，算法校正了脉冲宽度，产生相对信号在设定值的5％之内，至少78％的时间(22次成功)。如果去掉两个异常值，将会在5％之内，至少89％的时间(24次成功)。也证实了微控制器可控制腺苷三磷酸双磷酸酶脉冲宽度至0.5ms的计算脉冲宽度之内。
因为有所述各种实施方案和实施过程，相关领域技术人员显而易见的是，前述内容仅仅是说明性的而非限制性的，仅以实施例的方式给出。所述实施方案所用的各种功能性元件中分配功能的许多其它方案是可行的。任何元件的功能都可在替代实施方案中以不同方式实现。

Claims (40)

1.一种用于自适应试剂控制的方法，所述方法包括：
a)将第一浓度的酶试剂引入到含有反应底物的反应环境中，其中所述酶试剂和反应底物是测序过程的组成部分；
b)测定所述反应环境中第一浓度酶试剂的活性水平，其中所述活性水平包括所述酶试剂与所述反应底物之间反应的可检测产物；
c)用所检测到的第一浓度的活性水平来确定最佳浓度；和
d)在所述反应环境中使用所述酶试剂的最佳浓度实施测序过程，其中所述测序过程包括一系列重复的测序反应。
2.权利要求1的方法，所述方法还包括：
在步骤d)之前，用所述最佳浓度作为第一浓度，重复步骤a)和b)；和
用所检测到的活性水平来证实所述酶试剂的最佳浓度。
3.权利要求1的方法，所述方法还包括：
将第二浓度和第三浓度的所述酶试剂引入到含有所述反应底物的所述反应环境中；
测定所述反应环境中第二浓度和第三浓度的所述酶试剂的活性水平；和
用所检测到的第一、第二和第三浓度的活性水平来确定最佳浓度。
4.权利要求3的方法，其中：
分别测定第一、第二和第三浓度的活性水平，重复两次或更多次，其中用分别测定的第一、第二和第三浓度的活性水平的两次或更多次测定的平均值来确定最佳浓度。
5.权利要求1的方法，所述方法还包括：
e)在所述测序过程期间一次或多次重复步骤a)-c)。
6.权利要求1的方法，其中：
所述酶试剂包括腺苷三磷酸双磷酸酶，所述反应底物包括ATP，其中将ATP引入到含有腺苷三磷酸双磷酸酶的反应环境中。
7.权利要求6的方法，其中：
用模板核酸进行系列重复的测序反应，在测序反应后续循环之前，将最佳浓度的腺苷三磷酸双磷酸酶引入到所述反应环境中，以减少后续循环中产生的模板核酸序列组成中的引入错误。
8.权利要求7的方法，其中：
所述引入错误包括在所述反应环境中腺苷三磷酸双磷酸酶浓度低于最佳浓度时的延后错误。
9.权利要求7的方法，其中：
所述引入错误包括在所述反应环境中腺苷三磷酸双磷酸酶浓度高于最佳浓度时的不完全延伸错误。
10.权利要求7的方法，其中：
所述引入错误包括在所述反应环境中腺苷三磷酸双磷酸酶浓度高于最佳浓度时来自测序反应的低反应产物。
11.权利要求1的方法，其中：
所述酶试剂包括焦磷酸酶，所述反应底物包括焦磷酸，其中将焦磷酸引入到含有焦磷酸酶的所述反应环境中。
12.权利要求1的方法，其中：
所述酶试剂包括腺苷三磷酸双磷酸酶，所述反应底物包括焦磷酸，其中将焦磷酸引入到含有腺苷三磷酸双磷酸酶的所述反应环境中。
13.权利要求1的方法，其中：
所述酶试剂对环境条件敏感，其中所述环境条件改变所述酶试剂的活性水平。
14.权利要求13的方法，其中：
所述环境条件包括PH或温度。
15.权利要求1的方法，其中：
所述可检测产物包括从所述反应中发出的光。
16.权利要求1的方法，其中：
所述测序反应产生多种反应产物，其中包括反应底物。
17.权利要求1的方法，其中：
所述酶试剂降解所述反应底物。
18.权利要求1的方法，其中：
所述反应环境包括流动槽。
19.权利要求1的方法，其中：
所述反应环境包括板的孔。
20.权利要求19的方法，其中：
所述板包括含有所述孔阵列的纤维光学面板。
21.一种核酸测序系统，所述系统包括：
流动槽，所述流动槽具有进行包括一系列重复的测序反应在内的测序过程的反应环境；
阀门，所述阀门将第一浓度的酶试剂引入到含有反应底物的反应环境中，其中所述酶试剂和反应底物是所述测序过程的组成部分；
检测器，所述检测器检测所述反应环境中第一浓度的所述酶试剂活性水平，其中所述活性水平包括所述酶试剂与所述反应底物之间反应的可检测产物；
其中所述阀门响应所检测到的活性水平，给所述反应环境提供所述酶试剂的最佳浓度。
22.权利要求21的系统，所述系统还包括：
储存有可执行代码的计算机，其中所述可执行代码执行以下步骤：
为所述阀门提供指令控制，以将第一浓度的所述酶试剂和所述反应底物引入到所述反应环境中；
接收来自所述检测器的所检测到的第一浓度的活性水平；
用所检测到的第一浓度的活性水平来确定最佳浓度；和
为所述阀门提供指令控制，以提供最佳浓度。
23.权利要求22的系统，其中：
将所述指令控制提供给控制所述阀门的定时功能的微控制器。
24.权利要求23的系统，其中：
所述阀门的定时功能包括控制脉冲宽度。
25.权利要求21的系统，其中：
所述阀门是多通阀。
26.权利要求21的系统，所述系统还包括：
装有所述酶试剂贮液的第一流体贮存器和装有所述反应底物贮液的第二流体贮存器，其中所述阀门通过第一和第二流体贮存器将第一浓度的所述酶试剂和所述反应底物引入到所述反应环境中。
27.权利要求26的系统，其中：
所述阀门通过第一流体贮存器引进最佳浓度。
28.权利要求21的系统，其中：
所述检测器是CCD检测器。
29.权利要求21的系统，其中：
所述酶试剂包括腺苷三磷酸双磷酸酶，所述反应底物包括ATP，其中将ATP引入到含有腺苷三磷酸双磷酸酶的反应环境中。
30.权利要求29的系统，其中：
在第一重复后的测序反应的每次后续重复中，所述阀门提供腺苷三磷酸双磷酸酶的最佳浓度，以减少后续重复中产生的序列组成中的引入错误。
31.权利要求30的系统，其中：
所述引入错误包括在反应环境中腺苷三磷酸双磷酸酶浓度低于最佳浓度时的延后错误。
32.权利要求30的系统，其中：
所述引入错误包括在反应环境中腺苷三磷酸双磷酸酶浓度高于最佳浓度时的不完全延伸错误。
33.权利要求30的系统，其中：
所述引入错误包括在反应环境中腺苷三磷酸双磷酸酶浓度高于最佳浓度时来自测序反应的低反应产物。
34.权利要求21的系统，其中：
所述酶试剂对环境条件敏感，其中所述环境条件改变所述酶试剂的活性水平。
35.权利要求34的系统，其中：
所述环境条件包括PH或温度。
36.权利要求21的系统，其中：
所述可检测产物包括从所述反应中发出的光。
37.权利要求21的系统，其中：
所述测序反应产生多种反应产物，其中包括反应底物。
38.权利要求21的系统，其中：
所述酶试剂降解所述反应底物。
39.权利要求21的系统，其中：
所述反应环境包括板的孔。
40.权利要求39的系统，其中：
所述板包括含有所述孔阵列的纤维光学面板。
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