JP2002531808A - Ｄｎａ又はｒｎａの配列決定法 - Google Patents
Ｄｎａ又はｒｎａの配列決定法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、次の工程を有するデオキシリボ核酸又はリボ核酸の塩基配列決定法に関する：（１）平坦な支持体にＤＮＡ又はＲＮＡ１本鎖を固定化し、（２）１つの固定化された１本鎖にレーザー光線を集束させ、（３）固定化され、収束された１本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ相補鎖を、（ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンの少なくとも１種の発光標識されたヌクレオチド又はＲＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルの少なくとも１種の発光標識されたヌクレオチド及び（ｉｉ）ポリメラーゼを含有する溶液の添加により構築し、その際、発光標識されたヌクレオチドを相補鎖に組み込むごとに単分子検出器で検出し、その都度次の発光標識されたヌクレオチドの組み込みの前に、先行する発光標識されたヌクレオチドの発光信号を消去する。
Description
【０００１】 本発明は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）の塩基配列決
定法に関する。
定法に関する。
【０００２】 デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）の塩基配列決定は、今日
ではバイオテクノロジー、製剤工業、食品工業、医学診断及び他の応用分野にお
いて重要な分析技術に属している。生物のゲノムの解読は疾病の診断、治療及び
予防並びに改変された特性を有する生物を産出するための遺伝型の意図的変更の
可能性を開く。この潜在能力を利用するために、十分に迅速な配列決定法が必要
である。
ではバイオテクノロジー、製剤工業、食品工業、医学診断及び他の応用分野にお
いて重要な分析技術に属している。生物のゲノムの解読は疾病の診断、治療及び
予防並びに改変された特性を有する生物を産出するための遺伝型の意図的変更の
可能性を開く。この潜在能力を利用するために、十分に迅速な配列決定法が必要
である。
【０００３】 Sanger et al (Proceedings of the National Academy of Science, USA, 74,
5463-7; 1977)並びにMaxam 及び Gilbert (Proceedings of the National Acad
emy of Science, USA, 74, 560-564; 1977)による古典的な配列決定法はなお今
日の標準配列決定法の基礎であるが、２００個のヌクレオチドの配列決定のため
に１〜３日を必要とする。この方法は、約３・１０９個の塩基対を有するヒトゲ
ノムを配列決定する課題のためには冗長すぎる。
5463-7; 1977)並びにMaxam 及び Gilbert (Proceedings of the National Acad
emy of Science, USA, 74, 560-564; 1977)による古典的な配列決定法はなお今
日の標準配列決定法の基礎であるが、２００個のヌクレオチドの配列決定のため
に１〜３日を必要とする。この方法は、約３・１０９個の塩基対を有するヒトゲ
ノムを配列決定する課題のためには冗長すぎる。
【０００４】 配列決定法を加速するための最近の兆候は、個々のヌクレオチドの蛍光分光に
より検出する方法に集中している。米国特許第４９６２０３７号明細書は、塩基
に対して特徴付けした蛍光色素分子が各塩基に共有結合している相補的核酸鎖を
１本鎖に合成する配列決定法を開示している。この蛍光標識された核酸分子を粒
子表面に結合させ、その際、個々の粒子は例えばマイクロインジェクションピペ
ットを用いて液体流の形に保持される。エキソヌクレアーゼの使用により、次い
で各蛍光標識された塩基は核酸鎖から次々に脱離され、液体流の形でレーザー光
線の焦点に送られ、そこで励起後に塩基に対して特異的な蛍光を検出する。この
配列決定法の速度は、理論的にはエキソヌクレアーゼの切断速度によってのみ制
限されるので、１００〜１０００個の塩基／秒の配列決定速度から出発する。
より検出する方法に集中している。米国特許第４９６２０３７号明細書は、塩基
に対して特徴付けした蛍光色素分子が各塩基に共有結合している相補的核酸鎖を
１本鎖に合成する配列決定法を開示している。この蛍光標識された核酸分子を粒
子表面に結合させ、その際、個々の粒子は例えばマイクロインジェクションピペ
ットを用いて液体流の形に保持される。エキソヌクレアーゼの使用により、次い
で各蛍光標識された塩基は核酸鎖から次々に脱離され、液体流の形でレーザー光
線の焦点に送られ、そこで励起後に塩基に対して特異的な蛍光を検出する。この
配列決定法の速度は、理論的にはエキソヌクレアーゼの切断速度によってのみ制
限されるので、１００〜１０００個の塩基／秒の配列決定速度から出発する。
【０００５】 米国特許第４９６２０３７号明細書に開示された方法の実施のための前提条件
は、１つの核酸分子が１つの粒子に固定化されているだけである。しかしながら
、１つの核酸分子を有する１つの粒子を作成することは技術的に著しく費用がか
かり、実際の適用のためには適当ではないことが判明している。さらに、色素−
標識されたヌクレオチドの脱離を行うことができるエキソヌクレアーゼの使用が
必要である。このことがこの方法の発展を複雑化し、さらにこのために改変した
エキソヌクレアーゼの使用が、一般に塩基配列決定の際の不正確性を高めている
。
は、１つの核酸分子が１つの粒子に固定化されているだけである。しかしながら
、１つの核酸分子を有する１つの粒子を作成することは技術的に著しく費用がか
かり、実際の適用のためには適当ではないことが判明している。さらに、色素−
標識されたヌクレオチドの脱離を行うことができるエキソヌクレアーゼの使用が
必要である。このことがこの方法の発展を複雑化し、さらにこのために改変した
エキソヌクレアーゼの使用が、一般に塩基配列決定の際の不正確性を高めている
。
【０００６】 従って、本発明の課題は、例えば先行技術に記載された単一分子検出を用いた
配列決定法の高速性に関する利点を利用するが、同時に上記した欠点を克服した
ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列決定法を提供することであった。
配列決定法の高速性に関する利点を利用するが、同時に上記した欠点を克服した
ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列決定法を提供することであった。
【０００７】 前記課題の解決のために、本発明は、次の工程： （１） ＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を表面に固定化する工程； （２） 個々の固定化された１本鎖上にレーザー光線を集束させる工程； （３） 固定化され、集束された１本鎖のＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖を、（
ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のための塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミ
ンのヌクレオチドの混合物又はＲＮＡ相補鎖の構築のための塩基のアデニン、シ
トシン、グアニン及びウラシルのヌクレオチドの混合物及び（ｉｉ）ポリメラー
ゼを含有する溶液の添加により構築する工程を有し、その際、 ３ａ） 塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンの４種のヌクレオチ
ドの少なくとも２種又は塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルの４
種のヌクレオチドの少なくとも２種は完全に又は部分的に異なる発光標識がなさ
れており、 ３ｂ） 発光標識された１つのヌクレオチドを相補鎖中に組み込むごとに単分
子検出器を用いて検出し、及び ３ｃ） その都度、次の発光標識されたヌクレオチドの組み込みの前に先行す
る発光標識されたヌクレオチドの発光信号を消去する、 ＤＮＡ又はＲＮＡの第１の塩基配列決定法を提供する。
ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のための塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミ
ンのヌクレオチドの混合物又はＲＮＡ相補鎖の構築のための塩基のアデニン、シ
トシン、グアニン及びウラシルのヌクレオチドの混合物及び（ｉｉ）ポリメラー
ゼを含有する溶液の添加により構築する工程を有し、その際、 ３ａ） 塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンの４種のヌクレオチ
ドの少なくとも２種又は塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルの４
種のヌクレオチドの少なくとも２種は完全に又は部分的に異なる発光標識がなさ
れており、 ３ｂ） 発光標識された１つのヌクレオチドを相補鎖中に組み込むごとに単分
子検出器を用いて検出し、及び ３ｃ） その都度、次の発光標識されたヌクレオチドの組み込みの前に先行す
る発光標識されたヌクレオチドの発光信号を消去する、 ＤＮＡ又はＲＮＡの第１の塩基配列決定法を提供する。
【０００８】 さらに、本発明は、次の工程： （１） ＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を表面に固定化する工程； （２） 個々の固定化された１本鎖上にレーザー光線を集束する工程； （３′） 固定化され、集束された１本鎖のＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖を、
それぞれ（ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニ
ン及びチミンの１種のヌクレオチド又はＲＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデ
ニン、シトシン、グアニン及びウラシルの１種のヌクレオチド及び（ｉｉ）ポリ
メラーゼを含有する溶液を次々に添加することにより構築する工程を有し、その
際、 ３ａ′） 溶液中に含まれるヌクレオチドは発光標識されており、 ３ｂ） 発光標識された１つのヌクレオチドを相補鎖中に組み込むごとに単分
子検出器を用いて検出し、 ３ｃ） 発光標識された１つのヌクレオチドの相補鎖中への組み込みを検出し
た後に組み込まれたヌクレオチドの発光信号を消去し、 ３ｄ′） 次の溶液を添加する前にその都度洗浄する、 ＤＮＡ又はＲＮＡの第２の塩基配列決定法を提供する。
それぞれ（ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニ
ン及びチミンの１種のヌクレオチド又はＲＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデ
ニン、シトシン、グアニン及びウラシルの１種のヌクレオチド及び（ｉｉ）ポリ
メラーゼを含有する溶液を次々に添加することにより構築する工程を有し、その
際、 ３ａ′） 溶液中に含まれるヌクレオチドは発光標識されており、 ３ｂ） 発光標識された１つのヌクレオチドを相補鎖中に組み込むごとに単分
子検出器を用いて検出し、 ３ｃ） 発光標識された１つのヌクレオチドの相補鎖中への組み込みを検出し
た後に組み込まれたヌクレオチドの発光信号を消去し、 ３ｄ′） 次の溶液を添加する前にその都度洗浄する、 ＤＮＡ又はＲＮＡの第２の塩基配列決定法を提供する。
【０００９】 ＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖の概念は、本発明の場合、ハイブリダイズして
いないＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子を表す。このような１本鎖は、遺伝子工学
による方法を含めて生物から直接単離することにより、例えばこのような分子を
制限酵素を用いて処理することにより得ることができる。オリゴヌクレオチド、
ＰＣＲ産物及びｃＤＮＡはこの１本鎖に含める。２本鎖から１本鎖を製造するこ
とは当業者にとって、例えばJ. Sambrook et al., Molecular Cloning, 第２版,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989から公知である。制限酵素を用い
た処理は固定化の直前に実施することができ、これは多様な塩基配列を有する分
子の固定化を行う。１本鎖は有利に５〜２０００個の塩基、特に有利に１００〜
１０００個の塩基を有する。
いないＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子を表す。このような１本鎖は、遺伝子工学
による方法を含めて生物から直接単離することにより、例えばこのような分子を
制限酵素を用いて処理することにより得ることができる。オリゴヌクレオチド、
ＰＣＲ産物及びｃＤＮＡはこの１本鎖に含める。２本鎖から１本鎖を製造するこ
とは当業者にとって、例えばJ. Sambrook et al., Molecular Cloning, 第２版,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989から公知である。制限酵素を用い
た処理は固定化の直前に実施することができ、これは多様な塩基配列を有する分
子の固定化を行う。１本鎖は有利に５〜２０００個の塩基、特に有利に１００〜
１０００個の塩基を有する。
【００１０】 本発明による方法の工程（１）ではＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を表面に固
定化する。この表面は、後記する単一分子検出のために必要な光学的透明性を有
する平坦な支持体の表面が有利である。ガラス支持体、特に石英ガラス支持体が
特に有利である。有利な実施態様において、１本鎖を固定化する支持体の表面は
Langmuir-Blodgettフィルムを設置することにより化学的に変性される。セルロ
ース誘導体、特にトリメチルシリルエーテルセルロースシンナメート（ＴＭＳＣ
Ｃ）及びアミノアルキルトリメチルシリルエーテルセルロース（ＡＴＭＳＣ）の
Langmuir-Blodgettフィルムが特に有利である。
定化する。この表面は、後記する単一分子検出のために必要な光学的透明性を有
する平坦な支持体の表面が有利である。ガラス支持体、特に石英ガラス支持体が
特に有利である。有利な実施態様において、１本鎖を固定化する支持体の表面は
Langmuir-Blodgettフィルムを設置することにより化学的に変性される。セルロ
ース誘導体、特にトリメチルシリルエーテルセルロースシンナメート（ＴＭＳＣ
Ｃ）及びアミノアルキルトリメチルシリルエーテルセルロース（ＡＴＭＳＣ）の
Langmuir-Blodgettフィルムが特に有利である。
【００１１】 この１本鎖は吸着的に、共有結合を介して、同様に捕捉分子を介して表面に固
定化される。捕捉分子は特にヌクレオチド−オリゴマーであり、このオリゴマー
は表面に固定化されており、１本鎖はハイブリダイズにより結合することができ
る。表面上でのオリゴマーの固定化は、表面と化学的に反応性の基との共有結合
により又は吸着により行われる。（ストレプト）アビジン−ビオチン−技術を用
いた固定化が特に有利であり、この場合、オリゴマーはビオチンで誘導化されて
おり、表面上に固定化された（ストレプト）アビジン−分子が結合している。（
ストレプト）アビジン−分子の固定化は制限はない。有利な実施態様において、
（ストレプト）アビジン−分子はセルロース誘導体のLangmuir-Blodgettフィル
ムを介して表面に固定化される。この表面をまず１〜８の単層（Monolagen）の
アミノアルキルトリメチルシリルエーテルセルロース（ＡＴＭＳＣ）で、引き続
き１〜８の単層のトリメチルシリルエーテルセルロースシンナメート（ＴＭＳＣ
Ｃ；Trimethylsilylethercellulosecinnammoat）で被覆するのが特に有利である
。（ストレプト）アビジン−分子の共有結合のために次いでＴＭＳＣＣのシンナ
モイル基を酸化してアルデヒド基にする。さらに、本発明の場合、捕捉分子とし
て５′−アミノ−変性オリゴヌクレオチドを使用するのが有利であり、このオリ
ゴヌクレオチドはアルデヒド基、例えばLangmuir-Blodgettフィルム上に上記し
た種類の方法で得られるアルデヒド基に直接結合する。
定化される。捕捉分子は特にヌクレオチド−オリゴマーであり、このオリゴマー
は表面に固定化されており、１本鎖はハイブリダイズにより結合することができ
る。表面上でのオリゴマーの固定化は、表面と化学的に反応性の基との共有結合
により又は吸着により行われる。（ストレプト）アビジン−ビオチン−技術を用
いた固定化が特に有利であり、この場合、オリゴマーはビオチンで誘導化されて
おり、表面上に固定化された（ストレプト）アビジン−分子が結合している。（
ストレプト）アビジン−分子の固定化は制限はない。有利な実施態様において、
（ストレプト）アビジン−分子はセルロース誘導体のLangmuir-Blodgettフィル
ムを介して表面に固定化される。この表面をまず１〜８の単層（Monolagen）の
アミノアルキルトリメチルシリルエーテルセルロース（ＡＴＭＳＣ）で、引き続
き１〜８の単層のトリメチルシリルエーテルセルロースシンナメート（ＴＭＳＣ
Ｃ；Trimethylsilylethercellulosecinnammoat）で被覆するのが特に有利である
。（ストレプト）アビジン−分子の共有結合のために次いでＴＭＳＣＣのシンナ
モイル基を酸化してアルデヒド基にする。さらに、本発明の場合、捕捉分子とし
て５′−アミノ−変性オリゴヌクレオチドを使用するのが有利であり、このオリ
ゴヌクレオチドはアルデヒド基、例えばLangmuir-Blodgettフィルム上に上記し
た種類の方法で得られるアルデヒド基に直接結合する。
【００１２】 さらに、工程（１）では、ＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖が≦１分子／μｍ２ の表面密度で存在するようにＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を表面に固定化する
のが有利である。
のが有利である。
【００１３】 この表面密度は有利に表面上の共有結合点の表面密度を調節することにより調
節される。このための方法は、光架橋可能なLangmuir-Blodgettフィルム、例え
ば上記したＴＭＳＣＣフィルムを提供し、その上にＵＶ線を用いた照射時間に依
存する反応性の基を表面上に生じさせる。次にこの反応性の基はＤＮＡ１本鎖又
はＲＮＡ１本鎖、ヌクレオチド−オリゴマー又は（ストレプト）アビジン分子の
共有結合のために利用される。また固定化すべき１本鎖又は固定化すべきオリゴ
マーの溶液中の濃度により１本鎖の表面密度は調節される。この場合、この濃度
は支持体の表面、並びに固定化すべき１本鎖もしくは固定化すべきオリゴマーの
溶液の容量に依存する。
節される。このための方法は、光架橋可能なLangmuir-Blodgettフィルム、例え
ば上記したＴＭＳＣＣフィルムを提供し、その上にＵＶ線を用いた照射時間に依
存する反応性の基を表面上に生じさせる。次にこの反応性の基はＤＮＡ１本鎖又
はＲＮＡ１本鎖、ヌクレオチド−オリゴマー又は（ストレプト）アビジン分子の
共有結合のために利用される。また固定化すべき１本鎖又は固定化すべきオリゴ
マーの溶液中の濃度により１本鎖の表面密度は調節される。この場合、この濃度
は支持体の表面、並びに固定化すべき１本鎖もしくは固定化すべきオリゴマーの
溶液の容量に依存する。
【００１４】 本発明による方法の工程（２）では、レーザー光線を１つの固定化された１本
鎖上に集束させる。この場合、レーザー光線の選択は、ヌクレオチド塩基の使用
された発光標識に依存し、この標識は後記する。工程（２）において固定化され
た１本鎖上にレーザー光線の集束について、有利に（ａ）発光標識したヌクレオ
チド−オリゴマーを１本鎖とハイブリダイズさせ、（ｂ）ハイブリダイズしたヌ
クレオチド−オリゴマーの位置をレーザー光線を用いる１本鎖が固定化されてい
る表面の走査により決定し、（ｃ）ハイブリダイズしたヌクレオチド−オリゴマ
ーの発光信号を引き続き消去するように進行する。工程（ａ）は１本鎖の固定化
の前又は後で実施することができる。この場合、ヌクレオチド−オリゴマーの発
光標識及びレーザー光線は、工程（ｂ）において発光標識が励起して発光するよ
うに選択される。工程（ｂ）でのレーザー光線を用いた表面の走査は、例えばレ
ーザー操作顕微鏡において使用されているような慣用の走査装置又はスキャニン
グ装置を用いて行うことができる。工程（ｃ）において発光標識の消去は、レー
ザ標識の脱離、特に光脱離により又は光退色により行うことができる。
鎖上に集束させる。この場合、レーザー光線の選択は、ヌクレオチド塩基の使用
された発光標識に依存し、この標識は後記する。工程（２）において固定化され
た１本鎖上にレーザー光線の集束について、有利に（ａ）発光標識したヌクレオ
チド−オリゴマーを１本鎖とハイブリダイズさせ、（ｂ）ハイブリダイズしたヌ
クレオチド−オリゴマーの位置をレーザー光線を用いる１本鎖が固定化されてい
る表面の走査により決定し、（ｃ）ハイブリダイズしたヌクレオチド−オリゴマ
ーの発光信号を引き続き消去するように進行する。工程（ａ）は１本鎖の固定化
の前又は後で実施することができる。この場合、ヌクレオチド−オリゴマーの発
光標識及びレーザー光線は、工程（ｂ）において発光標識が励起して発光するよ
うに選択される。工程（ｂ）でのレーザー光線を用いた表面の走査は、例えばレ
ーザー操作顕微鏡において使用されているような慣用の走査装置又はスキャニン
グ装置を用いて行うことができる。工程（ｃ）において発光標識の消去は、レー
ザ標識の脱離、特に光脱離により又は光退色により行うことができる。
【００１５】 第１の本発明による方法の工程（３）において、固定化され、集束された１本
鎖のＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖は、（ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のために塩基
のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンのヌクレオチドの混合物又はＲＮＡ
相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルのヌク
レオチドの混合物及び（ｉｉ）ポリメラーゼを含有する溶液の添加により構築さ
れる。また、合成核酸、つまりホスフェート骨格を有しない、例えばペプチド骨
格を有する核酸（ペプチド核酸）のために、塩基のアデニン、シトシン、グアニ
ン及びチミンもしくは塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンのポリマ
ーの構築を実施することもできる。本発明の場合、塩基のアデニン、シトシン、
グアニン及びチミンの４種のヌクレオチドの少なくとも２種又は塩基のアデニン
、シトシン、グアニン及びウラシルの４種のヌクレオチドの２種が完全に又は部
分的に、異なる発光標識がなされている。全ての４種の塩基が異なる発光標識を
有することが特に有利である。これは、相補鎖の単に簡単な構築の際に塩基配列
を決定できる。４種の塩基の２種が異なる発光標識されている場合、完全な配列
を得るために構築を５回繰り返さなければならず、この場合、各繰り返しの際に
標識された塩基の多様な組合せが使用される。３種の異なる標識がなされた塩基
を使用する場合、多様な組合せの標識された塩基を用いてそれぞれ３回繰り返さ
なければならない。
鎖のＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖は、（ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のために塩基
のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンのヌクレオチドの混合物又はＲＮＡ
相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルのヌク
レオチドの混合物及び（ｉｉ）ポリメラーゼを含有する溶液の添加により構築さ
れる。また、合成核酸、つまりホスフェート骨格を有しない、例えばペプチド骨
格を有する核酸（ペプチド核酸）のために、塩基のアデニン、シトシン、グアニ
ン及びチミンもしくは塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンのポリマ
ーの構築を実施することもできる。本発明の場合、塩基のアデニン、シトシン、
グアニン及びチミンの４種のヌクレオチドの少なくとも２種又は塩基のアデニン
、シトシン、グアニン及びウラシルの４種のヌクレオチドの２種が完全に又は部
分的に、異なる発光標識がなされている。全ての４種の塩基が異なる発光標識を
有することが特に有利である。これは、相補鎖の単に簡単な構築の際に塩基配列
を決定できる。４種の塩基の２種が異なる発光標識されている場合、完全な配列
を得るために構築を５回繰り返さなければならず、この場合、各繰り返しの際に
標識された塩基の多様な組合せが使用される。３種の異なる標識がなされた塩基
を使用する場合、多様な組合せの標識された塩基を用いてそれぞれ３回繰り返さ
なければならない。
【００１６】 第２の本発明による方法の工程（３′）において、固定化され、集束された１
本鎖のＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖は、それぞれ（ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築の
ために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンの１つのヌクレオチド又
はＲＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシ
ルの１つのヌクレオチド及び（ｉｉ）ポリメラーゼを含有する溶液を相互に順番
に添加することにより構築され、その際、溶液中に含まれるヌクレオチドは発光
標識されている。ここでもまた、合成核酸、つまりホスフェート骨格を有さず、
例えばペプチド骨格を有するような核酸（ペプチド核酸）のために塩基のアデニ
ン、シトシン、グアニン及びチミンもしくは塩基のアデニン、シトシン、グアニ
ン及びウラシルの塩基のポリマーの構築を実施することができる。第２の本発明
による方法によると、相補鎖の構築は、それぞれのヌクレオチド溶液を相互に順
番に添加することにより行われ、その際、その都度次の溶液を添加する前に洗浄
しなければならない。ヌクレオチド溶液の添加後に組み込まれた信号の検出を単
分子検出器を用いて行う場合、それにより測定された塩基の信号は分類すること
ができる。例えばポリメラーゼ並びに塩基のアデニン、シトシン、グアニン及び
チミンのそれぞれ１つのヌクレオチドを含有する溶液を固定化された１本鎖に添
加し、かつ第２の溶液、つまりシトシン溶液の添加の際に単に単に信号を検出す
る場合、固定化された１本鎖の相応する塩基はグアニンである。それに対して、
第２並びに第３の溶液の添加の際に信号が検出された場合、従ってグアニン−シ
トシンの配列順序が固定化された１本鎖状に見られる。相応する溶液の添加を繰
り返すことにより、固定化された１本鎖の全体の配列が決定される。
本鎖のＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖は、それぞれ（ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築の
ために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンの１つのヌクレオチド又
はＲＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシ
ルの１つのヌクレオチド及び（ｉｉ）ポリメラーゼを含有する溶液を相互に順番
に添加することにより構築され、その際、溶液中に含まれるヌクレオチドは発光
標識されている。ここでもまた、合成核酸、つまりホスフェート骨格を有さず、
例えばペプチド骨格を有するような核酸（ペプチド核酸）のために塩基のアデニ
ン、シトシン、グアニン及びチミンもしくは塩基のアデニン、シトシン、グアニ
ン及びウラシルの塩基のポリマーの構築を実施することができる。第２の本発明
による方法によると、相補鎖の構築は、それぞれのヌクレオチド溶液を相互に順
番に添加することにより行われ、その際、その都度次の溶液を添加する前に洗浄
しなければならない。ヌクレオチド溶液の添加後に組み込まれた信号の検出を単
分子検出器を用いて行う場合、それにより測定された塩基の信号は分類すること
ができる。例えばポリメラーゼ並びに塩基のアデニン、シトシン、グアニン及び
チミンのそれぞれ１つのヌクレオチドを含有する溶液を固定化された１本鎖に添
加し、かつ第２の溶液、つまりシトシン溶液の添加の際に単に単に信号を検出す
る場合、固定化された１本鎖の相応する塩基はグアニンである。それに対して、
第２並びに第３の溶液の添加の際に信号が検出された場合、従ってグアニン−シ
トシンの配列順序が固定化された１本鎖状に見られる。相応する溶液の添加を繰
り返すことにより、固定化された１本鎖の全体の配列が決定される。
【００１７】 溶液中に含まれるポリメラーゼは相補鎖の構築を触媒する。このポリメラーゼ
の選択は、ポリメラーゼが色素で標識されたヌクレオチドを有する相補鎖を構築
できる限り制限はない。本発明により使用可能なポリメラーゼの例は、ネーティ
ブＴ４−ポリメラーゼ、ネーティブＴ７−ポリメラーゼ、Ｅ． ｃｏｌｉ ｐｏｌ
Ｉのクレノウ断片、Ｅｘｏ ＩＩＩ、Ｅ． ｃｏｌｉ ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素、
ヘビ毒ホスホジエステラーゼ及びＴａｑ−ポリメラーゼである。
の選択は、ポリメラーゼが色素で標識されたヌクレオチドを有する相補鎖を構築
できる限り制限はない。本発明により使用可能なポリメラーゼの例は、ネーティ
ブＴ４−ポリメラーゼ、ネーティブＴ７−ポリメラーゼ、Ｅ． ｃｏｌｉ ｐｏｌ
Ｉのクレノウ断片、Ｅｘｏ ＩＩＩ、Ｅ． ｃｏｌｉ ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素、
ヘビ毒ホスホジエステラーゼ及びＴａｑ−ポリメラーゼである。
【００１８】 相補鎖中への発光標識されたヌクレオチドのポリメラーゼにより触媒された各
組込みは、本発明の場合単分子検出器（Einzelmolekueldetektor）を用いて検出
される。本発明により使用可能な単分子検出器は、所定の検出容量、レーザー光
線の所定の波長及び出力及びヌクレオチドの所定の発光標識の場合に１つの発光
標識されたヌクレオチド分子の検出が行える限り制限はない。単分子検出器の感
度に関する要求はこの場合、検出容量の増加及びレーザー光線の出力の上昇と共
に向上する。従って、検出容量を最小にし、レーザー光線を回折限度（beugungs
begrenzt）で集束させるのが特に有利である。
組込みは、本発明の場合単分子検出器（Einzelmolekueldetektor）を用いて検出
される。本発明により使用可能な単分子検出器は、所定の検出容量、レーザー光
線の所定の波長及び出力及びヌクレオチドの所定の発光標識の場合に１つの発光
標識されたヌクレオチド分子の検出が行える限り制限はない。単分子検出器の感
度に関する要求はこの場合、検出容量の増加及びレーザー光線の出力の上昇と共
に向上する。従って、検出容量を最小にし、レーザー光線を回折限度（beugungs
begrenzt）で集束させるのが特に有利である。
【００１９】 発光標識の励起の目的で、散乱光の発生を最小にするために、６００ｎｍ以上
の波長を有するレーザー光線が有利である。本発明による方法のためにコストの
理由からこの波長領域の半導体レーザが特に有利である。蛍光寿命の測定を介し
て検出を行う場合、本発明により使用されるレーザは変調、有利にパルス化され
る。
の波長を有するレーザー光線が有利である。本発明による方法のためにコストの
理由からこの波長領域の半導体レーザが特に有利である。蛍光寿命の測定を介し
て検出を行う場合、本発明により使用されるレーザは変調、有利にパルス化され
る。
【００２０】 この発光標識は使用したレーザー光並びに使用した単分子検出器に適合させる
。本発明の場合に蛍光体を発光標識として使用するのが有利である。蛍光体の適
当な塩（つまり標識されたヌクレオチドごとの蛍光体）は、検出の種類に依存し
て選択される。この場合、色の検出（つまり放出される光子の波長）と蛍光体の
蛍光寿命の検出との間では区別すべきである。蛍光寿命の検出のための色素セッ
トの例は、S. Seeger et al., Ber Bunsenges. Physikal. Chem. 97, 1542-1548
(1993)並びにM. Sauer et al., J. Fluorescence 3, 131-139 (1993)に記載さ
れており、色の検出のための色素セットの例は、L. M. Smith et al., Nature 3
12, 674-670 (1989)並びにJ. M: Prober et al., Science 238, 336-341 (1987)
に記載されている。例えば、蛍光寿命の検出の場合、Sauer et al., J. Fluor.
5, 247-254, 1995に開示された色素ＪＡ２２、ＪＡ６６、ＪＡ５１−ＤＳ並びに
シアニン染料Ｃｙ５（Amersham Pharmacia Biothech, Uppsala, Schweden）を使
用することができ；色の検出の場合、色素ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ及びＲＯ
Ｘ（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を使用することができる。第
１の本発明による方法において発光標識されたヌクレオチドは異なる発光体を用
いて標識されているが、第２の本発明による方法において各ヌクレオチドに対し
て色素は同じであってもよく、それというのもヌクレオチドの区別はそれぞれの
溶液の相違によって可能であるためである。簡単な励起及び検出の観点でこの手
法が本発明の場合に有利である。
。本発明の場合に蛍光体を発光標識として使用するのが有利である。蛍光体の適
当な塩（つまり標識されたヌクレオチドごとの蛍光体）は、検出の種類に依存し
て選択される。この場合、色の検出（つまり放出される光子の波長）と蛍光体の
蛍光寿命の検出との間では区別すべきである。蛍光寿命の検出のための色素セッ
トの例は、S. Seeger et al., Ber Bunsenges. Physikal. Chem. 97, 1542-1548
(1993)並びにM. Sauer et al., J. Fluorescence 3, 131-139 (1993)に記載さ
れており、色の検出のための色素セットの例は、L. M. Smith et al., Nature 3
12, 674-670 (1989)並びにJ. M: Prober et al., Science 238, 336-341 (1987)
に記載されている。例えば、蛍光寿命の検出の場合、Sauer et al., J. Fluor.
5, 247-254, 1995に開示された色素ＪＡ２２、ＪＡ６６、ＪＡ５１−ＤＳ並びに
シアニン染料Ｃｙ５（Amersham Pharmacia Biothech, Uppsala, Schweden）を使
用することができ；色の検出の場合、色素ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ及びＲＯ
Ｘ（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を使用することができる。第
１の本発明による方法において発光標識されたヌクレオチドは異なる発光体を用
いて標識されているが、第２の本発明による方法において各ヌクレオチドに対し
て色素は同じであってもよく、それというのもヌクレオチドの区別はそれぞれの
溶液の相違によって可能であるためである。簡単な励起及び検出の観点でこの手
法が本発明の場合に有利である。
【００２１】 単分子検出器は、結像光学素子、光子の衝突の際に電気信号を発生させるユニ
ット並びに電気信号の評価のためのソフトウェアを備えたコンピュータからなる
。結像光学素子は有利に、電気信号を発生するユニット上に測定される光子をレ
ーザー光線の焦点に対する共焦点の結像を可能にする。このユニットは有利にフ
ォトダイオード、特に有利に単光子計数−アバランシュフォトダイオード（Einz
elphotonenzaehl-Avalanche-Photodiode）である。また、光電子倍増管又は強化
されたＣＣＤカメラを使用することもできる。本発明により使用可能な単分子検
出器は、レーザーによる励起後の特定の時間後に初めて検出を開始（Gating）す
るように調節されているのが特に有利である。本発明により使用可能な単分子検
出器はLoescher et al., Anal. Chem., 第７０巻, ３２０２−３２０５頁, 1998
に記載されている。色の識別のために検出器は相応するフィルタを装備する。蛍
光寿命の測定により識別するために、時間−相関−単光子計数モードで作業する
検出器を使用するのが有利である。さらに、例えばSL Microtest GmbH, Jenaに
より市販されている迅速な測定電子工学装置が必要である。
ット並びに電気信号の評価のためのソフトウェアを備えたコンピュータからなる
。結像光学素子は有利に、電気信号を発生するユニット上に測定される光子をレ
ーザー光線の焦点に対する共焦点の結像を可能にする。このユニットは有利にフ
ォトダイオード、特に有利に単光子計数−アバランシュフォトダイオード（Einz
elphotonenzaehl-Avalanche-Photodiode）である。また、光電子倍増管又は強化
されたＣＣＤカメラを使用することもできる。本発明により使用可能な単分子検
出器は、レーザーによる励起後の特定の時間後に初めて検出を開始（Gating）す
るように調節されているのが特に有利である。本発明により使用可能な単分子検
出器はLoescher et al., Anal. Chem., 第７０巻, ３２０２−３２０５頁, 1998
に記載されている。色の識別のために検出器は相応するフィルタを装備する。蛍
光寿命の測定により識別するために、時間−相関−単光子計数モードで作業する
検出器を使用するのが有利である。さらに、例えばSL Microtest GmbH, Jenaに
より市販されている迅速な測定電子工学装置が必要である。
【００２２】 有利な実施態様において、単分子検出器は自己相関関数を有している。この自
己相関関数は、自由拡散する分子の発光と固定化された核酸鎖の発光とを区別す
ることができ、従って信号−雑音−割合を高めるために用いられる。
己相関関数は、自由拡散する分子の発光と固定化された核酸鎖の発光とを区別す
ることができ、従って信号−雑音−割合を高めるために用いられる。
【００２３】 本発明の場合、組み込まれたヌクレオチドの検出された発光信号はその都度次
の発光標識されたヌクレオチドの組み込みの前に消去される。この消去は発光標
識の脱離により、特に光脱離により行うことができる。この消去は、例えばＷＯ
９５／３１４２９に開示されたように、発光標識が感光性基を介して結合してい
る場合に可能である。短いレーザーパルスは次に発光標識を脱離させる。脱離の
ためには一般に励起のためのレーザーの波長とは異なる波長が使用される。さら
にヌクレオチドの発光標識の光退色により発光信号を消去するのが有利である。
これは例えばレーザー強度を短期間高めることにより、つまり短いレーザーパル
スにより達成される。
の発光標識されたヌクレオチドの組み込みの前に消去される。この消去は発光標
識の脱離により、特に光脱離により行うことができる。この消去は、例えばＷＯ
９５／３１４２９に開示されたように、発光標識が感光性基を介して結合してい
る場合に可能である。短いレーザーパルスは次に発光標識を脱離させる。脱離の
ためには一般に励起のためのレーザーの波長とは異なる波長が使用される。さら
にヌクレオチドの発光標識の光退色により発光信号を消去するのが有利である。
これは例えばレーザー強度を短期間高めることにより、つまり短いレーザーパル
スにより達成される。
【００２４】 従って、発光信号を消去する速度は特にレーザーパルスの出力並びに検出とレ
ーザーパルスとの間の時間に依存する。両方のパラメータは良好に制御可能であ
る。組み込まれたヌクレオチドの発光信号をその都度次のヌクレオチドの組み込
みの前に消去することを保障するために、これらのパラメータは相補鎖の構築速
度に適合される。相補鎖の構築速度は、ポリメラーゼ活性に決定的に影響を及ぼ
す溶液の温度を調節することにより及びヌクレオチド濃度を調節することにより
制御できる。
ーザーパルスとの間の時間に依存する。両方のパラメータは良好に制御可能であ
る。組み込まれたヌクレオチドの発光信号をその都度次のヌクレオチドの組み込
みの前に消去することを保障するために、これらのパラメータは相補鎖の構築速
度に適合される。相補鎖の構築速度は、ポリメラーゼ活性に決定的に影響を及ぼ
す溶液の温度を調節することにより及びヌクレオチド濃度を調節することにより
制御できる。
【００２５】 第１の本発明による方法においてヌクレオチドの全ては発光標識しない場合、
相補鎖の１回の構築で固定化された１本鎖の塩基配列は第１の本発明による方法
において十分な精度で決定できない。従って、完全な配列の決定のために構築を
繰り返さなければならない。このことは本発明の場合同じ１本鎖に関して実施す
るのが有利である。このために、上記したように構築されたＤＮＡ相補鎖又はＲ
ＮＡ相補鎖を固定化されたＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖から温度上昇により脱
離させ、上記方法の方法工程（３）を繰り返す。従って、本発明による方法は同
一分子の配列決定を数回実施することができる。このことは発光標識されたヌク
レオチドを使用する場合でも配列決定の精度を高めるために有利である。
相補鎖の１回の構築で固定化された１本鎖の塩基配列は第１の本発明による方法
において十分な精度で決定できない。従って、完全な配列の決定のために構築を
繰り返さなければならない。このことは本発明の場合同じ１本鎖に関して実施す
るのが有利である。このために、上記したように構築されたＤＮＡ相補鎖又はＲ
ＮＡ相補鎖を固定化されたＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖から温度上昇により脱
離させ、上記方法の方法工程（３）を繰り返す。従って、本発明による方法は同
一分子の配列決定を数回実施することができる。このことは発光標識されたヌク
レオチドを使用する場合でも配列決定の精度を高めるために有利である。
【００２６】 また、本発明による方法は支持体上に固定化された他の１本鎖に関して繰り返
すことができる。同じ塩基配列を有する１本鎖の場合、配列決定の高い精度が得
られる。配列決定すべき核酸が固定化する前に制限酵素で処理されている場合、
この処理により生じた１本鎖の多様な断片を漸次に決定することも可能である。
制限酵素を用いた処理はこの場合固定化の直前に同じ反応容器中で行うことがで
きる。
すことができる。同じ塩基配列を有する１本鎖の場合、配列決定の高い精度が得
られる。配列決定すべき核酸が固定化する前に制限酵素で処理されている場合、
この処理により生じた１本鎖の多様な断片を漸次に決定することも可能である。
制限酵素を用いた処理はこの場合固定化の直前に同じ反応容器中で行うことがで
きる。
【００２７】 実施例 例１ １本鎖を徐々に結合させる場合に約４ｃｍ２のガラス表面に対して、１０- ８
ｍｏｌ／ｌのアミノ官能化されたオリゴヌクレオチド溶液１ｍｌをＰＢＳ緩衝液
中で一晩中インキュベートし、次いで１本鎖の１ｍｌ溶液の添加によりハイブリ
ダイズ緩衝液（１０- ８ｍｏｌ／ｌ）中で１〜２時間５８℃〜２８℃に勾配する
温度でハイブリダイズさせ、次いで色素標識されたオリゴヌクレオチド（１０-
８ｍｏｌ／ｌ、１ｍｌハイブリダイズ緩衝液、２８℃〜４℃に勾配する温度）を
２〜３時間対向ハイブリダイズさせた。約１分子複合体／１０μｍ２の密度が生
じた。
ｍｏｌ／ｌのアミノ官能化されたオリゴヌクレオチド溶液１ｍｌをＰＢＳ緩衝液
中で一晩中インキュベートし、次いで１本鎖の１ｍｌ溶液の添加によりハイブリ
ダイズ緩衝液（１０- ８ｍｏｌ／ｌ）中で１〜２時間５８℃〜２８℃に勾配する
温度でハイブリダイズさせ、次いで色素標識されたオリゴヌクレオチド（１０-
８ｍｏｌ／ｌ、１ｍｌハイブリダイズ緩衝液、２８℃〜４℃に勾配する温度）を
２〜３時間対向ハイブリダイズさせた。約１分子複合体／１０μｍ２の密度が生
じた。
【００２８】 例２ 固定化の前のハイブリダイズ工程を実施する第２の工程において、１本鎖、ア
ミノ官能化されたオリゴヌクレオチド及び色素標識されたオリゴヌクレオチドを
一緒に緩衝液１ｍｌ中でそれぞれ１０- ７ｍｏｌ／ｌの濃度で混合し、引き続き
この溶液を１０- １０ｍｏｌ／ｌに希釈し、固定化のために使用し、同様に約１
分子複合体／１０μｍ２の密度が生じた。
ミノ官能化されたオリゴヌクレオチド及び色素標識されたオリゴヌクレオチドを
一緒に緩衝液１ｍｌ中でそれぞれ１０- ７ｍｏｌ／ｌの濃度で混合し、引き続き
この溶液を１０- １０ｍｏｌ／ｌに希釈し、固定化のために使用し、同様に約１
分子複合体／１０μｍ２の密度が生じた。
【００２９】 例３ 固定化された１本鎖に、色素Ｃｙ５（Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsa
la, Schweden）で標識した１０- １１Ｍのモノヌクレオチド２μｌ及び７Ｐ−シ
ークエナーゼ−ポリメラーゼ３．５ｕを添加した。このヌクレオチドの組み込み
を４００μＷのレーザー出力及び２μｍの焦点直径で検出した。
la, Schweden）で標識した１０- １１Ｍのモノヌクレオチド２μｌ及び７Ｐ−シ
ークエナーゼ−ポリメラーゼ３．５ｕを添加した。このヌクレオチドの組み込み
を４００μＷのレーザー出力及び２μｍの焦点直径で検出した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G043 BA16 DA02 EA01 FA02 FA03 KA09 LA01 LA02 LA03 2G045 AA35 DA12 DA13 DA14 FA12 FB02 FB12 FB13 GC15 JA01 2G054 AB10 CA22 CE02 EA03 EB03 FB02 GA05 GB10 JA01 4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 HA13 HA14 HA19 4B063 QA13 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR55 QR66 QR84 QS03 QS11 QS20 QS36
Claims (15)
- 【請求項１】 次の工程： （１） ＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を表面に固定化する工程； （２） 個々の固定化された１本鎖上にレーザー光線を集束する工程； （３） 固定化され、集束された１本鎖のＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖を、（
ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のための塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミ
ンのヌクレオチドの混合物又はＲＮＡ相補鎖の構築のための塩基のアデニン、シ
トシン、グアニン及びウラシルのヌクレオチドの混合物及び（ｉｉ）ポリメラー
ゼを含有する溶液の添加により構築する工程を有し、その際、 ３ａ） 塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンの４種のヌクレオチ
ドの少なくとも２種又は塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルの４
種のヌクレオチドの少なくとも２種は完全に又は部分的に、異なる発光標識がな
されており、 ３ｂ） 発光標識された１つのヌクレオチドを相補鎖中に組み込むごとに単分
子検出器を用いて検出し、及び ３ｃ） その都度、次の発光標識されたヌクレオチドの組み込みの前に先行す
る発光標識されたヌクレオチドの発光信号を消去する、 ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列決定法。 - 【請求項２】 次の工程： （１） ＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を表面に固定化する工程； （２） 個々の固定化された１本鎖上にレーザー光線を集束する工程； （３′） 固定化され、集束された１本鎖のＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖を、
それぞれ（ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニ
ン及びチミンの１種のヌクレオチド又はＲＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデ
ニン、シトシン、グアニン及びウラシルの１種のヌクレオチド及び（ｉｉ）ポリ
メラーゼを含有する溶液を次々に添加することにより構築する工程を有し、その
際、 ３ａ′） 溶液中に含まれるヌクレオチドは発光標識されており、 ３ｂ） 発光標識された１つのヌクレオチドを相補鎖中に組み込むごとに単分
子検出器を用いて検出し、 ３ｃ） 発光標識された１つのヌクレオチドの相補鎖中への組み込みを検出し
た後に組み込まれたヌクレオチドの発光信号を消去し、 ３ｄ′） 次の溶液を添加する前にその都度洗浄する、 ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列決定法。 - 【請求項３】 工程（１）においてＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を表面に
固定化するために、表面上に固定化されたヌクレオチド−オリゴマーを介してハ
イブリダイズさせることにより前記１本鎖を固定化する、請求項１又は２記載の
方法。 - 【請求項４】 工程（１）においてＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を表面に
固定化する際に、ＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を≦１分子／μｍ２の表面密度
で固定化する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項５】 表面上の共有結合点の表面密度の調節により１本鎖の表面密
度を調節する、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 固定化すべき１本鎖又は固定化すべきオリゴマーの濃度によ
り１本鎖の表面密度を調節する、請求項４記載の方法。 - 【請求項７】 工程（２）において固定化された１本鎖上にレーザー光線を
集束するために、 ａ） 発光標識されたヌクレオチド−オリゴマーを１本鎖とハイブリダイズさせ
、 ｂ） ハイブリダイズしたヌクレオチド−オリゴマーの位置をレーザー光線を用
いた表面の走査により決定し、及び ｃ） ハイブリダイズしたヌクレオチド−オリゴマーの発光信号を引き続き消去
する、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】 工程（３ｂ）において発光標識された１つのヌクレオチドを
１本鎖中に組み込むごとに、発光標識されたヌクレオチドの蛍光寿命によって検
出する、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】 工程（３ｂ）において発光標識された１つのヌクレオチドを
１本鎖中に組み込むごとに、発光標識されたヌクレオチドの色によって検出する
、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１０】 工程（３ｂ）において単分子検出器は自己相関関数を有す
る、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１１】 工程（３ｃ）において発光信号の消去を、ヌクレオチドの
発光標識の脱離により行う、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１２】 工程（３ｃ）において発光信号の消去を、ヌクレオチドの
発光標識の光退色により行う、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１３】 工程（３ｃ）において、次の塩基を組み込む前のその都度
の発光信号の消去を、ポリメラーゼ活性、レーザー強度及びヌクレオチド濃度の
パラメータの調整により行う、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法
。 - 【請求項１４】 請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法により構
築されたＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖を固定化されたＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ
１本鎖から温度を上昇させることにより脱離させ、請求項１から１３までのいず
れか１項記載の方法を同じ１本鎖で繰り返す、ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列決定
法。 - 【請求項１５】 請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法を、表面
に固定化された他のＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖で繰り返す、ＤＮＡ又はＲＮ
Ａの塩基配列決定法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19844931A DE19844931C1 (de) | 1998-09-30 | 1998-09-30 | Verfahren zur DNS- oder RNS-Sequenzierung |
| DE19844931.3 | 1998-09-30 | ||
| PCT/EP1999/007209 WO2000018956A1 (de) | 1998-09-30 | 1999-09-29 | Verfahren zur dns- oder rns-sequenzierung |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP2000572403A Expired - Fee Related JP4441699B2 (ja) | 1998-09-30 | 1999-09-29 | Ｄｎａ又はｒｎａの配列決定法 |
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