CN113390839A - 对化学反应的光学控制 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于对包括试剂液(114)的反应室(149)中的化学反应进行光学控制的设备(100)和方法。在优选实施例中，所述化学反应包括在丝网上的核酸序列测定。基于对激励光(110)和裂解光(112)的强的光学限制，能够读出序列测定反应。通过使用具有光学可裂解的阻断基团的核苷酸来实现逐步序列测定。在读出之后，通过相同基底由裂解光解除对核苷酸中的构建的阻断。这确保了，仅被结合的核苷酸将被解阻断。为了避免裂解光的过度加热，所述试剂液沿着所述基底(101)的表面循环。

Description

对化学反应的光学控制
本申请是申请日为2014年11月20日、发明名称为“对化学反应的光学控制”的专利申请201480064934.X的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种用于对包括试剂液的反应室中的化学反应进行光学控制的设备和方法。具体地，本发明涉及一种用于对迭代逐步反应进行光学控制以确定核酸的序列的设备以及用于对迭代逐步反应进行光学控制以确定核酸的序列的方法。
背景技术
WO 2013/105025 Al描述了一种用于对被荧光标记的核酸到被附着至丝网基底的表面的分子中的迭代并入进行光学控制的设备和方法，在此通过引用将其并入本文。基于倏逝波对激励光和裂解光的强的光学限制，能够读出序列测定反应而无需清洗所述表面。通过使用具有光学可裂解的阻断基团的核苷酸来实现逐步序列测定。在读出之后，通过相同的基底由裂解光来解除对内嵌的核苷酸的阻断。这确保了，仅被结合的核苷酸将被解除阻断。
发明内容
获得允许具有增加的吞吐量的光学控制的化学反应(尤其是核序列测定反应)的流程将是有利的。
该问题是由根据权利要求1的设备和根据权利要求11的方法来解决的。在从属权利要求中公开了优选实施例。
根据第一方面，本发明的实施例涉及一种用于对反应室中的化学反应进行光学控制的设备，所述反应室包括试剂液。所述设备包括如下部件：
-基底，其用于将至少一个分子结合在基底的第一表面上，其中，所述第一表面是所述反应室的壁(边界)；所述基底可以尤其是丝网。
-光学装置，其被配置为将光引导至所述基底以光学诱发光化学裂解反应。由于该效应，该光将在下文中被称为“裂解光”。
-循环装置，其用于使所述反应室中的所述试剂液循环。
“反应室”通常是开放腔、闭合腔或者通过流体连接通道连接到其他腔的腔。
根据第二方面，本发明的实施例涉及一种用于对包括试剂液的反应室中的化学反应进行光学控制的方法，所述方法包括如下步骤：
-提供基底，其具有被结合在所述基底的第一表面上的分子，其中，所述第一表面是所述反应室的壁。
-由光学装置利用裂解波长λCL的裂解光，优选利用UV光，来辐照所述基底，并且从而光学诱发光化学裂解反应。
-使所述反应室中的所述试剂液优选沿着所述基底的所述第一表面循环。
应当注意到，本发明的涉及方法的所有实施例可以利用如所描述的步骤的次序来执行，然而，这并非是所述方法的仅有并且基本的次序。在此描述了所述方法的步骤的所有不同的次序和组合。
所描述的设备和方法基于相同的基本思想，即：试剂液沿着利用裂解光进行辐照的反应表面的循环。针对所述设备描述的解释说明和实施例因此针对方法也是类似地有效的，并且反之亦然。
所述设备和方法允许在基底的表面处以高吞吐量发生(光)化学反应。这是因为试剂液沿着所述表面的循环确保了由裂解光的辐照所产生的热被带走。因此，能够应用高强度的裂解光，而不会损伤在所述表面处的材料，这实现了更高的反应速率。
在下文中，将更为详细地描述不同的优选实施例，所述优选实施例能够结合所述设备以及所述方法两者来实现(即使仅仅针对所述设备和所述方法中的一个进行了解释)。对实施例的不同组合可以引起协同效应，尽管可能没有详细地对其进行描述。
优选进行对反应室中的试剂液的循环，使得(过多的)热被从所述第一表面移除。这例如可以在紧接在所述第一表面处和/或靠近所述第一表面的体积中的试剂液由于循环而被交换(移除)的情况下实现。具体而言，所述循环的至少部分可以被取向为沿着所述基底的第一表面。然而，循环的其他样式也是可能的，例如，利用垂直于所述第一表面和/或远离所述第一表面的液体流。
能够以被动的方式，例如通过重力、对流和/或毛细力，来实现试剂液的循环。在优选实施例中，所述试剂液是被主动泵送的。这尤其能够通过提供具有泵送元件的循环装置来实现。因此，由用户和/或由自动控制器能够控制和调节所述试剂循环的定时和/或强度。泵送例如可以基于感测的(例如，试剂液的)温度以反馈回路进行控制，使得在所述反应表面处的温度始终保持低于给定阈值。
在另一实施例中，所述试剂液可以被冷却。所述循环装置例如可以包括用于该目的的冷却元件。冷却例如可以通过沿着热交换表面引导所述试剂液来实现，通过所述热交换表面，过多的热能够被传递给冷却剂(例如，环境大气)。另外或者备选地，也可以提供用于对试剂液进行主动冷却的器件，例如珀耳帖元件。
所述循环装置优选可以包括至少一个气动驱动的致动器，例如气动驱动的泵。这允许将所述设备与气动操作的(微)流体设备容易地集成。
在另一实施例中，所述试剂液的循环可以与对试剂液的辐照同步。在该上下文中，术语“同步”应当指代对一方面进行循环以及另一方面进行辐照的协同定时。在具体情况中，循环可以与裂解光的辐照同时发生(任选，具有一些时间偏移和/或时间滞后)。
已经提到了，试剂液的循环防止在基底的表面处的体积的过热。因此，能够应用相比较而言高强度的裂解光。在优选实施例中，裂解光的强度大于大约0.1mW/cm2，大于大约0.5mW/cm2，大于大约1mW/cm2，或者大于大约5mW/cm2。
在下文中，将解释本发明的另外的实施例，针对所述实施例，可以在WO 2013/105025Al中找到额外的信息。
在本发明的上下文中，术语“阻断基团”应当被理解为这样的基团：在所述阻断基团被并入到分子并且酶在所述分子处执行合成过程的情况下，所述基团阻断酶的合成活性。阻断基团例如可以是阻断分子。
在本发明的上下文中，术语“可裂解”应当被理解为允许通过吸收波长λCL的裂解光来裂解开。
在本发明的上下文中，应当理解，本文公开的光学装置的每个实施例可以被配置为发射偏振的激励光和偏振的裂解光。因此，可以使用偏振器或者已经偏振的光源。稍后将描述细节。
此外，在本发明的上下文中，术语“激励光”分别应用于波长λΕx1、λΕx2、λΕx3和λΕx4。
根据本发明的示范性实施例，提出了用于对核酸序列进行光学控制的以上定义的种类的设备。具体而言，所述设备被配置为对迭代逐步反应进行光学控制，以通过合成法来确定核酸的序列。备选地，替换通过合成法的序列测定，通过绑扎(ligation)的合成也应当被理解为落在本发明的范围内。所提出的设备包括基底，其用于将至少一个分子结合在所述基底的第一表面上。所述设备还包括光学装置，其被配置为将至少第一激励波长λΕx1的激励光引导至所述基底，以激励第一核苷酸的荧光标记，所述第一核苷酸被并入到被结合在所述基底的第一表面上的分子中。所述光学装置该被配置为接收并检测由被并入到所结合的分子中第一核苷酸的荧光标记所发射的荧光。此外，所述光学装置被配置为将裂解波长λCL的裂解光，优选为UV光，引导至所述基底，以光学诱发在第一并入的核苷酸处的光化学裂解反应，从而使阻断基团和所述荧光标记从所述第一并入的核苷酸裂解开。此外，所述基底被配置为限制所述激励光并且因此被配置为提供在所述基底的第一表面处的激励光的倏逝波。此外，所述基底被配置为限制所述裂解光，优选为UV光，并且还被配置为通过在所述基底的第一表面处的裂解光的倏逝波。所述设备允许基于集成的容易的读出，但不再需要清洗步骤或者降低数量的清洗步骤，这意味着针对所有的读数进行单次试剂填充。
通过使用具有光学可裂解的阻断基团的核苷酸来实现逐步序列测定。在读出之后，通过相同纳米-光子学基底由裂解光(例如UV辐射)来解除对内嵌的核苷酸的阻断。这确保了，仅被结合的核苷酸将被解除阻断。
正如将在下文详细解释的，所述光学装置也可以被配置为将第一和第二和第三和第四激励波长λΕx1、λΕx2、λΕx3和λΕx4的激励光引导至所述基底，以激励第一核苷酸的荧光标记，所述第一核苷酸被并入到被结合在所述基底的第一表面上的分子中。因此，其能够确保，当各自的核苷酸使用特异性的并且区别的荧光标记时，例如四种不同的核苷酸，例如，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)和胞核嘧啶(C)能够被区分。然而，如果希望的话，以上描述的四个激励波长λΕx1、λΕx2、λΕx3和λΕx4中的仅两个或三个可以由所述设备引导至所述基底以激励所述分子，即：激励被并入在所结合的分子中的核苷酸的荧光标记。关于四个色系的细节，其中，使用针对以上描述的核苷酸A、G、C和T或U的四种不同的荧光标记，将在下文相对于如下图1和图2更为详细地进行解释。所结合的分子可能是核酸片段，并且能够被理解为这样的核酸，即：所述核酸的核苷酸的序列是由本发明确定的，并且其能够是DNA片段、DNA、RNA、mRNA或任意其他核酸。
此外，序列测定或DNA序列测定领域中的普通技术人员认识到这样的事实，即：结合被用于例如核苷酸A、G、C和T或U的四种荧光标记来选取波长λΕx1、λΕx2、λΕx3和λΕx4。换言之，所述波长被选取为使得所使用的荧光标记能够通过各自的激励光来光学地激励。此外，所述波长λCL被选取为使得所使用的核苷酸的期望的裂解反应能够通过辐照所述裂解光来光学地引起。
应当注意到，被结合在基底的第一表面处的分子例如可以是DNA片段、DNA、RNA、mRNA或另一核酸。此外，本文稍后将描述的酶也可以被结合到所述基底的第一表面。在本发明的上下文中，术语“结合”应当被理解为这样的状态，在所述状态中，所述元件被固定到所述基底的所述第一表面。
另外，所述基底提供斑点，所述斑点可以利用相同分子的克隆体来覆盖，以便增加光学信号，所述光学信号通过检测所述荧光来接收。因此，基底可以被提供作为具有各自的不同的克隆体的这样的斑点的阵列，使得序列测定的吞吐量增加。
裂解光的倏逝波和激励光的倏逝波能够通过提供丝网由所提出的设备的基底来生成。这可以允许使用高强度的聚焦射束，使得在非常靠近表面的非常有限的区域中以高速率发生光子-光学反应。所述光学装置可以在单个光学装置单元中包括用于对荧光的激励和检测(即，读出)的各自的光学元件以及用于解除阻断(即，激活)的各自的光学元件，或者也可以被包括在物理上被区分的元件中。
此外，所述光学装置可以包括各自的激励光源。此外，所述光学装置可以包括用于发射裂解光的光源。用于进行裂解的辐照，即，解除阻断和读出，即，对荧光的激励和检测，能够任选地通过相同的透镜来实现。然而，如果希望的话，也能够提出用于解除阻断和读出的两种不同的光学装置。
此外，所述基底可以由如下材料制成：聚合物，例如，聚(环)苯乙烯、聚碳酸酯、聚酯或PMMA。也可以使用金属和半导体。
根据本发明的另一示范性实施例，所述设备还包括被结合到所述基底的第一表面的分子。所述设备还包括具有多个核苷酸和酶的溶液(“试剂液”)。在本文中，所述核苷酸分别包括阻断基团。所述阻断基团被配置为，当各自的基团被并入到被结合至所述设备的第一表面的分子中时，阻断酶的合成活性。
如果希望的话，所述阻断基团包括荧光标记。然而，所述阻断基团和所述荧光标记被并入或定位在所述第一核苷酸的不同位置处。它们可以在一个单个裂解过程中或者在不同的裂解过程中被裂解开。这适用于本发明的每个实施例。
作为示范性实施例，所述阻断基团可以被实现为如所描述的3'-阻断的可逆终止子或者3'-解除阻断的可逆终止子，并且在Michael L.Metzker在Nature Review Genetics11(2010)31-46上的“Sequencing technologies,the next generation”一文中被定义。在本文中，也被称为“解除阻断的”，所述阻断基团3'-解除阻断的可逆终止子能够被用作阻断酶的活性。可逆终止子可以被理解为被附着到核苷酸/核糖单元的配体，其在并入之后停止任何随后的核苷酸的并入。当通过化学或光化学手段裂解后，它们是可逆的，该过程能够解除，并且聚合酶能够被构建在下一核苷酸中。此外，Metzker等人的3'-阻断的可逆终止子能够例如被化学地修改，以使得它们是可光裂解的。之后，利用裂解光的光裂解能够借助本发明来执行。另外，其他复合物可以被用作与各自的酶相结合的阻断基团，正如将在稍后描述的。本领域技术人员获知酶和阻断基团的何种组合导致阻断酶的合成活性的希望的效果。
根据另一示范性实施例，所述基底被配置为针对激励光以及针对裂解光的丝网。
所述丝网可以包括例如在玻璃基底上的金属丝的图案。在所述丝之间的间隙充当金属复合板波导，其中，主要贡献涉及两种基本模式。例如，对于入射在本发明的基底的丝上的TE偏振的激励光，在所述丝之间的所得到的模式是倏逝模式，其针对λ＝630纳米具有16.8纳米的示范性衰减长度。在本文中，假设基底的丝被填充具有水的折射率(n＝1.33)的介质。对于TM偏振的光，针对丝网的所得到的模式被称为传播模式，其在该范例中具有1.2μm的衰减长度。例如，丝高度在范例中可以是60纳米。在本文中，TM偏振模式以大约10％或更少的光损失透射，而TE偏振模式是倏逝地衰减。
理解丝网的不同的方式是想到例如作为金属的铝丝，其反射具有平行于所述丝的偏振(TE偏振)的激励光，并且其透射正交于所述丝的偏振(TM偏振)。TM偏振的光的最大透射率可以高于95％。在WO 2013/105025 Al的图3a和3b两者中都描绘了在入射TE激励光的情况下的倏逝场。由本发明的所述光学装置辐照的所述激励光和所述裂解光在本发明的这一实施例和每个其他实施例中可以具有这样的偏振。
本发明的丝网基底的使用提供了极端的光学限制。结合快速光化学裂解，其被用于对核苷酸上的用于防止继续并入下一核苷酸的所谓的阻断基团进行解耦，实现了所指出的优点。丝网的使用具有的额外优点在于，更大程度地独立于入射的角度。因此，其能够与聚焦射束结合使用，以实现局部的高强度，同时保持其余部分的昏暗。换言之，所述丝网允许激励分子并且仅对那些分子敏感，例如DNA片段，其非常接近倏逝场中的表面，并且因此不会引起对倏逝场之外的任何标记核苷酸的检测或影响。例如，所述倏逝场可以从所述基底的第一表面延伸大约20纳米。针对激励光和裂解光两者都是这样的情况。
丝网基底包括与所述第一表面相对的第二表面，并且所述光学装置被配置为利用激励光和裂解光来辐照所述基底的所述第二表面。换言之，所述光学装置中的所述基底被相对于彼此定位，使得所述裂解光和所述激励光被直接引导至所述基底的第二表面。这可以被视为对所述基底的背向辐射。在前表面上，所述第一表面上，由所述丝网来提供规则的丝结构。在规则的金属丝之间，即，在所述丝网之间的空间中，分子，例如DNA片段，被结合或固定。
在本发明的上下文中，术语“激励光”分别应用于波长λΕx1、λΕx2、λΕx3和λΕx4。因此，针对所有四个激励波长，所述基底确保了生成对各自的光的倏逝波的限制和创建。如果希望的话，能够使用更多或更少的光源和/或荧光标记而不脱离本发明。
根据本发明的另一示范性实施例，所述裂解反应花费时间t裂解，其取决于所辐照的裂解光的强度。此外，第二核苷酸到所结合的分子中的并入花费时间t并入。本文所提出的设备包括光学装置，所述光学装置被配置和调整为提供具有使得t裂解<t并入的强度的辐照裂解光。
光裂解应当仅在已经被并入和结合到所述表面的那些分子中发生。在体块中的反应将导致解除阻断的试剂，其可以在不被注意的情况下被构建，并且通过这种方式，在序列测定结果中引入误差。因此，有价值的是，仅局部地辐照短的时段以使得与通过所述酶对核苷酸的并入的速率相比快速的裂解反应。酶和阻断基团的工作原理已经在上文中进行了描述。所述公开应用在本文中被应用在所描述的示范性实施例中。所提出的实施例允许使下一核苷酸的并入同步，并且确保了所检测到的荧光信号是高度可靠的。
裂解光处在相对于基底的倏逝模式中的事实提供了这样的优点，即：重复的曝光不会导致溶液中的荧光标记被漂白并且损失其功能。换言之，所提出的实施例避免了对溶液中的荧光标记的这样的漂白和功能损失。
针对在若干结合的分子处的若干核苷酸的并入的改善的同步，利用裂解光的解除阻断的步骤应当尽快地执行，即，尽可能利用最高的裂解光强度。这可以通过利用透镜对所述裂解光，优选为UV光，进行聚焦来实现，并且通过移动透镜或者基底来扫描所述表面。所述解除阻断的步骤可以在读取序列测定的步骤之后实现。该读取能够通过扫描聚焦射束来实现，或者利用现场辐照的步骤和扫描来实现。可能也能够将裂解光实现为针对总表面的例如UV光的单闪烁。鉴于用于序列测定反应的基础并入的反应速率，局部裂解光辐照时间应当例如低于1分钟。
附图说明
将在如下附图中描述本发明的示范性实施例。
图1示意性示出了根据本发明的示范性实施例的第一设备。
图2示意性示出了根据本发明的示范性实施例的第二设备。
具体实施方式
图1描绘了设备100，所述设备用于对化学反应进行光学控制，在这种情况中，尤其对迭代逐步反应进行光学控制，以通过合成法来确定核酸的序列。所述设备包括基底101，其用于在所述基底的第一表面103上结合至少一个分子102。在基底101的第一或前表面103上结合的分子102例如可以是DNA的片段。第一基底103构成“反应室”149的壁或边界，在“反应室”149中能够容纳要处理的液体(这里是将在下文详细描述的溶液114)。反应室通常是较大(微型)流体设备或试剂盒(其未被详细示出)的部分。
此外，在图1中示出了光学装置104。图1示意性示出了，所述光学装置被配置为将例如第一激励波长λΕx1的激励光110引导至所述基底。此外，用参考符号109、116、117和118示意性示出并描绘了四个不同的核苷酸。例如，第一核苷酸109被示出为胸腺嘧啶T。核苷酸109包括阻断基团119。此外，阻断基团119包括第一荧光标记105。以类似地方式，在图1中示意性描绘了第二核苷酸116，从图1可以了解到，也包括阻断基团119和第二荧光标记106。第三核苷酸117也包括阻断基团和第三荧光标记107。另外，示意性描绘了第四核苷酸118，其也包括阻断基团和第四荧光标记108。然而，样本114可以包括更大量的多个这种核苷酸，并且在此示出的核苷酸109、116、117和118仅作为象征性的描绘。
此外，图1示出了溶液114，溶液114填充反应室149，并且在溶液114中包括了核苷酸和酶115。在所示出的四个核苷酸中的一个被并入在所结合的分子102中时，所提出的设备100提供如下优点。所述光学装置被配置为接收并检测由并入到所结合的分子102中的第一核苷酸的荧光标记所发射的荧光。
如能够从图1中进一步了解到地，所述光学装置被配置为将裂解波长λCL的裂解光112引导至所述基底。这允许在第一并入的核苷酸处光学地诱发光化学裂解反应，以将各自的荧光标记从所述第一被并入的第一核苷酸裂解开。此外，基底101被配置为限制激励光，使得创建在基底的第一表面处的激励光的倏逝波。此外，所述基底被配置为也限制裂解光，使得创建在基底的第一表面处的裂解光的倏逝波。
在图1的实施例中，基底101被配置为针对激励光110和针对裂解光112的丝网113。因此，丝网113包括规则图案，例如规则的金属丝结构。如能够从图1中了解到地，在规则图案之间提供了裂隙状的开口，在这些开口中，所结合的分子102被固定在基底101的第一表面103处。
此外，图1描绘了处理单元120，处理单元120包括计算机可读介质121，在计算机可读介质121上存储有计算机程序单元122。所述程序单元122适于指令处理单元120以进一步指令设备100来执行上文和下文描述的用于对迭代逐步反应进行光学控制以通过合成法来确定核酸的序列的方法。图1的设备100被配置为以序列逐步地并且光学地诱发对核苷酸109、116、117和119的并入，所述序列对应于所结合的分子102的核苷酸的序列。在分子102是DNA片段的情况下，由样本114包括的核苷酸以一序列被并入到分子102中，所述序列对应于分子102的核苷酸序列。
所述设备还被配置为，基于所接收并检测的由各自的并入的核苷酸的荧光标记所发射的响应荧光，来确定被并入的核苷酸的序列。因此，在图1中所介绍的设备100首先确保仅由激励光100来读出核苷酸，所述核苷酸通过使用激励光的倏逝波而被并入到所结合的分子102中。其次，图1的设备100确保仅结合的核苷酸被裂解光解除阻断，这避免尚未包含(也即，未被分子102并入的)核苷酸的功能的淡化和损失。因此，所检测的荧光信号100可以被视为光111，其对于核酸的序列的确定是高度可靠的。
因此，核酸序列测定的成本和速度(例如利用图1的设备100执行的DNA序列测定)两者都得到改进。由于不需要清洗的步骤，因而需要较少的试剂和酶。图1的设备示出了序列测定的简化和成本降低。图1所介绍的设备100通过允许在无需清洗步骤的情况下基于集成的容易的读出(这意味着针对所有读数的单试剂填充)来允许新的处理组合。在示例性核苷酸109、116、117、118内使用的阻断基团例如可以是可光裂解的3’-解除阻断的可逆终止子。然而，使用例如空间位阻的其他阻断基团也可以被用于达到期望的且在上文描述的效果。
此外，如在图1中所示的光学装置104可以被配置为以一强度提供辐照的裂解光，使得裂解反应时间t裂解小于将第二核苷酸并入到分子102中所花费的时间。由于裂解反应时间t裂解取决于所辐照的裂解光的强度，图1可以提供核苷酸与特定的阻断基团的选定组合以及光学装置的关于裂解光的强度的配置。换言之，图1的设备的裂解光的强度使得适于核苷酸和阻断基团的所使用组合，裂解反应时间t裂解小于t并入。
如果希望的话，另外或者备选地，设备100的如下设置可以被提供给用户。如果试剂液是静态的并且分子的运动受扩散驱动，那么该驻留可以被视为未被并入的核苷酸的裂解光的斑点中的平均驻留时间。光学装置还可以被配置为以一强度提供辐照的裂解光，使得t裂解小于t驻留。因此，没有发生由于不期望的裂解反应造成的自由且未结合的核苷酸的劣化。因此，通过配置所述设备使得t裂解小于t驻留的，通过裂解影响未被并入的核苷酸的概率得以下降或消除。换言之，为避免大量的裂解反应，丝网的倏逝场中的分子的平均驻留时间应当小于或远小于对于以有关强度的裂解所需的反应时间。在倏逝场的深度为大约25nm或更小且核苷酸的扩散系数为大约1e-10m2/s的情况下，分子扩散进入和离开倏逝场所花费的时间可以被估计为：(5e-8m)2/1e-10＝25μs。取决于为对所结合的分子接触阻断所需的照射时间，能够导出损伤的概率。假设照射时间为0.1s，这将是1:4000，假设照射时间为10ms，其将是1:400等。
同样地，总损伤与倏逝场在试剂溶液的总容积上的容积率成比例。在室高度为100μm的情况下，比率为1:4000。这意味着，在损伤倏逝场中的所有分子的最坏情况中，将损伤仅0.025％的分子。在读取长度为100的情况下，这最终将损伤溶液中有2.5％的分子(最坏情况)，这从序列测定的角度仍是可接受的。
以上考虑对于反应室149中的静态液体是有效的。然而，如果试剂液在反应室中是循环的(如下文详细解释的)，那么分子的移动是受主动泵送而不是受扩散支配的。为了通过流体循环实现冷却，期望在裂解光的两个脉冲的起始之间的每个间隔，在例如在10和100次之间，重复地改变激励容积中的流体。在这些情形中，必须考虑在想要实现的冷却效应与不裂解过多未结合的核苷酸之间的平衡(当被并入到DNA中的裂解的未结合的核苷酸因为其不再具有用于标识基团的荧光团而不能够被检测时)。具体而言，激励容积中的液体的驻留时间应当小于UV裂解时间，因为否则(在UV裂解期间)无法实现额外的冷却。
如果假定由裂解光激励的容积是具有大约100nm直径和大约25nm高度的圆柱，则产生大约2×10∧(-8)μl或0.02pl的非常小的体积(相比于典型的大约1-5ml的溶液的总体积而言)。因此，必须考虑被标记的核苷酸的浓度和刷新率，其可以变成在更换容积的大约2至10次之间，可能在大约2至5次之间。因此，在实践中，对于总共10ml溶液上的5x更换，在利用UV阻断光辐射的容积与每个斑点的总容积之间有10+11的倍数。
在下文，提供了用于使用图1(以及图2)的设备的信息。为了改善的同步，解除阻断的步骤应当尽可能快地实施，即，尽可能利用最高的强度。这可以通过利用透镜聚焦UV光并且通过移动透镜或基底扫描表面来实现。解除阻断的步骤在读取序列测定的步骤之后实施。这种读取能够通过扫描聚焦的光束或者通过用现场照射的步进扫描来实施。在优选实施例中，读取扫描能够通过将这两种光束集成在单个致动器中(甚至可能通过对齐光束在单个透镜中)来耦合到解除阻断的扫描。备选地，两个透镜能够被集成在单个阶段中或者集成在能够同步操作的两个分开的阶段中。这还能够以步进扫描读取方式来实施，其中，通过照射与读取器相同的场，UV步也以步进扫描模式来实施。优选实施例将取决于可用的UV光源及其功率。如果有足够的功率可用和/或序列测定表面的区域有限，那么也能够预期针对总表面的单个UV闪光。根据针对序列测定反应的用于基团并入的反应速率，局部UV照射时间应当远低于1分钟。
在上文已描述了使用丝网的单流体序列测定以及单分子序列测定。这些方法可以使用所谓的3’-解除阻断的可逆终止子，其中，需要UV光的闪光以解除对核苷酸的阻断，使得附有荧光团的下一被标记的核苷酸能够由多聚酶并入。读出被并入的核苷酸的颜色允许确定被并入的基团并且由此允许进行序列测定。
在所描述的流程中，需要高强度UV光。典型的强度值范围为大约4mW/cm2到大约1W/cm2。这对应于可观的能量，该可观的能量可以引起在丝网和包含试剂的缓冲剂中的加热。
为了改善系统性能并避免丝网/局部液体乃至试剂盒的过热，提出了通过泵送试剂液(例如通过使用对气动工作的试剂盒设计的对液体的气动驱动的泵送)来使试剂液(这里是缓冲剂以及所需的酶/核苷酸)循环。这将产生冷却效果并帮助避免局部过热。
上文涉及的建议是由“循环装置”150在图1的设备100中实现的，其被示意性地指示为连接反应室149的相对端的通道151。在图示的实施例中，通道151包括泵送元件152，通过所述泵送元件152，通道151中的液体能够被主动且可控地泵送(按照箭头示出的方向)。这诱发在反应室149中的强制循环，其中试剂液的流沿表面103。因而，分子102常常被其需要的化学物质包围，同时过多的热量特别是由裂解光产生的热量被从表面带离以避免过热。
在试剂液通过试剂盒的其他部件循环期间，通过该试剂液，前述的过多的热将通常被释放到环境。为了辅助该过程，提供了冷却元件153用作散热器。这例如可以是与环境有紧密热接触的面积或区域，以允许通过环境大气的冷却效应。另外或备选地，冷却元件153可以包括诸如珀尔帖元件的一些主动冷却单元。
在优选实施例中，由循环装置150使试剂液的(主动地、受控的)循环可以与在表面103处的热量的生成同步，特别是与裂解光112的辐照同步。主动的循环可以例如被限制到UV解除阻断脉冲的间隔。
因此，提供了序列测定系统，在所述序列测定系统中，序列测定是使用丝网结合使包含试剂的缓冲剂循环来进行的，以避免在使用UV解除阻断的同时使系统过热。
图2示出了设备100，其被配置为对迭代逐步反应进行光学控制，以通过合成法来确定核酸的序列。类似于图1，示出了丝网基底113，在丝网基底113上固定有(即，结合有)多个分子102。如从图2能够看到的，常规图案214提供了裂隙状的开口215，在这些开口中，分子202结合在第一表面103上。所述基底包括若干相邻的结合位置209、210、211和212，其用于将分子沿第一方向213结合到所述第一表面。所述结合位置可以被视为能够被相同分子的克隆体覆盖的斑点，使得能够增加所生成的光学信号。基底101之后利用各自不同的克隆体提供这样的斑点(即，这样的结合位置)的阵列。这可以增强吞吐量。图1和图2的设备100都允许仅使用一种液体的核酸序列测定，由此避免提供清洗步骤(在该清洗步骤中溶液液体是变化的)的需要。
此外，光学装置104包括五个不同的光源201至205。光源201至204可以被视为激励光源，以便提供如先前所描述的四个不同的激励波长λΕx1至λΕx4。光源205提供具有波长λCL的裂解光。例如，光源205可以发射UV光。附图标记206象征性地描绘了切换设备，其允许光学装置104在五个波长λΕx1至λΕx4以及λCL之间切换。此外，由所述光源201至205中的至少一个所发射的光被引导至偏振滤波器200。此外，示出了双色镜207，其朝向基底101发送光源201至205的发射光。在荧光标记已由激励光的倏逝波(波长λΕx1至λΕx4中的至少一个)激励后，由一个或多个荧光标记所发射的荧光光子被引导至双色镜207并且被引导至荧光检测器208。如从图2能够看到的，可以沿方向213来扫描光学装置104。因此，图2的设备100被配置为通过沿第一方向213相对于彼此移动基底101和光学装置104来执行光学扫描。因此，所述设备允许执行光学扫描，使得在沿第一方向213移动中，每个结合位置首先被激励光辐照并随后再被具有裂解波长的裂解光辐照。使用裂解光的解除阻断的步骤从而能够在读取经激励的被并入的核苷酸的荧光后实施。
图2还指示以上参照图1描述的循环装置150，其允许试剂液通过反应室149并沿具有分子102、209、210、211、212的反应表面的受控循环。应当注意地是，试剂液的流通常可以具有相对于丝网113的朝向。其例如可以是如所示出的平行于方向213，或者是垂直的，或者具有在此情形中手头便利的任何其他朝向。
进一步的细节和其他示例性设备和方法可以在WO 2013/105025 Al中找到，WO2013/105025 Al通过引用方式被整体地并入本文。
虽然已在附图和前述说明书中图示并详细描述了本发明，但这种图示和描述将被视为图示性的或者示例性的而非限制性的；本发明不限于所公开的实施例。对于所公开的实施例的其他变体，本领域技术人员在实行所要求保护的发明时可以理解并实现。在权利要求书中，词语“包括”不排除其他元件或步骤，非定冠词“一”或“一个”不排除多个。单个处理器或其他单元可以执行在权利要求书中记载的若干项目的功能。特定手段记载在相互不同的从属权利要求中这一事实本身并不指示这些手段的组合无法被用以获益。计算机程序虽然可以存储/分布在诸如与其他硬件一起或作为其他硬件的部分来提供的光学存储介质或者固态介质之类的适当介质上，但也可以以其他形式(诸如经由互联网或者其他有线或无线电信系统)分布。在权利要求书中的参考符号不应当被解释为限制保护范围。

Claims (15)

1.一种用于对包括试剂液(114)的反应室(149)中的化学反应进行光学控制的设备(100)，所述设备包括：
-基底(101)，其用于将至少一个分子(102)结合在所述基底的第一表面(103)上，其中，所述第一表面是所述反应室(149)的壁；
-光学装置(104)，其被配置为将裂解光(112)引导至所述基底以光学诱发光化学裂解反应；
-循环装置(150)，其用于使所述试剂液在所述反应室(149)中循环以将由所述裂解光产生的热从所述第一表面移除，其中，所述基底(101)被配置为丝网，并且其中，所述循环装置(150)包括连接所述反应室(149)的相对端面的通道(151)。
2.根据权利要求1所述的设备(100)，
其中，所述试剂液沿着所述基底(101)的所述第一表面(103)循环。
3.根据权利要求1所述的设备(100)，
其中，所述循环装置(150)包括用于主动泵送试剂液的泵送元件(152)和/或用于冷却试剂液的冷却元件(153)。
4.根据权利要求1所述的设备(100)，
其中，所述循环装置(150)包括至少一个气动驱动的致动器(152)。
5.根据权利要求1所述的设备(100)，
其中，所述循环装置(150)适于使所述试剂液的所述循环与裂解光(112)的辐照同步。
6.根据权利要求1所述的设备(100)，
其中，所述化学反应包括核酸序列测定，尤其是迭代逐步反应，以通过合成法来确定核酸的序列。
7.根据权利要求1所述的设备(100)，
其中，所述光学装置被配置为将至少第一激励波长λΕx1的激励光(110)引导至所述基底，以激励第一核苷酸(109、116、117、118)的荧光标记(105、106、107、108)，所述第一核苷酸被并入到结合在所述基底的所述第一表面(103)上的所述分子(102)中，
其中，所述光学装置还被配置为接收并检测由被并入到所结合的分子(102)中的所述第一核苷酸的所述荧光标记所发射的荧光(111)。
8.根据权利要求7所述的设备(100)，
其中，所述裂解光(112)，优选为UV光，具有裂解波长λCL，以光学诱发在第一并入的核苷酸处的光化学裂解反应，从而使阻断基团和所述荧光标记从所述第一并入的核苷酸裂解开。
9.根据权利要求1或7所述的设备(100)，
其中，所述基底(101)被配置为限制所述激励光(110)并且被配置为提供在所述基底的所述第一表面(103)处的所述激励光的倏逝波，和/或
其中，所述基底被配置为限制所述裂解光(112)并且被配置为提供在所述基底的所述第一表面处的裂解光的倏逝波。
10.根据权利要求8所述的设备(10)，所述设备还包括：
-所述分子(102)，其被结合到所述基底(101)的所述第一表面(103)，
-溶液(114)，其具有多个核苷酸(109、116、117、118)和酶(115)，
其中，所述核苷酸各自包括所述阻断基团(119)，
其中，所述阻断基团被配置为，当各自的核苷酸(109、116、117、118)被并入到结合至所述第一表面的所述分子(102)中时，阻断所述酶(115)的合成活性。
11.一种用于对包括试剂液(114)的反应室(149)中的化学反应进行光学控制的方法，所述方法包括如下步骤：
-提供基底(101)，其中，分子(102)被结合在所述基底的第一表面(103)上，其中，所述第一表面是所述反应室(149)的壁，
-由光学装置利用裂解波长λCL的裂解光(112)，优选利用UV光，来辐照所述基底，并且从而光学诱发光化学裂解反应，
-通过包括连接所述反应室(149)的相对端面的通道(151)的循环装置(150)使所述试剂液在所述反应室(149)中循环以将由所述裂解光产生的热从所述第一表面移除。
12.根据权利要求11所述的方法，还包括：使所述反应室(149)中的所述试剂液沿着所述基底(101)的所述第一表面(103)循环，和/或对所述试剂液的主动泵送，和/或对所述试剂液的冷却。
13.根据权利要求11所述的方法，
其中，使所述试剂液的所述循环与裂解光(112)的辐照同步。
14.根据权利要求11所述的方法，其中，所述裂解光(112)的强度大于大约0.1mW/cm2。
15.根据权利要求11所述的方法，还包括如下步骤：
-由光学装置利用至少第一激励波长λΕx1的激励光(110)来辐照所述基底(101)，并且从而光学激励被并入在所述基底上的所结合的分子中的第一核苷酸的荧光标记，
-由所述基底限制所述激励光，从而由所述基底在所述基底的所述第一表面处提供所述激励光的倏逝波，
-由所述光学装置来接收并检测第一被并入的核苷酸的经激励的荧光标记的荧光，
-利用所述裂解光来辐照所述基底并且从而光学诱发在所述第一并入的核苷酸处的光化学裂解反应，并且
-由所述基底限制裂解波长λCL的所述裂解光，从而由所述基底在所述基底的所述第一表面处提供所述裂解光的倏逝波。
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