CN101831384A - 生物芯片反应装置及利用该装置检测靶分子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物芯片反应装置及利用该装置检测靶分子的方法，该反应装置包括反应室、循环管道、循环泵和温度控制装置，反应室的入口和出口分别与循环管道连通构成循环回路，反应室中设置有用于固定生物芯片的芯片固定架；循环管道上设置有循环泵，通过循环泵控制液体在循环回路中不断循环；循环管道上还设置有进液口和出液口，进液口和出液口分别设置有开关阀；温度控制装置设置在反应室或/和循环管道内，通过温度控制装置控制循环回路的温度；本发明装置可以实现循环进样反应，直至待检样本溶液中的靶分子与芯片表面的识别分子充分结合，从而大大提高检测灵敏度，能够满足靶分子极低浓度检测的要求；利用该装置检测靶分子的方法操作简便，成本低。

Description

生物芯片反应装置及利用该装置检测靶分子的方法

技术领域

本发明涉及一种生物芯片反应装置，还涉及利用该装置检测靶分子的方法。

背景技术

生物芯片是根据分子间特异性地相互作用的原理，将能识别特定序列的核酸探针、适配子或特异性抗体等有序固定在固相支持物的表面形成阵列，从而实现对特定核酸、蛋白质的准确、快速、高通量检测。在实际应用中，常会遇到靶分子浓度极低的情况，而目前由于检测灵敏度所限，尚难以普通探针对极少量的靶分子进行检测，通常需要对靶分子或检测信号进行适当的放大。在核酸检测方面，多采用PCR方法在检测前对靶分子进行扩增以提高靶分子的浓度，使其达到检测灵敏度；但在蛋白质检测方面，因其结构相对比较复杂，有时不便于对靶分子进行扩增，这就向检测灵敏度提出了更高的要求。生物芯片反应装置主要是在检测前用于待检样本和生物芯片的反应，通常采用微流泵系统，因其为单次进样反应，待检样本溶液与生物芯片的反应时间短，当靶分子浓度极低时，常不能与芯片表面的识别分子完全结合，从而导致无法检测或检测误差较大、检测结果不可靠等问题。因此，必须对现有生物芯片反应装置进行改进，提高检测灵敏度，以实现靶分子的极低浓度检测。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种生物芯片反应装置，目的之二在于提供一种利用该装置检测靶分子的方法，可以实现循环进样反应，直至待检样本溶液中的靶分子与芯片表面的识别分子充分结合，从而大大提高检测灵敏度，能够满足靶分子极低浓度检测的要求。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、包括反应室、循环管道、循环泵和温度控制装置，所述反应室的入口和出口分别与循环管道连通构成循环回路，所述反应室中设置有用于固定生物芯片的芯片固定架；所述循环管道上设置有循环泵，通过循环泵控制液体在循环回路中不断循环；所述循环管道上还设置有进液口和出液口，所述进液口和出液口分别设置有开关阀；所述温度控制装置设置在反应室或/和循环管道内，通过温度控制装置控制循环回路的温度。

进一步，所述循环管道与反应室入口相连的一段沿液体流向设置缩口结构，收缩角为20～45度；所述循环管道与反应室出口相连的一段沿液体流向相反方向设置扩口结构，扩张角为20～45度；

进一步，所述芯片固定架设置在反应室底面，用其固定生物芯片后，所述生物芯片的反应面迎向反应室进液方向并与反应室底面成20～60度角倾斜，同时生物芯片的底边与反应室底面的横向水平线之间成20～60度水平夹角；

进一步，所述芯片固定架至少为两个，沿反应室底面纵向并列设置。

2、利用所述生物芯片反应装置检测靶分子的方法，包括以下步骤：

a、将表面固定有识别分子的生物芯片放入芯片固定架中，开启温度控制装置预热至设定温度；

b、从进液口加入待检样本溶液，开启循环泵，使待检样本溶液在循环回路中不断循环，生物芯片表面固定的识别分子识别待检样本溶液中的靶分子并与其发生特异性结合，待充分反应后，从出液口去除待检样本溶液；

c、从进液口加入清洗液，开启循环泵，清洗循环回路，清洗完成后，从出液口去除清洗液；

d、从进液口加入荧光报告分子溶液，开启循环泵，使荧光报告分子溶液在循环回路中不断循环并与生物芯片表面的识别分子-靶分子复合物充分反应，反应完成后，从出液口去除荧光报告分子溶液；

e、从进液口加入清洗液，开启循环泵，清洗循环回路，清洗完成后，从出液口去除清洗液；

f、对生物芯片进行荧光检测，根据荧光报告分子的荧光发射波长和荧光发射光谱对靶分子进行定量检测。

本发明的有益效果在于：本发明的生物芯片反应装置可以实现循环进样反应，待检样本溶液在循环回路中反复循环并与生物芯片表面固定的识别分子多次反应，即使靶分子浓度极低，通过重复多次反应，最终都能够反应完全，从而大大提高检测灵敏度，能够满足靶分子极低浓度检测的要求。利用本发明的生物芯片反应装置检测靶分子的方法，操作简便，成本低。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为本发明生物芯片反应装置的结构示意图；

图2为生物芯片设置示意图；

图3为利用本发明生物芯片反应装置检测四种细菌特异性基因混合样本的标准曲线；

图4为利用本发明生物芯片反应装置检测四种细菌特异性基因混合样本的测得量与加入量的对比结果。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、生物芯片反应装置

图1为本发明生物芯片反应装置的结构示意图，如图所示，生物芯片反应装置包括反应室1、循环管道2、循环泵3和温度控制装置8，反应室1的入口和出口分别与循环管道2连通构成循环回路，反应室1中设置有用于固定生物芯片的芯片固定架9；循环管道2上设置有循环泵3，通过循环泵3控制液体在循环回路中不断循环(图中箭头所示方向即为液体流向)；循环管道2上还设置有进液口5和出液口6，所述进液口5和出液口6分别设置有开关阀(图中为进液开关阀4和出液开关阀7)；温度控制装置8设置在反应室1或/和循环管道2内，通过温度控制装置8控制循环回路的温度。该反应装置为循环进样反应系统，待检样本溶液在循环回路中反复循环并与生物芯片表面固定的识别分子多次反应，即使靶分子浓度极低，经过重复多次反应，最终都可以与识别分子充分结合，从而大大提高检测灵敏度。在本实施例中，所述温度控制装置8为多个，分别设置在反应室1和循环管道2内，可以更好地控制循环回路的温度，使靶分子与识别分子的反应处于最佳状况中，减少错配率，同时减少因温度原因而导致的反应时间延长。

此外，循环管道2与反应室1入口相连的一段沿液体流向设置缩口结构，收缩角为20～45度，采用此种结构，可以使液体在进入反应室时获得较快的初速度；循环管道2与反应室1出口相连的一段沿液体流向相反方向设置扩口结构，扩张角为20～45度，采用此种结构，一方面可以使液体在进入循环管道时获得较快的初速度，另一方面可以产生涡流从而使液体混合均匀。

图2为生物芯片设置示意图，如图所示，本实施例的芯片固定架9设置在反应室底面，用其固定生物芯片10后，生物芯片10的反应面迎向反应室进液方向(图中箭头所示方向即为反应室进液方向)并与反应室底面成20～60度角倾斜(见图中夹角β)，同时生物芯片的底边与反应室底面的横向水平线之间成20～60度水平夹角(见图中夹角α)。采用此种结构，可以增加生物芯片与待检样本溶液的反应面积和反应时间，提高反应效率。在本实施例中，采用芯片固定架9固定生物芯片10后，夹角α和β均为45度。当然，芯片固定架9最好为角度可调节装置，从而可以任意调节生物芯片的倾斜角度。

此外，芯片固定架9至少为两个，沿反应室底面纵向并列设置；采用此种结构，可根据检测需要组合使用多张分别固定有不同识别分子的生物芯片，1次反应同时测定多种靶分子。在本实施例中，芯片固定架9为四个。

二、利用生物芯片反应装置检测靶分子

根据金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、破伤风梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌16SrDNA的保守序列设计通用引物，并分别针对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、破伤风梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌的特异性基因序列设计分别与靶序列两端互补的探针P1和P2，探针P1和P2之间不互补(通用引物和探针序列见附表)。以探针P1作为识别分子，将其固定在固相载体表面制成生物芯片。以CdTe量子点标记的探针P2作为荧光报告分子。分别以含有金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、破伤风梭状芽孢杆菌或产气荚膜梭菌全长基因的重组表达质粒为模板，以通用引物进行PCR扩增，所得PCR产物进行切胶回收纯化；将上述4种细菌纯化后的PCR产物等比例混合，作为待检样本溶液。

附表 通用引物和探针序列

利用本发明的生物芯片反应装置，采用上述生物芯片和荧光报告分子，分别对不同浓度的待检样本溶液进行检测，具体方法如下：

a、将表面分别固定有金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、破伤风梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌探针P1的4张生物芯片(每张芯片表面只固定一种探针P1)分别放入芯片固定架中，开启温度控制装置预热至温度45℃；

b、从进液口加入待检样本溶液，开启循环泵，使待检样本溶液在循环回路中不断循环，4张生物芯片表面固定的探针P1分别识别待检样本溶液中的靶序列并与其进行杂交，控温45℃反应0.5小时，从出液口去除待检样本溶液；

c、从进液口加入清洗液(即磷酸盐缓冲溶液)，开启循环泵，清洗循环回路2分钟，从出液口去除清洗液；重复此步骤3次；

d、从进液口加入4种荧光报告分子的混合溶液，开启循环泵，使荧光报告分子混合溶液在循环回路中不断循环，4种CdTe量子点标记的探针P2分别识别生物芯片表面的靶序列并与其进行杂交，控温45℃反应0.3小时，从出液口去除荧光报告分子混合溶液；

e、从进液口加入清洗液(即磷酸盐缓冲溶液)，开启循环泵，清洗循环回路2分钟，清洗完成后，从出液口去除清洗液；重复此步骤3次；

f、用全息激光分别扫描4张生物芯片，根据CdTe量子点的荧光发射波长和荧光发射光谱对4种细菌特异性基因进行定量检测。

图3为利用本发明生物芯片反应装置检测四种细菌特异性基因混合样本的标准曲线，用最小平方法求得各标准曲线的回归方程，R²均高于0.99，表明CdTe量子点的荧光强度与靶序列浓度成正比，可以据此对靶序列进行定量检测。与传统的有机荧光染料相比，量子点具有独特的理化特性和优越的荧光性能，如发射波长可调谐，激发波长范围宽，发射峰狭窄且对称，荧光强度高且不易漂白等，故利用量子点作为荧光标记物，可以进一步提高检测灵敏度。

图4为利用本发明生物芯片反应装置检测四种细菌特异性基因混合样本的测得量与加入量的对比结果，由图可知，第1次循环时，只有约60％的靶序列与探针P1进行杂交，而第2次循环时，杂交效率达到约78％；第3次循环时，杂交效率达到约87％；第4次循环时，杂交效率达到约98％，几乎完全反应；第5次循环时，杂交效率达到100％。因此，利用本发明的生物芯片反应装置和本发明方法，通过循环进样反应，可以检测出极低浓度的靶序列。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<120>生物芯片反应装置及利用该装置检测靶分子的方法

<160>11

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>通用引物Primer a

<400>1

gtaggagtct ggaccgtgtc                                                20

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>通用引物Primer b

<400>2

cggcgtgcct aatacatg                                                  18

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>通用引物Primer c

<400>3

cgccccgtag gagtctggac cgtgtc                                         26

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对金黄色葡萄球菌特异性基因的探针P1

<400>4

acagcaagac cgtctttcac ttttg                                            25

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对金黄色葡萄球菌特异性基因的探针P2

<400>5

aggggcggaa accccctaac actta                                            25

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对绿脓杆菌特异性基因的探针P1

<400>6

ccactttctc cctcaggacg  tatg                                            24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对绿脓杆菌特异性基因的探针P2

<400>7

atctcaagga tcccaacggc tagt                                            24

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对破伤风梭状芽孢杆菌特异性基因的探针P1

<400>8

gcccatctca aagcagatta ctc                                            23

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对破伤风梭状芽孢杆菌特异性基因的探针P2

<400>9

aggcggaata cttaatgtgt taact                                          25

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对产气荚膜梭菌特异性基因的探针P1

<400>10

atctcatagc ggattgctcc tttgg                                          25

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对产气荚膜梭菌特异性基因的探针P2

<400>11

cggcacggag gtgttgaaac cccca                                          25

Claims (5)

1.生物芯片反应装置，其特征在于：包括反应室、循环管道、循环泵和温度控制装置，所述反应室的入口和出口分别与循环管道连通构成循环回路，所述反应室中设置有用于固定生物芯片的芯片固定架；所述循环管道上设置有循环泵，通过循环泵控制液体在循环回路中不断循环；所述循环管道上还设置有进液口和出液口，所述进液口和出液口分别设置有开关阀；所述温度控制装置设置在反应室或/和循环管道内，通过温度控制装置控制循环回路的温度。

2.根据权利要求1所述的生物芯片反应装置，其特征在于：所述循环管道与反应室入口相连的一段沿液体流向设置缩口结构，收缩角为20～45度；所述循环管道与反应室出口相连的一段沿液体流向相反方向设置扩口结构，扩张角为20～45度。

3.根据权利要求2所述的生物芯片反应装置，其特征在于：所述芯片固定架设置在反应室底面，用其固定生物芯片后，所述生物芯片的反应面迎向反应室进液方向并与反应室底面成20～60度角倾斜，同时生物芯片的底边与反应室底面的横向水平线之间成20～60度水平夹角。

4.根据权利要求3所述的生物芯片反应装置，其特征在于：所述芯片固定架至少为两个，沿反应室底面纵向并列设置。

5.利用权利要求1所述的生物芯片反应装置检测靶分子的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、将表面固定有识别分子的生物芯片放入芯片固定架中，开启温度控制装置预热至设定温度；

b、从进液口加入待检样本溶液，开启循环泵，使待检样本溶液在循环回路中不断循环，生物芯片表面固定的识别分子识别待检样本溶液中的靶分子并与其发生特异性结合，待充分反应后，从出液口去除待检样本溶液；

c、从进液口加入清洗液，开启循环泵，清洗循环回路，清洗完成后，从出液口去除清洗液；

d、从进液口加入荧光报告分子溶液，开启循环泵，使荧光报告分子溶液在循环回路中不断循环并与生物芯片表面的识别分子-靶分子复合物充分反应，反应完成后，从出液口去除荧光报告分子溶液；

e、从进液口加入清洗液，开启循环泵，清洗循环回路，清洗完成后，从出液口去除清洗液；

f、对生物芯片进行荧光检测，根据荧光报告分子的荧光发射波长和荧光发射光谱对靶分子进行定量检测。

Images