CN108195919B - 基于酶水解能力的基片表面hp dna发卡构型的定量评测及背景信号消除方法 - Google Patents

基于酶水解能力的基片表面hp dna发卡构型的定量评测及背景信号消除方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及DNA自组装膜技术领域，具体涉及一种基于酶水解能力的基片表面HP DNA发卡构型的定量评测及消除背景信号的方法。具体步骤包括：通过高温变性去除二聚体；将基片浸入酶量为100U～300U的核酸外切酶I缓冲液中水解；利用电量积分技术确定电极表面HP DNA发卡构型的比例。本发明基于核酸外切酶I对ssDNA和HP DNA发卡构型水解能力的差异，结合电化学方法定量评测基片表面HP DNA发卡构型的比例。此外，核酸外切酶I的使用还可有效消除由非发卡构型引起的背景信号，从而极大的提高Hairpin DNA基生物传感器的检测灵敏度。

Description

基于酶水解能力的基片表面HP DNA发卡构型的定量评测及背 景信号消除方法
技术领域
本发明涉及DNA自组装膜技术领域，具体涉及一种基于酶水解能力的基片表面HPDNA构型的定量评测及消除背景信号的方法。
背景技术
Hairpin DNA(简称HP DNA)是一种能够形成茎-环(loop-stem)相连的“发卡状”构型的单链DNA。近年来，将HP DNA作为探针固定在基片上以固体器件的形式实现对靶标物的快速、高灵敏、高通量、无标记的分析与诊断，并产生了多种类型的HP DNA基生物芯片/传感器。
然而，当采用常规组装手段把HPD探针固定在基片上时，得到的将是包括单链卷曲构型、发卡构型、头-尾相连二聚体构型的混合构型的探针膜，其中非发卡构型的存在引起背景信号，势必会降低HPD基生物芯片/传感器的检测性能。
基片表面发卡构型行之有效的定量评价方法的建立是实现HP DNA发卡构型可控调控以充分发挥其优异检测性能的前提条件。电化学方法CV/CC等可通过电活性物质标记来测定电极表面DNA数量，但是电化学法检测的电量是电极表面DNA混合构型的总数量，不能区分不同构型的数量及比例。
发明内容
本发明在综合考虑电极表面二聚体的去除效率、探针膜稳定性、核酸外切酶对不同构型核酸的水解能力的差异、以及酶对不同构型DNA的最佳作用条件的基础上，提出了一种基于酶水解能力的电极表面Hairpin DNA发卡构型的定量评测方法，并通过该方法定量评价了不同组装工艺条件下，电极表面Hairpin DNA发卡构型的产率。此外，利用该酶的水解能力还可以有效的消除非发卡构型带来的背景信号的干扰。
本发明的目的是提供一种基于酶水解能力的基片表面HP DNA发卡构型的电化学定量评测方法。
本发明的再一目的是提供一种基于酶水解能力的消除HP DNA检测芯片的背景信号的方法。
根据本发明的基于酶水解能力的基片表面HP DNA发卡构型的电化学定量评测方法，包括以下步骤：
(1)通过高温变性去除基片表面的二聚体；
(2)将基片浸入酶量为100U～300U的核酸外切酶I缓冲液中，于25～37℃水解；
(3)确定电极表面HP DNA发卡构型的比例。
根据本发明的具体实施方式的基于酶水解能力的基片表面HP DNA发卡构型的电化学定量评测方法，对于HPD基生物芯片/传感器中二聚体的去除，只有控制在70～100℃、变性0～5min，然后在盐离子浓度为10mM～200mM Na+、5mM～100mM Mg2+的缓冲液中静置时间1～12h，才能保证对HPD基生物芯片/传感器中二聚体的有效去除，并且保证不会损伤HPD自组装膜(SAMs)。
根据本发明的具体实施方式，基于酶水解能力的基片表面HP DNA发卡构型的电化学定量评测方法包括以下步骤：
(1)去除HPD基生物芯片/传感器中的二聚体，将HPD基生物芯片/传感器置于70～100℃的高温热水中变性0～5min，然后将HPD基生物芯片/传感器静置于含盐离子缓冲液中1～12h，其中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，盐离子浓度为10mM～200mMNa+、5mM～100mM Mg2+；
(2)核酸外切酶I水解HPD基生物芯片/传感器中的ssDNA，将去除二聚体构型后的HPD基生物芯片/传感器置于100U～300U核酸外切酶I缓冲液中，于25～37℃1～12h；
(3)确定电极表面发卡构型的比例，以酶水解前后的电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极构建三电极体系，用电化学CC/CV法测定电活性物质标记DNA探针膜，获得酶水解前后金电极表面的电量Qa和Qb。根据测定的电量的减少，确定电极表面ssDNA的数量，进一步可确定电极表面发卡构型的比例。
ssDNA％＝{(Qa-Qb)/0.7}/Qa×100％
Hairpin DNA％＝{Qa-(Qa-Qb)/0.7}/Qa×100％
其中，Qa为酶水解前金电极表面的DNA电量，Qb为酶水解后金电极表的DNA电量，校正因子为0.7，因基片阻挡效应，Exo I对固定在电极表面的ssDNA链剪切效应通常为0.7。
根据本发明的基于酶水解能力的电极表面Hairpin DNA发卡构型的定量评测方法，其中，如图1所示，所述二聚体为头尾相连二聚体。
根据本发明的具体实施方式的基于酶水解能力的基片表面HP DNA发卡构型的电化学定量评测方法，其中，所述HPD基生物芯片/传感器通过以下步骤构建：
对HPD的末端进行不同的修饰，如末端修饰双硫键、生物素、氨基、羧基等基团；再对电极/玻璃表面进行相应的化学修饰，如电极/玻璃表面沉积纳米金颗粒、活化连接链霉亲和素、羧基、氨基修饰等。通过HPD末端和电极/玻璃表面的化学键作用可以构建HPD基生物芯片/传感器。
根据本发明的基于酶水解能力的消除HP DNA检测芯片的背景信号的方法包括以下步骤：
(1)通过高温变性去除检测芯片的基片表面的二聚体；
(2)将所述检测芯片浸入酶量为100U～300U的核酸外切酶I缓冲液中，于25～37℃水解。
根据本发明的基于酶水解能力的消除HP DNA检测芯片的背景信号的方法，HP DNA检测芯片可以为HPD基生物芯片或传感器，只有控制在70～100℃、变性0～5min，然后在盐离子浓度为10mM～200mM Na+、5mM～100mM Mg2+的缓冲液中静置时间1～12h，才能保证对HPD基生物芯片/传感器中二聚体的有效去除，并且保证不会损伤HPD自组装膜(SAMs)。
根据本发明的基于酶水解能力的消除HP DNA检测芯片的背景信号的方法，所述HPD基生物芯片/传感器通过以下步骤构建：
对HPD的末端进行不同的修饰，如末端修饰双硫键、生物素、氨基、羧基等基团；再对电极/玻璃表面进行相应的化学修饰，如电极/玻璃表面沉积纳米金颗粒、活化连接链霉亲和素、羧基、氨基修饰等。通过HPD末端和电极/玻璃表面的化学键作用可以构建HPD基生物芯片/传感器。
本发明的优点：
(1)本发明基于核酸外切酶I对ssDNA和HP DNA水解能力的差异，结合电化学方法定量检测基片表面HP DNA单链卷曲型和发卡构型的比例；
(2)本发明发现虽然核酸外切酶I能高效特异性水解ssDNA，但是核酸外切酶I水解Hairpin DNA的能力受制于发卡构型根部长度(稳定性)，特别是酶量的影响，根据本发明的技术方案，控制酶量在100U～300U之间可以确保核酸外切酶能高效剪切ssDNA，而不剪切具有稳定构型的Hairpin DNA链(茎部碱基对数目≥6)；
(3)本发明发现核酸外切酶I对溶液状态下和基片状态下的ssDNA剪切能力不同，为了实现精准测定HP DNA的比例，本发明优化电化学测量HP DNA的校正因子为0.7。
(4)本发明发现发卡构型稳定，茎部碱基对数目较长的HP DNA(如茎部为16对互补碱基)可以抵抗高浓度的核酸外切酶I水解，而茎部碱基对数目较短的HP DNA(如茎部为8对互补碱基)，则不具有抵抗高浓度(＞300U)的核酸外切酶I水解的能力，根据本发明的技术方案，控制酶量在100U～300U之间可以确保核酸外切酶I高效剪切ssDNA，而不剪切具有稳定发卡构型的Hairpin DNA链。
(5)根据本发明的技术方案，能有效消除了由非发卡构型引起的背景信号，同时显著提高Hairpin DNA基生物传感器的检测灵敏度。
附图说明
图1为实施例1中热水处理电极表面时的示意图。
图2为实施例1中80℃热水处理电极表面不同时间的循环伏安图。
图3为实施例1中热水变性时间和温度的优化图。
图4为实施例2中核酸外切酶I水解溶液态不同DNA构型导纳的电泳图。
图5为实施例2中不同酶量核酸外切酶I对电极表面ssDNA水解效率的影响图。
图6为实施例2中核酸外切酶I对电极表面不同链密度的ssDNA的水解效率图。
图7为实施例2中核酸外切酶I水解电极表面不同构型DNA的循环伏安图及其相应电量变化图。
图8为实施例3中核酸外切酶I水解不同比例HP-16/ssDNA的循环伏安图。
图9为实施例3中核酸外切酶I定量电极表面HP-16/ssDNA SAMs中发卡构型的比例图。
图10为实施例3中Target-10杂交法来定量电极表面HP-16/ssDNA SAMs中发卡构型的比例图。
图11为实施例3中核酸外切酶I水解和Target-10杂交法的相关性分析图。
图12为实施例3中酶切法判断不同组装工艺条件下HPD发卡构型的产率。
图13为实施例4中核酸外切酶I水解前后电化学背景信号的差异。
图14为实施例4中核酸外切酶I水解前后荧光背景信号的差异。
图15为实施例4中HPD基传感器在无(a)和有(b)酶参与时对HIV-1的电化学检测。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但所述实施不构成对本发明的限制。
实施例
一、去除Hairpin-16/ssDNA自组装膜中的二聚体
(1)构建Hairpin-16/ssDNA自组装膜(SAMs)：将0～1umol Hairpin-16和ssDNA混合，并用旋涡振荡器混匀，以制备不同比例的Hairpin-16/ssDNA混合溶液。将经过活化处理的金电极浸泡于预先配置的Hairpin-16/ssDNA混合溶液中，室温下放置4-24h，即得到Hairpin-16/ssDNA自组装膜，如图1所示。
(2)Hairpin-16/ssDNA自组装膜中二聚体的去除：将上述金电极，置于新配置的75～95℃热水中变性0.5～3min，然后将电极静置于10mM Tris-buffer(100mM～200mM Na+、30mM～80mM Mg2+)中1～12h，即可除去电极表面的二聚体构型，并使发卡构型重新折叠。如图2用80℃热水处理电极表面的循环伏安图所示，随着热水处理时间的增加，电极表面的DNA电量有所减少，但时间过长则会对DNA膜造成一定的损伤。图3为不同热水变性时间和温度的信号图，从图中可以看出在70℃的低温下加热1.5min才能去除表面的二聚体，而95℃的高温下加热0.5min即导致电极表面DNA电量的急剧下降，DNA自组装膜已遭到不可修复损伤。因此，80℃下变性1min既能保证电极表面二聚体的去除，又能保证不损伤电极表面的DNA薄膜。
二、分析核酸外切酶I水解基片表面ssDNA、dsDNA、HP-8和HP-16的能力
HP-8、HP-16指总碱基数为48，茎部分别有8对和16对碱基互补配对的HP DNA。
核酸外切酶I水解溶液态ssDNA、dsDNA、HP-8和HP-16：将1～5umol ssDNA、HP-8和dsDNA和HP-16与0～40U的核酸外切酶I混合摇匀后，于25～37℃下反应15～60min。然后，将上述混合液加入凝胶电泳的通道跑胶。如图4所示，随着核酸外切酶I量的增大，ssDNA被水解完全，dsDNA和HP-16则不受核酸外切酶I量的影响，而HP-8则随着酶量的增加逐渐被水解完全，表明HP-8构型的稳定性不足以抵抗Exo I的水解。因此，HP DNA发卡构型的稳定性及酶量的选择是区分不同构型的关键因素。
核酸外切酶I水解电极表面ssDNA、dsDNA、HP-8和HP-16：将经过活化处理的金电极浸泡于预先配置50-250uL 1～5umol ssDNA、dsDNA、HP-8和HP-16溶液中，室温下静置4-24h即得到ssDNA、dsDNA、HP-8和HP-16SAMs。然后将所得金电极分别置于新配置的50-250uL含0-100U核酸外切酶I的缓冲液中，于25～37℃环境下反应一定1～12h。以制备的金电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极构建三电极体系，用电化学CV法测定电活性物质三氯化六铵合钌标记DNA探针膜，获得核酸外切酶I水解前后金电极表面的电量。图5中，随着核酸外切酶I酶量的增加，对电极表面ssDNA的水解效率逐渐达到最大值并稳定。图6为核酸外切酶I对电极表面不同链密度的ssDNA的水解效率图，从图中可以看出核酸外切酶I对电极表面ssDNA的水解能力并不会随着电极表面ssDNA密度的变化而改变，均能达到70％的水解效率。图7为核酸外切酶I水解电极表面不同DNA构型的循环伏安图及其相应电量变化图，从图中可以看出核酸外切酶I对电极表面的ssDNA有一定程度的水解，而并不水解电极表面的dsDNA；电极表面HP-16中少量的单链卷曲型则会被水解；电极表面HP-8由于发卡构型自身稳定性的原因，在酶量为300U时，已不能抵抗核酸外切酶I的水解。因此，酶量为100U时能较好的区分电极表面的不同DNA构型。
三、“酶切法”定量评价Hairpin-16/ssDNA自组装膜中的发卡构型的比例
(1)Hairpin-16/ssDNA自组装膜的构建以及二聚体的去除同上。
(2)核酸外切酶I切Hairpin-16/ssDNA自组装膜中的ssDNA：将上述组装有Hairpin-16/ssDNA自组装膜的金电极，置于新配置的50-250uL含0-100U核酸外切酶I的缓冲液中，与25～37℃环境下反应1～12h。然后，以核酸外切酶I水解前后的金电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极构建三电极体系。用电化学CV法测定电活性物质三氯化六铵合钌标记Hairpin-16/ssDNA自组装膜探针膜，获得核酸外切酶I水解前后金电极表面的电量。根据两次测定的电量的减少，即可确定电极表面ssDNA的量，进一步可确定电极表面Hairpin-16发卡构型的比例。如图8所示为核酸外切酶I水解不同比例Hairpin-16/ssDNA的循环伏安图。从图中可以看出随着溶液中HP-16比例的增大，由酶水解所引起的电量的变化越小。图9为核酸外切酶I定量评价电极表面Hairpin-16/ssDNA自组装膜中发卡构型的比例图。从图中可以看出电极表面Hairpin DNA发卡构型的比例随着溶液中HairpinDNA的增加而增加，由此表明本发明提供的定量方法能定量电极表面Hairpin DNA发卡构型的比例。
(3)“酶切法”定量评价法可靠性的验证：将上述组装有Hairpin-16/ssDNA自组装膜的金电极，置于新配置的50-250uL1-10umol Target-10的缓冲液中(只与ssDNA末端杂交)。然后，以杂交前后的金电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极构建三电极体系。用电化学循环伏安(CV)分别测定电活性物质三氯化六铵合钌标记Hairpin-16/ssDNA自组装膜探针膜在杂交前后金电极表面的电量，根据两次测定的电量的增加值，即可得到电极表面ssDNA的数量，并进一步确定电极表面Hairpin-16发卡构型的比例。如图10所示，显示Target-10杂交法来定量电极表面Hairpin-16/ssDNA自组装膜中发卡构型的比例图，从图中也可以看出电极表面Hairpin DNA发卡构型的比例随着溶液中Hairpin DNA的增加而增加。图11为“酶切法”和“Target-10杂交法”两种方法的相关性分析图。研究结果发现，“酶切法”和“Target-10杂交法”的定量结果有很好的一致性，再次证明了“酶切法”定量评价的可靠性。
(4)“酶切法”定量评价不同组装工艺条件对HP-8(茎部有8对碱基互补配对)发卡构型的影响：HPD最常见的组装方式有三种，组装前不经过任何处理(I)、热解链后直接组装(II)、热解链后室温放置数小时后组装(III)。如图12所示，以HP-8为例，“酶切法”定量不同组装工艺条件对HP-8发卡构型的影响，在热解链后直接组装(II)的方法最利于电极表面发卡构型的形成。
四、Hairpin-6自组装膜中非发卡构型引起的背景信号的消除
(1)构建Hairpin-6自组装膜：将经过活化处理的金电极浸泡于预先配置的50-250uL 1～5umol Hairpin-6溶液中，室温下静置4-24h，即得到Hairpin-6自组装膜。
其中，HP-6指茎部分别有6对碱基互补配对的HP DNA。
(2)背景信号的消除：将上述金电极置于新配置的50-250uL含≤100U核酸外切酶I的缓冲液中，于25～37℃下反应1～12h。然后，分别检测其电化学和荧光信号，并与未与酶作用的电极对比其背景信号的差异。如图13所示，显示核酸外切酶I水解前后电化学背景信号的差异。从图中可以看出酶水解后电化学背景信号有了一定的降低。图14为酶水解前后荧光背景信号的差异，从图中可以看出，酶水解后的荧光背景信号比酶水解前有明显的降低，降低了非发卡构型引起的荧光背景信号。图15为HPD基传感器在无(a)和有(b)酶参与时对HIV-1的电化学检测图。从图中可以看出在有核酸外切酶I参与时，HPD基传感器的背景信号有所降低并检测到更低浓度的目标链HIV-1，其相应的检测限比没有酶参与时降低了将近两个数量级(表1)。
表1为HPD基传感器在无和有酶参与时对HIV-1的电化学检测限对比
核酸外切酶I 检测限
无 17pM
有 0.34pM

Claims (8)

1.一种基于酶水解能力的基片表面HP DNA发卡构型的电化学定量评测方法，其特征在于，所述基片表面的DNA自组装膜同时含有HP DNA发夹构型和ssDNA直链卷曲构型，所述HPDNA发卡构型的发夹部分≥6碱基对，
所述方法包括以下步骤：
(1)利用高温变性处理去除基片表面的二聚体；
(2)将基片浸入酶量为100U～300U的核酸外切酶I缓冲液中，于25～37℃水解；
(3)利用电量积分技术确定基片表面HP DNA发卡构型的比例。
2.根据权利要求1所述的基于酶水解能力的基片表面HP DNA发卡构型的电化学定量评测方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，将基片置于70～100℃的热水中变性≤5min。
3.根据权利要求1所述的基于酶水解能力的基片表面HP DNA发卡构型的电化学定量评测方法，其特征在于，在步骤(3)中，以核酸外切酶I水解前后的基片为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极构建三电极体系，用电化学法测定电活性物质标记的DNA探针膜，获得核酸外切酶I水解前后工作电极表面的电量Qa和Qb，根据测定的电量的减少，通过以下公式确定工作电极表面ssDNA直链卷曲构型和HP DNA发夹构型的数量，
ssDNA％＝{(Qa-Qb)/0.7}/Qa×100％
HP DNA％＝{Qa-(Qa-Qb)/0.7}/Qa×100％
其中，Qa为酶水解前工作电极表面的DNA电量，Qb为酶水解后工作电极表的DNA电量。
4.根据权利要求1所述的基于酶水解能力的基片表面HP DNA发卡构型的电化学定量评测方法，其特征在于，HP DNA发夹构型的末端通过化学键修饰与基片连接。
5.根据权利要求4所述的基于酶水解能力的基片表面HP DNA发卡构型的电化学定量评测方法，其特征在于，对HP DNA发夹构型的末端修饰双硫键、生物素、氨基、羧基，对基片表面修饰有纳米金颗粒、链霉亲和素、羧基、氨基。
6.一种基于酶水解能力消除HP DNA发夹构型检测芯片的背景信号的方法，其特征在于，所述芯片表面的DNA自组装膜同时含有HP DNA发夹构型和ssDNA直链卷曲构型，所述HPDNA发夹构型的发夹部分≥6碱基对，所述方法包括以下步骤：
(1)通过高温变性去除检测芯片的基片表面的二聚体；
(2)将所述检测芯片浸入酶量为100U～300U的核酸外切酶I缓冲液中，于25～37℃水解。
7.根据权利要求6所述的基于酶水解能力消除HP DNA发夹构型检测芯片的背景信号的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，将基片置于70～100℃的热水中变性≤5min。
8.根据权利要求6所述的基于酶水解能力消除HP DNA发夹构型检测芯片的背景信号的方法，其特征在于，对HP DNA发夹构型的末端与基片的表面分别进行化学修饰，从而将HPDNA发夹构型的末端与基片的表面连接。
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