CN113533479B - 一种电化学发光生物传感电极及其构建和用于检测基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本方案公开了生物传感器技术领域的一种电化学发光生物传感电极，包括以下内容：(1)合成了PdCuBP介孔纳米酶，并发现其对溶解的O2具有良好的催化活性。(2)首次合成PdCuBP@luminol介孔纳米球，在中性免H2O2介质中展现了优秀的电化学发光信号。(3)CRISPR/Cas12a系统作为检测触发器，特异性识别靶DNA，高效剪切界面发卡DNA‑多巴胺(hpDNA‑DA)猝灭剂。(4)联合PdCuBP@luminol和CRISPR/Cas12a构建电化学发光DNA生物传感器。该传感器可针对细胞色素c氧化酶亚基III基因检测，在临床诊断领域具有潜在应用价值。

Description

一种电化学发光生物传感电极及其构建和用于检测基因的 方法
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，特别涉及一种电化学发光生物传感电极及其构建和用于检测基因的方法。
背景技术
目前，聚类规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关系统(Cas)作为一种高效的基因编辑工具引起了生物学研究者的极大兴趣。CRISPR/Cas系统具有不同独特的可调节核酸酶活性，包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13a、CRISPR/Cas14等，用于序列特异性核酸检测。其中，属于II类V-A CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas12a，对目标双链DNA(dsDNA)特异识别后激活其高效的DNA酶活性，是下一代DNA生物传感理想的候选分子。CRISPR/Cas12a与荧光、横向流动、比色等技术相结合，迅速发展出一系列高灵敏度、高特异性的检测方法。但这些方法存在双标记昂贵、光学设备昂贵、信噪比低、颜色变化分辨力差等缺点，阻碍了CRISPR/Cas12a生物分析的适用性。
电化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)作为一种常用的生物分析技术，因其低本底、高灵敏度、分析快速、小型化、易控制等优点而受到广泛关注。考虑到这些优势，CRISPR/Cas12a与ECL结合可能成为DNA生物传感的替代技术。例如，Liang的团队开发了一种基于Cas12a的电化学发光生物传感器，在真实样品中表现出较好的DNA检测性能。但该方法存在如下不足：将挥发性有机化合物(三乙胺，TEA)作为外源性共反应剂加入高碱性工作溶液(pH＝11)，以提高ECL的强度。CRISPR/Cas12a的活性可能受到高碱性溶液和TEA的生物毒性的影响，对生物传感器的灵敏度和特异性产生负面影响。
在众多的电化学发光试剂中，鲁米诺(英文：luminol，又名发光氨。化学名称为3-氨基-苯二甲酰肼)因其优异的发光性能而被广泛应用于电化学发光生物传感器。过氧化氢(H2O2)作为外源性的共反应剂被用来增强鲁米诺的发射信号。但H2O2的可分解性和不稳定性抑制了鲁米诺在生物测定领域的应用。此外，为了增强鲁米诺发光信号，基于鲁米诺的电化学发光生物传感器需要在生物相容性不友好的碱性溶液中工作。因此，开发一种可以在中性免H2O2的鲁米诺电化学发光生物传感器至关重要。
发明内容
本发明意在解决现有技术中存在的问题，提供一种电化学发光生物传感电极、构建用于检测基因的方法。
本方案中的一种电化学发光生物传感电极的构建方法，包括以下步骤：
(1)合成PdCuBP介孔纳米酶：称取DODAC，加水溶解后，依次加入NH4F溶液、H3BO3溶液、H2PdCl4溶液和CuCl2溶液；适当温度下搅拌加热一定时间，然后加入NH3·H2O，搅拌至无色，滴入NaH2PO2·H2O，逐渐加热至90℃—95℃后恒温一定时间；最后，加入DMAB，充分搅拌，溶液颜色由白色变为深褐色，离心，洗涤，既得PdCuBP介孔纳米酶；
(2)合成PdCuBP@luminol纳米球
在步骤(1)所得PdCuBP介孔纳米酶的悬浮液中，加入luminol分散液混合，在室温避光搅拌一定时间，然后离心去除未负载的luminol，得到并收集PdCuBP@luminol纳米球；
(3)制备hpDNA-DA
将hpDNA溶于EDC和NHS中，静置、活化hpDNA的羧基，然后滴入DA溶液，充分搅拌即可得所述hpDNA-DA；
(4)构建电化学发光生物传感电极
将PdCuBP@luminol纳米球的悬浮液滴在清洁处理后的金电极表面，干燥成膜，再将hpDNA-DA滴在金电极表面，孵育一定时间后，滴涂MCH阻断金电极表面的非特异性位点，既得电化学发光生物传感电极。
本方案的工作原理是：本方案中的PdCuBP介孔纳米酶和PdCuBP@luminol纳米球，是一种多组分金属-非金属合成物质，PdCuBP介孔纳米酶具有巨大的表面积，可以携带丰富的鲁米诺(luminol)形成PdCuBP@luminol纳米球作为电极修饰剂；PdCuBP介孔纳米酶是一种良好的ECL信号放大器，具有良好的氧化物催化活性，加速溶解的O2转化为ROS，显著增强中性工作溶液中的鲁米诺ECL信号。本发明首次合成了PdCuBP@luminol介孔纳米球，在中性免H2O2介质中展现了优秀的电化学发光信号。
多巴胺(DA)作为猝灭剂被标记在巯基(SH)发卡DNA(hpDNA)上形成hpDNA-DA，随后被固定在金电极(Gold electrode,缩写GE)表面以猝灭PdCuBP@luminol纳米球的ECL发射。
将PdCuBP@luminol介孔纳米球负载于金电极表面，此时由于PdCuBP@luminol介孔纳米球的电化学发光信号，信号为“开启”的状态，将发卡DNA-多巴胺(hpDNA-DA)作为猝灭器偶联在金电极表面，猝灭PdCuBP@luminol介孔纳米球的电化学发光信号，此时信号为“关闭”的状态，当体系中含有靶DNA时，Cas12a的核酸酶切活性被激活，从而剪切金电极表面的hpDNA-DA，从而使信号得到输出。
本方案的有益技术效果是：细胞色素c氧化酶亚基III(COX III)基因是急性肾损伤(AKI)的新型生物标志物，现有技术中的CRISPR/Cas12a系统在细胞色素c氧化酶亚基III(COX III)基因的存在下被特异性激活，并在hpDNA-DA上具有非特异性的反式切割能力，从而开启ECL信号，特异性识别靶DNA，高效剪切界面hpDNA-DA猝灭剂。而CRISPR/Cas12a系统联合本发明中的电化学发光生物传感电极可构建一种新型的中性免H2O2的电化学发光DNA生物传感器，在中性环境中就可表现出良好的生物相容性、功能通用性、室温可操作性和优异的检测能力，不需要加入高碱性的工作液，不需要额外加入过氧化氢(H2O2)来增强电化学发光信号。
使用本发明的电化学发光生物传感电极，与CRISPR/Cas12a系统联合构建的电化学发光DNA生物传感器，在1pM～200nM之间具有良好的线性响应，检出限为0.44pM。同时，所制备的电化学发光DNA生物传感器具有良好的特异性和重复性。此外，所建立的方法已成功地在真实尿液中进行了评价，提示其对细胞色素c氧化酶亚基III基因的检测在临床诊断领域具有潜在应用价值。
同时本发明解决了现有技术中存在的检测成本高、操作复杂、灵敏度低等问题。
进一步，步骤(2)中将所得PdCuBP@luminol纳米球的原液稀释5倍后备用，所述步骤(4)中hpDNA-DA的浓度为3μM。本方案提高了电化学发光效率并降低研制成本。
进一步，所述金电极的清洁处理方式为：采用氧化铝微粉和抛光垫抛光裸金电极，在超纯水超声浴冲洗后，用食人鱼溶液蚀刻一定时间，然后用去离子水清洗，并在氮气下干燥、改性；所述食人鱼溶液为H2SO4/H2O2＝3:1的混合液。
进一步，步骤(1)中在35℃搅拌6分钟后加入NH3·H2O；滴入NaH2PO2·H2O加热至95℃后恒温20min。
进一步，步骤(3)中静置和搅拌的温度均为4℃。
进一步，步骤(4)中孵育的温度为4℃，时间为8h；得到的电化学发光生物传感电极用洗涤液冲洗后在4℃保存备用，所述洗涤液为0.01M PBS，含0.05％(w/v)Tween-20,pH7.41。
使用本发明方法构建得到的一种电化学发光生物传感电极，可与CRISPR/Cas12a系统联合使用构成电化学发光DNA传感器，用于检测基因。
使用本发明方法构建得到的一种电化学发光生物传感电极检测基因，检测前，在反应缓冲液中制备Cas12a/crRNA复合体，随后向其中添加靶标DNA，适当温度下孵育一定时间，取孵育后得到的溶液滴在电化学发光生物传感电极的表面，适当温度下孵育一定时间，冲洗、修饰电极表面，在-0.2～0.6V电位扫描，扫描速率为0.1～0.15V/s，脉冲宽度为50～100ms，光电倍增管为800V，在PBS(0.01M,pH 7.4)中进行电化学发光检测。
其中，所述Cas12a/crRNA复合体的制备为：在包含1U RNase抑制剂，1×NEBuffer2.1的反应缓冲液中，加入50nM crRNA和50nM Cas12a反应制得；在基因的检测过程中，所述Cas12a/crRNA复合体的浓度为50nM；每次孵育的温度为37℃，时间为1h。
附图说明
图1为使用本发明电化学发光生物传感电极的制备流程及检测原理的示意图；
图2为PdCuBP介孔纳米酶和PdCuBP@luminol介孔纳米球的结构和组成分析；
其中：(A)PdCuBP介孔纳米酶的TEM和粒径分布直方图；(B-C)PdCuBP介孔纳米酶的HRTEM图；(D)PdCuBP@luminol介孔纳米球的HAADF-STEM图；(E-J)PdCuBP@luminol的STEM-EDS元素映射图；
图3为PdCuBP介孔纳米酶的氮气吸附-脱附等温线；
图4为PdCuBP@luminol介孔纳米球的XPS谱图；
图5(A)不同修饰电极的电化学发光强度：分别是PdCuBP/GE(a)，luminol/GE(b)，PdCuBP@luminol/GE(c)在PBS(pH 7.4)中的ECL强度；(B)PdCuBP@luminol/GE在碱性(pH9.0)(a)和中性(pH 7.4)(b)PBS中的电化学发光强度；
图6(A)PdCuBP@luminol/GE在N2饱和(a)和空气饱和(b)的PBS中的电化学发光信号；(B)PdCuBP@luminol/GE在含10mM DMSO(a)和1mM对苯醌(b)的空气饱和PBS中的电化学发光响应；
图7(A)Cas12a介导裂解的可行性分析；(B)已开发生物传感器的可行性ECL分析：crRNA+target(a)，Cas12a(b)，Cas12a+crRNA(c)，Cas12a+target(d)，Cas12a+crRNA+target(e)；
图8电化学阻抗谱(A)和电化学发光(B)表征：裸GE(a),PdCuBP@luminol/GE(b),hpDNA-DA/PdCuBP@luminol/GE(c)，Cas12a-crRNA-target复合体处理后的hpDNA-DA/PdCuBP@luminol/GE(d)；
图9优化(A)PdCuBP@luminol的稀释倍数，(B)hpDNA-DA的浓度，(C)Cas12a/crRNA复合体的浓度，(D)Cas12a/crRNA/target复合体的孵育时间；
图10(A)设计的生物传感器在不同靶浓度下的电化学发光值(a-i:1pM,5pM,50pM,100pM,1nM,10nM,50nM,100nM,200nM)。(B)电化学发光值与COX III浓度对数的线性图。(C)设计的生物传感器的电化学发光响应:空白(无目标DNA)、5nM COX I、5nM COX II、1nM COXIII和混合(1nM COX III+5nM每个干扰物质)。误差棒：SD,n＝3；(D)在100pM COX III存在下连续循环电位扫描10个周期生物传感器的电化学发光响应。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
一、构建电化学发光生物传感电极，并用于COX III基因的检测，结合图1所示。
1、材料与方法
1.1材料
Lba Cas12a(Cpf1)和10×NEBuffer 2.1(0.5M NaCl,0.1M Tris-HCl,0.1MMgCl2,1mg/mL BSA,pH 7.9)购于New England Biolabs(伊普斯维奇，美国)，HPLC纯化的CRISPR RNA(crRNA)、RNase抑制剂、RNase-free水和DNA Marker购自Takara Biotech(大连，中国)。GoldView I购自Solarbio Tech(北京，中国)。6-巯基-1-己醇(MCH)、三(2-羧基)-磷酸盐酸盐(TCEP)和聚乙二醇山梨糖单月金酸酯(Tween-20)购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，美国)。所有HPLC纯化的DNA寡核苷酸均由生工生物技术有限公司(中国上海)合成。所有寡核苷酸序列列于表1。二十八烷基二甲基氯化铵(DODAC,96％)购自Alfa Aesar(希舍姆，英国)。次亚磷酸(NaH2PO2·H2O,98％)，盐酸多巴胺(99.9％)，氯化钯(II)(PdCl2,99.9％)和无水氯化铜(CuCl2,99％)从Adamas-beta(上海，中国)购买。硼烷二甲胺(DMAB,97％)配合物购自Acros Organics(赫尔，比利时)。氟化铵(NH4F,98％)和硼酸(H3BO3,99.5％)均购自Greagent(中国上海)。无水乙醇、盐酸(HCl)和氨水(NH3·H2O)购自川东化工有限公司(重庆，中国)。磷酸盐缓冲液(PBS,0.01M)(NaCl-Na2HPO4-KH2PO4-KCl)作为ECL工作缓冲液，pH为7.4。所有试剂都是分析级的，没有任何进一步的净化过程，并且在整个工作中使用Milliq超纯水(≥18MΩcm-1,Millipore)。
表1.本工作中使用的核酸序列
Figure BDA0003222639280000061
1.2检测仪器
ECL和电化学测量使用MPI-E多功能分析仪(西安，中国)和CHI 660E电化学工作站(上海，中国)进行。三电极系统由金电极(直径3毫米，GE，工作电极)、铂丝(对电极)和Ag/AgCl电极(浸没在饱和KCl溶液中，参比电极)组成。透射电子显微镜(TEM)和高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)使用JEM-2100F在200kV下工作。元素映射分析图在Oxford X-MAX能量色散谱仪上采集。采用Micromeritics TriStar II 3020仪器对粉末样品进行Brunauer-Emmett-Teller(BET)分析。在ESCALAB 250Xi光谱仪上采集X射线光电子能谱(XPS)图。
1.3PdCuBP介孔纳米酶的合成
称取180mg DODAC，在超声溶解于60mL超纯水中。然后依次加入NH4F溶液(6ml,0.337M)、H3BO3溶液(6ml,0.101M)、H2PdCl4溶液(3.84mL,10mM)和CuCl2溶液(0.96mL,10mM)。随后，在35℃温和搅拌加热6分钟，迅速加入NH3·H2O(2.4mL,10wt.％)，进一步搅拌至无色。将NaH2PO2·H2O(6mL,0.034M)滴入上述溶液中，逐渐加热至35℃至95℃，用油浴在95℃恒温20min。最后，将新制备的DMAB(6ml,0.1M)注入溶液中，充分搅拌，在95℃下保持30分钟。在DMAB还原后，颜色由白色变为深褐色，表明合成了PdCuBP介孔纳米酶。离心后，用乙醇水洗涤3次，悬浮在6ml去离子水中。
1.4PdCuBP@luminol纳米球的合成
首先将2mL合成的PdCuBP介孔纳米酶溶液与2mL luminol分散液(溶质为水，5mM)混合。然后在室温避光搅拌12h。离心去除未负载的luminol后，收集PdCuBP@luminol纳米球并均匀分散在1ml超纯水中。
1.5hpDNA-DA探针的制备
首先将500μL的hpDNA(1μM)溶于48mg EDC和7mg NHS中，4℃静置1h活化hpDNA的羧基。在上述混合物中滴入DA溶液(500μL,2μM)，在4℃下轻轻搅拌12h即可得到hpDNA-DA。
1.6电化学发光生物传感电极的构建
采用氧化铝微粉和抛光垫抛光裸金电极(裸GE)。在超纯水超声浴冲洗后，用食人鱼溶液(H2SO4/H2O2＝3:1)蚀刻10分钟，然后用去离子水清洗，并在氮气下干燥进行改性。然后将PdCuBP@luminol纳米微球悬浮液滴在清洁的金电极表面，在37℃干燥成膜。然后，将10μL hpDNA-DA滴在处理后的金电极表面，4℃孵育8h，然后滴涂MCH(10μL,0.5mM)阻断金电极表面的非特异性位点。最后，将构建的电化学发光生物传感电极用洗涤液(0.01M PBS，含0.05％(w/v)Tween-20,pH 7.4)冲洗，4℃保存备用。
1.7电化学发光检测步骤
在测量之前，使用50nM crRNA,50nM Cas12a在包含1U RNase抑制剂，1×NEBuffer2.1的缓冲液中制备Cas12a/crRNA复合体。随后，4μL靶标DNA添加到6μL反应缓冲中，孵育37℃ 10分钟。然后，取10μL上述溶液滴在制备的电极表面，在37℃孵育1h。轻轻冲洗修饰电极表面，在-0.2～0.6V电位扫描，扫描速率在0.1～0.15V/s范围，优选0.15V/s，脉冲宽度在50～100ms范围内，优选50ms，光电倍增管为800V，在PBS(0.01M,pH 7.4)中进行电化学发光检测。
二、表征PdCuBP介孔纳米酶和PdCuBP@luminol介孔纳米球
为了对PdCuBP介孔纳米酶进行表征，使用了如TEM、HRTEM和BET等技术。如图2A和B所示，制备的PdCuBP介孔纳米酶是直径约100nm的高单分散性纳米微球。如图1C所示，PdCuBP介孔纳米酶是一种类似于树枝分散球形结构(图2C)。如图3所示，氮吸附-洗脱等温线展示PdCuBP介孔纳米酶为多孔结构，通过计算得出，其表面面积约为41.17m2/g和平均孔径为5.02nm。
为了进一步探索PdCuBP@luminol纳米球的纳米结构和元素，我们进行了高角度环形暗场(HAADF)-STEM和STEM-EDS元素映射分析。从图2D可以看出，PdCuBP介孔纳米酶在加载鲁米诺后，仍然保持了本体的介孔纳米团簇结构。图2(E-J)中，介孔纳米酶中的Pd、Cu、B和P元素均匀分布在纳米团簇中，鲁米诺的N均匀分布在纳米颗粒上。这些结果表明，鲁米诺成功地负载到PdCuBP介孔纳米酶形成PdCuBP@luminol介孔纳米球。
通过XPS进一步研究PdCuBP@luminol介孔纳米球的表面电子态和化学键构型。PdCuBP@luminol介孔纳米球中N1s、Pd 3d、Cu 2p、B 1s和P 2p的XPS谱图如图4所示。如图4A所示，N 1s主峰出现在399.3eV处，可能是luminol的-NH2，402eV处的N1s峰可能是由N-氧化物引起的。此外，如图4B所示，PdCuBP介孔纳米酶中存在Pd 3d(Pd0和Pd2+)。Pd的化合价变化表明PdCuBP与luminol之间存在Pd-N键相互作用。
三、PdCuBP@luminol介孔纳米球的电化学发光性能
为了评价PdCuBP@luminol介孔纳米球在中性无H2O2工作溶液中的电化学发光性能，进行了不同修饰电极的对比实验。如图5A所示，PdCuBP介孔纳米酶修饰电极后，没有观察到电化学发光信号(曲线a)。此外，luminol修饰电极发射很低的电化学发光信号(曲线b)。而PdCuBP@luminol修饰电极后，获得了极高的电化学发光信号(曲线c)，这表明PdCuBP介孔纳米酶具有高的可接触比表面积，可以吸附大量的luminol，并展现了良好的生物催化活性，在无H2O2的工作溶液中触发luminol发射电化学发光信号。此外，如图5B所示，PdCuBP@luminol介孔纳米球在碱性和中性工作溶液中的电化学发光信号没有显著差异(曲线a和b)。这些结果表明PdCuBP@luminol介孔纳米球可以在中性无H2O2工作体系中实现高强度电化学发光信号输出。
四、PdCuBP@luminol介孔纳米球的电化学发光机制
为了深入了解PdCuBP@luminol介孔纳米球潜在的电化学发光机制，我们在不同的溶液中检测了ECL信号，所有实验都在pH 7.4的PBS中进行。如图6A所示，PdCuBP@luminol纳米球在N2饱和的PBS中几乎没有电化学发光信号(曲线a)。相应的，PdCuBP@luminol纳米球修饰电极在空气饱和的PBS中展现了明显的电化学发光信号(曲线b)。结果表明，PdCuBP介孔纳米酶能明显提高luminol在溶解O2中的发光效率。
众所周知，溶解的O2可以作为内源性的核反应物生成ROSs(如O2 ·-和OH·)，并与氧化luminol的活性中间体反应。因此，为了进一步探索PdCuBP介孔纳米酶与溶解O2相互作用致发光鲁米诺ECL的机制，我们设计并进行了以下实验。如图6所示B，在添加二甲亚砜(DMSO)清除罗斯OH·后，我们观察到的一个微小的信号变化(曲线a)。另外，在添加对苯醌以清除O2·-后，我们观察到电化学发光信号明显减少到1266a.u(曲线b)。上述结果表明，PdCuBP介孔纳米酶促进溶解氧气产生O2 ·-，而不是OH·，导致luminol的电化学发光。PdCuBP@luminol/O2系统可能的ECL机制可以描述如下：
Figure BDA0003222639280000091
luminol-2e--2H+→luminol·- (2)
luminol·-+O2 ·-→3-AP2-*+N2 (3)
luminol·-+O2→O2 ·-+luminol (4)
3-AP2-*→3-AP2-+hv (5)
五、该生物传感器的可行性分析
为了确认Cas12a的反式裂解活性，将反应产物进行PAGE电泳分析，如图7A所示。标记Cas12a/crRNA/target复合体各组分和单链DNA(ssDNA)的电泳位置(Lane 1-4)。Lane 5-7显示，由于Cas12a/crRNA/target复合体结构的不完善，Cas12a的核酸酶能力无法被激活。Lane 8提示Cas12a/crRNA复合体能够特异性识别和降解靶DNA。正如预期的那样，Cas12a、crRNA和target DNA可以形成一个三重复合体(Cas12a/crRNA/target复合体)来降解ssDNA(Lane 9)，这表明通过整合Cas12a/crRNA/target复合体可以充分激活Cas12a的核酸酶活性。
为了验证基于Cas12a的电化学发光平台用于COX III DNA检测的可行性，我们还进行了电化学发光测量，以进一步研究修饰电极(hpDNA-DA/PdCuBP@luminol纳米球/GE)上的核酸切割性能。同样，如图7B所示，Cas12a/crRNA/target复合体的三重结构不完整，不能激活Cas12a核酸酶活性，从而提高hpDNA-DA淬灭PdCuBP@luminol的电化学信号(曲线a-d)。只有含有Cas12a、crRNA和target(50nM)的混合物才能组装成Cas12a/crRNA/target的三重结构，导致hpDNA-DA的切割和PdCuBP@luminol发射的ECL信号恢复(曲线e)。PAGE和ECL检测结果均表明，基于Cas12a的ECL生物传感器可用于核酸检测。
六、电化学生物传感器的表征
采用电化学阻抗谱和循环伏安法对ECL生物传感器的制备过程进行了表征，制备过程在含0.1M KCl的5mM Fe(CN)6 3-/4-中进行。在电阻抗谱中，半圆直径等于电子转移电阻(Ret)。如图8A所示，裸GE的阻抗值较小(曲线a)。之后，随着在GE上修饰PdCuBP@luminol纳米球，阻抗值略有降低(曲线b)，说明PdCuBP@luminol具有一定的导电性。随后，当hpDNA-DA被修饰后，阻抗显著增加(曲线c)，这归因于hpDNA和DA阻碍了电极与电解质溶液之间的电子转移。如预期的那样，在Cas12a切割hpDNA-DA后，可以得到明显降低的阻抗强度(曲线d)。电化学阻抗谱结果表明，所设计的ECL生物传感器制备成功。
为了进一步验证电化学发光生物传感器的成功组装，记录了每个制备过程的电化学发光值。如图8B所示，由于没有发光体，裸GE没有观测到电化学发光信号(曲线a)。随后，由于PdCuBP@luminol纳米球的优异的电化学发光性能，获得了极高的信号(曲线b)。当用hpDNA-DA固定电极时，电化学发光信号显著下降(曲线c)，证明了hpDNA中的DA可以极大地猝灭鲁米诺的电化学发光发射。与Cas12a/crRNA/target复合体孵育后，可以恢复PdCuBP@luminol纳米球的电化学发光发射信号(曲线d)，因为hpDNA被裂解以释放DA猝灭剂。这些结果进一步表明，所制造的生物传感器的逐步制备如预期的成功实施。
七、优化生物传感器的制备和反应条件
为了获得最佳的分析性能，系统地优化了几种实验条件。初步研究了能提高电化学发光效率并降低研制成本的PdCuBP@luminol纳米球的稀释倍数。如图9A所示，在PdCuBP@luminol纳米球稀释倍数为5倍时，电化学发光生物传感器表现出最高的电化学发光强度。因此，我们选择五倍稀释PdCuBP@luminol纳米球作为修饰电极的最佳稀释倍数。接着，hpDNA-DA的浓度，作为熄灭PdCuBP@luminol纳米球的电化学发光效率的一个因素，也被优化。如图9B所示，3μM hpDNA-DA在修饰电极上孵育后，电化学发光信号接近最低。因此，我们在接下来的实验中选择了3μM的中位浓度作为最优浓度。此外，由于特异性识别和反式切割能力，工作缓冲液中Cas12a/crRNA复合体的浓度是构建生物传感器的基础条件。随后，我们对一系列20-60nM的Cas12a/crRNA复合体进行了优化。如图9C所示，随着Cas12a/crRNA复合体浓度从20nM到50nM的变化，生物传感器的电化学发光信号增加，然后随着Cas12a/crRNA复合体浓度的进一步增加，电化学发光信号保持不变。一般情况下，Cas12a/crRNA/target复合体在修饰电极上的孵育时间会影响检测系统的性能。图9D显示了不同孵育时间下的ECL值，Cas12a/crRNA/target复合体的最佳切割时间为60min。
八、电化学发光生物传感器的分析性能
在优化的条件下，利用所开发的电化学发光生物传感器对不同浓度的COX III基因进行定量检测。图9A显示浓度范围从1pM(曲线a)—200nM(曲线i)电化学发光的信号COXIII基因的定量检测DNA。图10B显示了良好的线性关系的回归方程为：I＝2556lg CCOXIII+33490(R2＝0.9904)。计算出的检测限(LOD)为0.44pM(S/N＝3)。这主要是由于PdCuBP@luminol纳米球的高ECL发射效率和激活的CRISPR/Cas12a对hpDNA-DA的高效切割活性。
为了证明所提出的电化学发光生物传感器的特异性，我们对几种干扰物质进行了交叉反应实验，包括COX I、COX II、COX III和含有COX III的混合物。与空白相比，当非特异性干扰物质存在时，电化学发光值的变化可以忽略不计(图9C)。同时，与各干扰物质相比，在靶物质存在的情况下获得了明显的电化学发光响应。结果表明，由于Cas12a/crRNA复合体具有典型的良好的识别能力，所开发的生物传感器具有极好的特异性。
电化学发光生物传感器的稳定性是需要考虑的关键参数。以相对标准偏差(RSD)评价方法的稳定性。在最佳条件下，对该生物传感器进行连续扫描10次。从图9D可以看出，在连续扫描下，电化学发光强度相对稳定，RSD为2.27％，说明该生物传感器的稳定性是令人满意的。
图10(A)设计的生物传感器在不同靶浓度下的电化学发光值(a-i:1pM,5pM,50pM,100pM,1nM,10nM,50nM,100nM,200nM)。(B)电化学发光值与COX III浓度对数的线性图。(C)设计的生物传感器的电化学发光响应:空白(无目标DNA)、5nM COX I、5nM COX II、1nM COXIII和混合(1nM COX III+5nM每个干扰物质)。误差棒：SD,n＝3。(D)在100pM COX III存在下连续循环电位扫描10个周期生物传感器的电化学发光响应。
九、电化学发光生物传感器的回收试验
为了评估构建的电化学发光生物传感器的潜在临床应用价值，我们对人尿液样本中添加的目标DNA(5pm、500pm和1000pm)进行了定量分析，并进行了回收试验。如表2所示，加样回收率为97.81％～103.73％，RSD<5％(n＝3)。结果表明，所提出的生物传感器在临床分析中的可靠和潜在的应用。
表2所研制的电化学发光生物传感器测定正常尿液中COXⅢ的含量
Figure BDA0003222639280000121
*回收率(％)表示为计算/加标COXⅢ的比值。
序列表
<110> 遵义医科大学附属医院
<120> 一种电化学发光生物传感电极及其构建和用于检测基因的方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aauuucuacu aaguguagau acuuccacuc cauaacgcuc 40
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctagccatgt gatttcactt ccactccata acgctcctca tactaggc 48
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcctagtatg aggagcgtta tggagtggaa gtgaaatcac atggctag 48
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acagcccatg catttgtaat aatcttcttc atagtaatac ccatcata 48
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatgatgggt attactatga agaagattat tacaaatgca tgggctgt 48
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccctacgcat cctttacata acagacgagg tcaacgatcc ctccctta 48
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taagggaggg atcgttgacc tcgtctgtta tgtaaaggat gcgtaggg 48
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttttttttta ccattttttt aacttatttg gttcagcgtt ccttt 45
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agtcagtgtg gaaaatctct agcagtcagt gt 32

Claims (10)

1.一种电化学发光生物传感电极的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成PdCuBP介孔纳米酶：称取DODAC，加水溶解后，依次加入NH4F溶液、H3BO3溶液、H2PdCl4溶液和CuCl2溶液；适当温度下搅拌加热一定时间，然后加入NH3·H2O，搅拌至无色，滴入NaH2PO2·H2O，逐渐加热至90℃—95℃后恒温一定时间；最后，加入DMAB，充分搅拌，溶液颜色由白色变为深褐色，离心，洗涤，即得PdCuBP介孔纳米酶；
(2)合成PdCuBP@luminol纳米球
在步骤(1)所得PdCuBP介孔纳米酶的悬浮液中，加入luminol分散液混合，在室温避光搅拌一定时间，然后离心去除未负载的luminol，得到并收集PdCuBP@luminol纳米球；
(3)制备hpDNA-DA
将hpDNA溶于EDC和NHS中，静置、活化hpDNA的羧基，然后滴入DA溶液，充分搅拌即可得所述hpDNA-DA；
(4)构建电化学发光生物传感电极
将PdCuBP@luminol纳米球的悬浮液滴在清洁处理后的金电极表面，干燥成膜，再将hpDNA-DA滴在金电极表面，孵育一定时间后，滴涂MCH阻断金电极表面的非特异性位点，即得电化学发光生物传感电极。
2.根据权利要求1所述的一种电化学发光生物传感电极的构建方法，其特征在于：步骤(2)中将所得PdCuBP@luminol纳米球的原液稀释5倍后备用，所述步骤(4)中hpDNA-DA的浓度为3μM。
3.根据权利要求2所述的一种电化学发光生物传感电极的构建方法，其特征在于：所述金电极的清洁处理方式为：采用氧化铝微粉和抛光垫抛光裸金电极，在超纯水超声浴冲洗后，用食人鱼溶液蚀刻一定时间，然后用去离子水清洗，并在氮气下干燥、改性；所述食人鱼溶液为H2SO4/H2O2＝3:1的混合液。
4.根据权利要求1～3任一项所述的一种电化学发光生物传感电极的构建方法，其特征在于：步骤(1)中在35℃搅拌6分钟后加入NH3·H2O；滴入NaH2PO2·H2O加热至95℃后恒温20min。
5.根据权利要求4所述的一种电化学发光生物传感电极的构建方法，其特征在于：步骤(3)中静置和搅拌的温度均为4℃。
6.根据权利要求5所述的电化学发光生物传感电极的构建方法，其特征在于：步骤(4)中孵育的温度为4℃，时间为8h；得到的电化学发光生物传感电极用洗涤液冲洗后在4℃保存备用，所述洗涤液为0.01M PBS，含0.05％(w/v)Tween-20,pH 7.41。
7.根据权利要求1～3、5、6任一项所述的方法得到的一种电化学发光生物传感电极。
8.包含如权利要求7所述电化学发光生物传感电极的电化学发光DNA传感器。
9.使用如权利要求7所述的电化学发光生物传感电极检测基因的方法，其特征在于：检测前，在反应缓冲液中制备Cas12a/crRNA复合体，随后向其中添加靶标DNA，适当温度下孵育一定时间，取孵育后得到的溶液滴在电化学发光生物传感电极的表面，适当温度下孵育一定时间，冲洗、修饰电极表面，在-0.2～0.6V电位扫描，扫描速率为0.1～0.15V/s，脉冲宽度为50～100ms，光电倍增管为800V，在PBS中进行电化学发光检测。
10.根据权利要求9所述的检测基因的方法，其特征在于：所述Cas12a/crRNA复合体的制备为：在包含1U RNase抑制剂，1×NEBuffer 2.1的反应缓冲液中，加入50nM crRNA和50nM Cas12a反应制得；在基因的检测过程中，所述Cas12a/crRNA复合体的浓度为50nM；每次孵育的温度为37℃，时间为1h。
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