CN103210092A

CN103210092A - 修饰的茎-环寡核苷酸介导的反转录和碱基间隔限制的定量pcr

Info

Publication number: CN103210092A
Application number: CN2011800383338A
Authority: CN
Inventors: 恒方·涂; 阿兹琳达·B·安瓦尔
Original assignee: National University of Singapore
Current assignee: National University of Singapore
Priority date: 2010-06-14
Filing date: 2011-06-13
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2031-06-13
Also published as: EP2580355A4; HK1187378A1; EP2580355B1; WO2011159256A1; SG185776A1; EP2580355A1; CN103210092B; JP2013530698A; US20130177915A1; US9850527B2; JP5851496B2

Abstract

提供了用于检测样品中靶RNA分子的方法。该方法包括：使用RT寡核苷酸反转录所述样品中包含的靶RNA以产生包含RT寡核苷酸和3’延伸区域的反转录产物，所述RT寡核苷酸包含含有被修饰或可被修饰为阻碍DNA聚合酶延伸的一个或多个核苷酸的茎-环部分和与靶RNA的下游部分互补的靶退火部分，所述靶退火部分位于茎-环部分的3’；使用下列引物扩增所述反转录产物以产生扩增产物：(i)第一扩增引物，其退火到所述反转录产物的3’延伸区域的下游部分，和(ii)第二扩增引物，其退火到与所述反转录产物互补的DNA链的交界部分，所述交界部分包含与RT寡核苷酸的3’部分和反转录产物中的3’延伸区域的5’部分互补的区域；以及检测所述扩增产物；其中所述茎-环部分在用于所述反转录的条件下采取茎-环结构但在用于所述扩增的条件下不采取茎-环结构且其中当所述茎-环部分包含可被修饰为阻碍DNA聚合酶延伸的一个或多个核苷酸时，该方法还包括在所述扩增之前修饰所述可被修饰的核苷酸。

Description

修饰的茎-环寡核苷酸介导的反转录和碱基间隔限制的定量PCR

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年6月14日递交的美国临时专利申请第61/354,683号的权益及来自该申请的优先权，在此通过引用将其内容全部并入本文。

发明领域

本发明涉及检测样品中的靶RNA，包括检测样品中的靶miRNA的方法。

发明背景

微小RNA(miRNA)是作为后生动物中基因表达的重要转录后调控因子发现(Bartel，2004)的小的非编码RNA(通常约22个核苷酸的长度)。虽然在各种生理过程中miRNA的表达是关键的(Harfe，2005；Miska，2005；Carthew，2006；Lindsay，2008)，但是miRNA的调控异常参与许多人类疾病例如癌症(Visone&Croce，2009)、肌肉疾患(Chen等人，2009a)和神经变性(Hebert&De Strooper，2009)的病理学。

近来，发现成熟的miRNA在血液中是非常稳定的，且因此具有作为潜在的人类疾病的非侵入性生物标志的广阔前景(Chen等人，2008；Mitchell等人，2008)。迄今为止，已在许多物种中鉴定到数百种独特的miRNA且这些miRNA中的每一种被预测为调控不同的靶基因(Bartel，2009)。随着通过计算机(in silico)预测和体内验证持续发现了更多的miRNA(Mendes等人，2009)，miRNA表达的表征不仅仍是用于评估miRNA的分布和调控的必要工具而且也是用于鉴定新型生物标志和潜在治疗靶的重要工具。

成熟miRNA可通过直接或间接方法检测。虽然直接检测方法(例如，荧光、比色和基于电学的方法)可将样品测量期间引入的变化最小化，但是这些方法受到测定灵敏度低和miRNA同源物之间区分差的限制(Hunt等人，2009中综述)。

间接检测方法主要包括RNA印迹、微阵列和反转录PCR(RT-PCR)。虽被广泛使用，但是RNA印迹和微阵列都是半定量的且受差的灵敏度的限制并需要大量的起始RNA。虽然微阵列提供miRNA的高通量检测和潜在的绝对定量的能力(Bissels等人，2009)，但是最近的研究表明，相比之下，实时PCR在灵敏度和特异性方面仍较为优越(Chen等人，2009b)。最近对用等温法测量miRNA的尝试已经取得了一些成功但却工作强度大(Cheng等人，2009；Yao等人，2009)。

迄今为止，实时RT-PCR仍是最灵敏和有效的定量RNA物质的方法。基于TaqMan探针的实时RT-PCR已被报道并广泛用于有效且特异性地检测miRNA。然而，由于额外的探针水解步骤，TaqMan测定与用于快速检测miRNA的快速热循环方案不相容。另外，随着通过深度测序(Bar等人，2008；Goff等人，2009)越来越多地鉴定到数以百计的候选miRNA，针对每一种新型miRNA的TaqMan探针的设计不仅成本过高而且在技术上也有挑战性并面临实际困难(Varkonyi-Gasic等人，2007)。

已进行不依赖荧光探针而改善miRNA检测的尝试(Raymond等人，2005；Shi&Chiang，2005；Sharbati-Tehrani等人，2008)，然而，这些测定通常包括多个样品处理步骤(Shi&Chiang，2005)并且受累于有限的动态检测范围(Raymond等人，2005)和/或针对同源miRNA的差的特异性(Raymond等人，2005；Shi&Chiang，2005；Sharbati-Tehrani等人，2008)。这些测定和一些其他TaqMan测定(Varkonyi-Gasic等人，2007；Yang等人，2009)的共同策略是使用通用的或共同的反向PCR引物和/或荧光探针以扩增和检测多种miRNA。在这些测定中，实时PCR的特异性仅通过正向PCR引物实现，这不足以区分许多同源miRNA。此外，尚待确定这些测定是否能够快速、多重且直接地检测miRNA而不需RNA分离。

虽然仍在确定多种基因组中微小RNA的数量，但是不同miRNA的数量被预期为多至几千。因为2006年对RNA干扰(A.Z.Fire&Craig C.Mello)授予了诺贝尔奖，所以对检测miRNA的测定的需求稳步增加。

因此，存在对检测样品中的靶RNA，包括miRNA的替代方法的需要。

发明概述

本发明提供了检测样品中靶RNA分子的方法。靶RNA分子可以是任何RNA分子，且在某些实施方式中可以是miRNA。

本发明的方法使用反转录(RT)和聚合酶链式反应(PCR)扩增的组合以从包含靶RNA的样品中特异性地鉴定该靶RNA。这些方法使用了修饰的茎-环RT寡核苷酸和半嵌套式PCR引物的组合以特异性地选择靶RNA。RT寡核苷酸内的修饰的核苷酸的使用为DNA聚合酶提供了阻碍以防止扩增反应期间的错误引发。因此，可减少或甚至消除对于该扩增反应的RT寡核苷酸遗留，同时可甚至在样品中存在miRNA同源物下增强针对靶miRNA的特异性。

本发明的方法可提供对靶RNA物质，例如来自前体miRNA和来自同源家族成员的成熟miRNA的特异且快速的检测。使用快速热循环测量法(fast thermo-cycling profile)(每个循环10秒钟)尚且保持特异性和灵敏性可能是可行的。

这些方法还可以以多重形式使用，所述多重形式对于直接从细胞裂解物筛选和检测miRNA而不需要费力的总RNA分离可能是有用的。

本发明的方法可被调整为适合现有的实时PCR方法。实时PCR已成为用于基因表达测量的标准方法且已成为用于基因表征(gene profiling)和用于生物标志发现的极为有用技术。

这些方法可能是经济、高性能、易于使用、快速和灵敏的。

因此，一方面，本发明提供了用于检测样品中的靶RNA分子的方法，该方法包括：使用RT寡核苷酸反转录样品中包含的靶RNA以产生包含RT寡核苷酸和3’延伸区域的反转录产物，所述RT寡核苷酸包含含有被修饰或可被修饰为阻碍DNA聚合酶延伸的一个或多个核苷酸的茎-环部分和与靶RNA的下游部分互补的靶退火部分，所述靶退火部分位于茎-环部分的3’；使用下列引物扩增所述反转录产物以产生扩增产物：(i)第一扩增引物，其退火到所述反转录产物的3’延伸区域的下游部分，和(ii)第二扩增引物，其退火到与所述反转录产物互补的DNA链的交界部分(interfaceportion)，所述交界部分包含与RT寡核苷酸的3’部分和反转录产物中的3’延伸区域的5’部分互补的区域；以及检测所述扩增产物；其中所述茎-环部分在用于所述反转录的条件下采取茎-环结构但在用于所述扩增的条件下不采取茎-环结构，且其中当所述茎-环部分包含可被修饰为阻碍DNA聚合酶延伸的一个或多个核苷酸时，该方法还包括在所述扩增之前修饰所述可被修饰的核苷酸。

在某些实施方式中，被修饰或可被修饰为阻碍DNA聚合酶延伸的一个或多个核苷酸位于茎-环部分的环内。

在某些实施方式中，茎-环部分包含被修饰为阻碍DNA聚合酶延伸的一个或多个核苷酸。例如，所述茎-环部分的环可包含用脂族碳链例如C6脂族链修饰的核苷酸。

可选择地，在某些实施方式中，茎-环部分包含可被修饰为阻碍DNA聚合酶延伸的一个或多个核苷酸且该方法还包括在扩增之前修饰该可被修饰的核苷酸。例如，该可被修饰的核苷酸可以是dU且所述修饰可包括用尿嘧啶-DNA糖基化酶处理。在另一个实例中，所述茎-环部分的环可包含一个或多个核糖核苷酸且所述修饰可包括用RNA酶处理。

在某些实施方式中，靶RNA是miRNA。

另一方面，本发明提供了用于检测样品中的靶miRNA分子的方法，该方法包括：使用RT寡核苷酸反转录样品中包含的靶miRNA以产生包含RT寡核苷酸和3’延伸区域的反转录产物，所述RT寡核苷酸包含含有dU核苷酸的茎-环部分和与靶miRNA的下游部分互补的靶退火部分，所述靶退火部分位于茎-环部分的3’；通过用尿嘧啶-DNA糖基化酶处理修饰该dU核苷酸；使用下列引物扩增所述反转录产物以产生扩增产物：(i)第一扩增引物，其退火到所述反转录产物的3’延伸区域的下游部分，和(ii)第二扩增引物，其退火到与所述反转录产物互补的DNA链的交界部分，所述交界部分包含与RT寡核苷酸的3’部分和反转录产物中的3’延伸区域的5’部分互补的区域；以及检测所述扩增产物；其中所述茎-环部分在用于所述反转录的条件下采取茎-环结构但在用于所述扩增的条件下不采取茎-环结构。

在本发明的方法的某些实施方式中，扩增引物具有当与DNA杂交时显示出热稳定性的核苷酸作为3’末端核苷酸。例如，当与DNA杂交时显示出热稳定性的核苷酸可被锁定在N-型呋喃糖构象中。

在某些实施方式中，包括其中RNA是miRNA的实施方式中，当退火到反转录产物时第一扩增引物的3’端位置与当退火到DNA链时第二扩增引物的3’端位置之间在扩增产物的序列中的距离是-4至5个核苷酸。

在某些实施方式中，RT寡核苷酸的靶退火部分为5至15个核苷酸的长度。

在某些实施方式中，茎-环的茎部分是4至6个核苷酸的长度且茎-环的环部分是4至12个核苷酸的长度。

在某些实施方式中，所述第二扩增引物退火到与RT寡核苷酸的茎-环部分的13至24个核苷酸、RT寡核苷酸的靶退火部分的5至15个核苷酸以及反转录产物的3’延伸区域的5’端处的1至5个核苷酸互补的序列。

在某些实施方式中，第一扩增引物为12至27个核苷酸的长度。

在某些实施方式中，所述检测包括用荧光嵌入染料检测。例如，所述荧光嵌入染料可以是SYBR Green或Eva Green。

经结合附图查阅本发明的具体实施方式的下列描述，本发明的其他方面和特征将对于本领域普通技术人员变得明显。

附图简述

仅通过举例的方式阐述了本发明的实施方式的表格和附图如下。

表1.使用茎-环或线性实时RT-PCR区分成熟miRNA和前体miRNA。用茎-环或线性RT寡核苷酸反转录10⁹拷贝的每种合成的成熟miRNA或体外转录的前-miRNA并使用相同的PCR引物定量。成熟miRNA和前体miRNA之间的区别被表示为ΔCt值(ΔCt＝Ct_前体-Ct_成熟)。

表2.用于miRNA前体的克隆和实时RT-PCR的引物序列。

表3.用于检测成熟miRNA的引物序列。

表4.茎-环RT寡核苷酸和线性RT寡核苷酸的比较。采用最稳定的二级结构来计算线性RT寡核苷酸的ΔG。对于每种miRNA的茎-环RT寡核苷酸和线性RT寡核苷酸之间的序列差异被加下划线。

表5列出了表1至4和附图中列出的各个序列，为每个序列指定了一个SEQ ID NO。

图1是提供了本发明的方法的反转录阶段概览的图解表示。

图2是提供了本发明的方法的扩增阶段概览的图解表示。

图3.提供了本发明的方法的实施方式概览的图解示意图。

图4.DNA阻碍物(dU)抑制DNA聚合酶的DNA延伸。

图5.用于设计半嵌套式实时RT-PCR测定的示意图。Pf，正向引物；Pr，反向引物。

图6.第一扩增引物(Pf)和第二扩增引物(Pr)的布置，示出了空隙或重叠。

图7.环尺寸的比较。小环(4个碱基)表现可与较大环(12个碱基)相当。

图8.用于设计半嵌套式实时RT-PCR测定的流程图和实例。

图9.miR-21半嵌套式实时RT-PCR测定的表现。(A、B)与标准循环方案相比在快速循环条件下通过实时PCR测定扩增miR-21cDNA(10⁸至10拷贝)。用miR-21RT寡核苷酸反转录(C、D)合成的miR-21miRNA(10⁹至10²拷贝)的稀释液，(E、F)来自A172细胞的总RNA(100ng至1pg)的稀释液，和(G、H)从U251细胞(100,000至10个细胞)的稀释液分离的总RNA。通过实时PCR扩增cDNA样品(10％v/v)连同无模板对照(NTC)。示出了该测定的扩增图(A、C、E、G)和标准曲线(B、D、F、H)。标准曲线被绘制为Ct对Log(每个RT的起始材料)。

图10.对掺入U251总RNA的合成的let-7d和let-7e miRNA的稀释液的定量。对合成的let-7d(A)或let-7e(B)的标准稀释液(10⁹、10⁸和10⁷拷贝)掺混100ng的从U251细胞分离的总RNA。用let-7d或let-7e RT引物反转录对照miRNA稀释液或掺入了总RNA的miRNA稀释液。通过实时PCR扩增cDNA样品(10％v/v)。标准曲线被绘制为Ct对Log(每个PCR反应的输入cDNA)。

图11.人let-7同源物的区分。A)八个let-7家族的miRNA的序列比对。B)特异性半嵌套式实时RT-PCR测定对每种let-7miRNA的相对检测(％)。

图12.miR-24(A、B)、miR-92(C、D)和miR-218(E、F)实时RT PCR测定的动态范围和效率。用miRNA特异性的RT寡核苷酸反转录合成的miR-24、miR-92和miR-218的标准稀释液。通过实时PCR扩增cDNA样品(10％v/v)连同无模板对照(NTC)。示出了该测定的扩增图(A、C、E)和标准曲线(B、D、F)。标准曲线被绘制为Ct对Log(每个PCR反应的输入cDNA)。

图13.使用并入dU的RT寡核苷酸的半嵌套式实时RT-PCR测定的特异性。A)dT RT寡核苷酸和dU RT寡核苷酸的序列比较。dU残基被加下划线。B)let-7a测定对let-7fmiRNA的相对检测。使用100nM或250nM的dT、dU1或dU2RT寡核苷酸反转录10⁹拷贝的let-7a或let-7f。用或不用UDG处理cDNA样品(10％v/v)并使用let-7a特异性PCR引物扩增。计算let-7f miRNA的非特异性扩增并将其表示为相对检测的％。误差条表示一式四份的测量值的标准差。UDG处理的和未处理的样品之间的相对检测的显著性差异通过Student t-检验(Student’s t-test)计算。**p＜0.001。

图14.miRNA实时RT-PCR产物的凝胶电泳。用10⁶拷贝的合成的miRNA(a)、10ng U251总RNA(b)或无模板对照(c)进行实时RT-PCR测定。从10pg的U251总RNA扩增U6。通过4％琼脂糖凝胶分辨扩增产物和25bp标准参照物(M)。产物大小：miR-7(37bp)、miR-21(38bp)、miR-218(36bp)、let-7f(45bp)、let-7g(42bp)、let-7i(38bp)和U6(94bp)。

图15.U251细胞中GDNF调控的miRNA表达。通过半嵌套式实时RT-PCR对所选择的成熟miRNA(A、B)的调控定量并表示为相对于未刺激的对照样品的倍数变化。误差条表示一式三份的测量值的标准差。处理的样品和对照样品之间的基因表达的显著性差异通过Student t-检验计算。*p＜0.01；**p＜0.001。

图16.并入dU的RT寡核苷酸的UDG处理阻止其用作RT之后的PCR引物。A)用于miR-21的标准(dT)和并入dU(dU)的RT寡核苷酸的序列。用dT(B)或dU(C)RT寡核苷酸反转录合成的miR-21(10⁹拷贝)。然后用(红色扩增曲线)或不用UDG(蓝色扩增曲线)处理cDNA样品(10％v/v)并用正向和反向引物(+Pr)或单独的正向引物(-Pr)进行实时PCR。D)经或未经RNA酶处理的环中具有RNA序列的RT寡核苷酸。

图17.对六个GDNF调控的miRNA的多重定量。通过24种miRNA的多重实时RT-PCR测定对miR-7(A)、miR-21(B)、miR-218(C)、let-7f(D)、let-7g(E)和let-7i(F)的表达定量。将对这些miRNA的调控表示为相对于未刺激的对照样品的倍数变化。误差条表示一式三份的测量值的标准差。处理的样品和对照样品之间的基因表达的显著性差异通过Student t-检验计算。*p＜0.01；**p＜0.001。

图18.U251人成胶质细胞瘤细胞中GDNF-引起的信号传导的活化。用2％SDS裂解对照U251细胞和GDNF刺激的U251细胞。使用microBCA蛋白质测定(Pierce，Rockford，IL，USA)对总蛋白质裂解物定量。通过SDS-PAGE分离总蛋白(10μg)并用针对磷酸ERK1/2的抗体(Cellphospho-Signaling Technologies，Danvers，MA，USA)探测。在蛋白质印迹脱除缓冲液(Western Blot Stripping Buffer)(Pierce)中脱除印迹并用总ERK1/2(Cell Signaling Technologies)重新探测以验证等量上样。对化学发光成像并通过ChemiDoc系统(Bio-Rad)分析。A)U251细胞中GDNF(100ng/ml)活化ERK1/2MAPK的时间进程。B)MEK抑制剂U0126(5μM)预处理抑制GDNF-引起的ERK1/2MAPK活化。

图19.对来自细胞裂解物的miRNA的直接和多重检测。直接裂解以多种密度(每孔10、100、1000、10000和100000个细胞)培养在96-孔板中的U251细胞并在包含24种miRNA RT寡核苷酸的反应混合物中反转录。通过(A)miR-21和(B)miR-222实时PCR测定扩增从分离的RNA或细胞裂解物中产生的cDNA样品(2.5％v/v)。对于分离的RNA的标准曲线被绘制为Ct对Log(每次RT的细胞数)。RI；RNA酶抑制剂。

图20.通过单重和多重实时RT-PCR对GDNF-调控的miRNA定量。通过单一的miRNA-特异性的RT寡核苷酸(黑线)或24-重RT寡核苷酸(红线)对总U251RNA样品反转录。然后对cDNA样品定量以表示为(A)miR218和(B)let7i。将对这些miRNA的调控表示为相对于未刺激的对照样品的倍数变化。

详述

目前提供了用于检测样品中的RNA的方法。该方法可用来检测任何RNA物质，且可用于检测成熟miRNA，包括从包含该miRNA的细胞直接检测。

该方法是一种RT-PCR(反转录-PCR)扩增方法，其将被设计成具有茎-环二级结构和被修饰为在扩增反应期间阻碍DNA聚合酶的核苷酸的RT寡核苷酸引物与扩增反应中的一对半嵌套扩增引物组合在一起。

图1和2提供了该方法概览的图解表示；指出了所示出的每个核酸分子的5’和3’端。图1表示反转录反应且图2表示扩增反应。

在方法的反转录阶段(图1)，初始反应混合物100包含待被反转录的靶RNA102，和充当反转录反应的引物的反转录(RT)寡核苷酸104。RT寡核苷酸104具有茎-环部分106和靶退火部分108。在反转录反应所用的条件，例如约37℃的反应温度下，茎-环部分106处于具有茎-环结构的退火构象中。茎-环部分106包含被修饰或可被修饰为阻碍DNA聚合酶延伸的一个或多个核苷酸110，如图1所示。

在反转录反应A1中，靶退火部分108退火到靶RNA102的下游部分112并然后通过反转录酶延伸以产生包含RT寡核苷酸104和3’延伸区域116的反转录产物114。

在方法的扩增阶段(图2)，初始反应混合物200包含反转录产物114，第一扩增引物202和第二扩增引物204。另外，初始反应混合物200还可包含从反转录反应遗留的某些RT寡核苷酸104，这些RT寡核苷酸104还因而可充当引物。在扩增反应所用的条件，例如约50℃或更高的反应温度下，茎-环部分106处于不具有茎-环结构的解链构象，如图2所示。

在第一轮扩增B1中，反转录产物114充当模板且第一扩增引物202结合到反转录产物114的下游部分206。DNA聚合酶延伸第一扩增引物202直到到达核苷酸110，阻碍进一步延伸，从而产生互补DNA链208，该互补DNA链208与反转录产物互补且具有在核苷酸110的互补位置附近的3’端。互补DNA链208具有交界部分210，交界部分210包含与在RT寡核苷酸104的3’端和3’延伸区域116的5’端之间的交界形成的反转录产物114中的交界互补的区域。

在第二轮扩增B2中，第二扩增引物204退火到交界部分210处的互补DNA链208，且互补DNA链208充当DNA聚合酶延伸的模板以产生DNA链212。由于第二扩增引物204由此从互补链208的末端嵌入，DNA链212具有反转录产物114的一部分序列，但是比反转录产物114短。

在随后轮次的扩增B3中，第一扩增引物202和第二扩增引物204将退火到可获得的DNA模板链。当第一扩增引物202退火到DNA链212时，所形成的互补DNA链208’比互补DNA链208短。因此DNA链212和互补DNA链208’形成扩增产物214。虽然一些更长的DNA链例如反转录产物114和互补DNA链208将用作模板而存在，但是随着扩增反应通过多轮反应而推进，由于包括核苷酸110和由于第二扩增引物204的嵌套，产生更多的扩增产物214。

图3中提供了该方法的另一种图解描绘。图4描绘了阻碍DNA聚合酶的被修饰的核苷酸对扩增反应的特异性的影响。

在一些之前的报道(Chen等人，2005；Raymond等人，2005；Shi&Chiang，2005；Duncan等人，2006；Varkonyi-Gasic等人，2007；Sharbati-Tehrani等人，2008；Yang等人，2009)中，反向扩增产物被设计为直接退火到RT寡核苷酸中的序列。为实现这些方法中的特异性，需要独特的miRNA-特异性的荧光探针来区分靶与非特异性扩增子(Chen等人，2005)。在某些基于TaqMan的测定的情形中，通过使用一种共同的检测探针以获得通量便利性而损害了这种特异性。相比之下，在如本文所述的方法中，增加的特异性可通过设计半嵌套式反向PCR引物实现，所述半嵌套式反向PCR引物被设计为退火到反转录寡核苷酸引物的一部分和反转录产物的3’延伸区域的一部分。

与定量实时PCR方法相比，本文描述的方法不需要使用荧光探针，因为半嵌套式反向扩增引物增强了测定的特异性，且可允许在快速热循环条件下使用荧光嵌入染料例如SYBR Green I对少至亚介摩尔(subzeptomole)量的miRNA定量。

因此，一方面提供了用于检测样品中的靶RNA的方法。

该方法包括反转录反应。使用RT寡核苷酸作为反应引物对包含靶RNA的样品进行反转录反应。

如将应理解的，RT寡核苷酸因此充当反转录酶的引物，所述反转录酶使用靶RNA作为模板并延伸RT寡核苷酸以形成反转录产物，该反转录产物包含该反转录产物的5’端处的RT寡核苷酸和该反转录产物的3’端处的延伸区域。

RT寡核苷酸包含茎-环部分和位于所述茎-环部分的3’的靶退火部分。

因此，反转录反应中使用的RT寡核苷酸是被设计为具有包含茎-环结构的5’部分的DNA寡核苷酸。如将理解的，茎-环结构是具有一起配对以形成短的双链体DNA茎的互补碱基序列的自身退火结构。所述环由介于形成所述茎的两个互补区域之间的核苷酸形成，且该环在茎的一端形成单链部分，连接形成双链茎的两个部分。

茎-环部分被设计为在用于反转录反应的条件下，意思是在包括缓冲液、盐和温度条件及将影响DNA二级结构的任何其他参数的条件下采取茎-环结构，所述条件被选择为允许反应中所用的反转录酶进行反转录。如下文讨论的，茎-环部分还被设计为在用于扩增反应的条件下解链，或不采取茎-环结构。因此，茎部分的序列可被选择为在包括将相关的缓冲条件考虑在内的用于反转录的温度下退火，但不在再次包括将相关的缓冲条件考虑在内的用于扩增反应的温度下退火。例如，茎-环部分在37℃或更低的温度下可能采取茎-环结构，但在约50℃或更高的温度下可能不退火形成茎-环结构。

RT寡核苷酸的茎-环部分包括DNA聚合酶阻碍位置。DNA聚合酶阻碍位置是茎-环区域中当线性化和不采取茎-环结构时充当延伸DNA聚合酶(elongating DNA polymerase)的阻碍物的位置，所述DNA聚合酶使用反转录产物作为模板在扩增反应中延伸扩增引物。

DNA阻碍位置可置于RT寡核苷酸的茎-环部分内的任何地方。在一个实施方式中，DNA阻碍位置置于茎-环部分的环内。

DNA阻碍位置可以是阻碍延伸DNA聚合酶延伸引物的对茎-环区域的任何修饰。例如，DNA阻碍位置可以是不能被DNA聚合酶读码的修饰的核苷酸，例如，使用DNA核苷酸或具有附加的化学基团的修饰的DNA核苷酸的衍生物。

所述修饰可以是修饰的核苷酸的核酸碱基的结构改变；也就是说其可以是DNA聚合酶不能用作模板或经过其延伸的A、G、C或T的类似物。

所述修饰可以是为DNA阻碍位置处的核苷酸上的取代基的基团，包括非核苷酸基团，且可以是侧基或可被连接到两个核苷酸使得该基团形成寡核苷酸骨架的一部分。例如，DNA阻碍位置可位于环区域且可包括连接两个核苷酸的脂族碳链，例如C6脂族链。因此，修饰可包括并入非核苷酸基团，包括并入到骨架中，以阻碍DNA聚合酶的延伸。

在某些实施方式中，DNA阻碍位置可能已被修饰以当向转录反应中添加RT寡核苷酸时阻碍DNA聚合酶。例如，可使用修饰的核苷酸2-氨基-5-(2’-脱氧-b-D-呋喃核糖基)吡啶-5’-三磷酸(d*CTP)或5-(2’-脱氧-b-D-呋喃核糖基)-3-甲基-2-吡啶酮-5’-三磷酸(d*TTP)。已表明这两种修饰的核苷酸在由Taq聚合酶催化的PCR中显示出强烈抑制(Guo等人，1998)。

在其他实施方式中，DNA阻碍位置可以是经处理可被修饰以阻碍DNA聚合酶的核苷酸或基团。也就是说，可被修饰的核苷酸或基团当被加入到RT反应时被进一步处理以在DNA阻碍位置形成修饰的核苷酸。

例如，在一个实施方式中，可被修饰的核苷酸是dU核苷酸，用尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)对其进行处理。在另一个实施方式中，可被修饰的核苷酸可以是核糖核苷酸，用RNA酶对其进行处理。在两种情况下，修饰处理产生修饰的核苷酸，包括RT寡核苷酸的裂解，从而有效地阻止DNA聚合酶延伸。

在扩增反应之前对可被修饰的核苷酸进行修饰，且可在RT反应之后进行。

茎-环部分可具有任何合适的长度以在反转录期间提供茎-环结构并在扩增反应期间解链。例如，整个茎环结构可以是12至24个核苷酸的长度。在某些实施方式中，茎-环的茎部分可以是4或6个核苷酸的长度。在某些实施方式中，茎-环的环部分可以是4至12个核苷酸的长度。对形成茎环结构的寡核苷酸的设计是已知的，且将计算给定序列的退火温度或将设计用于特定退火条件的茎-环结构的计算机程序是可获得的，例如MFOLD软件。如以上陈述的，茎部分的序列可被设计为在用于反转录反应的温度下退火，而在用于扩增反应的温度下解链。

如以上陈述的，RT寡核苷酸包含靶退火部分。靶退火部分位于茎-环部分的3’并被设计为与靶RNA的下游部分互补。在某些实施方式中，RT寡核苷酸的靶退火部分为5至15个核苷酸的长度。

因此，在反转录反应之后，产生反转录产物，所述反转录产物包含该RT产物的5’端处的RT寡核苷酸，和RT寡核苷酸的3’处的与靶RNA的下游部分互补的延伸区域，该延伸区域位于与RT寡核苷酸的靶退火部分互补的区域的下游(或位于其3’)。

对被反转录的样品进行扩增反应。

所使用的PCR方法可包括如本领域已知的实时PCR方法。这些方法包括在产生扩增产物时使用荧光探针检测该产物。

如将应理解的，扩增反应使用一对扩增引物，正向引物和反向引物进行。

第一扩增引物(即，正向引物)被设计为退火到RT产物的3’延伸区域的下游部分。该引物可以是适合退火到RT产物的3’延伸区域的期望部分的任何合适的长度。引物长度可部分地由所选择的退火温度和条件决定。对待退火到模板核酸内的期望序列的扩增引物的设计是已知的。在某些实施方式中，第一扩增引物为12至27个核苷酸的长度。

第二扩增引物(即，反向引物)被设计为退火到与RT产物互补的DNA链的交界部分。互补DNA链的交界部分包括与RT产物从RT寡核苷酸过渡到3’延伸区域的点互补的区域。因此，所述交界部分包含与RT寡核苷酸的3’部分和RT产物中的3’延伸区域的5’部分互补的区域。在某些实施方式中，第二扩增引物被设计为退火到与RT寡核苷酸的茎-环部分的13至24个核苷酸、RT寡核苷酸的靶退火部分的5至15个核苷酸以及反转录产物中的3’延伸区域的5’端处的1至5个核苷酸互补的序列。在某些实施方式中，第二扩增引物为13至24个核苷酸的长度。

在某些实施方式中，包括其中RNA为miRNA的实施方式中，当退火到反转录产物时第一扩增引物的3’端位置和当退火到DNA链时第二扩增引物的3’端位置之间在扩增产物的序列中的距离为-4至5个核苷酸，意思是在第一扩增引物的3’端退火到RT产物的地方和第二扩增引物的3’端退火到与RT产物互补的DNA链的地方之间可能存在1至4个核苷酸的重叠，或可能存在1至5个核苷酸的空隙，或当退火到各自的模板核酸上时在扩增引物的3’端之间可能存在对准。

扩增引物中的任何一个或两者都可具有当与DNA杂交时显示出热稳定性的核苷酸作为3’末端核苷酸。与不包括该热稳定性核苷酸的DNA相比，包括该核苷酸允许使用增加的解链温度，促使扩增引物优先退火到DNA。例如，当与DNA杂交时显示出热稳定性的核苷酸可被锁定在N-型呋喃糖构象中。

选行扩增反应并产生扩增产物。

一旦扩增产生，则其被检测到。

检测扩增产物可包括任何检测方法，包括例如将扩增产物与具有固定的互补序列的微阵列杂交，使用例如凝胶电泳的技术的尺寸分离或使用实时PCR方法以当扩增产物被产生时检测所述扩增产物。

检测可包括用荧光嵌入染料检测扩增产物。例如，所述荧光嵌入染料可以是SYBR Green或Eva Green。

在该方法的一个示例性实施方式中，提供了用于检测样品中的靶miRNA分子的方法，该方法包括：使用RT寡核苷酸反转录包含该靶miRNA的样品以产生包含RT寡核苷酸和3’延伸区域的反转录产物，所述RT寡核苷酸包含含有dU核苷酸的茎-环部分和与靶miRNA的下游部分互补的靶退火部分，所述靶退火部分位于茎-环部分的3’；通过用尿嘧啶-DNA糖基化酶处理修饰该dU核苷酸；使用下列引物扩增包含所述反转录产物的样品以产生扩增产物：(i)第一扩增引物，其退火到所述反转录产物的3’延伸区域的下游部分，和(ii)第二扩增引物，其退火到与所述反转录产物互补的DNA链的交界部分，所述交界部分包含与RT寡核苷酸的3’部分和反转录产物中的3’延伸区域的5’部分互补的区域；以及检测扩增产物；其中所述茎-环部分在用于反转录的条件下采取茎-环结构但在用于扩增的条件下不采取茎-环结构。

通过下列非限制性实施例进一步例示了这些方法。

实施例

实施例1

使用并入脱氧尿苷的寡核苷酸和半嵌套引物通过实时RT-PCR对成熟微小RNA的高性能定量

材料和方法

成熟miRNA和前体miRNA模板和序列分析。通过Proligo(Sigma，StLouis，MO，USA)或Integrated DNA Technologies(Coralville，IA，USA)合成成熟的miRNA。使用带T7启动子测序标签的PCR引物(T7promotersequenced tagged PCR primer)克隆前体miRNA(表2)。通过测序验证纯化的PCR产物并根据厂家说明使其经受用于前体miRNA的体外转录的MEGAscript T7转录试剂盒(Ambion，Austin，TX，USA)的处理。通过分光光度法对成熟miRNA和前体miRNA定量并将其稀释成期望的浓度以用作标准品。使用版本8.0的Vector NTI软件(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)进行miRNA同源物的序列比对和系统发生分析。

细胞培养和总RNA分离。将人成胶质细胞瘤细胞系A172和U251培养在37℃下的5％CO2加湿的培养箱中的补充有10％胎牛血清(FBS，Sigma)和抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的DMEM中。将U251细胞以每孔200,000个细胞接种在六孔板中，持续24小时并用无FBS的DMEM培养基孵育12-16h。然后在DMEM中用100ng/ml的GDNF刺激细胞，持续确定的时间段。对于MEK抑制剂的研究，在GDNF刺激之前在DMEM中用5μM U0126(Promega，Madison，WI，USA)预孵育细胞45min。根据厂家说明使用TRIzol试剂(Invitrogen)在20μg/ml的直链丙烯酰胺(Ambion)的存在下从未处理的或GDNF处理的成胶质细胞瘤细胞中分离总RNA。然后使用分光光度法对所提取的RNA样品定量并通过变性RNA凝胶电泳检查完整性。

反转录(RT)。用无RNA酶的DNA酶I(Promega)在37℃下处理总RNA样品30min。在80℃下持续5min使DNA酶失活。对于初级miRNA和前体miRNA的RT，首先在80℃下在150nM的基因特异性反向引物的存在下加热100ng的DNA酶I处理的总RNA或体外转录的前体miRNA标准品的稀释液5min，在冰上速冷并如厂家(Invitrogen)详细说明的进行反转录[1x缓冲液、dNTP(10mM)、二硫苏糖醇(DTT)、RNA酶抑制剂、Thermoscript(15U)]。在60℃下进行反转录45min并通过在85℃下进一步孵育5min终止。对于前体的检测，用预先验证的基因特异性引物如之前报道的(Jiang等人，2005)进行RT和实时PCR。

对于成熟miRNA的RT，在10μl的总体积中使用100U的ImpromII(Promega)和100nM的茎-环或线性RT寡核苷酸在42℃下对100ng的DNA酶I处理的总RNA或合成的人成熟miRNA标准品的稀释液进行反转录，持续30min。通过在70℃下加热5min终止反应。对于24种成熟miRNA的多重RT，在40μl的总体积中使用400U的Improm II和100nM的每种RT寡核苷酸(总共2.4μM)在42℃下对100ng的DNA酶I处理的总RNA样品进行反转录，持续30min。然后将cDNA样品用于使用miRNA-特异性引物的实时PCR。表3中列出了用于RT和实时PCR的引物。表4中列出了线性RT寡核苷酸。

尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG)处理。通过Integrated DNA Technologies合成具有脱氧尿苷(dU)并入的RT寡核苷酸。如上所述地进行反转录。然后用5U UDG(New England Biolabs，Beverley，MA，USA)在37℃下处理cDNA样品10min。在95℃下持续10min使反应失活并进行实时PCR。

不经RNA分离检测miRNA。用PBS洗涤96-孔板中各种细胞密度(每孔10至10⁵细胞)的U251细胞一次，裂解并在存在或不存在RNA酶抑制剂SUPERase-In(1U/μl，Ambion)下在42℃下在具有40μl的包含0.5％Triton X-100(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)、400U Improm II(Promega)和100nM的每种RT寡核苷酸(总共2.4μM)的RT混合物的孔中直接反转录30min。为了比较，从相同密度的细胞中分离总RNA并在相同的RT混合物中反转录。然后将cDNA样品用于实时PCR。

实时PCR。使用SYBR Green I在CFX96系统(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上进行实时PCR。根据之前的报道(Schmittgen等人，2004；Jiang等人，2005)对前体miRNA和U6snRNA进行实时PCR。在95℃下最初预变性10min后，接下来对miRNA cDNA进行快速热循环：50循环的95℃下变性5s以及在60℃下退火/延伸5s。在包含2.5mM MgCl2、100nM的每一种引物和1.25U KlearTaqDNA聚合酶(KBiosciences，Hoddesdon，UK)的1XXtensaMix-SG^TM(BioWORKS，Singapore)中以25μl的总体积对1μl的每一种cDNA样品进行实时PCR。使用CFX管理软件(Bio-Rad)自动计算循环阈值(Ct)。若可应用的话，将所有miRNA表达水平标准化成U6snRNA表达。

实时RT-PCR测定效率和特异性的计算。如之前所述(Too，2003)地确定实时RT-PCR的效率和特异性。简单地讲，对miRNA的10倍稀释液进行实时RT-PCR。通过绘制合成的miRNA稀释液的Ct对Log(拷贝数)的曲线获得miRNA的标准曲线。通过(10^1/S-1)×100％计算测定效率，其中S为标准曲线的斜率。对于特异性的计算，通过实时RT-PCR对相同量(每RT10⁹拷贝)的完全匹配的miRNA和错配的miRNA定量。然后将ΔCt计算为Ct_{完全匹配的miRNA}-Ct_{错配的miRNA}。然后通过10^ΔCt/S×100％计算错配的miRNA的相对检测。

结果

半嵌套式实时RT-PCR测定的概括。在本研究中，我们已设计了用于通过半嵌套式实时RT-PCR特异性检测成熟miRNA的简单方法(图5)。起初，我们注意到在一些之前的报道(Chen等人，2005；Raymond等人，2005；Shi&Chiang，2005；Duncan等人，2006；Varkonyi-Gasic等人，2007；Sharbati-Tehrani等人，2008；Yang等人，2009)中，反向PCR引物被设计为直接退火到RT寡核苷酸中的序列。为实现特异性，需要独特的miRNA-特异性的荧光探针来区分靶与非特异性扩增子(Chen等人，2005)。在某些基于TaqMan的测定的情形中，通过使用一种共同的检测探针以获得通量便利性而损害了这种特异性。我们假设可通过设计半嵌套式反向PCR引物代替使用共同的或通用的反向PCR引物实现增加的特异性。图6展示了该方法中在双链模板上的每条引物的3’端之间具有不同距离的正向和反向引物的设计。图7表明较小的4个核苷酸的环与较大的12个核苷酸的环一样有效。

为检验该假设，先通过在RT期间采取稳定的茎-环二级结构的RT寡核苷酸在42℃下对成熟miRNA进行反转录。然后使用带标签的正向引物(Pf)和半嵌套式反向引物(Pr)扩增cDNA样品，其中3-5个核苷酸延伸在RT寡核苷酸之外。使用SYBR Green I在实时PCR中监测cDNA样品的扩增。可向RT寡核苷酸并入脱氧尿苷(dU)残基并随后在扩增前在37℃下用尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)处理所产生的cDNA。为辅助用户确定任何实时RT-PCR测定的设计，使用hsa-miR-21(下文的miR-21)作为例子呈现了流程图(图8)。

半嵌套式实时RT-PCR测定的性能。首先使用miR-21cDNA稀释液在快速(每个循环10s)和标准(每个循环75s，15s变性和60s退火/延伸)的热循环测量法下评价半嵌套式实时RT-PCR测定的性能。该测定在两种循环测量法下都显示出极佳的动态范围(dynamic range)和线性度(linearity)(图9A、B)，表明该测定对于快速检测miRNA的稳健性。为评价RT和PCR的性能，对合成的miR-21稀释7个数量级(每RT10⁹至100拷贝)并通过半嵌套式实时RT-PCR定量。标准曲线的极佳线性度表明miR-21测定具有至少7log的宽的动态范围且能够检测每RT反应少至100拷贝(亚介摩尔)(图9C、D)。

接下来我们检查了该测定在检测来自总RNA样品的miRNA方面的性能。使用miR-21半嵌套式实时RT-PCR测定对100ng至1pg的总RNA稀释液(图9E、F)和从100,000至10个细胞中分离的总RNA(图9G、H)定量。标准曲线再次表现出极佳的线性度(图9F、H)，表明该测定能够可靠地检测来自微量(1Pg)总RNA或来自少至10个细胞的miRNA。总RNA掺入实验进一步支持了该测定对不经RNA分级的来自总RNA的成熟miRNA定量的能力。此处，用不同量的合成let-7d或let-7e miRNA掺混来自U251细胞的不包含let-7d和let-7e的100ng总RNA(数据未示出)。总RNA的存在不影响成熟let-7d/let-7e miRNA的定量(图10)。

还评价了用于三种其他miRNA(miR-24、miR-92和miR-218)的半嵌套式实时RT-PCR测定(图12)。所有三种测定都表现出极佳的动态范围(至少7log)、灵敏度(每RT10³-10⁴拷贝)和RT-PCR效率(88％-100％)。此外，这些测定显示了来自合成的标准品和总RNA样品的靶miRNA的特异性扩增。通过凝胶电泳验证扩增子的大小(图14)。

成熟miRNA相对于前体miRNA的特异性检测。使用9种成熟miRNA及其对应的前体(miR-21、miR-7-1、miR-7-2、miR-218-1、miR-218-2、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i)研究了半嵌套式实时RT-PCR测定在区分成熟miRNA与前体miRNA方面的能力。为了对比，我们还评价了RT期间不形成有利的二级茎-环结构的线性RT寡核苷酸(ΔG≥0.5kcal/mol)。为了更好地比较，将这些茎-环RT寡核苷酸及其对应的线性RT寡核苷酸设计为1)仅5’端处的4-5个碱基不同；2)具有相同的GC含量和相似的Tm(＜1℃差异)以及3)具有相同的3’序列使得可在PCR中使用相同的引物。

使用茎-环或线性RT和半嵌套式实时PCR单独对相同量(每RT10⁹拷贝)的成熟miRNA和前-miRNA定量。取决于所测试的9种前-miRNA，使用茎-环RT寡核苷酸早于前-miRNA3-14个循环检测到成熟miRNA(平均ΔCt为8.7个循环)。相比之下，使用线性RT寡核苷酸的测定的区分力较差(平均ΔCt为4.8个循环)且不能区分某些成熟的miRNA与其前体例如前-miR-21、前-let-7f-1和前-let-7i(表1)。

人let-7miRNA同源物的区分。多个miRNA家族(例如，hsa-let-7、hsa-miR-30)由仅单个核苷酸或几个核苷酸不同的高度同源的miRNA组成。八个let-7家族的miRNA共享最多63.6％的整体序列同一性，其中let-7a和let-7c、let-7a和let-7f、let-7b和let-7f仅单个核苷酸不同(图11A)。在该研究中，设计了用于每种let-7miRNA的半嵌套式实时RT-PCR测定。

使用每种测定扩增所有八种合成的let-7miRNA并比较相对检测。简单地讲，先使用靶向不太同源的3’区域的茎-环RT寡核苷酸实现每种let-7miRNA(每RT10⁹拷贝)的特异性反转录。miRNA-特异性正向PCR引物和优选地具有miRNA-特异性3’末端序列的半嵌套式反向引物进一步改善了对多种let-7miRNA的区分。除了相对于let-7c具有1.778％的相对检测的let-7a测定以外，所有八种let-7测定表现出极佳的对同源miRNA的区分，非特异性检测小于1％(图11B)。对于2个或更多个核苷酸不同的let-7miRNA，这些测定能够特异性地检测靶miRNA，交叉靶扩增小于0.3％。该结果表明通过不昂贵的SYBR Green I检测化学，半嵌套式实时RT-PCR测定能够在可与基于荧光探针的实时RT-PCR测定(Chen等人，2005)相当的水平上区分高度同源的miRNA。

通过并入dU的RT寡核苷酸和UDG处理提高测定的性能。可使用包括尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)处理的新型策略进一步改善对某些高度同源的miRNA的区分。在该研究中，我们观察到遗留的RT寡核苷酸的量能够用作PCR期间的扩增引物，但是具有较差的效率(图16)。有趣的是，UDG处理之后，并入dU的RT(dU-RT)寡核苷酸而不是标准RT(dT-RT)寡核苷酸不能用作反向PCR引物(图16B、C)。然后我们假设let-7miRNA同源物之间的区分可通过相似的策略进一步改善。实际上，虽然用于let-7a的标准(dT)RT寡核苷酸相对于let-7fmiRNA表现出0.03％的相对检测，但是在UDG处理后在环(dU1)或茎(dU2)区域具有dU并入的let-7a RT寡核苷酸明显不太能够交叉扩增let-7f(图13)。let-7a dT和dU RT寡核苷酸都能够同样好地引发let-7a的反转录(数据未示出)。

应用多重测定鉴定U251细胞中GDNF-引起的miRNA的表达。为评价该miRNA检测方法的稳健性，设计并应用半嵌套式实时RT-PCR测定来鉴定U251细胞中GDNF-调控的miRNA。测试了总共26种miRNA，包括被报道为在人成胶质细胞瘤中调控异常的18种miRNA(miR-7、miR-10b、miR-15b、miR-21、miR-124、miR-128、miR-137、miR-139、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-218、miR-221、miR-222、miR-425、miR-451、miR-486)(Pang等人，2009)和8种let-7家族miRNA。发现U251细胞中表达二十种miRNA(除了miR-137、miR-146b、miR-181c、miR-451、let-7d和let-7e以外)(数据未示出)。通过GDNF引起的对ERK1/2MAPK的时间依赖性激活刺激细胞，通过MEK抑制剂U0126预处理抑制ERK1/2MAPK(图18)。然后我们量化了U251细胞中由GDNF这20种miRNA的表达的瞬时调控。有趣的是，GDNF刺激引起对miR-7、miR-21、miR-218(图15A)和let-7f、let-7g、let-7i(图15B)的时间依赖性上调。未观察到对其他miRNA的明显调控。

然后我们研发了用于同时对26种miRNA(对应24种RT寡核苷酸)反转录并随后通过半嵌套式实时PCR检测单独的miRNA的多重测定。使用该24-重测定，我们发现通过用U0126预处理细胞有效地抑制了GDNF对6种miRNA的上调，表明MEK-ERK1/2信号传导通路是GDNF-引起的miRNA表达所需要的(图17)。使用miR-218和let-7i作为实例通过标准单重测定获得了相似的结果(图20)。

对细胞裂解物中miRNA的直接和多重检测。对来自细胞裂解物的miRNA的直接检测可避免费时的多步骤RNA分离过程并急剧增加测定的通量。然后我们还研究了半嵌套式实时RT-PCR测定在直接和多重定量来自在96-孔中的10至100,000个培养的U251细胞的miRNA方面的能力。从这些细胞分离的总RNA用作定量对照。与图9H相似，分离的RNA对照的miR-21和miR-222标准曲线的极佳的线性度表明来自从少至10个细胞提取的总RNA的miRNA可被可靠地定量(图19)。重要的是，与分离的RNA对照相比，使用该多重测定可一样好地检测来自10-1000个细胞的裂解物的miR-21和miR-222。然而，值得注意的是用接近汇合(10⁴细胞/孔)或过度汇合(10⁵细胞/孔)的细胞密度的裂解物损害了miRNA的直接定量。有趣的是，在含有或不含RNA酶抑制剂下检测来自细胞裂解物的miRNA时未观察到显著差异，表明成熟miRNA的极大的稳定性。

讨论

现在已知miRNA在调节基因表达方面起重要作用且已表明多至60％的人基因被miRNA靶向(Friedman等人，2009)。随着对miRNA的表达特征的兴趣增加，用于检测成熟miRNA的快速、稳健且有成本效益的方法是极为期望的。本文所述的半嵌套式实时RT-PCR测定设计起来简单且表现出极佳的性能并为未来可被鉴定的任何miRNA的设计提供灵活性。

关于合成的miRNA靶，半嵌套式实时RT-PCR测定表现出至少7log的宽的动态范围，少至每RT100个分子(亚介摩尔)的高灵敏度和大于90％的高的RT-PCR效率。除了miRNA表达的相对定量之外，合成的miRNA标准品也可允许对来自总RNA样品的miRNA表达绝对定量。与之前报道的在每个循环45至75s的标准热循环设定下进行的miRNA实时PCR测定(Chen等人，2005；Raymond等人，2005；Shi&Chiang，2005；Sharbati-Tehrani等人，2008；Yang等人，2009)相比，我们的测定能够快速热循环(每个循环10s)而不改变反应混合物。该测定的快速循环能力可部分地归因于通过半嵌套引物产生的短的扩增子(＜50bp)和SYBR Green I的快速荧光获取而不需要探针水解。

特异且灵敏地对来自总RNA样品的成熟miRNA定量通常分别需要大小分级和预扩增。已报道除了另外的样品处理步骤之外，大小分级可导致miRNA的一致性损失(Wang等人，2007)且预扩增效率极大地受miRNA中A碱基数量的影响(Mestdagh等人，2008)。通过我们的miRNA定量分析，可有效地检测少量的总RNA(1pg至100ng)和从少至10个细胞分离的总RNA而不需要分级或预扩增。之前，用于同时反转录220至450种miRNA的Megaplex miRNA测定已被应用于量化来自微量的总RNA或单细胞的miRNA表达(Tang等人，2006；Mestdagh等人，2008)。因为对于每种miRNA使用了低得多的RT寡核苷酸浓度，所以尤其当起始总RNA小于350ng时在实时PCR之前需要预扩增。在该研究中，我们已表明对24种miRNA的多重测定产生与单重测定相当的结论，而未减少RT寡核苷酸的浓度或不需要预扩增。因此，我们提出用该方法对相对少量的miRNA多重检测可减少样品和试剂需求且仍允许对miRNA的可靠定量。这些多重测定还可用于对来自培养在96-孔的细胞的miRNA直接定量。因此，本文报道的方法不仅能够对来自微量的分离的RNA而且能够直接对来自裂解的细胞的miRNA表达可靠、快速且高通量地定量检测，而不需要费力、费时的RNA分离方法。

在该研究中，对来自前体的成熟miRNA的特异性检测通过具有茎-环二级结构的RT寡核苷酸实现。虽然前体miRNA的表达水平通常与成熟miRNA相关(Calin等人，2004；Schmittgen等人，2004)，但是常见的是，miRNA的成熟可被调控，从而前体miRNA被表达，但是所述前体miRNA的成熟形式不能被检测到(Ambros等人，2003；Michael等人，2003；Wulczyn等人，2007；Schmittgen等人，2008)。为了区分对miRNA加工和成熟的调控，用于成熟miRNA和前体miRNA的特异性测定是极为期望的。我们发现茎-环RT寡核苷酸而不是线性RT寡核苷酸优先反转录成熟miRNA而不是前体miRNA。茎-环策略之前已被成功地应用于特异性反转录正在复制的逆转录病毒的有义链(Anwar等人，2006)。已提出线性RT寡核苷酸应包含至少7个核苷酸的miRNA-特异性序列以有效地反转录成熟miRNA(Raymond等人，2005)。该研究中使用的线性RT寡核苷酸(具有6个miRNA-特异性核苷酸)对成熟miRNA与前-miRNA的差的区分可能是由于对成熟miRNA的无效反转录，这与之前的发现(Chen等人，2005)一致。这些结果表明反转录期间茎-环二级结构可以稳定RT寡核苷酸和成熟的miRNA之间的短的碱基配对。

基于作为靶识别的关键性决定因素的跨越miRNA的5’处的2-7个核苷酸的相同的种子序列，miRNA被分为几个家族(例如let-7家族)(Lewis等人，2005)。虽然同一家族的miRNA可能共有一些共同的靶和功能，但是该家族的具体成员可能参与某些生理过程和疾病状态。例如，发现let-7b随年龄被特异性上调并造成衰退的干细胞自我更新(Nishino等人，2008)。let-7d的低表达被建议作为头部和颈部鳞状细胞癌的预后标志(Childs等人，2009)，且let-7i被鉴定为人上皮性卵巢癌的新型生物标志(Yang等人，2008)。这样一来，对于开发生物标志和对于miRNA的生物起源的研究需要对这些miRNA的特异性且定量的检测。之前，let-7同源物的区分通过TaqMan实时RT-PCR测定实现，其中在miRNA-特异性RT之后，共同的反向引物被用于PCR且miRNA-特异性TaqMan探针是区分所需要的(Chen等人，2005)。具有相似策略但是未使用荧光探针的测定受累于显著更差的对let-7同源物的区分(Raymond等人，2005；Shi&Chiang，2005；Sharbati-Tehrani等人，2008)。我们假设且表明了半嵌套式miRNA-特异性反向PCR引物急剧地增强了测定的特异性且不需要使用荧光探针。使用该方法，可使用不昂贵的SYBR Green I来特异性地检测所有let-7miRNA，具有与TaqMan实时RTPCR(Chen等人，2005)相当且在某些情况下优于TaqMan实时RTPCR的极佳的区分。

过多的RT寡核苷酸的存在可在PCR期间用作将促使非特异性扩增的反向引物。尤其当PCR中的正向引物也可与共有序列(例如，来自同源miRNA的cDNA)杂交时，这是成问题的。缓和该问题的常见做法是通过在RT后稀释cDNA样品减少RT寡核苷酸的遗留。然而，尤其是对于低丰度的靶miRNA，该方法将总是降低测定的灵敏度。对于低丰度的miRNA，通过在实时PCR之前用脱氧尿苷残基修饰RT寡核苷酸并用UDG处理cDNA进一步改进该测定。UDG最先从大肠杆菌(E.Coli)中纯化出来且发现其能够裂解来自包含尿嘧啶的DNA的尿嘧啶(Lindahl等人，1977)。尿嘧啶残基的释放在DNA上产生可阻碍PCR期间DNA聚合酶复制的无嘧啶位点(Longo等人，1990)。可能UDG处理使得未使用的dU RT寡核苷酸不能用作PCR引物。在其中最大特异性是期望的或在RT期间难以实现区分(例如let-7a和let-7f共有相同的用于RT引发的3’序列)的情形中这是一种简单且有吸引力的方法。

已知miRNA以与正常的脑相比不同的方式在成胶质细胞瘤中表达，且这些异常调节的miRNA中的许多参与成胶质细胞瘤生长、侵入和化学抗性(Lawler&Chiocca，2009；Li等人，2009)。对所选择的miRNA使用半嵌套式实时RT-PCR测定，发现GDNF通过MEK-ERK1/2MAPK信号传导通路调控miR-7、miR-21、miR-218、let-7f、let-7g和let-7i的表达。这些GDNF-引起的miRNA的功能意义仍有待研究。使用本文研发的快速且高通量的方法，现在通过表征miRNA表达中的变化来筛选药物是可行的。

目前公知领域中miRNA的数量超过17,000种(Kozomara&Griffiths-Jones，2011)并被预期随生物信息学预测和体内验证例如深度测序增加。由于对miRNA表达分析的持续需求，本研究中呈现的半嵌套式实时RT-PCR测定为快速且可靠地检测功能性的成熟miRNA提供了高性能的方法。

如同每一份单独的出版物或专利申请被明确且单独地指明被通过引用并入一样，本说明书中提到的所有出版物和专利申请被通过引用并入本文。对任何出版物的提及是为其在申请日之前的公开内容且不应解释为承认本发明无权由于在先发明而早于该出版物。

如在本说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文明确地另外指明，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数的所指对象。如在本说明书和所附权利要求中使用的，术语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和其他形式的这些术语意在为非限制性包括的含义，也就是说，包括特定的所提及的元素或组分而不排除任何其他元素或组分。如在本说明书和所附权利要求中使用的，所提供的所有范围或列表意在表达限制于其中的任何中间值或范围或任何子列表。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

虽然为了清楚理解的目的已通过阐述和举例以某些细节描述了前述发明，但是根据本发明的教导对本领域普通技术人员易于明显的是可对其进行某些改变和修改而不偏离所附权利要求的精神和范围。

参考文献

Ambros V， Lee RC，Lavanway A，Williams PT，Jewell D.2003.MicroRNAs and other tiny endogenous RNAs in C.elegans.Curr Biol13：807-818.

Anwar A，August JT，Too HP.2006.A stem-loop-mediated reversetranscription realtime PCR for the selective detection and quantification of thereplicative strand of an RNAvirus.AnalBiochem352：120-128.

Bar M，Wyman SK，Fritz BR，Qi J，Garg KS，Parkin RK，Kroh EM，Bendoraite A，Mitchell PS，Nelson AM，Ruzzo WL，Ware C，Radich JP，Gentleman R，Ruohola-Baker H，Tewari M.2008.MicroRNA discovery andprofiling in human embryonic stem cells by deep sequencing of small RNAlibraries.Stem Cells26：2496-2505.

Bartel DP.2004.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，andfunction.Cell116：281-297.

Bartel DP.2009.MicroRNAs：target recognition and regulatory functions.Cell136：215-233.

Bissels U，Wild S，Tomiuk S，Holste A，Hafner M，Tuschl T，Bosio A.2009.Absolute quantification of microRNAs by using a universal reference.RNA.

Calin GA，Liu CG， Sevignani C，Ferracin M，Felli N，Dumitru CD，Shimizu M，Cimmino A，Zupo S，Dono M，Dell′Aquila ML，Alder H，RassentiL，Kipps TJ，Bullrich F，Negrini M，Croce CM.2004.MicroRNA profilingreveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.Proc NatlAcadSci USA101：11755-11760.

Carthew RW.2006.Gene regulation by microRNAs.Curr Opin GenetDev16：203-208.

Chen C，Ridzon DA，Broomer AJ，Zhou Z，Lee DH，Nguyen JT，BarbisinM，Xu NL，Mahuvakar VR，Andersen MR，Lao KQ，Livak KJ，Guegler KJ.2005.Realtime quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.NucleicAcids Res33：e179

Chen JF，Callis TE，Wang DZ.2009a.microRNAs and muscle disorders.JCellSci122：13-20.

Chen X，BaY，Ma L，Cai X，YinY，Wang K，Guo J，ZhangY，Chen J，GuoX，Li Q，Li X，WangW，Wang J，Jiang X，XiangY，Xu C，ZhengP，Zhang J，LiR，Zhang H，Shang X，Gong T，Ning G， Zen K，Zhang CY.2008.Characterization of microRNAs in serum：a novel class of biomarkersfordiagnosis of cancer and other diseases.CellRes18：997-1006.

Chen Y，Gelfond JA，McManus LM，Shireman PK.2009b.Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profilingand comparison with microarray analysis.BMC Genomics10：407.

Cheng Y，Zhang X，Li Z，Jiao X，Wang Y，Zhang Y.2009.Highly sensitivedetermination of microRNA using target-primed and branched rolling-circleamplification.Angew Chem Int Ed Engl48：3268-3272.

Childs G， Fazzari M，Kung G， Kawachi N，Brandwein-Gensler M，McLemore M，Chen Q，Burk RD，Smith RV，Prystowsky MB，Belbin TJ，Schlecht NF.2009.Lowlevel expression of microRNAs let-7d and miR-205areprognostic markers of head and neck squamous cell carcinoma.Am J Pathol174：736-745.

Duncan DD，Eshoo M，Esau C，Freier SM，Lollo BA.2006.Absolutequantitation of microRNAs with a PCR-based assay.Anal Biochem359：268-270.

Friedman RC，Farh KK，Burge CB，Bartel DP.2009.Most mammalianmRNAs are conserved targets of microRNAs.GenomeRes19：92-105.

Goff LA，Davila J，Swerdel MR，Moore JC，Cohen RI，Wu H，Sun YE，Hart RP.2009.Ago2immunoprecipitation identifies predicted microRNAs inhuman embryonic stem cells and neural precursors.PLoS One4：e7192.

Guo MJ，Hildbrand S，Leumann CJ，McLaughlin LW和Waring MJ.1998.Inhibition of DNA polymerase reactions by pyrimidine nucleotide analogueslacking the2-keto group.Nucleic Acids Research，26(8)：1863-1869.

Harfe BD.2005.MicroRNAs in vertebrate development.Curr Opin GenetDev15：410-415.

Hebert SS，De Strooper B.2009.Alterations of the microRNA networkcause neurodegenerative disease.Trends Neurosci32：199-206.

Hunt EA，Goulding AM，Deo SK.2009.Direct detection andquantification of microRNAs.Anal Biochem.

Jiang J，Lee EJ，Gusev Y，Schmittgen TD.2005.Real-time expressionprofiling of microRNA precursors in human cancer cell lines.Nucleic A cidsRes33：5394-5403.

Kozomara A，Griffiths-Jones S(2011)miRBase：integrating microRNAannotation and deep-sequencing data.Nucleic acids research39(Databaseissue)，D152-57

Lawler S，Chiocca EA.2009.Emerging functions of microRNAs inglioblastoma.J Neurooncol92：297-306.

Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.2005.Conserved seed pairing，oftenflanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNAtargets.Cell120：15-20.

LiY，LiW，YangY，LuY，He C，Hu G， Liu H，Chen J，He J，Yu H.2009.MicroRNA-21targets LRRFIP1 and contributes to VM-26resistance inglioblastoma multiforme.Brain Res1286：13-18.

Lindahl T，Ljungquist S，Siegert W，Nyberg B，Sperens B.1977.DNAN-glycosidases：properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli.JBiolChem252：3286-3294.

Lindsay MA.2008.microRNAs and the immune response.TrendsImmunol29：343-351.

Longo MC，Berninger MS，Hartley JL.1990.Use of uracil DNAglycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions.Gene93：125-128.

Mendes ND，Freitas AT，Sagot MF.2009.Current toolsfor theidentification of miRNA genes and their targets.Nucleic Acids Res37：2419-2433.

Mestdagh P，Feys T，Bernard N，Guenther S，Chen C，Speleman F，Vandesompele J.2008.High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNAexpression profiling using minute amounts of input RNA.Nucleic AcidsRes36：e143.

Michael MZ，SM OC，van Holst Pellekaan NG， Young GP，James RJ.2003.Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia.MolCancerRes1：882-891.

Miska EA.2005.How microRNAs control cell division，differentiationand death.Curr Opin Genet Dev15：563-568.

Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，Fritz BR，Wyman SK，Pogosova-Agadjanyan EL，Peterson A，Noteboom J，O′Briant KC，Allen A，LinDW，Urban N，Drescher CW，Knudsen BS，Stirewalt DL，Gentleman R，Vessella RL，Nelson PS，Martin DB，Tewari M.2008.Circulating microRNAsas stable blood-based markers for cancer detection.Proc NatlAcad Sci U SA105：10513-10518.

Nishino J，Kim I，Chada K，Morrison SJ.2008.Hmga2promotes neuralstem cell selfrenewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a andp19ArfExpression.Cell135：227-239.

Pang JC，Kwok WK，Chen Z，Ng HK.2009.Oncogenic role ofmicroRNAs in brain tumors.Acta Neuropathol117：599-611.

Raymond CK，Roberts BS，Garrett-Engele P，Lim LP，Johnson JM.2005.Simple，quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring ofmicroRNAs and short-interfering RNAs.RNA11：1737-1744.

Schmittgen TD，Jiang J，Liu Q，Yang L.2004.A high-throughput methodto monitor the expression of microRNA precursors.Nucleic A cids Res32：e43.

Schmittgen TD，Lee EJ，Jiang J，Sarkar A，Yang L，Elton TS，Chen C.2008.Realtime PCR quantification of precursor and mature microRNA.Methods44：31-38.

Sharbati-Tehrani S，Kutz-Lohroff B，Bergbauer R，Scholven J，EinspanierR.2008.miR-Q：a novel quantitative RT-PCR approach for the expressionprofiling of small RNA molecules such as miRNAs in a complex sample.BMCMolBiol9：34.

Shi R，Chiang VL.2005.Facile means for quantifying microRNAexpression by realtime PCR.Biotechniques39：519-525.

Tang F，Hajkova P，Barton SC，Lao K，Surani MA.2006.MicroRNAexpression profiling of single whole embryonic stem cells.Nucleic A cids Res34：e9.

Too HP.2003.Real time PCR quantification of GFRalpha-2alternativelyspliced isoforms in murine brain and peripheral tissues.Brain Res Mol BrainRes114：146-153.

Varkonyi-Gasic E，Wu R，Wood M，Walton EF，Hellens RP.2007.Protocol：a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification ofmicroRNAs.Plant Methods3：12.

Visone R，Croce CM.2009.MiRNAs and cancer.AmJPathol174：1131-1138.Wang H，Ach RA，Curry B.2007.Direct and sensitive miRNAprofiling from low-input total RNA.RNA13：151-159.

Wulczyn FG， Smirnova L，Rybak A，Brandt C，Kwidzinski E，NinnemannO，Strehle M，Seiler A，Schumacher S，Nitsch R.2007.Post-transcriptionalregulation of the let-7microRNA during neural cell specification.FASEB J21：415-426.

Yang H，Schmuke JJ，Flagg LM，Roberts JK，Allen EM，Ivashuta S，Gilbertson LA，Armstrong TA，Christian AT.2009.A novel real-timepolymerase chain reaction method for high throughput quantification of smallregulatory RNAs.PlantBiotechnolJ7：621-630.

Yang N，Kaur S，Volinia S，Greshock J，Lassus H，Hasegawa K，Liang S，Leminen A，Deng S，Smith L，Johnstone CN，Chen XM，Liu CG， Huang Q，Katsaros D，Calin GA，Weber BL，Butzow R，Croce CM，Coukos G， Zhang L.2008.MicroRNA microarray identifies Let-7i as a novel biomarker andtherapeutic target in human epithelial ovarian cancer.Cancer Res68：10307-10314.

Yao B，Li J，Huang H，Sun C，Wang Z，Fan Y，Chang Q，Li S，Xi J.2009.Quantitative analysis of zeptomole microRNAs based on isothermalramification amplification.RNA15：1787-1794.