JP2008507284A - デュアルハイブリダイゼーションによるオリゴヌクレオチドの検出 - Google Patents

Abstract

本発明は、修飾核酸オリゴヌクレオチドを検出及び／又は定量するための方法及び組成物を提供する。これらの方法及び組成物は、生物試料中の、アプタマー、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムなどの、診断及び／又は治療用合成修飾オリゴヌクレオチドを検出及び定量するのに有用である。

Description

本発明は、オリゴヌクレオチド検出の分野のものである。より具体的には、本発明は、試料中のオリゴヌクレオチド、特に生物試料中の修飾ヌクレオチドを含有する合成アプタマーを検出又は定量する方法に関する。

アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及びさらに最近の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む生物活性合成オリゴヌクレオチドは、直接的及び特異的に個々の遺伝子及びタンパク質を標的とすることを可能にすることによって、分子医学を劇的に変化させてきた。生物試料中のごく少量のこのような外来オリゴヌクレオチドでさえも高感度で検出及び定量できることは、臨床的に関連する治療及び診断法として、これらの発展に対する非常に重要なキーとなろう。

アプタマー（Ｇｒ．Ａｐｔｕｓ−英語で「ｆｉｔ（適合した）」の意；ｍｅｒｏｓ−部分又は領域）は、タンパク質などの標的分子と非常に高い特異性及び親和性で結合するオリゴヌクレオチドである。アプタマー結合は、正しく折りたたまれたオリゴヌクレオチドの特異的な３次元立体構造に依存する。アプタマーは、アミノ酸、薬物、タンパク質及びその他の分子に対して生成させることができる。吸着、回収及び再増幅の反復プロセスにより、合成核酸のコンビナトリアルライブラリからこれらを単離することができる。標的にしっかりと結合するプライマリーＲＮＡオリゴヌクレオチド配列の選択後、アプタマーの安定性及び／又はアンタゴニスト（又はアゴニスト）生物活性を最適化するために、骨格、糖及び塩基ならびに配列の５’及び３’末端に対して多くの第二の修飾を行うことができる。例えば、アプタマーオリゴヌクレオチドは、そのヌクレアーゼ耐性を強くするために、２’−リボ位（例えば、２’−フルロ又は２’−Ｏ−メチルで）が修飾されることが多い。さらに、アプタマーの３’末端は、ヌクレアーゼ耐性を向上させるために、「反転Ｔキャップ」（つまり、アプタマーの３’末端における−３’ｄＴの付加）により修飾が行われることが多く、アプタマーの５’末端におけるこのような「反転Ｔキャップ」構造の使用もまた記載されている（米国出願番号６０／４９３，５００参照）。さらに、ヌクレアーゼ耐性及び／又はその他の薬物動態学的特性を向上させるために非免疫原性の高分子量又は新油性化合物を５’末端又はその他の位置に付加することも記載されている（例えば、米国特許第６，０１１，０２０号、同第６，１４７，０２４号、同第６，２２９，００２号、同第６，４２６，３３５号、同第６，４６５，１８８号及び同第６，５８２，９１８号を参照のこと。）。最後に、アプタマーのアンタゴニスト特性を向上させるためにデキストラン又はポリエチレングリコールなどの可溶性の高分子量立体基を付加することが記載されている（米国出願番号第１１／１０５，２７９号を参照のこと。）。

治療適用において修飾オリゴヌクレオチドを使用することに伴う重要な問題は、対象における修飾オリゴヌクレオチドの存在及び持続を確認することである。生物試料中の核酸を検出及び／又は定量するための方法は数多くあるが、オリゴヌクレオチドアプタマー及びある一定のアンチセンス物質において、それらが比較的短いものであることと合わせて、大幅な修飾があることにより、それらの検出及び定量が困難なものとなっている。実際に、５’−ＰＥＧ化など、ある高分子量修飾物は、ある種の従来からの検出手段を妨害する。したがって、宿主試料中に存在する修飾オリゴヌクレオチドを検出するための、信頼性があり、定量的な方法は、非常に有用である。

本発明は、ある部分、修飾オリゴヌクレオチドの、信頼性があり、高感度で定量的な検出を可能とする方法の発見に基づくものである。特に、本発明は、以下に限定されないが、対象から得られた生物試料中の５’−ＰＥＧ化治療用アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ及びアンチセンス核酸オリゴヌクレオチドを含む、修飾オリゴヌクレオチドの信頼性があり、高感度で定量的な検出のための方法に関する。

ある態様において、本発明は、標的オリゴヌクレオチドと第一のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、標的オリゴヌクレオチドの第一の部分と相補的な第一のポリヌクレオチドと試料を接触させることにより、試料中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法を提供する。この態様において、第一のポリヌクレオチドは、機能的タグと連結されている。次に、標的オリゴヌクレオチドと第二のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、標的オリゴヌクレオチドの近接及び非重複部分と相補的な第二のポリヌクレオチドと試料を接触させる。第二のポリヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドに対して実質的に非相補的である、検出可能な標識又は増幅可能な配列を含む。次に、標的オリゴヌクレオチドに近接するようにハイブリダイズされている、第一及び第二のポリヌクレオチドは、ライゲーションハイブリッド複合体を形成させるために、場合によっては一緒にライゲーションされる。次に、増幅段階又はその他の手段により、ライゲーションハイブリッド複合体における、第二のポリヌクレオチドの、検出可能な標識又は増幅可能な配列を検出する。検出可能な標識又は増幅可能な配列の検出は、標的オリゴヌクレオチドがオリジナル試料中に存在することを示す。

本発明のこの態様のある実施形態において、本発明の方法は、さらに、第一のポリヌクレオチドのタグを用いて試料の残りの部分からライゲーションハイブリッド複合体を分離することを含む。

ある実施形態において、標的オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドである。あるいくつかのこのような実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは修飾ホスホジエステル骨格を有する。その他のこのような実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホロアミデート結合又はホスホネート結合などの少なくとも１個の修飾ホスホジエステル結合を含む。

その他の有用な実施形態において、標的オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のリボヌクレオチドヌクレオチド残基を含む。さらに他のこのような実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−置換リボヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−ハロリボヌクレオチド、２’−Ｏ−アリールリボヌクレオチド、２’−Ｏ−アリルリボヌクレオチド又は２’−アミノリボヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−フルロリボヌクレオチド、２’−クロロリボヌクレオチド、２’−ブロモリボヌクレオチド又は２’−ヨードリボヌクレオチドである、２’−ハロリボヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、２’−置換リボヌクレオチドは、２’−フルオロリボヌクレオチドである。その他の実施形態において、２’−置換リボヌクレオチドは、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、カルボニル、カルボキシアルキル及びアミノからなる群から選択される１以上の置換基で置換された、２’−Ｏ−Ｃ_１−６アルキルリボヌクレオチドである。特定の実施形態において、２’−置換リボヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。さらなる実施形態において、、２’−置換リボヌクレオチドは、２’−４’ロックドリボヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン橋構造を有するものなどである。その他の実施形態において、２’−置換リボヌクレオチドは、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、カルボニル、カルボキシアルキル又はアミノ基などの１以上の置換基により置換された２’−Ｏ−アリールリボヌクレオチドである。さらに他の実施形態において、２’−置換リボヌクレオチドは、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、カルボニル、カルボキシアルキル又はアミノ基などの１以上の置換基により置換された２’−Ｏ−アリルリボヌクレオチドである。

さらなる実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、図３で示されるＰＥＧ化アプタマーなど、ＰＥＧ化される。その他の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに沿った何れかの位置で連結されている可溶性の高分子量立体基を有する。あるこのような実施形態において、可溶性の高分子量立体基はデキストランである。その他のこのような実施形態において、可溶性の高分子量立体基は、ポリエチレングリコール、多糖類、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、アルギン酸塩、ポリエステル、高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリレート、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物、カルボキシメチルセルロース、セルロース誘導体、キトサン、ポリアルデヒド又はポリエーテルである。特定のこのような実施形態において、ポリエステル基は、共ブロックポリマー性ポリエステル基である。その他の特定のこのような実施形態において、アルギン酸塩は、ナトリウム又はカルシウムなどの陽イオン性対イオンとの塩として与えられる陰イオン性アルギン酸塩である。ある実施形態において、可溶性高分子量立体基は、約２０ｋＤから約１００ｋＤの分子量のポリマー性組成物である。その他の実施形態において、可溶性高分子量立体基は、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端においてオリゴヌクレオチドに連結される。さらなる実施形態において、可溶性高分子量立体基は、修飾オリゴヌクレオチドの３’末端においてオリゴヌクレオチドに連結される。さらに他のこのような実施形態において、可溶性高分子量立体基は、アプタマー配列の５’末端又は３’末端以外の位置でオリゴヌクレオチドに連結される。またさらなるこのような実施形態において、可溶性高分子量立体基は、１以上の塩基の環外アミノ基、１以上のピリミジン塩基の５−位、１以上のプリン塩基の８位、１以上のリン酸残基のヒドロキシル基又は１以上のリボース基のヒドロキシル基などの位置でオリゴヌクレオチドに連結されている。

特定の実施形態において、標的オリゴヌクレオチドは、アプタマー、例えば、ＶＥＧＦアプタマー（例えば、次の構造を有するＶＥＧＦアプタマー：
ＰＥＧ−リンカー−Ｃ_ｆＧ_ｍＧ_ｍＡ_ｒＡ_ｒＵ_ｆＣ_ｆＡ_ｍＧ_ｍＵ_ｆＧ_ｍＡ_ｍＡ_ｍＵ_ｆＧ_ｍＣ_ｆＵ_ｆＵ_ｆＡ_ｍＵ_ｆＡ_ｍＣ_ｆＡ_ｍＵ_ｆＣ_ｆＣ_ｆＧ_ｍ３’−３’−Ｔｄ（配列番号１））である。

本発明のこの態様のさらなる実施形態において、第一のポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドポリヌクレオチドである。その他の実施形態において、第一のポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドポリヌクレオチドである。特定の実施形態において、第一のポリヌクレオチドは、次の配列を含む捕捉プローブである：ＡＣＧＧＡＴＧＴＡＴＡＡＧＣＡ（配列番号２）。特定の実施形態において、第一のポリヌクレオチドは、構造：５’−アミン−ＡＡＡＡＣＧＧＡＴＧＴＡＴＡＡＧＣＡ−３’（配列番号３）である。その他の特定の実施形態において、第一のポリヌクレオチドは、構造：５’−アミン−ＡＡＡＡＣＧＧＡＴＧＴＡＴＡＡＧＣＡＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＣＣＧ−３’（配列番号４）である。

またさらなる実施形態において、タグは、ハプテン、抗体、リガンド、リガンド特異的受容体、炭水化物又は炭水化物結合レクチンなどの、高親和性リガンド又はそれに対する結合パートナーである。あるいくつかの実施形態において、高親和性リガンド又はその結合パートナーは、ビオチン、アビジン又はストレプトアビジンである。ある実施形態において、タグは磁気ビーズを含む。

本発明のこの態様のさらなる実施形態において、第二のポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドポリヌクレオチドである。その他の実施形態において、第二のポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドポリヌクレオチドである。特定の実施形態において、第二のポリヌクレオチドは、構造：５’−Ｐｈｏｓ−ＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＴＣＡＣＧＧＴＴＡＡＡＧＧＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＴＧＣＧＧＧＣＴＧＴＴＧＡＣＧＡ−３’（配列番号６）を有する第二のポリヌクレオチドなど、配列ＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号５）を含む検出プローブである。

またさらなる実施形態において、第二のポリヌクレオチドは、ジゴキシゲニンである検出可能な標識を含む。本発明の方法のあるこのような実施形態において、ジゴキシゲニンは、抗ジゴキシゲニン抗体により検出される。他の実施形態において、第二のポリヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドに対して実質的に非相補的である増幅可能な配列を含む。標的オリゴヌクレオチドに対して実質的に非相補的であるこのような増幅可能な配列の一例において、配列：ＧＡＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＴＣＡＣＧＧＴＴＡＡＡＧＧＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＴＧＣＧＧＧＣＴＧＴＴＧＡＣＧ（配列番号７）が利用される。特定の実施形態において、第二のポリヌクレオチドの増幅可能な配列は、ポリメラーゼ連鎖反応増幅段階を用いて検出される。あるこのような実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅される単位複製配列を検出する蛍光プローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応増幅段階が行われる。特定のこのような実施形態において、蛍光プローブは、配列：ＡＡＧ ＧＡＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＡ（配列番号８）を含有する核酸を有するＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブなどの、ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブである。その他の特定のこのような実施形態において、蛍光プローブは、構造：６ＦＡＭ−ＡＡＧ ＧＡＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＡ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号９）を有するＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブなどのＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブである。さらなるこのような実施形態において、配列 ＧＡＧ ＡＡＣ ＡＧＴ ＧＴＣ ＡＣＧ ＧＴＴ ＡＡＡ ＧＧＡ（配列番号１０）を有するフォワードＰＣＲプライマーを用いて、増幅可能な配列を増幅させる。その他の実施形態において、配列 ＣＧＴ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＣＣ ＧＣＡ ＡＡ（配列番号１１）を有するリバースＰＣＲプライマーを用いて、増幅可能な配列を増幅させる。またさらなる実施形態において、蛍光プローブは、分子指標プローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ、ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブ又はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎプローブである。

本発明のこの態様の特定の実施形態において、検出段階は、リアルタイムＰＣＲ反応を利用する。このような実施形態において、定量的リアルタイムＰＣＲ反応検出段階において、試料中に存在する標的オリゴヌクレオチドの量を定量する。

特定の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応増幅は、約１０から約４０サイクルを含む。

あるいくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチドがハイブリダイズする標的オリゴヌクレオチドの部分に対する標的オリゴヌクレオチドの３’部分にハイブリダイズする。他の実施形態において、第一のポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチドがハイブリダイズする標的オリゴヌクレオチドの部分に対する標的オリゴヌクレオチドの５’部分にハイブリダイズする。ある実施形態において、第一及び第二のポリヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドの、近接した、非隣接配列にハイブリダイズし、近接するが隣接していないポリヌクレオチドの３’末端は、第一及び第二のポリヌクレオチドがそれにより隣接させられるように、ポリメラーゼを用いて伸長される。あるこのような実施形態において、非隣接ポリヌクレオチドを伸長させるのに利用されるポリメラーゼは、実質的に基本的な３’から５’エクソヌクレアーゼ活性を持たず、得られる隣接ポリヌクレオチドは、ライゲーション可能である。またさらなる実施形態において、近接するようにハイブリダイズされたポリヌクレオチドをＤＮＡリガーゼと接触させることにより、第一及び第二のポリヌクレオチドのライゲーションの段階を行う。その他の実施形態において、近接するようにハイブリダイズされたポリヌクレオチドをＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ）と接触させることにより、第一及び第二のポリヌクレオチドをライゲーションする段階を行う。

本発明のこの態様の特定の実施形態において、第一のポリヌクレオチドのタグを用いて試料の残りの部分からライゲーションハイブリッド複合体を分離する。あるこのような実施形態において、タグは、プラスチックディッシュに固定化されたビオチン−ストレプトアビジン複合体を含む。その他のこのような実施形態において、利用されるタグは、不溶性基質、例えば磁気ビーズ又はアガロースを含む。特定の実施形態において、不溶性基質を洗浄することにより、試料の残りの部分からのライゲーションハイブリッド複合体の分離を達成する。

別の有用な態様において、本発明は、対象からの生物試料中のアプタマーを定量する方法を提供する。本発明のこの方法により、最初に、アプタマーと捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能にするために、アプタマーの第一の部分と相補的な捕捉プローブと生物試料を接触させる。捕捉プローブは、タグに連結されている。次の段階において、アプタマーと検出プローブのハイブリダイゼーションを可能にするために、アプタマーの近接非隣接であるが非重複である部分に対して相補的な検出プローブと試料を接触させる（該検出プローブは、アプタマーに対して実質的に非相補的な増幅可能配列を含む。）。次に、アプタマーに近接するようにハイブリダイズされた捕捉プローブ及び検出プローブを場合によってはライゲーションハイブリッド複合体を形成するようにライゲーションする。次に、捕捉プローブに連結させられているタグを用いて、ハイブリッド複合体を試料の残りから分離する。次に、ハイブリッド複合体中に存在する検出プローブの増幅可能な配列を定量する。本発明のこの態様により、ハイブリッド複合体中の検出プローブの増幅可能な配列の量は、生物試料中のアプタマーの量に対応する。したがって、本発明のこの方法は、対象由来の元の生物試料中に存在するアプタマーの量を定量する手段を提供する。

別の有用な態様において、本発明は、第一のポリヌクレオチドがさらなる増幅可能な配列を含む、上述のようなデュアルハイブリダイゼーションアッセイを用いて核酸を定量する方法を提供する。さらなる増幅可能配列を含有する第一のポリヌクレオチドは品質管理（ＱＣ）捕捉プライマー（「ＱＣプローブ」）として有用である。ＰＣＲデュアルハイブリダイゼーションアッセイの特性をより理解するために、本発明のこの態様を使用することができる。

ある実施形態において、ＱＣ捕捉プライマーは、配列：ＡＣＧＧＡＴＧＴＡＴＡＡＧＣＡ（配列番号２）をハイブリダイズするＶＥＧＦアプタマーを含有する。

ある実施形態において、ＱＣ捕捉プライマーは、配列：アミノ−ＡＡＡ ＣＴＣ ＣＧＴ ＧＧＧ ＡＣＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＡＣＡ ＧＴＧ ＣＣＡ ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＴＧ ＧＡＣ ＴＡＣ ＧＣＴ ＡＡＡ ＣＧＧ ＣＧＴ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＣＧＧ ＡＴＧ ＴＡＴ ＡＡＧ ＣＡ（配列番号１２）を含有する。

この捕捉プライマーは、配列 ＣＣＡ ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＴＣ ＧＡＣ（配列番号１３）を有するＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブにより検出可能である。ある実施形態において、捕捉プライマーは、構造 ６ＦＡＭ−ＣＣＡ ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＴＣ ＧＡＣ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号１４）を有するＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブ及び配列 ＣＴＣ ＣＧＴ ＧＧＧ ＡＣＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＡＣＡ（配列番号１５；フォワードプライマー）及びＴＣＡ ＧＣＣ ＡＴＡ ＣＧＣ ＣＧＴ ＴＴＡ ＧＣ（配列番号１６；リバースプライマー）のプライマーにより検出可能である。

ＱＣ捕捉プライマーの使用にはいくつかの長所がある。ＱＣ捕捉プライマーを使用する長所の１つは、磁気ビーズに共有結合する捕捉プライマーの量を決定できることである。これは、被覆プロセス後に、ＱＣ捕捉プライマー被覆磁気ビーズの試料においてＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ^（Ｒ））を行うこと及び溶液中のＱＣ捕捉プライマーの既知の量を検出することにより得た標準曲線からＣｔ値を推定することにより遂行される。

ＱＣ捕捉プライマーの使用の別の長所は、試料の洗浄段階を通して持ち込まれた磁気ビーズの相対的量を決定できることである（例えば、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒを利用した洗浄段階）。これにより、アッセイのロバスト性及び再現性を決定することができる。ある実施形態において、ＱＣ捕捉プライマーＴａｑＭａｎプローブ及びプライマーセット（実施例４参照）を使用することにより、ＰＣＲデュアルハイブリダイゼーションプロセス後、ＴａｑＭａｎを用いて磁気ビーズ４μＬが検出される。同じＴａｑＭａｎプライマー及びプローブを用いて溶液中の遊離捕捉プライマーを検出することにより得られた標準曲線からこのＣｔ値を推定する。

ＱＣ捕捉プライマーの使用の別の長所は、ハイブリダイズした試料核酸（例えばペガプタニブ）の割合を決定できることである。ある実施形態において、これは、遊離検出プライマー標準曲線から、ペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ^（Ｒ））試料由来のＣｔ値を推定することにより行われる。検出プライマーのＴａｑＭａｎ検出により、この曲線を作成する。ハイブリダイズしたＭａｃｕｇｅｎの割合は、ペガプタニブにハイブリダイズする検出プライマーの比が１：１比であるため、計算することができる（図２参照）。

さらなる態様において、本発明は試料中のＶＥＧＦアプタマーを検出するためのキットを提供する。このようなキットは、捕捉プローブ、例えばＶＥＧＦアプタマー−ハイブリダイズ配列：ＡＣＧＧＡＴＧＴＡＴＡＡＧＣＡ（配列番号２）を含む捕捉プローブ；検出プローブ、例えば配列：ＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＴＣＡＣＧＧＴＴＡＡＡＧＧＡＴＡ−ＡＧＧＡＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＴＧＣＧＧＧＣＴＧＴＴＧＡＣＧＡ（配列番号６）を含む検出プローブ；及び検出可能プローブ、例えば構造：６ＦＡＭ−ＡＡＧＧＡＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＡ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号９）を有するＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブなどを含む。特定の実施形態において、本キットは、ＰＣＲプライマー、例えば配列：ＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＴＣＡＣＧＧＴＴＡＡＡＧＧＡ（配列番号１０）を有するフォワードＰＣＲプライマー及び配列：ＣＧＴＣＡＡＣＡＧＣＣＣＧＣＡＡＡ（配列番号１１）を有するリバースＰＣＲプライマーをさらに含む。

本明細書中で参照される特許、科学及び医学刊行物は本発明がなされた時点で当業者が利用可能な知識を確立する。発行米国特許、許可済みの出願、公開外国出願ならびに本明細書中で引用される他の参考文献は、それぞれが具体的かつ独立に参照により組み込まれることが示されているように同一程度に、参照により本明細書中に組み込まれる。

概要
一般に、アプタマー、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムなどの修飾オリゴヌクレオチドは、生物試料から信頼性を持って検出し正しく定量することが困難であるが、その理由の１つとしては、それらの長さが比較的短く、活性及び／又は安定性が向上している一方、化学的修飾の存在により信頼性のある検出及び定量が妨害され得るということが挙げられる。特に、ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの信頼性のある検出及び正確な定量は一般に達成されていない。したがって、本明細書中に記載の方法は、アプタマー、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムとして機能する修飾オリゴヌクレオチドなど、生物試料中に少量しか存在しない場合でさえ、存在するオリゴヌクレオチドの信頼性ある検出及び／又は正確な定量に有用である。

定義
本明細書中で使用する全ての技術及び科学用語は、下記で別段の定義がない限り、当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有するものとし、本明細書中で利用される技術に対する言及は、当業者にとって明白である、同等物又は後に開発された技術の技術又は置き換えにおける変法を含め、当技術分野で通常理解されるような技術を指すものとする。本発明である目的物をより明確かつ簡明に説明するために、明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるある一定の用語に対して次の定義を与える。

「約」という用語は、本明細書中において、およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）、〜の範囲（ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ）、ほぼ（ｒｏｕｇｈｌｙ）、又は〜付近（ａｒｏｕｎｄ）を意味するのに用いられる。「約」が数値範囲と併せて用いられる場合、記載される数値の上下に境界を拡張することによってこの範囲が変化する。一般に、「約」という用語は、本明細書中において、数値を開始値の上下に２０％の変動で変化させるために用いられる。

「増幅される」とは、鋳型として核酸配列の少なくとも１個を用いた、核酸配列の複数コピー又は核酸配列に相補的な複数コピーの構築を意味する。増幅システムとしては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システム、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）システム、核酸配列をベースにした増幅（ＮＡＳＢＡ、Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、Ｑ−Ｂｅｔａ レプリカーゼシステム、転写をベースにした増幅システム（ＴＡＳ）及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）が挙げられる。例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄ．Ｈ．Ｐｅｒｓｉｎｇら編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（１９９３）を参照のこと。増幅産物を単位複製配列と呼ぶ。本明細書中で使用する場合、「増幅されたＤＮＡ」又は「単位複製配列」とは、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅の産物を指す。単位複製配列は、長さであり、ある事柄に対して診断的な配列を有する。あるいは、プライマーペアは、全挿入を含む単位複製配列を産生するように、挿入ＤＮＡの両側での隣接配列由来であり得る。

本明細書中で使用する場合、「アプタマー」という用語は、非共有結合性物理的相互作用を介した、非ポリヌクレオチド分子（例えば、タンパク質）に対する選択的結合親和性を有するあらゆるポリヌクレオチド又はこれらの塩を意味する。アプタマーは、抗体のそのエピトープへの結合に類似する様式で、リガンドに結合するポリヌクレオチドである。本発明のアプタマーは、５’−ＰＥＧ化、２’−リボヌクレオチド置換、リン酸骨格修飾及び５’−５’及び３’−３’反転キャップ配列ならびに高分子量、可溶性立体基による修飾を有するものなど、本明細書中で説明されるように、修飾オリゴヌクレオチドを含有するものを含む。

「生物試料」とは、個体、体液、細胞株、組織培養物又は、修飾オリゴヌクレオチドを含有するその他の源から得られる何らかの生物試料を意味する。示されるように、生物試料には、体液（硝子体液、血清、血漿、尿、滑液及び髄液など）が含まれる。哺乳動物由来の組織生検及び体液を用いてこのような生物試料を得るための方法は、当技術分野で周知である。本発明の方法は、何らかの適切な生物試料において核酸を検出及び／又は定量するために使用し得る。ある実施形態において、眼組織及び体液中の核酸を検出及び／又は定量するために、本発明の方法を使用する。眼組織及び体液としては、以下に限定されないが、例えば、硝子体、結膜、角膜、強膜、虹彩、水晶体、毛様体、コロイド、網膜及び視神経などの眼の周囲におけるものが挙げられる。

「ハイブリダイゼーション」とは、本明細書中で使用する場合、完全又は部分的に相補的な塩基対による、２以上のポリヌクレオチドの会合を指す。

本明細書中で使用する場合、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、適切であればリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを指す。この用語はまた、同等物として、ヌクレオチド類似体から調製されるＲＮＡ又はＤＮＡ何れかの類似体及び、記載される実施形態へ適用可能なように、１本鎖（センス又はアンチセンス）及び２本鎖ポリヌクレオチドを含むものとして理解されたい。

「オリゴマー」という用語は、本明細書中で使用する場合、分子量が低すぎてポリマーとはみなされないポリマーを指す。オリゴマーは、通常、数１００単位の分子量を有するが、ポリマーは、通常、数１０００以上の単位の分子量である。

「ポリエチレングリコール」又はＰＥＧという用語は、一般式Ｈ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯＨの何らかのポリマーを指し、ここで、ｎは４より大きい。ポリエチレングリコールの平均相対分子量は、末尾に添えた数字により示される（例えば、ポリエチレングリコール４０００）場合がある。

本明細書中で使用する場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」とは、特異的な配列に相補的なポリヌクレオチドから開始するポリメラーゼによりヌクレオチドの特異的な配列を増幅する方法を指す。通常は、増幅される標的ヌクレオチド配列の２つの末端領域の反対の鎖に相補的な、相補的ポリヌクレオチドから開始する、熱安定性のＴａｑＤＮＡポリメラーゼにより、増幅のために標的とされる特異的な配列が複製される。

「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用する場合、あるヌクレオチド単位のグリコース部分のある位置（例えば３’位）と、近接するもののグリコース部分の別の位置（例えば５’位）との間で、ホスホロジチオアート又はホルホロチオアート結合など、ホスホジエステル又は修飾ホスホジエステル結合により連結された、約１０から約２００の修飾又は未修飾ヌクレオチド単位を含有する何らかの分子である。「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、適切な条件（例えば、ｐＨ、温度、溶媒、イオン強度、電場強度）下で相補的又は実質的に相補的な配列の天然核酸に対して選択的結合親和性を有する、共有結合したヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドの配列を含むあらゆる分子を包含するものとする。ポリヌクレオチドには、天然核酸ならびに、修飾ヌクレオシドもしくはヌクレオシド間結合を有する核酸類似体、及び結合もしくは検出を促進するリンカーもしくは検出可能な標識で修飾されている分子が含まれる。ポリヌクレオチドはさらに、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの、広く修飾された誘導体を含み、これは、依然として相補的配列に特異的にハイブリダイズ可能である。ＰＮＡは、ペプチド結合により連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位の繰り返しから構成される骨格を有し、様々なプリン及びピリミジン塩基がメチレンカルボニル結合によりこの骨格に連結される。本明細書中で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡ又はＤＮＡ（２本鎖もしくは１本鎖の何れか（コードもしくはアンチセンス））又は１本鎖もしくは二重型における複数のヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含むが、上記種のそれぞれが特に指定され得る。本発明の「ポリヌクレオチド」に関して使用する場合、「ヌクレオチド」という用語は、１本鎖もしくは二重型におけるあらゆる長さのＲＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含有する分子を説明するための「形容詞」として使用される。本発明の「ポリヌクレオチド」に関して使用する場合、「ヌクレオチド」という用語はまた、個々のヌクレオチド又は様々なヌクレオチド（つまり、プリンもしくはピリミジン、リボースもしくはデオキシリボース糖部分及びリン酸基、又はホスホジエステル結合（オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド内のヌクレオチドの場合）を含む、より大きな核酸分子における、分子又は個々の単位）を指すための名詞として本明細書中で使用される。「ヌクレオチド」という用語は、本発明の「ポリヌクレオチド」に関して使用する場合、また、少なくとも１個の修飾（ａ）代替的な連結基、（ｂ）プリンの類似体、（ｃ）ピリミジンの類似体又は（ｄ）例えば、類似連結基、プリン、ピリミジン及び糖の類似糖を含有する、「修飾ヌクレオチド」を包含するために本明細書中で使用される（例えば、ＰＣＲ公開ＷＯ９５／０４０６４を参照のこと。）。本発明の有用な修飾には、以下に限定されないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）イブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル-５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル及び２，６−ジアミノプリンが含まれる。オリゴヌクレオシドに連結し、ならびに混合骨格化合物を有するメチレンメチルイミノは、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，３８６，０２３号、同第５，４８９，６７７号、同第５，６０２，２４０号及び同第５，６１０，２８９号に記載のように調製され得る。ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号及び同第５，２６４，５６４号に記載のように調製され得る。エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号に記載のように調製され得る。ホスフィネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，５０８，２７０号に記載のように調製され得る。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第４，４６９，８６３号に記載のように調製され得る。３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，６１０，２８９号又は同第５，６２５，０５０号に記載のように調製され得る。ホスホアミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，２５６，７７５号又は同第５，３６６，８７８号に記載のように調製され得る。アルキルホスホノチオアートオリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１７０９３及びＷＯ９４／０２４９９に記載のように調製され得る。３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミデートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，４７６，９２５号に記載のように調製され得る。ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，０２３，２４３号に記載のように調製され得る。ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，１３０，３０２号及び同第５，１７７，１９８号に記載のように調製され得る。本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、組み換え、エクスビボ生成又はこれらの組合せを含む何らかの公知の方法ならびに当技術分野で公知の何らかの精製方法を利用して調製され得る。

本明細書中で使用する場合、「ヌクレオシド」という用語は、天然リボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシド：アデノシン、シトシン、グアノシン、チモシン又はウラシルのいずれかを意味する。

「修飾ヌクレオチド」又は「修飾ヌクレオシド」又は「修飾塩基」という用語は、リボ核酸（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵ）及びデオキシリボ核酸（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ）に生じる標準塩基、糖及び／又はリン酸骨格化学構造の変形物を指す。例えば、Ｇ_ｍは２’−メトキシグアニル酸を表し、Ａ_ｍは２’−メトキシアデニル酸を表し、Ｃ_ｆは２’−フルオロシチジル酸を表し、Ｕ_ｆは２’−フルオロウリジル酸を表し、Ａ_ｒはリボアデニル酸を表す。アプタマーはシトシン又は、５−メチルシトシン、４−アセチルシトシン、３−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、２−チオシトシン、５−ハロシトシン（例えば、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、及び５−ヨードシトシン）、５−プロピニルシトシン、６−アゾシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、Ｎ４、Ｎ４−エタノシトシン、フェノキサジンシチジン、フェノチアジンシチジン、カルバゾールシチジンもしくはピリドインドールシチジンを含む、あらゆるシトシン関連塩基を含む。アプタマーは、さらに、グアニン又は、６−メチルグアニン、１−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２−プロピルグアニン、６−プロピルグアニン、８−ハログアニン（例えば、８−フルオログアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン及び８−ヨードグアニン）、８−アミノグアニン、８−スルフィドリルグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、７−メチルグアニン、８−アザグアニン、７−デアザグアニンもしくは３−デアザグアニンを含む、あらゆるグアニン関連塩基を含む。アプタマーは、さらに、アデニン又は、６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、８−ハロアデニン（例えば、８−フルオロアデニン、８−ブロモアデニン、８−クロロアデニン及び８−ヨードアデニン）、８−アミノアデニン、８−スルフィドリルアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、７−メチルアデニン、２−ハロアデニン（例えば、２−フルオロアデニン、２−ブロモアデニン、２−クロロアデニン、及び２−ヨードアデニン）、２−アミノアデニン、８−アザアデニン、７−デアザアデニンもしくは３−デアザアデニンを含む、あらゆるアデニン関連塩基を含む。ウラシル又は、５−ハロウラシル（例えば、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、１−メチルシュードウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アゾウラシルもしくは４−チオウラシルを含む、あらゆるウラシル関連塩基も含まれる。当該技術分野において公知の他の修飾塩基変種の例には、以下に限定されないが、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（ｐ）（１）で列挙されるもの、例えば、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２’−メトキシシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルシュードウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチル−カルバモイル）スレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウリジン、ケオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジンが含まれる。ヌクレオチドには、米国特許第３，６８７，８０８号、同第３，６８７，８０８号、同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号及び同第５，６８１，９４１号に記載されるあらゆる修飾核酸塩基も含まれる。当技術分野で公知の修飾ヌクレオシド及びヌクレオヂド糖骨格変種の例には、以下に限定されないが、例えば、２’リボシル置換、例えば、Ｆ、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２、ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２、ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２Ｎ（ＣＨ_３）_２、Ｏ（Ｃ_１−１０アルキル）、Ｏ（Ｃ_２−１０アルケニル）、Ｏ（Ｃ_２−１０アルキニル）、Ｓ（Ｃ_１−１０アルキル）、Ｓ（Ｃ_２−１０アルケニル）、Ｓ（Ｃ_２−１０アルキニル）、ＮＨ（Ｃ_１−１０アルキル）、ＮＨ（Ｃ_２−１０アルケニル）、ＮＨ（Ｃ_２−１０アルキニル）、及びＯ−アルキル−Ｏ−アルキルを有するものが含まれる。望ましい２’リボシル置換には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ_３）、２’−アミノプロポキシ、（２’ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）、２’−アリル（２’−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’−アミノ（２’−ＮＨ_２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。２’−置換はアラビノ（上）位置又はリボ（下）位置であり得る。

本明細書中で使用する場合、「５’−５’反転ヌクレオチドキャップ」という用語は、第１のヌクレオチドの５’位とオリゴヌクレオチドの５’末端との間のホスホジエステル結合を介した、オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合する第１のヌクレオチドを意味する。

「３’−３’反転ヌクレオチドキャップ」という用語は、最終ヌクレオチドの３’位とオリゴヌクレオチドの３’末端との間のホスホジエステル結合を介して、オリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合する最終ヌクレオチドを意味するものとして本明細書中で使用される。

「立体」という用語は、「立体障害」における場合、ある分子的実体（例えばタンパク質）と別のもの（例えば相互作用するタンパク質）との結合又は相互作用が制限又は妨害されることを指す。「立体障害」という用語は、立体グループにおける原子又は基の、大きさ及び／又は空間的配置ゆえに、アプタマーの標的タンパク質と、標的タンパク質結合パートナー（例えばその受容体とのリガンド）との結合を制限又は妨害することにおける、可溶性の高分子量立体基を有する立体的に強化されたアプタマーの影響を含む。

「治療用」という用語は、本明細書中で使用する場合、処置及び／又は予防を含む。使用される場合、「治療用」は、ヒトならびにその他の動物に関する。

「ＶＥＧＦアプタマー」又は「抗ＶＥＧＦアプタマー」は、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦの活性を阻害するポリヌクレオチドアプタマーを包含するものとする。このような抗アプタマーは、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー又は混合（すなわち、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方）組成物を有するアプタマーであり得る。公知の方法を用いてこのようなアプタマーを同定することができる。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号及び第５，２７０，１６３号（参照によりその全体を本明細書中に組み込む。）に記載されるように試験管内人工進化法又はＳＥＬＥＸ法を用いることができる。抗−ＶＥＧＦアプタマーは、米国特許第６，１６８，７７８号、第６，０５１，６９８号、第５，８５９，２２８号及び第６，４２６，３３５号（参照によりその全体を本明細書中に組み込む。）に記載される配列を含む。これらの配列は、５’−５’及び／又は３’−３’反転キャップを含むように修飾することができる（Ａｄａｍｉｓ，Ａ．Ｐ．ら、ＷＯ２００５／０１４８１４（参照によりその全体を本明細書中に組み込む。）を参照のこと。）。

他に具体的に指示されない限り、「又は」という単語は、本明細書中で、「及び／又は」の包括的な意味で用いられ、「いずれか／又は」の排他的な意味ではない。

本明細書中で使用する場合、「増加」及び「減少」は、それぞれ、統計的に有意の増加（すなわち、ｐ＜０．１）及び統計的に有意の減少（すなわち、ｐ＜０．１）を意味する。

変数の数値範囲の列挙は、本明細書中で使用する場合、この範囲内の数値のいずれかに等しい変数で本発明を実施できることを伝えようとするものである。したがって、本質的に不連続である変数については、この変数は、この範囲の終点を含めて、この数値範囲内のあらゆる整数値に等しいものであり得る。同様に、本質的に連続的である変数については、この変数は、この範囲の終点を含めて、この数値範囲内のあらゆる実数値に等しいものであり得る。例として、以下に限定されないが、０から２の値を有するものと記載される変数は、本質的に不連続である変数については０、１又は２であり得、本質的に連続的である変数については０．０、０．１、０．０１、０．００１、又は≧０及び≦２であるあらゆる他の実数値であり得る。

修飾オリゴヌクレオチド標的物
本明細書中に記載の方法を用いて検出及び／又は定量できる修飾オリゴヌクレオチドには、修飾ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、アプタマー、アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉ及びｓｉＲＮＡ分子が含まれる。このような分子は、合成核酸類似体又は天然及び合成核酸類似体の組合せを含有し得る。合成核酸類似体には、１以上の骨格、塩基又は糖修飾を含有するものが含まれる。このような修飾は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｖｅｒｍａら、（（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４）を参照のこと。特に、本方法を用いて配列決定され得る修飾核酸分子には、フッ素化、メチル化、ＰＥＧ化（例えば５’末端において）、反転デオキシチミジンキャップ又はその他の５’もしくは３’末端修飾などの修飾を含有する核酸分子が含まれる。修飾分子は、より多くの修飾のうち１つを含有し得る。例えば、分子は、フッ素及びメチル基を含有し得る。

本発明の方法により分析される修飾オリゴヌクレオチドは、１以上修飾されたヌクレオシド間結合を含み得る。このような修飾ヌクレオシド間結合には、ホスホロチオアート及び／又はホスホロジチオアート結合が含まれる。ホスホロチオアート及び／又はホスホロジチオアートヌクレオチド間結合の数は、１から、オリゴヌクレオチド中に存在するだけ多くのヌクレオチド間結合数までの範囲であり得る。例えば、本発明による修飾オリゴヌクレオチドは、約１０から約１００ヌクレオチド長の範囲であり得、有用には、約２０から約５０ヌクレオチド長の範囲であり得る。したがって、後者の実施形態において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、１９から約４９のホスホロチオアート及び／又はホスホロジチオアートヌクレオチド間結合を有する。

本発明の方法により分析される修飾オリゴヌクレオチドは、１もしくは２’−置換リボヌクレオチド又はこれらの組合せを有するものを含み得る。本発明の目的のために、「２’−置換」という用語は、２’−Ｈではなく、例えば２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−アリール、２’−Ｏ−アルキル、２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）又は２’−アミノによる、リボース分子の２’−ＯＨの置換を意味し、ここで、アリル、アリール又はアルキル基は、非置換であるか又は、例えばハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボニル、カルボアルコキシ又はアミノ基で置換されている。本発明による修飾オリゴヌクレオチドは、１以上のリボヌクレオチド又は２’−置換リボヌクレオチドを含有し得る。例えば、このようなオリゴヌクレオチドは、デュプレックス安定性を向上させるために、６以上のリボヌクレオチド及び／又は２’−置換リボヌクレオチドを有し得る。このようなリボヌクレオチド及び／又は２’−置換リボヌクレオチドは、単独で、ペアで、又はより大きい連続したセグメントで存在し得、オリゴヌクレオチド内の何れかの位置で、又はオリゴヌクレオチド内の複数の位置で存在し得る。このようなリボヌクレオチド及び／又は２’−置換リボヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド内の１つのヌクレオシドを除いて全て含み得る。したがって、特に有用な実施形態において、約２０から約５０個のヌクレオチドを有する場合、リボヌクレオシド又は２’−置換リボヌクレオチドの数は、約２０から約５０個の範囲である。修飾オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド残基をさらに含み得る。

本発明の方法での使用のための修飾オリゴヌクレオチド（例えばアプタマー）は、特に、核酸配列の何れかの位置でオリゴヌクレオチド（例えば標的特異的アプタマー）に結合し得る可溶性の高分子量立体基により修飾されているものを含む（米国出願第１１／１０５，２７９号を参照のこと。）。

例えば、立体基の結合は、アプタマー核酸の５’末端、アプタマー核酸の３’末端又は５’と３’末端との間のアプタマー核酸配列に沿った何れかの位置を介し得る。例えば、高分子量立体基は、塩基の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５位、プリンヌクレオチドの８位、リン酸のヒドロキシル基又はアプタマー核酸配列のリボース基のヒドロキシル基でアプタマーに結合し得る。これらの様々な位置でアプタマー核酸配列に対して高分子量立体基を化学結合する手段は、当技術分野で公知であり、及び／又は以下で例示する。

このような高分子量立体基には、通常、アプタマー−結合標的とその結合パートナーとの間の相互作用を立体的に妨害するのに十分な流体力学的体積を有する何らかの可溶性高分子量化合物が含まれる。例としては、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）、ゲル形成化合物などが挙げられる。本明細書中で教示される手段及び本明細書中で教示される方法及び組成物を用いて、特定の可溶性高分子量立体基の最適特性を最適化し得る。本発明の特に有用な立体基の例としては、多糖類、例えばグリコサミノグリカン、ヒアルロナン及びアルギン酸塩、ポリエステル、高分子量ポリオキシアルキレンエーテル（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^ＴＭなど）、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリレート、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物、カルボキシメチルセルロース、その他のセルロース誘導体、キトサン、ポリアルデヒド又はポリエーテルが挙げられる。特に有用な立体基は、約２０から約１００ｋＤａの分子量及び／又は、立体障害を与えるのに十分な大きさの流体力学的体積を有する（例えば、アンタゴニストアプタマー標的の、標的結合パートナーとの結合、例えばリガンドとその受容体との結合をブロックするのに十分な大きさ。）。

さらに、ヌクレアーゼ耐性及び／又はその他の薬物動態学的特性を向上させるために非免疫原性の高分子量又は新油性化合物を５’末端に付加することも記載されている（例えば、米国特許第６，０１１，０２０号、同第６，１４７，０２４号、同第６，２２９，００２号、同第６，４２６，３３５号、同第６，４６５，１８８号及び同第６，５８２，９１８号）。親油性基の例は、飽和又は不飽和炭化水素、例えばアルキル、アルケニル又はその他の脂質基である。ステロール（例えば、コレステロール）及びその他の医薬的に許容されるアジュバント（α−トコフェロールのような抗酸化剤を含む。）も、小胞安定性を向上させるか、又はその他の所望の特性を与えるために含まれ得る。通常、修飾オリゴヌクレオチドを形成するための結合のためのこのような「親油性化合物」は、実質的に親油性成分からなる構造を含む、誘電定数が低い、脂質及び／又はその他の物質もしくは相と会合する、又はそれらに分離する傾向を有する化合物である。親油性化合物は、脂質ならびに、脂質（及び／又は誘電定数が低い、その他の物質もしくは相）と会合する傾向を有する化合物を含有する非脂質を含む。コレステロール、リン脂質及びグリセロ脂質、例えばジアルキルグリセロール及びジアシルグリセロール、及びグリセロアミド脂質は、このような親油性化合物のさらなる例である。

本発明の方法において有用な修飾オリゴヌクレオチドには、特に、アプタマーが含まれる。アプタマーは、タンパク質リガンドに特異的に結合できるようにする三次構造を有する核酸分子である（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５−９；及びＰａｔｅｌ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：３２−４６）。修飾塩基を含有する核酸のライブラリから、このような分子を選択し得る（例えば、リガンドの試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）を用いて。）。ＳＥＬＥＸ ｐｒｏｃｅｓｓ：ａ ｓｕｒｐｒｉｓｉｎｇ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ｇｏｌｄ Ｌ．Ｈａｒｖｅｙ Ｌｅｃｔ．１９９５−９６；９１：４７−５７。ある場合において、アプタマーなどの選択された核酸は、選択に続き、化学的に修飾（例えば、メチル化により。）及び／又は例えばポリエチレングリコール、脂質、リポタンパク質又はリポソームに結合される。オリジナルＳＥＬＥＸ選択核酸の配列は既知であり得るが、続く適用において核酸配列を確認することが望ましいであろう。例えば、分子の核酸配列を製造プロトコルにおいて又は薬物承認プロセスのために確認することが望ましいか、又は必要とされることがあり得る。しかし、ある一定のタイプの修飾は、修飾核酸分子の配列決定を妨げるということが当技術分野で実質的に明らかになっており、信じられている。

アプタマー核酸配列は、幅広い様々な標的分子に結合するように調製されてきた。本発明のアプタマー核酸配列は、完全にＲＮＡもしくは部分的にＲＮＡ、又は完全に又は部分的にＤＮＡ及び／又はその他のヌクレオチド類似体から構成され得る。アプタマーは、通常、ＳＥＬＥＸとして知られる、既知のインビボ又はインビトロ（最も多いのはインビトロ）選択技術を用いて、特定のリガンドを結合するように開発される。アプタマーを作製する方法は、例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８；Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：５０５；米国特許第５，５８２，９８１号；同第５，７５６，２９１号及び同第５，２７０，１６３号；ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４５０６、ＷＯ９９／２７１３３、ＷＯ９７／４２３１７及びＷＯ００／２００４０；Ｌｏｒｓｃｈ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：９７３；Ｍａｎｎｉｒｏｎｉら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：９７２６；Ｂｌｉｎｄ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：３６０６−３６１０；及びＨｕｉｚｅｎｇａ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：６５６−６６５に記載されている。

通常、それらの最も基本的な形態において、ＲＮＡアプタマーを同定するためのインビトロ選択技術は、無作為化又は突然変異誘発された少なくともいくつかの領域を含有する所望の長さのＤＮＡ分子の大きなプールを最初に調製することを含む。例えば、アプタマー選択に対する通常のオリゴヌクレオチドプールは、ＰＣＲプライマーの結合に有用な明確な配列の約１０から３０のヌクレオチド長の領域と両端で近接している、２０から１００の無作為化ヌクレオチドの領域を含有し得る。標準的ＰＣＲ技術を用いて、オリゴヌクレオチドプールを増幅させる。次に、ＤＮＡプールをインビトロで転写する。次に、ＲＮＡ転写物をアフィニティクロマトグラフィーに供する。最も典型的には、転写物をカラムに通すか、又は、標的リガンドがその上に固定化されている磁気ビーズなどと接触させる。リガンドに結合するプール中のＲＮＡ分子はカラム又はビーズ上に保持され、一方、非結合配列は洗い流される。次に、リガンドに結合するＲＮＡ分子を逆転写し、再びＰＣＲで増幅する（通常、溶出後）。次いで、選択されたプール配列を選択の同じタイプの別のラウンドに供する。通常、プール配列を選択手段の合計約３回から１０回の反復ラウンドに供する。次に、ｃＤＮＡを増幅し、クローニングし、標的リガンドに対してアプタマーとして作用することができるＲＮＡ分子の配列を同定するために、標準的手段を用いて配列決定を行う。

アプタマー及び会合されるリガンドに対する会合定数は、例えば、リガンドがアプタマーに結合するために機能し、リガンド投与時に得られるリガンド濃度で所望の効果を有するようなものである。インビボでの使用の場合、例えば、会合定数は、結合が、血清又はその他の組織（眼球硝子体液など）中で達成され得るリガンドの濃度以下で起こるようなものであるべきである。例えば、インビボでの使用のために必要とされるリガンド濃度はまた、生体において望ましくない影響を有し得る濃度未満でもある。

ＲＮＡ、ＤＮＡ及び混合組成物などに加えて、アプタマー核酸配列を修飾し得る。例えば、ある種の修飾ヌクレオチドは、これらを含有する高親和性核酸リガンドにおける特性を向上させ得る（例えば、インビボ安定性を向上させる、又は送達特性を向上させるなどのように。）。このような修飾の例としては、リボース及び／又はリン酸及び／又は塩基位置における化学置換が挙げられる。修飾ヌクレオチドを含有する、ＳＥＬＥＸで同定された核酸リガンドは、米国特許第５，６６０，９８５号（題名：「Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，」（ピリミジンの５−及び２’−位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載する。）に記載されている。米国特許第５，６３７，４５９号（前出）は、２’−アミノ（２’−ＮＨ_２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）及び／又は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１以上のヌクレオチドを含有する高い特異性の核酸リガンドを記載する。米国出願第０８／２６４，０２９（１９９４年６月２２日提出、題名：「Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｎｏｗｎ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ ２’Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ，」は、様々な２’−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載する。

本発明の方法により分析できるアプタマー核酸配列はさらに、米国特許第５，６３７，４５９号、題名「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＳＥＬＥＸ」及び米国特許第５，６８３，８６７号、題名「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｂｌｅｎｄｅｄ ＳＥＬＥＸ」でそれぞれ記載されているような、その他の選択されたオリゴヌクレオチド及び／又は非オリゴヌクレオチド機能単位と組み合わせ得る。

本発明の方法により分析できるアプタマー修飾オリゴヌクレオチドは、特定の治療又は診断的目標を達成するために、生物標的と特異的に結合するように設計される。例えば、ＶＥＧＦのアプタマーアンタゴニストは、血管新生に関与する疾患の治療に有用である。ＶＥＧＦアンタゴニストは、例えば、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、高齢者において結果として他の疾患よりも重篤な失明を招く、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）があることを特徴とする進行性の症状を治療するために使用されている（Ｃｓａｋｙら（２００３）Ｏｐｈｔｈａｏｍｏｌ．１１０：８８０−１）。通常標的特異的アプタマー及びＶＥＧＦアプタマーを得るためのＳＥＬＥＸプロセス及び特に処方物は、例えば米国特許第５，２７０，１６３号、同第５，４７５，０９６号、同第５，６９６，２４９号、同第５，６７０，６３７号、同第５，８１１，５３３号、同第５，８１７，７８５号、同第５，９５８，６９１号、同第６，０１１，０２０号、同第６，０５１，６９８号、同第６，１４７，２０４号、同第６，１６８，７７８号及び同第６，４２６，３３５号に記載されている。

多くのその他のアプタマー配列は、様々なその他の生物標的を標的とするように作製されてきた。例えば、アプタマー配列は、ＰＤＧＦ（米国特許第５，６６８，２６４号、同第５，６７４，６８５号、同第５，７２３，５９４号、同第６，２２９，００２号、同第５，５８２，９１８号及び同第６，６９９，８４３号参照。）、塩基性ＦＧＦ（米国特許第５，４５９，０１５号及び同第５，６３９，８６８号参照。）、ＣＤ４０（米国特許第６，１７１，７９５号参照。）、ＴＧＦｂ（米国特許第６，１２４，４４９号、同第６，３４６，６１１号及び同第６，７１３，６１６号参照。）、ＣＤ４（米国特許第５，８６９，６４１号参照。）、絨毛ゴナドトロピンホルモン（米国特許第５，８３７，４５６号及び５，８４９，８９０号参照。）、ＨＫＧＦ（米国特許第５，７３１，４２４号、同第５，７３１，１４４号、同第５，８３７，８３４号及び同第５，８４６，７１３号参照。）、ＩＣＰ４（米国特許第５，７９５，７２１号参照。）、ＨＩＶ逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号参照。）、ＨＩＶインテグラーゼ（米国特許第５，５８７，４６８及び同第５，７５６，２８７号参照。）、ＨＩＶ−ｇａｇ（米国特許第５，７２６，０１７号参照。）、ＨＩＶ−ｔａｔ（米国特許第５，６３７，４６１号参照。）、ＨＩＶ−ＲＴ及びＨＩＶ−ｒｅｖ（米国特許第５，４９６，９３８号及び同第５，５０３，９７８号参照。）、ＨＩＶヌクレオキャプシド（米国特許第５，６３５，６１５号及び同第５，６５４，１５１号参照。）、ニュートフィルエラスターゼ（米国特許第５，４７２，８４１号及び同第５，７３４，０３４号参照。）、ＩｇＥ（米国特許第５，６２９，１５５号及び同第５，６８６，５９２号参照。）、タキキニンサブスタンスＰ（米国特許第５，６３７，６８２号及び同第５，６４８，２１４号参照。）、分泌性ホスホリパーゼＡ２（米国特許第５，６２２，８２８号参照。）、トロンビン（米国特許第５，４７６，７６６号参照。）、腸ホスファターゼ（米国特許第６，２８０，９４３、６，３８７，６３５号及び同第６，６７３，５５３号参照。）、テネイシン−Ｃ（米国特許第６，２３２，０７１号及び同第６，５９６，４９１号参照。）、ならびにサイトカイン（米国特許第６，０２８，１８６号参照。）、７回膜貫通型Ｇタンパク質カップリング受容体（米国特許第６，６８２，８８６号参照。）、ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，６９３，５０２号、同第５，７６３，１７３号、同第５，８７４，５５７号及び同第６，０２０，１３０号参照。）、補体系タンパク質（米国特許第６，３９５，８８８号及び同第６，５６６，３４３号参照。）、レクチン（米国特許第５，７８０，２２８号、同第６，００１，９８８号、同第６，２８０，９３２号及び同第６，５４４，９５９号参照。）、インテグリン（米国特許第６，３３１，３９４号参照。）、肝細胞増殖因子／細胞分散因子（ＨＧＦ／ＳＰ）又はその受容体（ｃ−ｍｅｔ）（米国特許第６，３４４，３２１号参照。）及びアンジオポエチン（ＷＯ２００２／０２６９３２参照。）を標的とするものが開発されてきた。所望の生物標的を標的とするさらに多くのアプタマーが、ＳＥＬＥＸによる方法の適応性を与えられ得る。

本発明の特に有用なアプタマー標的には、接着分子及びそれらのリガンドが含まれ、これらの多くは、細胞情報伝達を促進する大きな多ドメイン細胞外領域を有し、これらは、本発明の方法及び組成物に特に適している。接着分子としては、セレクチン（例えば、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ、これは、硫酸化ＧｌｙＣＡＭ−１、ＣＤ３４及びＭＡｄＣＡＭ−１と結合する。）、Ｅ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）及びＰ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ））；インテグリン（例えば、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）（これは、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２及びＩＣＡＭ−３と結合する。）及びＣＤ１１ｂ（これは、ＩＣＡＭ−１、第Ｘ因子、ｉＣ３ｂ及びフィブリノーゲンと結合する。））；ＭＡＧ（ミエリン関連糖タンパク質）、ＭＯＧ（ミエリン−オリゴデンドロサイト糖タンパク質）及びＮＣＡＭ−Ｉ（ＣＤ５６）などの神経特異的ＩｇＣＡＭＳ及び、ＩＣＡＭ−Ｉ（ＣＤ５４）（ＬＦＡ−Ｉに結合。上記参照。）、ＩＣＡＭ−２（ＣＤ１０２）、ＩＣＡＭ−３（ＣＤ５０）及びＣＤ４４（ヒアルロニン、アニキリン、フィブロネクチン、ＭＩＰＩｂ及びオステオポンチンに結合する。）などの全身性ＩｇＣＡＭを含むタンパク質の免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー；ならびにカドヘリン（カドヘリンＥ（１）、Ｎ（２）、ＢＲ（１２）、Ｐ（３）、Ｒ（４）など及びデスモコリン１などのデスモコリンなど。）が挙げられる。

ある場合において、検出のための修飾オリゴヌクレオチドは、アンチセンス核酸である。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的又はｍＲＮＡ配列に相補的な）ヌクレオチド配列を含み得るか、又は、転写された非コード配列（例えば遺伝子の５’及び３’非翻訳領域）に相補的であり得る。アンチセンス核酸は、全体的なコード鎖又はその一部のみに相補的であり得る。天然ヌクレオチド又は、分子の生物学的安定性を向上させるように設計された、もしくは、アンチセンスとセンス核酸との間（例えば、使用され得る、ホスホロチオアート誘導体とアクリジン置換ヌクレオチドとの間）に形成されるデュプレックスの物理的安定性を向上させるように設計された、様々な修飾ヌクレオチドを用いて、アンチセンス分子及びその他の核酸分子を化学的に合成し得る。本明細書中に記載の方法を使用して、このような修飾分子を検出及び／又は定量し得る。ある実施形態において、アンチセンス核酸は、配列（５’から３'）：ＣＡＣ ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＡ Ｇ（配列番号１７）を有する。

その他のタイプの修飾を含有する核酸も本明細書中に記載のように配列決定し得る。例えば、全身投与の場合、例えば、細胞表面受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体に核酸分子を連結することにより、選択された細胞表面で発現される受容体又は抗原に特異的に結合するように核酸分子を修飾する。修飾核酸分子のさらなる例には、１以上の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１-６１４８）又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を含有するものが含まれる。記載の方法を用いて、検出可能な標識（例えば、蛍光、化学発光、放射活性又は比色）を含有する核酸分子を配列決定し得る。

塩基部分、糖部分又はリン酸骨格において、核酸分子を修飾し、例えば、分子の、安定性、ハイブリダイゼーション又は溶解性を向上させることができる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成させることができる（Ｈｙｒｕｐら、１９９６、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：５−２３を参照のこと。）。本明細書中で使用する場合、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」という用語は、核酸模倣物、例えば、ＤＮＡ模倣物を指し、デオキシリボースリン酸骨格は擬ペプチド骨格により置き換えられ、４個の天然核酸塩基のみが保持される。ＰＮＡの中性骨格により、イオン強度が低い条件下でＤＮＡ及びＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能とすることができる（Ｈｙｒｕｐら、１９９６、前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１４６７０−１４６７５）。

ある場合において、修飾核酸は、ペプチドなどの付加基（例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的とするため）又は、細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：６４８-６５２；ＰＣＴ公開ＷＯ８８／０９８１０）もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８９／１０１３４）を通る輸送を促進する物質を含む。さらに、ハイブリダイゼーション誘発切断物質（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照のこと。）又は挿入剤（例えば、Ｚｏｎ、１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと。）を用いて、オリゴヌクレオチドを修飾することができる。この目的に対して、オリゴヌクレオチドを別の分子に結合させることができる（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、又はハイブリダイゼーション誘発切断物質）。本発明に記載の方法を用いて配列決定され得るさらに別のタイプの修飾核酸は、分子指標オリゴヌクレオチドプライマー及び選択された核酸に相補的な少なくとも１個の領域を有するプローブ分子であり、分子指標が、試料中の選択された核酸の存在を定量するのに有用であるように、２つの相補的領域のうち１つは蛍光プローブを有し、１つは消光剤を有する。分子指標核酸は、例えば、米国特許第５，８５４，０３３号；同第５，８６６，３３６号及び同第５，８７６，９３０号に記載されている。

ある場合において、検出のための修飾オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）；遺伝子抑制の技術のために用いられる核酸である。「ＲＮＡｉ」核酸は、ある一定の遺伝子にマッチする配列がその遺伝子の発現を妨害する、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の小さな断片を含み得る。細胞にＲＮＡｉ核酸を導入して、メッセンジャーＲＮＡを混乱させ、タンパク質への翻訳を妨害することができる。ある実施形態において、ＲＮＡｉ核酸は、配列５'から３’ＵＵＧ ＣＡＣ ＡＵＵ ＧＣＵ ＣＡＧ ＵＵＣ ＡＵＡ ＣＡＣ Ｃ（配列番号１８）を有する。次のＲＮＡｉアンチセンス鎖（５’から３'）：ＧＧＵ ＧＵＡ ＵＧＡ ＡＣＵ ＧＡＧ ＣＡＡ ＵＧＵ ＧＣＡ Ａ（配列番号１９）とともに、この配列を与える。

ポリヌクレオチド
本発明のデュアルハイブリダイゼーション検出／定量法において使用するためのポリヌクレオチドは、第一の、つまり捕捉プローブ及び第二の、つまり検出プローブ、ポリヌクレオチドを含む。第一及び第二のポリヌクレオチドは通常、それぞれ標的修飾オリゴヌクレオチド（例えばアプタマー）の（非重複）部分にハイブリダイズする。本発明のポリヌクレオチド核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ又は混合物、又はそれらの、合成、化学的修飾型であり得る。第一及び第二のポリヌクレオチドのそれぞれの標的に対するハイブリダイゼーションの領域は、それらが同時に完全に標的にハイブリダイズし、続いて、場合によっては第一のポリヌクレオチド−第二のポリヌクレオチド結合物へと一緒にライゲーションされるように、２つの標的が重複し、有用に隣接する限り、標的オリゴヌクレオチドの、５’領域又は３’領域の何れかに対応し得る。

ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、少なくとも約８個のヌクレオチド（ｎｔ）、例えば少なくとも約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、２０又は約３０以上のヌクレオチド（例えば、４０、５０又は６０）ヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡの何れか）であるものとする。一般に、本発明の第一及び第二のポリヌクレオチドは、１０から３０、１２から２０又は１３から１５ヌクレオチドの範囲の、およそ何らかの整数個、つまり、参照ポリヌクレオチドの全長とハイブリダイズする。これらは、以下に限定されないが、上述のような、及び下記で詳述する、診断用プローブ及びプライマーの用途を有する。例えば、「少なくとも１０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの一部とは、特に挙げる範囲を含むものとする。

本明細書中で使用する場合、「特異的にハイブリダイズする」又は「特異的に検出する」という用語は、本発明の核酸分子が、アプタマー（例えばＶＥＧＦアプタマー）などの標的オリゴヌクレオチドの少なくともおよそ６、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３５、４０、５０、１００もしくは連続ヌクレオチド又はそれに相補的な配列又はそれらの天然の突然変異型にハイブリダイズできることを指す。

特に有用なポリヌクレオチドは、特異的に本発明の修飾オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。本発明の特異的なポリヌクレオチドは、適切なストリンジェンシー下で、修飾オリゴヌクレオチド（例えばアプタマー）などの標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は、例えば、実施例中で以下に与える（例えば、６ｘＳＳＣ／１.０％サルコシル）。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進するその他の条件には、約２５から４５℃での６．０ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて、２５から５０℃での２．０ｘＳＳＣを用いた洗浄が含まれる。その他の条件は当業者にとって公知であるか、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６．３．６で見出すことができる。さらに、室温、約２２℃での低いストリンジェンシー条件から、高温でのより高いストリンジェンシー条件へと、洗浄段階の温度を上昇させることができる。温度及び塩の両方を変化させるか、温度又は塩の何れかを一定に保ち、他方の可変要素を変化させることができる。ある有用な実施形態において、標的修飾オリゴヌクレオチドは、例えば約２．０ｘＳＳＣ及び約４０℃の中程度のストリンジェント条件下で、第一又は第二のポリヌクレオチド（つまり、捕捉及び検出プローブ）の１つに結合する。

有用なポリヌクレオチドは、標的修飾オリゴヌクレオチド配列と、少なくとも約７５％相同、少なくとも８０％相同、少なくとも８５％相同、少なくとも９０％相同又は少なくとも９５％相同である配列を有する。例えば、図１で示される、及びより一般的には、標的修飾オリゴヌクレオチドと同一でない配列を有する、ヌクレオチド配列と異なる配列を有する第一及び第二のポリヌクレオチドが本発明に含まれる。

タグ
本発明は、本発明のポリヌクレオチドに結合するための１以上のタグを含む。本発明の特に有用なタグは、本発明の捕捉プローブ（すなわち第一のポリヌクレオチド）に結合させられ、捕捉プローブを固定化させ、それに特異的にバイブリダイズしている何らかである（例えば、標的オリゴヌクレオチド又は標的オリゴヌクレオチド及び検出プローブ（つまり第二のポリヌクレオチド））。本発明のタグは、洗浄又は当技術分野で公知のその他の手段（例えば磁気ビーズを介した分離）などにより、捕捉プローブと特異的に会合する、オリゴヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドを分離するのに有用である。

例えば本発明の第一のポリヌクレオチド／捕捉プローブへの連結時に使用するための本発明のタグの例としては、タグ含有複合体を固体支持体に連結させるために使用され得る何らかの固定化物質が挙げられる（例えば、「洗浄」による除去に耐えるものなど。）。本発明に従う固定化部分として適した多くの固体支持体が当技術分野で周知であり、文献に広く記載されており、一般的に言えば、固体支持体は、化学及び生物学的手段において、現在広く使用されているか、又は固定化、分離などのために提案されている、周知の支持体又はマトリクスの何れかであり得る。したがって、例えば、固定化部分は、例えばポリマー性物質（例えばアガロース、セルロース、アルギン酸塩、テフロン、ラテックス又はポリスチレン）製の、粒子、シート、ゲル、フィルター、膜、マイクロファイバー片、チューブ又はプレート、ファイバーもしくは毛細管の形を取り得る。例えばＮｉｌｓｓｏｎら（（１９９５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：４００−４０８）に記載のような小型実験系を与えるための、又は診断ツールとしての、固体支持体として、バイオチップを使用し得る。特定の物質、特にビーズは、この目的に一般に有用である。例えば、セファロース又はポリスチレンビーズを使用し得る。固定化部分は、磁気粒子を含み得、これにより、磁気凝集により固定化した物質を容易に分離することができ（例えば、ストレプトアビジン磁気粒子（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１ ６４１ ７７８）、これを例えばビオチン化捕捉プローブとともに使用し得る。このような部分の要件は、洗浄の条件に対して安定であることである。磁気ビーズは、最適な希土類ネオジム永久磁石を含み得る。ある実施形態において、磁気ビーズは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^（Ｒ）である。Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、粒子全体に均一に分布する孔に沈殿した磁気物質を有する高度に架橋したポリスチレンからなる、均一な単一サイズ超常磁性ビーズである。この粒子はさらに、グリシジルエーテルの親水層で被覆されており、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ内部の酸化鉄を隠している。次いで、エポキシド又はカルボン酸などの官能基を表面に導入する。特定の実施形態において、本発明は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^（Ｒ）Ｍ−２７０カルボン酸（カルボン酸被覆）又はＤｙｎａｂｅａｄｓ^（Ｒ）Ｍ−２７０エポキシ（エポキシド被覆）を使用する。

固定化支持体は、ポリヌクレオチド結合のためのさらなる部分を有し得る。一般に、これらは、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジン、ＰＮＡ（又はＤＮＡ）及びＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ｌａｃＩ抑制タンパク質又はそれが結合するｌａｃＩオペレーター配列の何れか。）、抗体（モノクローナル又はポリクローナルであり得る。）、抗体断片又は、抗体の、エピトープもしくはハプテンなどの、親和性結合パートナーのペアの１つを含有する。これらの場合、結合ペアの１つのパートナーは、固定化部分に結合されており（又は本質的にその一部である。）、他方のパートナーは、第一のポリヌクレオチド（例えば捕捉プローブ）に結合されている（又は本質的にその一部である。）。当技術分野で周知の方法（これは、例えば、適切な表面被覆を与えるために固定化支持体を処理することにより与えられ得る、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド又はアミノ基を介した結合を含む。）により、前述の結合部分を固定化支持体に結合させ得る。例えば、米国特許第４，６５４，２６７号は、多くのこのような表面被覆の導入について述べている。別の代表的なタグ及び固定化支持体系については、５’−ＮＨ_２基及び、エポキシド又はカルボン酸基を含有する磁気ビーズを含有する捕捉プローブを用いて下記で述べる。エポキシド又はカルボン酸含有磁気ビーズを伴う捕捉プローブを添加すると、磁気ビーズ-オリゴヌクレオチド複合体が得られる。

検出可能な標識
ある実施形態において、本発明は検出可能な標識を含み、これは、本発明のポリヌクレオチド（例えば「検出プローブ」又は「第二のポリヌクレオチド」）の１つと結合させ得る。ある有用な実施形態において、検出可能な標識はジゴキシゲニン標識である。

利用しうる検出可能な標識の例としては、放射性標識、酵素、蛍光化合物、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、磁気部分、金属結合部分、抗原（例えばジゴキシゲニン）、ハプテン又は抗体部分などが挙げられる。代表的なハプテンとしては、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ及びフルオレセインが挙げられる（Ｈｏｌｔｋｅら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１２（１）：１０４−１１３及びＯｌｅｓｅｎら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１５（３）：４８０−４８５）。

本発明の検出可能マーカーとしては、以下に限定されないが、放射性標識ならびに比色、発光もしくは蛍光マーカー又は金が挙げられる。適切な放射性標識としては、以下に限定されないが、：^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３３Ｐ；^３５Ｓ、^３６Ｃｌ、^５１Ｃｒ、^５７Ｃｏ、^５９Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^９０Ｙ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ及び^１８６Ｒｅが挙げられる。蛍光マーカーとしては、以下に限定されないが、フルオレセイン、ローダミン及びオーラミンが挙げられる。比色マーカーとしては、以下に限定されないが、ビオチン及びジゴキシゲニンが挙げられる。ポリクローナル又はモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者にとって公知である。さらに、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素に連結させ得る第二抗体により、抗体又は核酸分子複合体を検出し得る。用い得るその他の酵素は、当業者にとって公知である。

ライゲーション
本発明は、第一及び第二のポリヌクレオチドを一緒にライゲーションするための、キット及び方法（これにより、第一及び第二のポリヌクレオチドと標的オリゴヌクレオチドとの間の三重複合体の安定性が向上する。）を含む。この任意のライゲーション段階により、本発明の方法の特異性及び感度が向上する。化学的に、又は適切な天然リガーゼもしくはそれらの変種を用いて、ライゲーションを達成し得る。ハイブリダイゼーションのみと比較して、ライゲーションが本発明の任意の特性のみを表す一方、ライゲーション段階を含める場合、検出の特異性及び感度が顕著に向上する。

利用可能な何らかの公知の酵素又は化学的方法を用いて、ライゲーションを達成し得る。例えば、ヌクレオチド末端がデオキシリボヌクレオチドポリヌクレオチドである場合、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用し得、一方、ヌクレオチド末端がリボヌクレオチドポリヌクレオチドである場合、ＲＮＡリガーゼを使用し得る。さらに、Ｐｆｕ、Ｔａｑ及びＴＴＨ ＤＮＡリガーゼなどの熱安定性リガーゼを高温（例えば６５℃から７２℃）で使用して、必要なインキュベーション時間を短縮しながら、特異性及び効率を向上させ得る。

請求する方法において何らかのリガーゼを使用し得ることが強調される。有用なリガーゼは、高率で１本鎖ＤＮＡの遊離末端をライゲーションできないリガーゼを含む、２本鎖ＤＮＡのニックにおいてホスホジエステル結合を形成するものである。熱安定性リガーゼはこの点で有用である。何らかの適切なリガーゼの使用の具体的な詳細は、当技術分野で公知である。例えば：Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｄａｖｉｓら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８０））、Ｅ．コリＤＮＡリガーゼ（Ｐａｎａｓｎｋｏら（１９７８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：４５９０−４５９２）、ＡＭＰＬＩＧＡＳＥ．ＲＴＭ．（Ｋａｌｉｎら（１９９２）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８３（２）：１１９−１２３；Ｗｉｎｎ−Ｄｅｅｎら、（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｎｇｌａｎｄ）７（３）：１７９-１８６）、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ（Ｂａｒａｎｙ（１９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８９−１９３（１９９１），Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（サーマス・サーモフィルス）ＤＮＡリガーゼ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（サーマス・スコトダクトゥス）ＤＮＡリガーゼ及びＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ（ロドサーマス・マリヌス）ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｏｒｂｊａｒｎａｒｄｏｔｔｉｒら（１９９５）Ｇｅｎｅ１５１：１７７−１８０）である。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに含まれるＤＭＡ末端をライーゲションすることができるため、ＲＮＡ標的配列を含むライゲーションに有用である（Ｈｓｕｉｈら、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＣＶ ＲＮＡ ｕｓｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌ．，Ｎｏｖ．３−７、１９９５））。ＲＮＡ鎖にハイブリダイズされた核酸鎖のＤＮＡ末端をライゲーションするために、Ｔ４ＲＮＡリガーゼも使用し得る。あるいは、ライゲーション剤は、臭化シアン又はカルボジイミドなどの化学物質であり得る（Ｓｏｋｏｌｏｖａら（１９８８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２３２：１５３−１５５）。

ライゲーションは、第一のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端を第二のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端（それぞれ、捕捉プローブ及び検出プローブ）に連結させて、連続的な機能的１本鎖オリゴヌクレオチド分子（ライゲーションされた増幅的配列）を形成するのに役立つ。ライゲーションされた増幅可能な配列の存在は、例えばジゴキシゲニン標識により直接検出され得る。捕捉及び標的オリゴヌクレオチドとの三重複合体における標識された第二のポリヌクレオチドの存在は、試料中に標的核酸が存在することを示す。あるいは、ライゲーションされた増幅配列は、ＰＣＲ又はＳＤＡなど、何らかの様々な増幅系に対して鋳型として役立つ。処理後にライゲーションされないままである何らかの第二のポリヌクレオチドプローブは、本方法での次の段階で増幅されない。

酵素法（つまりリガーゼを用いて）によるライゲーションに対する代替法として、捕捉及び検出プローブを化学的方法と組み合わせることができる（例えば、鎖を架橋させるための、ソラレン部分及びＵＶ光）。

増幅検出及び／又は定量
本発明は、増幅可能な配列、例えば検出プローブに存在する増幅可能な配列を増幅させるための方法を含む。基本的なＰＣＲ技術は、関心のある核酸配列の増幅に適用する。基本的なＰＣＲ技術に対する方法及び組成物は、当技術分野で周知である（例えば、Ｋｅｌｌｏｇｇ（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：２０２−８；及びＰａｎｇ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４３：８５−８９を参照のこと。）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、当技術分野で公知の様々な核酸増幅法の何らかにより、核酸増幅を行うことができる。様々な増幅法が当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号及び４，６８３，２０２号及びＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０に記載されている。本発明の実施において、核酸増幅に対して何らかの公知の方法を使用し得る。

同様に、ＰＣＲ増幅産物検出のための何らかの公知の方法を使用し得る。例えば、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウムによる染色は、ＤＮＡ単位複製配列を検出する一般的な周知の方法である。別の方法は、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４１６７−４１７５、１９９４）である。検出オリゴヌクレオチドをマイクロタイタープレートのウェルに固定化する。関心のある領域の熱増幅後（挿入配列における１つのプライマー及び近接した隣接ゲノム配列における１つのプライマーを使用。）、１本鎖熱増幅産物を固定化したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることができ、ＤＮＡポリメラーゼ及び、予想される次の塩基に対して特異的な標識ｄｄＮＴＰ（ジデオキシヌクレオチド三リン酸）を用いた１塩基伸長反応に対する鋳型として使用し得る。読み出しは、蛍光又はＥＬＩＳＡを用いて行い得る。シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション及び１塩基伸長が成功したことにより、単位複製配列配列の存在を示す。

特に有用な実施形態において、本発明は、検出プローブ／標的オリゴヌクレオチドの、高感度の検出及び／又は定量に対するＲＴ−ＰＣＲ反応を含む。逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）において、逆転写段階を基本的なＰＣＲプロトコールに付け加える。これにより、特異的なＲＮＡ核酸、例えばリボヌクレオチドポリヌクレオチドの検出及び定量へ基本的なＰＣＲ法が適応させられる。

ＲＴ−ＰＣＲを行うための方法は、当技術分野で公知である。簡潔に述べると、逆転写段階でのｃＤＮＡの合成後、増幅段階において適切なエンドポイントに対してＰＣＲを行い、次いで、検出、つまりアッセイの段階において、反応産物の定量を行うことができる。「リアルタイムＰＣＲ」（又は「カイネティックＰＣＲ」）として知られるＲＴ−ＰＣＲの変形において、増幅及び検出段階を組み合わせる。ＰＣＲ産物の量がサイクルごとに増加するのをリアルタイムで定量する。増幅反応において従来のフォワード及びリバースプライマーとともに「プローブ」を含むことにより、これを達成し得る。増幅配列内でハイブリダイズするプローブは、通常、約２０から２５ヌクレオチド長である。市販のＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、５’末端に蛍光レポーター部分（色素）を、及び３’末端に消光剤部分（色素）を含む。インタクトなプローブにおいて、レポーターの蛍光は、消光剤部分により内在的な消光を介して強く抑制される。進行するＴａｑポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ作用がハイブリダイズしたプローブを消化する場合、レポーターは消光されず、結果として蛍光を発し、それが検出及び定量される（図３参照。）。

リアルタイムＰＣＲによるポリヌクレオチドの定量は、相対的又は絶対的である。いずれの場合においても、試料中のポリヌクレオチドの定量は、適切な標準曲線に対する参照によるものである。相対的定量に対する標準曲線の場合、基本的な試料（「キャリブレーター」と呼ばれることが多い。）に対して量を表す。実験試料の場合、標的物質の量は標準曲線から求められ、それをキャリブレーターの値で割る。したがって、キャリブレーターは、１ｘ試料となり、その他の全ての量は、キャリブレーターに対するｎ倍の違いとして表される。例えば、体液中のアプタマーの安定性の実験において、生体試料に曝露されていない未処理対照アプタマーを適切なキャリブレーターとして使用する。実験的量をキャリブレーター量で割るので、標準曲線単位、例えば蛍光強度は脱落する。これは、相対的量に対して、適切な連続希釈系列を調製した後、標的オリゴヌクレオチドを含有する修飾オリゴヌクレオチドの何らかのソースを使用して標準曲線を作成することができることを意味する。一方、リアルタイムＰＣＲによるオリゴヌクレオチドの絶対的量は、標的配列を含有するＲＮＡの絶対量が独立に知られている標準物質を必要とする。標的修飾オリゴヌクレオチド（例えばアプタマー）の保存溶液を用いて単純に標準曲線を作成することにより、これを得ることができる。ある実施形態において、１０００ｎＭから０．００１６ｎＭの範囲の濃度に対してペガプタニブ標準曲線を作成する。さらなる実施形態において、その他の核酸を用いて、１ｘ組織（１ｘを調製するために組織ストックを１：１０にする。）中１００ｎＭから０．００８ｎＭの範囲の濃度に対して標準曲線を作成する。

リアルタイムでのＰＣＲ産物の検出を可能にする新規化学物質及び装置プラットフォームの開発により、核酸定量のための最適な方法としてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲが広く適用されるようになった。

ＰＣＲ反応の開始において、試薬は過剰であり、鋳型及び産物は、産物の復元（リネーチャリング）がプライマー結合と競合しないよう十分に低い濃度であり、増幅は一定して指数関数的速度で進行する。反応速度が指数関数的でなくなり、増幅の直線的相に入る点は、複製試料でさえも、非常に様々であるが、主に、産物復元（リネーチャリング）がプライマー結合と競合するからであると思われる（より多くの試薬又は酵素を添加してあまり効果がないため。）。ある程度後のサイクルにおいて、増幅速度は０近く（停滞）に落ち、さらに産生されるのはごくわずかである。

正確さと精度のために、全ての試料が増幅の指数関数的相にある点で定量的なデータを回収する必要がある（増幅が非常に再現可能であるのはこの相のみであるため。）。あるサイクル数における指数関数的相の間の反応の分析は、理論的に、いくつかの桁のダイナミックレンジを与える。少ない標的はおそらく検出限界を下回り、一方、主要な標的は指数関数的相を過ぎる。実際に、エンドポイント相対的ＲＴ−ＰＣＲ中に２−３ログのダイナミックレンジを定量することができる。この範囲を延長するために、より多い又はより少ないサイクル数で複製反応を行い得、試料の全てを指数関数的相で分析することができる。

リアルタイムＰＣＲにより、サイクルごとの各試料の反応産物を定量することによって、さもなければ労力を要するプロセスであるこのプロセスが自動化される。この結果は広い（例えば約１０^７倍）ダイナミックレンジとなり、使用者の介入又は複製を必要としない。標準曲線作成及びコピー数計算を含むデータ解析が自動的に行われる。リアルタイム解析に必要とされる機器を入手している研究室及びコア施設が増加しており、この技術は主要なＲＴ−ＰＣＲベースの定量技術となっている。

リアルタイムＰＣＲ化学物質
現在、４種類の様々な化学物質、ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ^（Ｒ）及びＳＹＢＲ^（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）がリアルタイムＰＣＲに対して使用可能である。これらの化学物質は全て、蛍光シグナルの生成を介してＰＣＲ産物の検出を可能にする。ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ及びＳｃｏｒｐｉｏｎｓは、Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）に依存して、蛍光性色素分子及び同じ又は異なるオリゴヌクレオチド基質に対する消光部分のカップリングを介して蛍光シグナルを生成させる。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎは、溶液中では少量しか蛍光を発しないが、２本鎖ＤＮＡと結合した際に強い蛍光シグナルを発する蛍光性色素である。

ＴａｑＭａｎ ^（Ｒ） プローブ
ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブは、ＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性に依存し、標的単位複製配列にハイブリダイズさせられるオリゴヌクレオチドを加水分解する。ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブは、５’末端に結合させられた蛍光レポーター色素及び３’末端にカップリングさせられた消光部分を有するオリゴヌクレオチドである。これらのプローブは、ＰＣＲ産物の内部領域にハイブリダイズするように設計されている。ハイブリダイズしない状態において、蛍光及び消光分子の近接性により、プローブからの蛍光シグナルの検出が妨げられる。ＰＣＲの際に、ポリメラーゼがＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブが結合する鋳型を複製する場合、ポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性によりプローブが切断される（図４参照。）。これにより蛍光及び消光色素が分断され、ＦＲＥＴは起こらない。したがって、蛍光は各サイクルで増強し、プローブ切断の量に比例する。

適切に設計されたＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブは、最適化を殆ど必要としない。さらに、これらは、スペクトルの面でユニークな蛍光／消光ペアとともに各プローブを設計することにより、複数アッセイに対して使用することができる。しかし、ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブは、分析されるべき各ポリヌクレオチド標的に対して必要とされる個々のプローブとともに合成することで費用が嵩み得る。

本発明の方法及び組成物とともに、何らかの適切なレポーター色素を使用することができる。適切なレポーター色素としては、以下に限定されないが、６ＦＡＭ（４９５で励起最大、５２２で発光最大）、５−ＦＡＭ（４９４で励起最大、５３０で発光最大）、ＴＥＴ（５２１で励起最大、５３８で発光最大）、ＨＥＸ（５３５で励起最大、５５３で発光最大）、ＪＯＥ（５２８で励起最大、５５４で発光最大）、ＶＩＣ（５３８で励起最大、５５４で発光最大）及びＮＥＤ（５４６で励起最大、５７５で発光最大）が挙げられる。

本発明の方法及び組成物とともに何らかの適切な消光剤を使用することができる。適切な消色剤としては、以下に限定されないが、ＭＧＢＮＦＱ及びＴＡＭＡＲＡが挙げられる。

ある実施形態において、プローブは、４９５ｎＭの励起最大及び５２０ｎＭの発光最大波長を有する、５’ＦＡＭ標識レポーター色素（６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ））及び３’ＭＧＢＮＦＱ消光剤（マイナーグルーブ結合剤／非蛍光消光剤）を含有する。

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ
ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブのように、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓもまた、ＦＲＥＴを用いて、オリゴヌクレオチド基質の５’末端にカップリングさせられた蛍光及びオリゴヌクレオチド基質の３’末端に結合させられた消光剤を介して合成ＰＣＲ産物を検出及び定量する。ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブとは異なり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓは、増幅反応の際にインタクトなままであるように設計されており、シグナル測定のためにサイクルごとに標的に再結合しなければならない。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓは、溶液中で遊離している場合、ステムループ構造を形成する。したがって、蛍光及び消光分子の近接近により、プローブの蛍光発光が妨げられる。分子指標が標的にハイブリダイズする場合、蛍光色素及び消光剤が離れ、ＦＲＥＴは起こらず、蛍光色素は照射の際に光を発する。ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブのように、各プローブにおいて、スペクトルの面で離れている蛍光／消光部分を用いることにより、複数アッセイにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓを使用することができる。ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブと同様に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓは各標的に必要な個々のプローブとともに合成するのに費用が嵩み得る。

Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ
Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブにより、１個のオリゴヌクレオチドを用いて、配列特異的プライミング及びＰＣＲ産物検出を遂行する。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、ハイブリダイズされていない状態においてステムループ配置を維持している。蛍光プローブは５’末端に結合され、３’末端にカップリングされた部分により消光される。ステムの３’部分もまた、プライマーの伸長産物と相補的な配列を含有する。非増幅可能モノマーを介して、特異的プライマーの５’末端にこの配列が連結される。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーの伸長後、特異的なプローブ配列は、伸長された単位複製配列内のその相補体に結合可能であり、したがって、ヘアピンループを開く。これにより、蛍光の消光が妨げられ、シグナルが観察される。

ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎは、リアルタイム反応におけるＰＣＲ産物の検出及び定量のための最も単純かつ最も経済的な様式を与える。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎは、励起により光が放たれる際に２本鎖ＤＭＡに結合する。したがって、ＰＣＲ産物が蓄積するに従い、蛍光が強くなる。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの長所は、安価であり、使用しやすく高感度であることである。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの欠点は、プライマー二量体及びその他の非特異的産物を含め、反応においてあらゆる２本鎖ＤＮＡに結合し、その結果、標的濃度が実際より高く出てしまうことである。適切に設計されたプライマーを用いた１個のＰＣＲ産物反応の場合、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎは非常に役立つ。

マルチプレックスＰＣＲに対するリアルタイムレポーター
異なる発光スペクトルを有する色素が異なるプローブに結合し得るので、ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブ、分子指標及びＳｃｏｒｐｉｏｎｓにより複数ＤＮＡ種を同じ試料中で測定すること（マルチプレックスＰＣＲ）が可能となる。マルチプレックスＰＣＲにより、内部対照を共増幅でき、１本の試験管の同種アッセイ中で対立遺伝子を識別することが可能となる。これらのハイブリダイゼーションプローブにより、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎによって得ることができないレベルで識別できるようになるが、これは、これらのハイブリダイゼーションプローブがＰＣＲにおいて本当の標的とのみハイブリダイズし、プライマー二量体又はその他の偽の産物とはハイブリダイズしないからである。

結果の定量
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより得られる結果を定量するために、２種類のストラテジーが一般に使用される；即ち、標準曲線法及び相対的閾値法である。これらを以下で簡潔に考察する。

標準曲線法
この方法において、最初に既知濃度の標的オリゴヌクレオチドから標準曲線を構築する。次に、未知濃度のオリゴヌクレオチドに対する定量情報を推定するための参照標準としてこの曲線を使用する。

標的修飾オリゴヌクレオチドに加えて、精製プラスミドｄｓＤＮＡ、インビトロで生成されたｓｓＤＭＡ又は標的遺伝子を発現する何らかのｃＤＮＡ試料を含め、その他の核酸試料を使用して、標準曲線を構築することができる。２６０ｎＭでの分光測定を用いて、これらのＤＮＡの濃度を評価することができ、次に、使用する試料の分子量に基づいてコピー数の値に変換することができる。ｃＤＮＡプラスミドは、標準曲線定量にとって好ましい標準物質である。

相対的Ｃｔ法
別の定量アプローチは相対的Ｃｔ法と呼ばれる。この方法には、関心のある試料のＣｔ値と対照又は未処理試料もしくは正常組織からのＲＮＡなどのキャリブレーターとの比較が含まれる。キャリブレーター及び関心のある試料両方のＣｔ値を適切な内在性ハウスキーピング遺伝子に対して正規化する。

有効であるべきΔＣｔ計算に対して、標的及び内在性参照の増幅効率はほぼ同値でなければならない。これは、ΔＣｔが鋳型希釈によりどのように変化するかを見ることにより達成することができる。オリゴヌクレオチド希釈対ΔＣｔのプロットがゼロに近い場合、標的と参照との効率が非常に近いことが示唆される。参照遺伝子において、その増幅効率が標的と同様であることが見られない場合、標準曲線法が好ましい。

リアルタイムＰＣＲのための機器
リアルタイムＰＣＲは、サーマルサイクラー、コンピューター、蛍光励起及び発光回収のための光学機器及びデータ収集及び解析ソフトウェアから構成される機器プラットフォームを必要とする。いくつかの製造元から入手可能なこれらの機器は、試料許容量（あるものは９６ウェル標準フォーマットであり、他のものはそれより少ない試料に対するものであるか、又は特別なガラスキャピラリーチューブを必要とする。）、励起方法（あるものはレーザを利用し、他のものは可変フィルター付きの広域スペクトルの光源を利用する。）及び全体的な感度が異なる。ソフトウェアのデータ処理方法おいて、プラットフォーム特異的な違いもある。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行うための市販のキットとしては、例えば、ＡｍｂｉｏｎのＭｅｓｓａｇｅＳｅｎｓｏｒ^ＴＭキットが挙げられる。このキットは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ実験でのＲＮａｓｅ Ｈ活性が無効になっているＭＭＬＶ ＲＴ酵素よりも明らかに優れているＲＮａｓｅ Ｈ＋ＭＭＬＶ ＲＴを含む。多くのその他のｑＲＴ−ＰＣＲキットとは異なり、ＭｅｓｓａｇｅＳｅｎｓｏｒは、トータルＲＮＡ対照、対照ヒトＧＡＰＤＨプライマーセット、ＲＮａｓｅ阻害剤及びヌクレオチドならびに、ＳＹＢＲ^（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ色素での検出を可能にする緩衝添加剤を含む。上述の具体的な製品に加えて、Ａｍｂｉｏｎは、ＳｕｐｅｒＴａｑ^ＴＭポリメラーゼ、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素及びＲＮａｓｅ−フリーＰＣＲチューブを販売している。ＰＣＲ実験中の交差汚染を防ぐために、Ａｍｂｉｏｎはまた、ＤＮＡＺａｐ^ＴＭＤＮＡ分解溶液及びＲＮａｓｅフリーバリヤピペットチップも販売している。

磁気粒子プロセッサー
磁気粒子を用いた試料調製を手動で行うか、又は、自動化磁気粒子プロセッサーを用いて自動的に行い得る。市販の粒子ムーバーとしては、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ^（Ｒ）磁気粒子濃縮器（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号ＭＰＣ−Ｓ、Ｂｒｏｗｎ Ｄｅｅｒ，ＷＩ）が挙げられる。Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｓは、液体試料から磁気ビーズを分離するツールである。チューブをＤｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｓハウジングに入れて、磁気スライドを挿入した際に、チューブ壁の近傍にあるマグネットに磁気ビーズを引き寄せる。これにより、上清を容易に除去することが可能となる。チューブから単離して磁気ビーズを取り去る。市販の磁気粒子プロセッサーとしては、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ^（Ｒ）プロセシング技術（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ；Ｖａｎｔａａ，Ｆｉｎｌａｎｄ；例えば米国特許第６，５９６，１６２号及びＰＣＴ公開ＷＯ０１／６８２６３Ａ１を参照のこと。）が挙げられる。ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ^（Ｒ）９６磁気粒子プロセッサーは、９６ウェルプレート様式で、核酸、タンパク質及び細胞の試料調製プロセスを自動化する。

キット
本発明は、上記方法において使用できるキットを提供する。ある実施形態において、キットは、第一（捕捉プローブ）及び第二（検出プローブ）ポリヌクレオチドを含有し、これらはそれぞれ、選択された標的オリゴヌクレオチド（例えばＶＥＧＦアプタマー）の非重複部分に相補性がある。このキットは場合によってはさらに、第一のポリヌクレオチドに連結された、又は連結できるようになっている、タグ（例えば磁気ビーズ）を含む。このキットはさらに、標的オリゴヌクレオチドへの第一及び第二のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションのための緩衝液を含み得る。このキットはまたさらに、例えば洗浄及び／又はリアルタイムＰＣＲのための緩衝液を含み得る。場合によっては、このキットはさらに、第一及び第二のポリヌクレオチドをライゲーションするための手段を含む（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼ酵素。）。ある実施形態において、このキットはさらに、第二のポリヌクレオチド（検出プローブ）に存在する増幅可能な配列に対応するフォワード及びリバースＰＣＲプライマー、ならびに検出プローブ（例えば、一般構造：６ＦＡＭ−ＸＸＸ−ＭＧＢＮＦＱ（ここで、「ＸＸＸ」は、検出プローブの増幅可能な配列に対応する、約１０から２０又はより多くのヌクレオチドの配列である。）を有するＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブ）を含む、リアルタイムＰＣＲを介した検出及び／又は検出プローブの定量のための成分を含む。

（実施例）
以下の実施例は、本発明の実施のある有用な実施形態及び態様を説明するために使用するが、請求される発明の範囲を制限するもではない。類似の結果を得るために代替的な材料及び方法を用いることができる。

試薬及び化学物質
デュアルハイブリダイゼーションアッセイにおいて次の試薬及び化学物質を用いた：ペガプタニブ、Ｍａｃｕｇｅｎ^（Ｒ）ＥＹＥ００１（Ｅｙｅｔｅｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）；捕捉プローブ（２１マービオチン−オリゴプライマー）（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ；Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）；検出プローブ（２１マージゴキシゲニン−オリゴプライマー）；（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ；Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）；抗ジゴキシゲニン−ＡＰ（ＲｏｃｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号１０９３２７４、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）；ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅフリー水（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カタログ番号８２１７３９、Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）；塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ−９８８８、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；トリズマ−塩基（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ−１５０３、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；トリズマ−塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ−６６６６、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；ＥＤＴＡ、二ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＥＤ２Ｐ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；ヒトＥＤＴＡ血漿；２０ｘＳＳＣ緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号９７６３、Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）；３０％ナトリウム−Ｎ−ラウロイル−サルコシル溶液（Ｆｌｕｋａ、カタログ番号６１７４７、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−７９４９）；ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング溶液（ＴＢＳ中）（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３７５３５ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；ＡＰ用ＡｔｔｏＰｈｈｏｓ蛍光基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｓ１０００（Ｓ１０１０は基質のみ）、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。上記で挙げた試薬のいずれも、代替供給者からのその他の同等の試薬で置き換えることができる。

材料及び装置
デュアルハイブリダイゼーションアッセイにおいて次の試薬及び化学物質を用いた：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^（Ｒ）Ｍ２７０エポキシ磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号１４３．０１、Ｂｒｏｗｎ Ｄｅｅｒ，ＷＩ）；Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^（Ｒ）Ｍ２７０カルボン酸磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号１４３．０５及び１４３．０６、Ｂｒｏｗｎ Ｄｅｅｒ，ＷＩ）；磁気粒子ムーバー（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＭＰＣ−Ｓ（磁気粒子濃縮器、Ｓ型）、Ｂｒｏｗｎ Ｄｅｅｒ，ＷＩ）；ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ^（Ｒ）９６磁気粒子プロセッサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号５４０ ０５ ００、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）；ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６ＫＦプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９７０ ０２ ５４０、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）；ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ ９６ ディープウェルチップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９７０ ０２ ５３０、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）；２００μＬ ＰＣＲチューブ（ＩＳＣＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ、カタログ番号Ｔ−３０３５−１、Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，ＵＴ）、Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１６３５３７９、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）；ＭＪ Ｔｅｔｒａｄ ＰＣＲサーマルサイクラー（又は何らかのその他の適切なＰＣＲサーマルサイクラー）；ピペットチップ、様々なサイズ（ＶＷＲ）；微小遠心管、１．５ｍＬ（Ｃｏｓｔａｒ ３２０７、ＶＷＲカタログ番号２９４４２−５８０）；ポリプロピレンチューブ（キャップ付き）（５０ｍＬ）；Ｒａｉｎｉｎ調節可能ピペット（１ｍＬから２０ｍＬ）；Ｒａｉｎｉｎ調節可能ピペット（１０ｍＬから１００ｍＬ）；Ｒａｉｎｉｎ調節可能ピペット（１００ｍＬから１０００ｍＬ）；上記で挙げた材料及び装置のいずれも、代替供給者からのその他の同等の材料及び装置で置き換えることができる。

抗ＶＥＧＦアプタマー（ペガプタニブ）の抗体を用いた検出
デュアルハイブリダイゼーションアッセイのこの実施例は、ヒトＥＤＴＡ血漿中でペガプタニブアプタマーを検出するために使用される抗体を用いた方法である、定量的アッセイである。ヒトＥＤＴＡ血漿試料中のペガプタニブを２種類の相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ）と混合する。このオリゴの一方（捕捉オリゴ）をビオチンで標識する（これにより、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎで前もって被覆したマイクロタイタープレート上での複合体の捕捉が可能となる。）。第二のオリゴは、ジゴキシゲニンで標識された検出オリゴである。ペガプタニブ／オリゴ混合物を７５℃で加熱し、オリゴをペガプタニブにアニールさせるために３７℃でインキュベートする。次いで、複合体を捕捉し、アルカリホスファターゼ標識した抗ジゴキシゲニン抗体で検出するために、混合物をＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎで被覆したプレートに移す。蛍光読み取りのための基質としてＡｔｔｏＰｈｏｓを使用する。標準曲線（これは、４−パラメーターロジスティック方程式を用いてフィットさせている。）から補間することにより試料濃度を求める。１００μＬの試料体積で反応を行う。カリブレーション範囲は、２．００から２５６ｎｇ／ｍＬである。定量の範囲は、８．００から２５６ｎｇ／ｍＬである。−２０℃以下の公称温度で試料を保存する。

ＰＣＲデュアルハイブリダイゼーションを用いた核酸の検出：予備試験手段
試薬調製：
ハイブリダイゼーション緩衝液（６ｘＳＳＣ／１．０％サルコシル）を調製する；１５０ｍＬ ２０ｘＳＳＣ及び１６．７ｍＬ ３０％サルコシルを混合し、蒸留水（ｄＨ_２Ｏ）で体積を５００ｍＬに調整する（４℃で保存可能）。

洗浄緩衝液４ｘ濃縮液は、８０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、０．６Ｍ ＮａＣｌ及び０．４％Ｔｗｅｅｎ２０である。この溶液を次のように調製する：９．６９ｇＴｒｉｓ塩基及び３５．０６ｇＮａＣｌをｄＨ_２Ｏ１Ｌ中で溶解させ；４．０ｍＬ Ｔｗｅｅｎ２０を添加し、よく混合する；室温で保存する。１ｘ洗浄緩衝液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０であり、２５０ｍＬの緩衝液と７５０ｍＬのｄＨ_２Ｏとを混合して４ｘ濃縮洗浄緩衝液を希釈することにより調製し、室温で保存する。

オリゴをＨ_２Ｏで再懸濁して１００ｍＭ保存濃度を得ることにより、オリゴヌクレオチド１００ｍＭ保存溶液を調製する。保存溶液をチューブあたり３０．０ｍＬオリゴずつ分注し、−２０℃で保存する。

試料の調製、保存標準物質、カリブレーション標準物質及び品質管理：
ＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅフリー水中で凍結乾燥ペガプタニブを戻し、保存溶液を調製することにより、保存標準物質を調製する。この保存標準物質をＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅフリーポリプロピレンチューブに分注し、−２０℃以下で分注して保存する。

カリブレーション標準物質を調製するために、保存標準物質の分注物を凍結融解し、適切な組織又は水中に入れる。ペガプタニブに対する個々のカリブレーション標準曲線の点の濃度は、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．００８ｎＭ、０．００１６ｎＭ及び０ｎＭである。対照に対する濃度は、４００ｎＭ、４０ｎＭ、０．４ｎＭである。他の核酸の試験の場合、個々のカリブレーション標準曲線の点の濃度は、１００ｎＭ、２５ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．０４ｎＭ及び０．００８ｎＭであり、一方、対照に対する濃度は、５０ｎＭ、１０ｎＭ及び０．５ｎＭである。

プライマーを調製するために、１００μＭプライマーを凍結融解し、プライマー混合液（１００ｎＭ）及びハイブリダイゼーション緩衝液中の希釈保存液１：１０００（試料デュプリケートあたり、１６５μＬプライマー混合液）を調製する。

品質管理プールを調製するために、保存標準物質の分注物を凍結融解し、適切な組織に入れる。推奨されるＱＣ濃度は、２５．００及び０．２５ｎｇ／ｍｌである。試料調製及びアッセイ方法を下記で述べた。

Ｍ−２７０エポキシ磁気ビーズ３ｍｇを１ｘＰＢＳ ５００μＬ中で再懸濁し；ＭＰＣ−Ｓで落とすことにより洗浄し、上清を除去し、繰り返し、ＭＰＣ−Ｓからチューブを取り出し、２４０μＬ １ｘＰＢＳ及び１２０μＬ ３Ｍ酢酸ナトリウム中で捕捉プライマー６０μｇを含有するプライマー混合液３６０μＬ中でビーズを再懸濁し、回転器において一晩インキュベートし、ビーズを捕捉し、上清を除去し、１ｘＰＢＳ ５００μＬ中で再懸濁し（２回繰り返す。）、最後に５７６μＬ最終体積でビーズを再懸濁（これを１ｘとみなす。）することにより、捕捉プライマー被覆Ｍ−２７０エポキシ磁気ビーズ（捕捉ビーズ）を調製した。

ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−２７０カルボン酸包装の添付文書に記載の、１段階被覆法により（段階３．１ａ）、捕捉プライマー被覆Ｍ−２７０カルボン酸磁気ビーズ（捕捉ビーズ；Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^（Ｒ））を調製した：１）リガンド及びＤｙｎａｂｅａｄｓを混合する；２）カルボジイミドを添加し、反応混合液をインキュベートする；３）Ｄｙｎａｂｅａｄｓを洗浄し、緩衝液中で再懸濁する。３０ｍｇビーズ／ｍＬで、４℃で一晩被覆する。翌日、１ｘＰＢＳ又はハイブリダイゼーション緩衝液を用いて１ｍＬあたりのビーズを５．５ｍｇにする。リガンドカップリングのための従来法は、リガンドの第一級アミノ基と、Ｄｙｎａｂｅａｄｓの表面のカルボン酸基との間のアミド結合の形成であり、カルボジイミド活性化が介在する。カルボン酸とカルボジイミドとの間の反応の中間体生成物は、非常に不安定であり、すぐに加水分解される。あるいは、活性化されたＤｙｎａｂｅａｄｓを、Ｎ−ヒドロキシルスクシニミドエステル（ＮＨＳ、ＭＷ１１５．１又はスルホ−ＮＨＳ、ＭＷ２１７．１）などの不安定性のより低い中間体として捕捉することができる。

細胞溶解：
細胞溶解液を得るために、与えられたマニュアルの指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮａｓｅ Ｐｒｏｔｅｃｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（カタログ番号７４１２４）を用いる。細胞溶解液からＲＮＡを単離する必要はない。ＲＮｅａｓｙキットは、ＲＮＡｌａｔｅｒＲＮＡ安定化試薬（５０ｍＬ）、５０個のＲＮｅａｓｙミニスピンカラム、回収用チューブ（１．５ｍＬ及び２ｍＬ）、ＲＮａｓｅフリー試薬及び緩衝液を含む（米国特許第５，２３４，８０９号及び欧州特許第０，３８９，０６３，号を参照。）。

組織消化：
次のようにウサギ眼組織を酵素消化によりホモジェナイズする：１ｘＰＢＳ ５００から１５００μＬを組織の大きさに依って添加し、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈにより４種類のヒアルロニダーゼ各５μＬ（カタログ番号Ｈ−４２７２、Ｈ−３７５７、Ｈ−３５０６、Ｈ−３６３１）、Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ ２０μＬ（Ｒｏｃｈｅ／Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、カタログ番号１８１４１７６；Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅｓは、精製度の高いコラゲナーゼ及び中性プロテアーゼ酵素の混合液であり、効率的で穏やかで再現性をもって、様々なソース由来の組織を分離できるように配合されている。）及びＤＮＡｓｅ１０μＬ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号７７６７８５）を添加する。よく混合し、３７℃で一晩インキュベートする。翌日、プロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ、カタログＰ−６５５６）２０μＬを添加し、検体を６５℃で２時間インキュベートする。こうして組織が分析に使用できる状態となる。

抗ＶＥＧＦアプタマー（ペガプタニブ）の、ＰＣＲデュアルハイブリダイゼーションを利用した検出
オリゴヌクレオチド配列：
標的オリゴヌクレオチド、ＥＹＥ００１は、構造：ＰＥＧ−リンカー−Ｃ_ｆＧ_ｍＧ_ｍＡ_ｒＡ_ｒＵ_ｆＣ_ｆＡ_ｍＧ_ｍＵ_ｆＧ_ｍＡ_ｍＡ_ｍＵ_ｆＧ_ｍＣ_ｆＵ_ｆＵ_ｆＡ_ｍＵ_ｆＡ_ｍＣ_ｆＡ_ｍＵ_ｆＣ_ｆＣ_ｆＧ_ｍ３’−３’−Ｔｄ（配列番号１）を有する。

捕捉プローブ１００ｍＭ、２１マー５’−アミン標識オリゴヌクレオチドプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）：
５’−アミン-ＡＡＡＡＣＧＧＡＴＧＴＡＴＡＡＧＣＡＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＣＣＧ−３’（配列番号４）；
検出プローブ：１００ｍＭ、７２マー５’−ホスフェート標識オリゴヌクレオチドプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）：
５’−Ｐｈｏｓ−ＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＴＣＡＣＧＧＴＴＡＡＡＧＧＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＴＧＣＧＧＧＣＴＧＴＴＧＡＣＧＡ−３’（配列番号６）。

アッセイ方法：
最初に、カリブレーション標準物質、品質管理物質及び試料を室温で調製する。次に、キャリブレーター、対照及び未知試料２５μＬを、およそ０．２ｍＬのＰＣＲチューブに入れる。検出プライマー１ｎＭ １６５μＬを各キャリブレーター、対照及び未知試料に添加する。次いで、Ｍａｃｕｇｅｎ検出のために、各キャリブレーター、対照及び未知試料に捕捉ビーズ５μＬを添加する（他の核酸を検出する場合は１０μＬ）。７５℃で１５分間（その他の核酸の場合、９５℃で行う。）、３７℃で１時間及び０．１℃／秒で２５℃に低下させるというようにプログラムしたサーマルサイクラーにＰＣＲチューブをセットする。

マニュアルベンチ法：
１ｘ洗浄緩衝液５００μＬ中で磁気ビーズを再懸濁し、室温で５分間インキュベートする。ＭＰＣ−Ｓ上のビーズを捕捉し、上清を除去する（３回繰り返す。）。次いで、１ｘライゲーション緩衝液中でビーズを再懸濁し、新しい１．５ｍＬチューブに移す。次に、ＭＰＣ−Ｓ上のビーズを捕捉し、ライゲーション混合液３０μＬ中で再懸濁し：反応ごとに１ｘライゲーション緩衝液１５μＬ、２ｘライゲーション緩衝液１５μＬ及びリガーゼ１μＬを添加し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、これを１ｘ洗浄緩衝液５００μＬ中で再懸濁し、７５℃にて５分間インキュベートする。ビーズをＭＰＣ−Ｓにおいて捕捉し、上清を除去する（この洗浄を７回繰り返す。）。最後に、ビーズをＨ_２Ｏ １００μＬ中で再懸濁する。

自動化法（ライゲーションなし）：
サーマルサイクラープログラム終了時に、各試料１４０μＬをＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６ＫＦプレートの適切なウェルに移す。１ｘ緩衝液２００μＬでビーズを５回洗浄するようにプログラムされたＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒにプレートを置き、最終的には、脱イオン水１００μＬに洗浄したビーズを入れる。

自動化法（ライゲーションあり）：
サーマルサイクラープログラム終了時に、各試料１４０μＬをＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６ＫＦプレートの適切なウェルに移す。次のようにプログラムされたＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒにプレートを置く：１ｘ緩衝液２００μＬでビーズを２回、１ｘライゲーション緩衝液１００μＬで１回洗浄する。次に、ライゲーション混合液（ライゲーション混合液は、１ｘライゲーション緩衝液２５μＬ、２ｘライゲーション緩衝液２５μＬ及びリガーゼ酵素１μＬを含有する。）５０μＬ中でこれらを３０分間インキュベートする。３０分終了時にＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒが停止して、ライゲーションプレートへ１ｘ洗浄緩衝液１５０μＬを手動で添加できる（ライゲーション混合液は、グリセロールを含有し、１ｘ洗浄緩衝液を添加することにより、確実に次のプレートへビーズを適切に移動できるようになる。）。次に、１ｘ洗浄緩衝液２００μＬにより、７５℃にてビーズを７回洗浄する。ビーズの洗浄終了後、脱イオン水の１００μＬを含有するプレートに入れる。

ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）法：
最初に、試料ごとに次のＰＣＲカクテルを用意する：１μＬ Ｈ_２Ｏ、１２．５μＬ ２ｘＴａｑＭａｎ^（Ｒ）ＰＣＲ混合液、０．１２５μＬ フォワードＰＣＲプライマー、０．１２５μＬ リバースＰＣＲプライマー及び１．２５μＬプローブ。（プライマー及びプローブは、実験によって変化し得る。）。

ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ^（Ｒ））デュアルハイブリダイゼーションプライマー／プローブセットは：
プローブ−６ＦＡＭ−ＡＡＧ ＧＡＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＡ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号７）；
フォワードプライマー−ＧＡＧ ＡＡＣ ＡＧＴ ＧＴＣ ＡＣＧ ＧＴＴ ＡＡＡ ＧＧＡ（配列番号８）；及び
リバースプライマー−ＣＧＴ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＣＣ ＧＣＡ ＡＡ（配列番号９）を含む。

次に、上記ＰＣＲカクテル１５μＬを９６ウェルプレートフォーマットのＴａｑＭａｎ^（Ｒ）光学チューブに添加し、各光学チューブに試料１０μＬを添加し、キャップを閉じる。次いで、ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）中にＰＣＲ反応物を置き、次のＰＣＲセットアップを使用する：５０℃で２分間、９５℃で１０分間及び、９５℃で１５秒の後６０℃で１分間を４０サイクル行う。最後に、ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）データを分析する。

データ処理：
４−パラメーターロジスティック方程式を用いてフィットさせた標準曲線からの補間により、試料濃度を求める。

結果：
ペガプタニブを含有する試料の平均Ｃｔ値を求めたところ、１９．４０６であった（表１（Ｂ）参照）。表１（Ａ）及び図１０において示されるようなペガプタニブ標準曲線からの補間から、ペガプタニブ２.７ｎＭが試料中に存在することが分かった。

ＱＣプライマーを用いたペガプタニの検出及び定量
実施例３に記載の一般的方法を用いて、品質管理（ＱＣ）プライマーとして使用するために、ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）検出部位を含有する捕捉プライマーを含むように修飾した。捕捉プライマー標準曲線を作成した。得られた標準曲線を表２（Ａ）及び図５で示す。ペガプタニブを定量するための検出プライマーに対する標準曲線を作成した。得られた標準曲線を表２（Ｃ）及び図７で示す。

ビーズ：
カルボン酸ビーズを次の捕捉プローブ配列とカップリングさせた（５’から３'）：
アミノ−ＡＡＡ ＣＴＣ ＣＧＴ ＧＧＧ ＡＣＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＡＣＡ ＧＴＧ ＣＣＡ ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＴＧ ＧＡＣ ＴＡＣ ＧＣＴ ＡＡＡ ＣＧＧ ＣＧＴ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＣＧＧ ＡＴＧ ＴＡＴ ＡＡＧ ＣＡ（配列番号１２）。

ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ^（Ｒ））デュアルハイブリダイゼーションプライマー／プローブセットには：
ＱＣプローブ−６ＦＡＭ−ＣＣＡ ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＴＣ ＧＡＣ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号１４）；
フォワードプライマー−ＣＴＣ ＣＧＴ ＧＧＧ ＡＣＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＡＣＡ（配列番号１５）；及び
リバースプライマー−ＴＣＡ ＧＣＣ ＡＴＡ ＣＧＣ ＣＧＴ ＴＴＡ ＧＣ（配列番号１６）が含まれる。

結果：
被覆プロセス及び溶液中のＱＣ捕捉プライマーの既知量を検出することにより標準曲線からＣｔ値を推定した後、ＱＣ捕捉プライマー被覆磁気ビーズの試料においてＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ^（Ｒ））を行うことにより、磁気ビーズに共有結合させられた捕捉プライマーを定量した。ＱＣ捕捉プライマー被覆磁気ビーズの平均Ｃｔ値を求めたところ、９．３６となった（表２（Ａ）参照）。図５で示されるように、ＱＣ捕捉プライマー標準曲線からの補間から、ＱＣ−捕捉プライマー１８．１５ｎＭが被覆磁気ビーズにおいて存在することが分かった。

ペガプタニブを含有する試料の平均Ｃｔ値を求めたところ、１７．４７となった（表２（Ｂ）参照）。表２（Ｃ）及び図７で示されるように、ペガプタニブ標準曲線からの補間から、ペガプタニブ０.０００１ｐｍｏｌがＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解液中に存在することが分かった。ペガプタニブの％ハイブリダイゼーションを計算したところ、０．０３％となった（表２（Ｄ）参照）。

表２（Ｅ）及び図６で捕捉プライマー標準曲線を示す。

ＶＥＧＦアンチセンス核酸の検出及び定量
実施例３に記載の一般的方法を用いて、次のＶＥＧＦアンチセンス核酸配列（５’から３'）：ＣＡＣ ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＡ Ｇ（配列番号１７）を検出し、定量した。ＶＥＧＦアンチセンス核酸配列に対する標準曲線を作成した。得られた標準曲線を表３（Ａ）及び図７を示す。

試料：
ＮＩＨ３Ｔ３細胞における、トランスフェクトされたＶＥＧＦアンチセンス核酸の細胞溶解液。次のハイブリダイゼーション緩衝液：６ｘＳＳＣ、１％サルコシルを使用した。オートクレーブ水中の１ｘ洗浄緩衝液。試料細胞溶解液を蒸留水で１／１０に希釈し、１ｘ細胞溶解液を調製した。

ビーズ：
カルボン酸ビーズを次の捕捉プローブ配列にカップリングさせた（５’から３'）：アミノ−ＡＡＣ ＴＴＴ ＣＴＧ ＣＴＧ（配列番号２０）。

検出プライマー：
ＶＥＧＦアンチセンス検出プローブ配列（５'から３'）：ＴＣＴ ＴＧＧ ＧＴＧ ＡＧＡ ＧＡＡ ＣＡＧ ＴＧＴ ＣＡＣ ＧＧＴ ＴＡＡ ＡＧＧ ＡＴＡ ＡＧＧ ＡＡＣ ＴＣＴ ＧＧＡ ＡＴＧ ＡＣＴ ＴＴＧ ＣＧＧ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＡＣ ＧＡ（配列番号２１）をＤＥＰＣ水中でアッセイ用に１００ｎＭへと希釈した。

結果
ＶＥＧＦアンチセンス核酸を含有する試料の平均Ｃｔ値を求めたところ、１９．７０となった（表３（Ｂ）参照）。表３（Ａ）及び図７で示されるように、ＶＥＧＦアンチセンス標準曲線からの補間から、ＶＥＧＦアンチセンス核酸１４．９ｎＭがＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解液中に存在することが分かった。

ＲＮＡｉ核酸の検出及び定量
実施例３に記載の一般的方法を用いて、次のＲＮＡｉ核酸配列（５'から３’ＵＵＧ ＣＡＣ ＡＵＵ ＧＣＵ ＣＡＧ ＵＵＣ ＡＵＡ ＣＡＣ Ｃ（配列番号１８）を検出し、定量した。この配列を次のＲＮＡｉアンチセンス鎖（５’から３'）：ＧＧＵ ＧＵＡ ＵＧＡ ＡＣＵ ＧＡＧ ＣＡＡ ＵＧＵ ＧＣＡ Ａ（配列番号１９）とともに与えた。ＲＮＡｉ核酸配列に対する標準曲線を作成した。得られた標準曲線を表４（Ａ）及び図８で示す。

試料：
ＮＩＨ３Ｔ３細胞における、トランスフェクトされたＶＥＧＦアンチセンス核酸の細胞溶解液。次のハイブリダイゼーション緩衝液を用いた：６ｘＳＳＣ、１％サルコシル。オートクレーブ水中の１ｘ洗浄緩衝液。蒸留水で試料細胞溶解液を１／１０に希釈し、１ｘ細胞溶解液を調製した。

ビーズ：
カルボン酸ビーズを次の捕捉プローブ配列（５’から３'）：アミノ−ＡＡＧ ＧＴＧ ＴＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ（配列番号２２）にカップリングさせた。

結果：
ＲＮＡｉ核酸を含有する試料の平均Ｃｔ値を求めたところ、１９．８５となった（表４（Ｂ）参照）。表４（Ａ）及び図８で示されるように、ＶＥＧＦアンチセンス標準曲線からの補間から、ＲＮＡｉ核酸４１．７ｎＭがＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解液中に存在することが分かった。

検出プライマー：
ＲＮＡｉ検出プローブ配列（５’から３'）：ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＴＧ ＣＡＡ ＡＧＡ ＧＡＡ ＣＡＧ ＴＧＴ ＣＡＣ ＧＧＴ ＴＡＡ ＡＧＧ ＡＴＡ ＡＧＧ ＡＡＣ ＴＣＴ ＴＣＴ ＧＧＡ ＡＴＧ ＡＣＴ ＴＴＧ ＣＧＧ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＡＣ ＧＡ（配列番号２３）をアッセイのためにＤＥＰＣ水中で１００ｎＭに希釈した。

等価物
当業者は、定型的にしか過ぎない実験を用いて、本明細書中で具体的に説明される特定の実施態様の多くの等価物を認識し、又は確認することができるであろう。このような等価物は添付の請求の範囲に包含されるものとする。

図１は、標的アプタマー（５’−３’方向で一番上に示されるＶＥＧＦアプタマー；配列番号１）がハイブリダイゼーションにより捕捉プローブ（３’−５’方向で示される；配列番号３）に結合し、それ自身が磁気ビーズに結合している、デュアルハイブリダイゼーションアッセイ様式の図表示である。捕捉プローブは、検出プローブに近接し、検出プローブにライゲーション可能である（３’−５’方向でも示される；配列番号６）。検出プローブに対する、リアルタイムＰＣＲプライマー及び蛍光ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブのハイブリダイゼーションの相対的位置も示す。 図２は、標的アプタマー（５’−３’方向で一番上に示されるＶＥＧＦアプタマー；配列番号１）がハイブリダイゼーションにより品質管理捕捉プローブ（３’−５’方向で示される；配列番号２の配列を含む。）に結合し、それ自身が磁気ビーズに結合している、品質管理デュアルハイブリダイゼーションアッセイ様式の図表示である。捕捉プローブは、検出プローブに近接し、検出プローブにライゲーション可能である（３’−５’方向でも示される；配列番号５の配列を含む。）。検出プローブ及び品質管理捕捉プローブに対するリアルタイムＰＣＲプライマー及び蛍光ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブのハイブリダイゼーションの相対的位置も示す。 図３は、ＰＥＧ化ＶＥＧＦアンタゴニストアプタマー（つまり、ペガプタニブ、Ｍａｃｕｇｅｎ^（Ｒ）（ＥＹＥ００１））の化学構造の略図である。 図４は、ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）蛍光性５’ヌクレアーゼ化学を用いた、リアルタイムＰＣＲ反応の図表示である。 図５は、磁気ビーズ上に被覆された捕捉プライマーの量を決定するための標準曲線を表すグラフである。 図６は、洗浄手段後に得られる捕捉プライマーの量を決定するための標準曲線を表すグラフである。 図７は、検出プライマーの量を求めるための標準曲線を表すグラフである。 図８は、試料中のＲＮＡｉの量を求めるための標準曲線を表すグラフである。 図９は、試料中のアンチセンス核酸の量を求めるための標準曲線を表すグラフである。 図１０は、試料中のペガプタニブの量を求めるための標準曲線を表すグラフである。

Claims (46)

1. 試料中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法であって、段階：
   （ａ）標的オリゴヌクレオチドと第一のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、標的オリゴヌクレオチドの第一の部分と相補的な第一のポリヌクレオチドと試料を接触させること（該第一のポリヌクレオチドはタグに連結されている。）；
   （ｂ）標的オリゴヌクレオチドと第二のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、標的オリゴヌクレオチドの近接及び非重複部分と相補的な第二のポリヌクレオチドと試料を接触させ、それによりハイブリッド複合体を形成させること（該第二のポリヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドに対して実質的に非相補的な増幅可能配列を含む。）；ならびに
   （ｃ）増幅段階により、ハイブリッド複合体中の第二のポリヌクレオチドの増幅可能配列を検出すること；
   を含み、
   それにより、増幅可能配列の検出が、標的オリゴヌクレオチドが試料中に存在することを示す方法。
2. 第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドを一緒にライゲーションする段階をさらに含み、第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドが、近接して標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、ライゲーションハイブリッド複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
3. 第一のポリヌクレオチドのタグを用いて試料の残りの部分からハイブリッド複合体を分離する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. タグが、高親和性リガンド又はそれに対する結合パートナーである、請求項１に記載の方法。
5. タグが、ハプテン、抗体、リガンド、リガンド特異的受容体、炭水化物、炭水化物結合レクチン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン及び磁気ビーズからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
6. タグが磁気ビーズである、請求項１に記載の方法。
7. 標的オリゴヌクレオチドが、アプタマー、アンチセンス核酸及びＲＮＡｉ核酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
8. 標的オリゴヌクレオチドがアプタマーである、請求項１に記載の方法。
9. 標的オリゴヌクレオチドが抗ＶＥＧＦアプタマーである、請求項１に記載の方法。
10. 抗ＶＥＧＦアプタマーが、構造：
    ＰＥＧ−リンカー−Ｃ_ｆＧ_ｍＧ_ｍＡ_ｒＡ_ｒＵ_ｆＣ_ｆＡ_ｍＧ_ｍＵ_ｆＧ_ｍＡ_ｍＡ_ｍＵ_ｆＧ_ｍＣ_ｆＵ_ｆＵ_ｆＡ_ｍＵ_ｆＡ_ｍＣ_ｆＡ_ｍＵ_ｆＣ_ｆＣ_ｆＧ_ｍ３’−３’−Ｔｄ（配列番号１）を有する、請求項７に記載の方法。
11. 増幅可能な配列が蛍光プローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
12. 蛍光プローブが、配列ＡＡＧ ＧＡＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＡ（配列番号８）を有する核酸を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 蛍光プローブが、構造：６ＦＡＭ−ＡＡＧ ＧＡＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＡ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号９）を有する、請求項１１に記載の方法。
14. 第一のポリヌクレオチドが、配列 ＡＡＡＡＣＧＧＡＴＧＴＡＴＡＡＧＣＡ（配列番号３）を含む、請求項１に記載の方法。
15. 第二のポリヌクレオチドが、配列 ＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号５）を含む、請求項１に記載の方法。
16. 生物試料中の、構造：
    ＰＥＧ−リンカー−Ｃ_ｆＧ_ｍＧ_ｍＡ_ｒＡ_ｒＵ_ｆＣ_ｆＡ_ｍＧ_ｍＵ_ｆＧ_ｍＡ_ｍＡ_ｍＵ_ｆＧ_ｍＣ_ｆＵ_ｆＵ_ｆＡ_ｍＵ_ｆＡ_ｍＣ_ｆＡ_ｍＵ_ｆＣ_ｆＣ_ｆＧ_ｍ３’−３’−Ｔｄ（配列番号１）
    を有するＶＥＧＦアプタマーを検出する方法であって、
    （ａ）ＶＥＧＦアプタマーと第一のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、ＶＥＧＦアプタマーの第一の部分に相補的な第一のポリヌクレオチドと試料を接触させること（第一のポリヌクレオチドはタグに連結されており、及び配列：５’−ＡＡＡＡＣＧＧＡＴＧＴＡＴＡＡＧＣＡ−３’（配列番号３）を有する。）；
    （ｂ）ＶＥＧＦアプタマーと第二のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、ＶＥＧＦアプタマーの近接及び非重複部分と相補的な配列ＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号５）を含有する第二のポリヌクレオチドと試料を接触させること（第二のポリヌクレオチドは、ＶＥＧＦアプタマーに対して実質的に非相補的な増幅可能配列をさらに含有する。）；
    （ｃ）第一及び第二のポリヌクレオチドを一緒にライゲーションし、第一及び第二のポリヌクレオチドが、近接してＶＥＧＦアプタマートにハイブリダイズされ、ライゲーションハイブリッド複合体を形成すること；
    （ｄ）第一のポリヌクレオチドのタグを用いて試料の残りの部分からライゲーションハイブリッド複合体を分離すること；ならびに
    （ｅ）構造：
    ６ＦＡＭ−ＡＡＧ ＧＡＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＡ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号９）
    を有する蛍光プローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応増幅により第二のポリヌクレオチドの増幅可能な配列を検出すること（増幅可能な配列はＶＥＧＦアプタマーが生物試料中に存在する場合検出される。）、を含み、
    それにより、生物試料中のＶＥＧＦアプタマーを検出する方法。
17. 試料中の標的オリゴヌクレオチドを検出するためのキットであって、
    （ａ）標的オリゴヌクレオチドと第一のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするための、標的オリゴヌクレオチドの第一の部分と相補的な第一のポリヌクレオチド（該第一のポリヌクレオチドはタグに連結されている。）；
    （ｂ）標的オリゴヌクレオチドと第二のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするための、標的オリゴヌクレオチドの近接及び非重複部分と相補的な第二のポリヌクレオチド（該第二のポリヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドに対して実質的に非相補的な増幅可能配列を含む。）；ならびに
    （ｃ）増幅可能な配列の少なくとも一部に対して相補的な核酸を含有する蛍光プローブ；
    を含有するキット。
18. タグが、高親和性リガンド又はそれに対する結合パートナーである、請求項１７に記載のキット。
19. タグが、ハプテン、抗体、リガンド、リガンド特異的受容体、炭水化物、炭水化物結合レクチン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン及び磁気ビーズからなる群から選択される、請求項１７に記載のキット。
20. タグが磁気ビーズである、請求項１７に記載のキット。
21. 標的オリゴヌクレオチドが、アプタマー、アンチセンス核酸及びＲＮＡｉ核酸からなる群から選択される、請求項１７に記載のキット。
22. 標的オリゴヌクレオチドがアプタマーである、請求項１７に記載のキット。
23. 標的オリゴヌクレオチドが抗ＶＥＧＦアプタマーである、請求項１７に記載のキット。
24. 抗ＶＥＧＦアプタマーが、構造：
    ＰＥＧ−リンカー−Ｃ_ｆＧ_ｍＧ_ｍＡ_ｒＡ_ｒＵ_ｆＣ_ｆＡ_ｍＧ_ｍＵ_ｆＧ_ｍＡ_ｍＡ_ｍＵ_ｆＧ_ｍＣ_ｆＵ_ｆＵ_ｆＡ_ｍＵ_ｆＡ_ｍＣ_ｆＡ_ｍＵ_ｆＣ_ｆＣ_ｆＧ_ｍ３’−３’−Ｔｄ（配列番号１）を有する、請求項２３に記載のキット。
25. 蛍光プローブが、配列 ＡＡＧ ＧＡＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＡ（配列番号８）を含有する核酸を含む、請求項１７に記載のキット。
26. 蛍光プローブが、構造：６ＦＡＭ−ＡＡＧ ＧＡＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＡ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号９）を含む、請求項１７に記載のキット。
27. 第一のポリヌクレオチドが、配列 ＡＡＡＡＣＧＧＡＴＧＴＡＴＡＡＧＣＡ（配列番号３）を含む、請求項１７に記載のキット。
28. 第二のポリヌクレオチドが、配列 ＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号５）を含む、請求項１７に記載のキット。
29. 試料中の標的オリゴヌクレオチドを定量する方法であって、段階：
    （ａ）標的オリゴヌクレオチドと捕捉プライマーのハイブリダイゼーションを可能にするために、標的オリゴヌクレオチドの第一の部分と相補的な捕捉プライマーと試料を接触させることと（該捕捉プライマーは、標的オリゴヌクレオチドに対して実質的に非相補的な第一の増幅可能な配列を含有し、該捕捉プライマーはタグに連結されている。）；
    （ｂ）標的オリゴヌクレオチドと検出プライマーのハイブリダイゼーションを可能にするために、標的オリゴヌクレオチドの近接及び非重複部分と相補的な検出プライマーと試料を接触させ、それによりハイブリッド複合体を形成させること（該検出プライマーは、標的オリゴヌクレオチドに対して実質的に非相補的な第二の増幅可能配列を含む。）；
    （ｃ）リアルタイムＰＣＲにより、第一の増幅可能な配列の量を測定すること；ならびに
    （ｄ）リアルタイムＰＣＲにより、第二の増幅可能な配列の量を測定することと；
    を含み、
    これにより、第一の増幅可能な配列の量の測定が、試料中に存在する捕捉プライマーの量を示し、第二の増幅可能な配列の量の測定が、試料中に存在する標的オリゴヌクレオチドの量を示す方法。
30. 捕捉プライマー及び検出プライマーを一緒にライゲーションする段階をさらに含み、捕捉プライマー及び検出プライマーが一緒に、近接して標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、ライゲーションハイブリッド複合体を形成する、請求項２９に記載の方法。
31. 第一のポリヌクレオチドのタグを用いて試料の残りの部分からハイブリッド複合体を分離する段階をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
32. タグが、高親和性リガンド又はそれに対する結合パートナーである、請求項２９に記載の方法。
33. タグが、ハプテン、抗体、リガンド、リガンド特異的受容体、炭水化物、炭水化物結合レクチン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン及び磁気ビーズからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
34. タグが磁気ビーズである、請求項２９に記載の方法。
35. 標的オリゴヌクレオチドが、アプタマー、アンチセンス核酸及びＲＮＡｉ核酸からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
36. 標的オリゴヌクレオチドがアプタマーである、請求項２９に記載の方法。
37. 標的オリゴヌクレオチドが抗ＶＥＧＦアプタマーである、請求項２９に記載の方法。
38. 抗ＶＥＧＦが、構造：
    ＰＥＧ−リンカー−Ｃ_ｆＧ_ｍＧ_ｍＡ_ｒＡ_ｒＵ_ｆＣ_ｆＡ_ｍＧ_ｍＵ_ｆＧ_ｍＡ_ｍＡ_ｍＵ_ｆＧ_ｍＣ_ｆＵ_ｆＵ_ｆＡ_ｍＵ_ｆＡ_ｍＣ_ｆＡ_ｍＵ_ｆＣ_ｆＣ_ｆＧ_ｍ３’−３’−Ｔｄ（配列番号１）を有する、請求項３７に記載の方法。
39. 第一の増幅可能な配列が、第一の蛍光プローブを用いて検出される、請求項２９に記載の方法。
40. 第二の増幅可能な配列が、第二の蛍光プローブを用いて検出される、請求項２９に記載の方法。
41. 第一の蛍光プローブが、配列 ＣＣＡ ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＴＣ ＧＡＣ（配列番号１３）を有する核酸を含む、請求項３９に記載の方法。
42. 第一の蛍光プローブが、構造：
    ６ＦＡＭ−ＣＣＡ ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＴＣ ＧＡＣ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号９）を含有する、請求項３９に記載の方法。
43. 第二の蛍光プローブが、配列 ＡＡＧ ＧＡＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＡ（配列番号８）を有する核酸を含む、請求項４０に記載の方法。
44. 第二の蛍光プローブが、構造：
    ６ＦＡＭ−ＡＡＧ ＧＡＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＡ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号９）を有する、請求項４０に記載の方法。
45. 捕捉プライマーが、配列 ＡＡＡＡＣＧＧＡＴＧＴＡＴＡＡＧＣＡ（配列番号３）を含有する、請求項２９に記載の方法。
46. 検出プライマーが、配列 ＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号５）を含有する、請求項２９に記載の方法。

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