JP2009521230A - ナノレポーターならびにその作製方法および使用方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2
Description
本発明は、生体分子サンプル中の個別標的分子の検出および定量のための組成物および方法に関する。特定的には、本発明は、個別標的分子に結合可能なコード化標識化レポーター分子(本明細書中では標識化「ナノレポーター」と記す)に関する。ナノレポーターの標識コードを介して、標的分子へのナノレポーターの結合により標的分子の同定を行う。そのようなナノレポーターの作製方法および使用方法をも提供する。ナノレポーターは、診断、予後判定、品質管理、およびスクリーニングの用途で使用可能である。
本発明は、一般的には、混合物中の標的分子の検出、同定、および定量の分野に関する。
Schena ら、 1995, Science 270:467-470 Lockhartら、 1996, Nature Biotechnology 14:1675-1680 Blanchard ら、 1996, Nature Biotechnology 14:1649
本発明は、多種多様な標的分子の検出、同定、および直接定量に使用しうるユニークに標識された分子、好ましくは合成分子(本明細書中ではナノレポーターと記す)のさまざまな集団を生成させる方法に関する。本方法は、ごく少数の異なるタイプの標識モノマーから出発して識別可能に標識された多数のレポーター分子(それぞれ単一標的分子の検出が可能である)を生成させるという点で有利である。
(以下の「図面の簡単な説明」に記載)
本発明は、ナノレポーターならびにその作製および使用に関する。完全に集合および標識されたナノレポーターは、2つの主要部分、すなわち、標的分子に結合可能な標的特異的配列と、標的特異的配列に関連付けられる「コード」(「ナノレポーターコード」)のシグナルを放出する標識化領域と、を含む。標的分子へのナノレポーターの結合時、ナノレポーターコードは、ナノレポーターが結合される標的分子を同定する。
ナノレポーター:「ナノレポーター」という用語は、(i)少なくとも2つの標識結合領域を含有する分子(「スカフォールド」);(ii)少なくとも1つの標識結合領域に結合される少なくとも1つのパッチ;および(iii)標的特異的配列;を有する分子状物質を意味する。以下で詳細に説明するように、ナノレポーターは、シングルナノレポーター(すべての成分が単一の分子状物質中に存在する)またはデュアルナノレポーター(すべての成分が2つの個別の分子状物質中に存在する)でありうる。ナノレポーターは、好ましくは合成分子、すなわち天然に存在しない分子、たとえば、通常は2つ以上の分子(たとえば、プラスミド、染色体、ウイルスゲノム、タンパク質など)上に存在する2つ以上の人工の配列および/または天然に存在する配列を連結させることにより作製されるキメラ分子である。
ナノレポータースカフォールドは、標識モノマーが直接的もしくは間接的に結合されうる標識結合領域を含有する任意の分子状物質、より好ましくは核酸分子でありうる。一実施形態では、ナノレポータースカフォールドは、タンパク質スカフォールドであり;好ましい実施形態では、ナノレポータースカフォールドは、核酸スカフォールドであり、その標識結合領域は、オリゴヌクレオチドパッチ、RNAパッチ、またはDNAパッチのような他の核酸がハイブリダイゼーションにより結合されうる一本鎖領域である。特定の実施形態では、ナノレポータースカフォールドは、核酸分子である。
本発明は、ナノレポーターの標識および検出を最適化する特性を有するようにデザインされる人工の核酸分子(DNA、RNA、またはDNA/RNAハイブリッド)であるナノレポータースカフォールドを提供する。本発明のこれらの態様では、ナノレポータースカフォールドは、50〜50,000塩基長の1つ以上の合成配列を含む人工の核酸である。したがって、好ましくはDNAであるナノレポータースカフォールドは、特定の塩基の規則的パターン(「規則的反復塩基」)を含む標識結合領域として有用な1つ以上の当該領域を有するようにデザインされる。そのような領域では、規則的反復塩基は、n番目ごとの塩基の周期性を有して存在する。ただし、nは、任意の数、好ましくは4〜25である。
標識モノマーの数/1000ヌクレオチド=(A260/ALM)×(9010/ECLM)×1000
に従って計算される。式中、ECLMは、標識モノマーの吸光係数である。この式から、発光標識モノマーに結合される規則的反復塩基の存在パーセントを計算することが可能である。
AGGGCCATAGAAGCATGAAGAACTGAACGCATGAGACAATAGGAAGCTACGCC
ACTAGGGACCTGAGAAGCTGAGCGGCTCAGCGGGTCCGAGCGTCAAAAAATAA
AAGAGTGAAACAATAGACGAATGACGCGGTAAAACCATCCAGAAGTAAACGGG
TACAAACATACAGAGATAGCCACCTGGACCAATAGGCACGTACAAACGTACAA
GCCTGGCGCGATGAGGCAATCCACACGTGCAGAGCTGGAACAATGGAAAGATG
CAAGAATAAACCGATACCGGGATCGAGGGCTCAGCGAATAAAGCAGTCAACAA
CTGGAAAGATCCACACATACCGGCGTAACCGAGTCCAAACATACAGACCTGCA
AGACTCGCGACATGGGACGGTAAAACCATCCGACCGTAAACCGGTAACCAGGT
AGCCGGGTAAAAACATAGCAGGGTGGAGACCTCAGAACGTAAAGACGTCCAAG
GGTCGCCGGATAGCGAACTACGCGCATCGCCCAATGGGCCAATCAACAGATAA
ACGAGTAGAAAAGTCAGAAAATAAGAAACTAACGAAATACGAGGGTCCAAGG
ATGCAAGACTGAGGCCCTAAGGAGATAAGGAAATAGGCCGATGCAGACCTGAA
ACGATGCACCGATCCGACGGTAAAAGACTAGACACGTAGCCGGATCAGGGCCT
GGGAGGCTGGAACCGTGAGCACATAGCAAAGTCGCAGCGTCGGCAGATGCGCC
GGTAAAAAAGTAGAGGCATGACCGGATGGGCAAATAGCGACGTACAGCAGTGA
AGCACTAAAAGCATCCAAGGGTAGGAGACTAGGCGCCTCGACGGGTAGGTACC
本発明に係る合成核酸は、天然に存在するヌクレオチドを用いて、または分子の生物学的安定性を増大させるようにもしくは標識結合領域とアニールされるパッチまたはセグメントとから形成される二本鎖の物理的安定性を増大させるようにデザインされた種々の修飾ヌクレオチドを用いて、化学合成可能である。たとえば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換型ヌクレオチドを使用することが可能である。合成核酸を生成するために使用しうる修飾ヌクレオチドの例としては、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガラクトシルクエオシン、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルクエオシン、5’−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、2−チオシトシン、5−メチル2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−N−2−カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6−ジアミノプリンが挙げられる。
ナノレポーターコードの全部もしくは一部を構成するシグナルを放出する標識モノマーは、本明細書中では「パッチ」と記される構造体を介してナノレポータースカフォールドの標識結合領域に結合される。標識モノマーは、パッチに直接的に(たとえば共有結合もしくは非共有結合で)結合されうるか、またはパッチに間接的に(たとえばハイブリダイゼーションを介して)結合されうる。
該鎖の第1の部分にハイブリダイズされ、該第2の領域は、(ii)該「A」パッチのβ末端にあり;(b)各「B」パッチは、第3の領域(3P)と第4の領域(4P)とを含むオリゴヌクレオチドであり、該第3の領域は、(i)該「B」パッチのα末端にあり、かつ(ii)該「A」パッチの該第2の領域にハイブリダイズされ、該第4の領域は、(i)該「B」パッチのβ末端にあり、かつ(ii)該鎖の第2の部分にハイブリダイズされ、該鎖の該第2の部分は、該鎖の該第1の部分の最初のところにあり、該第2の領域は、該「B」パッチにハイブリダイズされていない第1のハイブリダイズ可能な領域をそのβ末端にさらに含み、該第3の領域は、該「A」パッチにハイブリダイズされていない第2のハイブリダイズ可能な領域をそのα末端にさらに含む。
本発明に係るナノレポーターは、さまざまな標識モノマーのいずれか、たとえば、放射性同位体、蛍光色素、色素、酵素ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、または直接的(たとえば発光により)もしくは間接的(たとえば蛍光標識化抗体の結合により)に検出可能な当技術分野で公知の他のモノマーで標識可能である。一般的には、ナノレポーター中の標識結合領域の1つ以上は、1つ以上の標識モノマーで標識され、ナノレポーターの標識結合領域に結合された標識モノマーにより放出されるシグナルは、ナノレポーターの標的特異的領域が結合する標的を同定するコードを構成する。特定の実施形態では、標識結合領域に由来する所与のシグナルの欠如(すなわち「ダーク」スポット)もまた、ナノレポーターコードの一部を構成しうる。ダークスポットの例は、図1A中のナノレポーターの位置12に示される。
5.5.1 デュアルナノレポーター
成分が2つの分子状物質の形態で存在するナノレポーターは、デュアルナノレポーターと呼ばれる。デュアルナノレポーターでは、一般的には、各成分は、標的へのナノレポーターの結合速度論的挙動の特異性を改良する標的特異的配列を含有する。2つの異なる標的特異的配列は、標的分子の異なる部分を認識するように、デザインまたは選択される。
「レジスター」という用語は、一連の交互(1つおき)の標識結合領域を意味する。スペーサー領域を用いることなく隣接する標識結合領域を標識することが望ましい場合および所望の検出方法を用いて隣接する標識結合領域から放出されるシグナルを空間的に解像することができない場合、レジスターは有用である。したがって、レジスターを用いて検出されるシグナルは、隣接する標識結合領域ではなく交互の標識結合領域により形成されるものである。複数のレジスター(たとえば、合わせると全標識結合領域になるレジスター)から検出されるシグナルは、組み合わされてナノレジスターコードを形成しうる。一般的には、レジスターを使用する場合、隣接する標識結合領域が、分光的に識別可能な標識モノマーで標識される。
当技術分野で公知のさまざまなアフィニティータグを用いて、ナノレポーターの精製および/または固定を行うことが可能である。
「標的特異的配列」という用語は、標的分子に結合可能な分子状物質を意味する。ナノレポーターとの関連では、標的特異的配列は、ナノレポータースカフォールドに結合される。
「標的分子」という用語は、標識化ナノレポーターの結合により検出または測定される分子のことであり、標識化ナノレポーターの標的特異的配列(複数可)は、それを認識する(それに対する特異的結合パートナーである)。好ましくは、標的分子は、次の化合物:DNA、cDNA、RNA、mRNA、ペプチド、ポリペプチド/タンパク質(たとえば、細菌もしくはウイルスのタンパク質または抗体)、脂質、炭水化物、糖タンパク質、糖脂質、小分子、有機モノマー、あるいは薬剤のいずれかでありうるが、これらに限定されるものではない。一般的には、標的分子は、天然に存在する分子または天然に存在する分子のcDNAまたは該cDNAの相補体である。
本発明は、ナノレポーター集団またはナノレポーター標識ユニット集団、たとえば、それぞれ、少なくとも10種、少なくとも15種、少なくとも20種、少なくとも25種、少なくとも30種、少なくとも40種、少なくとも50種、少なくとも75種、少なくとも100種、少なくとも200種、少なくとも300種、少なくとも400種、少なくとも500種、少なくとも750種、もしくは少なくとも1,000種のユニークなナノレポーターまたはナノレポーター標識ユニットを含有するナノレポーターライブラリーまたはナノレポーター標識ユニットライブラリーを提供する。本明細書中で使用する場合、集団内のナノレポーターまたはナノレポーター標識ユニットに関連して使用するときの「ユニーク」とは、同一の集団において他のナノレポーターまたは標識ユニットから区別するコードを有するナノレポーターまたは標識ユニットを意味するものとする。
本発明に係るナノレポーターシステムを使用することにより、任意の生体分子サンプル中の標的分子を検出することが可能である。当業者であればわかるであろうが、サンプルは、任意の数の次のもの(ただし、これらに限定されるものではない)を含みうる:細胞(プライマリー細胞および培養細胞系の両方を包含する)、細胞の溶解物または抽出物(RNA抽出物、精製mRNAを包含するが、これらに限定されるものではない)、組織および組織抽出物(RNA抽出物、精製mRNAを包含するが、これらに限定されるものではない);体液(血液、尿、血清、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、房水もしくは硝子体液、初乳、喀痰、羊水、唾液、肛門および膣の分泌液、発汗、ならびに精液を包含するが、これらに限定されるものではない)、漏出液、滲出液(たとえば、膿瘍または任意の他の感染部位もしくは炎症部位から得られる液)、あるいは関節(たとえば、正常関節、またはリウマチ様関節炎、骨関節炎、痛風、もしくは敗血症性関節炎のような疾患に罹患した関節)から得られる液、これらは、事実上任意の生物のものであるが、哺乳動物サンプルが好ましく、ヒトサンプルがとくに好ましい;環境サンプル(空気、農業用の水および土壌のサンプルを包含するが、これらに限定されるものではない);生物兵器サンプル;研究サンプル、たとえば、細胞外液、細胞培養物に由来する細胞外上清、細菌中の封入体、細胞内コンパートメント、細胞ペリプラズム、ミトコンドリアコンパートメントなど。
標識化ナノレポーターから生成される全シグナルの検出のほかに、本発明は、ナノレポーター上の標識モノマーから放出されるシグナルの空間的位置(すなわちスポット)の測定法を提供する。この場合、各スポットは、所与の標識結合領域に結合された標識モノマーに由来する総和シグナルに対応する。スポットは、同一の波長または異なる波長のシグナルを含有しうる。したがって、ナノレポーター上のスポットの性質およびその位置は、ナノレポーターコードを構成する。
本発明は、さまざまなナノレポーターの一次構造の同定を容易にする方法および組成物を提供する。特定の態様では、本発明は、伸長状態のナノレポーターを選択的に固定する方法を提供する。本発明によれば、伸長のためにいかなる力を使用した場合でも完全に伸長された状態でナノレポーターを選択的に固定することが可能である。そのほかに、本発明に係る方法は、互いに配向された伸長型ナノレポーターの選択的固定を容易にする。言い換えれば、本発明に係る方法によれば、複数のナノレポーターを互いに同一の配向状態で容易に固定することが可能である。
以上に記載したように、本発明は、伸長状態のナノレポーターの選択的固定方法を提供する。ナノレポーターは、選択的固定の後、当業者に自明な任意の目的に使用可能である。
本発明に係る方法では、ナノレポーターの第1の部分は固定される。一般的には、第1の部分は、固定されたことが当業者により確認されれば、固定されている。第1の部分は、当業者に自明な任意の技術により固定可能である。特定の実施形態では、ナノレポーターの第1の部分を固定する技術は、本発明に係る方法に重要ではない。
本発明に係る特定の方法では、ナノレポーターは伸長状態である。一般的には、いずれのナノレポーターも、そうであることが当業者により確認されれば、伸長状態である。
本発明に係る特定の方法では、ナノレポーターは配向状態である。一般的には、いずれのナノレポーターも、そうであることが当業者により確認されれば、配向状態である。
以上で述べたように、本発明に係る方法では、ナノレポーターの第2の部分は選択的に固定される。ナノレポーターの第2の部分は、ナノレポーターの第1の部分と同一でないナノレポーターの任意の部分でありうる。いくつかの実施形態では、ナノレポーターの第2の部分は、ナノレポーターの第1の部分のいかなる一部分ともオーバーラップしない。
特定の実施形態では、本発明は、伸長状態または配向状態のナノレポーターの第1の部分および第2の部分を選択的に固定する方法を提供する。注目すべき点として、本発明に係る方法によれば、ナノレポーターは、ナノレポーターを伸長または配向させうる力の適用前に固定する必要はない。
本発明に係る方法では、固定用基材は、ナノレポーターに選択的に結合しうる当業者に自明な任意の基材でありうる。さらに、特定の態様では、本発明は、伸長状態で選択的に固定されたナノレポーターを含む組成物を提供する。組成物は、本明細書に記載されるように伸長状態でナノレポーターを固定してなる基材を含む。ナノレポーターは、もちろん、本発明に係る方法に従って固定可能である。
特定の実施形態では、選択的に固定された引き伸ばされたナノレポーターは、分離および標識の逐次的検出を目的として巨大分子バーコードを生成すべく使用可能である。分子に沿って離間して配置されたこれらの標識は、ナノレポーターが伸長および固定されたときに読取り可能なユニークなコードを提供する。伸長および選択的固定は、巨大分子バーコードの解読を容易にしうる。
本発明はさらに、本発明に係る1つ以上の成分を含むキットを提供する。キットは、たとえば、本発明に係る基材と、基材上に選択的に固定された1つ以上の伸長型もしくは配向型またはその両方のナノレポーターと、を含みうる。キットは、以上に記載のものをはじめとする当業者に自明な任意の目的に使用可能である。
ナノレポーターは、所与のナノレポーター上の特定のシグナルを検出しうる当技術分野で利用可能な任意の手段により検出される。ナノレポーターが蛍光標識される場合、適切な励起光源の好適な要件が検討されうる。可能な光源としては、アークランプ、キセノンランプ、レーザー、発光ダイオード、またはいくつかのそれらの組合せが挙げられうるが、これらに限定されるものではない。適切な励起光源は、適切な光学検出システム、たとえば、倒立型蛍光顕微鏡、落射蛍光顕微鏡、または共焦点顕微鏡と組み合わせて使用される。好ましくは、ナノレポーター上の一連のスポットを測定するのに十分な空間解像度で検出を行いうる顕微鏡が使用される。
顕微鏡の対物レンズに関する主要な要件は、光学解像度を有することであり、この光学解像度は、その開口数(NA)によって決まる。一般的には、NAが大きいほど、光学解像度は良好である。所要のNAは、好ましくは、δ=0.61λ/NA(δ=光学解像度およびλ=波長)の関係式に基づいて少なくとも1.07である。対象レンズにより集光される光量は、NA4/Mag2(Mag=対象レンズの倍率)により決定される。したがって、できるかぎり多くの光を集光するために、高いNAおよび低い倍率を有する対物レンズを選択すべきである。
CCDカメラを選択する場合、第1の要件は、画像化システムの最終解像度を部分的に決定するピクセルサイズである。最適には、光学解像度は、CCDカメラにより損なわれないようにすべきである。たとえば、光学解像度が210〜300nm(60倍にした後のCCDチップ上の12.6〜18μmに対応する)である場合、解像および光学解像度の保持のために、サンプルの各スポットに対して少なくとも2つのピクセルが存在するようにすべきである。すなわち、CCDチップのピクセルサイズは、多くとも6.3〜9μmにすべきである。
本発明は、ナノレポーター画像の収集、ナノレポーターの同定、および/またはナノレポーターコードの解読をコンピューター化するために使用可能なコンピューターシステムを提供する。特定的には、本発明は、プロセッサーと、プロセッサーに結合されかつ1つ以上のプログラムをコード化するメモリーと、を含む種々のコンピューターシステムを提供する。ナノレポーターの画像化に利用される顕微鏡にコンピューターシステムを接続することにより、ナノレポーターの画像化、同定、および解読、ならびにナノレポーター画像および関連情報の記憶を単一の装置で行うことが可能である。メモリーによりコード化された1つ以上のプログラムにより、プロセッサーは本発明に係る方法を実行する。
本発明に係る組成物および方法は、診断、予後判定、治療、およびスクリーニングの目的に使用可能である。本発明は、本発明に係る方法を用いて単一の生体分子サンプルから多くの異なる標的分子を一度に分析できるという利点を提供する。これにより、たとえば、いくつかの診断試験を1つのサンプルで実施することが可能である。
本方法は、疾患細胞タイプがサンプル中に存在するかを調べるためにおよび/または疾患の病期を判定するために、患者から取得されるかまたは患者に由来する生体分子サンプルの分析に適用可能である。
ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドで固定されたパラフィン包埋組織サンプルから抽出されるRNAは、典型的には、質が悪く(断片化)、収量が少ない。このため、組織学的サンプルまたは長期保存病理組織で低発現遺伝子の遺伝子発現解析を行うことはきわめて困難であり、多くの場合、完全に実行不可能である。ナノレポーター技術は、ごく少量の低品質の全RNAの分析を可能にすることにより、この満たされないニーズを満たすことが可能である。
本発明に係る方法を用いて、とくに、種々の標的分子に及ぼす攪乱因子(たとえば、化学化合物、突然変異、温度変化、成長ホルモン、増殖因子、疾患、または培養条件変化)の影響を調べることが可能であり、これにより、存在、不在、またはレベルが特定の生物学的状態の指標となる標的分子を同定することが可能である。好ましい実施形態では、本発明は、疾患状態の要素および経路の解明および探索のために使用される。たとえば、疾患組織中に存在する標的分子の量を「正常」組織のものと比較することにより、疾患に関与する重要な標的分子を解明することが可能であり、それにより、疾患の治療に使用可能な新しい薬剤候補物質の探索/スクリーニングのための標的を同定することが可能である。
本発明はさらに、本発明に係る1つ以上の成分を含むキットを提供する。キットは、標識済みナノレポーターを含みうるか、またはナノレポーターを標識するための1つ以上の成分と共に非標識化ナノレポーターを含みうる。さらに、キット中に提供されるナノレポーターは、あらかじめ結合された標的特異的配列を有していてもよいし有していなくてもよい。一実施形態では、ナノレポータースカフォールドに結合されていない状態で標的配列がキット中に提供される。
ここでは、種々の成分からナノレポーターを構築する方法の工程別の例を示す。
選択されたオリゴヌクレオチドスカフォールド配列をVector NTI(登録商標)ソフトウェアを用いて分析した。第1に、New England Biolabsから商品として購入した環状M13mp18一本鎖DNAを線状化することにより、一本鎖核酸を作製した。環状M13mp18をBamH1酵素で消化し、それを線状化した。使用した材料は、M13mp18ベクター(250ng/μl)、パッチ_1L_BamH1.02(100μMストック液の10μM希釈液)、10×BamH1緩衝液、BamH1酵素で構成された。全量0.8pmolの線状M13mp18を作製するためのプロトコルは、次の工程を含む。1)加熱ブロックを37℃に予備加熱する;2)0.65mlエッペンドルフチューブ中で、40μlの250ng/μl M13mp18ベクター、2μlの10μM パッチ_1L_BamH1.02、および5μlの10×BamH1緩衝液を混合する;3)上端をフォイルで覆ってエッペンドルフチューブを37℃の加熱ブロック中に配置する。チューブを37℃で15分間インキュベートしてパッチユニットをM13mp18スカフォールドにハイブリダイズさせる;4)15分後、2μlのBamH1酵素を添加し、反応系を37℃で30分間消化させ、その後、追加の2μlのBamH1酵素を添加して反応を継続させ、37℃でさらに30分間消化させる(BamH1酵素の最終量は8%である);および5)10μlのアリコートに分けて0.65mlエッペンドルフチューブ中に導入し、フリーザー内に貯蔵する(線状M13mp18の最終濃度は200ng/μlである)。
第2に、パッチユニットをプールの形態で調製する。M13mp18鎖およびヒトゲノム配列に対して最適な長さおよび所望の相同性/非相同性になるように、パッチオリゴヌクレオチド配列を選択した。パッチは、60または65ヌクレオチド塩基のいずれかの長さの市販のオリゴヌクレオチド(Integrated DNA technologiesから購入)であった。各パッチオリゴヌクレオチドの50ヌクレオチド塩基は、M13mp18一本鎖DNAに相補的であり、10ヌクレオチド塩基は、隣接するパッチに相補的であり、かつ5ヌクレオチド塩基対は、対応するフラップに相補的である。パッチ間の10ヌクレオチド塩基マッチは、ステム構造を形成し、これにより、構造を安定化させるとともに、被覆されたスカフォールドからフラップを持ち上げるのを支援して標識化オリゴヌクレオチドの結合に一層役立つようにする。フラップに結合させるためのパッチ上の5ヌクレオチド塩基の合成結合部位は、モジュールシステムの能力の強化を可能にする。
位置1:パッチユニット1〜9(AまたはC)
位置2:パッチユニット10〜18(BまたはD)
位置3:パッチユニット19〜27(AまたはC)
位置4:パッチユニット28〜36(BまたはD)
位置5:パッチユニット37〜45(AまたはC)
位置6:パッチユニット46〜54(BまたはD)
位置7:パッチユニット55〜63(AまたはC)
位置8:パッチユニット64〜72(BまたはD)
材料:互いにあらかじめアニールされた右パッチおよび左パッチ(各オリゴヌクレオチドは10μMの濃度である)。100pmolのBPP 1を作製するための材料:(位置1でパッチ座標1LがBamH1消化のために使用されるが、このパッチはBPP 1に含まれない):10μlのそれぞれあらかじめアニールされたパッチユニット(各10μM)(座標2〜9)、5μlの[20μM]パッチ_1R(AまたはC)。各パッチの最終濃度は1.18pmol/μlである。100pmolのBPP 2〜8を作製するための材料:10μlのそれぞれあらかじめアニールされた適切なパッチユニット(各10μM)。それぞれに9種のパッチユニットが添加される。すなわち、全体で90μlである。各パッチの最終濃度は1.11pmol/μlである。
第3に、二本鎖オリゴヌクレオチドスカフォールドを作製するために、パッチユニットを調製して一本鎖線状M13mp18にアニールし、鎖を被覆する。結合が非常に特異的でありかつパッチがM13mp18鎖上の不適切な座標にアニールしないように、60および65ヌクレオチド塩基のパッチをM13mp18にアニールするための条件は、高い塩濃度になるようにする必要がある。アニーリング工程では、各パッチユニットに全量0.5pmolの一本鎖M13mp18配列を2:1〜4:1の比で添加する。フラップをアニールする前に過剰のパッチを除去する。
1.7μl A1 BPP(アニール済み、12/15;1.18μM/各パッチ)
1.8μl B2 BPP(アニール済み、12/15;1.11μM/各パッチ)
1.8μl A3 BPP(アニール済み、12/15;1.11μM/各パッチ)
1.8μl B4 BPP(アニール済み、12/15;1.11μM/各パッチ)
1.8μl C5 BPP(アニール済み、12/15;1.11μM/各パッチ)
1.8μl B6 BPP(アニール済み、12/15;1.11μM/各パッチ)
1.8μl A7 BPP(アニール済み、12/15;1.11μM/各パッチ)、
2.4μl BPP−D8(位置8の座標64、65、66、67、68、69、および70の最初の7つのパッチユニットのプール、「D」特異性)[ただし、F8に0.83μMの精製用タグ(FHF、これは、パッチ座標71L、71R、72L、72R、73Lにアニールして、ビオチンリンカーとして使用するための「F」特異性を有するフルスプリットフラップ/パッチユニットを位置F8に形成する)を有する]、ならびに7.3μl 20×SSC。最終反応量は、0.027pmol/μlで29.3μlになるであろう。
第4の工程は、二本鎖オリゴヌクレオチドスカフォールドを作製するためにパッチユニットを一本鎖線状M13mp18にアニールして鎖を被覆するためのプロトコルを含み、次に工程で実施される:1)加熱ブロックを42℃にあらかじめ加熱し、上端をフォイルで覆った小さいPCR(またはストリップ)チューブ中で以上の反応溶液を45℃に15分間加熱し、ヒートブロックを65℃に変更してさらに1時間45分間インキュベートし、そしてチューブを取り出して氷上に配置するかまたは凍結する。
第5の工程は、フラップの結合前に行われ、ここでは、M13mp18鎖にアニールされなかった過剰のパッチユニットを二本鎖オリゴヌクレオチドスカフォールドから分離する。スカフォールドを「フック」で固定するために、パッチユニットの相補的5ヌクレオチド塩基オーバーハングに対する5ヌクレオチド塩基相同領域を有する精製用タグをアニールする。ビオチン化オリゴヌクレオチドを「精製用タグ」にアニールし、ビオチン化オリゴヌクレオチドを用いたスカフォールドをキャプチャーするためにストレプトアビジンを有する磁気ビーズを使用する。過剰のパッチユニットを上清と共に除去する。回収のためにスカフォールドを溶融して磁気ビーズから溶液内に遊離させる。
D−ビオチンキャッチャーをナノレポーター上の精製用タグにアニールする(溶液中の利用可能なD8−フラップ位置の量に対して2倍(これはM13に対して2倍)または4倍の最終量にする):0.5pmol×25フックオリゴヌクレオチド位置(5×5)、4倍では50pmolが0.50μlの100pmol/μl D−ビオチンを意味する、0.5μlの(D、E、F)−ビオチン(100μM)をサンプルに添加し、混合し、そして室温で30分間インキュベートする。
5×SSC中、室温で、25倍過剰のF−フックオリゴヌクレオチドをナノレポーターに30分間アニールする。200μlのDynaBead MyOne StreptavidinTMビーズ溶液を1.5mlチューブ中にピペットで添加し、マグネット上に配置し、そして上清を除去する。以上の工程のときと同様に再懸濁およびマグネットによる清澄化を行うことにより、5×SSCを用いて2回洗浄する。5×SSC中の80μlのサンプル(この実施例では80fモルのサンプル)を添加する。ボルテックス上に15分間配置することにより、十分に再懸濁させる。マグネットを用いて溶液を清澄化し、後続のゲル分析のために上清を新しいチューブに移す。マグネット上にある状態で、最初に添加したのと同一の80μlの量でペレット上にピペットで3回添加することにより、80μlのTEでペレットを洗浄する(再懸濁させない)。洗液を除去し、分析のために新しい「洗浄」チューブ中に配置する。TE緩衝液を45℃に昇温し、80μlを各ペレットに添加し、そして再懸濁させる。45℃のヒートブロック上にチューブを15分間配置し、ビーズが懸濁状態を保持していることを保証するためにピペッティングで一度上下に操作する。ただちに、マグネットを用いて温かいうちに生成物を清澄化し、貯蔵する。精製ナノレポーターの大部分は、45℃で溶出されたこの生成物中に存在するはずである。
第6の工程は、「被覆されたスカフォールド」を作製するためにスカフォールドにアニールされるスプリットフラップオリゴヌクレオチドを含む。過剰のスプリットフラップを除去するために、後続的に磁気ビーズによる精製を行う。構造の安定性を増大させるために、T4リガーゼを用いて、被覆されたスカフォールドのライゲーションを行う。1つの蛍光色素あたりただ1つのタイプのフラップが必要とされる。フラップは、95もしくは100塩基のいずれかの長さであり、パッチに対して、標識化オリゴヌクレオチドに対して、および互いに、相補的な領域を有する。各フラップは、標識化オリゴヌクレオチドに結合させるための15塩基の反復配列を有する。反復配列は、いかなるパリンドロームおよびヘアピン構造体をも除去すべく分析されたλ配列に基づく。
ABABCBAD=
A:40.5×0.023=0.93pmol;量:1μMで0.93μlのSF(スプリットフラップ)−AL、1μMで0.93μlのSF−AR
B:40.5×0.023=0.93pmol;量:1μMで0.93μlのSF−BL、1μMで0.93μlのSF−BR
C:13.5×0.023=0.31pmol;量:1μMで0.31μlのSF−CL、1μMで0.31μlのSF−CR
D:13.5×0.023=0.31pmol;量:1μMで0.31μlのSF−DL、1μMで0.31μlのSF−DR
ライゲーション反応(全量25μl)は次のもので構成される:スプリットフラップ(以上参照;全量4.96μlまたは約5μl)、0.0016pmol/μlで14.3μlのMODB−スカフォールド、2.5μl 10×T4ライゲーション緩衝液、2.2μl NanoPure H2O、および1μl T4リガーゼ。チューブを45℃で5分間インキュベートする。37℃水浴に移して5分間インキュベートする。1μl T4リガーゼをサンプルに添加する。37℃でさらに1時間インキュベートする。ただちに凍結するかまたは75℃で5分間加熱してT4リガーゼを失活させる。
第7の工程は、ナノレポーターへの標的特異的配列のライゲーションを含む。DNA標的特異的配列は、RNA(たとえばmRNA)またはDNA(たとえばcDNAもしくはゲノムDNA)でありうる標的分子に相補的になるようにデザインされる。標的特異的配列は、35〜60もしくは70ヌクレオチド塩基の長さでありうる。被覆されたスカフォールド上の一本鎖オーバーハング領域を用いて標的特異的配列をスカフォールドにライゲートすることが可能である。単一タイプの標的特異的配列を有するスカフォールドを個別に作製し、次に、混合してライブラリーを形成することが可能である。
ナノレポーターへのオリゴヌクレオチドの付加は、ナノレポーター構築時の任意の時点で実施可能である。本発明の特定の態様では、標識化オリゴヌクレオチドは、15ヌクレオチド塩基の長さである。5’末端に単一の蛍光色素が結合される。特定の蛍光色素を有するオリゴヌクレオチドは、一般的には、同一の配列を有するであろう。これらの標識化オリゴヌクレオチドは、スプリットフラップの反復配列に結合する。この実施例に最適な蛍光物質としては、Alexa 488、cy3、Alexa 594、およびAlexa 647が挙げられるが、これらに限定されるものではない。15ヌクレオチド塩基の長さがあれば、互いに消光できないようにかつ可視化プロセスの条件で標識化核酸が安定であること(溶融して相補鎖から遊離されないこと)が保証されるように、蛍光物質は十分に離間して保持される。標識化オリゴヌクレオチドは、40℃で安定である。この短い長さはまた、フラップ上への多数の蛍光色素の充填を可能にする。本発明の特定の態様では、標識化オリゴヌクレオチドは、標的サンプルの処理時に導入される。
当業者に公知の任意の手段を用いて、ナノレポーターを標的分子に結合させることが可能である。代表的な実施形態では、それぞれ250pmolの第1のプローブおよび第2プローブの両方を125pmolの標的と混合することにより、デュアルナノレポーターを標的分子にハイブリダイズさせる。4μlおよび最終濃度の5×SSC緩衝液になるように全量を調整する。カバーをかけたPCRチューブ中、42度で、この混合物を一晩インキュベートすることにより、ハイブリダイゼーションを行う。
標的分子と、対応する標識化核酸、すなわち、標識モノマーに結合された核酸との両方にナノレポーターを結合させた後、標識モノマーにより放出されたシグナルの順序の解像ひいては標的分子の同定を行うために、それらを表面に結合させて伸長させる。この実施例では、特定の標的分子に対応する蛍光色素コードを空間的に解像するために、ナノレポーターを伸長させる。一端を表面(この実施例では、カバースリップ、以下の調製を参照されたい)に結合させることにより、ナノレポーターを伸長させる。2つの表面結合方法を使用しうる:A)Accelr8 Corporation製のストレプトアビジン被覆スライドとビオチン化されたナノレポーターおよびB)ビオチン被覆スライドとストレプトアビジンを有するナノレポーター。緩衝液中でナノレポーターを活性表面に接触させ、ある時間にわたりインキュベートする。チャネルを形成するようにエッチングされたシリコンウェーハ中に成形されたPDMS製のフローセル中で、反応を行う。緩衝液およびサンプルを挿入するために、チャネルの端でコアウェルへの金属チューブを使用する。チャネルの寸法は、幅0.5mmもしくは1mmおよび高さ54μmである。サンプルをフローセルレーンに充填してインキュベートした後、ナノレポーターは結合されているはずである。電圧を印加することによりまたは後退メニスカスで液体を除去することによりナノレポーターを伸長させ、鎖を伸長状態に保持して乾燥させることが可能である。
結合表面(Accelr8ブランドのStreptavidin−OptiChem、被覆カバースリップ)は、スライド容器1つあたり5つの表面が含まれるユニットとして輸送され、各容器は、フォイルパウチ内でシリカ乾燥剤のパッケージに包囲されている。使用時までパウチを−20℃で貯蔵する。
最初に、選択されたレーンの1つのウェル中に5μLのサンプル液滴(一般的には、pH9.8の100mMホウ酸ナトリウム緩衝液中に希釈される)を適用することにより、サンプルを表面に結合させる。液滴は、チャネルがウェルに連結する点にちょうど接触する状態が望ましい(この時点で、いくらかのサンプルがチャネル中に滲み込む可能性がある)。チャネルを通って対向するウェルに達するように非常に弱い真空(<2kPa)を用いてドロップレットを吸引することにより、チャネルを満たし、チャネル全体にわたり結合を均等化させる。他のサンプルについてそれらのそれぞれのレーン中でこのプロセスを反復する。次に、過剰の液をウェルから除去し、ウェルをテープで留めて蒸発を低減させ、そして暗所中、室温でデバイスを20分間インキュベートする。
カバースリップ/PDMSデバイスの下端に液浸油をスポットし、顕微鏡上に配置する。第1のPDMSチャネルの両端のウェルに電極を挿入する(負極を上端ウェルに、正極を下端ウェルに)。チャネルの第1の画像は、下端ウェルの近傍で取得されるであろう。その際、対象の領域の焦点が合うように、顕微鏡ステージを調整する。
アークランプを光源として使用する場合、最良の蛍光物質の選択は、蛍光の重なりを生じない最高輝度のタイプ、たとえば、Alexa 488、Cy3、およびAlexa 594である。Alexa 647やCy5.5のようなより弱い蛍光色素を使用することも可能である。
選択される蛍光物質Alexa 488、Cy3、Alexa 594、およびAlexa 647では、Cy3とAlexa 594との間に重なりが存在しうる。しかしながら、572〜600nmの帯域幅を有する発光フィルターを特注すれば、重なりは最小限に抑えられる。
使用した顕微鏡モデルは、複数の蛍光色素候補物質からの蛍光発光の選択を可能にする6つのフィルターカセットを有する倒立型蛍光画像化ステーションを用いたNikon Incorporation製のNikon Eclipse TE2000Eであった。選択された色素では、所要の光学解像度は、すべての波長(500〜700nm)に対して約400nmである。選択された対物レンズは、1.45のNAおよび60倍の倍率を有するNikon Plan Apo TIRFレンズである。光学解像度は、さまざまな波長に対して約210〜300nmである。
この実施例では、一本鎖線状M13mp18ウイルスDNAとオリゴヌクレオチドパッチユニットと長いフラップとよりなるナノレポーターを作製する他の方法を示す。
5μgのM13=20μlストック液(New England Biolabs製)=2pmol
オリゴヌクレオチドミックス:180−34フラップ領域−10 Acrydite修飾オリゴ=0.74pmol/オリゴ
10pmol/オリゴヌクレオチド=13.5μl=1350pmol
1単位のOptikinaseは、最終的に1nmolのリン酸を変換する。過剰量を使用する。4μlのOptikinaseを使用した。
ナノレポーターを作製し、実質的にこの実施例に記載の方法を用いて標的分子を検出するために利用し、好結果を得た。そのようなこの方法を用いて標的を検出する例を図6に示す。
一本鎖環状M13mp18 DNA(USB Corporation)をBam HI認識部位に相補的な10倍モル過剰のオリゴヌクレオチド(Bamカッターオリゴ)にアニールし、Bam HI制限酵素で切断して線状一本鎖DNAバックボーンを得る。続いて、Bamカッターオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド(抗Bamオリゴヌクレオチド)をBamカッターオリゴヌクレオチドに対して50倍過剰で添加して遊離のBamカッターオリゴヌクレオチドを封鎖することにより、後続の工程時におけるM13の再環状化を防止する。
M13スカフォールドに沿って10個の異なる領域を形成ために、10セットのオリゴヌクレオチドプライマーペアをデザインした。各ペアは、5’末端にT7 RNAポリメラーゼプロモーターを有する1つのプライマーを含有する。領域2〜7は、900塩基(約300nm)の長さになるようにデザインされる。なぜなら、これは、回折限界スポット(標準的光学素子で達成可能な最小スポット)の近似サイズであるからである。領域1および8は、長体および短体の両方を有し、長体は、全900塩基領域をカバーし、一方、短体は、標的特異的配列をライゲートできるように900塩基領域の一部だけをカバーする。したがって、標的特異的配列は、いずれかの末端に結合可能である。アンカーまたはタグの結合のために、末端を使用することも可能である。
以上に記載のPCR産物を二本鎖鋳型として用いて、Ambion製のin vitro転写キット(Megascript T7キット)によりRNAセグメントを作製する。Qiagen製のRNeasyキットを用いて、転写反応産物を精製する(鋳型を除去するためのDNAse Iによる処理を含む)。
以上に記載のPCR産物を二本鎖鋳型として用いて、Ambion製のin vitro転写キット(MessageAmp aRNAキット)により、後続の色素結合のためのRNAセグメントを作製する。転写時にアミノアリル修飾UTPヌクレオチドをRNAセグメント中に組み込む。Qiagen製のRNeasyキットを用いて、転写反応産物を精製する(鋳型を除去するためのDNAse Iによる処理を含む)。
Ambion Aminoallyl Labelingキットを用いて、20〜100μgのアミノアリル修飾RNAセグメントをNHS−エステル色素に結合させる。使用した色素としては、Alexa 488、Alexa 594、およびAlexa 647(Invitrogen/Molecular Probes)、ならびにCy3(Amersham)が挙げられる。
1×SSPE緩衝液中70℃で、2:1のセグメント対M13スカフォールド比で、各位置に対するセグメントを2時間アニールする。
9.1 プローブおよび標的オリゴヌクレオチドの合成
S2 DNA標的オリゴヌクレオチドを合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Integrated DNA Technologies)により精製した。Ambion MegascriptTMキットを用いて製造業者の使用説明書に従って、クローン化SARSコロナウイルス遺伝子(Invitrogen)の領域に対応するPCR産物のin vitro転写により、S2 RNA標的分子を作製した。S2ゴーストプローブ(図6A(i))は、S2標的配列の特定の50塩基領域(S2−a)に相補的であり、5’末端にビオチン−TEGモノマーを有するように合成され、高速液体クロマトグラフィー(Integrated DNA Technologies)により精製された。S2標的(S2−b)に相補的な50bpとM13スカフォールドへのライゲーションに用いられる追加の配列の9bpとを有する第2のオリゴヌクレオチド(全59bp)を合成し、HPLC(Integrated DNA Technologies)により精製した。S2−aおよびS2−b標的領域がオーバーラップしていなかったことに留意されたい。
オリゴヌクレオチドS2−bを線状化M13[図6A(iii)]の5’末端にライゲートし、得られた生成物を、製造業者の使用説明書に従ってYM100フィルター(Millipore)に通してサイズ排除濾過により精製し、ライゲートされていない残留オリゴヌクレオチドから分離した。製造業者の使用説明書に従ってAmbion MegascriptTMキットを利用して、M13の位置2、4、6、および8に相補的なアミノアリル修飾RNAセグメント(配列番号)(図1C)をDNA鋳型(PCR産物)のin vitro転写から作製した。次に、Ambionの使用説明書(アミノアリルMessageAmpTM II aRNAキット)に従ってセグメントをNHS−エステル修飾Alexa 647色素(Invitrogen)に結合した。M13スカフォールドの位置1、3、5、および7に対応するRNAセグメント(図1C)を以上に記載のDNA鋳型から未修飾in vitro転写RNAとして作製した。1×SSPE緩衝液(150mM塩化ナトリウム、10mMリン酸ナトリウム、1mM EDTA)中、70℃で、10fmol/μlの8つの各セグメントを5fmol/μlのM13−S1−bスカフォールドに2時間アニールすることにより、ナノレポーターの集合を行った。最終生成物は、ダークセグメントを介在させてA647(赤色)で標識された4つのセグメントを有するナノレポーターであった。
標的へのナノレポーターおよびゴーストプローブのハイブリダイゼーションを次の条件下で行った:5×SSPE(750mM塩化ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、5mMジナトリウムEDTA)、40pMゴーストプローブ(結合オリゴヌクレオチドS2−a)、40pMナノレポーターS2−b、100ng/μl剪断サケ精子DNA、5×Denhardt溶液、および0.1%Tween。最終標的濃度は、20pM S2 DNA標的(図6B)および1pM S2 RNA標的(図6C)であった。陰性対照(図6D)には標的を添加しなかった。
標的分子がタンパク質またはポリペプチドである場合、ナノレポータースカフォールドが核酸でありかつ標的特異的配列が一価もしくは二価抗体フラグメントであるナノレポーターを作製することが可能である。
25種の内在性細胞遺伝子の検出および定量を単一の多重化ハイブリダイゼーション反応で行った。そのほかに、約10、100、および300コピー/細胞にそれぞれ対応する3種の非ヒト対照配列を各反応系にスパイクした。また、細胞RNAの不在下で陰性対照ハイブリダイゼーションを行った。
各サンプルを三重反復試験方式でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション試薬の最終濃度は、次のとおりであった:1.12nM全ナノレポーター(それぞれ40pMで28種の個別ナノレポーター)、1.12nM全ゴーストプローブ(28種の個別ゴーストプローブ)、5×SSPE(pH7.5)、5×Denhardt試薬、100ng/μl剪断サケ精子DNA、0.1%トゥイーン20、150fM S3スパイクDNA、50fM S4スパイク、および5fM S6スパイク。全胎盤RNAの最終濃度は、33ng/μlであった。陰性対照ハイブリダイゼーションには全胎盤RNAを添加しなかった。反応の最終量は、30μlであった。試薬を混合し、加熱蓋を備えたサーモサイクラーブロック中65℃で20時間インキュベートした。
磁気ビーズ(F−ビーズ)に結合されたゴーストプローブに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーション反応系を精製し、ハイブリダイズされていないレポーターを除去した。最終塩濃度が1×SSPEになるようにハイブリダイゼーション反応系を0.1%トゥイーン20中に5倍希釈し、溶液を30μlのF−ビーズ(150μlの1×SSPE/0.1%トゥイーン20中で2回予備洗浄した)に添加した。連続回転させながら、ハイブリダイズされた複合体をビーズに室温で15分間結合させ、150μlの0.5×SSPE中で1回洗浄し、そして25μlの0.1×SSPE中、45℃で15分間溶出させた。
0.1μM TetraspecTM蛍光マイクロスフェア(製品番号T7279、Molecular Probes)の1/1000希釈液1μlおよび3μlの1Mビス−トリスプロパン(pH9.0)を添加することにより、結合用としてサンプルを調製した。ストレプトアビジンで被覆されたAccerl8 Optichem(登録商標)スライド(製品番号TB0200)に結合させるために、サンプルをナノ鎖流体デバイスに充填した。充填後、各ウェルに40μlのTAEを添加することにより、スライド表面を1×TAEで1回洗浄して電気伸長用として調製した。流体チャネルを横切って200Vを印加することにより、結合された複合体を伸長させた。1分後、電圧の印加を5分間継続しながら、負荷電電極の入ったウェルに60μlの500mMのG−フックオリゴ溶液を添加することにより、サンプルを伸長位置で固定した。固定後、TAE溶液を除去し、画像化のために光漂白防止試薬で置き換えた。
メタルハライド光源(X−cite 120、Exfo Corporation)と倍率60倍の油浸レンズ(1.4 NA Plan Apo VC、Nikon)とを備えたNikon Eclipse TE2000Eを用いて、スライドを画像化した。Metamorphソフトウェア(Universal Imaging Corporation)の制御下でOrca Ag CCDカメラ(Hamamatsu)を用いて、各視野ごとに異なる励起波長(480、545、580、および622)で4つの画像を取得した。特注品の画像処理ソフトウェアを用いて画像を処理した。
特注品のソフトウェアを用いて処理画像から生データを抽出した。各サンプル中の対照スパイクの平均カウント数を基準にしてデータを規格化した。システムにより遺伝子が「検出」されたかを判定するために、スチューデントのt検定を用いて、各遺伝子ごとにRNAを含有するハイブリダイゼーションから得られたカウント数をRNAなしのハイブリダイゼーションで得られたカウント数と比較した。p値<0.05を有する遺伝子を検出されたと判定した。バックグラウンドを除去した後、スパイク対照の線形回帰から細胞mRNAの濃度を推定した。次の仮定を用いてこれらの濃度をコピー/細胞に変換した:1個の細胞は10pgの全RNAを含有し;各細胞は300,000個のmRNA分子を含有し;反応の最終量は30μlである。
以下の表3は、以上に記載のデータ解析の結果を示している。この結果に示されるように、本明細書に記載のナノレポーター技術を用いて、1転写産物/細胞未満の濃度で存在する転写産物(たとえばCASP3)を検出することが可能である。したがって、ナノレポーター技術は、遺伝子発現の検出および定量を行うきわめて高感度の手段を提供する。
12.1 背景
標的に対して大過剰のプローブを用いる溶液ハイブリダイゼーションは、擬一次速度式に従う。このレジームでは、反応速度は、プローブ濃度だけに依存し、標的濃度には依存しない。溶液中の標的の濃度に関する正確な情報を提供する二プローブ一標的ストラテジーでは、プローブは両方とも、標的よりも過剰に存在するはずである。したがって、可能な濃度範囲は、好ましくは、標的の濃度によりその下限が制限される。しかしながら、本明細書に記載のナノレポーター技術の有用な濃度範囲は、実用上、ハイブリダイゼーションを行うのに必要な時間量によりその下限が制限される。
好ましい実施形態では、検出のために標的(T)がレポータープローブ(R)およびゴーストプローブ(G)の両方にハイブリダイズしなければならない標的検出および定量アッセイが行われる(たとえば、結果的に(T)の存在下でのみ複合体を形成する(R)および(G)だけを含む複合体のアフィニティー選択および検出により)。この反応が不可逆であると仮定すると、起こる可能性のある素反応は4つである。
しかしながら、RTG(レポーター−標的−ゴーストプローブ複合体)の生成速度を定量的に計算するためには、4つの反応をすべて考慮に入れなければならない。系を記述する微分方程式は、以下のとおりである:
k2=6.55×105L/mol/s
k3=3.99×105L/mol/s
k4=1.91×105L/mol/s
これらの速度定数を用いて微分方程式の系を数値的に解くと(プローブが標的に対して少なくとも10倍過剰であると仮定する)、5pMレポーターおよび5pMゴーストプローブは、終夜反応(16〜18時間)で最終到達点の10%までハイブリダイゼーションを起こすであろうという予測結果が得られる。5pM未満の濃度では、完全にハイブリダイズされた分子の量は、おそらく実際上測定不可能であろう。したがって、好ましい実施形態では、ナノレポーター成分(ゴーストプローブおよび/またはレポータープローブ)の下限濃度は、5pMである。
理論によれば、プローブ濃度が増加するにつれて、ハイブリダイゼーション速度は際限がなく上昇し、プローブの溶解度だけが制約になると予測される。しかしながら、レポータープローブは、本発明に係るナノレポーターシステム中の標的特異的配列と比較して非常に大きい可能性がある。いかなる理論によっても拘束されるものではないが、レポータープローブへの結合により、標的特異的配列の速度論は、古典的溶液ハイブリダイゼーションの速度論とは異なったものになると本発明者らは考えている。レポータープローブは大きい高分子であるので、他のナノレポーターに接触したときに互いに長時間の相互作用(絡合い)をする可能性がある。低濃度では、2つのポリマーが絡み合った状態になる可能性は低いが、溶液中のポリマーの濃度および/またはサイズが増加するにつれて、この相互作用はより一般的に見受けられるようになる。非常に高い濃度の非常に長い分子という極端な場合、ポリマーは、溶液中で永久的網状構造またはゲルを形成する。溶液ハイブリダイゼーションが起こるようにするには、プローブ(たとえば、ナノレポータープローブ)/標的ペアは、互いに接触してハイブリダイゼーション核が生成されるまで溶液中を拡散しなければならない。古典的には、分子の並進拡散はハイブリダイゼーションの核生成よりも速いので、ハイブリダイゼーション反応は拡散律速ではない(すなわち、プローブおよび標的は、一緒に拡散して、核生成が行われる前に何回も相互作用する)。希薄溶液中では、その大きいサイズは、レポータープローブの並進拡散を遅くするであろうが、速度論には有意な影響を及ぼさない可能性がある。ある中間濃度では、レポータープローブは、溶液中の空間のほとんどすべてを占めて効果的に永久的絡合いゲルを生成し、もはや溶液中を拡散できない。しかしながら、ゴーストプローブおよび標的は、絡み合ったレポータープローブを通って依然として拡散しハイブリダイゼーションを起こしうるより小さい分子であると考えられる(おそらくより遅い速度であろうが)。同様に本発明者らの考えるところによれば、あるより高い濃度では、溶液中のレポータープローブは、反応が拡散律速になる点までゴーストプローブおよび標的の運動を妨害するであろう。この濃度(これは、定量的にはわかっておらず、レポータープローブ構造、ゴーストプローブ構造、および標的サイズに依存する)は、ナノレポーターシステムにおける有用な濃度範囲の上限であり、当業者であれば本明細書に記載の原理に基づいて経験的に決定可能である。
ハイブリダイゼーションの上限濃度はレポーター構造およびゴーストプローブ構造(それらには多くの可能な形態が存在する)の両方に依存するので、有用な濃度範囲の変化を予測する理論的枠組みは、本発明を実施するのに有用である。古典的理論によれば、ハイブリダイゼーションの速度論は、より小さいプローブのサイズにのみ依存すると予測される。したがって、理論的には、標的分子およびゴーストプローブの両方が有意により小さいかぎり、レポーターのサイズは、ハイブリダイゼーションの速度論に関与しないであろうと予測されよう。その場合、理論によれば、ハイブリダイゼーションの速度(一定の標的長さに対して)は、ハイブリダイゼーションの立体阻害に基づいて、1/L1/2〔ただし、Lはゴーストプローブの長さである〕に依存すると予測される。結果的に、ハイブリダイゼーションの速度は、ゴーストプローブが小さいほど速いであろう。ゴーストプローブの長さが増加するにつれて、ハイブリダイゼーションの速度は、1/L1/2に応じて減少するはずである。一定のゴーストプローブ長さを仮定すれば、ハイブリダイゼーション事象の測定可能な量を生じるレポーターの長さおよび濃度の範囲を規定することが可能である。レポーターサイズを規定した後、ゴーストプローブサイズの近似的範囲を決定することが可能である。これは反復プロセスであるが、本発明者らの論拠の基礎になる理論が、レポータープローブを利用しないシステムでのハイブリダイゼーションデータから導かれたものであることを考慮すれば、詳細な経験的ガイドラインを作成するためのデータを収集する良好な出発点を与えうる。
レポータープローブは、本質的には、自由溶液中のポリマーであり、ランダムコイルの挙動を示す。単一のレポーターにより占有される体積Vpは、自由連結鎖モデル(FJC、一本鎖DNAもしくはRNAのような可撓性ポリマー用)またはみみず鎖モデル(WLC、二本鎖DNAもしくはレポーターのような剛性ポリマー用)に基づく高分子物理学理論から計算可能である。いずれのモデルの場合にも、
ハイブリダイゼーション反応におけるレポーターの最大濃度がC*であると仮定すると、各レポーター(特定の標的に特異的)の濃度は、C*/Mに等しい。ただし、Mは、反応の多重度(同時に取り扱われる異なる標的の数)である。逆に、特定のレポーター構造体の可能な多重レベルは、プローブ濃度の下限(速度論に由来するCp、約10nM未満)および絡合いの閾値から次のように計算可能である。
利用可能なナノレポーターコードの数がレポータープローブのサイズに依存しない場合、ナノレポーターの多重化は、主に、レポータープローブのサイズおよび濃度(この濃度がゴーストプローブよりもかなり高いため)に依存する。ゴーストプローブはハイブリダイゼーション時に絡合いに対して有意な寄与を示さないので、本発明者らの考えるところによれば、ゴーストプローブの濃度は、レポータープローブの濃度よりもかなり増大させることが可能である。以下の表4中、最大全ゴーストプローブ濃度([G])は、すべてのレポーター濃度に対して1000nMに設定されている。ゴーストプローブおよびレポータープローブのこの濃度差は、調整可能なパラメーターである。予備試験では、7200bpレポーターと100bゴーストとを用いた多重ハイブリダイゼーション反応において、40pMの各レポータープローブおよび200pMの各ゴーストプローブは、終夜反応でほぼ完全なハイブリダイゼーションを生じることが示される。
以下の表4には、以上の理論により近似したときのさまざまな多重化におけるゴーストプローブおよびレポータープローブの最適の有用なサイズおよび濃度の範囲がまとめられている。本発明者らの考えるところによれば、約200塩基までのゴーストプローブは、ほとんどの用途に実用可能であろう。
この節では、デュアルナノレポーターの集合の実施形態について記述する。ここでは、一方のプローブは、ゴーストプローブであり、他方のプローブは、M13バックボーン上に集合された色RNAセグメントを含むレポータープローブである。ゴーストプローブは、ビオチン化F−フックに結合され、レポータープローブは、ビオチン化G−フックに結合される。標的分子の検出および定量のために、デュアルナノレポーターを生体分子サンプルにハイブリダイズさせる。以下の工程は、示された順序で行わなければならないわけではない。さらに、それぞれの特定の工程は、以下に示される以外の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態を示している。
一本鎖環状M13mp18 DNA(USB Corporation)をBam HI認識部位に相補的な5倍モル過剰のオリゴヌクレオチド(Bamカッターオリゴ)にアニールし、Bam HI制限酵素で切断して線状一本鎖DNAバックボーンを得る。続いて、Bamカッターオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド(抗Bamオリゴヌクレオチド)を50倍過剰で添加して遊離のBamカッターオリゴヌクレオチドを封鎖することにより、後続の工程時におけるM13の再環状化を防止する。
対象の標的核酸に相補的な配列(たとえば、30〜70ヌクレオチドの配列)と、M13スカフォールドへのライゲーションに使用される追加の9bpの配列と、を含むオリゴヌクレオチドを作製し、線状化M13スカフォールドの3’末端にライゲートする。
G−タグ(たとえば、G−フック5'-GGTCTGTGTGATGTT-3'の相補体4コピーと続いて9塩基のライゲーター配列とを含みかつG−フックに相補的な配列5'-AACATCACACAGACC AACATCACACAGACC AACATCACACAGACC AACATCACACAGACC AGCCCTTTG-3'を有するオリゴヌクレオチド)を線状化一本鎖M13バックボーンの5’末端に結合させ、(1)レポーターの精製ならびに続いてセグメントのライゲーションおよび/またはアニーリングと;(2)固体表面上で「伸長」させた後のレポーターの固定と;を可能にする。G−タグをBamHI部位で線状化された一本鎖M13の5’末端に結合させるためのライゲーターの配列は、5'-CTCTAGAGGATCCAAAGGGCT-3'でありうる。ライゲーション反応は、約80pmolのG−タグ/M13ライゲーション産物を生成するための以下のプロトコルに従って実施可能である:
材料:
[100μM] 抗G4タグオリゴ
[100μM] 抗G4タグライゲーターオリゴ
[80nM] 線状一本鎖M13
10×T4 DNAリガーゼ緩衝液(Fermentas)
T4 DNAリガーゼ(Fermentas)
20×SSC(Ambion)
DEPC H2O(Ambion)
方法:
1.G−タグとライゲーターとをあらかじめアニールする:
25μM 2:1 G/Glig 1×SSC中
20μl [100μM] G−タグライゲーター
40μl [100μM] G−タグ
4μl 20×SSC
16μl DEPC H2O
* MJサーモサイクラー上でアニールする
95℃、3分間;72℃、30秒間、−1℃/サイクル、×68サイクル;4℃に保持する
2.G−タグを線状M13にライゲートする:
64nM M13−G4 1×Lig緩衝液中
1000μl [80nM] 線状M13
80μl [25μM] 2:1 G/Glig 1×SSC中
124μl 10×T4 DNAリガーゼ緩衝液
40μl T4 DNAリガーゼ
* フォイルで覆われたアルミニウムヒートブロック中、37℃で2時間ライゲートし、次に、酵素を65℃で15分間不活性化させる。
M13スカフォールドに沿って10個の異なる領域を形成するために、10セットのオリゴヌクレオチドプライマーペアをデザインする。各ペアは、5’末端にT7 RNAポリメラーゼプロモーターを有する1つのプライマーを含有する。領域2〜7は、900塩基(約300nm)の長さになるようにデザインされる。なぜなら、これは、回折限界スポット(標準的光学素子で達成可能な最小スポット)の近似サイズであるからである。領域1および8は、長体および短体の両方を有し、長体は、全900塩基領域をカバーし、一方、短体は、標的特異的配列をライゲートできるように900塩基領域の一部だけをカバーする。したがって、標的特異的配列は、いずれかの末端に結合可能である。アンカーまたはタグの結合のために、末端を使用することも可能である。
以上に記載のPCR産物を二本鎖鋳型として用いて、Ambion製のin vitro転写キット(MessageAmp aRNAキット)により、後続の色素結合のためのRNAセグメントを作製する。転写時にアミノアリル修飾UTPヌクレオチドをRNAセグメント中に組み込む。Qiagen製のRNeasyキットを用いて、転写反応産物を精製する(鋳型を除去するためのDNAse Iによる処理を含む)。
1×SSPE緩衝液中70℃で、2:1のセグメント対M13スカフォールド比で、各位置に対するセグメントを2時間アニールする。標識化RNAセグメントを有する集合ナノレポーターを図3A〜3Bに示す。図3Aは、交互の「スポット」(1、3、5、および7)だけが標識されているナノレポーターを示し、図3Bは、すべてのスポットが標識されているナノレポーターを示している。
レポータープローブの標的特異的配列が相補的である領域とは異なる対象の標的核酸の領域に相補的な配列(たとえば、30〜70ヌクレオチドの配列)を含む1つ以上のオリゴヌクレオチドを作製する。場合により、F−フックの3’末端上の短い配列とゴーストプローブの5’末端上の短い配列とに相補的なライゲーターオリゴヌクレオチドを用いて、F−フック結合用のF−タグをゴーストプローブの5’末端にライゲートする。ライゲーターオリゴヌクレオチドに相補的な配列は、F−フック配列の一部でもなければプローブ配列の一部でもなく、ライゲーションを容易にするためにそれらオリゴに付加された追加のヌクレオチドである。
F−タグ(たとえば、F−フック5'-GCTGTGATGATAGAC-3'の相補体2コピーと続いて9塩基のライゲーター配列とを含みかつF−フックに相補的である配列5'-GATGGAGAC GTCTATCATCACAGC GTCTATCATCACAGC-ビオチン-3'を有するオリゴヌクレオチド)をゴーストプローブの3’末端に結合させ、(1)ゴーストプローブ−標的−レポーターハイブリダイゼーション複合体の精製と;(2)ビオチン部分を介するスライド上へのハイブリダイゼーション複合体の結合と;を可能にする。F−タグをゴーストプローブの3’末端に結合させるためのライゲーターの配列は、5'-GTCTCCATCTTCCGACAG-3'でありうる。
100μM F−ビオチンタグ
100μM Fゴーストプローブライゲーター
Fermentas 10×T4 DNAリガーゼ緩衝液
1μMゴーストプローブ
Fermentas T4 DNAリガーゼ
方法:
1.フックとライゲーターとをあらかじめアニールする:
5μM F−ビオチンタグ/ライゲーターミックス
5μl [100μM] F−ビオチンタグ
5μl [100μM] F−ゴーストプローブライゲーター
10μl 10×T4 DNAリガーゼ緩衝液
80μl DEPC H2O
MJサーモサイクラー上でアニールする(95℃、3分間;72℃、30秒間、−1℃/サイクル ×68サイクル;4℃に保持する)。
300nM 抗F2−ビオチン−GP
6.0μl [1μM] ゴーストプローブ
4.8μl [5μM] 抗F2−ビオチンタグ/ライゲーターミックス
1.52μl 10×T4 DNAリガーゼ緩衝液
3.68μl DEPC H2O
4.0μl T4 DNAリガーゼ
MJサーモサイクラー上でライゲートする(37℃、18時間;65℃、15分間;4℃に保持する)。
以下の充填溶液を調製する:
ライゲーション
3.33μl [300nM] ライゲーション
1.67μl DEPC H2O
5μl 2×充填緩衝液
陰性対照−ゴーストプローブ
1μl [1μM] ゴーストプローブ
0.33μl 10×T4 DNAリガーゼ緩衝液
3.67μl DEPC H2O
5μl 2×充填緩衝液
陰性対照−F−ビオチンタグ/ライゲーターミックス
2μl [0.5μM] F−ビオチンタグ/ライゲーターミックス
0.33μl 10×T4 DNAリガーゼ緩衝液
2.67μl DEPC H2O
5μl 2×充填緩衝液
50bpオリゴラダー
4μlラダー
6μl 2×充填緩衝液
180Vで15% Novex TBE−Ureaゲルにて50分間泳動させる。
ビオチンを一本鎖F−タグに共有結合させるのではなく、ゴーストプローブの共通部分に相補的な配列を有するビオチン化オリゴヌクレオチド(DNAまたはRNA)をアニールすることにより、ゴーストプローブのビオチン化を達成することも可能である。そのような配列は、F配列自体でありうるかまたはF配列に加えてゴーストプローブに付加される他の配列でありうる。そのような追加の配列を付加する場合、それは、10〜100塩基の長さの1〜10コピーでありうるが、好ましい構成は、50〜100塩基の長さの単一コピーである。
mRNAサンプルを直接標識するのに利用可能ないくつかの市販のキットが存在する。たとえば、Label IT(登録商標)μArrayTM Biotin Mirus #MIR 8010)およびBiotin−Chem−Link(Roche (1 812 149)が挙げられる。製造業者の手順に従って、ただし、次の変更を加えて、ビオチン標識化mRNAを第3d節に記載のハイブリダイゼーション反応系(以下参照)に追加する:ほとんどのプロトコルはポリA+mRNAの使用を推奨するので、RNAの使用量を典型的なハイブリダイゼーションでの全RNA100ngよりも少ない10ngまで、場合により1ngまで減少させることが可能である。この反応系にはゴーストプローブを添加してはならない。Fビーズポストハイブリダイゼーション精製は、もはや必要とされない。スライドへの結合に競合する可能性のあるハイブリダイズされていないビオチン化mRNAを除去するために、Gビーズポストハイブリダイゼーション精製を使用すべきである。RNAの使用量に依存して、これは必要なこともあれば必要でないこともある。他の選択肢として、ポリA+画分の精製を必要とすることなく、全RNAをビオチン化することが可能である。この場合、元の量の全RNAを使用すべきである(100ng)。全RNAを使用する際、標識化効率を増大させるために、製造業者のプロトコルに変更を加えることが必要になることもある。
多くのハイブリダイゼーション条件は、遺伝子発現データを得るのに十分である。妥当なハイブリダイゼーション効率を保持しながらハイブリダイゼーション時間を短くするために、いくつかのパラメーターに変更を加えた:i)ゴーストプローブおよびレポーターの濃度を増大させる、ii)全RNAを200〜500bpの平均サイズ範囲に断片化し、一方、ハイブリダイゼーションのpHを6.5に低下させる、iii)同一のハイブリダイゼーション体積でより多くの全RNAを使用する、iv)ハイブリダイゼーション体積を約10μlまで減少させる。さまざまな種に由来するmRNAへのハイブリダイゼーション効率やクロスハイブリダイゼーションに有害作用を及ぼすことなく、Denhardt試薬やssDNAのようなブロッキング試薬を省略することが可能である。
1〜500種のナノレポーターおよびゴーストプローブの多重化を用いてこのプロトコルを実施し、好結果を得た。ヒト試薬(ナノレポーターおよびゴーストプローブ)を用いて行われるハイブリダイゼーションからssDNAおよびDenhardt試薬を省略しても、ssDNAおよびDenhardtを含むハイブリダイゼーションと比較した場合、マウス全RNAとのクロスハイブリダイゼーションにまったく影響を及ぼさなかった。そのほか、ssDNAおよびDenhardt試薬を省略しても、バックグラウンドシグナルの増大を生じない(陰性ハイブリダイゼーション対照を基準にして)。最後に、ssDNAおよびDenhardt試薬の存在下または不在下でハイブリダイズされた内在性遺伝子のシグナルの有意な損失(または増大)は存在しない(509種の遺伝子、R2値=0.998)。
熱的プロトコルおよびカチオン触媒プロトコルの両方を用いて細胞RNAの断片化を達成した。100〜700bp(平均で)の断片長さが得られるようにこれらのプロトコルをデザインした。熱的断片化:RNAseを含まない水中に全RNAサンプルを200ng/μlになるように希釈する。加熱蓋を備えた温度ブロック中でサンプルを95℃に加熱する。サンプルを氷上に配置することにより断片化を停止する。ただちに使用するかまたは使用時まで−80℃で貯蔵する。製造業者のプロトコル(Ambion)に変更を加えたカチオン触媒反応による断片化。RNAseを含まない水を用いてRNAサンプルの体積を9μlにする。全RNAの最終濃度は、0.2〜2μg/mlでなければならない。1μlの10×断片化緩衝液(Ambion 10×断片化緩衝液)を添加する。温度ブロック中70℃で5分間インキュベートする。時間をより長くすれば、平均の断片サイズは小さくなるであろう。1μl 200mM EDTAを添加することにより反応を停止させる。ただちに使用するかまたは使用時まで−80℃で貯蔵する。
全レポータープローブ濃度が1nM超である場合、ポストハイブリダイゼーション精製が好ましい。精製は、非特異的結合を有意に減少させ、より高いレポーター濃度およびゴーストプローブ濃度でスライドへの特異的結合効率を増大させる。以上に提供される実施例では、単一のF−ビーズ精製が記載されている(ハイブリダイズされた複合体をゴーストプローブ末端から精製する)。以下の実施例9に記載されるように、ハイブリダイゼーション複合体をレポーターの5’末端から精製して過剰のハイブリダイズされていないゴーストプローブを効果的に除去する後続のGビーズ精製を介して、高いゴーストプローブ濃度(>5nMの全量)で最適結果が得られる。精製の好ましい順序は、F−ビーズ、次にGビーズであるが、順序を逆にすることが可能であり、それに従ってプロトコルを最適化することが可能である。これらのアフィニティー精製に使用される正確な配列は、おそらく、変更可能であり、技術の他の選択肢の実施形態で最適化可能である。これらのアフィニティー精製工程および試薬は、一般的には、核酸に基づくものであるが、理論上は、互いに特異的結合を呈し、かつ相互作用が破壊されて開放されるように化学的処理または結合条件の変更を行うことにより放出されうる任意の結合ペアでありうる。たとえば、抗体/抗原ペア、タンパク質/金属相互作用、またはリガンド/レセプター相互作用など。
伸長された複合体のスライドへの結合および固定は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を利用して達成可能である。他の選択肢の実施形態では、固定および伸長は、他の相互作用ペアを用いて達成される。ただし、2つのうちの一方は、スライド上に固定され、他方は、ゴーストプローブまたはレポーターのいずれかに結合される。電気泳動を利用して伸長を達成する必要はなく、機械的に実施可能である。結合前、サンプルへのビス−トリスプロパンの添加は必要でない。技術は、異なる標識モノマーを画像処理により分離しうるかぎり、本明細書中に例示された特定の標識モノマーの使用に限定されるものではない。
14.1 ハイブリダイゼーション反応
509種の内在性細胞遺伝子の検出を単一の多重化ハイブリダイゼーション反応で行った。細胞1個あたり約0.1、0.5、1、5、10、50、および100コピーに対応する8種の非ヒト対照配列を各反応系にスパイクした。同様に、標的を用いずに2種のレポーターをスパイクした(陰性対照)。また、ポストハイブリダイゼーション精製プロセスに対する陽性(3)および陰性(1)の対照として機能する4種のレポーターを添加した。また、全ナノ鎖レポーターライブラリーを含有するが細胞RNAが欠如した一連の陰性対照ハイブリダイゼーションを行った。
磁気ビーズ(F−ビーズ)に結合されたゴーストプローブに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーション反応系を精製し、ハイブリダイズされていないレポーターを除去した。ハイブリダイゼーション反応系を0.1%Tween−20/TE中に5倍希釈して最終塩濃度を1×SSPEにした。次に、希釈されたハイブリダイゼーション溶液を100μlのF−ビーズ(0.1%Tween−20中)に添加し、連続回転させながら室温でビーズに30分間結合させた。次に、150μlの0.1×SSPE/0.1%Tween−20中でビーズを3回洗浄し、100μlの0.1×SSPE/0.1%Tween−20中45℃で15分間溶出させた。
0.1μM TetraspecTM蛍光マイクロスフェア(製品番号T7279、Molecular Probes)の1/5000希釈液1μlを添加することにより、結合用としてサンプルを調製した。サンプルをナノ鎖流体デバイスに充填し、15分間にわたりデバイスを45°傾斜させることにより、ストレプトアビジンで被覆されたAccelr8 Optichem(登録商標)スライド(製品番号TB0200)に結合させ、合計4回反復した。充填後、90μlの1×TAEでスライド表面を1回洗浄した。洗浄緩衝液を除去した後、40μlのTAEを各ウェルに添加することにより、電気伸長用としてサンプルを調製する。流体チャネルを横切って200Vを印加することにより、結合された複合体を伸長させた。1分後、電圧の印加を5分間継続しながら、負荷電電極の入ったウェルに60μlの500nMのG−フックオリゴ溶液を添加することにより、サンプルを伸長位置で固定した。固定後、TAE溶液を除去し、画像化のために光漂白防止試薬で置き換えた。
メタルハライド光源(X−cite 120、Exfo Corporation)と倍率60倍の油浸レンズ(1.4 NA Plan Apo VC、Nikon)とを備えたNikon Eclipse TE2000Eを用いて、スライドを画像化した。Metamorphソフトウェア(Universal Imaging Corporation)または特注品のソフトウェアのいずれかの制御下でOrca Ag CCDカメラ(Hamamatsu)を用いて、各視野ごとに異なる励起波長(480、545、580、および622)で4つの画像を取得した。特注品の画像処理ソフトウェアを用いて画像を処理した。
特注品のソフトウェアを用いて処理画像から生データを抽出した。各サンプル中の対照スパイクの平均カウント数を基準にしてデータを規格化した。システムにより遺伝子が「検出」されたかを判定するために、スチューデントのt検定を用いて、各遺伝子ごとにRNAを含有するハイブリダイゼーションから得られたカウント数を2つの陰性対照の平均カウント数と比較した。検出された遺伝子の数は、サンプル#1および#2で、それぞれ、441種(87%)および445種(88%)であった。
以上に述べたように、ナノレポータースカフォールド領域の標識結合領域は、10nm〜10,000nmの間の任意の長さを有するが、好ましくは、標準的光学素子で検出可能な最小スポット(約300nmである)にほとんど一致する。異なる色(分光的に識別可能)のスポットは、同一の色のスポットよりも狭い間隔で空間的に解像可能である。同一の色の2つのスポット間に異なる色の1、2、3、もしくは4つのスポットを割り込ませて、しかもすべてのスポットをスペクトル的におよび空間的に解像することが可能である。同一の色の2つのスポット間の距離を有意に減少させることも可能である。
本明細書に引用されている参考文献はすべて、あたかも個々の刊行物または特許または特許出願が具体的かつ個別的に明示されて参照によりその全体があらゆる目的で組み入れられたのと同一程度まで、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (47)
- 第1のプローブおよび第2のプローブを含むプローブペアであって、該第1のプローブが、
(a)(i)第1のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが結合される第1の標識結合領域;(ii)第2のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが結合される第2の標識結合領域(該第1の標識結合領域とオーバーラップしない);を含む第1の分子と、
(b)該第1の分子に結合された第1の標的特異的配列と、
を含む複合体であり、
該第2のプローブが、(i)第2の標的特異的配列;(ii)場合により、第3のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが結合される第3の標識結合領域;および(iii)場合により、第2の分子に結合されたアフィニティータグ;を含む第2の分子であり、
該第1の標的特異的配列および該第2の標的特異的配列が、同一の標的分子の異なる領域に結合し、
該標的分子が、天然に存在する分子または天然に存在する分子のcDNAまたは該cDNAの相補体であり、
該プローブペアがその標的分子に結合された時、該第1および該第2のシグナルの同一性ならびにそれらの互いの相対位置が、該標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する、上記プローブペア。 - 第1のプローブおよび第2のプローブを含むプローブペアであって、該第1のプローブが、
(a)(i)第1のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが結合される第1の標識結合領域;(ii)第2のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが結合される第2の標識結合領域;を含む第1の分子と、
(b)該第1の分子に結合された第1の標的特異的配列と、
を含む複合体であり、
該第2のプローブが、(i)第2の標的特異的配列;(ii)場合により、第3のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが結合される第3の標識結合領域;および(iii)場合により、第2の分子に結合されたアフィニティータグ;を含む第2の分子であり、
該第1の標的特異的配列および該第2の標的特異的配列が、同一の標的分子の異なる領域に結合し、
該第1のシグナルおよび該第2のシグナルが、空間的もしくは分光的に識別可能であり、
該標的分子が、天然に存在する分子または天然に存在する分子のcDNAまたは該cDNAの相補体であり、
該プローブペアがその標的分子に結合された時、該第1および該第2のシグナルの同一性ならびにそれらの互いの相対位置が、該標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する、上記プローブペア。 - 前記第1および前記第2の標識結合領域が所定のヌクレオチド配列である、請求項1または2に記載のプローブペア。
- 第1のDNA分子が前記第1の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第1のDNA分子に、前記第1のシグナルを構成する光を放出する前記1つ以上の標識モノマーが結合され;かつ第2のDNA分子が前記第2の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第2のDNA分子に、前記第2のシグナルを構成する光を放出する前記1つ以上の標識モノマーが結合される、請求項3に記載のプローブペア。
- 第1のRNA分子が前記第1の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第1のRNA分子に、前記第1のシグナルを構成する光を放出する前記1つ以上の標識モノマーが結合され;かつ第2のRNA分子が前記第2の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第2のRNA分子に、前記第2のシグナルを構成する光を放出する前記1つ以上の標識モノマーが結合される、請求項3に記載のプローブペア。
- 複数の第1のDNA分子が前記第1の標識結合領域にハイブリダイズされ、これらのDNA分子に、前記第1のシグナルを構成する光を放出する前記1つ以上の標識モノマーが結合され;かつ複数の第2のDNA分子が前記第2の標識結合領域にハイブリダイズされ、これらの第2のDNA分子に、前記第2のシグナルを構成する光を放出する前記1つ以上の標識モノマーが結合される、請求項3に記載のプローブペア。
- 複数の第1のRNA分子が前記第1の標識結合領域にハイブリダイズされ、これらのRNA分子に、前記第1のシグナルを構成する光を放出する前記1つ以上の標識モノマーが結合され;かつ複数の第2のRNA分子が前記第2の標識結合領域にハイブリダイズされ、これらの第2のRNA分子に、前記第2のシグナルを構成する光を放出する前記1つ以上の標識モノマーが結合される、請求項3に記載のプローブペア。
- 前記第1のプローブがアフィニティータグをさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のプローブペア。
- 前記第2のプローブがアフィニティータグを含む、請求項1〜7に記載のプローブペア。
- 前記第2のプローブが、第3のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが結合される第3の標識結合領域を含む、請求項1〜7に記載のプローブペア。
- 前記第3の標識結合領域が所定のヌクレオチド配列であり、かつ第3のRNA分子が前記第3の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第3のRNA分子に、前記第3のシグナルを構成する光を放出する前記1つ以上の標識モノマーが結合される、請求項10に記載のプローブペア。
- 前記プローブペアがその標的分子に結合された時、前記コードが、前記第1のシグナル、前記第2のシグナル、および前記第3のシグナルの同一性とそれらの互いの相対位置とを含む、請求項11に記載のプローブペア。
- 前記コードが、前記第1および前記第2のシグナルの同一性と、それらの互いの相対位置と、前記シグナルの少なくとも1つから生じるスポットのサイズと、を含む、請求項1または2に記載のプローブペア。
- 前記第1および前記第2の分子が核酸分子である、請求項9に記載のプローブペア。
- 前記標識結合領域および前記標的特異的配列が所定のヌクレオチド配列である、請求項14に記載のプローブペア。
- 前記1つ以上の標識モノマーが、それらのそれぞれの結合領域にハイブリダイズされた核酸に共有結合される、請求項15に記載のプローブペア。
- 前記核酸が、1つ以上の非共有結合架橋核酸を介してそれぞれの結合領域にハイブリダイズされる、請求項16に記載のプローブペア。
- 前記第1および前記第2の標的特異的配列が、1つ以上の前記標識モノマーのいずれによっても標識されない、請求項1または2に記載のプローブペア。
- 前記第2の分子が、第4のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが結合される第4の標識結合領域(前記第3の標識結合領域とオーバーラップしない)をさらに含む、請求項9に記載のプローブペア。
- 前記プローブペアがその標的分子に結合された時、前記コードが、前記第1のシグナル、前記第2のシグナル、前記第3のシグナル、および前記第4のシグナルの同一性とそれらの互いの相対位置とを含む、請求項19に記載のプローブペア。
- 前記第2のプローブがアフィニティータグをさらに含む、請求項8に記載のプローブペア。
- 第1のRNA分子が前記第1の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第1のRNA分子に、前記第1のシグナルを構成する光を放出する前記1つ以上の標識モノマーが結合され;かつ第2のRNA分子が前記第2の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第2のRNA分子に、前記第2のシグナルを構成する光を放出する前記1つ以上の標識モノマーが結合され;かつ前記第1のプローブおよび/または前記第2のプローブがアフィニティータグをさらに含む、請求項8に記載のプローブペア。
- 前記アフィニティータグが前記第1の分子または前記第2の分子に共有結合される、請求項8に記載のプローブペア。
- 前記第1の標識結合領域に結合された標識モノマーが同一の波長の光を放出し、この光が前記第1のシグナルを構成し、かつ前記第2の標識結合領域に結合された標識モノマーが同一の波長の光を放出し、この光が前記第2のシグナルを構成する、請求項1に記載のプローブペア。
- 前記第1のシグナルおよび前記第2のシグナルの少なくとも一方が、複数の異なる波長の光を含む、請求項1に記載のプローブペア。
- 前記第1および前記第2のシグナルが分光的に識別可能である、請求項1に記載のプローブペア。
- 前記第1および前記第2のRNA分子が、それぞれ、100〜3,000ヌクレオチドの長さである、請求項5に記載のプローブペア。
- 前記第1および前記第2のRNA分子が、それぞれ、500〜1,500ヌクレオチドの長さである、請求項5に記載のプローブペア。
- 前記第2のプローブが、
(a)前記第2の分子と、ただし、この第2の分子は、第3のRNA分子がハイブリダイズされる第3の標識結合領域を含み、この第3のRNA分子に、第3のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが結合される;
(b)前記第2の分子に結合された前記第2の標的特異的配列と;
を含む核酸複合体であり、
前記コードが、前記第1、前記第2、および該第3のシグナルの同一性とそれらの互いの相対位置とを含む、請求項5に記載のプローブペア。 - 前記第1の標識結合領域に結合された標識モノマーが同一の波長の光を放出し、この光が前記第1のシグナルを構成し;前記第2の標識結合領域に結合された標識モノマーが同一の波長の光を放出し、この光が前記第2のシグナルを構成し;かつ前記第3の標識結合領域に結合された標識モノマーが同一の波長の光を放出し、この光が前記第3のシグナルを構成する、請求項29に記載のプローブペア。
- 前記第1のシグナル、前記第2のシグナル、および前記第3のシグナルの少なくとも1つが、複数の異なる波長の光を含む、請求項29に記載のプローブペア。
- 前記第1の標的特異的配列および前記第2の標的特異的配列が、1つ以上の前記標識モノマーのいずれによっても標識されない、請求項29に記載のプローブペア。
- 第1、第2、および第3のシグナルが分光的に識別可能である、請求項29に記載のプローブペア。
- 第1および第3のシグナルが、同一の1つもしくは複数の波長で発光する、請求項29に記載のプローブペア。
- 前記第1のプローブがアフィニティータグをさらに含む、請求項29に記載のプローブペア。
- 前記第2のプローブがアフィニティータグをさらに含む、請求項29に記載のプローブペア。
- 前記第2のプローブがアフィニティータグをさらに含む、請求項35に記載のプローブペア。
- 前記アフィニティータグが前記第1の分子に共有結合される、請求項35に記載のプローブペア。
- 前記アフィニティータグが前記第2の分子に共有結合される、請求項36に記載のプローブペア。
- 前記第1、前記第2、および前記第3のRNA分子が、それぞれ、100〜3,000ヌクレオチドである、請求項29に記載のプローブペア。
- 前記第1、前記第2、および前記第3のRNA分子が、それぞれ、500〜1,500ヌクレオチドである、請求項29に記載のプローブペア。
- 生体分子サンプル中の標的分子を検出する方法であって、(i)該サンプルを、該標的分子への前記第1の標的特異的配列および前記第2の標的特異的配列の結合を可能にする条件下で請求項1〜41のいずれか1項に記載のプローブペアに、接触させることと、(ii)該標的分子を同定するコードを検出することと、を含む、上記方法。
- 前記生体分子サンプル中の前記標的分子の量を定量することをさらに含む、請求項42に記載の方法。
- 前記第1および前記第2の標的特異的配列のそれぞれの濃度が、前記標的分子の濃度を超える、請求項42または43に記載の方法。
- 生体分子サンプル中の複数の標的分子を検出する方法であって、(i)該サンプルを、請求項1〜41のいずれか1項に記載のプローブペアの集団に、それらの標的分子のそれぞれへの各プローブペアの第1の標的特異的配列および第2の標的特異的配列の結合を可能にする条件下で接触させることと、ただし、該集団中の各プローブペアは、その標的分子のそれぞれに結合された時、識別可能なコードに関連付けられる、(ii)該複数の標的分子を同定するコードを検出することと、を含む、上記方法。
- 前記生体分子サンプル中の前記複数の標的分子のそれぞれの量を定量することをさらに含む、請求項45に記載の方法。
- 前記集団の各プローブペアの第1および第2の標的特異的配列のそれぞれの濃度が、その標的分子のそれぞれの濃度を超える、請求項45または46に記載の方法。
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