JP2021093991A - プローブ、プローブセット、および溶液中の任意のｄｎａ配列を同定する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ナノポアを用いた特定DNA配列の同定や計数や存在有無の検証において、検出対象となる特定DNA配列の種類が多くなったときにも、それら特定DNA配列の同定や計数の精度、またその存在の有無の検証の精度を良好に保つことを可能にする技術を提供する。【解決手段】本開示は、任意のDNA配列に特異的に結合できる配列認識部分と、配列認識部分の末端以降に複数の３次元構造体が配列しているプローブ部と、を含み、複数の３次元構造体の配列の順番は、DNA配列と一対一に対応している、プローブについて提案する。【選択図】図４
Description
本開示は、プローブ、プローブセット、および溶液中の任意のDNA配列を同定する方法に関する。
水溶液中に存在する分子や粒子の検出の手段として、ナノポアを用いた技術が検討されている。すなわち、メンブレンに、検出対象となる分子や粒子と同程度の大きさの孔（ナノポア）を設け、メンブレンの上下チャンバは水溶液で満たし、両チャンバに水溶液に接触するよう電極を設け、チャンバの片側には測定対象となる検出対象物を入れて、両チャンバに設けた電極間に電位差を持たせて検出対象物を電気泳動させてナノポアに通過させた際に、両電極間に流れるイオン電流の時間変化を計測することで、検出対象物の通過の検出や、その構造的な特徴を把握しようとするものである。なお一般的に、検出対象物がナノポアを通過する際、検出対象物がナノポアの一部を封鎖することによって電気抵抗が増大するので、イオン電流値は減少する。また検出対象物は大きければ大きいほど電気抵抗は増大し、その結果イオン電流の減少量も増大する。
ナノポアデバイスの製造は、機械的強度が高いこと等から、半導体基板、半導体材料および半導体プロセスを用いる方法が注目を集めている。例えばメンブレンはシリコン窒化膜(SiNx膜)を用いて形成でき、ナノポアの形成には例えばＴＥＭ（transmission electron microscope）装置をもちいて、電子ビームの照射面積をメンブレン上に小さく絞り、エネルギー、電流をコントロールすることで、ナノポアの直径が１０ｎｍ以下のポアを形成することが出来る（非特許文献１）。また最近では、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４にあるような、メンブレンの絶縁破壊現象を利用した新たなナノポアの形成方法も報告されている。
ナノポアを用いた測定の用途のひとつとして、水溶液中の特定対象物の検出および計数がある。例えば水溶液中に特定対象物が存在する場合、特定対象物にのみ吸着する大きな分子を特定対象物に結合させることで、特定対象物がナノポアを通過する際のイオン電流減少量が大きくなり、非特定対象物が通過したときのイオン電流減少量と見分けがつくようになる。こうすることで、ナノポア計測による水溶液中の特定対象物の同定やその計数が可能となる。なお水溶液中に特定対象物が存在しない場合は、非特定対象物がナノポアを通過する際の小さなイオン電流減少しか観測されず、その情報をもって水溶液中に特定対象物はいないと判断できる。なお特定対象物とは、例えば特定の配列を有するDNAである。
１つの例として非特許文献５の例を以下に説明する。この例では、PNAにPEGが結合した構造(以下、PNA-PEGプローブと称する)を用いており、そのPNA-PEGプローブのPNA部分は、特定配列を有したDNAの特定配列部分にのみ特異的に結合するよう設計してある。またPEGの大きさは大きく、PNA-PEGプローブが結合した特定配列を有するDNAがナノポアを通過したときのイオン電流減少量と、PNA-PEGプローブが結合していないDNA(特定配列を有さないDNA)がナノポアを通過したときのイオン電流減少量に差があるようになっている。このようにして、水溶液中に存在する特定配列を含むDNAの同定や計数、またその存在の有無の検証が可能となる。
また、検出対象の特定DNA配列が２種類以上、例えばｎ種類（ｎは２以上の整数)存在する時には、まず各特定のDNA配列に特異的に結合できる、大きさの異なるｎ個のプローブを用意して、それらを各特定DNA配列に結合させる。そしてそれらプローブと結合した各特定DNA配列がナノポアを通過する際の各イオン電流減少量は、各プローブの大きさによってそれぞれ異なるので、各特定DNA配列の同定や計数、またその存在の有無の検証がナノポア計測によって可能となる。
実際、特許文献１のFIG.4Aから4Cには、大きさの異なるプローブをDNAに結合させて、それら結合体がナノポアを通過する際のイオン電流減少量の違いから、どの大きさのプローブがついたDNAがナノポアを通過したかを判別する方法が記載されている。
Jacob K Rosenstein, et al., Nature Methods, Vol.9, No.5, 487-492 (2012)
Harold Kwok, et al., PloS ONE, Vol.9, No.3, e92880. (2013)
Kyle Briggs, et al., Nanotechnology, Vol.26, 084004 (2015)
Kyle Briggs, et al., Small, 10(10):2077-86 (2014)
Trevor J. Morin, et al., PLoS ONE 11(5):e0154426. doi:10.1371/journal.pone.0154426
Itaru Yanagi, et al., Scientific Report, 8, 10129 (2018).
検出対象の特定DNA配列が２種類以上、例えばｎ種類（ｎは２以上の整数）存在する時には、各特定のDNA配列に特異的に結合できる、大きさの異なるn個のプローブを用意して、それらを各特定DNA配列に結合させた後、各プローブが付いた各特定DNA配列がナノポアを通過する際のイオン電流減少量を計測することで、各特定DNA配列の同定や計数、またその存在の有無の検証が、原理的には可能である。
しかしながら、ｎ（特定DNA配列の種類）はいくらでも大きく（種類を多く）出来るわけではない。非特許文献１から６やその他多数の文献でも報告されている通り、ある一つの分子（１種類の分子）が複数回ナノポアを通過した際の、各回のイオン電流減少量（ΔI）は、毎回同じにはならずバラつくことが知られている。このバラつきは、分子がナノポアを通過する際、ナノポアの真ん中付近を通過するのか端付近を通過するのかの違いや、ナノポアへ分子が入るときの入射角度の違いや、ナノポア中での分子の向きの違いを反映したものである。従って、ある分子が通過した際のイオン電流の減少量ΔIは、ΔI = ΔIave.±ΔIdev.(ΔIave.は複数回測定したイオン電流減少量の平均値、ΔIdev.は複数回測定したイオン電流減少量のバラつきの値)と、ばらつきを含めた表現をすることができる。
そして、検出対象となる各々の異なる特定DNA配列に結合する各々のプローブの大きさの差が小さい場合、各々のプローブと結合した各々の異なる特定DNA配列がナノポアを通過する際の、それぞれのΔIave.の値の差が小さくなる。その場合、先に述べたとおり、ΔIはバラつきΔIdev.があるので、別種類（別サイズ）のプローブがついた異なる特定DNA配列がナノポアを通過したときにも、ほぼ同じΔIが観測されることが多くなる。その結果、特定DNA配列の同定に誤りが生じやすくなり、特定DNA配列の同定や計数の精度、またその存在の有無の検証の精度が下がることになる。
従って、特定DNA配列の同定精度や検出精度を高めるためには、各々のプローブの大きさの差は出来るだけ大きくした方がよい。一方で、当然ながらナノポアのサイズよりも大きな構造体は入れないため、ナノポアのサイズよりも小さい範囲内で、複数のサイズのプローブを用意する必要がある。なので、特定DNA配列の同定や計数の精度を良好に保ったまま検出できる特定DNA配列の種類の数は、自ずと限られてくる。
例えば、特定DNA配列a,b,c,dを検出しようとして、サイズの異なるプローブを４種類用意し、これらプローブと特定DNA配列a,b,c,dが結合したものがナノポアを通過した際のΔIが、ばらつきも含めそれぞれΔIa = 1.5x±x、ΔIb = 4x±x、ΔIc = 7x±x、ΔId = 10x±xであった場合、ばらつきを含めても各ΔIの値は分離しているので、ΔIの値からナノポアを通過した特定DNA配列a,b,c,dの同定は正確に行うことができる。
ここでさらに、ナノポア中に何もイオン電流を阻害するものが入っていない場合に、ナノポアを流れるイオン電流値（以下、ベースライン電流値と称する）は、約11x程度であり、特定DNA配列dに結合したプローブの大きさがほぼナノポアの大きさに近しい場合を想定する。その上で、検出対象のDNA配列を１つ追加し、特定DNA配列a,b,c,d,eを検出することを考える。このときにサイズの異なるプローブを５種類用意する。そして、それらのプローブと特定DNA配列a,b,c,d,eが結合したものがナノポアを通過する。その結合したものがナノポアを通過した際のΔIがばらつきも含めそれぞれΔIa = 1.5x±x、ΔIb = 4x±x、ΔIc = 7x±x、ΔId = 10x±x、ΔIe = 8.5x±xであった場合、ΔIcとΔIdとΔIeの値は、バラつきを考慮すると一部オーバーラップする。この場合、特定DNA配列c,d,eの同定精度は減少する。つまり、検出対象の特定DNA配列の種類が多くなるにつれ、それぞれのDNA配列の同定精度は減少する。
また、非特許文献２は、水溶液中の複数の特定DNA配列をナノポアで同定する別の方法について開示する。非特許文献２では、NANPと呼ばれるプローブが用いられている。これは、大きな構造体と、その構造体に連結された複数の配列認識部位からなる分子であり、その配列認識部位は特定DNA配列を認識して結合できるようになっている。また、非特許文献２では、検出対象の特定DNA配列をバイオマーカーと称している。どのように複数のバイオマーカーをナノポアで同定するかというと、非特許文献２のFIG.10にあるように、NANPの設計を工夫し、まず検出すべきバイオマーカー（FIG.10では４種類）と、大きさの異なるNANP（FIG.10では５種類）が交互に連結した構造体を形成させる。その後、形成された構造体をナノポアに通過させ、その際に、各NANPの大きさの違いによって生じるイオン電流値の変化の様子（FIG.10にはそのイメージ図が記載されている）から、形成された構造体中にあるバイオマーカーの種類を同定することができる。本方式でも抱えている課題は同じである。つまり、NANPの数が多くなればなるほど、各NANP由来のΔIの差が小さくなっていき、その結果、各バイオマーカーの同定精度が減少する。むしろ当該方式ではn種類の異なるバイオマーカー（DNA配列）を検出するのにn+1種類の大きさの異なるNANP（プローブ）が必要であり、先に述べた例（n種類のDNA配列を同定するのにn種類のプローブを用いる例）よりも必要となる大きさの異なるプローブの数が増えてしまっている分、特定DNA配列の同定精度は先の例よりも減少すると考えられる。
本開示は、このような状況に鑑み、ナノポアを用いた特定DNA配列の同定や計数や存在有無の検証において、検出対象となる特定DNA配列の種類が多くなったときにも、それら特定DNA配列の同定や計数の精度、またその存在の有無の検証の精度を良好に保つことを可能にする技術を提供する。
上記課題を解決するために、本開示は、任意のDNA配列に特異的に結合できる配列認識部分と、配列認識部分の末端以降に複数の３次元構造体が配列しているプローブ部と、を含み、複数の３次元構造体の配列の順番は、DNA配列と一対一に対応している、プローブについて提案する。
また、本開示は、溶液中の任意のDNA配列を同定する方法であって、上記プローブを、DNA配列と当該プローブの配列認識部分において結合させることと、プローブとDNA配列が結合した構造体がナノポアを通過する際の電流値を計測することと、電流値の波形から、複数の３次元構造体の配列の順番を特定することで、DNAの配列の存在を同定することと、を含み、電流値の波形は、複数の構造体の通過を反映した信号となっている、方法について提案する。
本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。
本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味においても限定するものではないことを理解する必要がある。
本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味においても限定するものではないことを理解する必要がある。
本開示によれば、ナノポアを用いた測定によって、検出対象の特定DNA配列を高精度に同定、計数することが出来る。
本実施形態を説明するための全図において同一機能を有するものは同一の符号を付すようにし、その繰り返しの説明は可能な限り省略するようにしている。以下、本実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。実施例に記載するデバイス構造および材料は、本発明の思想を具現化するための一例であり、材料および寸法などを厳密に特定するものではない。また実施例に記載する具体的な電圧値や電流値、電圧印加時間、本発明の思想を具現化するための一例であり、それらを厳密に特定するものではない。
なお、本実施形態において対象としているのは、一例として、検出すべき複数の特定DNA配列が、それぞれ別々のDNA断片に１つずつふくまれて存在しているという状況である。つまり、１本のDNA断片に複数の特定DNA配列が含まれていて、それら１本のDNA断片中の複数の特定DNA配列をナノポア計測によって同定するという状況については触れていない。また、事前のDNAサンプル前処理工程において、検出すべき複数の特定DNA配列が、それぞれ別々のDNA断片に１つずつ含まれるよう調整することは、公知の技術を用いて可能である。
（１）第１の実施形態
＜生体分析装置の構成例＞
図１は、ナノポアを通過するイオン電流計測を行うセットアップ（生体分析装置の構成例）を示す模式図である。１００はナノポア、１０１および１０２は溶液である。ナノポア１００を通過する対象物を計測する際は、溶液１０１および１０２のいずれか一方もしくは両方に、測定対象物が含まれている。溶液１０１および１０２の種類としては、例えば、ＫＣｌが溶解した水溶液を用いることができる。１０３はナノポア１００を有しているメンブレンであり、その材料としては、例えばＳｉＮを用いることが可能である。１０４は溶液を入れるチャンバである。チャンバ１０４は、膜（メンブレン）１０３の上下に配置されている。チャンバ１０４と膜（メンブレン）１０３は、例えば、ｏ−ｒｉｎｇ１０８を介して接続されている。１０５は、チャンバに溶液を導入する際の溶液導入口ならびに溶液出口である。１０６と１０７は、溶液に接続している電極であり、例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いることができる。電極１０６と１０７間に電位差を設けると、溶液中のイオンがナノポア１００を通過し、イオン電流が流れる。この電流は、電極１０６と１０７間に接続された電流計で計測される。そしてその電流値は、測定対象物がナノポアを通過する際に変化する。一般的には、測定対象物がナノポアを通過する際、測定対象物は、電気的にナノポアの一部をふさぐ抵抗体となるので、電流は減少する。なお本明細書で対象とする主な測定対象物は、DNAや、プローブが結合したDNAである。
＜生体分析装置の構成例＞
図１は、ナノポアを通過するイオン電流計測を行うセットアップ（生体分析装置の構成例）を示す模式図である。１００はナノポア、１０１および１０２は溶液である。ナノポア１００を通過する対象物を計測する際は、溶液１０１および１０２のいずれか一方もしくは両方に、測定対象物が含まれている。溶液１０１および１０２の種類としては、例えば、ＫＣｌが溶解した水溶液を用いることができる。１０３はナノポア１００を有しているメンブレンであり、その材料としては、例えばＳｉＮを用いることが可能である。１０４は溶液を入れるチャンバである。チャンバ１０４は、膜（メンブレン）１０３の上下に配置されている。チャンバ１０４と膜（メンブレン）１０３は、例えば、ｏ−ｒｉｎｇ１０８を介して接続されている。１０５は、チャンバに溶液を導入する際の溶液導入口ならびに溶液出口である。１０６と１０７は、溶液に接続している電極であり、例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いることができる。電極１０６と１０７間に電位差を設けると、溶液中のイオンがナノポア１００を通過し、イオン電流が流れる。この電流は、電極１０６と１０７間に接続された電流計で計測される。そしてその電流値は、測定対象物がナノポアを通過する際に変化する。一般的には、測定対象物がナノポアを通過する際、測定対象物は、電気的にナノポアの一部をふさぐ抵抗体となるので、電流は減少する。なお本明細書で対象とする主な測定対象物は、DNAや、プローブが結合したDNAである。
＜特定DNA配列と配列認識部分を有するプローブ（結合前）の例＞
図２は、様々な検出すべき特定DNA配列を有するDNA断片(図中の左側に図示された６種類のDNA断片、代表して１１４と称する)と、それら特定DNA配列部分を特異的に認識して結合できる配列認識部分を有したプローブ（図中の右側に図示された６種類のプローブ、代表して１１３と称する）の構造を示す図である。ここでは一例として６種類のDNA断片とプローブを示しているが、その種類数は、検出すべきDNA配列の種類数によって可変である。
図２は、様々な検出すべき特定DNA配列を有するDNA断片(図中の左側に図示された６種類のDNA断片、代表して１１４と称する)と、それら特定DNA配列部分を特異的に認識して結合できる配列認識部分を有したプローブ（図中の右側に図示された６種類のプローブ、代表して１１３と称する）の構造を示す図である。ここでは一例として６種類のDNA断片とプローブを示しているが、その種類数は、検出すべきDNA配列の種類数によって可変である。
本実施形態の特徴は、各プローブが、その配列認識部分の末端以降に、サイズの異なる複数の３次元構造体からなる配列を有していることである。ここでは一例として、３つの３次元構造体１１０、１１１、および１１２が配列している場合を示している。そして、６種類のプローブでは、これら３次元構造体の配列が違うことが特徴である。なお、配列認識部分には、例えば、特定DNA配列と特異的に結合できる相補鎖配列を用いるのがよい。
＜特定DNA配列と配列認識部分を有するプローブ（結合後）の例＞
図３は、図２に示した様々な特定DNA配列を有するDNA断片と、それら特定DNA配列部分を特異的に認識して結合できる配列認識部分を有したプローブとを結合させた後の構造例を示す図である。なお、検出対象の特定DNA配列を有するDNA断片と、それら特定DNA配列部分を特異的に認識して結合できる配列認識部分を有したプローブの結合は、両者を水溶液中で混ぜ合わせることで行うことができる。
図３は、図２に示した様々な特定DNA配列を有するDNA断片と、それら特定DNA配列部分を特異的に認識して結合できる配列認識部分を有したプローブとを結合させた後の構造例を示す図である。なお、検出対象の特定DNA配列を有するDNA断片と、それら特定DNA配列部分を特異的に認識して結合できる配列認識部分を有したプローブの結合は、両者を水溶液中で混ぜ合わせることで行うことができる。
＜各プローブと結合したDNA断片の電流値の変化＞
図４は、それぞれ６種類の異なるプローブが結合した特定DNA配列を有する各DNA断片がナノポア１００を通過した際に生じる、ナノポア１００を通過する電流値の変化を示す図である。
図４は、それぞれ６種類の異なるプローブが結合した特定DNA配列を有する各DNA断片がナノポア１００を通過した際に生じる、ナノポア１００を通過する電流値の変化を示す図である。
例えば、図４(i)のケースでは、DNA断片の先端がナノポア１００に入った時点で、少しだけナノポア１００を通過する電流値は減少し、３次元構造体１１０の部分がナノポア１００に入った時点で、電流値はさらに減少する（１２０の部分）。その後、３次元構造体１１０がナノポアを通過し終えると、電流値は３次元構造体１１０がナノポア１００に入る前の値にほぼ戻る。続いて、３次元構造体１１１がナノポアに入った時点で、電流値はまた減少する（１２１の部分）。そして、３次元構造体１１０よりも３次元構造体１１１のほうが大きいため、３次元構造体１１１がナノポア１００に入った時の電流減少量は、１１０が入った時の電流減少量より大きくなる。３次元構造体１１１がナノポア１００を通過し終えると、電流値は３次元構造体１１１がナノポア１００に入る前の値にほぼ戻る。その後、３次元構造体１１２がナノポア１００に入った時点で、電流値はまた減少する（１２２の部分）。そして、３次元構造体１１１よりも３次元構造体１１２の方が大きいため、３次元構造体１１２がナノポア１００に入った時の電流減少量は、３次元構造体１１１が入った時の電流減少量より大きくなる。その後３次元構造体１１２がナノポアを通過し終えると、電流値は３次元構造体１１２がナノポア１００に入る前の値にほぼ戻る。プローブ１１３と、特定DNA配列を有するDNA断片１１４が結合した結合体がナノポア１００を通過し終えると、電流値は、ナノポア１００中に何も対象物がいないときに流れている値に戻る。
このように、各３次元構造体が通過した際に現れる、大きさの異なるブロック信号（１２０、１２１、および１２２）の出現の順番から、プローブ１１３中に、大きさの異なる３次元構造体がどの順番で並んでいるかという配列の情報を読み取ることができる。図４(ii)から(vi)も場合も同様であり、プローブ１１３中の、大きさの異なる３次元構造体の配列の順番は、電流中の、大きさの異なるブロック信号の出現の順番を決定しており、両者は一対一対応をしている。したがって、大きさの異なるブロック信号の出現の順番の情報から、どのプローブ１１３が結合したDNA配列がナノポアを通過したかが分かり、そしてそれはすなわち、どの特定DNA配列がナノポアを通過したかが分かるということである。このようにして、水溶液中の特定DNA配列の同定や計数やその存在有無の検証ができる。
＜従来の特定DNA配列の検出方法＞
ここで、従来法の特定DNA配列の検出方法（従来法）との比較を行う。図５は、従来による特定DNA配列の検出方法を説明するための図である。
ここで、従来法の特定DNA配列の検出方法（従来法）との比較を行う。図５は、従来による特定DNA配列の検出方法を説明するための図である。
従来法では、検出すべき特定DNA配列がn種類あった場合、それらにそれぞれ特異的に結合するn種類の大きさの異なるプローブ１１３を用意し、それらを結合させた後、それら結合体をナノポア１００に通過させ、その時のイオン電流減少量の大きさの違いから、ナノポア１００を通過した特定DNA配列（DNA断片１１４）の種類を同定する。つまり、この方法における、プローブ１１３と特定DNA配列（DNA断片１１４）の関係を図に表すと、図５のように、一つの３次元構造体を有したプローブ１１３が、一つの特定DNA配列（DNA断片１１４）と、配列認識部分で結合した形となっている。そして、異なる特定DNA配列（DNA断片１１４）には、異なる大きさの３次元構造体１１０から１１２を有したプローブ１１３が結合している。その場合、プローブ１１３と特定DNA配列（DNA断片１１４）が結合した結合体がナノポア１００を通過した際の電流変化は、図５に示した通り、３次元構造体の大きさに応じて、変化する。具体的には、図５(i)のように、一番小さな３次元構造体１１０を有するプローブ１１３が結合した特定DNA配列（DNA断片１１４）がナノポア１００を通過する際には、３次元構造体１１０由来の一番小さなブロック信号１２０が得られる。同様に図５(ii)および(iii)も３次元構造体１１１や１１２の通過に由来したブロック信号１２１および１２２が得られる。それらの大きさは、各３次元構造体１１０から１１２の大きさを反映している。ここで、上述したように、ある対象物が通過した際のイオン電流の減少量ΔIは、ΔI = ΔIave.±ΔIdev.と表現でき、その値にはバラつきΔIdev.がある。故に、ブロック信号１２０、１２１、および１２２の大きさΔIi、ΔIii、およびΔIiiiにはバラつきがある。したがって、ナノポア１００を通過した特定DNA配列の同定精度が十分に保たれるようにするためには、ばらつきも含めた各ΔIの値が十分に分離する必要があり、そのためには異種プローブが有する３次元構造体の大きさの差は、十分に大きくなくてはならない。
例えば、図５の例で、それぞれのΔIの値がばらつきも含めて、ΔIi = 1.5x±x, ΔIii = 4x±x, ΔIi=6.5x±xであり、ナノポアに何も検出対象物が入っていない場合にナノポアを流れる電流値が約7.5xの場合を考える。この時、各Ii、 ΔIii、およびΔIiiiは、バラツキを含めてもそれらの値が重なり合うことはない（図５の右下に、各Ii、ΔIii、およびΔIiiiの電流値のΔIave.とΔIdev.を、エラーバー付きのグラフとしてあらわしている。グラフが示す通り、お互いの電流値が重なり合っていない）。したがって、ナノポアを通過したプローブ付き特定DNA配列の種類を、精度よく同定することができる。
次に、図６を用いて、従来法において、図５の例に示した３種類以外の特定DNA配列（DNA断片１１４）、つまり４種類目の新たな特定DNA配列（DNA断片１１４）も同定しようとして、それと特異的に結合できる４種類目のプローブを用意した場合を考える。
４種類目のプローブ１１３が有する３次元構造体１５０は、当然３次元構造体１１０、１１１、および１１２のいずれとも大きさが異なり、かつナノポア１００を通過できる大きさでなくてはならない。そのような条件に当てはまる３次元構造体１５０を有したプローブ１１３が４種類目の特定DNA配列と結合し、その結合体がナノポア１００を通過した際の電流減少量ΔIivが、ΔIiv = 5.3x±xであるとする。そうすると、ΔIii、ΔIiii、およびΔIivの値は、バラつきを含めると一部重なることになる（図６の右下の、エラーバー付き各ΔIのグラフを参照）。そうすると、３次元構造体１１１を有したプローブ１１３が結合した特定DNA配列（DNA断片１１４）のナノポア通過イベントと、３次元構造体１５０を有したプローブが結合した特定DNA配列のナノポア通過イベントを、ΔIの値から正確に区別するのは困難になってくる。つまり識別の精度が落ちてくる。また、３次元構造体１５０を有したプローブ１１３が結合した特定DNA配列のナノポア通過イベントと、３次元構造体１１２を有したプローブ１１３が結合した特定DNA配列（DNA断片１１４）のナノポア通過イベントの識別精度も下がる。
このように、４種類目のプローブ１１３が有する３次元構造体１５０の大きさや構造を如何に調整しても、バラつきを含めた各ΔIi、ΔIii、ΔIiii、およびΔIivの値の分布の一部に大きな重なりが生じる場合、４種類の特定DNA配列（DNA断片１１４）を十分な精度を保って同定するのは困難である。したがって、この例では、十分な精度を保って特定DNA配列を同定できるのは、図５のように特定DNA配列（DNA断片１１４）の種類が３種類以下の場合である。
一方、上述のように、本実施形態の技術によれば、３種類よりも多くの特定DNA配列（DNA断片１１４）を精度良く検出することができるようになる。本実施形態によれば、図５に示す例の場合、３種類の３次元構造体１１０、１１１、および１１２を用いて、３種類よりも多くの特定DNA配列（DNA断片１１４）を精度良く検出することが可能である。その方法の特徴としては、まず、図２から図４に示す通り、一つのプローブ中に複数の３次元構造体（１１０、１１１、および１１２）が配列した構造となっており、特定DNA配列（DNA断片１１４）の種類に応じて、プローブ１１３中の３次元構造体の配列の順番が異なっていることである。そして、特定DNA配列（DNA断片１１４）とそれらプローブ１１３が結合した結合体がナノポア１００を通過する際、各３次元構造体の大きさに由来したブロック信号（ΔIi、ΔIii、およびΔIiii）の出現の順番から、特定DNA配列（DNA断片１１４）の種類を同定する。ΔIi、ΔIii、およびΔIiiiは、先に述べた通りばらつきも含めて重なりあっていないため、大きさΔIi、ΔIii、およびΔIiiiのブロック信号の出現の順番の判定も正確に行える。したがって、大きさの異なる３次元構造体が３種類しかなくても、図４のように例えば６種類の特定DNA配列（DNA断片１１４）の同定が可能となる。原理的には、大きさの異なる３種類の３次元構造体の配列の種類は３×３×３＝２７通りあるので、２７通りの特定DNA配列（DNA断片１１４）の同定ができることとなる。その中には、プローブ１１３中の複数の３次元構造体のすべてもしくは一部が同一種類の３次元構造体で構成されているケースも含まれている(例の一部を図７に示す)。その場合、３次元構造体に由来した複数のブロック信号の一部もしくはすべてが同じ大きさとなる。こういったケースが含まれていても、特定DNA配列（DNA断片１１４）の同定や計数の精度に影響を及ぼすことはない。つまり、図７で示される３つの例の電流信号は、互いに識別可能であるし、また図７で示される３つの例の電流信号は、図４に示されるような電流信号とも互いに識別可能である。
なお、言うまでもないが、図２から４は、例として３種類の３次元構造体がプローブに配列している場合の例を示しているが、３次元構造体の種類は３種類でなくてもよい。２種類でもよいし、４種類以上であっても、各３次元構造体に由来したブロック信号（ΔＩ）が、互いに識別可能であればよい。また、図３に示したような、複数の３次元構造体が配列されるプローブ１１３と、図５に示したような単数の３次元構造体を有するプローブ１１３を併用し、それぞれのプローブがそれぞれ別々の特定DNA配列（DNA断片１１４）を認識し結合するようにさせて、それら結合体をナノポア１００に通過させ、特定DNA配列（DNA断片１１４）の同定を行ってもよい。
図８は、異なる大きさの複数の３次元構造体の配列を有するプローブの例を示す図である。異なる大きさの複数の３次元構造体の配列を有するプローブは、例えば、図８に示されるように、プローブ（DNA鎖）１１３中にDIG１１５、アミノ基１１６、およびビオチン１１７を足場分子として形成しておき、そこにそれぞれDIG１１５、アミノ基１１６、あるいはビオチン１１７と特異的に結合しやすいDIG抗体１１０、PEG１１１、ストレプトアビジン１１２を結合させることで、形成することができる。もちろん上記の足場分子と３次元構造体の例はあくまで一例であって、このような足場分子と３次元構造体の種類や組み合わせは数多く存在している。本実施形態の実施環境（例えば溶液条件など）に合わせて、最適な足場分子と３次元構造体を用いればよい。
＜バルジ構造を有するプローブの例＞
図９は、バルジ構造を有するプローブの構造例を示す図である。プローブとしては、図９のように、配列認識部分（特定DNA配列の相補鎖）の末端以降が２本鎖DNAとなっており、その中にバルジDNA構造をとっている部分が複数（例えば、バルジ構造DNA２００、２０１、および２０２の部分）あり、そのバルジDNA構造の大きさがそれぞれ異なるような構造でもよい。ここでいうバルジDNA構造が、これまでの説明中における３次元構造体に当たる。
図９は、バルジ構造を有するプローブの構造例を示す図である。プローブとしては、図９のように、配列認識部分（特定DNA配列の相補鎖）の末端以降が２本鎖DNAとなっており、その中にバルジDNA構造をとっている部分が複数（例えば、バルジ構造DNA２００、２０１、および２０２の部分）あり、そのバルジDNA構造の大きさがそれぞれ異なるような構造でもよい。ここでいうバルジDNA構造が、これまでの説明中における３次元構造体に当たる。
したがって、検出すべき特定DNA配列の種類に応じて、大きさの異なるバルジDNA構造の配列を変えたプローブを用意し、それらと特定DNA配列が結合した結合体がナノポア１００を通過した際に電流値に現れる、各ブロック信号の大きさとその順番の情報から、ナノポア１００を通過した特定DNA配列の同定を行うことができる。
なお、以降の実施形態では、３次元構造体を有するプローブと称した場合、それは３次元構造体の部分がそれぞれDIG抗体１１０、PEG１１１、およびストレプトアビジン１１２のようにDNAと異なる分子で形成されている場合ならびに、３次元構造体の部分がバルジDNA構造で形成されている場合のどちらも意味することとする。
また、本実施形態の説明では、基本的に、各３次元構造体のサイズが異なる場合に、各３次元構造体がナノポア１００を通過する際のブロック信号の大きさが異なるという説明をしているが、各３次元構造体のサイズがほぼ同じでも、各３次元構造体の電気陰性度等の物性値が異なれば、それらがナノポアを通過する際のブロック信号の大きさに差が出る。つまり必ずしもサイズに差が無くても、それらがナノポアを通過する際のブロック信号の大きさに差が有れば、異なる大きさの３次元構造体とみなして利用することが可能である。
＜具体的な技術的効果例＞
図１４は、本実施形態によるプローブ付き特定DNA配列の構成の技術的効果の一例を説明するための図である。
図１４は、本実施形態によるプローブ付き特定DNA配列の構成の技術的効果の一例を説明するための図である。
図１４Ａに示すように、プローブ１１３における３次元構造体１１０、１１１、および１１２の配置が十分に離れていれば、各々の３次元構造体がナノポア１００を通過した際のブロック信号が互いに分離して観測される。つまり、３つのブロック信号が分離して観測される。
一方、プローブ１１３における３次元構造体１１０、１１１、および１１２の配置が少し近い場合、図１４Ｂに示すように、各ブロック信号間が分離せず、連続的な階段信号となる。このような場合でも、階段信号の各段の電流値を各ブロック信号値と見なすことができ、それら電流値は各３次元構造体のナノポア通過ならびにその順番を問題なく反映した値となっている。
従って、これまでの実施形態で説明した方法と同様にして、各３次元構造体に由来したブロック電流値の大きさと、その出現の順番の情報から、各プローブが結合した各特定DNA配列の同定を行うことができる。
（２）第２の実施形態
第１の実施形態では、複数の異なる大きさの３次元構造体が配列した構造を有するプローブ１１３を用いて、特定DNA配列（DNA断片１１４）を検出する例について説明した。第２の実施形態２では、１種類の大きさの同じ３次元構造体のみが配列されるプローブを用いて、特定DNA配列を検出する例について説明する。
第１の実施形態では、複数の異なる大きさの３次元構造体が配列した構造を有するプローブ１１３を用いて、特定DNA配列（DNA断片１１４）を検出する例について説明した。第２の実施形態２では、１種類の大きさの同じ３次元構造体のみが配列されるプローブを用いて、特定DNA配列を検出する例について説明する。
図１０に示すように、特定DNA配列を認識する配列認識部分以降に、３次元構造体１１１が１つだけ存在する場合、２つ配列する場合、３つ配列する場合、４つ配列する場合の４種類のプローブを用意し、それらを各特定DNA配列と結合させる。このような特定DNA配列とプローブの結合体のそれぞれがナノポア１００を通過する際の電流値を観測すると、図１０（i）から（iv）に示されるような電流-時間波形が得られる。つまり、別種類の特定DNA配列に結合した別種類のプローブがナノポア１００を通過した際、出現するブロック信号１２１の回数が異なっている。このブロック信号の回数の情報から、ナノポア１００を通過した特定DNA配列の種類を同定することが出来る。
なお、非特許文献５には、プローブが有する３次元構造体としてPEGをもちい、そのPEGの数を変えることで、プローブ付DNAがナノポアを通過した際のイオン電流減少量(ブロック信号)の大きさを変化させられることが報告されている。非特許文献５の例では、プローブにPEGを１つ付けた場合と３つ付けた場合の比較が報告されており、３つのPEGを有したプローブが結合したDNAがナノポアを通過したときのブロック信号は、１つのPEGを有したプローブが結合したDNAがナノポアを通過したときのブロック信号よりも大きくなっている。しかしながら、プローブ中に配置された３つのPEGの位置は、お互いにほとんど離れていないため、３つのPEGを有したプローブが結合したDNAがナノポアを通過したときのブロック信号は、一つのブロック信号として観測されている。一方、図１０に示されるように、本実施形態では、複数の３次元構造体のナノポア通過が、独立した複数のブロック信号として観測されている。非特許文献５では、プローブ中のほぼ同じ位置に複数の３次元構造体が配置されており、そのプローブがナノポアを通過する時に、それら複数の３次元構造体に由来したブロック信号が１つのブロック信号として観測される場合、そのブロック信号の大きさのバラつきは大きい。なぜなら、複数の３次元構造体がほぼ同時にナノポアに進入し、その後ほぼ同時にナノポアから脱出すれば、ブロック信号の大きさは非常に大きくなるが、複数の３次元構造体がナノポアに進入するタイミングや脱出するタイミングがそれぞれずれていれば、ブロック信号の大きさは非常に小さくなるからである。
従って、プローブ中の３次元構造体の種類ならびにサイズが１種類で、その数を変えることにより、各プローブがナノポア１００を通過した時のイオン電流変化の様子に、明確な差を持たすためには、図１０に示す本実施形態のように、各３次元構造体間の間隔を十分に確保（例えば、各３次元構造体が干渉しないように配置、つまり、各３次元構造体がナノポア１００通過中に干渉しないような距離を置いて配列される）すればよい。そうすれば、３次元構造体の数と同じ数のブロック信号を出現させることができる。このようにすることにより、各プローブと特異的に結合した各特定DNA配列の同定を高精度に行うことができるようになる。
（３）第３の実施形態
第１の実施形態において、図４(i)と(iv)のケースを考える。もし、図４(i)のケースにおいて、プローブが結合した特定DNA配列がナノポアに入るとき、特定DNA配列部分の方から先に入るのではなく、３次元構造体１１２の方から先にナノポア１００に入った場合、出現するブロック信号の順番は、１２２→１２１→１２０という順番になる。このため、得られる電流変化の様子は、図４(iv)のケースに近いものとなってしまう。もちろん、３次元構造体１１２の方からナノポア１００に入った場合、特定DNA配列部分の方から先にナノポア１００に入った場合と比べて、プローブとDNAが結合した結合体がナノポア１００に入って少しだけイオン電流が減少した時点から、最初の３次元構造体由来のブロック信号が得られるまでの時間が異なる。従って、その時間の違いから、プローブ付きDNAがナノポア１００に入ったときに、特定DNA配列の側から入ったのか３次元構造体がある方から入ったのか見分けることは可能ではある。しかし、処理の手順が増えるため、確実に識別できない場合も出てくる可能性もある。
第１の実施形態において、図４(i)と(iv)のケースを考える。もし、図４(i)のケースにおいて、プローブが結合した特定DNA配列がナノポアに入るとき、特定DNA配列部分の方から先に入るのではなく、３次元構造体１１２の方から先にナノポア１００に入った場合、出現するブロック信号の順番は、１２２→１２１→１２０という順番になる。このため、得られる電流変化の様子は、図４(iv)のケースに近いものとなってしまう。もちろん、３次元構造体１１２の方からナノポア１００に入った場合、特定DNA配列部分の方から先にナノポア１００に入った場合と比べて、プローブとDNAが結合した結合体がナノポア１００に入って少しだけイオン電流が減少した時点から、最初の３次元構造体由来のブロック信号が得られるまでの時間が異なる。従って、その時間の違いから、プローブ付きDNAがナノポア１００に入ったときに、特定DNA配列の側から入ったのか３次元構造体がある方から入ったのか見分けることは可能ではある。しかし、処理の手順が増えるため、確実に識別できない場合も出てくる可能性もある。
そこで、第３の実施形態は、より確実に、図４(i)と(iv)のケースを峻別する（取り違えない）ための方法について開示する。図１１は、第３の実施形態におけるプローブと特定DNA配列の結合例を示す図である。図１１に示すように、検出対象の各特定DNA配列の一部は、これまでと同様、大きさの異なる３次元構造体の配列が異なる各プローブと結合させる。ここでは、さらに、各特定DNA配列のうち、プローブ１１３と結合していない部分を認識するプローブ１１８を用意する。プローブ１１８は、３次元構造体１１９を有しており、このプローブ１１８を特定DNA配列の一部に結合させる。３次元構造体１１９の大きさは、３次元構造体１１０、１１１、および１１２の大きさと異なるようにしてもよい。
こうして出来た特定DNA配列とプローブの結合体がナノポアを通過する際、図１１(i)のケースでは、３次元構造体１１９の方からナノポア１００に入る場合と、３次元構造体１１２の方からナノポア１００に入る場合の２通りに対応して、図１１(i)および(i)’に示されるような２通りの電流波形が得られる。一方、図１１(iv)のケースでは、３次元構造体１１９の方からナノポア１００に入る場合と、３次元構造体１１０の方からナノポア１００に入る場合の２通りに対応して、図１１(iv)および(iv)’に示すような２通りの電流波形が得られる。これら図１１(i)および (i)’と図１１(iv)および(iv)’の波形には、それぞれ３次元構造体１１９に由来したブロック信号１２９が存在する。このため、図１１(i)および (i)’と図１１(iv)および(iv)’の電流波形は互いに明確な差をもった信号となっている。つまり、ブロック信号１２９のおかげで、特定DNA配列とプローブの結合体の両末端のうち、どちらの末端からナノポア１００に入ったかがはっきりと分かる。従って、より正確に図１１(i)と(iv)の各特定DNA配列のナノポア通過を区別・同定することが出来る。
なお、例えば、３次元構造体１１０の例としてはDIG抗体、３次元構造体１１１の例として5kDaのPEG、３次元構造体１１２の例としてストレプトアビジン、３次元構造体１１９の例として10kDaのPEGを用いる。そして、それらの足場分子としてはそれぞれDIG抗体に対してDIG、PEGに対してアミノ基、ストレプトアビジンに対してビオチンを用いることができる。また、３次元構造体１１０、１１１、１１２、および１１９は、大きさの異なるバルジ構造DNAを用いてもよい。
（４）第４の実施形態
溶液中の特定DNA配列の量が少なくなればなるほど、当然プローブ付き特定DNA配列がナノポアを通過する頻度も少なくなってくる。そうすると、プローブ付き特定DNA配列を検出するまでの時間が非常に長くなってしまう。このような場合には、プローブ付き特定DNA配列を増幅（例えば、PCR反応によって増幅）して、その量を増やしておけばよい。図１２ＡおよびＢ、並びに図１３ＡからＣは、プローブ付き特定DNA配列を増幅する方法を説明するための図である。
溶液中の特定DNA配列の量が少なくなればなるほど、当然プローブ付き特定DNA配列がナノポアを通過する頻度も少なくなってくる。そうすると、プローブ付き特定DNA配列を検出するまでの時間が非常に長くなってしまう。このような場合には、プローブ付き特定DNA配列を増幅（例えば、PCR反応によって増幅）して、その量を増やしておけばよい。図１２ＡおよびＢ、並びに図１３ＡからＣは、プローブ付き特定DNA配列を増幅する方法を説明するための図である。
（i）３次元構造体付きプローブを用いる場合（図１２ＡおよびＢ）
まず特定DNA配列を含む２本鎖DNAを高温(例えば９５℃)で乖離させ、１本鎖DNAにする(図１２Ａ（ａ）から（ｂ））。
まず特定DNA配列を含む２本鎖DNAを高温(例えば９５℃)で乖離させ、１本鎖DNAにする(図１２Ａ（ａ）から（ｂ））。
その後、プローブ１１３とプローブ１１８を、特定DNA配列と配列認識部分を介して結合させる（図１２Ａ（ｃ））。その際の温度は例えば６５℃である。その後、例えば７２℃に昇温し、各プローブの配列認識部分をプライマとして、DNA伸張反応を促す酵素(例えばポリメラーゼ)と、基質(dNTP)によって、DNA伸張反応をさせる（図１２Ａ（ｃ））。
伸張反応を終えた後、例えば９５℃に昇温することで、伸張反応を終えた産物を１本鎖DNAの状態に乖離させる(図１２Ａ（ｄ））。
伸張反応を終えた後、例えば９５℃に昇温することで、伸張反応を終えた産物を１本鎖DNAの状態に乖離させる(図１２Ａ（ｄ））。
その後、それらにまたプローブ１１３とプローブ１１８を、配列認識部分を介して結合させる（図１２Ａ（ｅ））。その際の温度は例えば６５℃である。その後、例えば７２℃に昇温し、各プローブの配列認識部分をプライマとして、DNA伸張反応を促す酵素(例えばポリメラーゼ)と、基質(dNTP)によって、DNA伸張反応をさせる（図１２（ｅ））。
その結果、図１２Ｂ（ｆ）に示すような産物が形成される。その後、例えば９５℃に昇温し、それら産物を１本鎖DNAの状態に乖離させた後、それらにまたプローブ１１３とプローブ１１８を、配列認識部分を介して結合させる（図１２Ｂ（ｇ））。結合させる際の温度は例えば６５℃である。その後、例えば７２℃に昇温し、各プローブの配列認識部分をプライマとして、DNA伸張反応を促す酵素(例えばポリメラーゼ)と、基質(dNTP)によって、DNA伸張反応をさせる（図１２Ｂ（ｇ））。
以上の手順を複数回繰り返すことで、第１から第３の実施形態例に示したような、異なる大きさの３次元構造体の配列を有するプローブと特定DNA配列とが結合してなる結合体を、大量に得ることができる。なお、この場合、プローブは既に３次元構造体を含んでいるので、ユーザは、直ぐに当該結合体を用いることができるようになる。
（ii）足場分子のみ有するプローブを用いる場合（図１３ＡからＣ）
DNA増幅反応が終わった後に、プローブ１１３に３次元構造体を結合させることも出来る。その場合、まず特定DNA配列を含む２本鎖DNAを高温（例えば９５℃）で乖離させ、１本鎖DNAにする（図１３Ａ（ａ）から（ｂ）)。
DNA増幅反応が終わった後に、プローブ１１３に３次元構造体を結合させることも出来る。その場合、まず特定DNA配列を含む２本鎖DNAを高温（例えば９５℃）で乖離させ、１本鎖DNAにする（図１３Ａ（ａ）から（ｂ）)。
そして、３次元構造体は有していないが、３次元構造体と特異的に結合できる足場分子１１５、１１６、および１１７を有するプローブ１１３と足場分子１９０を有するプローブ１１８とを、特定DNA配列と配列認識部分を介して、結合させる（図１３Ａ（ｃ））。その際の温度は例えば６５℃である。その後、例えば７２℃に昇温し、各プローブの配列認識部分をプライマとして、DNA伸張反応を促す酵素(例えばポリメラーゼ)と、基質(dNTP)によって、DNA伸張反応をさせる（図１３Ａ（ｃ））。
その伸張反応を終えた後、例えば９５℃に昇温することで、伸張反応を終えた産物を１本鎖DNAの状態に乖離させる（図１３Ａ（ｄ））。
その伸張反応を終えた後、例えば９５℃に昇温することで、伸張反応を終えた産物を１本鎖DNAの状態に乖離させる（図１３Ａ（ｄ））。
それらにまたプローブ１１３とプローブ１１８を、配列認識部分を介して結合させる（図１３Ａ（ｅ））。その際の温度は例えば６５℃である。その後、例えば７２℃に昇温し、各プローブの配列認識部分をプライマとして、DNA伸張反応を促す酵素(例えばポリメラーゼ)と、基質(dNTP)によって、DNA伸張反応をさせる（図１３Ａ（ｅ））。
その結果、図１３Ｂ（ｆ）に示すような産物が形成される。その後、例えば９５℃に昇温し、それら産物を1本鎖DNAの状態に乖離させた後、それらにまたプローブ１１３とプローブ１１８を、配列認識部分を介して結合させる（図１３Ｂ（ｇ））。結合させる際の温度は例えば６５℃である。その後、例えば７２℃に昇温し、各プローブの配列認識部分をプライマとして、DNA伸張反応を促す酵素(例えばポリメラーゼ)と、基質(dNTP)によって、DNA伸張反応をさせる（図１３Ｂ（ｇ））。
この手順を複数回繰り返して得られた産物と、３次元構造体１１０、１１１、１１２、および１１９を溶液中で混ぜ合わせると、図１３Ｃ（ｈ）のような産物を大量に得ることが出来る。すなわち、これら上記の手順を用いることで、第１から第３の実施形態に示すような、異なる大きさの３次元構造体の配列を有したプローブと特定DNA配列とが結合した結合体を大量に得ることができる。なお、この場合、DNA増幅反応が終わった後に３次元構造体をプローブ１１３に結合させる処理はユーザによって行わなければならないが、最後に３次元構造体を付着させるので、DNA増幅時の熱処理によって３次元構造体がプローブから外れてしまうという事態を回避することができるようになる。
（５）第５の実施形態
図１５および１６は、第５の実施形態によるプローブと特定DNA配列の結合を示す図である。第１から第４の実施形態では、プローブ１１３中に存在する特定配列認識部分は特定DNA配列の相補鎖である。第５の実施形態では、図１５（ａ）に示すように、プローブ１１３に存在する特定配列認識部分が、PNAで構成されている。このPNA部分は、特定DNA配列部分に特異的に結合できるよう設計してある。特定DNA配列を有する２本鎖DNAに、このPNAを特定配列認識部分として有したプローブ１１３を結合させるには、特定DNA配列を有する２本鎖DNAと、プローブ１１３を混ぜ合わせた溶液を昇温(例えば９０℃)し、その後温度を下げればよい。そうすることで、図１５（ｂ）に示すように、２本鎖DNAのうち特定DNA配列を有した部分にPNAがインベージョンする。これにより、プローブ１１３を特定DNA配列に特異的に結合することができる。
図１５および１６は、第５の実施形態によるプローブと特定DNA配列の結合を示す図である。第１から第４の実施形態では、プローブ１１３中に存在する特定配列認識部分は特定DNA配列の相補鎖である。第５の実施形態では、図１５（ａ）に示すように、プローブ１１３に存在する特定配列認識部分が、PNAで構成されている。このPNA部分は、特定DNA配列部分に特異的に結合できるよう設計してある。特定DNA配列を有する２本鎖DNAに、このPNAを特定配列認識部分として有したプローブ１１３を結合させるには、特定DNA配列を有する２本鎖DNAと、プローブ１１３を混ぜ合わせた溶液を昇温(例えば９０℃)し、その後温度を下げればよい。そうすることで、図１５（ｂ）に示すように、２本鎖DNAのうち特定DNA配列を有した部分にPNAがインベージョンする。これにより、プローブ１１３を特定DNA配列に特異的に結合することができる。
なお、図１６に示すように、反応工程の最後に、３次元構造体をプローブ１１３に結合させてもよい。特定DNA配列を有する２本鎖DNAと、３次元構造体の足場分子１１５、１１６、および１１７を有したプローブ１１３を混ぜ合わせた溶液を昇温（例えば９０℃）し、その後温度を下げる。このようにすることにより、図１６（ｂ）に示すように、PNA部分が特定配列部分にインベージョンした構造が得られる。その後、その得られた構造と３次元構造体を混ぜ合わせることで、図１６（ｃ）に示すような、特定DNA配列に、３次元構造体１１０、１１１、および１１２を有するプローブ１１３を結合することができる。
（６）まとめ
（i）第１の実施形態によるプローブは、図２に示されるように、任意のDNA配列に特異的に結合できる配列認識部分（特定DNA配列の相補鎖）と、配列認識部分の末端以降に複数の３次元構造体が配列しているプローブ部と、を含み、複数の３次元構造体（１１０、１１１、１１２：例えば、３次元構造体として、ストレプトアビジンまたはPEGまたはDIG抗体またはバルジDNA構造のいずれか、もしくはそれらの組み合わせを含むものを用いることができる）の配列の順番が、DNA配列と一対一に対応するように構成されている。この場合、複数の３次元構造体はそれぞれ種類が異なり、３次元構造体の個数は、他のプローブと同一とすることができる。このようにプローブを構成することにより、検出対象となる特定DNA配列の種類が多くなったときにも、それら特定DNA配列の同定や計数の精度、またその存在の有無の検証の精度を良好に保つことが可能となる。
（i）第１の実施形態によるプローブは、図２に示されるように、任意のDNA配列に特異的に結合できる配列認識部分（特定DNA配列の相補鎖）と、配列認識部分の末端以降に複数の３次元構造体が配列しているプローブ部と、を含み、複数の３次元構造体（１１０、１１１、１１２：例えば、３次元構造体として、ストレプトアビジンまたはPEGまたはDIG抗体またはバルジDNA構造のいずれか、もしくはそれらの組み合わせを含むものを用いることができる）の配列の順番が、DNA配列と一対一に対応するように構成されている。この場合、複数の３次元構造体はそれぞれ種類が異なり、３次元構造体の個数は、他のプローブと同一とすることができる。このようにプローブを構成することにより、検出対象となる特定DNA配列の種類が多くなったときにも、それら特定DNA配列の同定や計数の精度、またその存在の有無の検証の精度を良好に保つことが可能となる。
この場合、溶液中の任意のDNA配列を同定する方法は、上記プローブを、DNA配列と配列認識部分において結合させることと、プローブとDNA配列が結合した構造体がナノポアを通過する際の電流値を計測することと、電流値の波形から、複数の３次元構造体の配列の順番を特定することで、DNAの配列の存在を同定することと、を含んでいる。このとき、計測した電流値の波形は、複数の構造体の通過を反映した信号となっている。
なお、このようなプローブを複数まとめてセットとして提供してもよい。セットとして取り扱うことができるのは、他の実施形態によるプローブも同様である。
なお、このようなプローブを複数まとめてセットとして提供してもよい。セットとして取り扱うことができるのは、他の実施形態によるプローブも同様である。
（ii）第２の実施形態によるプローブは、任意のDNA配列に特異的に結合できる配列認識部分（特定DNA配列の相補鎖）と、配列認識部分の末端以降に複数の３次元構造体（図１０の１１１）が配列している部分と、を含み、複数の３次元構造体が、１種類の構造体のみで構成されており、その個数がDNA配列と一対一に対応するように構成されている。この場合、複数の３次元構造体は、ナノポア通過時に互いに干渉しないような距離をもって配列されている。このようなプローブを用いることにより、１種類の３次元構造体を用いて、特定DNA配列の同定や係数の精度等を良好に保つことが可能となる。
この場合、溶液中の任意のDNA配列を同定する方法は、上記プローブ（図１０）を、DNA配列と前記配列認識部分において結合させることと、プローブとDNA配列が結合した構造体がナノポアを通過する際の電流値を計測することと、電流値の波形から、複数の３次元構造体の配列の個数を特定することで、DNAの配列の存在を同定することと、を含んでいる。このとき、計測した電流値の波形は、複数の３次元構造体の通過を反映した信号となっている（３次元構造体が通過した時のブロック信号の個数が３次元構造体の個数に対応する）。
（iii）第３の実施形態は、上記第１の実施形態のプローブの構成に加えて、DNA配列において、当該プローブが結合する部分とは異なる箇所でDNA配列と結合する第２プローブを含んでいる（図１１：プローブセット）。このようにプローブセットを構成することにより、プローブがナノポアに入る方向を見分けることが可能となり、よって、短時間に特定DNA配列を精度良く同定することが可能となる。
（iv）第４の実施形態によるプローブは、任意のDNA配列に特異的に結合できる配列認識部分と、配列認識部分の末端以降に特定の３次元構造体と特異的に結合する複数の足場分子が配列している第１プローブ部と、を含み、複数の足場分子の配列の順番が、DNA配列と一対一に対応するように構成される。このようにすることにより、プローブ付き特定DNA配列を増幅した後に３次元構造体を取り付けることができるので、増幅時の処理によって３次元構造体が外れてしまうという事態を起こさないようにすることが可能となる。
（v）第５の実施形態によるプローブは、上記第１の実施形態によるプローブにおいて、配列認識部分がPNAで構成されている。このようにすることにより、2本鎖DNAの特定配列部分に、PNAを介してプローブを結合させることができる。
（vi）なお、各実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより、種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。さらに、異なる実施形態にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。本開示は、具体例に関連して記述したが、これらは、すべての観点において限定の為ではなく説明の為である。
加えて、本技術分野の通常の知識を有する者には、本開示のその他の実装がここに開示された本開示の明細書及び実施形態の考察から明らかになる。記述された実施形態の多様な態様は、単独又は如何なる組み合わせでも使用することが出来る。明細書と具体例は典型的なものに過ぎず、本開示の範囲と精神は後続する特許請求の範囲で示される。
１００ ナノポア
１０１、１０２ 溶液、水溶液
１０３ 膜（メンブレン）
１０４ チャンバ
１０５ 溶液導入口ならびに溶液出口
１０６ Ag/AgCl電極
１０７ Ag/AgCl電極
１０８ o-ring
１１０、１１１、１１２、１１９、１５０ ３次元構造体
１１３、１１８ プローブ
１１４ 特定DNA配列を含むDNA断片
１１５、１１６、１１７、１９０ ３次元構造体と結合する足場分子
１２０、１２１、１２２、１２９ ブロック信号
２００、２０１、２０２ バルジ構造DNA
１０１、１０２ 溶液、水溶液
１０３ 膜（メンブレン）
１０４ チャンバ
１０５ 溶液導入口ならびに溶液出口
１０６ Ag/AgCl電極
１０７ Ag/AgCl電極
１０８ o-ring
１１０、１１１、１１２、１１９、１５０ ３次元構造体
１１３、１１８ プローブ
１１４ 特定DNA配列を含むDNA断片
１１５、１１６、１１７、１９０ ３次元構造体と結合する足場分子
１２０、１２１、１２２、１２９ ブロック信号
２００、２０１、２０２ バルジ構造DNA
Claims (20)
- 任意のDNA配列に特異的に結合できる配列認識部分と、
前記配列認識部分の末端以降に複数の３次元構造体が配列しているプローブ部と、を含み、
前記複数の３次元構造体の配列の順番は、前記DNA配列と一対一に対応している、プローブ。 - 請求項１において、
前記複数の３次元構造体はそれぞれ種類が異なり、
前記３次元構造体の個数は、他のプローブと同一である、プローブ。 - 請求項１において、
前記複数の３次元構造体は、ストレプトアビジンまたはPEGまたはDIG抗体またはバルジDNA構造のいずれか、もしくはそれらの組み合わせを含んでいる、プローブ。 - 請求項１において、
前記配列認識部分は、前記DNA配列の一部あるいは全部の相補鎖配列構造を含む、プローブ。 - 請求項１において、
前記配列認識部分は、PNAで構成されている、プローブ。 - 任意のDNA配列に特異的に結合できる配列認識部分と、
前記配列認識部分の末端以降に複数の３次元構造体が配列している部分と、を含み、
前記複数の３次元構造体は、１種類の構造体のみで構成されており、その個数が前記DNA配列と一対一に対応をしている、プローブ。 - 請求項７において、
前記複数の３次元構造体は、ナノポア通過時に互いに干渉しないような距離をもって配列している、プローブ。 - 請求項１に記載のプローブを複数個含む、プローブセット。
- 請求項２に記載のプローブを複数個含み、
前記複数の３次元構造体の配列の順番は、異種のプローブ間において異なる、プローブセット。 - 任意のDNA配列に特異的に結合できる配列認識部分と、
前記配列認識部分の末端以降に複数の３次元構造体が配列しているプローブ部と、を含み、前記複数の３次元構造体の配列の順番は、前記DNA配列と一対一に対応している、第１プローブと、
前記DNA配列のうち、前記配列認識部分が結合する部分以外の場所で特異的に前記DNA配列と結合可能な第２プローブと、
を含む、プローブセット。 - 任意のDNA配列に特異的に結合できる配列認識部分と、
前記配列認識部分の末端以降に特定の３次元構造体と特異的に結合する複数の足場分子が配列している第１プローブ部と、を含み、
前記複数の足場分子の配列の順番は、前記DNA配列と一対一に対応している、プローブ。 - 溶液中の任意のDNA配列を同定する方法であって、
任意のDNA配列に特異的に結合できる配列認識部分と、前記配列認識部分の末端以降に複数の３次元構造体が配列している第１プローブ部と、を含み、前記複数の３次元構造体の配列の順番は、前記DNA配列と一対一に対応している、プローブを、前記DNA配列と前記配列認識部分において結合させることと、
前記プローブと前記DNA配列が結合した構造体がナノポアを通過する際の電流値を計測することと、
前記電流値の波形から、前記複数の３次元構造体の配列の順番を特定することで、前記DNA配列の存在を同定することと、を含み、
前記電流値の波形は、前記複数の構造体の通過を反映した信号となっている、方法。 - 請求項１２において、
前記プローブにおける前記複数の３次元構造体の個数と種類数は同じで、その配列が異なるように設計された複数の前記プローブを用いて、複数の異なる前記DNA配列をそれぞれ同定する、方法。 - 請求項１２において、
前記電流値の波形は、複数のブロック信号を含み、
各ブロック信号の大きさと各ブロック信号の発生の順番の情報から、前記複数の３次元構造体の配列を特定する、方法。 - 請求項１２において、
前記プローブにおける前記複数の３次元構造体は、ストレプトアビジンまたはPEGまたはDIG抗体またはバルジDNA構造のいずれか、もしくはそれらの組み合わせで構成されている、方法。 - 請求項１２において、
前記DNA配列のうち、前記プローブの前記配列認識部分が結合する部分以外に、特異的に結合する第２プローブを結合させることを含む、方法。 - 請求項１２において、
前記配列認識部分は、前記DNA配列の一部もしくは全体の相補鎖配列構造となっている、方法。 - 請求項１２において、さらに、
前記プローブにおける前記配列認識部分をプライマとして、前記DNA配列を増幅させることを含む、方法。 - 請求項１２において、
前記プローブにおける前記配列認識部分がPNAで構成されていることを特徴とする方法。 - 溶液中の任意のDNA配列を同定する方法であって、
任意のDNA配列に特異的に結合できる配列認識部分と、前記配列認識部分の末端以降に複数の３次元構造体が配列している部分と、を含み、前記複数の３次元構造体は、１種類の構造体のみで構成されており、その個数が前記DNA配列と一対一に対応をしている、プローブを、前記DNA配列と前記配列認識部分において結合させることと、
前記プローブと前記DNA配列が結合した構造体がナノポアを通過する際の電流値を計測することと、
前記電流値の波形から、前記複数の３次元構造体の個数を特定することで、前記DNA配列の存在を同定することと、を含み、
前記電流値の波形は、前記複数の構造体の通過を反映した信号となっている、方法。
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Non-Patent Citations (1)
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| SCIENTIFIC REPORTS, vol. Vol.9, 13143, JPN6023009422, September 2019 (2019-09-01), pages 15, ISSN: 0005011689 * |
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