JP2010530759A - 拡張によるハイスループット核酸配列決定 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1B
Description
本願は、2007年6月19日に出願された米国特許仮出願第60/945,031号;2007年10月23日に出願された米国特許仮出願第60/981,916号;及び、2007年10月25日に出願された米国特許仮出願第61/000,305号の米国特許法第119条(e)の下での恩典を主張するものであり、これらは全てそれらの全体が引用により本明細書中に組込まれている。
(技術分野)
本発明は概して、核酸配列決定、更にはそれに関連している方法及び生成物に関する。
核酸配列は、生物が機能しかつ再生するために必要な情報をコードしており、本質的に生命の設計図である。従ってそのような配列の決定は、いかにしてかつどこで生物体が生存するかの純粋な研究、更にはそのような創薬の応用科学において有用な道具である。医薬品において、配列決定道具は、癌、心臓疾患、自己免疫疾患、多発性硬化症、又は肥満症を含む様々な病理に関する診断及び治療の開発に使用することができる。産業において、配列決定は、改善された酵素プロセス又は合成生物体をデザインするために使用することができる。生物学において、そのような道具は、例えば、生態系の健全性を調べるために使用することができ、その結果広範な有用性がある。
大まかに言うと、現存するハイスループット核酸配列決定技術により示された空間分解能の問題点を克服する方法及び対応する装置及び生成物が明らかにされる。これは、より容易に検出される伸張された長さの代理ポリマーの核酸情報をコードすることにより実現される。この代理ポリマー(本明細書において「エクスパンドマー(Xpandomer)」と称される)は、標的核酸の当初の遺伝情報を保存するが、その配列データの個々のエレメントの線形分離(linear separation)も増大する、テンプレートに方向づけられた合成(template-directed 合成)により形成される。
構造(I):
Tは、テザーを表し;
P1は、第一のプローブ部分を表し;
P2は、第二のプローブ部分を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;及び
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列の配列情報を含む。)。
Tは、テザーを表し;
P1は、第一のプローブ部分を表し;
P2は、第二のプローブ部分を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;及び
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列の配列情報を含み;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。
Tは、テザーを表し;
P1は、第一のプローブ部分を表し;
P2は、第二のプローブ部分を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;及び
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列の配列情報を含み;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。
Tは、テザーを表し;
P1は、第一のプローブ部分を表し;
P2は、第二のプローブ部分を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列の配列情報を含み;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。
Tは、テザーを表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列の配列情報を含み;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。
Tは、テザーを表し;
Nは、核酸塩基残基を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、10よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列の配列情報を含み;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。
Tは、テザーを表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、10よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列の配列情報を含み;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。
Tは、テザーを表し;
Nは、核酸塩基残基を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、10よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列の配列情報を含み;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。
Tは、テザーを表し;
Nは、核酸塩基残基を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、10よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列の配列情報を含み;
χ1は、隣接サブユニットのテザーとの結合を表し;及び
χ2は、テザー間結合を表す。)。
Tは、テザーを表し;
n1及びn2は、各々、核酸塩基残基の第一の部分及び第二の部分を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、10よりも大きい整数であり;及び
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列の配列情報を含む。)。
本発明のこれら及び他の態様は、添付図面及び以下の詳細な説明を参照し明らかにされるであろう。この目的のために、より具体的に特定の手順、化合物及び/又は組成物を説明する様々な参考文献を本明細書において記載し、これらはそれらの全体が引用により本明細書中に組込まれている。
図面において、同じ参照番号は、同様のエレメントを確定している。図面中のエレメントのサイズ及び相対位置は、必ずしも縮尺どうりに描かれてはなく、これらのエレメントの一部は、図面のわかりやすさを向上するために任意に拡大されかつ配置されている。更に、描かれたエレメントの特定の形状は、その特定のエレメントの実際の形状に関する情報を伝えることを意図するものではなく、単に該図面における認識を容易にするために選択されている。
下記説明において、ある特定の詳細は、様々な実施態様の完全な理解を提供するために示されている。しかし当業者は、本発明はこれらの詳細を伴わずに実践されてもよいことを理解するであろう。別の場合、周知の構造は、本実施態様の不必要に曖昧な説明を避けるために、詳細には示さず、又は説明しない。文脈がそうでないことを必要としない限りは、本明細書及び後続の請求項を通じ、用語「らを含む」並びに「を含む」及び「を含んでいる」などのその様々な変形は、開放された非排他的な意味で、すなわち「を含んでいるが、これらに限定されるものではない」として解釈されるべきである。更に本明細書に提供された表題は、単に便宜上のものであり、請求される発明の範囲又は意味を説明するものではない。
本明細書において使用される下記の用語は、その文脈が別に指摘しない限りは、以下に特定された意味を有する。
「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、又はそれらの複素環式誘導体、アナログ、若しくは互変異性体などの、複素環式塩基である。核酸塩基は、天然存在型又は合成型であることができる。核酸塩基の非限定的例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、8-アザプリン、メチル又は臭素により8位で置換されたプリン、9-オキソ-N6-メチルアデニン、2-アミノアデニン、7-デアザキサンチン、7-デアザグアニン、7-デアザ-アデニン、N4-エタノシトシン、2,6-ジアミノプリン、N6-エタノ-2,6-ジアミノプリン、5-メチルシトシン、5-(C3-C6)-アルキニルシトシン、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、チオウラシル、シュードイソシトシン、2-ヒドロキシ-5-メチル-4-トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、7,8-ジメチルアロキサジン、6-ジヒドロチミン、5,6-ジヒドロウラシル、4-メチル-インドール、エテノアデニン、米国特許第5,432,272号及び第6,150,510号、並びにPCT出願WO 92/002258、WO 93/10820、WO 94/22892、及びWO 94/24144、並びにFasmanの文献(「生化学及び分子生物学の実践ハンドブック(Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology)」、385-394頁、1989、CRC Press社、ボカラトン、LO)に開示された非天然型の核酸塩基であり、並びに全てそれらの全体が引用により本明細書中に組込まれている。
「基質」又は「基質メンバー」は、標的テンプレートへの結合特異性を有する、オリゴマー、プローブ又は核酸塩基残基である。基質は一般に、テザーと組合せられ、基質構築物を形成する。娘鎖の主要骨格を形成する基質構築物の基質は、娘鎖の基質又は基質メンバーでもある。
「テザー」又は「テザーメンバー」は、一般に線形の次元を有し、かつ2つの反対端の各々に末端部分を伴う、ポリマー又は分子構築物をいう。テザーは、少なくとも1つの末端部分で連結により基質へ付着され、基質構築物を形成する。該テザーの末端部分は、基質への切断可能な連結又は「拘束された立体配置」でテザーを拘束するのに役立つ切断可能なテザー内連結へ接続されてよい。娘鎖が合成された後、各末端部分は、他のテザーへ直接又は間接に共役する末端連結を有する。共役されたテザーは、拘束されたエクスパンドマーを含み、これは更に娘鎖を含む。テザーは、「拘束された立体配置」及び「拡張された立体配置」を有する。拘束された立体配置は、基質構築物及び娘鎖において認められる。エクスパンドマー産物において認められるように、テザーの拘束された立体配置は、拡張された立体配置に対する前駆体である。拘束された立体配置から拡張された立体配置への転移は、娘鎖の主要骨格又はテザー内連結内であってよい選択的に切断可能な結合の切断を生じる。拘束された立体配置のテザーは、テザーが追加されて「主要骨格」の集成後に娘鎖を形成する場合にも使用される。テザーは任意に、基質の配列情報をコードすることができるその長さに沿った1種以上のレポーター又はレポーター構築物を含むことができる。テザーは、エクスパンドマーの長さを拡張し、これにより配列情報線密度を低下する手段を提供する。
「ホスホノ-ペプチド核酸」又は「pPNA」は、骨格が、N-(2-ヒドロキシエチル)ホスホノグリシン又はN-(2-アミノエチル)ホスホノグリシンなどのアミノ酸アナログを含み、かつ核酸塩基ユニット間の連結が、ホスホノエステル又はホスホノアミド結合を介している、ペプチド核酸である。
「ヒドロキシプロリン核酸」又は「HypNA」は、骨格が4-ヒドロキシプロリン残基を含むペプチド核酸である。そのような残基は、アミド又はエステル連結を介して連結されることができる。
「レポーター構築物」は、検出可能なシグナル(類)を作製することができる1種以上のレポーターを含み、ここで検出可能なシグナル(類)は一般に配列情報を含む。このシグナル情報は、「レポーターコード」と称され、その後遺伝子配列データへ解読される。レポーター構築物は、テザーセグメント、又はポリマー、グラフトコポリマー、ブロックコポリマー、親和性リガンド、オリゴマー、ハプテン、アプタマー、デンドリマー、連結基若しくは親和性結合基(例えばビオチン)を含む他の構造上の成分も含んでよい。
「エクスプローブ(Xprobe)」は、拡張可能なオリゴマー性基質構築物である。各エクスプローブは、プローブメンバー及びテザーメンバーを有する。このテザーメンバーは一般に1つ以上のレポーター構築物を有する。5'-一リン酸エステル修飾を伴うエクスプローブは、エクスパンドマー合成のための酵素的ライゲーション-ベースの方法と適合性がある。5'及び3'リンカー修飾を伴うエクスプローブは、エクスパンドマー合成のための化学的ライゲーション-ベースの方法と適合性がある。
「単プローブ伸長」は、オリゴマー性基質が1個づつ付加される循環式段階的プロセスをいう。一般にこの共役反応は、可逆的なブロック基を使用することにより、任意の一工程における単基質伸長を超える進行が抑止される。
「遺伝子外(extragenetic)」は、主要骨格の一部ではない娘鎖の任意の構造をいい;例えば、遺伝子外レポーターは、その主要骨格に存在する核酸塩基それ自身ではない。
大まかにいうと、単分子標的核酸の複製に関する方法及び対応する装置及び生成物が説明されている。そのような方法は、増大した処理量及び精度で、標的核酸を配列決定することが可能である「エクスパンドマー」を利用する。エクスパンドマーは、線形に拡張されたフォーマットで標的核酸のヌクレオチド配列データをコード化(解析)し、これにより任意にシグナル強度の増幅を伴い、空間的分解能を改善している。これらのプロセスは、本明細書において「拡張による配列決定」又は「SBX」と称されている。
多くの周知の分子生物学プロトコール、例えば標的DNAの断片化及び末端アダプターのライゲーションのためのプロトコールを、配列決定法で使用するために適合することができ、かつここで使用し、配列決定のための標的DNA(30)が調製される。ここで本発明者らは、大まかに、該断片の末端のポリッシュ(polishing)プロセス及び配列決定プライマーとの使用のためにデザインされたアダプター(31,32)の平滑末端ライゲーションのプロセスで、当業者が熟知していることを図示している。これらの働きは、図3Aの工程Iに示されている。工程II及びIIIにおいて、標的核酸は変性され、該アダプターと相補的な好適なプライマー(33)とアニールされる。
Pは、プローブ基質メンバーであり、P1-P2で構成され、ここでP1は第一のプローブ部分であり、及びP2は第二のプローブ部分であり;
Tはテザーであり;
括弧は、娘鎖のサブユニットを示し、ここで各サブユニットは、種-特異的プローブメンバーを有するサブユニットモチーフであり、更にここで前記サブユニットモチーフの前記プローブメンバーは、ここではP1'-P2'と表示されるテンプレート鎖の対応する連続ヌクレオチド配列に対し連続的に相補的であり、かつ該エクスパンドマー中間体の主要骨格を形成し、かつここでテザーメンバーは、任意にプローブ部分と一緒に拘束されたエクスパンドマー骨格を形成する。エクスパンドマー中間体内の1つ以上の選択的に切断可能な結合の切断は、サブユニットの拡張を可能にし、エクスパンドマー産物を作製し、そのサブユニットも括弧で示されており;
εは、プローブメンバー又はテザーの第一の終端又は部分に付着された第一のリンカー基であり;制御された条件下で、εは、隣接サブユニットの近接する終端のリンカー基δと、直接的に又はクロスリンカーを介して、選択的に反応し、共有的又は同等に耐久性のある連結を形成することが可能であり;
δは、プローブメンバー又はテザーの第一終端又は部分に付着された第二リンカー基であり;制御された条件下で、δは、隣接サブユニットの近接する終端のリンカー基εと、直接的に又はクロスリンカーを介して、選択的に反応し、共有的又は同等に耐久性のある連結を形成することが可能であり;
〜は、選択的に切断可能な結合を示し、これは複数の選択的に切断可能な結合が存在する場合に、同じ又は異なることができ;
R1は、ヒドロキシル、水素、三リン酸エステル、一リン酸エステル、エステル、エーテル、グリコール、アミン、アミド、及びチオエステルを含むが、これらに限定されるものではなく;
R2は、ヒドロキシル、水素、三リン酸エステル、一リン酸エステル、エステル、エーテル、グリコール、アミン、アミド、及びチオエステルを含むが、これらに限定されるものではなく;並びに
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでκ=1、2、・・・mであり、ここでm>3、及び一般にm>20、及び好ましくはm>50、及びより優先的にはm>1000である。
Nは、核酸塩基残基であり;
Tはテザーであり;
括弧は、娘鎖のサブユニットを示し、ここで各サブユニットは、種-特異的核酸塩基残基を有するサブユニットモチーフであり、更にここで該サブユニットモチーフの該核酸塩基残基は、ここではN'と表示されるテンプレート鎖の対応する連続ヌクレオチド配列に対し連続的に相補的であり、かつ該エクスパンドマー中間体の主要骨格を形成し、かつここでテザーメンバーは、任意に核酸塩基残基と一緒に、拘束されたエクスパンドマー骨格を形成する。エクスパンドマー中間体内の1つ以上の選択的に切断可能な結合の切断は、サブユニットの拡張を可能にしてエクスパンドマー産物を作製し、そのサブユニットも括弧で示されており;
n2は、核酸塩基残基の第二部分であり;
εは、プローブメンバー又はテザーの第一の終端又は部分に付着された第一のリンカー基であり;制御された条件下で、εは、隣接サブユニットの近接する終端のリンカー基δと、直接的に又はクロスリンカーを介して、選択的に反応し、共有的又は同等に耐久性のある連結を形成することが可能であり;
δは、プローブメンバー又はテザーの第一終端又は部分に付着された第二リンカー基であり;制御された条件下で、δは、隣接サブユニットの近接終端のリンカー基εと、直接又はクロスリンカーを介して、選択的に反応し、共有的又は同等に耐久性のある連結を形成することが可能であり;
χ1は、連結基δ1とε1の反応の生成物の連結であり;
χ2は、連結基δ2とε2の反応の生成物の連結であり;
〜は、選択的に切断可能な結合を示し、これは複数の選択的に切断可能な結合が存在する場合に、同じ又は異なることができ;
R1は、ヒドロキシル、水素、三リン酸エステル、一リン酸エステル、エステル、エーテル、グリコール、アミン、アミド、及びチオエステルを含むが、これらに限定されるものではなく;
R2は、ヒドロキシル、水素、三リン酸エステル、一リン酸エステル、エステル、エーテル、グリコール、アミン、アミド、及びチオエステルを含むが、これらに限定されるものではなく;並びに
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでκ=1、2、・・・mであり、ここでm>10、及び一般にm>50、及び典型的にはm>500又は>5,000である。
エクスパンドマー前駆体及び構築物は、テンプレートに方向付けられた集成のために使用される基質(オリゴマー性又はモノマー性)を基にふたつの範疇に分けることができる。これらのオリゴマー基質を基にしたエクスパンドマー構造、前駆体及びそれらの合成方法が、以下に考察される。
図10に目を移すと、クラスIオリゴマー性構築物がより詳細に説明されている。図10Aから10Cは、これらの分子を基質として及びSBXプロセスのヘテロ-コポリマー生成物として示すために適合された表記を利用する。これらの図は、左から右へと読み、最初にプローブ基質構築物(エクスパンドマーのオリゴマー性前駆体)、次に中央に中間体二重鎖娘鎖、及び右側に配列決定のために調製されたエクスパンドマー産物を示す。
図18Aから18Eを参照し、(異性体クラスIIIオリゴマー性構築物と共に)、エクスプローブ又はエクスマーのいずれかであることができる、クラスIIオリゴマー性構築物がより詳細に説明される。
図18Aから18Cは、左から右へと読み、最初にプローブ基質構築物(エクスパンドマーのオリゴマー性前駆体)、次に中央に中間体二重鎖娘鎖、及び右側に配列決定のために調製されたエクスパンドマー産物を示す。
このクラスは、全てのクラスが、鏡像の適用(すなわち、R1基とR2基の交換)を反映することができることを強調するために役立てることができる。更にこれは、説明されたクラスは完全ではないが、本発明が包含している多くの可能性のある配置のいくつかを反映していることを意図することを例示するために役立つ。
図22Aから22Eを参照し、クラスIVオリゴマー性構築物をより詳細に説明する。
図22Aから22Cは、左から右へと読み、最初にプローブ基質構築物(エクスパンドマーのエクスプローブ又はエクスマー前駆体)、次に中央に中間体二重鎖娘鎖、及び右側に配列決定のために調製されたエクスパンドマー産物を示す。
クラスI実施態様は、エクスプローブ及びエクスマーを含む。エクスプローブは一リン酸エステルであるが、エクスマーは三リン酸エステルである。「エクスマー」は、エクスパンドマーの酵素依存型のテンプレートに方向づけられた合成で重合されることができる拡張可能なオリゴヌクレオチド三リン酸基質構築物である。エクスプローブのように、エクスマー基質構築物は、図10A及び10Cに図示されている特徴的「プローブ−ループ」型を有し、ここでR1は5'-三リン酸エステルであり、及びR2-は3'-OHである。前記基質構築物は、オリゴ核酸塩基三リン酸エステル又はオリゴマーアナログ三リン酸エステルであるが、このプローブメンバー(すなわち該オリゴマー)は、テザー構築物、及び図10Dに示され、かつその機能は図10Eに更に図示されているようなテザーの末端連結の間の選択的に切断可能な結合により修飾されていることに注意されたい。
選択的に切断可能な結合を伴うプローブオリゴマーで始まり、引き続きテザー及びレポーターテザー構築物が続く、合成及び切断の戦略の概要が、以下に示されている。
一般に、エクスプローブ及びエクスマー基質構築物は、テザーの制御された拡張を可能にする選択的に切断可能な結合を有する。先に言及したように、そのような選択的切断は、当業者に公知のいくつかの技術により実現することができ、これは金属陽イオンによるホスホロチオラート骨格切断、ホスホロアミデート骨格修飾の酸切断、骨格保護のためのヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート修飾を使用する標準ホスホジエステル連結の選択的ヌクレアーゼ切断、ニトロベンジル修飾された骨格リンカーの光切断、及びジスルフィド結合の還元を含むが、これらに限定されるものではない。
一実施態様において、テザーは、それにテザー化されている核酸塩基残基(又は図8のエクスプローブ、エクスマー、及び他のオリゴマー基質の「プローブ」)又は核酸塩基(図9のXNTP、RT-NTP、及びモノマー性基質)の配列を独自に同定する「レポーター構築物」によりコードされている。レポーターは、基質に固有の配列情報及び基質がエクスパンドマーに取り込まれるために固有の配列情報を「解析」又は「コード化」するために利用される一般にテザーに会合されたレポーター又はレポーターの組合せである。一部の実施態様において、テザーは、単にスペーサーであり、及びレポーターは、基質であるか、又は基質に会合されている。
テザー上に展示されたレポーター又はレポーター前駆体を伴うクラスI基質構築物の合成は、様々な方法で実現することができる。ジスルフィド橋を介して基質構築物のテザー付着末端の近くに接続されるヘアピンテザーポリマーを集成するために、段階的プロセスを使用することができる。これは、テザーのプローブへの共役が高度に有利であるように、反応性末端に配向している。4種全てのヌクレオチドのためのアミノ-修飾因子C6ホスホロアミダイトが市販されており(Glen Research社, 米国)、例えばテザーを付着し、完成された基質構築物を形成するために使用される。あるいは、ベンズアルデヒド修飾されたヌクレオチドの形のリンカー化学を利用することができる。サイズ及び/又はアフィニティ精製は、正確に集成された基質構築物の濃厚化に有用である。
「レポーターコード」は、特定のレポーター構築物のレポーター内に組織化されている特定のシグナル又はシグナル配列のデジタル表示である。「レポーター構築物」は遺伝子外情報の物理的顕在化であるが、このレポーターコードは、そのデジタル同等物である。
デジタルコード化は、ある規則に従うレポーターコードを必要とする。例えば、4merエクスプローブライブラリーの可能性のある組合せ全てを同定するためには、少なくとも256種のレポーターコードが必要とされる。可能性のあるレポーター構築物組合せよりもより多いレポーターコードを有することは、ギャップタグ付け、位置情報の提供、又はパリティエラー若しくは高次エラーの同定などの他の目的のために余分な状態を使用することができるので、利点である。
図36Eにおいて、先の7-ビットレポーター構築物の剛性の同等物が示されている。
クラスI−Vオリゴマー性基質構築物を使用する数多くのSBX法が、先の図面において図示されている(図11-17、20、21、24)。本発明者らは、ここでこれらのプロトコールを補充する任意の方法を考察する。
図38は、標的末端アダプターの調製及び使用を図示している。図38Aは、二官能性の共役可能な末端(「L1」及び「L2」)及び酵素的にライゲーション可能な末端(5'リン酸及び3'-OH)を持つアダプターを形成するための、二重鎖化された末端官能基化された相補的オリゴヌクレオチドを図示している。これらのアダプターは、追加の官能性を伴うようにデザインすることもできる。例えば図38Bに示されたように、入れ子式の骨格クロスリンカー(「L3」)及び切断可能な結合(「V」)を持つ末端官能基化されたアダプターを合成することができる。簡略化のために、切断可能な結合Vは、エクスパンドマーを解放又は拡張するために使用されるものと同じ切断可能な結合化学(又は酵素学)であることができるが、独立した切断工程間で識別することが望ましい場合には、他の切断可能なリンカーを利用することができる。図38C及び38Dは、図38Bの多官能性アダプターの構築工程を示す。示されたように、各アダプター鎖に相補的な表面テザー化されたオリゴヌクレオチドを伴う磁気ビーズ(2種の異なるビーズ混合物)を使用し、異なるように修飾されたオリゴヌクレオチドセグメントを集成することができる。一旦集成されると、セグメントを酵素的にライゲーションして、アニールされたセグメントを共有的に連結することができる。本アプローチにより、各セグメントは、標準オリゴヌクレオチド合成に利用可能でない方式で、個別に修飾されることができる。
エクスプローブベースのSBX法を使用する長い連続したDNAの全ゲノムの配列決定を実行するために、DNAは、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、必要ならばギャップ充填、拡張及び測定のために操作可能な形で調製されると推定される。このエクスパンドマー集成プロセスは、一部の実施態様において、(1)複雑性及び交差ハイブリダイゼーション作用を減少するため、(2)洗浄を改善するため、(3)改善されたハイブリダイゼーションを促進するよう標的の操作(伸長)を可能にするため、及び/又は、(4)ナノ細孔センサーが使用される場合、検出プロセスとの継ぎ目のないインターフェイスを提供するために、DNA標的の表面固定により改善される。以下に詳細に説明されるように、標的テンプレートの調製、解析及び表面付着の方法は、データの品質及び配列集成を改善すると予想される。
配列決定のための標的核酸の調製方法のひとつは、図39に示されたような、末端官能基化された2本鎖化DNA標的を使用する。この例に関して、各アダプターは典型的には、例えばスクシンイミジル4-ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン(SANH)連結化学及びアミン修飾された末端アダプターオリゴヌクレオチド二重鎖を使用する、更なる処理に有用なANH基(反応性ヒドラジド)を備えている。同様にアミン反応性SANHを使用し、反応性ヒドラジド部分を作製することができる。SANHは、アルデヒド様4-ホルミル安息香酸エステル(4-FB)と容易に共役し、安定したヒドラゾン共有結合を形成する。アミン反応性C6-スクシンイミジル4-ホルミル安息香酸エステル(C6 SFB)を使用し、反応性ベンズアルデヒド部分を生成することができる。末端官能基化された相補的オリゴヌクレオチドは二重鎖化され、二官能性共役可能な末端(SANH及びアミン)及び酵素的にライゲーション可能な末端(3'OH及び5'リン酸エステル)を形成する。アダプターのライゲーションは、表面にテザー化されたアルデヒド基に架橋されることができる末端官能基化されたdsDNA標的を作製する。図39は、SANH及びアミン修飾された末端アダプターオリゴヌクレオチド二重鎖を用い官能基化されたdsDNA標的末端を図示している。
図40に示されたように、標的DNAの自由端でテザー化されたビーズ又はナノ粒子(400)を利用し、例えばエクスプローブライブラリーハイブリダイゼーション時に、伸長し、及び標的をその1本鎖化された高次構造内に保持することができる。伸長された高次構造内の標的の保持は、より低い温度で形成する標的分子内の二次構造の頻度及び安定性を有意に低下する。二次構造の影響の低下又は更には除去は、効率的で高い忠実度の基質構築物集成を促進する。
図40に説明された方法の代替は、標的を伸長するために、表面テザー化されたDNA標的の自由端に共有的に連結された長い官能基化されたポリマー(ビーズの代わりに)使用する。多孔質基質を通るポリマー末端修飾の電気-伸展及びスレッド化、それに続く基質内のポリマーの捕獲(隔離)は、二次構造が著しく自由な完全に伸長された1本鎖化された標的DNAを生じる。図42Aは、この方法を図示しており、これは基質内の細孔を通る標的鎖のスレッド化を示している。多孔質基質は、ゲルマトリックス、多孔質酸化アルミニウム、及び多孔質メンブレンを含むが、これらに限定されるものではない。完全に伸長されたポリマーの捕獲は、制御された化学官能基化により実現することができ、ここではポリマーの多孔質基質への架橋又は結合は、標的の完全な伸長後選択的に開始することができる。様々な架橋又は結合戦略が利用可能である。例えばカルボキシル官能基化された伸長されたポリマーのアミン官能基化された多孔質基質への架橋は、架橋剤1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)の導入により実現することができる。
図43Aにおいて、1本鎖化された標的DNA整列(固形支持体への付着に対し)の代替法を示しており、ここでこの標的は、篩ゲルマトリックス(430)へ共有的に付着される。図43b(挿入図)において、基質構築物は、まっすぐ伸展されている係留されたテンプレートに会合しているように見える。電界を標的伸長及び基質構築物提示に使用することができる。このアプローチは、標的密度及び標的伸長(電気直線化)の点で、DNA標的アレイに関して他の方法に勝る利点を有する。例えばDNAを、アクリレート修飾された末端アダプター(オリゴヌクレオチドへ付着された)を介してアクリルアミドへ架橋することは、慣習的に行われている。Acrydite(商標)は、利用可能なホスホロアミダイトであり(Matrix Technologies社, ハドソン, NH, 米国)、これはメタクリル5'終端修飾をオリゴヌクレオチドへ取り込むために広範に使用されており:Acrydite基内の二重結合は、アクリルアミドの活性化された二重結合と反応する(Kenneyらの論文「電気泳動及びゲル固定されたAcryditeプローブを使用する変異タイピング(Mutation typing using electrophoresis and gel-immobilized Acrydite prpbes)」、Biotechniques, 25(3):516-21, 1998)。アミン官能基化されたアガロースも、標準規格品で入手でき(G Biosciences社, セントルイス, MO, 米国)、これも同様に標準規格品のアミン反応性架橋化学を使用し、DNAへの架橋に使用することができる(Spagnaらの論文「アミンアガロースゲルへ結合することによるアスペルギルス・ニジェール由来のβ-グルコシダーゼの安定化(Stabilization of a β-glucosidase from Aspergillus niger by binding to an amine agarose gel)」、J. of Mol. Catalysis B: Enzymatic 11(2,3): 63-69, 2000)。
ライゲーション法における複数の変種を使用し、ギャップ管理及びギャップ充填に対処することができる。一実施態様において、循環式段階的ライゲーションが使用され、ここではプローブは、標的ポリヌクレオチドへ二重鎖化された表面テザー化されたプライマーから逐次的に集成される。別の実施態様において、基質構築物の「乱交雑」ハイブリダイゼーション及びライゲーションが、一般にプライマーを伴わずに、全標的DNA配列にわたり同時に生じる。
図45の工程Vのエクスプローブで図示されたように、ハイブリダイゼーション及びライゲーション循環プロセスの完了後、配列ギャップは充填され、連続するエクスパンドマーを作製することができる。標的DNA骨格に沿ったギャップは、よく確立されたDNAポリメラーゼ/リガーゼベースのギャップ充填プロセスを用いて充填することができる(Stewartらの論文「反復性ギャップライゲーションによるアレル割合を評価するための定量アッセイ(A quantitative assay for assessing allelic proportions by iterative gap ligation)」、Nucleic Acids Research, 26(4):961-966, 1998)。これらのギャップは、エクスプローブの隣接鎖が互いに向き合い、かつそれらの間に長さ1、2又は3個のヌクレオチドギャップを有する場合に生じる(図45において図示されたように4merクラス1エクスプローブを仮定)。ギャップ充填は、化学架橋を介しても行うことができる(Burginらの論文)。ギャップ充填が完了した後、周期的な1、2又は3個のヌクレオチド充填物を伴うライゲーションされたエクスプローブで主に構成されている、標的DNA相補物(compliment)は、適宜処理され(精製、切断、末端修飾、レポーター標識)、測定可能なエクスパンドマーを作製することができる。SBXアッセイ生成物は、検出工程前にバッチ処理において調製及び精製されるので、検出は効率的であり、かつ任意の並行する生化学処理により律速されない。
i)このハイブリダイゼーション/ライゲーション工程は、ランダム位置でランダムに配列決定されたDNAテンプレートにランダムに出会い、かつそれらがマッチした場合にハイブリダイズする、ランダム4merエクスプローブをシミュレートしている。エクスプローブは、いずれのヌクレオチドも重複することができない。ハイブリダイゼーションは、3ヌクレオチド長よりも大きい標的上の全ての位置が、ハイブリダイズされるまで続く;
iii)このサイクルの反復は、i)及びii)により定義され、その結果エクスプローブは、マルチ-エクスプローブ鎖の存在する遺伝子座でランダムに崩壊(build off)される。このサイクリングは、2つの連続するサイクルの間で変化が生じない場合に停止する。
前述の基本的4merハイブリダイゼーション実施態様の伸長は、3塩基及び2塩基の配列ギャップを充填するために、各々、3mer及び2merの基質構築物を使用する。図49は、比較的短いエクスプローブの逐次的又は同時付加によるギャップ充填の例を示している。大部分の標的テンプレートが、4merハイブリダイゼーションに続き、エクスプローブとうまく二重鎖化される場合、残存するギャップのほとんどは、長さ1、2又は3塩基のいずれかである。割合が中から高である2及び3塩基ギャップが、比較的小さいエクスプローブにより充填されかつライゲーションされる場合に、エクスパンドマーの平均サイズは著しく増加することができる。これらの比較的小さいプローブのハイブリダイゼーションは、ほとんどの標的が二重鎖化された後に行われるので、温度ストリンジェンシーは、各々、3mer及びその後2mer二重鎖化を可能にするよう低下することができる。比較的小さいエクスプローブの二重鎖安定性は、塩基スタッキング安定化のために、増大される。ライゲーション後、残存するギャップは、ヌクレオチドを挿入するためのポリメラーゼを用いて充填され、その後残存する全ての隣接5'リン酸エステル及び3'ヒドロキシルを連結するために再度ライゲーションされる。このポリメラーゼ取り込まれたリンカー修飾されたヌクレオチドは、取り込みの前又は後のいずれかに、ギャップ標識することができる。これらの標識は、この塩基を同定することができるか又はできない。図50のチャートにまとめられた統計モデルを基に、完全長エクスパンドマーポリマーは、95%以上の標的配列の対象範囲を有する(16塩基よりも大きい)。このモデルに従い、3mer/2merエクスプローブギャップ充填の使用は、標識されない塩基の割合を1/6に押し下げ(高効率の取り込みを想定)、これは5000塩基標的配列に関して、標的レプリコンを通じて50未満の識別されない単塩基ギャップを伴う、ほとんど連続した配列の5000塩基を生じる。従って、未同定のギャップ配列の99%よりも大きい16×対象範囲が同定される。
長い表面テザー化された1本鎖化された標的DNAは、分子内の二次構造のために、チャレンジするハイブリダイゼーション標的を提示することができる。図41Eに説明されたような、末端テザー化されたビーズの添加は、これらの分子内形成の出現を低下し、かつそれらが生じる場合にそれらを不安定にする。しかしアジュバントの添加により、基質構築物ハイブリダイゼーションを効果的にブロックすることができる、二次構造の形成の更なる縮小が必要であることを認めることができる。
標的二次構造を減少する別のアプローチは、未変性DNAと比べ減少された二次構造安定性を有する合成cDNA標的を作製するための、標的DNAの複製である。図53は、米国特許出願第2005/0032053号(「低下した二次構造を伴う核酸分子」)に図示された、いくつかのヌクレオチドアナログを列記しており、これらは説明された合成cDNA標的へ取り込まれることができる。これらのアナログは、N4-エチルデオキシシチジン、2-アミノアデノシン-5'一リン酸、2-チオウリジン一リン酸、イノシン一リン酸、ピロロピリミジン一リン酸及び2-チオシチジン一リン酸を含み(しかしこれらに限定されない)、これらはcDNA二次構造を減少することが明らかにされている。このアプローチは、二次構造を減少するために、標的の伸長及びハイブリダイゼーション用アジュバントと共に使用することができる。
先に言及したように、本エクスパンドマーは、いくつかの技術により標識及び測定されることができる。SBX法の大量のデータ出力能は、ナノ細孔をベースにしたセンサーアレイ又は同等の技術によく合致されている。一実施態様において、ナノ細孔アレイは、質量分析計の前面イオン化給源として機能し、ここでエクスパンドマー上のレポーターコードは、切断可能な質量分析用タグである。別の実施態様は、電気インピーダンス/コンダクタンス又はFRETなどの、ナノ細孔センサーの使用に関連している。
ナノ細孔によるポリマー-ベースの検出は、米国特許第6,465,193号及び第7,060,507号に開示されており、例えば、ポリマーの物理的パラメータは、予想されるようにナノ細孔からの電気出力を変調することが示されている。これらの特許及び関連する技術分野は、本明細書に完全に引用として取り込まれている。
公開されたヒトゲノム参照配列(又は他の参照配列)を、SBXにより作製された膨大な量の配列データの集成を補助するための、アラインメント道具として使用することができる。エクスパンドマー-ベースのSBXについて説明された長いリード長の能力は、小さい位置的に同定された配列ギャップを含む可能性があるにも関わらず、全ゲノム配列の集成を単純化しかつ忠実度を改善する。先に考察したように、本プロセスは更に、アッセイ反応表面上の寸法的に限られた位置での連続断片の分割により単純化することができる。この実施態様において、本解析方法は、集成時間及びエラーを劇的に減少することができる。
図9は、本発明のモノマー性構築物の概要を提供している。4つのRT-NTPクラス(VI、VII、VIII、及びIX)並びに1つのXNTPクラス(X)を含む、全部で5つのクラスが区別されている。各クラスを、以下に個別に考察する。
クラスVIからXのモノマー性構築物は、これらは基質として単独の核酸塩基残基を使用する点で、クラスIからVのオリゴマー性構築物から区別される。以下の説明において、Nは、任意の核酸塩基残基をいうが、ここでは典型的にはヌクレオチド三リン酸又はアナログである。これは、例えば塩基の複素環への、リボース基への、又は核酸塩基残基のα-リン酸エステルへの付着点を、テザー上に有する(本明細書においても説明される)。説明されたように、テンプレートに方向づけられた合成の主要な方法は、ポリメラーゼを使用するが、化学的及び酵素的ライゲーション方法を含む、テンプレートに方向づけられた合成を実行することができる任意の方法が適している。
モノマー性基質として適している基質ライブラリーは、修飾されたATP、GTP、CTP、TTP及びUTPを含む(しかし限定されない)。
図60は、クラスVIモノマー性基質構築物(RT-NTP型)をより詳細に説明している。図60Aから60Cは、左から右へと読み、最初にモノマー性基質構築物(単独の核酸塩基残基を有するエクスパンドマー前駆体)、次に中央に中間体二重鎖娘鎖、及び右側に配列決定のために調製されたエクスパンドマー産物を示す。
前記娘鎖は、「拘束された立体配置」においてテザーで更に構成される「拘束されたエクスパンドマー」と称されるエクスパンドマー前駆体で構成される。テザーがそれらの「拡張された立体配置」へ変わる場合、この拘束されたエクスパンドマーは、エクスパンドマー産物に変わる。これらのテザーは、サブユニット間χ連結、基質付着、及び任意に依然存在するならばテザー内連結により拘束されている。このχ連結は、第一サブユニットのテザー第一末端部分を、第二サブユニットの近接する末端でテザー第二末端部分へ付着し、かつ並べて置かれたリンカー基の第一サブユニットのε及び第二サブユニットのδの連結により形成される。
クラスVII分子は、先に説明されたクラスVIのアナログである。主な違いは、切断可能な結合が、基質間の代わりに、テザーと基質の間であることである。図62において、クラスVIIモノマー性基質構築物(RT-NTP型)は、より詳細に説明されている。図62Aから62Cは、左から右へと読み、最初にモノマー性基質構築物(単独の核酸塩基残基を有するエクスパンドマー前駆体)、次に中央に中間体二重鎖娘鎖、及び右側に配列決定のために調製されたエクスパンドマー産物を示す。
前記娘鎖は、「拘束された立体配置」内のテザーで更に構成される「拘束されたエクスパンドマー」と称されるエクスパンドマー前駆体で構成される。テザーがそれらの「拡張された立体配置」へ変わる場合、この拘束されたエクスパンドマーは、エクスパンドマー産物に変わる。これらのテザーは、サブユニット間χ連結、基質への切断可能な連結、及び任意に依然存在するならばテザー内連結により拘束されている。このχ連結は、第一サブユニットのテザー第一末端部分を、第二サブユニットの近接する末端でテザー第二末端部分へ付着し、かつ並べて置かれたリンカー基の第一サブユニットのε及び第二サブユニットのδの連結により、形成される。
クラスVIII分子は、先に説明されたクラスVIのアナログである。主な違いは、リンカー基εが、テザーの代わりに、基質へ直接接続されていることである。図63において、本発明者らは、クラスVIIIモノマー性基質構築物(RT-NTP型)をより詳細に説明している。図63Aから63Cは、左から右へと読み、最初にモノマー性基質構築物(単独の核酸塩基残基を有するエクスパンドマー前駆体)、次に中央に中間体二重鎖娘鎖、及び右側に配列決定のために調製されたエクスパンドマー産物を示す。
前記娘鎖は、「拘束された立体配置」内のテザーで更に構成される「拘束されたエクスパンドマー」と称されるエクスパンドマー前駆体で構成される。テザーがそれらの「拡張された立体配置」へ変わる場合、この拘束されたエクスパンドマーは、エクスパンドマー産物に変わる。これらのテザーは、サブユニット間χ連結、基質付着、及び任意に依然存在するならばテザー内連結により拘束されている。このχ連結は、第一サブユニットの基質を、第二サブユニットの近接する末端でテザー第二末端部分へ付着し、かつ並べて置かれたリンカー基の第一サブユニットのε及び第二サブユニットのδの連結により、形成される。
クラスIX基質構築物は、主要骨格が集成された後、そこに遊離のテザーが付着される2つのテザー付着点を有するので、他のRT-NTPからは区別される。図64は、クラスIXモノマー性基質構築物(RT-NTP型)を詳細に説明している。図64Aから64Cは、左から右へと読み、最初にモノマー性基質構築物(単独の核酸塩基残基を有するエクスパンドマー前駆体)、次に中央に中間体二重鎖娘鎖、及び右側に配列決定のために調製されたエクスパンドマー産物を示す。
一実施態様において、遊離テザーは、配列情報を有さず、「裸の」と称される。この場合、単独のリンカー化学を使用することができ、そのためリンカー基δ1及びδ2は同じであり、並びにリンカー基ε1及びε2は、1つのχ結合型と同じである。
前記娘鎖は、「拘束された立体配置」内のテザーで更に構成される「拘束されたエクスパンドマー」と称されるエクスパンドマー前駆体で構成される。テザーがそれらの「拡張された立体配置」へ変わる場合、この拘束されたエクスパンドマーは、エクスパンドマー産物に変わる。これらのテザーは、隣接基質へのχ連結、及び任意に(依然存在するならば)テザー内連結により拘束されている。
図64Eは、生成物エクスパンドマーへの取り込み後の基質構築物を示している。これらのサブユニットは、切断されかつ拡張されており、テザー間χ1結合(930,931)、及びテザー間χ2結合(932,933)により連結されている。各サブユニットは、モノマー基質に連結されたテザーであり、次のχ1結合に接続される。サブユニットは、添付されている図64Cにおいて括弧により表されているように、反復サブユニットに括弧をつけている縦の点線により示されている。
クラスX基質構築物は、XNTPとも称され、テザーが各モノマー基質内に含まれ、基質内テザーを形成し、各XNTP基質は、基質内に選択的に切断可能な結合を有し、これが一旦切断されると、拘束されたテザーの拡張が可能である点がRT-NTPと異なる。図66において、本発明者らは、クラスXモノマー性基質構築物をより詳細に説明している。図66Aから66Cは、左から右へと読み、最初にモノマー性基質構築物(単独の核酸塩基残基を有するエクスパンドマー前駆体)、次に中央に中間体二重鎖娘鎖、及び右側に配列決定のために調製されたエクスパンドマー産物を示す。
(選択的に切断可能なリボシル-5'-3'ヌクレオチド間結合を持つキメラ2merエクスプローブ「CA」の合成)
オリゴマー性基質構築物は、プローブメンバー及びテザーメンバーで構成され、かつ一般的「プローブ-ループ」構築を有する。プローブメンバー合成は、固相オリゴマー合成の良く確立された方法を使用し実現される。これらの方法において、核酸塩基の樹脂上の新生プローブ鎖への付加は、例えばホスホロアミダイト化学(米国特許第4,415,732号及び第4,458,066号)により達成され、並びに数ミリグラム又は数グラムの合成オリゴマーは、容易に入手可能な自動合成装置を用い、経済的に合成することができる。典型的固相オリゴヌクレオチド合成は、脱保護、共役、キャップ形成、及び酸化の4工程の反復実行に関連している。しかし、クラスIエクスプローブ基質構築物のプローブ内の少なくとも1つの結合は、選択的に切断可能な結合であり、少なくとも2つのプローブ部分は、テザーメンバーの受容のために修飾されている。この選択的に切断可能な結合は、テザー付着のために選択されたプローブ部分の間に位置している(すなわち、テザー付着の第一点及び第二点は、各々、プローブの第一部分及び第二部分上のどこかに位置されることのみ必要であり、これらの部分は選択的に切断可能な結合により結合されているので、「間」は、「隣接核酸塩基メンバーの間」の意味に限定されるものではない)。この実施例において、リボヌクレアーゼHにより選択的に切断可能であるリボシル5'-3'ヌクレオチド間結合は、選択的に切断可能な結合であり、かつテザー付着の2つの点は、2merプローブの第一及び第二の核酸塩基残基である。
(選択的に切断可能なホスホロチオラート結合を持つ4merエクスプローブ「TATA」の合成)
選択的に切断可能な結合として、ホスホロチオラート連結を持つエクスプローブ4merを合成することができる。下記実施例について、5'リン酸(dT)(アミノC6-dA)(dT)(アミノC6-dA)3'テトラヌクレオチドの合成が説明されている。
(選択的に切断可能な5'-3'ホスホジエステル結合を持つ3merエクスプローブ「CTA」の合成)
選択的に切断可能な結合としてのホスホジエステル連結を伴うエクスプローブを合成することもできる。下記の実施例に関して、橋かけしないホスホロチオエート修飾を伴う5'リン酸エステル(アミノC6-dC)(アミノC6-dT)(dA)3'トリヌクレオチドの合成が説明されている。ホスホジエステル結合は、様々なヌクレアーゼにより攻撃される。橋かけしないイオウを伴うホスホロチオエート結合は、本実施例において、ヌクレアーゼ-耐性結合として使用される。
(選択的に切断可能な5' N-P-O 3'ホスホロアミデート結合を持つ3merエクスプローブ「ATA」の合成)
アミノ修飾因子C6デオキシアデノシンは、5'-ジメトキシトリチル-N6-ベンゾイル-N8-[6-(トリフルオロアセチルアミノ)-ヘキサ-1-イル]-8-アミノ-2'-デオキシアデノシン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイトを用い、普遍的支持体へ最初に付着し、引き続き次ぎのサイクルにおいて、MMT-ブロックされた5'アミノ-dT(5'モノメトオキシトリチルアミノ-2'-デオキシチミジン)を添加する。脱ブロック後、この5'-アミノ末端を、アミノ修飾されたC6デオキシアデノシンホスホロアミダイトと、標準条件下で反応する。化学リン酸化試薬の添加、それに続く標準的切断、脱保護、及び精製の方法は、合成を完成する。トリヌクレオチド5'(アミノC6-dA)(O-P-N)(dT)(O-P-O)(アミノC6-dA)3'は、5'アミノC6-dAと最後から2番目のdTの間にホスホロアミデート結合を有する。
(内部光切断可能な結合を持つ6merエクスプローブ「CACCAC」の合成)
修飾されないデオキシシトシン及びデオキシアデノシンホスホロアミダイトによる標準の3'から5'への合成後、アミノ-修飾されたC6 dC(5'-ジメトキシトリチル-N-ジメチルホルムアミジン-5-[N-(トリフルオロアセチルアミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシシチジン,3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト; Glen Research社;カタログ番号10-1019)を共役し、これによりCACトリマーを形成する。次のサイクルに関して、光切断可能なリンカーが、(3-(4,4'-ジメトキシトリチル)-1-(2-ニトロフェニル)-プロパン-1-イル-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト;Glen Research社;カタログ番号10-4920)を共役する。次のサイクルにおいて、第二のアミノ-修飾されたdCを付加し、引き続き2つの最終ラウンドで、各々、dA及びdCホスホロアミダイトを標準付加する。得られる生成物「CAC-pc-CAC」は、第三及び第四の塩基位置にアミノ-リンカーを含み、かつ2つのアミノ-修飾された塩基の間に光切断可能なニトロベンゼン構築物により形成された選択的に切断可能な結合を橋かけするテザーの付加により修飾することができる。光切断可能なリンカーで修飾されたホスホジエステル骨格の選択切断は、例えば、Sauerらの論文(「光切断及び電荷タグ付けによる一塩基多型のMALDI質量分析解析(MALDI mass spectrometry analysis of single nucleotide polymorphism by photocleavage and charge-tagging)」、Nucleic Acids Research 31,11 e63, 2003)、Valloneらの論文(「MALDI-TOF MSにおけるUV切断可能なオリゴヌクレオチドを使用するSNPs遺伝子型解析(Genotyping SNPs using a UV-photocleavable oligonucleotide in MALDI-TOF MS)」、Methods Mol. Bio. 297:169-78, 2005)、及びOrdoukhanianらの論文(「多用途の光切断可能なDNAビルディングブロックのデザイン及び合成、光誘起型ハイブリダイゼーションへの適用(Design and synthesis of a versatile photocleavable DNA building block, application to phototriggered hybridization)」、J. Am. Chem. Soc. 117, 9570-9571, 1995)に明らかにされている。
(エクスマー基質構築物の合成)
エクスマー基質構築物は、エクスプローブのデザイン及び組成に密接に関連している。エクスマーライブラリーは、例えば、エクスプローブの5'-ピロリン酸化により合成される。5'-一リン酸エステルのピロリン酸処理の確立された手法は、例えばAbramovaらの論文(「ジヌクレオチド5'-三リン酸の容易かつ効果的合成(A facile and effective synthesis of dinucleotide 5'-triphoshates)」、Bioorganic Medicinal Chemistry 15: 6549-55, 2007)を含む。この方法において、オリゴマーの終端一リン酸エステルを、最初にセチルトリメチルアンモニウム塩としての終端リン酸エステルを、求核触媒としてDMAP(4-ジメチルアミノピリジン)又は1-MeIm(1-メチルイミダゾール)を使用し、DMF/DMSO中で等モル量のトリフェニルホスフィン(Ph3P)及び2,2'-ジピリジルジスルフィド(PyS)2と反応することにより、引き続きのピロリン酸との反応に関する必要性に応じて活性化する。この生成物を、アセトン中のLiCl04により沈殿し、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。
(ポリメラーゼ-ホスホロアミデート切断を持つエクスパンドマー合成)
エクスパンドマーの合成は、5'-三リン酸エステル末端及び3'-OH末端を伴い調製された基質構築物を用いて実行される。Klessの特許である米国特許第7,060,440号は、三リン酸オリゴマーを重合するためのポリメラーゼの使用を開示しており、及びこの方法は、ここでエクスパンドマーの合成に適合される。この基質構築物は、ヌクレオチド間5' N-P-Oホスホロアミデート選択的に切断可能な結合を伴う2merプローブメンバー"pppCA"及びPEGテザーループ構築物からなる。テンプレート鎖及び仲間(companion)プライマーを合成し、かつ精製後、使用する。配列:
(ポリメラーゼ-ホスホロチオエート切断を持つエクスパンドマー合成)
エクスパンドマーの合成は、5'-三リン酸エステル末端及び3'-OH末端を伴い調製された基質構築物を用いて実行される。Klessの特許である米国特許第7,060,440号は、三リン酸オリゴマーを重合するためのポリメラーゼの使用を開示している。この基質構築物は、"pppCA"である。この基質構築物は、選択的に切断可能なヌクレオチド間ホスホロチオラート骨格連結及びPEG 2000テザーループ構築物を伴いデザインされている。テンプレート鎖及び仲間プライマーを合成し、かつ精製後、使用する。配列:
(リガーゼによるエクスパンドマーキメラ合成)
エクスパンドマーの合成は、5'-一リン酸エステル末端及び3'-OH末端を伴い調製された基質構築物を用いて実行される。この基質構築物は、キメラ"5'pdC rA〜dC dA 3'"の4merであり、ここで5'側の最後から2番目のアデノシンはリボヌクレオチドであり、この基質の残りはデオキシリボヌクレオチドである。この基質構築物は、1個の選択的に切断可能なヌクレオチド間リボシル5'-3'ホスホジエステル結合("〜"により示される)及びPEG 2000テザーループ構築物を伴うようにデザインされ、ここでテザーは、この4merの終端"C"及び"A"で付着されている。テンプレート鎖及び仲間プライマーを、合成し、かつ精製後、使用する。配列:
(αリン酸エステルリンカー構築体の調製)
テザーリンカーは、Agrawalの論文において考察されたように(「2つの異なるレポーター基の付着のためのオリゴヌクレオチドの位置指定官能基化(Site specific functionalization of oligonucleotides for attaching two different reporter groups)」、Nuc. Acids Res. 18:5419-23, 1990)、ホスホロチオエートSジエステル又はホスホロアミデートN-アミドにも付着されてよい。アミノヘキシルホスホロアミデート(N-1アミノアルキル)リンカー及びホスホロチオエートの2種の異なるヌクレオチド間骨格連結の官能基化の方法が明らかにされている。Agrawalにより説明されたように調製されたC6アミンを、本発明の核酸塩基間テザー構築物の合成のためのリンカーとして使用する。N3'-P5'結合の誘導体化も報告されている(Sinyakovらの論文、「ヌクレオチド間ホスホロアミデート結合を含むオリゴヌクレオチドの官能基化(Functionalization of the oligonucleotides containing an internucleotide phosphoroamidate bond)」、Russian J Bioorganic Chem, 29:100-102, 2003)。
(テザー構築物へのヘテロ二官能性経路)
選択的に切断可能な結合を含む修飾されたオリゴマーの合成は、実施例1-5において説明されている。ここで4merの第二位置にC6-アミノ修飾された塩基及び第三位置に4-ホルミル安息香酸エステル-リンカー修飾された塩基を伴う4merが、標準のオリゴマー合成化学により調製される。この第二及び第三の塩基は、リボシル5'-3'ホスホジエステル結合、デオキシリボシル5'-3'ホスホジエステル結合、ホスホロチオラート結合(5'O-P-S3'若しくは5'S-P-O3')、ホスホロアミデート結合(5'O-P-N3'若しくは5'N-P-O3')、又は光切断可能な結合から選択された選択的に切断可能な結合により隔てられている。C6リンカーのアミンを、Sulfo EGSと反応し、活性エステルNHS基を形成する。次にヘテロ二官能性テザーループ合成を、修飾されたプローブメンバーの、アミン及びヒドラジド末端終結基で官能基化されたテザーとの反応により実現する。テザー-環状化された末端生成物が得られる。
(色素-標識されたテザー構築物)
単独のレポーターを持つエクスプローブ基質構築物を調製する。第一及び第二塩基上にC6アミンを伴う2merを、標準方法を用いて最初に合成する。この第一及び第二の塩基は、リボシル5'-3'ホスホジエステル結合、デオキシリボシル5'-3'ホスホジエステル結合、ホスホロチオラート結合(5'O-P-S3'若しくは5'S-P-O3')、ホスホロアミデート結合(5'O-P-N3'若しくは5'N-P-O3')、又は光切断可能な結合から選択された選択的に切断可能な結合により隔てられている。この実施例において、テザーは、1個の内部リンカー基を持つ種-特異的末端-官能基化されたPEG2000分子であり、このリンカーはテザー中央部(mid-tether)に配置されたマレイミド-官能基化されたリンカーである。レポーターは、デンドリマー上のスルフヒドリル部分を介して、テザー上のマレイミドリンカー基に付着された色素-標識されたデンドリマーである。これにより得られるレポーター構築物は、テザー上に1個のレポーターを含む。シスタミンデンドリマー(Dendritic Nanotechnologies社, マウントプレザント, MI, 米国;カタログ番号DNT-294 G3、直径5.4nm、デンドリマー半分につき16個の表面アミン)が、レポーターとして使用される。特異的色素の付着によるか、又は色素のデンドリマー上のアミン基への組合せにより、この基質構築物種は、同定のために独自に標識される。
(ペプチド-標識されたテザー構築物)
単独のレポーターを持つエクスプローブ基質構築物を調製する。第一及び第二塩基上にC6アミンを伴う2merを、標準方法を用いて最初に合成する。この第一及び第二の塩基は、リボシル5'-3'ホスホジエステル結合、デオキシリボシル5'-3'ホスホジエステル結合、ホスホロチオラート結合(5'O-P-S3'若しくは5'S-P-O3')、ホスホロアミデート結合(5'O-P-N3'若しくは5'N-P-O3')、又は光切断可能な結合から選択された選択的に切断可能な結合により隔てられている。この実施例において、テザーは、1個の内部リンカー基を持つ種-特異的末端-官能基化されたPEG2000分子であり、この事例においてこのリンカーはテザー中央部に配置されたマレイミド-官能基化されたリンカーである。レポーターは、デンドリマー上のスルフヒドリル部分を介して、テザー上のマレイミドリンカー基に付着された色素-標識されたデンドリマーである。これにより得られるレポーター構築物は、テザー上に1個のレポーターを含む。シスタミンデンドリマー(Dendritic Nanotechnologies社, マウントプレザント, MI, 米国;カタログ番号DNT-294 G3、直径5.4nm及びデンドリマー半分につき16個の表面アミン)が、レポーターとして使用される。特異的色素の付着によるか、又は色素のデンドリマー上のアミン基への組合せにより、この基質構築物種は、同定のために独自に標識される。官能基化されたアミンである、特異的ペプチドのデンドリマーへの付着により、この基質構築物種を、後の同定のためにタグ付けする。付着されたペプチドの寸法及び電荷を、検出装置における検出特徴として使用する。
(テザーレポーター構築物へのヘテロ二官能性経路)
複数のレポーターを伴う基質構築物を調製する。2merの第一位置にC6-アミノ修飾された塩基及び第二位置に4'-ホルミル安息香酸エステル修飾された塩基(4FB)を伴う2merのライブラリーを、標準有機化学により調製する。この第一及び第二の塩基は、リボシル5'-3'ホスホジエステル結合、デオキシリボシル5'-3'ホスホジエステル結合、ホスホロチオラート結合(5'O-P-S3'若しくは5'S-P-O3')、ホスホロアミデート結合(5'O-P-N3'若しくは5'N-P-O3')、又は光切断可能な結合から選択された選択的に切断可能な結合により隔てられている。このアミンは、Sulfo EGSと反応し、活性エステルNHS基を形成する。第二工程において、種-特異的二官能性アミンレポーターセグメント(セグメント1)を、この活性NHS基と反応し、並びに種-特異的二官能性ヒドラジドレポーターセグメント(セグメント4)を、4FBと反応する。次にセグメント1上の遊離アミンを、Sulfo EGSと反応し、活性エステルNHSを形成する。アミン及び4FB末端基を伴うレポーターセグメントの対(セグメント2及び3)からなる種-特異的ヘテロ二官能性キャップを、次にこの構築物と反応し、そのテザーループを閉じる。
(合成後標識によるレポーター構築物へのヘテロ二官能性経路)
複数のレポーターを持つ基質構築物を調製する。2merの第一位置にC6-アミノ修飾された塩基及び第二位置に4'-ホルミル安息香酸エステル修飾された塩基(4FB)を伴う4merのライブラリーを、標準有機化学により調製する。この第二及び第三の塩基は、リボシル5'-3'ホスホジエステル結合、デオキシリボシル5'-3'ホスホジエステル結合、ホスホロチオラート結合(5'O-P-S3'若しくは5'S-P-O3')、ホスホロアミデート結合(5'O-P-N3'若しくは5'N-P-O3')、又は光切断可能な結合から選択された選択的に切断可能な結合により隔てられている。このアミンは、Sulfo EGSと反応し、活性エステルNHS基を形成する。第二工程において、種-特異的二官能性アミンレポーターセグメント(セグメント1)を、この活性NHS基と反応し、並びに種-特異的二官能性ヒドラジドレポーターセグメント(セグメント4)を、4FBと反応する。次にセグメント1上の遊離アミンを、Sulfo EGSと反応し、活性エステルNHSを形成する。アミン及び4FB末端基を伴うレポーターセグメントの対(セグメント2及び3)からなる種-特異的ヘテロ二官能性キャップを、次にこの構築物と反応し、そのテザーループを閉じる。
(色素-標識されたレポーターエレメント)
実施例14及び15を参照し、デンドリマー性レポーターエレメントの表面アミンを、活性エステル化学により標識する。Alexa Fluor 488(緑色)及びAlexa Fluor 680(赤色)が、Molecular Probes社(ユージーン, OR)からsNHS活性エステルとして一工程付着のために入手可能である。密度及び色素比を変動し、各レポーターエレメント上に識別可能な分子タグを作製する。
(多状態レポーターエレメント)
色素の様々なパレットを、当業者に公知であるように、M-FISH及びSKYにおいて使用した技術に類似した技術により選択し、デンドリマー性レポーターへ複合する。従って各テザーのレポーターエレメントは、「空間アドレス」を構成し、これにより複数の色素結合部位を有する単独のデンドリマー性構築物は、複数のレポーターコードを作製することができる。実施例14及び15に説明されたテザー構築物を参照し、5-状態のスペクトルアドレスは、625種のレポーターコード組合せを作製する。
(PEG-5000スペーサーテザー)
テザーセグメントを、SBX反応物に対する結合親和性をほとんど又は全く有さない、耐久性のある水溶液/有機溶媒可溶性ポリマーで構築する。修飾されたPEG 5000を、ポリリジン5000レポーターの側方に位置する柔軟なテザースペーサーに使用する。遊離PEG末端を、プローブメンバーへの付着のために官能基化する。このポリマーは、ヘテロ二官能性リンカー化学を使用するプローブ付着点の架橋により環状化する。
(質量タグレポーター組成物の調製)
テザーを、以下のように合成する:切断可能な質量タグを、標準アミン共役化学を使用し、ポリ-l-リジンペプチドで官能基化されたG5デンドリマー(Dendritic Nanotechnologies社, マウントプレザント MI)に共有結合する。このG5デンドリマーは、直径〜5.7nmであり、かつ128個の反応性表面基を提供する。10,000分子量のポリリジンペプチドで官能基化されたG5デンドリマーの10個のストリング(string)は、〜57nmデンドリマーセグメント内に集合的に約100,000個のレポーター付着部位を提供する。合計約10,000の質量タグが、この完全に集成されたセグメント上での検出に利用可能であり、これは利用可能な結合部位のわずかに10%の占拠と想定される。先に説明された3種の質量タグレポーターコーディング法(図37)を使用し、各質量タグの約3,300コピーが測定に利用可能である。代替として、10,000分子量のポリ-リジンで官能基化された単独G9デンドリマー(2048個の反応基を有する)は、レポーター構築物の12nmセグメント内に利用可能な約170,000個の質量タグ付着部位を有する。
(非標識基質構築物の直接分析)
基質構築物ライブラリーを合成する;これらのテザーは、レポーターを含まない。エクスパンドマー産物の調製後、エクスパンドマー産物の個々の塩基を、電子トンネル分光法により分析する。
(非標識基質構築物のハイブリダイゼーション-支援分析)
オリゴマー性基質構築物ライブラリーを合成する;これらのテザーは、レポーターを含まない。エクスパンドマー産物の調製後、標識されたプローブの完成されたセットを次に、エクスパンドマー産物とハイブリダイズし、これらの二重鎖化されたプローブを、逐次的に分析する。
(Lys-Cys-PEG-ポリグルタミン酸-PEG-Cys-COOHテザーによるデオキシアデノシン三リン酸の合成)
BOC-保護されたアミノ側鎖を伴うリジンを、樹脂上に固定し、並びに標準ペプチド合成方法を使用し、システイン残基と反応させる。このリジンのアミノ側鎖は、RT-NTPテザーのε反応性官能基であろう(クラスVI、VII参照)。このシステインは、テザー内ジスルフィド結合の最初の半分を形成する。システイン上の脱保護されたアミンを、SANH(Pierce-Thermo Fisher社, 米国;カタログ番号22400: Bioconjugate Toolkit)により修飾し、ヒドラジドを形成する。
ビス-4FB PEGスペーサーセグメントを次に、システイン上のヒドラジドリンカーにカップルし、終端反応基として4FB基を残し、この樹脂を洗浄する。
システイン残基を、標準ペプチド合成試薬を用い、遊離カルボキシルへ共役する。システインの終端カルボキシルは、O-ベンジル保護されている。得られる生成物を再度洗浄し、樹脂から切断する。切断により作製された遊離カルボキシルはその後、EDC、アミノヘキシル、及びSANHにより修飾し、反応性ヒドラジドを形成する。
(RT-NTP三リン酸ライブラリーの合成)
テザー内SS-結合を持つテザー化されたヌクレオチド三リン酸塩基A、T、C及びGを、実施例22に説明したように調製するが、各塩基に使用されるPEG化されたグルタミン酸セグメントの電荷及び物理パラメータは、個別のレポーター特性を提供するように選択する。
(ポリグルタミン酸テザー化されたRT-NTPを使用するSBEによるエクスパンドマー合成)
ジスルフィドテザー内結合を持つ修飾されたRT-NTPアデノシン及びグアノシンヌクレオチド三リン酸を調製する。これらの塩基は、3'-位で可逆的にブロックされるように、更に修飾する。アリル-ベースの可逆的なブロック化学は、Ruparelの論文に説明されている(「合成によるDNA配列決定のための可逆的ターミネーターとしての3'-O-アリル光切断可能な蛍光ヌクレオチドのデザイン及び合成(Design and synthesis of a 3'-O-allyl photocleavable fluorescent nucleotide as a reversible terminator for DNA sequencing by synthesis)」、PNAS, 102:5932-37, 2005)。修飾された塩基のテザーは、一般に図61に示されたように、δ官能基及びε官能基を持つように構築される。δ官能基は、テザーのペンダントシステインのカルボキシルであり、かつε官能基は、プリンへのテザーの付着の近傍のリジンの側鎖アミンである。これらのテザーは、核酸塩基-特異的修飾されたポリグルタミン酸セグメントを含むように、更に修飾する。
SBEのサイクルは、複数回反復し、これにより拘束された立体配置でエクスパンドマー中間体を形成することができる。χ結合された核酸塩基の成長している鎖内の各テザーは、拘束されたエクスパンドマー立体配置内にある。
(クラスXエクスパンドマーを形成するためのヌクレアーゼ及びTCEP切断)
実施例24のエクスパンドマー中間体を、ヌクレアーゼで切断し、テザーセグメント及びχ結合により連結された個別の核酸塩基で構成されたエクスパンドマー産物を形成する。このヌクレアーゼは、テンプレート及び任意の会合されたプライマーも分解し、生成物を遊離する。テザー内ジスルフィド連結を、還元剤(TCEP, Pierce社、カタログ番号20490)の添加により切断する。
このエクスパンドマー産物を、短縮型シントン及びヌクレアーゼ消化副生物を除去するために、濾過しかつ精製する。線状化されたエクスパンドマーの検出及び分析は、多種多様な現存する方法及び次世代の方法を用いて行うことができる。
(テザー内光切断可能なリンカーを持つデオキシアデノシン三リン酸の合成)
グリシンを、樹脂上に固定し、かつシステインと反応させる。次にシステインアミノ基を、脱保護し、グルタミン酸塩と反応させ、このグルタミン酸は、Holmesらの論文(「コンビナトリアル有機合成のための試薬:固相合成のための新規O-ニトロベンジル光解離性リンカーの開発(Reagents for combinatorial organic synthesis: development of a new O-nitrobenzyl photolabile linker for solid phase synthesis)」、J Org Chem, 60:2318-19, 1995)に説明されたものから適合された2-ニトロベラトリルアミンリンカーなどの、Oベンジル保護されたカルボキシルを終端とする光解離性リンカーで修飾された側鎖を有する。このシステインは、RT-NTPテザーの「ε官能基」であろう。グルタミン酸上の脱保護されたアミンを、SANH(Pierce-Thermo Fisher社, 米国;カタログ番号22400: Bioconjugate Toolkit)により修飾し、ヒドラジドを形成する。グルタミン酸の側鎖は、テザーの合成後、光切断可能なテザー内リンカーを形成する。
リジン残基を、ペプチド結合により、スペーサーの遊離アミンに共役する。リジン残基を、BOCにより側鎖上で保護し、リジンのα-アミンを、FMOCにより保護する。光切断可能なリンカーのOベンジル終端カルボキシル及びリジンのBOC-保護された側鎖を、次に脱保護し、EDC/Sulfo-NHSで架橋し、テザーを環状化する。
得られる生成物を再度洗浄し、その後樹脂から切断する。切断により生成された遊離グリシンカルボキシルを、次にEDC、アミノヘキシル、及びSANHにより修飾し、反応性ヒドラジドを形成する。
(光切断可能なRT-NTPを使用するSBEによるエクスパンドマー合成)
光切断可能なテザー内結合を持つ修飾されたRT-NTPアデノシン及びグアノシンヌクレオチド三リン酸を調製する。これらの塩基は、3'-位で可逆的にブロックされるように、更に修飾する。アリル-ベースの可逆的なブロック化学は、Ruparelの論文に説明されている(「合成によるDNA配列決定のための可逆的ターミネーターとしての3'-O-アリル光切断可能な蛍光ヌクレオチドのデザイン及び合成(Design and synthesis of a 3'-O-allyl photocleavable fluorescent nucleotide as a reversible terminator for DNA sequencing by synthesis)」、PNAS, 102:5932-37, 2005)。修飾された塩基のテザーは、一般に図61に示されたように、δ官能基及びε官能基を持つように構築される。δリンカー基は、テザーの終端ペンダントリジンのアミンであり、かつεリンカー基は、テザーの付着点の近傍のシステインのスルフヒドリルである。これらのテザーは、種-特異的修飾されたポリグルタミン酸セグメントを含むように、更に修飾する。
SBEのサイクルは、複数回反復し、これにより拘束された立体配置でエクスパンドマー中間体を形成することができる。χ結合された核酸塩基の成長している鎖内の各テザーは、拘束されたエクスパンドマー立体配置内にある。
(クラスXエクスパンドマーを形成するためのヌクレアーゼ及び光切断)
実施例27のエクスパンドマー中間体を、ヌクレアーゼで切断し、テザーセグメント及びχ結合により連結された個別の核酸塩基で構成されたエクスパンドマー産物を形成する。このヌクレアーゼは、テンプレート及び任意の会合されたプライマーも分解し、生成物を遊離する。テザー内光切断可能な連結は、UV光への曝露により切断される。
このエクスパンドマー産物を、短縮型シントン及びヌクレアーゼ消化副生物を除去するために、濾過しかつ精製する。線状化されたエクスパンドマーの検出及び分析は、多種多様な現存する方法及び次世代の方法を用いて行うことができる。
(インサイチュにおけるRT-NTPテザーの合成)
固形支持体上の標準ペプチド合成方法を使用し、構造(樹脂-C')-Glu-Cys-(Gly-Ala)10-Pro-Ser-Gly-Ser-Pro-(Ala-Gly)10-Cys-Lysを有するペプチドを調製する。この終端アミンは、SANH(Pierce社, カタログ番号22400)と反応され、ヒドラジドリンカーを作製する。
別に、C6アミン修飾されたデオキシアデノシン三リン酸(N6-(6-アミノ)ヘキシル-dATP, Jena Bioscience社, ジェナ DE;カタログ番号NU-835)を、SFB(Pierce社Bioconjugate Toolkit, カタログ番号22419)により処理し、4FB官能基を形成する。修飾された塩基を先の工程の反応性ヒドラジドと組合せることにより、テザー-プローブ基質構築物を集成する。
これらのジスルフィドは、クラスII、III、VI、VII、及びVIII基質構築物において描かれた(図8及び9参照)テザー内安定化の代表であるが、ここではクラスVI、VII及びVIIIのモノマー性基質構築物をより詳細に言及し図示されている。ほどけたテザーの長さは、残基C-Cペプチド結合長3.8Åと仮定し、約10nmであるが、β-ヘアピン内の水素結合のためコンパクトな形状と想定される。
(エクスプローブを使用するエクスパンドマー合成)
ひとつのSBX実施態様において、256種の4merエクスプローブのエクスプローブライブラリーが、表面テザー化されかつ伸長された1本鎖DNA標的に、ハイブリダイゼーションのために提示される。このハイブリダイゼーション工程は、長いエクスプローブ鎖を促進するために慣習的である正確なサーマルサイクリング下で継続される。弱く結合した非特異的プローブ-標的二重鎖を、再度正確な温度制御下で、単純な洗浄工程により除去する。酵素的ライゲーションを、標的DNAに沿って任意のエクスプローブ鎖を連結するために実行し、引き続き2回目洗浄する。ハイブリダイゼーション/洗浄/ライゲーション/洗浄のサイクルを繰り返すことにより、より長いライゲーションされた配列が、標的テンプレートの複製がほとんど完成されるまで、標的DNAに沿って複数の部位において成長する。
(ポリメラーゼを使用するXNTPエクスパンドマー合成)
クラスXエクスパンドマーの合成は、αリン酸エステルで橋かけしない2-アミノエチルホスホネート及び橋かけしているホスホロチオラート(3'O-P-S 5')からなる混合された骨格を有する修飾された8-[(6-アミノ)ヘキシル]-アミノ-デオキシアデノシン三リン酸基質構築物を使用し、実行する。ヌクレオチド内テザーを、2-アミノエチルホスホネートリンカー及び8-[(6-アミノ)ヘキシル]-アミノ-デオキシATP上のC6アミノリンカーに付着する。配列
(ポリメラーゼを使用するXNTPエクスパンドマー合成)
クラスXエクスパンドマーの合成は、αリン酸エステルで橋かけしない(N-1-アミノアルキル)ホスホロアミデート及び橋かけするホスホロチオラート(3'O-P-S5')からなる混合された骨格を有する修飾されたN6-(6-アミノ)ヘキシル-デオキシアデノシン三リン酸基質構築物を使用し、実行する。ヌクレオチド内テザーは、N-1-アミノアルキル基及びN6-(6-アミノ)ヘキシル-デオキシATP上のC6アミノリンカーに付着される。配列
(リガーゼを使用するXNTPエクスパンドマー合成)
クラスXエクスパンドマーの合成は、αリン酸エステルで橋かけしない2-アミノエチルホスホネート及び橋かけするホスホロアミデート(3'-O-P-N-5')からなる混合型骨格を有する修飾された8-[(6-アミノ)ヘキシル]-アミノ-デオキシアデノシン一リン酸基質構築物を使用し、実行する。ヌクレオチド内テザーは、2-アミノエチルリンカー及び8-[(6-アミノ)ヘキシル]-アミノ-デオキシAMP上のC6アミノリンカーに付着される。配列
Claims (74)
- 標的核酸を配列決定するための方法であって、
a)テンプレートに方向づけられた合成によって作製される娘鎖を提供することであって、該娘鎖が該標的核酸の全体又は一部の連続ヌクレオチド配列に対応する配列に共役された複数のサブユニットを含み、該個々のサブユニットがテザー、少なくとも1つのプローブ又は核酸塩基残基、及び少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を含む、前記提供;
b)該少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を切断して、該娘鎖の複数のサブユニットより長い長さのエクスパンドマーを産生することであって、該エクスパンドマーが該標的核酸の全体又は一部の連続ヌクレオチド配列に対応する配列における遺伝情報を解析するためのテザー及びレポーターエレメントを含む、前記切断;及び、
c)該エクスパンドマーのレポーターエレメントの検出;
を含む、前記方法。 - 前記遺伝情報を解析するためのレポーターエレメントが、前記エクスパンドマーのテザーと会合されている、請求項1記載の方法。
- 前記遺伝情報を解析するためのレポーターエレメントが、前記少なくとも1つの選択的に切断可能な結合の切断前に、前記娘鎖と会合されている、請求項1記載の方法。
- 前記遺伝情報を解析するためのレポーターエレメントが、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合の切断後に、前記エクスパンドマーと会合されている、請求項1記載の方法。
- 前記エクスパンドマーが、前記少なくとも1つのプローブ又は核酸塩基残基の全体又は一部を更に含む、請求項1記載の方法。
- 前記遺伝情報を解析するためのレポーターエレメントが、前記少なくとも1つのプローブ若しくは核酸塩基残基であるか又はこれに会合されている、請求項5記載の方法。
- 前記少なくとも1つの選択的に切断可能な結合が、共有結合である、請求項1記載の方法。
- 前記少なくとも1つの選択的に切断可能な結合が、テザー内結合である、請求項1記載の方法。
- 前記少なくとも1つの選択的に切断可能な結合が、前記娘鎖のプローブ若しくは核酸塩基残基の間の又はその中の結合である、請求項1記載の方法。
- 前記少なくとも1つの選択的に切断可能な結合が、前記娘鎖のプローブ若しくは核酸塩基残基と標的テンプレートの間の結合である、請求項1記載の方法。
- 前記娘鎖が、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合の切断前に、下記構造を有するテンプレート−娘鎖二重鎖を含む、請求項11記載の方法:
Tは、テザーを表し;
P1は、第一のプローブ部分を表し;
P2は、第二のプローブ部分を表し;
〜は、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を表し;
P1'は、P1が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
P2'は、P2が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;及び
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列に相補的である。)。 - 前記娘鎖が、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合の切断前に、下記構造を有するテンプレート−娘鎖二重鎖を含む、請求項14記載の方法:
Tは、テザーを表し;
P1は、第一のプローブ部分を表し;
P2は、第二のプローブ部分を表し;
〜は、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を表し;
P1'は、P1が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
P2'は、P2が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列に相補的であり;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。 - 前記娘鎖が、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合の切断前に、下記構造を有するテンプレート−娘鎖二重鎖を含む、請求項17記載の方法:
Tは、テザーを表し;
P1は、第一のプローブ部分を表し;
P2は、第二のプローブ部分を表し;
〜は、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を表し;
P1'は、P1が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
P2'は、P2が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列と相補的であり;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。 - 前記娘鎖が、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合の切断前に、下記構造を有するテンプレート−娘鎖二重鎖を含む、請求項20記載の方法:
Tは、テザーを表し;
P1は、第一のプローブ部分を表し;
P2は、第二のプローブ部分を表し;
〜は、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を表し;
P1'は、P1が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
P2'は、P2が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列に相補的であり;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。 - 前記娘鎖が、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合の切断前に、下記構造を有するテンプレート−娘鎖二重鎖を含む、請求項23記載の方法:
Tは、テザーを表し;
P1は、第一のプローブ部分を表し;
P2は、第二のプローブ部分を表し;
〜は、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を表し;
P1'は、P1が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
P2'は、P2が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列と相補的であり;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。 - 前記娘鎖が、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合の切断前に、下記構造を有するテンプレート−娘鎖二重鎖を構成する、請求項26記載の方法:
Tは、テザーを表し;
Nは、核酸塩基残基を表し;
N'は、Nが相補的であるテンプレート鎖のヌクレオチド残基を表し;
〜は、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、10よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列に相補的であり;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。 - 前記娘鎖が、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合の切断前に、下記構造を有するテンプレート−娘鎖二重鎖を含む、請求項29記載の方法:
Tは、テザーを表し;
Nは、核酸塩基残基を表し;
N'は、Nが相補的であるテンプレート鎖のヌクレオチド残基を表し;
〜は、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、10よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列に相補的であり;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。 - 前記娘鎖が、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合の切断前に、下記構造を有するテンプレート−娘鎖二重鎖を含む、請求項32記載の方法:
Tは、テザーを表し;
Nは、核酸塩基残基を表し;
N'は、Nが相補的であるテンプレート鎖のヌクレオチド残基を表し;
〜は、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、10よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列に相補的であり;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。 - 前記娘鎖が、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合の切断前に、テンプレート鎖と二重鎖化され、下記構造を有するテンプレート−娘鎖二重鎖を産生する、請求項35記載の方法:
Tは、テザーを表し;
Nは、核酸塩基残基を表し;
N'は、Nが相補的であるテンプレート鎖のヌクレオチド残基を表し;
〜は、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、10よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列と相補的であり;
χ1は、隣接サブユニットのテザーとの結合を表し;及び
χ2は、テザー間結合を表す。)。 - 標的核酸を配列決定するためのテンプレートに方向づけられた合成における使用のためのオリゴマー基質構築物であって、第一及び第二のプローブ部分の各々がテンプレートに方向づけられた合成に適した末端基を有する該第二のプローブ部分へ結合された第一のプローブ部分、並びに、該第一及び第二のプローブ部分の少なくとも1つに結合されているテザーの少なくとも第一末端を有する第一末端及び第二末端を有するテザーを含み、ここで該オリゴマー基質構築物は、テンプレートに方向づけられた合成において使用される場合、拘束されたエクスパンドマーを含み、かつ該標的核酸の全体又は一部の連続ヌクレオチド配列に対応する配列に共役された複数のサブユニットを有する娘鎖を形成することが可能であり、ここで該個々のサブユニットは、テザー、該第一及び第二のプローブ部分、並びに少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を含む、前記オリゴマー基質構築物。
- 標的核酸を配列決定するためのテンプレートに方向づけられた合成における使用のためのモノマー基質構築物であって、テンプレートに方向づけられた合成に適した末端基を有する核酸塩基、並びに、該核酸塩基残基に結合されているテザーの少なくとも第一末端を有する第一末端及び第二末端を有するテザーを含み、ここで該モノマー基質構築物は、テンプレートに方向づけられた合成において使用される場合、拘束されたエクスパンドマーを含む娘鎖を形成することが可能であり、該拘束されたエクスパンドマーは、該標的核酸の全体又は一部の連続ヌクレオチド配列に対応する配列に共役された複数のサブユニットを有し、ここで該個々のサブユニットは、テザー、該核酸塩基残基、及び少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を含む、前記モノマー基質構築物。
- テンプレート鎖と二重鎖化された娘鎖を含む、標的核酸を配列決定するためのテンプレートに方向づけられた合成における使用のための二重鎖娘鎖であって、該娘鎖は、拘束されたエクスパンドマーを含み、かつ該標的核酸の全体又は一部の連続ヌクレオチド配列に対応する配列に共役された複数のサブユニットを有し、ここで該個々のサブユニットは、テザー、少なくとも1つのプローブ又は核酸塩基残基、及び少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を含む、前記二重鎖娘鎖。
- 下記構造を有する、請求項53記載の二重鎖娘鎖:
Tは、テザーを表し;
P1は、第一のプローブ部分を表し;
P2は、第二のプローブ部分を表し;
〜は、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を表し;
P1'は、P1が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
P2'は、P2が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;及び
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列と相補的である。)。 - 下記構造を有する、請求項53記載の二重鎖娘鎖:
Tは、テザーを表し;
P1は、第一のプローブ部分を表し;
P2は、第二のプローブ部分を表し;
〜は、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を表し;
P1'は、P1が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
P2'は、P2が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列と相補的であり;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。 - 下記構造を有する、請求項53記載の二重鎖娘鎖:
Tは、テザーを表し;
P1は、第一のプローブ部分を表し;
P2は、第二のプローブ部分を表し;
〜は、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を表し;
P1'は、P1が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
P2'は、P2が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列と相補的であり;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。 - 下記構造を有する、請求項53記載の二重鎖娘鎖:
Tは、テザーを表し;
P1は、第一のプローブ部分を表し;
P2は、第二のプローブ部分を表し;
〜は、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を表し;
P1'は、P1が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
P2'は、P2が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列と相補的であり;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。 - 下記構造を有する、請求項53記載の二重鎖娘鎖:
Tは、テザーを表し;
P1は、第一のプローブ部分を表し;
P2は、第二のプローブ部分を表し;
〜は、少なくとも1つの選択的に切断可能な結合を表し;
P1'は、P1が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
P2'は、P2が相補的であるテンプレート鎖の少なくとも1つのヌクレオチド残基の連続ヌクレオチド配列を表し;
κは、m個のサブユニットの鎖内のκ番目のサブユニットを表し、ここでmは、3よりも大きい整数であり;
αは、サブユニットモチーフのライブラリーから選択されたサブユニットモチーフの種を表し、ここで該種の各々は、該標的核酸の一部の連続ヌクレオチド配列と相補的であり;及び
χは、隣接サブユニットのテザーとの結合を表す。)。 - 標的核酸の全体又は一部の連続ヌクレオチド配列に対応する配列における遺伝情報を解析するための複数のテザー及びレポーターエレメントを含む、標的核酸を配列決定するためのテンプレートに方向づけられた合成における使用のための、エクスパンドマー。
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