JP2021509584A - 芳香族化合物による核酸重合の強化 - Google Patents

芳香族化合物による核酸重合の強化 Download PDF

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Abstract

本発明は、例えば、DNAテンプレートのナノ細孔ベースの単一分子シーケンシングのためのポリマーを生成させる、インビトロプライマー伸長によるDNA複製を含む、核酸重合を改善する化合物、方法、及び組成物に関する。核酸ポリメラーゼ反応組成物は、ヌクレオチド類似体を用いる場合の強化されたDNAポリメラーゼ活性を可能とし、シーケンシングへの応用のためのプライマー伸長生成物の改善した長さをもたらす重合強化部位を備える。【選択図】図１Ａ

Description

(配列表に関する記載)
本出願に関連する配列表が、紙での複写物の代わりにテキスト形式で提供され、これにより引用により本明細書に組み込まれる。該配列表が入ったテキストファイルの名称は、870225_423WO_SEQUENCE_LISTING.txtである。該テキストファイルは、14.9KBであり、2018年12月19日に作成されたものであり、EFS-Webを通じて電子的に提出されている。
(発明の分野)
本発明は、概して、新規化学物質に関し、より具体的には、無機成分を任意に有する新規有機分子(その組成物を含む)、並びにその生産のため、及び、特に、酵素の性能に影響を及ぼすことにおけるその利用のための方法に関する。
(背景)
生体分子の測定は、現代の医学の基盤であり、医学研究において、より具体的には、診断及び治療において、並びに創薬において広く用いられる。核酸は、生物が機能し生殖するのに必要な情報をコードしており、本質的に、生命の設計図である。そのような設計図を決定することは、純粋な研究においても、応用科学においても有用である。医学においては、シーケンシングは、がん、心疾患、自己免疫障害、多発性硬化症、及び肥満症を含む種々の病態の診断のため、及びそれらの治療を開発するのに使用し得る。産業においては、シーケンシングを、改善された酵素プロセス又は人工生物を設計するのに使用することができる。生物学においては、このツールを、例えば、生態系の健全性を研究するのに使用することができ、従って、広い範囲で有用である。同様に、タンパク質及び他の生体分子の測定は、疾患及び病原体の伝播のマーカー及び理解を提供している。
個人の特有のDNA配列は、ある疾患へのかかりやすさに関する価値ある情報を提供する。また、これは、患者に、早期発見のためのスクリーニングを行いかつ/又は予防的処置を受ける機会を提供する。更に、患者の個々の設計図が与えられれば、臨床医は、薬効を最大化しかつ/又は有害な薬物応答のリスクを最小化する個別化療法を実施することができるであろう。同様に、病原性生物の設計図を決定することは、感染性疾患の新たな治療及びより堅固な病原体の監視に繋がる可能性がある。低コストの全ゲノムDNAシーケンシングは、現代の医学に基盤を提供するであろう。本目的を達成するためには、シーケンシング技術は、処理量、正確度、及びリード長に関して改善され続けなければならない。
この10年間の間に、多数の次世代DNAシーケンシング技術が、商業的に利用可能となり、かつ全ゲノムをシーケンシングするコストを劇的に減少させている。これには、合成によるシーケンシング(「SBS」)プラットフォーム(Illumina社、454 Life Sciences、Ion Torrent、Pacific Biosciences)及び類似ライゲーション(analogous ligation)ベースのプラットフォーム(Complete Genomics、Life Technologies社)が含まれる。多様な試料処理及び検出方法を利用するいくつかの別の技術が開発中である。例えば、GnuBio社(Cambridge, Mass.)は、ピコリットルの反応容器を用いて、数百万の慎重なプローブシーケンシング反応を制御し、その一方で、Halcyon Molecular(Redwood City, Calif.)は、透過型電子顕微鏡を用いる直接的なDNA測定のための技術を開発する試みを行っていた。
ナノ細孔ベースの核酸シーケンシングは、広く研究されている関心をひいてやまないアプローチである。Kasianowiczら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13770-13773、1996)は、一本鎖ポリヌクレオチドを、脂質二重層に埋め込まれたアルファヘモリジンナノ細孔を通して電気的に移動させながら、それをキャラクタリゼーションした。ポリヌクレオチドを移動させる間に、ナノ細孔開口の部分的な閉塞を、イオン電流の低減として測定することができることが示された。しかしながら、ナノ細孔におけるポリヌクレオチドシーケンシングでは、かなりのバックグラウンドノイズに埋もれた小さいシグナル差を用いて間隔が詰まった塩基(0.34nm)を分離しなければならないことが負担となる。このナノ細孔における単一塩基の分離の測定上の難題は、通常、1マイクロ秒あたり1塩基のオーダーであるポリヌクレオチドに観察される速い移動速度のために、より大変なものとなる。移動速度を、いくつか例を挙げるならば電圧、塩組成、pH、温度、及び粘度などの実行パラメーターを調整することによって減少させることができる。しかしながら、そのような調整では、移動速度を、単一塩基の分離を可能とするレベルまで低下させることはできていない。
Stratos Genomicsは、DNAの配列を「エクスパンドマー(Xpandomer)」と呼ばれる測定可能なポリマー上に転写する生化学的プロセスを用いる拡張によるシーケンシング(「SBX」)と呼ばれる方法を開発している(Kokorisらの文献、米国特許第7,939,259号、「拡張によるハイスループット核酸シーケンシング」)。転写された配列は、〜10nm隔てられており、かつ高い信号対ノイズのよく区別された応答のために設計されている高い信号対ノイズのレポーターに、エクスパンドマー骨格に沿ってコード化される。これらの差は、ネイティブDNAと比較して、エクスパンドマーの配列リードの効率及び正確度の著しい性能強化を提供する。エクスパンドマーは、いくつかの次世代DNAシーケンシング検出技術を可能にすることができ、ナノ細孔シーケンシングにかなり適している。
エクスパンドマーは、合成の後にエクスパンドマー骨格が拡張されることを可能とする非常に長い置換基を特徴とする、XNTPと名付けられた非天然ヌクレオチド類似体から作製される(その全体が引用により本明細書に組み込まれている、KokorisらのPCT出願公開公報第WO2016/081871号を参照されたい)。その非定型的な構造のために、XNTP、及び他のヌクレオチド類似体(例えば、検出可能な標識部位で修飾されたヌクレオチド類似体)は、現在利用可能なDNAポリメラーゼの基質として新しい課題を持ち込む。その全体が引用により本明細書に組み込まれるKokorisらのPCT出願公開公報第WO2017/087281号及び第WO2018/204717号には、基質として非天然のかさ高いヌクレオチド類似体を利用する強化されたプライマー伸長活性を有する操作されたDP04ポリメラーゼバリアントが記載されている。
DNAテンプレートそれ自体の中では、あるヌクレオチド配列モチーフが、DNAポリメラーゼに対して複製に関する追加の課題を引き起こすことが知られている。特に重要なものは、スリップ鎖の誤対合、すなわち「複製スリップ(replication slippage)」を引き起こすことがある、ホモポリマーの連続(runs of homopolymers)、又は短い繰り返されたDNA配列である。複製スリップは、以下のステップ:(i)複製機構による第1の反復の複製、(ii)複製休止及び新たに合成された末端からのポリメラーゼの解離、(iii)該新たに合成された鎖の不対化、及びそれと第2の反復との対形成、並びに(iv)DNA合成の再開を含むと考えられている。従って、繰り返し領域内での複製機構の停止は、プライマー及びテンプレートの誤整列をもたらす。インビボでは、複製の間の2つのDNA鎖の誤整列は、さまざまな長さの欠失又は重複などのDNA再編成に繋がることがある。インビトロでは、複製スリップは、スリップ事象の場で複製のエラーをもたらす。このようなポリメラーゼ進行性又は正確度の減少は、特定の応用又は所望の遺伝子操作を顕著に損なう。
従って、非定型的な構造を有する1種以上の試薬を含む条件下でのポリメラーゼ反応を強化するための新たな方法及び組成物が、例えば、拡張によるシーケンシング(SBX)並びにバイオテクノロジー及び生体医学における他の応用(DNA増幅、従来のシーケンシング、標識化、検出、クローニングなど)において必要とされており、かつ当該技術分野において価値を見いだすであろう。本発明は、これらの要求を満たし、さらなる関連する利点を提供する。
背景セクションで論じられた全ての主題は、必ずしも先行技術であるわけではなく、単に背景セクションでそれを論じたことの結果として先行技術であるとみなされるべきではない。このように、背景セクションにおける先行技術で論じられているか又はそのような主題に関連する問題のいかなる認識も、明示的に先行技術であると述べられている場合を除き、先行技術として扱われるべきではない。その代わりとして、背景セクションにおけるいかなる主題の議論も、それ自体としても独創的であり得る特定の問題への発明者のアプローチの一部として扱われるべきである。
(概要)
手短にいうと、本開示は、核酸ポリメラーゼ活性を強化する化合物、組成物、及びそれらの使用を提供する。ある実施態様において、ポリメラーゼ活性が、該ポリメラーゼに対する1つ以上の課題を持ち込む条件、例えば、ポリメラーゼの進行性を損なう非天然のヌクレオチド類似体基質又はテンプレートモチーフを含む条件下での重合反応において強化される。そのような強化は、本明細書において、任意に、ポリメラーゼ強化分子又はPEMと称されることもある、1つ以上の本開示の化合物を、重合反応に追加することによって達成される。
一態様において、前記PEMは、式(I)の化合物(その溶媒和物、水和物、互変異性体、キレート、又は塩を含む)である:
Figure 2021509584
 (式中、各出現において独立に:mは、1、2、又は3であり;nは、0、1、又は2であり;pは、0、1、又は2であり;Ar1は、任意に置換されたアリールであり;Ar2は、5員及び6員の単環式芳香環、並びに一緒に縮合した2個の5員及び/又は6員の単環式環を含む9及び10員の縮合二環式環から選択され、ここで、該2個の縮合した単環式環の少なくとも一方は、芳香環であり、ここで、Ar2は、ハライド、C1-C6アルキル、C1-C6ハロアルキル、E-CO2R0、E-CONH2、E-CHO、E-C(O)NH(OH)、E-N(R0)2、及びE-OR0から選択される1個以上の置換基で任意に置換され、ここで、Eは、直接の結合及びC1-C6アルキレンから選択され;かつR0は、H、C1-C6アルキル、及びC1-C6ハロアルキルから選択され;Mは、水素、ハロゲン、及びC1-C4アルキルから選択され;かつLは、連結基である)。
一態様において、本開示は、核酸ポリメラーゼ反応を強化する方法であって、テンプレート核酸、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド及び/又はヌクレオチド類似体の混合物、少なくとも1種のPEMを含む核酸ポリメラーゼ反応組成物を形成させる工程;及び該核酸ポリメラーゼ反応組成物を、核酸重合反応を可能とする条件下でインキュベートする工程を含む、前記方法を提供する。前記PEMは、核酸ポリメラーゼ反応の進行性、速度、及び/又は忠実度を増加させる。一実施態様において、前記少なくとも1種のPEMは、結果として得られる核酸生成物の長さを、該PEMを欠く核酸ポリメラーゼ反応と比較して増加させる。
追加の実施態様において、核酸ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼである。ある実施態様において、DNAポリメラーゼは、DPO4又はそのバリアントである。別の実施態様において、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物は、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含むヌクレオチド類似体の混合物であり、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、及びポリマー性のテザー部位を含み、該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該ポリマー性のテザー部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている。ある実施態様において、前記核酸重合反応が、ヌクレオチド類似体の拡張可能なポリマーを生じさせ、ここで、該拡張可能なポリマーが、前記テンプレート核酸の核酸塩基配列情報をコードする。別の実施態様において、前記核酸重合反応を可能とする条件は、好適な重合バッファー及びオリゴヌクレオチドプライマーを含む。さらなる実施態様において、前記好適なバッファーは、Tris OAc、NH4OAc、PEG、DMF、NMP、及びアセトンなどの水混和性有機溶媒、ポリホスフェート60、並びにMnCl2のうちの1つ以上、例えば、これらのそれぞれを含む。別の実施態様において、前記反応混合物は、核酸インターカレート剤をさらに含む。別の実施態様において、前記反応混合物は、ポリアニオン認識部位をさらに含む。さらなる実施態様において、前記ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物は、検出可能な標識を含むヌクレオチド類似体を含む。さらに別の実施態様において、前記検出可能な標識は、発光標識、化学発光標識、蛍光標識、蛍光発生標識、発色団標識、又は発色性標識からなる群から選択される光学的に検出可能な標識である。
別の態様において、本開示は、少なくとも1種のPEM及びヌクレオチド類似体の混合物を含む組成物を提供する。この組成物は、例えば、ポリメラーゼと組み合わされた場合に有用であり、ここで、該少なくとも1種のPEMは、テンプレート依存性重合反応の間に娘鎖に取り込まれるヌクレオチド類似体の数及び正確度を、該少なくともPEMが存在しない同一の重合反応と比較して増加させる。別の実施態様において、前記少なくとも1種のPEMは、複数のPEMを含む。
任意に、前記ヌクレオチド類似体の混合物は、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含み、ここで、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該重合体のエーテル部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている。別の実施態様において、前記組成物は、Tris OAc、NH4OAc、PEG、DMF及びNMPなどの水混和性有機溶媒、ポリホスフェート60、N-メチルコハク酸イミド(NMS)、並びにMnCl2のうちの少なくとも1種、例えば、2種、3種、4種など、又はこれらのそれぞれを含むバッファーをさらに含む。別の実施態様において、前記組成物は、一本鎖結合タンパク質(SSB)をさらに含む。別の実施態様において、前記組成物は、尿素をさらに含む。ある実施態様において、前記ヌクレオチド類似体の混合物は、検出可能な標識を含むヌクレオチド類似体を含む。ある実施態様において、前記検出可能な標識は、発光標識、化学発光標識、蛍光標識、蛍光発生標識、発色団標識、又は発色性標識からなる群から選択される光学的に検出可能な標識である。
別の態様において、本発明は、DNAテンプレートをシーケンシングする方法であって、該DNAテンプレート、該テンプレートと複合体を形成する複製プライマー、DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物、及び少なくとも1種のPEMを含むDNAポリメラーゼ反応組成物を形成させる工程、DNA重合反応を可能とする条件下で該DNAポリメラーゼ反応組成物をインキュベートする工程を含み、該少なくとも1種のPEMが、該DNAポリメラーゼ反応の速度、忠実度、又は進行性を増加させる、前記方法を提供する。該方法は、結果として得られるヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のポリマー内の該ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の配列を決定する工程をさらに含み得る。前記PEMは、式(I)の化合物と記載されることもある。ある実施態様において、前記少なくとも1種のPEMは、式(II)の化合物から選択される。別の実施態様において、前記ヌクレオチド類似体の混合物は、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含み、ここで、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該重合体のエーテル部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている。別の実施態様において、前記DNAポリメラーゼは、DPO4又はそのバリアントである。別の実施態様において、前記結果として得られるヌクレオチド類似体のポリマーは、拡張可能なポリマーである。別の実施態様において、前記方法は、前記拡張可能なポリマーを、ホスホロアミデート切断剤と接触させて、拡張されたヌクレオチド類似体のポリマーを生成させる工程をさらに含む。ある実施態様において、前記ヌクレオチド類似体のそれぞれの前記ポリマー性のテザー部位は、該類似体の核酸塩基に対して一意的なレポーター部位を含む。別の実施態様において、前記レポーター部位は、特有の電子信号を生じさせる。さらに別の実施態様において、前記ヌクレオチド類似体の配列を決定する工程は、ナノ細孔を通して前記拡張されたヌクレオチド類似体のポリマーを移動させる工程を含む。
従って、一実施態様において、本開示は、PEM及びポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。別の実施態様において、本開示は、PEM及びポリペプチド、例えば、酵素などのポリペプチドを含む組成物を提供し、ここで、該酵素は、核酸ポリメラーゼであってもよい。
以下は、本開示の一部の例示的な特定かつ番号付けした実施態様である。以下に示される例示的なAr1構造の一部において「k」で指定される位置は、括弧、すなわち、「( )」内のトリアゾール環、が、mが、2である場合にAr1環に結合する位置である。同じく、別段の明確な言及がある場合を除き、化学式において特定される各原子は、該原子の同位体のいずれかであり得る。例えば、C(炭素)という指定は、12C、13C、又は14C、及びそれらの混合物、特に、天然存在量の同位体混合物を含み、一方で、H(水素)は、1H、2H、及び3H、並びにそれらの混合物を含み、かつO(酸素)は、16O及び18O並びにそれらの混合物を含み、かつN(窒素)は、14N及び15N並びにそれらの混合物を含み、他の原子についても同様である:
1) 式(I)の化合物:
Figure 2021509584
 (式中、各出現において独立に:mは、1、2、又は3であり;nは、0、1、又は2であり;pは、0、1、又は2であり;Ar1は、任意に置換されたアリールであり;Ar2は、5員及び6員の単環式芳香環、並びに一緒に縮合した2個の5員及び/又は6員の単環式環を含む9及び10員の縮合二環式環から選択され、ここで、一緒に縮合した該2つの単環式環の少なくとも一方は、芳香環であり、ここで、Ar2は、ハライド、C1-C6アルキル、C1-C6ハロアルキル、E-CO2R0、E-CONH2、E-CHO、E-C(O)NH(OH)、E-N(R0)2、及びE-OR0から選択される1個以上の置換基で任意に置換され、ここで、Eは、直接の結合及びC1-C6アルキレンから選択され;かつR0は、H、C1-C6アルキル、及びC1-C6ハロアルキルから選択され;Mは、水素、ハロゲン、及びC1-C4アルキルから選択され;かつLは、連結基である;)又はその溶媒和物、水和物、互変異性体、キレート、もしくは塩。
2) nが、0であり、かつmが、2であり、以下の式:
Figure 2021509584
 を有する、実施態様1記載の化合物。
3) Ar1が、単環式炭素環式アリールである、実施態様1又は2記載の化合物。
4) mが、2であり、かつAr1が、以下:
Figure 2021509584
 から選択される、実施態様1又は2又は3記載の化合物。
5) Ar1が、単環式ヘテロ環式アリールである、実施態様1又は2記載の化合物。
6) mが、2であり、かつAr1が、以下:
Figure 2021509584
 から選択される、実施態様1又は2又は5記載の化合物。
7) Ar1が、二環式アリールである、実施態様1又は2記載の化合物。
8) mが、2であり、かつAr1が、以下:
Figure 2021509584
 から選択される二環式炭素環式アリールである、実施態様1又は2記載の化合物。
9) Ar1が、以下:
Figure 2021509584
 から選択される二環式ヘテロ環式アリールである、実施態様1又は2記載の化合物。
10) Ar1が、三環式アリールである、実施態様1又は2記載の化合物。
11)Ar1が、以下:
Figure 2021509584
 から選択される三環式炭素環式アリールである、実施態様1又は2記載の化合物。
12) Ar1が、以下:
Figure 2021509584
 から選択される三環式ヘテロアリールである、実施態様1又は2記載の化合物。
13) Ar1が、以下:
Figure 2021509584
 から選択される三環式ヘテロアリールである、実施態様1又は2記載の化合物。
14) Ar1が、非置換アリールである、実施態様1〜13のいずれか1つ記載の化合物。
15) Ar1が、置換アリールである、実施態様1〜13のいずれか1つ記載の化合物。
16) Ar1上の少なくとも1個の置換基が、ハロゲン、ヒドロキシル、メルカプタン、ニトロ、及びニトリルからなる群から選択される、実施態様15記載の化合物。
17) Ar1上の少なくとも1個の置換基が、-SOR1、-S(O)2R1、-S(O)2NR2R3、-OR1、-OC(O)R3、-C(O)OR3、-C(O)R1、-C(O)NR2R3、-NR2R3、-N(R3)C(O)R1、及び-NS(O)2R3からなる群から選択され;かつR1の各出現が、独立に、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のシクロアルキル、置換又は非置換のヘテロシクリル、置換又は非置換のアリール、及び置換又は非置換のヘテロアリールからなる群から選択され;かつR2及びR3の各出現が、独立に-H、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のシクロアルキル、置換又は非置換のヘテロシクリル、置換又は非置換のアリール、及び置換又は非置換のヘテロアリールからなる群から選択される、実施態様15記載の化合物。
18) Ar1上の少なくとも1個の置換基が、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のアルケニル、置換又は非置換のアルキニル、置換又は非置換のシクロアルキル、置換又は非置換のヘテロシクリル、置換又は非置換のアリール、置換又は非置換のヘテロアリール、置換又は非置換のアリールアルキル、置換又は非置換のヘテロアリールアルキル、置換又は非置換のハロアルキル、及び置換又は非置換のハロアルコキシからなる群から選択される、実施態様15記載の化合物。
19) Ar1上の少なくとも1個の置換基が、-R4-H(式中、R4は、1個以上のヘテロ原子で中断されたアルキレンであり、該ヘテロ原子は、O、S、NH、又はそれらの組み合わせである)からなる群から選択される、実施態様15記載の化合物。
20) Ar1上の少なくとも1個の置換基が、-O-(C1-6アルキル)、C1-6アルキル、C1-6ハロアルキル、-CO2-C1-6アルキル、-CONH-C1-6アルキル、-CONH2、CN、及び-NO2からなる群から選択される、実施態様15記載の化合物。
21) Ar2が、チオフェン、1,2-チアゾール、1,3-チアゾール、フラン、1,2-オキサゾール、1,3-オキサゾール、1H-ピロール、1H-ピラゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、1,2,4-トリアゾール、1,2,3-トリアゾール、及び1H-イミダゾールからなる群から選択される5員の単環式芳香環である、実施態様1〜20のいずれか1つ記載の化合物。
22) Ar2が、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、及びピラジンからなる群から選択される6員の単環式芳香環である、実施態様1〜20のいずれか1つ記載の化合物。
23) Ar2が、ベンゾフラン、1,3-ベンゾオキサゾール、フロ[3,2-b]ピリジン、フロ[3,2-c]ピリジン、フロ[2,3-c]ピリジン、フロ[2,3-b]ピリジン、インドール、1H-ベンゾイミダゾール、1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン、1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン、1H-ピロロ[2,3-c]ピリジン、1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン、ベンゾチオフェン、1,3-ベンゾチアゾール、チエノール[3,2-b]ピリジン、チエノ[3,2-c]ピリジン、チエノ[2,3-c]ピリジン、ベンゾオキサジアゾール、ベンゾチアジアゾール、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾトリアゾール、及びチエノ[2,3-b]ピリジンからなる群から選択される9員の縮合二環式芳香環系である、実施態様1〜20のいずれか1つ記載の化合物。
24) Ar2が、ナフタレン、キノリン、キナゾリン、キノキサリン、1,5-ナフチリジン、1,6-ナフチリジン、1,7-ナフチリジン、1,8-ナフチリジン、イソキノリン、フタラジン、2,6-ナフチリジン、及び2,7-ナフチリジンからなる群から選択される10員の縮合二環式芳香環系である、実施態様1〜20のいずれか1つ記載の化合物。
25) Ar2が、以下:
Figure 2021509584
 (式中、置換基Gは、該ピリジニル環上に0個、1個、又は2個存在する)
から選択されるピリジニル環である、実施態様1〜20のいずれか1つ記載の化合物。
26) Ar2が、以下:
Figure 2021509584
 (式中、置換基Gは、該フェニル環上に0個、1個、又は2個存在する)
の式のフェニル環である、実施態様1〜20のいずれか1つ記載の化合物。
27) Ar2が、以下:
Figure 2021509584
 から選択される置換フェニル環である、実施態様1〜20のいずれか1つ記載の化合物。
28) 前記Ar2上の置換が、アミノを含む、実施態様1〜24のいずれか1つ記載の化合物。
29) 前記Ar2上の置換が、メトキシを含む、実施態様1〜24のいずれか1つ記載の化合物。
30) 前記Ar2上の置換が、カルボン酸を含む、実施態様1〜24のいずれか1つ記載の化合物。
31) 前記Ar2上の置換が、-CH2-CO2-CH3を含む、実施態様1〜24のいずれか1つ記載の化合物。
32) Ar2上の置換が、トリフルオロメチルを含む、実施態様1〜24のいずれか1つ記載の化合物。
33) Ar2上の置換が、ヒドロキシルを含む、実施態様1〜24のいずれか1つ記載の化合物。
34) Ar2上の置換が、1個のカルボン酸及び1個のヒドロキシルである、実施態様1〜24のいずれか1つ記載の化合物。
35) Ar2上の置換が、1個のカルボン酸及び1個のトリフルオロメチルである、実施態様1〜24のいずれか1つ記載の化合物。
36) ヒドロキシル、カルボン酸、及びトリフルオロメチルのうちの少なくとも2つを含むAr2上の置換を有する、実施態様1〜24のいずれか1つ記載の化合物。
37) 以下の式:
Figure 2021509584
 の、実施態様1〜20のいずれか1つ記載の化合物。
38) 以下の式:
Figure 2021509584
 の、実施態様1〜20のいずれか1つ記載の化合物。
39) 以下の式:
Figure 2021509584
 の、実施態様1〜20のいずれか1つ記載の化合物。
40) 以下の式:
Figure 2021509584
 の、実施態様1〜20のいずれか1つ記載の化合物。
41) 以下の式:
Figure 2021509584
 の、実施態様1〜20のいずれか1つ記載の化合物。
42) キレートの形態である、実施態様1〜41のいずれか1つ記載の化合物。
43) 前記キレートが、銅キレートである、実施態様42記載の化合物。
44) 少なくとも4.9のlogPを有する、実施態様1〜41のいずれか1つ記載の化合物。
45) 実施態様1〜44のいずれか1つ記載の化合物、及び分子クラウディング剤を含む組成物。
46) 前記分子クラウディング剤が、ポリアルキレングリコールである、実施態様45記載の組成物。
47)実施態様1〜44のいずれか1つ記載の化合物、及び水性バッファーを含む組成物。
48) 前記水性バッファーが、水及びTris HClを含む、実施態様47記載の組成物。
49) 実施態様1〜44のいずれか1つ記載の化合物、及びポリヌクレオチドを含む組成物。
50) 前記ポリヌクレオチドが、一本鎖ポリヌクレオチドである、実施態様49記載の組成物。
51) 実施態様1〜44のいずれか1つ記載の化合物、及びタンパク質を含む組成物。
52) 前記タンパク質が、DNAポリメラーゼである、実施態様51記載の組成物。
53) 実施態様1〜44のいずれか1つ記載の化合物、及びヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物を含む組成物。
54) 核酸ポリメラーゼ反応を強化する方法であって:
a. 以下:
i. テンプレート核酸,
ii 核酸ポリメラーゼ、
iii. ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物、及び
iv. 実施態様1〜44のいずれか1つ記載の少なくとも1種の化合物
を含む核酸ポリメラーゼ反応組成物を形成させること;及び
b. 該核酸ポリメラーゼ反応組成物を、核酸重合反応を可能とする条件下でインキュベートすること
を含み、
該実施態様1〜44のいずれか1つ記載の少なくとも1種の化合物が、該核酸ポリメラーゼ反応の進行性、速度、又は忠実度を増加させる、前記方法。
55) 前記実施態様1〜44のいずれか1つ記載の化合物が、結果として得られる核酸生成物の長さを、該実施態様1〜44のいずれか1つ記載の化合物を欠く核酸ポリメラーゼ反応と比較して増加させる、実施態様54記載の方法。
56) 前記実施態様1〜44のいずれか1つ記載の少なくとも1種の化合物が、実施態様1〜44のいずれか1つ記載の複数の化合物を含む、実施態様54記載の方法。
57) 前記核酸ポリメラーゼが、DNAポリメラーゼである、実施態様54記載の方法。
58)前記DNAポリメラーゼが、DPO4又はそのバリアントである、実施態様57記載の方法。
59) 前記ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物が、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含むヌクレオチド類似体の混合物であり、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該ポリマー性のテザー部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている、実施態様54記載の方法。
60) 前記核酸重合反応が、ヌクレオチド類似体の拡張可能なポリマーを生じさせ、該拡張可能なポリマーが、前記テンプレート核酸の核酸塩基配列情報をコードする、実施態様54記載の方法。
61) 前記核酸重合反応を可能とする条件が、好適な重合バッファー及びオリゴヌクレオチドプライマーを含む、実施態様54記載の方法。
62) 前記好適なバッファーが、以下の群:Tris OAc、NH4OAc、PEG、水混和性有機溶媒、ポリホスフェート60、NMS、及びMnCl2から選択される成分を含む、実施態様54記載の方法。
63) 前記反応混合物が、一本鎖結合タンパク質をさらに含む、実施態様54記載の方法。
64) 前記反応混合物が、尿素をさらに含む、実施態様54記載の方法。
65) 前記ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物が、検出可能な標識を含むヌクレオチド類似体を含む、実施態様54記載の方法。
66) 前記検出可能な標識が、発光標識、化学発光標識、蛍光標識、蛍光発生標識、発色団標識、又は発色性標識からなる群から選択される光学的に検出可能な標識である、実施態様65記載の方法。
67) 実施態様1〜44のいずれか1つ記載の少なくとも1種の化合物、及びヌクレオチド類似体の混合物を含む、DNAポリメラーゼ反応の進行性、忠実度、又は速度を強化するための組成物。
68) 実施態様1〜44のいずれか1つ記載の少なくとも1種の化合物、及びヌクレオチド類似体の混合物を含む組成物であって、
該実施態様1〜44のいずれか1つ記載の少なくとも1種の化合物が、テンプレート依存性重合反応の間に娘鎖に取り込まれるヌクレオチド類似体の数及び正確度を、該実施態様1〜44のいずれか1つ記載の少なくとも1種の化合物がない場合の同一の重合反応と比較して増加させる、前記組成物。
69) 前記ヌクレオチド類似体の混合物が、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含み、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該重合体のエーテル部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている、実施態様68記載の組成物。
70) Tris OAc、NH4OAc、PEG、水混和性有機溶媒、ポリホスフェート60、NMS、及びMnCl2から選択される1種以上の成分を含むバッファーをさらに含む、実施態様68又は69記載の組成物。
71) 一本鎖結合タンパク質をさらに含む、実施態様68又は69記載の組成物。
72) 尿素をさらに含む、実施態様68又は69記載の組成物。
73) 前記ヌクレオチド類似体の混合物が、検出可能な標識を含むヌクレオチド類似体を含む、実施態様68又は69記載の組成物。
74) 前記検出可能な標識が、発光標識、化学発光標識、蛍光標識、蛍光発生標識、発色団標識、又は発色性標識からなる群から選択される光学的に検出可能な標識である、実施態様73記載の組成物。
75) 実施態様67〜74のいずれか1つ記載の少なくとも1種の組成物を含む、核酸テンプレートをシーケンシングするためのキット。
76) DNAテンプレートをシーケンシングする方法であって、以下の工程:
a. 以下:
i. DNAテンプレート、
ii. 該テンプレートと複合体を形成する複製プライマー、
iii. DNAポリメラーゼ、
iv. ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物、
v. 実施態様1〜44のいずれか1つ記載の少なくとも1種の化合物
を含むDNAポリメラーゼ反応組成物を形成させる工程;
b. DNA重合反応を可能とする条件下で該DNAポリメラーゼ反応組成物をインキュベートする工程であって、該実施態様1〜44のいずれか1つ記載の少なくとも1種の化合物が、該DNAポリメラーゼ反応の速度、忠実度、又は進行性を増加させる、前記工程;及び
c. 結果として得られるヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のポリマー内の該ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の配列を決定する工程
を含む、前記方法。
77) 前記ヌクレオチド類似体の混合物が、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含み、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該重合体のエーテル部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている、実施態様76記載の方法。
78) 前記DNAポリメラーゼが、DPO4又はそのバリアントである、実施態様76又は77記載の方法。
79) 前記結果として得られるヌクレオチド類似体のポリマーが、拡張可能なポリマーである、実施態様76又は77記載の方法。
80) 前記拡張可能なポリマーを、ホスホロアミデート切断剤と接触させて、拡張されたヌクレオチド類似体のポリマーを生成させる工程をさらに含む、実施態様79記載の方法。
81)前記ヌクレオチド類似体のそれぞれの前記ポリマー性のテザー部位が、該類似体の核酸塩基に対して一意的なレポーター部位を含む、実施態様76又は77記載の方法。
82) 前記レポーター部位が、特有の電子信号を生じさせる、実施態様77記載の方法。
83) 前記ヌクレオチド類似体の配列を決定する工程が、ナノ細孔を通して前記拡張されたヌクレオチド類似体のポリマーを移動させる工程を含む、実施態様77記載の方法。
以下のより詳細な説明を参照することによって、本発明の上で言及した特徴及び追加の特徴及びそれらを得る方法が明らかとなり、かつ発明が、最もよく理解されるであろう。本明細書で開示される全ての引例は、それぞれが個別に組み込まれているかのように、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
この簡単な概要は、さらに以下で詳細な説明に詳しく説明されるある概念を簡略化された形態で紹介するよう提供されている。別段の明示的な記載がある場合を除き、この簡単な概要は、特許請求される主題の重要又は必須の特徴を特定することを意図せず、また、これは、特許請求される主題の範囲を制限することを意図しない。
1つ以上の実施態様の詳細が、以下の説明に記載される。1つの例示的な実施態様に関連して例示される又は説明される特徴を、別の実施態様の特徴と組み合わせてもよい。従って、本明細書に記載されるさまざまな実施態様のうちのいずれかを組み合わせ、さらなる実施態様を提供することができる。実施態様の態様を改変し、必要であれば、本明細書で特定されるようなさまざまな特許、特許出願、及び刊行物の概念を採用して、なおさらなる実施態様を提供することができる。他の特徴、目的、及び利点は、明細書、図面、及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
(図面の簡単な説明)
本開示の例示的な特徴、その性質、及びさまざまな利点が、添付の図面及び以下のさまざまな実施態様の詳細な説明から明らかとなるであろう。非限定的かつ非網羅的な実施態様が、添付の図面を参照して説明される。図面では、同様な標識又は参照番号は、特に明記されない限り、さまざまな図の全体にわたって同様な部分を指す。図面において要素の大きさ及び相対的な位置は、必ずしも縮尺に合わせて描かれたものではない。例えば、さまざまな要素の形状は、図面の見やすさを改善するよう選択、拡大、及び配置される。描かれている要素の特定の形状は、図面での認識の容易さのために選択されている。
図1A、図1B、図1C、及び図1Dは、一般化されたXNTPの主要な特徴及びそれらの拡張によるシーケンシング(SBX)における使用を説明する簡約的な概略図である。
図2は、XNTPの一実施態様のさらなる詳細を説明する概略図である。
図3は、生物学的ナノ細孔を通過するエクスパンドマーの一実施態様を説明する概略図である。
図4は、プライマー伸長生成物を示すゲルである。
図5は、プライマー伸長生成物を示すゲルである。
図6A及び図6Bは、ナノ細孔から得た配列の整列されたリードの集団のヒストグラム表示である。
図7A及び図7Bは、ナノ細孔から得た配列の整列されたリードの集団のヒストグラム表示である。
図8は、プライマー伸長生成物を示すゲルである。
図9は、プライマー伸長生成物を示すゲルである。
図10は、プライマー伸長生成物を示すゲルである。
図11は、プライマー伸長生成物を示すゲルである。
図12は、プライマー伸長生成物を示すゲルである。
図13は、プライマー伸長生成物を示すゲルである。
図14は、プライマー伸長生成物を示すゲルである。
(発明の詳細な説明)
本発明は、以下の本発明の好ましい実施態様の詳細な説明及び本明細書に含まれる実施例を参照することによって容易に理解され得る。別段の説明がされている場合を除き、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本件開示が属する分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。
一態様において、本開示のPEMは、式(I)の化合物
Figure 2021509584
 (式中、各出現において独立に:
mは、1、2、又は3であり;
nは、0、1、又は2であり;
pは、0、1、又は2であり;
Ar1は、任意に置換されたアリールであり;
Ar2は、5員及び6員の単環式芳香環、並びに一緒に縮合した2個の5員及び/又は6員の単環式環を含む9及び10員の縮合二環式環から選択され、ここで、該2つの単環式環の少なくとも一方は、芳香環であり、ここで、
Ar2は、ハライド、C1-C6アルキル、C1-C6ハロアルキル、E-CO2R0、E-CONH2、E-CHO、E-C(O)NH(OH)、E-N(R0)2、及びE-OR0から選択される1個以上の置換基で任意に置換され、ここで
Eは、直接の結合及びC1-C6アルキレンから選択され;かつ
R0は、H、C1-C6アルキル、及びC1-C6ハロアルキルから選択され、
Mは、水素、ハロゲン、及びC1-C4アルキルから選択され;かつ
Lは、連結基である;)及び
その溶媒和物、水和物、互変異性体、キレート、又は塩である。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられる場合、別段の明記がない限り、以下の用語は、述べられた意味を有する。
本明細書で挙げられる一定の化学基には、示された化学基に認められるべき炭素原子の総数を示す省略表記が前置される。例えば;C1-C4アルキルは、C1-4アルキルと書かれることもあるが、少なくとも1個かつ最大で4個の炭素原子を有するアルキル基を言い、その一方で、C4-C12シクロアルキルアルキル(同様に、C4-12シクロアルキルアルキルと書かれることもある)は、合計で4〜12個の炭素原子を有するシクロアルキルアルキル基を言う。省略表示での炭素の総数は、記載された基の置換基に存在し得る炭素を含まない。例として、C1-C6アルキルは、1〜6個の炭素原子を含むアルキルラジカルを指し;C1-C6ハロアルキルは、1〜6個の炭素原子を含むハロアルキルラジカルを指し;C1-C6アルキレンは、1〜6個の炭素原子を含むアルキレンジラジカルを指す。
前述のものに加えて、本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられる場合、別段の明記がない限り、以下の用語は、述べられた意味を有する:
「アルキル」は、炭素及び水素原子のみからなり、不飽和を含まず、かつ示された数の炭素原子を任意に有する、例えば、1〜12個の炭素原子、1〜8個の炭素原子、又は1〜6個の炭素原子、又は1〜4個の炭素原子を有し、かつ単結合によって分子の残りに結合している、直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖ラジカルを指す。例は、メチル、エチル、n-プロピル、1-メチルエチル(イソ-プロピル)、n-ブチル、n-ペンチル、1,1-ジメチルエチル(t-ブチル)、3-メチルヘキシル、2-メチルヘキシルなどである。アルキル基に不飽和が導入される場合、結果として得られる基は、不飽和のアルキル基と呼ばれることもあり、ここで、不飽和アルキル基は、アルケニル基(少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を有する)及びアルキニル基(少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を有する)として一般に知られている。一実施態様において、明記されている場合、本開示の化合物におけるアルキル基は、不飽和アルキル基であってもよく、又は不飽和アルキル基を含んでいてもよい。
「アルケニル」は、炭素及び水素原子のみからなり、少なくとも1個の二重結合を含み、示された数の炭素、例えば、2〜12個の炭素原子、又は2〜8個の炭素原子、又は2〜6個の炭素原子、又は2〜4個の炭素原子を任意に有し、かつ単結合によって分子の残りに結合している直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖ラジカル基、例えば、エテニル、プロパ-1-エニル、ブタ-1-エニル、ペンタ-1-エニル、ペンタ-1,4-ジエニルなどを指す。
「アルキニル」は、炭素及び水素原子のみからなり、少なくとも1個の三重結合を含み、示された数の炭素を任意に有し、例えば、2〜12個の炭素原子、又は2〜8個の炭素原子、又は2〜6個の炭素原子、又は2〜4個の炭素原子を有し、かつ単結合によって分子の残りに結合している直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖ラジカル基、例えば、エテニル、プロパ-1-エニル、ブタ-1-エニル、ペンタ-1-エニル、ペンタ-1,4-ジエニルなどを指す。
「ハロ」は、ブロモ、クロロ、フルオロ、又はヨードを指す。
「ハロアルキル」は、上で定義されたような1個以上のハロラジカルによって置換された、上で定義されたようなアルキルラジカル、例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、2,2,2-トリフルオロエチル、1-フルオロメチル-2-フルオロエチル、3-ブロモ-2-フルオロプロピル、1-ブロモメチル-2-ブロモエチルなどを指す。同様に、「ハロアルケニル」は、本明細書で定義されるような1個以上のハロラジカルによって置換された、本明細書で定義されるようなアルケニルラジカルを指し、「ハロアルキニル」は、本明細書で定義されるような1個以上のハロラジカルによって置換された、本明細書で定義されるようなアルキニルラジカルを指す。
「アルキレン」又は「アルキレン鎖」は、分子の残りをラジカル基へと連結する、炭素及び水素のみからなり、不飽和を含まず、かつ示された数の炭素原子を任意に有する、直鎖又は分岐鎖の2価の炭化水素鎖を指す。例は、メチレン、エチレン、プロピレン、n-ブチレンなどである。アルキレン鎖は、単結合を介して分子の残りに結合しており、かつ単結合を介してラジカル基に結合している。アルキレン鎖の分子の残りへの結合点及びラジカル基への結合点は、鎖内の1個の炭素を介していても、任意の2個の炭素を介していてもよい。アルキル基と同様に、不飽和が、アルキレン鎖に導入されて、不飽和アルキレン鎖が提供されてもよい。不飽和が、アルキレン鎖に導入される場合、結果として得られる基は、不飽和アルキレン基又は鎖と呼ばれ得る。ここで、不飽和アルキレン鎖は、アルケニレン基(少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を有する)及びアルキニレン基(少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を有する)として一般に知られている。一実施態様において、明記されている場合、本開示の化合物におけるアルキレン鎖は、不飽和アルキレン鎖であり得るか、又はそれを含む。
「アルケニレン」又は「アルケニレン鎖」は、分子の残りをラジカル基へと連結する、炭素及び水素のみからなり、少なくとも1個の二重結合を含み、かつ示された数の炭素原子、例えば、2〜12個の炭素原子を任意に有する、直鎖又は分岐鎖の2価の炭化水素鎖を指す。アルケニレン基の例は、エテニレン、プロペニレン、n-ブテニレンなどである。アルケニレン鎖は、単結合を介して分子の残りに結合しており、二重結合又は単結合を介してラジカル基に結合している。アルケニレン鎖の分子の残りへの結合点及びラジカル基への結合点は、鎖内の1個の炭素を介していても、任意の2個の炭素を介していてもよい。
「アリール」は、任意に、O、S、及びNから選択される1〜6個のヘテロ環原子を含む少なくとも5個の環原子を含み、かつ少なくとも1個の芳香環を含む環系ラジカルを指す。5員の単環式芳香環は、炭素及びヘテロ原子から選択される5個の環原子を含み、6員の単環式芳香環は、炭素及びヘテロ原子から選択される6個の環原子を含む。例示的な5員の単環式芳香環は、ピロールであり、例示的な6員の単環式芳香環は、ピリジンである。アリールラジカルは、例えば、単環式、二環式、三環式、又は四環式の環系であってよく、これは、縮合又は架橋した環系を含み得る。炭素環式アリールラジカルは、環原子に炭素のみを含み、ここで、例としては、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、フルオランテン、フルオレン、as-インダセン、s-インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、フェナレン、フェナントレン、プレイアデン、ピレン、及びトリフェニレンから誘導されるアリールラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施態様において、アリールは、フェニル又はナフチルであり、別の実施態様においては、フェニルである。アリールラジカルが、非炭素環原子、例えば、酸素、硫黄、及び窒素を含む場合、該アリール基は、ヘテロアリール基と呼ばれることもある。該ヘテロアリールラジカルは、例えば、単環式、二環式、三環式、又は四環式の環系であってよく、これは、縮合又は架橋した環系を含み得る。ヘテロアリールラジカル内の窒素、炭素、又は硫黄原子は、任意に酸化されていてもよい;窒素原子は、任意に四級化されていてもよい。
「縮合した」は、環の間での縮合を含む環系を指し、ここで、縮合は、2個の隣接する環原子を共有している環を指す。一緒に縮合した2個の5員及び/又は6員の単環式環を含む縮合環は、各環が、単環式であり、かつ独立に5個又は6個いずれかの環原子を有し、かつ該2個の環が、それらが2個の環原子を共有するという点で縮合している二環式環系を指す。例えば、ナフタレンは、一緒に縮合した2個の6員の単環式環(ベンゼン)から形成された10員の縮合環系である。ナフタレンは、それが、2個(ビ(bi)=2)の環を含むという点で二環式(bicyclic)である。別の例として、1,3-ベンゾチアゾールは、一緒に縮合した1個の6員環(ベンゼン)及び1個の5員環(1,3-チアゾール)から形成された9員の縮合環系である。1,3-ベンゾチアゾールは、それが、2個の環を含むという点で二環式である。
「カルボシクリル」は、3〜18個の炭素原子からなる安定な3〜18員の芳香族又は非芳香族環ラジカルを指す。本明細書に明確に別段の記載がない限り、該カルボシクリルラジカルは、単環式、二環式、三環式、又は四環式の環系であってよく、これは、縮合又は架橋した環系を含み得、かつ部分飽和又は完全飽和であってもよい。非芳香族カルボシクリルラジカルには、シクロアルキルが含まれ、芳香族カルボシクリルラジカルには、アリールが含まれる。
「シクロアルキル」は、3〜15個の炭素原子、好ましくは、3〜10個の炭素原子を有する、縮合又は架橋した環系を含み得る、炭素及び水素原子のみからなり、かつ飽和又は不飽和でありかつ単結合によって分子の残りに結合している安定な非芳香族の単環式又は多環式炭化水素ラジカルを指す。単環式ラジカルとしては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが挙げられる。多環式ラジカルとしては、例えば、アダマンチル、ノルボルニル、デカリニル、7,7-ジメチル-ビシクロ-[2.2.1]ヘプタニルなどが挙げられる。
「ヘテロシクリル」は、2〜12個の炭素原子、及び窒素、酸素、及び硫黄からなる群から選択される1〜6個のヘテロ原子からなる安定な3〜18員の芳香族又は非芳香族環ラジカルを指す。本明細書に明確に別段の記載がない限り、該ヘテロシクリルラジカルは、単環式、二環式、三環式、又は四環式の環系であってよく、これは、縮合又は架橋した環系を含み得;かつ該ヘテロシクリルラジカル内の窒素、炭素、又は硫黄原子は、任意に酸化されていてもよく;窒素原子は、任意に四級化されていてもよく;かつ該ヘテロシクリルラジカルは、部分飽和又は完全飽和であってもよい。非芳香族ヘテロシクリルラジカルの例としては、ジオキソラニル、チエニル[1,3]ジチアニル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、2-オキソピペラジニル、2-オキソピペリジニル、2-オキソピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、4-ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾロピリミジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリオキサニル、トリチアニル、トリアジナニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、1-オキソ-チオモルホリニル、及び1,1-ジオキソ-チオモルホリニルが挙げられるが、これらに限定されない。
明記されている場合のみであるが、任意に、本開示のPEM化合物におけるアルキル、アルケニル、アルキレン、アルケニレン、カルボシクリル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、及びヘテロアリールのそれぞれは、アルキル、アルケニル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルケニル、シアノ、オキソ、チオキソ、ニトロ、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、-Rb-ORa、-Rb-OC(O)-Ra、-Rb-N(Ra)2、-Rb-C(O)Ra、-Rb-C(O)ORa、-Rb-C(O)N(Ra)2、-Rb-N(Ra)C(O)ORc、-Rb-N(Ra)C(O)Rc、-Rb-N(Ra)S(O)tRc(式中、tは、1〜2である)、-Rb-N=C(ORa)Ra、-Rb-S(O)tORc(式中、tは、1〜2である)、-Rb-S(O)sRc(式中、sは、0〜2である)、及び-Rb-S(O)tN(Ra)2(式中、tは、1〜2である)(ここで、各Raは独立に、水素、アルキル、アルケニル、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアリールアルキルであり;各Rbは、独立に、直接の結合、又は直鎖又は分岐鎖のアルキレンもしくはアルケニレン鎖であり;かつ各Rcは、アルキル、アルケニル、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアリールアルキルである)からなる群から選択される1個以上の非置換置換基(例えば、アルキル基上のアルキル置換基が、さらに置換されることはない、すなわち、該アルキル置換基は、非置換アルキルである)によって置換されていてもよい。
「アミノ」は、-NH2ラジカルを指す。「シアノ」は、-CNラジカルを指す。「ヒドロキシ」は、-OHラジカルを指す。「ニトロ」は、-NO2ラジカルを指す。「オキソ」は、=O置換基を指す。「チオキソ」は、=S置換基を指す。「トリフルオロメチル」は、-CF3ラジカルを指す。「トリフルオロメトキシ」は、-OCF3ラジカルを指す。メルカプタンは、チオールとしても知られるが、-SHラジカルを指す。
「アシル」は、ラジカル-C(O)Rを指し、これは、-C(=O)Rと記載されることもあり、ここで、Rは、アルキル、アラルキル、カルボシクリル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルである。例えば、Rが、メチルである場合、そのアシル基は、アセチルと称されることもある。
「アルコキシ」は、式-ORのラジカルを指し、ここで、Rは、アルキル又はハロアルキルラジカルである。一実施態様において、該アルコキシラジカルは、最大で6個の炭素原子を含む。代表的なアルコキシ基としては、メトキシ及びエトキシが挙げられる。ハロで置換されたアルコキシは、本明細書においてハロアルコキシと呼ばれることもあり、これには、例えば、トリフルオロメトキシ、トリクロロメトキシなどが含まれる。
「ヘテロアルケニレン」又は「ヘテロアルケニレン鎖」は、分子の残りをラジカル基へと連結する、炭素並びに水素並びにN、O、及びSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子からなる、直鎖又は分岐鎖の2価の炭化水素鎖を指す。
「ハロアルコキシ」は、上で定義されたような1個以上のハロラジカルによって置換されたアルコキシラジカル、例えば、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリクロロメトキシ、2,2,2-トリフルオロエトキシ、3-ブロモ-2-フルオロプロピルオキシなどを指す。該ハロアルコキシラジカルのアルコキシ部分は、アルコキシ基について上で定義したように、任意に置換されていてもよい。
「N-ヘテロシクリル」は、少なくとも1個の窒素を含むヘテロシクリルラジカルを指す。N-ヘテロシクリルラジカルは、ヘテロシクリルラジカルについて上で説明したように、任意に置換されていてもよい。
「ヘテロシクリルアルキル」は、式-RbRhのラジカルを指し、Rbは、上で定義したようなアルキレン鎖であり、かつRhは、上で定義したようなヘテロシクリルラジカルであり、かつ該ヘテロシクリルが、含窒素ヘテロシクリルである場合、該ヘテロシクリルは、窒素原子で該アルキルラジカルに結合していてもよい。該ヘテロシクリルアルキルラジカルのアルキレン鎖は、アルキレン鎖について上で定義したように、任意に置換されていてもよい。該ヘテロシクリルアルキルラジカルのヘテロシクリル部分は、ヘテロシクリル基について上で定義したように、任意に置換されていてもよい。
「N-ヘテロアリール」は、少なくとも1個の窒素を含む、上で定義したようなヘテロアリールラジカルを指し、ここで、分子の残りへの該ヘテロアリールラジカルの結合点は、該ヘテロアリールラジカル内の窒素原子を介するものである。N-ヘテロアリールラジカルは、ヘテロアリールラジカルについて上で説明したように、任意に置換されていてもよい。
「ヘテロアリールアルキル」は、式-RbRiのラジカルを指し、ここで、Rbは、上で定義したようなアルキレン鎖であり、かつRiは、本明細書で定義されるようなヘテロアリールラジカルである。該ヘテロアリールアルキルラジカルのヘテロアリール部分は、ヘテロアリール基について本明細書で定義されるように、任意に置換されていてもよい。該ヘテロアリールアルキルラジカルのアルキレン鎖部分は、アルキレン鎖について本明細書で定義されるように、任意に置換されていてもよい。同様に、アリールアルキル基は、ヘテロアリール部分が、対応する炭素環式アリール基で置き換えられている、すなわち、ヘテロ原子が、必要に応じた水素置換の調整を伴って炭素と置き換えられている、ヘテロアリールアルキル基を指す。
「ヒドロキシアルキル」は、式-RbOHのラジカルを指し、ここで、Rbは、本明細書で定義されるようなアルキレン鎖である。該-OH(ヒドロキシル、別名:ヒドロキシ)基は、アルキレン鎖内の任意の炭素に取り付けることができる。該ヘテロアリールアルキルラジカルのアルキレン鎖部分は、さらに、アルキレン鎖について上で定義したように、任意に置換されていてもよい。
酸性又は塩基性の基を有する本明細書に記載されるPEM化合物は、一般に、遊離酸又は遊離塩基として使用し得る。あるいは、酸性又は塩基性の基を有するPEM化合物を、塩、例えば、酸又は塩基付加塩の形態で用いてもよい。遊離アミノ化合物の酸付加塩は、当技術分野において周知の方法で調製され得、かつ、有機及び無機酸から形成され得る。好適な有機酸としては、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、プロピオン酸、酒石酸、サリチル酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、マンデル酸、ケイ皮酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、グリコール酸、グルタミン酸、及びベンゼンスルホン酸が挙げられる。好適な無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、及び硝酸が挙げられる。塩基付加塩は、カルボキシレートアニオンと形成する塩を含み、かつアルカリ及びアルカリ土類金属(例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、バリウム、及びカルシウム)、並びにアンモニウムイオン及びその置換誘導体(例えば、ジベンゾイルアンモニウム、ベンジルアンモニウム、2-ヒドロキシエチルアンモニウムなど)から選択されるものなどの有機及び無機カチオンと形成される塩を含む。従って、本明細書に記載されるPEM化合物の「塩」という用語は、任意かつ全ての塩形態を包含することが意図される。
本開示のPEM化合物は、キレートの形態であってもよい。キレートは、2点以上で中心金属原子に結合した有機リガンド(トリアゾール-Ar基など)を含む化合物を指す。
立体異性体に関して、本明細書に記載されるPEM化合物は、1個以上のキラル(又は不斉)中心を有し得、従って、絶対立体化学の観点から(R)-又は(S)-として規定され得る、エナンチオマー、ジアステレオマー、及び他の立体異性形態を生じさせ得る。本明細書に記載される化合物が、オレフィン性二重結合又は別の幾何不斉中心を含む場合、別途指定されない限り、該化合物が、E及びZ幾何異性体(例えば、cis又はtrans)の双方を含むことが意図される。同様に、別途示されない限り、全ての可能な異性体、並びにそれらのラセミ体及び光学的に純粋な形態、並びに全ての互変異性体もまた、含まれることが意図される。従って、さまざまな立体異性体及びそれらの混合物が、その分子が、互いに重ね合わせることができない鏡像である2つの立体異性体を指す「エナンチオマー」を含むことが想定される。従って、化合物は、ラセミ化合物、ラセミ混合物を含む任意の異性体形態で、及び個々のエナンチオマー又はジアステレオマーとして存在し得る。
更に、PEM化合物の結晶形の一部は、多形として存在することがあり、これは、本明細書で想定される。加えて、PEM化合物の一部は、水又は他の有機溶媒との溶媒和物を形成することもある。そのような溶媒和物は、同様に、本明細書に記載される化合物の範囲内に含まれる。
当業者であれば理解するであろうが、上述の化合物はいずれも、放射性同位体を組み込み得る。従って、1個以上の原子が、自然界で通常みられる原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有する原子で置き換えられた、本明細書に記載されるものと同一の同位体標識された化合物の使用も想定される。これらの化合物に組み込むことができる同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン(phosphorous)、フッ素、及び塩素の同位体が挙げられる。従って、水素(H)又は炭素(C)などの元素への言及は、該元素の全ての同位体を包含することが意図される。例えば、C(炭素)という指定は、12C、13C、又は14C及びそれらの混合物を含み、H(水素)は、1H、2H、及び3H、並びにそれらの混合物を含み、O(酸素)は、16O及び18O並びにそれらの混合物を含み、N(窒素)は、14N及び15N並びにそれらの混合物を含み、他の原子についても同様である。同位体標識されたPEM化合物は、それらのアッセイなどでの使用の間にPEM化合物又はその一部を追跡するのに有用であり得る。
式(I)のPEM化合物において、Ar1は、芳香族部位とも称されるアリール基である。該芳香族部位は、炭素環式芳香族部位であってもヘテロ環式芳香族部位であってもよく、ここで、炭素環式芳香族部位では、各芳香環原子は炭素であり、ヘテロ環式芳香族部位では、芳香環原子のうちの少なくとも1個は、窒素、酸素、又は硫黄である。
一実施態様において、Ar1は、1〜6個の環を含んでもよく、ここで、該環原子のうちの6個までが、酸素、硫黄、及び窒素から選択されてもよく、残りは、炭素原子である。任意に、Ar1部位は、1〜5個の環を含んでもよく、ここで、該環原子のうちの5個までが、酸素、硫黄、及び窒素から選択されてもよい。別の選択肢として、Ar1基は、1〜4個の環を含んでもよく、ここで、該環原子のうちの4個までが、酸素、硫黄、及び窒素から選択されてもよい。さらに別の選択肢として、Ar1部位は、1〜3個の環を含んでもよく、ここで、該環原子のうちの3個までが、酸素、硫黄、及び窒素から選択されてもよい。さらなる例として、Ar1は、1〜2個の環を含んでもよく、ここで、該環原子のうちの3個までが、酸素、硫黄、及び窒素から選択されてもよい。いかなる場合でも、各環は、独立に、5員環(すなわち、5個の環原子が、該環を形成する)、又は6個環、又は7員環であってよく、その一方で、ある選択肢において、前記環のそれぞれは、5員環又は6員環のいずれかである。
例示的な芳香族部位は、炭素環式芳香族部位である。該炭素環式部位は、1個(例えば、ベンゼン)又は2個(例えば、ナフタレン、アズレン)、又は3個(例えば、アセナフチレン、フルオレン)、又は4個(例えば、フルオランテン、アセアントリレン)、又は5個(例えば、ペンタセン、ピセン)、又は6個(例えば、ヘキサセン)の芳香環を含んでもよく、ここで、便宜上、Ar1基は、それらの非置換体(例えば、ベンゼン)を挙げることによって本明細書で例示されることがあるが、本開示の化合物においては、該Ar1基は、対応するラジカルであり、例えば、mが、2であり、かつAr1が、その他の点では非置換である場合は、2個の環水素が、トリアゾール基と置き換えられる。例えば、芳香族部位は、単環式炭素環式部位、すなわち、C6芳香族部位とも称されるフェニルであり得る。別の例として、芳香族部位は、二環式炭素環式部位、例えば、C10芳香族部位であるナフチルであり得る。
例示的なAr1芳香族部位は、ヘテロアリール基と呼ばれることもある、ヘテロ環式芳香族部位である。ヘテロ環式部位は、1又は2又は3又は4又は5又は6個のヘテロ原子、すなわち、窒素、硫黄、及び酸素原子から選択される炭素以外の原子を含むことに加えて、1個又は2個又は3個又は4個又は5個又は6個の芳香環を含んでもよい。任意に、該ヘテロ原子は、存在するのであれば、窒素である。例えば、芳香族部位は、単環式ヘテロ環式部位、例えば、6員のC5芳香族部位であるピリジニル、又は6員のC4芳香族部位であるピラジニルであり得る。別の例として、芳香族部位は、二環式ヘテロ環式部位、例えば、10員のC9芳香族部位であるキノリニルもしくはイソキノリニル、又は例示的な10員のC8芳香族部位である1,5-ナフチリジニル、2,6-ナフチリジニル、もしくは2,7-ナフチリジニルであり得る。
このように、ヘテロアリール基は、5個以上の環員を含み、そのうちの1個以上が、これらに限定されないが、N、O、及びSなどのヘテロ原子である芳香環化合物である。C2-ヘテロアリールと呼ばれるヘテロアリール基は、２個の炭素原子及び3個のヘテロ原子を有する5員環、2個の炭素原子及び4個のヘテロ原子を有する6員環などとすることができる。同様に、C4-ヘテロアリールは、1個のヘテロ原子を有する5員環、2個のヘテロ原子を有する6員環などとすることができる。炭素原子の数＋ヘテロ原子の数は、合計で、環原子の総数と等しくなる。ヘテロアリール基としては、ピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、ピリジニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、インドリル、アザインドリル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、アザベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、イミダゾピリジニル、イソオキサゾロピリジニル、チアナフタレニル、プリニル、キサンチニル、アデニニル、グアニニル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、キノキサリニル、及びキナゾリニル基などの基が挙げられるが、これらに限定されない。このように、「ヘテロアリール」及び「ヘテロアリール基」という用語は、必ずしも全ての環ではないが、少なくとも1個の環が、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、インドリル、及び2,3-ジヒドロインドリルなどの芳香族であるものなどの縮合環化合物を含む。
Ar1が、2個のトリアゾール-Ar2部位で必ず置換されるようにmが、2である場合、Ar1芳香族部位の任意の2個の炭素が、これら2個のトリアゾール-Ar2部位のうちの1個で置換され得る。例えば、Ar1が、置換ベンゼンである場合、Ar1は、以下に示されるようにオルト、メタ、又はパラ位で置換され得、ここで、kは、置換が芳香族部位上のどこで起こるかを指定する:
Figure 2021509584
 。
別の例として、Ar1が、置換ナフタレンであり、かつmが、2である場合、Ar1は、任意の2個のナフチル炭素原子の場所で置換され得、ここで、以下の構造は、置換の選択肢を示し、kは、芳香族部位上のどこで(トリアゾール-Ar2)によって提供されるトリアゾール置換が起こり得るかを示す
Figure 2021509584
 。
上記の例は、例示的なAr1部位として炭素環式芳香族Ar1基を用いて、Ar1上のトリアゾール置換を例示した。しかしながら、同じ原理が、ヘテロ環式芳香族Ar1基上のトリアゾール置換に当てはまる。例えば、Ar1が、置換ピリジンであり、かつmが、2である場合、(トリアゾール-Ar2)の2個のトリアゾール基は、ピリジン環上の以下の位置のうちの任意の位置に配置され得るここで、kは、トリアゾール基が配置され得る位置を指定するのに用いられる:
Figure 2021509584
 。
従って、例示的な一実施態様において、Ar1は、以下
Figure 2021509584
 (ここで、トリアゾール環は、Ar1上の位置kで置換される)
から選択される、単環式ヘテロ芳香族構造である。別の例示的な実施態様において、Ar1は、
Figure 2021509584
 (ここで、トリアゾール環は、Ar1上の位置kで置換される)
から選択される単環式炭素環式構造である。別の例示的な実施態様において、Ar1は、
Figure 2021509584
 (ここで、トリアゾール環は、Ar1上の位置kで置換される)
から選択される二環式炭素環式構造である。別の実施態様において、Ar1は、2個の6員環及び1個の5員環を有し、かつ1個の窒素環原子を有し、かつ
Figure 2021509584
 (ここで、トリアゾール環は、Ar1上の位置kで置換される)
から選択される、多環式ヘテロ環式構造である。さらに別の例示的な実施態様において、Ar1は、3個の6員環及び2個の窒素環原子を有し、かつ
Figure 2021509584
 (ここで、トリアゾール環は、Ar1上の位置kで置換される)
から選択される、多環式ヘテロ環式構造である。
Ar1は、本明細書に記載されるような置換型及び無置換型芳香族部位の双方を含む。一実施態様において、Ar1は、置換型芳香族部位である。一実施態様において、Ar1は、無置換型芳香族部位であって、これは、非置換型芳香族部位とも呼ばれる。置換型芳香族部位においては、環原子に結合していたであろう1個以上の水素原子が、置換基と置き換えられており、例えば、任意に、水素原子のうちの1個、又は2個、又は3個、又は4個、又は5個、又は6個が、置換基と置き換えられ得る。Ar1上の置換基は、mが、1に等しい場合に必然的に存在するトリアゾール-Ar2部位を指すことも、mが、2に等しい場合に必然的に存在する2個のトリアゾール-Ar2部位を指すことも、mが、3に等しい場合に必然的に存在する3個のトリアゾールAr2部位を指すこともない。
一実施態様において、Ar1上の置換基は、存在するのであれば、重水素、ハロゲン(F、Cl、Br、I)、炭素、窒素、酸素、及び硫黄から選択される原子からなるであろうし、また、任意に、水素を含むであろうし、また、対イオンを形成する追加の原子を含むであろう。重水素及びハライドは、1価原子とみなされ、一方で、炭素、窒素、酸素、及び硫黄は、それらが、2つ以上の共有結合を同時に形成する能力があるという理由で、多価原子とみなされる。1価の原子に加えて、Ar1上の置換基は、複数の多価原子、例えば、1〜25個の多価原子、又は1〜20個の多価原子、又は1〜15個の多価原子、又は1〜10個の多価原子、又は1〜5個の多価原子を有していてもよく、該原子は、任意に、炭素、窒素、酸素、及び硫黄から選択される。最大で10個の多価原子を有する置換基の実例を、以下に提供する。最大で25個の多価原子を有する置換基を含む他の置換基も、類推によって、当業者に公知である。
一実施態様において、Ar1上の置換基は、0個の多価原子を含む。この実施態様において、環原子に結合した水素は、重水素、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素などの別の1価の原子と置き換えられている。
一実施態様において、Ar1上の置換基は、1個の多価原子を含む。この実施態様において、Ar1の環原子に結合した1個以上の水素原子が、単一の多価原子と置き換えられ、ここで、該多価原子上の空いている原子価は、1個以上の1価の原子で埋められる。例としては、ヒドロキシル(OH)、チオール(SH)、アミノ(NH2)、メチル(CH3)、及びメチレン(=CH2)が挙げられ、これらの完全に又は部分的にハロゲン化されたもの及び重水素化されたもの、例えば、CF3も含まれる。
一実施態様において、Ar1上の置換基は、2個の多価原子を含む。この実施態様において、Ar1の環原子に結合した1個以上の水素原子は、第1の多価原子と置き換えられ、これは、次いで、第2の多価原子に結合し、従って、2個の多価原子から形成される置換基をもたらす。ここで、該多価原子上の空いている原子価は、1個以上の1価の原子で埋められる。これらの置換基の例は、当業者に周知である。具体例としては、エチル(CH2CH3)、エチレン(CH=CH2)、エチニル(C≡CH)、エチリデン(=CHCH3)、アミノメチル(CH2NH2)、アミノメチレン(=CHNH2)、チオメチレン(=CHSH)、ヒドロキシメチレン(=CHOH)、ヒドロキシメチル(CH2OH)、チオメチル(CH2SH)、N-メチルアミン(NHCH3)、メチルスルフィド(SCH3)、メトキシ(OCH3)、ニトリル(CN)、ホルミル(C(O)H)、チオホルミル(C(S)H)、N-ヒドロキシ(N-OH)、ヒドロキシルアミン(ONH2)、ヒドラジン(NHNH2)、ジアジン(N=NH)、ジアゾニウム(N≡N)が挙げられ、これには、これらの完全に又は部分的にハロゲン化されたもの及び重水素化されたもの、例えば、OCF3及びCH2CD3も含まれる。
一実施態様において、Ar1上の置換基は、3個の多価原子を含む。この実施態様において、Ar1の環原子に結合した1個以上の水素原子は、第1の多価原子と置き換えられ、これは、次いで、第2及び第3の多価原子のそれぞれに直接又は間接的に結合し;従って、第1の多価原子が、第2の多価原子に結合し、かつ第3の多価原子が、第1及び第2の多価原子のいずれか又は双方に結合し、従って、3個の多価原子から形成される置換基をもたらす。ここで、該多価原子上の空いている原子価は、1個以上の1価の原子で埋められる。これらの置換基の例は、当業者に周知であり、かつ本明細書で提示される。例えば、ニトロ、メチルケトン、カルボキシルである。
一実施態様において、Ar1上の置換基は、4個の多価原子を含む。この実施態様において、Ar1の環原子に結合した1個以上の水素原子は、第1の多価原子と置き換えられ、これは、次いで、第2、第3、及び第4の多価原子のそれぞれに直接又は間接的に結合し、従って、4個の多価原子から形成される置換基をもたらす。ここで、該多価原子上の空いている原子価は、1個以上の1価の原子で埋められる。これらの置換基の例は、当業者に周知であり、かつ本明細書で提示される。例えば、メチルエステル(CO2CH3)、N-メチルカルボキサミド(C(O)NHCH3)、及びアセトアミド(NHC(O)CH3)である。
一実施態様において、Ar1上の置換基は、5個の多価原子を含む。この実施態様において、Ar1の環原子に結合した1個以上の水素原子は、第1の多価原子と置き換えられ、これは、次いで、第2、第3、第4、及び第5の多価原子のそれぞれに直接又は間接的に結合し、従って、5個の多価原子から形成される置換基をもたらす。ここで、該多価原子上の空いている原子価は、1個以上の1価の原子で埋められる。これらの置換基の例は、当業者に周知であり、かつ本明細書で提示される。例えば、エチルエステル(CO2CH2CH3)、S-エチルカルボチオエート(C(O)SCH2CH3)、N-エチルカルボキサミド(C(O)NHCH2CH3)、及びN,N-ジメチルカルボキサミド(C(O)N(CH3)2)である。
一実施態様において、Ar1上の置換基は、6個の多価原子を含む。この実施態様において、Ar1の環原子に結合した1個以上の水素原子は、第1の多価原子と置き換えられ、これは、次いで、第2、第3、第4、第5、及び第6の多価原子のそれぞれに直接又は間接的に結合し、従って、6個の多価原子から形成される置換基をもたらす。ここで、該多価原子上の空いている原子価は、1個以上の1価の原子で埋められる。これらの置換基の例は、当業者に周知であり、かつ本明細書で提示される。例えば、N-シクロプロピルカルボキサミド(C(O)NH-シクロプロピル)、N-プロピルカルボキサミド(C(O)NHCH2CH2CH3)、N-(2-ヒドロキシエチル)カルボキサミド(C(O)NHCH2CH2OH)、及びN-カルバミミドカルボキサミド(C(O)NHC(=NH)NH2)である。
一実施態様において、Ar1上の置換基は、7個の多価原子を含む。この実施態様において、Ar1の環原子に結合した1個以上の水素原子は、第1の多価原子と置き換えられ、これは、次いで、第2、第3、第4、第5、第6、及び第7の多価原子のそれぞれに直接又は間接的に結合し、従って、7個の多価原子から形成される置換基をもたらす。ここで、該多価原子上の空いている原子価は、1個以上の1価の原子で埋められる。これらの置換基の例は、当業者に周知であり、かつ本明細書で提示される。例えば、N-(n-ブチル)カルボキサミド(C(O)NHCH2CH2CH2CH3)、N-(t-ブチル)カルボキサミド(C(O)NHC(CH3)3)、N,N-ジエチルカルボキサミド(C(O)N(CH2CH3)2)、及びN-シクロブチルカルボキサミド(C(O)NH(シクロブチル))である。
一実施態様において、Ar1上の置換基は、8個の多価原子を含む。この実施態様において、Ar1の環原子に結合した1個以上の水素原子は、第1の多価原子と置き換えられ、これは、次いで、第2、第3、第4、第5、第6、第7、及び第8の多価原子のそれぞれに直接又は間接的に結合し、従って、8個の多価原子から形成される置換基をもたらす。ここで、該多価原子上の空いている原子価は、1個以上の1価の原子で埋められる。これらの置換基の例は、当業者に周知であり、かつ本明細書で提示される。例えば、N-シクロペンチルカルボキサミド(C(O)NH(シクロペンチル))、(ピペリジン-1-イル)メタノン(C(O)-ピペリジン-1-イル)、及び(モルホリン-4-イル)メタノン(C(O)-モルホリン-4-イル)である。
一実施態様において、Ar1上の置換基は、9個の多価原子を含む。この実施態様において、Ar1の環原子に結合した1個以上の水素原子は、第1の多価原子と置き換えられ、これは、次いで、第2、第3、第4、第5、第6、第7の、第8、及び第9の多価原子のそれぞれに直接又は間接的に結合し、従って、9個の多価原子から形成される置換基をもたらす。ここで、該多価原子上の空いている原子価は、1個以上の1価の原子で埋められる。これらの置換基の例は、当業者に周知であり、かつ本明細書で提示される。例えば、ジ-(イソ-プロピル)エステル(C(O)O(CH(CH3)2)2、ジ-(n-プロピル)エステル(C(O)O(CH2CH2CH3)2)、N-シクロヘキシルカルボキサミド(C(O)NH(シクロヘキシル))、(4-メチルピペラジン-1-イル)メタノン (C(O)(4-メチルピペラジン-1-イル)、2-(アセチルアミノ)エチルカルボキサミド (C(O)NHCH2CH2NHC(O)CH3)、及びN-フェニルカルボキサミド(C(O)NH(フェニル))である。
一実施態様において、Ar1上の置換基は、10個の多価原子を含む。この実施態様において、Ar1の環原子に結合した1個以上の水素原子は、第1の多価原子と置き換えられ、これは、次いで、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、及び第10の多価原子のそれぞれに直接又は間接的に結合し、従って、10個の多価原子から形成される置換基をもたらす。ここで、該多価原子上の空いている原子価は、1個以上の1価の原子で埋められる。これらの置換基の例は、当業者に周知であり、かつ本明細書で提示される。例えば、N-ベンジルカルボキサミド(C(O)NHCH2(フェニル))である。
一実施態様において、Ar1は、Ar1上の少なくとも1個の置換基が、ハロゲン、ヒドロキシル、メルカプタン、ニトロ、及びニトリルからなる群から選択される、置換アリールである。
一実施態様において、Ar1は、Ar1上の少なくとも1個の置換基が、-SOR1、-S(O)2R1、-S(O)2NR2R3、-OR1、-OC(O)R3、-C(O)OR3、-C(O)R1、-C(O)NR2R3、-NR2R3、-N(R3)C(O)R1、及び-NS(O)2R3からなる群から選択され;かつR1の各出現が独立に、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のシクロアルキル、置換又は非置換のヘテロシクリル、置換又は非置換のアリール、及び置換又は非置換のヘテロアリールからなる群から選択され;かつR2及びR3の各出現が独立に、-H、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のシクロアルキル、置換又は非置換のヘテロシクリル、置換又は非置換のアリール、及び置換又は非置換のヘテロアリールからなる群から選択される、置換アリールである。
一実施態様において、Ar1は、Ar1上の少なくとも1個の置換基が、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のアルケニル、置換又は非置換のアルキニル、置換又は非置換のシクロアルキル、置換又は非置換のヘテロシクリル、置換又は非置換のアリール、置換又は非置換のヘテロアリール、置換又は非置換のアリールアルキル、置換又は非置換のヘテロアリールアルキル、置換又は非置換のハロアルキル、及び置換又は非置換のハロアルコキシからなる群から選択される、置換アリールである。
一実施態様において、Ar1は、Ar1上の少なくとも1個の置換基が、-R4-H(式中、R4は、1個以上のヘテロ原子で中断されたアルキレンであり、ここで、該ヘテロ原子は、O、S、NH、又はそれらの組み合わせである)からなる群から選択される、置換アリールである。
該Ar1基は、本明細書で説明されるように芳香族部位を含むものであり、ここで、該芳香族部位は、同じく本明細書に記載されるように、任意に置換されていてもよく、該置換は、(トリアゾール-Ar2)m基で置換されることに加えてのものである。一実施態様において、例示的なAr1の置換基は、フルオリド、クロリド、及びブロミドなどのハライド、メチル及びエチルなどの1〜6個の炭素原子を有するアルキル基、トリフルオロメチルなどの1〜6個の炭素原子を有するハロアルキル基、シアノ、ホルミル、及びカルボキサミドである。別の実施態様において、例示的なAr1の置換基は、ニトロ(-NO2)、シアノ(-CN)、カルボン酸(-COOH、又はその塩)、カルボキサミド(-C(O)NH2)、メトキシをはじめとするC1-C6アルコキシ、メチルをはじめとするC1-C6アルキル、トリフルオロメチルなどのC1-C6ハロアルキル、-NHC(O)CH3、C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-NHC(O)CH2CH3、C(O)NHCH2CH3、-C(O)N(CH3)CH2CH3、-C(O)N(CH2CH3)2、-C(O)NH(C1-C6シクロアルキル)、及び-NHC(O)(C1-C6シクロアルキル)(例えば、C(O)NH(シクロプロピル)、-NHC(O)-シクロプロピル、C(O)NH(シクロヘキシル)、NHC(O)-シクロヘキシル)、C(O)NHCH2CH2CH2CH3、-C(O)NH(C(CH3)3)、-C(O)NH(CH2CH2OH)をはじめとする、-NHC(O)(C1-C6アルキル)、-NHC(O)(C1-C6ヘテロアルキル)、-C(O)NH(C1-C6アルキル)、-C(O)NH(C1-C6ヘテロアルキル)、-C(O)N(C1-C6アルキル)(C1-C6アルキル)、-C(O)N(C1-C6アルキル)(C1-C6ヘテロアルキル)、及び-C(O)N(C1-C6ヘテロアルキル)(C1-C6ヘテロアルキル)などの、アミド含有C1-C6ヘテロアルキル、-C(O)CH3をはじめとする-C(O)(C1-C6アルキル)、-C(O)-シクロヘキシル及びC(O)-(ヘテロシクロアルキル)(ここで、該ヘテロシクロアルキルは、例えば、モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、N-メチルピペラジニルであり得る)をはじめとする-C(O)(シクロアルキル)などのケトン、-CO2CH3、-CO2CH2CH3、-CO2CH2CH2CH3、-CO2CH2(CH3)2をはじめとする-CO2-(C1-C6アルキル)などのエステル、並びに-C(O)-S-CH3及び-C(O)-S-CH2CH3をはじめとするC(O)-S-(C1-C6アルキル)などのチオエステルである。
一実施態様において、Ar1は、Ar1上の少なくとも1個の置換基が、-O-(C1-6アルキル)、C1-6アルキル、C1-6ハロアルキル、-CO2-C1-6アルキル、-CONH-C1-6アルキル、-CONH2、CN;及び-NO2からなる群から選択される、置換アリールである。
一実施態様において、nが、0ではない場合、Ar1上の置換は、1個以上のトリアゾール-Ar2基を含む。一実施態様において、Ar1上の任意選択の置換は、まさに1個のトリアゾール-Ar2基を含み、その結果、本開示の化合物は、任意に、まさに2個のトリアゾール-Ar2基(mが、1である場合)を有するか、又は、任意に、例えば、本明細書で特定される化合物47である、4,4'-((4-(ブタ-3-イン-1-イルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸)によって例示されるようにまさに3個のトリアゾール-Ar2基(mが、2である場合)を有する。別の実施態様において、Ar1上の任意選択の置換は、まさに2個のトリアゾール-Ar2基を含み、その結果、本開示の化合物は、mが、1に等しい場合には、任意に、まさに3個のトリアゾール-Ar2基を有し、又はmが、2に等しい場合、任意に、本明細書で特定される化合物71である、4,4',4'',4'''-((((ブタン-1,4-ジイルビス(アザンジイル))ビス(カルボニル))ビス(ピリジン-4,2,6-トリイル))テトラキス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))テトラキス(2-ヒドロキシ安息香酸)によって例示されるように、まさに4個のトリアゾールAr2基を有する。
式(I)の化合物において、指示子mは、Ar1に直接結合している-トリアゾール-Ar2基の最低数を表す。式(I)において、mは、1、2、又は3から選択され、その結果、Ar1は、それぞれ、少なくとも1、2、又は3個のトリアゾール-Ar2基に直接結合している。それぞれが、本開示のPEMの実施態様であるこれらの選択肢は、表1の式(Ia)、式(Ib)、及び式(Ic)に示される。
(表1)
Figure 2021509584
任意に、式(I)の化合物において、nは、0に等しく、その場合、本開示の化合物は、以下の式によって記述される:
Figure 2021509584
 (式中、Ar1は、置換されていても、置換されていなくてもよいが、Ar1が、置換されている場合は、Ar1は、トリアゾール-Ar2基では置換されていない)。任意に、mは、1、2、又は3であり、その結果、Ar1は、それぞれ、1個、2個、又は3個のトリアゾール-Ar2基で置換される。それぞれが本開示のPEMの実施態様であるこれらの選択肢は、表2に式(Id)、式(Ie)、及び式(If)として示される。
(表2)
Figure 2021509584
任意に、式(I)の化合物において、nは、1に等しく、その場合、本開示のPEMは、以下の式によって記述され得る:
Figure 2021509584
 (式中、pは、式のそれぞれが本開示のPEMの実施態様である表3に示されるような化学式(Ig)、(Ih)、及び(Ii)によって記述され得る化合物を提供するように、0、1、又は2であり得る)。
(表3)
Figure 2021509584
式(I)のPEMのさまざまな実施態様において、式のそれぞれが本開示のPEMの実施態様である表4に示されるような式(Ij)、式(Ik)、及び式(Im)の化合物を提供するように、nは、1に等しく、かつmは、2に等しい。
(表4)
Figure 2021509584
任意に、式(I)のPEM化合物において、nは、2に等しく、その場合、本開示の化合物は、以下の式によって記述される:
Figure 2021509584
 (式中、表5に示されるような化学式(In)、(Io)、及び(Ip)によって記述され得る化合物をそれぞれ提供するように、pは、0、1、又は2であり得る)。表5のそれぞれの式は、本開示のPEM化合物の実施態様である。
(表5)
Figure 2021509584
さまざまなPEMの実施態様において、表6に示されるような式(Iq)、式(Ir)、及び式(Is)の化合物を提供するように、式(I)の化合物においてnは、2に等しく、かつmは、2に等しい。表6に示されるそれぞれの式は、本開示のPEM化合物の実施態様である。
(表6)
Figure 2021509584
nが、1又は2である場合、式(I)の化合物は、リンカーLを含むこととなり、ここで、該リンカー基は、本開示のPEM化合物中に必ず存在するAr1基を、本開示のPEM化合物中に任意に存在する1個以上のトリアゾール-Ar2アーム(すなわち、式のブラケット｛ ｝内の1個以上のトリアゾール-Ar2基)に、共有結合的に連結する。一実施態様において、リンカーLは、直接の結合であってもよい。別の実施態様において、該リンカーは、直接の結合ではなく、その代わりに、1個以上の原子、特に、炭素、酸素、硫黄から選択される原子である。別の実施態様において、リンカーは、アルキレン基(例えば、C1-C6アルキレン)、又は置換アルキレンであってもよい。リンカーは、ヘテロアルキレンリンカーであってもよく、これは、元の鎖の内部のかつ/又は元の鎖の1つ以上の末端位置に配置された酸素、窒素、又は硫黄から選択される少なくとも1個のヘテロ原子(例えば、1、2、3、又は4個のヘテロ原子)をさらに含む、置換又は無置換型のアルキレンを指す。一実施態様において、Lは、1個以上の炭素原子が、酸素、窒素、及び硫黄から選択される少なくとも1個のヘテロ原子と置き換えられた、長さが2〜10個の炭素原子であるヘテロアルキレン基である。一実施態様において、Lは、少なくとも1個のN、O、又はSヘテロ原子を有するヘテロアルキレンリンカーであって、該ヘテロアルキレンが、直鎖であるか又は環化されたものであり得、かつ任意に置換されており、例示的な置換基として、オキソ、-OH、C1-4アルキル、及びC1-4アルコキシが挙げられる、前記ヘテロアルキレンリンカーであり得る。ヘテロアルキレンリンカー基の例としては、-C(O)NH-アルキレン-及び-C(O)NH-アルキレン-NHC(O)-(式中、アルキレンは任意に、C1-C6アルキレンである)などのアミド含有ヘテロアルキレン基が挙げられる。ヘテロアルキレン基の別の例としては、-C(O)O-アルキレン-及び-C(O)O-アルキレン-OC(O)-(式中、一実施態様において、アルキレンは、非置換型C1-C6アルキレンであり、別の実施態様において、アルキレンは、置換型C1-C6アルキレンである)などのエステル含有ヘテロアルキレン基が挙げられる。一実施態様において、リンカーは、加水分解的に安定であり、その結果、PEMが、水中に置かれた場合に、これは、分解や劣化や別の分解を起こさない。
リンカーLは、通常、非常に長い必要はない;一実施態様において、これは、原子の総数から水素及びハロゲンを除いて1〜約25個の原子を含み、ここで、該リンカーは、任意に、水素及びハロゲンに加えて炭素、窒素、酸素、及び硫黄から選択される原子で構成され得る。様々な別の実施態様において、該リンカーは、25個よりも少ない原子(水素及びハロゲンを除く)を有し、例えば、これは、1〜約20個の原子、又は1〜約15個の原子、又は1〜約10個の原子、又は1〜約5個の原子を含み、いずれの場合にも、原子の総数から水素及びハロゲンは除かれ、計数される原子は、任意に、炭素、酸素、窒素、及び硫黄から選択され得る。
一実施態様において、式(I)の化合物中のトリアゾール環は、Ar1及びAr2に直接結合することに加えて、置換され得る。一般的に、本開示の化合物は、任意に、化学式
Figure 2021509584
 (式中、Ar1及びAr2は、本明細書の別のところで定義され、かつMは、水素であってよく(この場合、トリアゾール環は、Ar1及びAr2で置換されるのみである)、又はMは、ハライド置換基、例えば、フルオリド、クロリド、ブロミド、又はヨウ素であってよい)を含むものとして記述され得る。一実施態様において、本開示の化合物は、Ar1及びAr2のみで置換されたトリアゾール環を有し、すなわち、Mは、水素である。別の実施態様において、本開示の化合物は、Ar1、Ar2、及びハライドで置換されたトリアゾール環を有する。別の実施態様において、本開示の化合物は、ヨージド置換トリアゾール環を含み、すなわち、Mは、ヨージドである。別の実施態様において、本開示の化合物は、トリアゾール環上にM置換基を有し、ここで、Mは、水素及びヨージドから選択される。
従って、一実施態様において、本開示は、以下の式の化合物を提供する:
Figure 2021509584
 (式中、Ar1及びAr2は、本明細書の別の場所で定義され、かつMは、水素及びハライドから選択される。任意に、上述のように、Mは、水素であってよく、又は別の選択肢において、Mは、化合物4,4'-((4l3-ピリジン-2,6-ジイル)ビス(5-ヨード-1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸)で例示されるように、例えば、ヨージドなどのハライドであってよい。上述の構造におけるもののように、本開示の化合物が、2個以上のM置換トリアゾール環を有する場合、Mは各出現において独立に選択される。しかしながら、一実施態様において、Mは、本開示の化合物における各出現において同じ原子である。例えば、本開示は、Mが、Mの各出現において水素である化合物を提供する。別の例において、本開示は、Mが、Mの各出現においてヨージドである化合物を提供する。
式(I)の化合物は、少なくとも1個のトリアゾール-Ar2部位を含む。一実施態様において、本開示の化合物は、2個以上のトリアゾール-Ar2部位を含み、例えば、以下の式の化合物である
Figure 2021509584
 。本開示の化合物が、2個又は2個超のトリアゾール-Ar2部位を含む場合、Ar2部位は、任意に、各出現において同じ化学構造を有してもよい。しかしながら、本開示のPEM化合物が、複数のトリアゾール-Ar2部位を含む場合、一実施態様において、これらのAr2部位は、必ずしも互いに同一ではなく、実際に、これらは、同一でなくてもよい。Ar2部位は、Ar2環原子の観点からかつ/又はAr2環原子上の置換の観点から互いに異なっていてもよい。例えば、一方のAr2基が、フェニルであり、かつ他方のAr2基が、ピリジニルである場合、該2つのAr2基は、該Ar2基を構成する環原子の観点から異なる。別の例として、例えば、4-(4-(3-(1-(4-メトキシフェニル)-1H-1、2,3-トリアゾール-4-イル)フェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)安息香酸でのように、双方のAr2基が、フェニルであるが、一方のフェニルが、カルボキシルで置換されており、他方のフェニルが、メトキシで置換されている場合、該化合物は、2個の異なるAr2基を有するとみなされる。さらに別の例において、2つのAr2基は、双方のAr2基が、フェニルであり、かつ双方のフェニル環が、ヒドロキシル及びカルボキシルで置換されているが、ヒドロキシル及び/又はカルボキシル基の位置が、該2個のフェニル環上で異なる場合でのように、互いの位置異性体であってもよく、例えば、一方のフェニル環上で、トリアゾールが、カルボキシル基に対して3位に位置し、他方のフェニル環上で、トリアゾールが、カルボキシル基に対して4位に位置する場合、該2個のAr2基は、位置異性体かつ非同一であるとみなされる。一実施態様において、Ar2環は、本開示の化合物での各出現において、あらゆる点で同一である。一実施態様において、Ar2 環原子は、Ar2の各出現において同一であるが、Ar2環上の置換は、Ar2の各出現において、非同一である。別の実施態様において、Ar2環原子は、Ar2の各出現において非同一であり、かつAr2環上の置換は、同一であっても同一でなくてもよい。
式(I)の化合物は、少なくとも1個のAr2部位を含み、ここで、一実施態様において、Ar2が、フェニル及びピリジニルから選択される単環式芳香環であり、これらは、任意に置換されていてもよい。一実施態様において、Ar2は、単環式の6員芳香環であり、ここで、例は、フェニル、ピリジニル、及びピラジニルであり、ここでも、該Ar2基は、環原子上に置換基を任意に含む。別の実施態様において、Ar2は、5員の単環式芳香環であり、これは、任意に置換されていてもよい。別の実施態様において、Ar2は、5又は6員の芳香環であり、これは、任意に置換されていてもよい。別の実施態様において、Ar2は、一緒に縮合した2個の5員及び/又は6員の単環式環を含む9又は10員の縮合二環式環であり、ここで、該2つの単環式環の少なくとも一方は、芳香環である。別の実施態様において、Ar2は、一緒に縮合した2個の5員及び/又は6員の単環式環を含む9又は10員の縮合二環式環であり、ここで、該2つの単環式環は双方とも、芳香環である。一実施態様において、Ar2は、これらの選択肢のうちのいずれかであってよく、すなわち、Ar2は、(a)5員の単環式芳香環、(b)6員の単環式芳香環、(c)一緒に縮合した1個の5員単環式環及び1個の6員単環式環を含む9員の縮合二環式環(ここで、該2つの単環式環の少なくとも一方、及び任意に該単環式環の双方が、芳香環である)、並びに(d)一緒に縮合した2個の6員の単環式環を含む10員の縮合二環式環(ここで、該2つの単環式環の少なくとも一方、及び任意に単環式環の双方が、芳香環である)から選択される。
式(I)の化合物において、任意に、Ar2は、チオフェン、1,2-チアゾール、1,3-チアゾール、フラン、1,2-オキサゾール、1,3-オキサゾール、1H-ピロール、1H-ピラゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、1,2,4-トリアゾール、1,2,3-トリアゾール、及び1H-イミダゾールからなる群から選択される5員の単環式芳香環である。
式(I)の化合物において、任意に、Ar2は、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、及びピラジンからなる群から選択される6員の単環式芳香環である。
式(I)の化合物において、任意に、Ar2は、ベンゾフラン、1,3-ベンゾオキサゾール、フロ[3,2-b]ピリジン、フロ[3,2-c]ピリジン、フロ[2,3-c]ピリジン、フロ[2,3-b]ピリジン、インドール、1H-ベンゾイミダゾール、1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン、1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン、1H-ピロロ[2,3-c]ピリジン、1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン、ベンゾチオフェン、1,3-ベンゾチアゾール、チエノール[3,2-b]ピリジン、チエノ[3,2-c]ピリジン、チエノ[2,3-c]ピリジン、ベンゾオキサジアゾール、ベンゾチアジアゾール、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾトリアゾール、及びチエノ[2,3-b]ピリジンからなる群から選択される9員の縮合二環式芳香環系である。
式(I)の化合物において、任意に、Ar2は、ナフタレン、キノリン、キナゾリン、キノキサリン、1,5-ナフチリジン、1,6-ナフチリジン、1,7-ナフチリジン、1,8-ナフチリジン、イソキノリン、フタラジン、2,6-ナフチリジン、及び2,7-ナフチリジンからなる群から選択される10員の縮合二環式芳香環系である。
上述のように、本開示の化合物は、少なくとも1個のAr2基を含み、ここで、該Ar2基は、少なくとも1個の芳香環を含み、かつ該芳香環上に1個以上の置換基を任意に含む。一実施態様において、Ar2は、芳香環上に少なくとも1個、すなわち、1個以上の置換基、例えば、1〜5個、又は1〜4個、又は、1〜3個、又は1〜2個の置換基を含む。任意に、Ar2は、芳香環上にちょうど1個の置換基を含む。別の選択肢において、Ar2は、芳香環上にちょうど2個の置換基を含む。さらに別の選択肢において、Ar2は、芳香環上にちょうど3個の置換基を含む。さらなる選択肢において、Ar2は、芳香環上にちょうど4個の置換基を含む。任意の一実施態様において、Ar2は、芳香環上に2個以上の置換基を含む。
一実施態様において、Ar2の環原子上の1個以上の置換基は、任意に「G」と名付けられる置換基から選択され、ここで、該置換基は、E-M、E-CO2R、E-CONH2、E-CHO、E-NR2、及びE-ORから選択され、式中、(a)Eは、直接の結合、メチレン、エチレン、プロピレン、及びブチレンから選択され;(b)Mは、フルオリド、クロリド、ブロミド、及びヨージドから選択されるハライドであり;かつ(c)Rは独立に、H及びC1-C6アルキルから選択される。別の実施態様において、Ar2の環原子上の1個以上の置換基は、ハライド、C1-C6アルキル、C1-C6ハロアルキル、E-CO2R0、E-CONH2、E-CHO、E-C(O)NH(OH)、E-N(R0)2、及びE-OR0から選択され、式中、Eは、直接の結合及びC1-C6アルキレンから選択されるアルキレン基、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、又はブチレンから選択され;かつR0は、H、C1-C6アルキル、及びC1-C6ハロアルキルから選択される。任意に、アルキレン基は、置換アルキレン基であってもよい。
一実施態様において、Ar2上の置換は、アミノ(-NH2)を含む。一実施態様において、Ar2上の置換は、アルコキシ、例えば、C1-C6アルコキシを含む。例えば、一実施態様において、Ar2上の置換は、メトキシを含む。一実施態様において、Ar2上の置換は、カルボン酸又はアルキレン-カルボン酸を含む。例えば、一実施態様において、式(I)のPEM化合物のAr2上の置換は、カルボン酸を含む。一実施態様において、Ar2上の置換は、カルボン酸エステル、又はアルキレン-カルボン酸エステルを含む。例えば、一実施態様において、式(I)のPEM化合物のAr2上の置換は、-CH2-CO2-CH3を含む。一実施態様において、Ar2上の置換は、ハロアルキル基、例えば、C1-C6ハロアルキル基を含む。例えば、一実施態様において、式(I)のPEM化合物のAr2上の置換は、トリフルオロメチルを含む。一実施態様において、Ar2上の置換は、ヒドロキシル又はヒドロキシル置換アルキル、例えば、ヒドロキシル置換C1-C6アルキルを含む。例えば、一実施態様において、式(I)の化合物のAr2上の置換は、ヒドロキシル(-OH)を含む。
一実施態様において、Ar2上の置換は、カルボン酸及びアルキレン-カルボン酸、例えば、C1-C6アルキレン-カルボン酸から選択される1個の基、及びヒドロキシル及びヒドロキシル置換アルキル、例えば、1個のヒドロキシルで置換されたC1-C6アルキルから選択されるもう1つの基を含む。例えば、一実施態様において、Ar2上の置換は、1個のカルボン酸及び1個のヒドロキシルであるか、又はそれを含む。任意に、この例において、式(I)の化合物は、式(Ia)、式(Ib)、式(Ic)、式(Id)、式(Ie)、式(If)、式(Ig)、式(Ih)、式(Ii)、式(Ij)、式(Ik)、式(Im)、式(In)、式(Io)、式(Ip)、式(Iq)、式(Ir)、及び(Is)を含む、式(I)のPEM化合物のいずれかであり得、かつAr2環は、6員の炭素環式又はヘテロ環式の芳香環、例えば、フェニル、ピリジニル、又はピラジニルであり得る。
一実施態様において、Ar2上の置換は、カルボン酸及びアルキレン-カルボン酸、例えば、 C1-C6アルキレン-カルボン酸から選択される1個の基、及びハロアルキル、例えば、C1-C6ハロアルキルから選択される1個の基を含む。例えば、一実施態様において、Ar2上の置換は、1個のカルボン酸基及び1個のトリフルオロメチル基であるか、又はそれを含む。任意に、この例において、式(I)の化合物は、式(Ia)、式(Ib)、式(Ic)、式(Id)、式(Ie)、式(If)、式(Ig)、式(Ih)、式(Ii)、式(Ij)、式(Ik)、式(Im)、式(In)、式(Io)、式(Ip)、式(Iq)、式(Ir)、及び(Is)を含む、式(I)のPEM化合物のいずれかであり得、かつAr2環は、6員の炭素環式又はヘテロ環式の芳香環、例えば、フェニル、ピリジニル、又はピラジニルであり得る。
一実施態様において、Ar2上の置換は、ヒドロキシル及びヒドロキシル置換アルキルから選択される1個の基、例えば、1個のヒドロキシルで置換されたC1-C6アルキル、及びハロアルキル、例えば、C1-C6ハロアルキルから選択されるもう1つの基を含む。例えば、一実施態様において、Ar2上の置換は、1個のヒドロキシル基及び1個のトリフルオロメチル基であるか又はそれを含む。任意に、この例において、式(I)の化合物は、式(Ia)、式(Ib)、式(Ic)、式(Id)、式(Ie)、式(If)、式(Ig)、式(Ih)、式(Ii)、式(Ij)、式(Ik)、式(Im)、式(In)、式(Io)、式(Ip)、式(Iq)、式(Ir)、及び式(Is)を含む式(I)のPEM化合物のいずれかであり得、かつAr2環は、6員の炭素環式又はヘテロ環式の芳香環、例えば、フェニル、ピリジニル、又はピラジニルであり得る。
一実施態様において、式(I)のAr2環上の置換は、a)カルボン酸及びアルキレン-カルボン酸、例えば、C1-C6アルキレン-カルボン酸;b)ヒドロキシル及びヒドロキシル置換アルキル、例えば、1個のヒドロキシルで置換されたC1-C6アルキル;並びにc)ハロアルキル、例えば、C1-C6ハロアルキルのうちの少なくとも1つを含む。例えば、カルボン酸、ヒドロキシル、及びトリフルオロメチルのうちの少なくとも1つである。任意に、この例において、式(I)の化合物は、式(Ia)、式(Ib)、式(Ic)、式(Id)、式(Ie)、式(If)、式(Ig)、式(Ih)、式(Ii)、式(Ij)、式(Ik)、式(Im)、式(In)、式(Io)、式(Ip)、式(Iq)、式(Ir)、及び式(Is)を含む式(I)のPEM化合物のいずれかであり得、かつAr2環は、6員の炭素環式又はヘテロ環式の芳香環、例えば、フェニル、ピリジニル、又はピラジニルであり得る。
一実施態様において、式(I)のAr2環上の置換は、a)カルボン酸及びアルキレン-カルボン酸、例えば、C1-C6アルキレン-カルボン酸;b)ヒドロキシル及びヒドロキシル置換アルキル、例えば、1個のヒドロキシルで置換されたC1-C6アルキル;並びにc)ハロアルキル、例えば、C1-C6ハロアルキルのうちの少なくとも2つを含む。例えば、カルボン酸、ヒドロキシル、及びトリフルオロメチルのうちの少なくとも2つである。任意に、この例において、式(I)の化合物は、式(Ia)、式(Ib)、式(Ic)、式(Id)、式(Ie)、式(If)、式(Ig)、式(Ih)、式(Ii)、式(Ij)、式(Ik)、式(Im)、式(In)、式(Io)、式(Ip)、式(Iq)、式(Ir)、及び式(Is)を含む式(I)のPEM化合物のいずれかであり得、かつAr2環は、6員の炭素環式又はヘテロ環式の芳香環、例えば、フェニル、ピリジニル、又はピラジニルであり得る。
一実施態様において、式(I)のAr2環上の置換は、a)カルボン酸及びアルキレン-カルボン酸、例えば、C1-C6アルキレン-カルボン酸;b)ヒドロキシル及びヒドロキシル置換アルキル、例えば、1個のヒドロキシルで置換されたC1-C6アルキル;並びにc)ハロアルキル、例えば、C1-C6ハロアルキルの3つ全てを含む。即ち、Ar2は、カルボン酸、ヒドロキシル、及びトリフルオロメチルで置換され得る。任意に、この例において、式(I)の化合物は、式(Ia)、式(Ib)、式(Ic)、式(Id)、式(Ie)、式(If)、式(Ig)、式(Ih)、式(Ii)、式(Ij)、式(Ik)、式(Im)、式(In)、式(Io)、式(Ip)、式(Iq)、式(Ir)、及び式(Is)を含む式(I)のPEM化合物のいずれかであり得、かつAr2環は、6員の炭素環式又はヘテロ環式の芳香環、例えば、フェニル、ピリジニル、又はピラジニルであり得る。
例えば、一実施態様において、Ar2基は、以下:
Figure 2021509584
 から選択される置換フェニル基である。
言及したように、一実施態様において、本開示のPEM化合物は、Ar2上にヒドロキシル及びカルボン酸置換を有し得る。これら2つの基は、Ar2環上のさまざまな位置に配置され得る。例えば、一実施態様において、本開示は、式:
Figure 2021509584
 によって記述される式(I)のPEM化合物を提供する。
別の実施態様において、本開示の式(I)のPEM化合物は、以下の式:
Figure 2021509584
 で規定されるように、Ar2上にヒドロキシル及びカルボン酸置換を有する。
さらに別の実施態様において、本開示の式(I)のPEM化合物は、以下の式:
Figure 2021509584
 に示されるように、Ar2上にヒドロキシル及びカルボン酸置換を有する。
一実施態様において、本開示の式(I)のPEM化合物は、Ar2上に少なくともヒドロキシル置換及びカルボキシル置換を有し、かつAr2上に別の置換を有し得る。例えば、Ar2は、ヒドロキシル、カルボン酸、及びアルキル、例えば、C1-C6アルキルで置換されて、例えば、以下の式:
Figure 2021509584
 の化合物を提供し得る。
前述のように、一実施態様において、本開示の式(I)のPEM化合物は、Ar2上に、上記構造で例示されるようなヒドロキシル及びカルボン酸ではなく、ハロアルキル及びカルボン酸置換を有し得る。一例として、本開示のPEM化合物は、以下の式によって記述され得る:
Figure 2021509584
 。
式(I)のPEM化合物は、その水和物を含む溶媒和物、キレート、及び塩形態を含む。ある例において、PEM化合物は、アモルファスであり得、別の例においては、PEM化合物は、結晶性であり得る。更に、化合物の結晶形の一部は、多形として存在し得、これは、本明細書で想定される。加えて、化合物の一部は、水又は他の有機溶媒との溶媒和物を形成することもある。そのような溶媒和物も、本明細書に記載される化合物の範囲内に含まれる。
式(I)のPEM化合物は、銅キレートなどのキレートの形態であってもよい。銅キレートは、本開示のPEM化合物を硫酸銅と結合させることによって形成され得る。式(I)のPEM化合物は、Ar1基及びAr2基上の置換基に応じて、酸付加塩又は塩基付加塩いずれかの塩の形態であってもよい。
PEM構造は、その全ての安定な立体異性形態を含む。従って、本明細書に記載されるPEM化合物は、1個以上のキラル(又は不斉)中心を有することがあり、従って、絶対立体化学の観点から、(R)-又は(S)-として定義され得る、エナンチオマー、ジアステレオマー、及び他の立体異性形態を生じさせ得る。本明細書に記載される化合物が、オレフィン性の二重結合又は他の幾何不斉中心を含み、かつ別途指定されない場合、該化合物が、E及びZ幾何異性体(例えば、cis又はtrans)の双方を含むことが意図される。同様に、別途示されない限り、全ての可能な異性体、並びにそれらのラセミ形態及び光学的に純粋な形態、及び全ての互変異性体も含まれることが意図される。従って、さまざまな立体異性体及びそれらの混合物が、それらの分子が、重ね合わせることができない互いの鏡像である2つの立体異性体を指す「エナンチオマー」を含むことが想定される。従って、化合物は、ラセミ化合物、ラセミ混合物、及び個々のエナンチオマー又はジアステレオマーを含む任意の異性体形態で存在し得る。
本開示のPEM化合物は、一般に、水溶性である。水溶性の尺度の1つは、化合物のlogP値である。LogP値は、商業的なソフトウェアを用いて、化合物の化学構造に基づいて計算し得る。例えば、CHEMDRAW化学描画ソフトウェア(PerkinElmer Holdingsの子会社であるCambridgesoft社)は、描かれた化学構造のlogP値を算出することができる。一実施態様において、本開示のPEM化合物は、少なくとも4.9のlogPを有する。
本開示の化合物、例えば、上述のような式(I)のPEM化合物、及び以下に示されるような式(II)のPEM化合物は、通常、Cu(I)触媒の存在下での、式Ar1(C≡CH)2のジエチニル化合物の、式Ar2-N3のアジド化合物との反応によって合成され得る。Kosmrlj J編の「クリックトリアゾール(Click Triazoles)」「ヘテロ環式化学のトピックス(Topics in Heterocyclic Chemistry)」、第28巻、Springer, Berlin, Heidelberg doi.org/10.1007/7081_2011_67内の、Crowley J.D., McMorran D.A.の文献(2012)「『クリックトリアゾール』配位化学:リガンドとしての1,4-二置換-1,2,3-トリアゾールの活用(“Click-Triazole” Coordination Chemistry: Exploiting 1,4-Disubstituted-1,2,3-Triazoles as Ligands)」も参照されたい。
具体的かつ類似の反応物質は、大部分の公共図書館及び大学図書館で利用可能であり、オンラインデータベースを通じても利用可能である米国化学会のケミカルアブストラクトサービス(Chemical Abstract Service)によって準備された既知の化学物質の索引によっても同定され得る(さらなる詳細については、the American Chemical Society, Washington, D.C.に照会可能である)。既知ではあるが、カタログで商業的に入手できない化学物質は、カスタム化学合成企業によって調製されてもよく、ここで、多くの標準的な化学物質供給企業(例えば、上で挙げたもの)が、カスタム合成サービスを提供している。本開示の医薬塩の調製及び選定についての引例は、P. H. Stahl及びC. G. Wermuthの文献「医薬塩のハンドブック(Handbook of Pharmaceutical Salts)」、Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich, 2002である。
式Ar1(C≡CH)の化合物は、例えば、TCI America(Portland, Oregon, 米国)から商業的に入手でき、例えば、1,3-ジエチニルベンゼン、1,4-ジエチニルベンゼン、2,6-ジエチニルピリジン、及び3,6-ジエチニルカルバゾールが販売されている。
一般に、エチニル芳香族化合物は、MilliporeSigma社(St. Louis, MO, 米国)から入手可能なジメチル(ジアザオメチル)ホスホネート(dimethyl (diazaomethyl) phosphonate)を用いて、アリールアルデヒドからSeyferth-Gilbert増炭反応によって調製され得る。あるいは、ジメチル(ジアゾメチル)ホスホネートは、ジメチル-1-ジアゾ-2-オキソプロピルホスホネート(大平-Bestmann試薬)からからインサイチュで発生させることができる。例えば、Seyforthらの文献、J. Org. Chem. 36(10): 1379-1386 (1971). doi:10.1021/jo00809a014及びBestmanらの文献、Synlett. 1996 (06): 521-522 (1996). doi:10.1055/s-1996-5474を参照されたい。
エチニル芳香族化合物への別の経路は、パラジウム触媒の存在下でのハロ芳香族化合物の(t-ブチルジメチルシリル)アセチレンとの薗頭カップリングを必要とする。次いでシリル基の脱保護を行うと、エチニル芳香族が形成される。例えば、Sonogashiraの文献、Organomet. Chem., 653: 46-49 (2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0を参照されたい。
以下の反応(I)、(II)、及び(III)は、ジエチニル芳香族化合物の例示的な調製を説明する。反応(I)においては、2,6-ジブロモピリジン-4-アミンが、対応する2,6-ジエチニルピリジン-4-アミン化合物に変換される。反応(II)においては、2,6-ジヨード-4-ニトロアニリー(2,6-diiodo-4-nitroanilie)が、対応する2,6-ジエチニル-4-ニトロアニリンに変換される。反応(III)においては、2-ヒドロキシ-3,5-ジヨード安息香酸が、対応する3,5-ジエチニル-2-ヒドロキシ安息香酸に変換される。示されるように、いずれの場合にも、変換は、中間体であるジ-トリメチルシリル(TMS)化合物を経て進行する。
Figure 2021509584
 これら反応生成物のそれぞれ、すなわち2,6-ジエチニルピリジン-4-アミン、及び2,6-ジエチニル-4-ニトロアニリン、及び3,5-ジエチニル-2-ヒドロキシ安息香酸は、本開示のPEMの調製において、Ar1への前駆体として機能し得る。してがって、これらはそれぞれ、Cu(I)触媒の存在下で式Ar2-N3のアジド化合物と反応して、PEMを提供し得るAr1(C≡CH)2化合物を表す。これらの反応(I)、(II)、及び(III)は、本開示置換Ar1部位への前駆体の調製を説明している。
式Ar2-N3の化合物も、例えば、TCI America (Portland, Oregon, 米国)、Synthonix (Wake Forest, North Carolina, 米国)、SigmaAldrich (St. Louis, Missouri, 米国)、Toronto Research Chemicals (Toronto, カナダ)、及びAnaSpec (Fremont, California, 米国)から商業的に入手可能である。一般に、式Ar2-N3のアジドは、アルキル、ベンジル、又はアリルのヨージド又はブロミドなどの求電子性化合物の、アジ化ナトリウムを用いる求核置換(nucleophilic displacement)によって調製され得る。
一般的に、本明細書に記載される反応で用いられる化合物は、市販の化学物質から及び/又は化学文献に記載される化合物から出発して、当業者に公知の有機合成技術によって調製され得る。「市販の化学物質」は、Across Organics (Pittsburgh Pa.、Aldrich Chemical (Milwaukee Wis.、Sigma Chemical及びFlukaを含む)、Apin Chemicals社(Milton Park 英国)、Avocado Research (Lancashire 英国)、BDH社(Toronto, カナダ)、Bionet (Cornwall, 英国)、Chemservice社(West Chester Pa.)、Crescent Chemical社(Hauppauge N.Y.)、Eastman Organic Chemicals, Eastman Kodak社(Rochester N.Y.)、Fisher Scientific社(Pittsburgh Pa.)、Fisons Chemicals (Leicestershire 英国)、Frontier Scientific (Logan Utah)、ICN Biomedicals社(Costa Mesa Calif.)、Key Organics (Cornwall 英国)、Lancaster Synthesis (Windham N.H.)、Maybridge Chemical社(Cornwall 英国)、Parish Chemical社(Orem Utah)、Pfaltz & Bauer社(Waterbury Conn.)、Polyorganix (Houston Tex.)、Pierce Chemical社(Rockford Ill.)、Riedel de Haen AG (Hanover, ドイツ)、Spectrum Quality Product社(New Brunswick, N.J.)、TCI America (Portland Oreg.)、Trans World Chemicals社(Rockville Md.)、及びWako Chemicals USA社(Richmond Va.)を含む、標準的な商業的供給業者から入手し得る。
一実施態様において、本開示のPEM化合物、例えば、式(I)のPEM化合物又は式(II)のPEM化合物は、組成物中に存在している。例えば、本開示のPEM化合物は、水性バッファーも含む組成物中に存在することがある。一実施態様において、本開示のPEM化合物は、ポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドなどの生体分子を含む組成物中に存在する。該ポリペプチドは、DNAポリメラーゼなどの酵素であってもよい。以下の定義は、これらの組成物及びそのある種の使用の理解に役立であろう。
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドとも呼ばれる「核酸」は、1つのヌクレオチドのペントースの3’位が、次のヌクレオチドの5’位に、ホスホジエステル基によって連結されている、共有結合的に連結されたヌクレオチドの連結である。核酸分子は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、又は双方の組合せであり得る。DNA(デオキシリボ核酸)及びRNA(リボ核酸)は、ヌクレオチド残基が、ホスホジエステル結合によって特定の配列に連結されている、生物学的に生じるポリヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、又は「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの線状骨格を有するいかなるポリマー化合物をも包含する。オリゴマーともよばれるオリゴヌクレオチドは、一般に、より短い鎖のポリヌクレオチドである。核酸は、一般に、シーケンシングの標的とされた場合には、「標的核酸」又は「標的配列」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「テンプレート依存型の様式」という用語は、プライマー分子のテンプレート依存型伸張を伴うプロセス(例えば、DNAポリメラーゼによるDNA合成)を指すことが意図される。「テンプレート依存型の様式」という用語は、ポリヌクレオチドの新たに合成された鎖の配列が、周知の相補的塩基対形成の法則(例えば、「遺伝子の分子生物学(Molecular Biology of the Gene)」、第4版, W. A. Benjamin社, Menlo Park, Calif. (1987)中のWatson, J. D.らの文献を参照されたい)によって決定される、RNA又はDNAのポリヌクレオチド合成を指す。
本明細書で使用される場合、「核酸ポリメラーゼ」は、一般に、3'-OH 5'-三リン酸ヌクレオチド、オリゴマー、及びそれらの類似体を連結するための酵素である。ポリメラーゼとしては、DNA依存性DNAポリメラーゼ、DNA依存性RNAポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメラーゼ、RNA依存性RNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、T3 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ1、クレノウ断片、サーモフィルス・アクウァーティクス(Thermophilus aquaticus)DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、VentR(登録商標)DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、Deep VentR(登録商標)DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、Bst DNAポリメラーゼ大断片、Stoeffel断片、9° N DNAポリメラーゼ、9° N DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、RepliPHI Phi29 ポリメラーゼ、Tli DNAポリメラーゼ、真核生物DNAポリメラーゼβ、テロメラーゼ、Therminator(商標)ポリメラーゼ(New England Biolabs)、KOD HiFi(商標)DNAポリメラーゼ(Novagen)、KOD1 DNAポリメラーゼ、Q-βレプリカーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、AMV逆転写酵素、M-MLV逆転写酵素、Phi6逆転写酵素、HIV-1逆転写酵素挙げられるが、これらに限定されない。本発明によるポリメラーゼは、バリアント、変異体、又はキメラのポリメラーゼとすることができる。
本明細書で使用される場合、「DPO4型DNAポリメラーゼ」は、一般に、損傷乗り越え合成(TLS)として知られるプロセスによる、損傷したDNAの複製において機能する、古細菌であるスルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)により天然に発現されるDNAポリメラーゼ、又は関連するYファミリーDNAポリメラーゼである。YファミリーDNAポリメラーゼは、DPO4ポリメラーゼと相同であり;例としては、原核生物酵素、PolII、PolIV、PolV、古細菌酵素、Dbh、並びに真核生物酵素、Rev3p、Rev1p、Pol η、REV3、REV1、Pol I、及びPolκDNAポリメラーゼと、それらのキメラが挙げられる。修飾された組換えDPO4型DNAポリメラーゼは、天然に生じる野生型DPO4型DNAポリメラーゼと比較して1つ以上の変異、例えば、かさ高いヌクレオチド類似体を基質として利用する能力又は別のポリメラーゼとしての性質を増加させる1つ以上の変異を含み、かつ野生型のDPO4型DNAポリメラーゼに対して追加の変化又は修飾、例えば、1つ以上の欠失、挿入、及び/又は追加のペプチドもしくはタンパク質配列の融合(例えば、ポリメラーゼを表面に固定化するためのもの、又はそうではなくポリメラーゼ酵素にタグ付けするためのもの)を含み得る。本発明によるバリアントポリメラーゼの例は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる、PCT特許出願公開公報第WO2017/087281 A1号並びにPCT特許出願第PCTUS2018/030972号及び第PCTUS2018/64794号に記載されたスルホロブス・ソルファタリカスDPO4のバリアントである。
本明細書で使用される、「核酸ポリメラーゼ反応」は、テンプレート依存型の様式で、核酸の新たな鎖を作製するか、又は既存の核酸(例えば、DNA又はRNA)を伸長させるためのインビトロでの方法を指す。本発明による核酸ポリメラーゼ反応は、組み込まれたヌクレオチド又はヌクレオチド類似体が、標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的となるように、プライマーの3’末端へのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の組み込みをもたらす、プライマー伸長反応を含む。核酸ポリメラーゼ反応のプライマー伸長生成物を、単一分子シーケンシングのためにか、又は追加の核酸分子を合成するテンプレートとしてさらに使用することができる。
プライマー伸長反応試薬は、通常、(i)ポリメラーゼ酵素;(ii)バッファー;及び(iii)1つ以上の伸長可能なヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含む。プライマー伸長反応を使用して、特定の実験条件下で結果として得られる核酸生成物の長さを測定することができ、かつ例えば、ゲル電気泳動によって伸長されたプライマー生成物の長さを比較することによって、ポリメラーゼ活性に対するさまざまなポリメラーゼ反応添加剤(例えば、PEM)の効果を決定することができる。
本明細書で使用される、「核酸ポリメラーゼ反応を強化すること」は、添加剤、例えば、PEMの、核酸ポリメラーゼが、該PEMの非存在下でのものよりも長さが少なくともサブユニット1個分長いプライマー伸長生成物を合成することを可能とする能力を指す。
本明細書で使用される核酸ポリメラーゼ反応の速度は、核酸ポリメラーゼが、ポリマー鎖を伸長させる平均速度を指す。本明細書で使用される場合、「速度」及び「伸長速度」という用語は、互換的に用いられる。Hogrefeらの文献(Methods in Enzymol. Vol. 334、pp. 91-116 (2001))のヌクレオチド取り込みアッセイを使用して、重合の速度を測定することができる。簡単に述べると、ポリメラーゼ活性を、活性化サケ精子DNA(Pharmaciaから購入;活性化プロトコルについては、C. C. Richardsonの文献, Procedures in Nucl. Acid Res. (Cantoni及びDavies編),263〜276頁(1966)の第264頁を参照されたい)内への32P-dCTPの取り込み速度として測定可能である。反応バッファーは、例えば、50mM Tris-HCl (pH 8.0)、5mM MgCl2、1mM ジチオスレイトール(DTT)、50μg/ml ウシ血清アルブミン(BSA)、及び4％ (v/v)グリセロールとすることができる。ヌクレオチド基質及びDNAは、大過剰で、通常、アッセイされているポリメラーゼのKmの少なくとも10倍で用いられ、例えば、各200μMのdATP、dTTP、及びdGTP、195μMのdCTP＋5μIMの標識化dCTP、並びに250μg/mLの活性化DNAである。反応は氷上でクエンチされ、反応混合物の一定分量が、イオン交換フィルター(例えば、Whatman DE81)上にスポットされる。取り込まれていないヌクレオチドを、よく洗浄し、それに続き、シンチレーション測定を行って、取り込まれた放射能を測定する。
本明細書で使用される、「速度を増加させること」は、本明細書で定義されるような速度を増加させるPEMがない重合反応と比較して、5〜10％、10〜50％、もしくは50〜100％、又はそれを超える増加を指す。
本明細書で使用される場合、「進行性」は、核酸ポリメラーゼとそのテンプレートとの間の単回の接触の間の該ポリメラーゼによる重合の程度、すなわち基質から解離せずに基質に作用し続ける、該ポリメラーゼの性質を指す。重合の程度は、ポリメラーゼとそのテンプレートとの間の単回の接触の間の、ポリメラーゼによって付加されるヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の数を指す。進行性は、ポリメラーゼの性質、テンプレートの配列、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体基質の構造、及び反応条件、例えば、塩濃度、温度、又は特定の添加剤の存在に応じて決まり得る。
本明細書で使用される場合、「進行性を増加させること」は、本明細書で定義されるような進行性を増加させるPEMがない重合反応と比較して、5〜10％、10〜50％、もしくは50〜100％、又はそれ以上の増加を指す。核酸ポリメラーゼの進行性を測定するための方法は、例えば、その全体が、引用により本明細書に組み込まれている、「モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)」、第2版、CSH Press内のSambrookらの文献1989, 7.79-7.83及び13.8、並びに米国特許出願公開第2002/0119467号、PCT出願公開公報第WO01/92501号、及び米国特許第5,972,603号に記載されているように、当技術分野において一般に知られいる。
本明細書で使用される「忠実度」という用語は、テンプレート依存性核酸ポリメラーゼによる核酸重合の正確度を指す。DNAポリメラーゼの忠実度は、誤り率(不正確なヌクレオチド、すなわち、テンプレート依存性様式で取り込まれなかったヌクレオチドを取り込む頻度)によって測定される。DNAポリメラーゼの忠実度又は誤り率は、本技術分野で公知のアッセイを用いて測定され得る(例えば、Lundburgらの文献、1991 Gene, 108:1-6を参照されたい)。本明細書で使用される場合、「忠実度を増加させること」は、本明細書で定義されるような忠実度を増加させる添加剤がない重合反応と比較して、5〜10％、10〜50％、もしくは50〜100％、又はそれ以上の増加を指す。
本明細書で使用される「複数」という用語は、「少なくとも2個」を指す。
「XNTP」は、テンプレート依存型酵素重合と適合する伸長可能な5' 三リン酸修飾ヌクレオチド基質である。XNTPは、2つの別個の機能的構成要素;すなわち、核酸塩基5'-トリホスホロアミデート、及び各ヌクレオシドトリホスホロアミデート内部で、ホスホロアミデート結合のヌクレオチド内での切断による制御された拡張を可能にする位置で取り付けられたテザーを有する。XNTPは、本明細書で使用される、例示的な「非天然の高度に置換されたヌクレオチド類似体基質」である。例示的なXNTP及びそれを作製する方法は、例えば、その全体が引用により本明細書に組み込まれている、出願人によるPCT出願公開公報第WO2016/081871号に記載されている。
「エクスパンドマー中間体」は、XNTPから構築される中間体生成物(本明細書では、「娘鎖」とも称される)であり、標的核酸テンプレートを用いるXNTPのポリメラーゼ媒介性テンプレート指示型構築(polymerase-mediated template-directed assembly)によって形成される。新たに合成されたエクスパンドマー中間体は、拘束エクスパンドマーである。XNTPによって提供されるホスホロアミデート結合が切断されるプロセス工程の下では、拘束エクスパンドマーは、もはや拘束されておらず、テザーが伸ばされて展開されたエクスパンドマー生成物となっている。
「エクスパンドマー」又は「エクスパンドマー生成物」は、XNTP基質のテンプレート指示型構築によってそれ自体が合成される、拘束エクスパンドマーの拡張によって製造される合成の分子構築体である。エクスパンドマーは、それが製造される元の標的テンプレートよりも長いものとされている。これは、配列情報を含む、各サブユニットが1つのモチーフであり、各モチーフがライブラリーの1要素であるサブユニット、テザー、及び、任意に、基質の一部又は全ての連結で構成され、それらの全ては、形成可能な基質構築体(formative substrate construct)に由来する。エクスパンドマーは、拡張して、標的テンプレートよりも長くなり、それによって、長さに沿った標的テンプレートの配列情報の線密度を低下させるよう設計される。加えて、エクスパンドマーは、任意に、レポーターの大きさ及び存在量を増加させるためのプラットフォームを提供し、これは、次いで、検出のための信号対ノイズを改善する。より低い情報線密度及びより強い信号は、分解能を増加させ、テンプレート鎖の配列を検出及び解読する感度要件を減少させる。
「テザー」又は「テザーメンバー」は、概して線状の広がりを有しかつ2つの反対の末端のそれぞれに末端部位を有するポリマー又は分子構築体を指す。テザーは、末端部位での結合でヌクレオシドトリホスホロアミデートに取り付けられて、XNTPを形成する。この結合は、テザーを「拘束立体配置」に拘束するのに役立つ。テザーは、「拘束立体配置」及び「拡張立体配置」を有する。拘束立体配置は、XNTP内及び娘鎖又はエクスパンドマー中間体内に見られる。テザーの拘束立体配置は、エクスパンドマー生成物に見られるような拡張立体配置への前駆体である。拘束立体配置から拡張立体配置への移行は、選択的に切断可能なホスホロアミデート結合の切断の結果として起こる。テザーは、基質の配列情報をコードすることができる1つ以上のレポーター又はレポーター構築体を、その長さに沿って含む。テザーは、エクスパンドマーの長さを増加させ、それによって、配列情報の線密度を低下させる手段を提供する。
「テザーエレメント」又は「テザーセグメント」は、概して線状の広がりを有し、2つの終末端を有し、該末端が、テザーエレメントを連結するための末端結合を形成している、ポリマーである。テザーエレメントは、テザーのセグメントである。そのようなポリマーとしては:ポリエチレングリコール、ポリグリコール、ポリピリジン、ポリイソシアニド、ポリイソシアネート、ポリ(トリアリールメチル)メタクリレート、ポリアルデヒド、ポリピロリノン、ポリ尿素、ポリグリコールホスホジエステル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルエステル、ポリスチレン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ酪酸、ポリブタジエン、ポリブチロラクトン、ポリピロリジノン、ポリビニルホスホネート、ポリアセトアミド、ポリサッカライド、ポリヒアルラネート(polyhyaluranate)、ポリアミド、ポリイミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリテレフタレート、ポリシラン、ポリウレタン、ポリエーテル、ポリアミノ酸、ポリグリシン、ポリプロリン、N置換ポリリジン、ポリペプチド、側鎖N置換ペプチド、ポリN置換グリシン、ペプトイド、側鎖カルボキシル置換ペプチド、ホモペプチド、オリゴヌクレオチド、リボ核酸オリゴヌクレオチド、デオキシ核酸オリゴヌクレオチド、ワトソン・クリック塩基対形成を妨げるように修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、ポリシチジル酸、ポリアデニル酸、ポリウリジル酸、ポリチミジン、ポリホスフェート、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ポリエチレングリコール-ホスホジエステル、ペプチドポリヌクレオチド類似体、トレオシル-ポリヌクレオチド類似体、グリコール-ポリヌクレオチド類似体、モルホリノ-ポリヌクレオチド類似体、ロックされたヌクレオチドオリゴマー類似体、ポリペプチド類似体、分岐鎖ポリマー、櫛形ポリマー、星形ポリマー、樹枝状ポリマー、ランダム、グラジエント、及びブロックコポリマー、アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマー、ステムループを形成するポリマー、剛直セグメント、並びに可撓性セグメントを挙げることができるが、これらに限定されない。
「レポーター」は、1つ以上のレポーターエレメントで構成される。レポーターは、標的核酸の遺伝情報を解析するのに役立つ。
「レポーター構築体」は、検出可能な信号(複数可)を生じさせることができる1つ以上のレポーターを含み、ここで、該検出可能な信号(複数可)は、一般に、配列情報を含む。この信号情報は、「レポーターコード」と名付けられ、その後、遺伝学的な配列データに解読される。レポーター構築体はまた、テザーセグメント又はポリマー、グラフト共重合体、ブロック共重合体、親和性リガンド、オリゴマー、ハプテン、アプタマー、デンドリマー、連結基、又は親和性結合基(例えば、ビオチン)をはじめとする他の構築成分も含み得る。
「レポーターコード」は、測定されたレポーター構築体の信号由来の遺伝情報である。レポーターコードは、解読されて、配列特異的な遺伝情報データを提供する。
従って、一実施態様において、本開示は、本明細書で開示されるようなPEM、及びバッファーを含む組成物を提供する。別の実施態様において、本開示は、本明細書で開示されるようなPEM、並びに複数のヌクレオチド及び/又はヌクレオチド類似体を含む組成物を提供する。別の実施態様において、本開示は、本明細書で開示されるようなPEM、及びポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。別の実施態様において、本開示は、本明細書で開示されるようなPEM、及びタンパク質を含む組成物であって、任意に、該タンパク質が、上述のポリメラーゼのいずれかを含むポリメラーゼである、前記組成物を提供する。
一実施態様において、本開示は、本開示のPEM化合物、例えば、式(I)のPEM化合物又は式(II)のPEM化合物、及び分子クラウディング剤を含む組成物を提供する。一般に、分子クラウディング剤という用語は、さまざまな大型の中性ポリマーを含む。有用な分子クラウディング試薬の例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、フィコール、デキストラン、又はポリビニルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な分子クラウディング試薬及び製剤は、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第7,399,590号に記載されている。一実施態様において、分子クラウディング剤は、4,000〜10,000の数平均分子量を任意に有するポリアルキレングリコールである。一実施態様において、分子クラウディング剤(molecular crowing agent)は、ポリアルキレングリコールの誘導体であり、例えば、ポリアルキレングリコールの末端ヒドロキシル基の一方又は双方は、エステル又はエーテル基の形態である。一実施態様において、分子クラウディング剤は、不活性な水溶性ポリマーである。
一実施態様において、本開示は、本開示のPEM化合物及び水性バッファーを含む組成物を提供する。一実施態様において、PEM化合物は、式(I)を有する。別の実施態様において、PEM化合物は、式(II)を有する。一選択肢において、前記組成物は、約6〜8.5のpHを有し、かつ前記バッファーは、組成物のpHを安定化するのに役立つ。例示的なバッファーは、Tris HClである。他の好適なバッファーとしては、例えば、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、酢酸ナトリウムバッファー、炭酸ナトリウムバッファーなどの当該技術分野で公知のものが挙げられる。
一実施態様において、本開示は、本開示のPEM化合物、例えば、式(I)のPEM化合物、及びポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。一選択肢において、該ポリヌクレオチドは、一本鎖、例えば、一本鎖DNA又は一本鎖RNAである。ポリヌクレオチドが、プライマーとして機能することが意図される場合、該ポリヌクレオチドは、一本鎖DNA分子である。プライマーとして機能することが意図される場合、前記ポリヌクレオチドは、約10-60merのオリゴヌクレオチド、例えば、20〜30オリゴヌクレオチドの長さを有し得る。あるいは、該ポリヌクレオチドは、テンプレートとして機能し得る。その場合、これは、一本鎖DNAでも一本鎖RNAでもよく、かつ30塩基〜キロベース以上の値、例えば、10k塩基以上の長さを有し得る。
一実施態様において、本開示は、本開示のPEM化合物、例えば、式(I)のPEM化合物、及びタンパク質を含む組成物を提供する。例えば、該タンパク質は、酵素、核酸ポリメラーゼ、DNAポリメラーゼであり得る。好適なDNAポリメラーゼの一例は、本明細書で述べられるような、DPO4ポリメラーゼのバリアントである。
一実施態様において、本開示は、少なくとも1種の本開示のPEM化合物、例えば、式(I)のPEM化合物、及びヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物を含む組成物であって、該少なくとも1種の化合物が、テンプレート依存性重合反応の間に娘鎖に取り込まれるヌクレオチド類似体の数及び正確度を、該少なくとも1種の化合物がない場合の同一の重合反応と比較して増加させる、前記組成物を提供する。任意に、該ヌクレオチド類似体の混合物は、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含み、ここで、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンから選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を有し、ここで、該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該重合体のエーテル部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている。任意に、該組成物は、Tris OAc、NH4OAc、PEG、ジメチルホルムアミド(DMF)、N-メチルピロリドン(NMP)、又はアセトンなどの水混和性有機溶媒、ポリホスフェート60、NMS、及びMnCl2のうちの1つ以上を含むバッファーをさらに含む。任意に、該組成物は、一本鎖結合タンパク質も含む。任意に、該組成物は、尿素を含む。任意に、前記ヌクレオチド類似体の混合物は、検出可能な標識を含むヌクレオチド類似体を含み、ここで、該検出可能な標識は、任意に、発光標識、化学発光標識、蛍光標識、蛍光発生標識、発色団標識、又は発色性標識のうちの1つである。一実施態様において、前記組成物は、これらの選択肢のうちの2つ以上、例えば、これらの選択肢の全てを含む。
本開示の一態様において、本明細書で開示されるPEM及びその組成物を用いて、核酸重合反応を強化するか、又は結果として得られる核酸の性質、例えば、反応生成物の長さ又は正確度を改善し得る。重合反応は、例えば、プライマー伸長反応、PCR、変異誘発、等温増幅、DNAシーケンシング、及びプローブ標識法を含む。このような方法は、当技術分野において周知である。強化は、ポリメラーゼの進行性を増加させること(すなわち、ポリメラーゼのテンプレートからの解離を減少させること)、基質結合又は酵素触媒反応の速度を増加させること、及びヌクレオチド取り込みの正確度又は忠実度を増加させることなどの機構によってヌクレオチド取り込みを刺激することによって提供され得る。加えて、強化は、二次構造及び二本鎖DNAなどの、核酸テンプレートでの障害を減少させることによって提供され得る。そのような障害をPEMの添加によって克服する又は改善することは、重合反応がより正確に又はより効率的に起こることを可能とすることができるか、又はより低い変性/伸長温度又は等温度の使用を可能とすることができる。
ある実施態様において、PEMは、ポリメラーゼ反応を強化する別の添加剤クラスと組み合わせて用いられ得る。例示的な添加剤クラスの1つは、副溝結合タンパク質(MGB)である。一実施態様において、MGBは、ディスタマイシンA及びその合成類似体、ネトロプシン、(+)-CC-1065、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、トラベクチン(trabectin)及びその類似体、ヘキスト色素及びその誘導体、レキシトロプシン、チアゾトロプシンA(thiazotropsin A)、ジアミジン、並びにポリアミドからなる群から選択される。ある実施態様において、前記少なくとも1つの副溝結合部位は、ヘキスト色素である。ポリメラーゼ反応を強化するMGBの使用についてのさらなる情報は、出願人により同時に提出された「MGBによる核酸重合の強化」と題する出願で入手し得る。
PEMで強化することができる例示的なポリメラーゼ反応の1つは、Stratos Genomicsにより開発された「拡張によるシーケンシング」(SBX)プロトコルの基礎を成す「XNTP」として知られる非天然ヌクレオチド類似体の重合である(例えば、Kokorisらの文献、米国特許第7,939,259号、「拡張によるハイスループット核酸シーケンシング(High Throughput Nucleic Acid Sequencing by Expansion)」を参照されたい)。一般的には、SBXは、この生化学的重合を使用して、DNAテンプレートの配列を、「エクスパンドマー」と呼ばれる測定可能なポリマー上に転写する。転写された配列は、〜10nm離された高い信号対ノイズのレポーターに、エクスパンドマー骨格に沿ってコード化され、高い信号対ノイズのよく区別された応答のために設計される。これらの差は、ネイティブDNAと比較して、エクスパンドマーの配列リード効率及び正確度における著しい性能強化を提供する。一般化されたSBXプロセスの概要を、図1A、図1B、図1C、及び図1Dに示す。
XNTPは、テンプレート依存型酵素重合と適合する、拡張可能な5' 三リン酸塩修飾ヌクレオチド基質である。高度に簡略化されたXNTPが、図1Aに例示され、ここでは、これらヌクレオチド類似体のユニークな特徴が強調されている:XNTP 100は、2つの別個の機能的領域;すなわち、5’ α-リン酸115を核酸塩基105へ連結している、選択的に切断可能なホスホロアミデート結合110、及びホスホロアミデート結合のヌクレオチド内切断によって制御された拡張を可能にする位置で、ヌクレオシドトリホスホロアミデート内部に取り付けられたテザー120を有する。XNTPのテザーは、前記選択的に切断可能なホスホロアミデート結合によって分離されたリンカーアーム部位125A及び125Bから構成される。その全体が引用により本明細書に組み込まれているKokorisらの文献米国特許第8,324,360号に開示されているように、各リンカーは、連結基(LG)を介してレポーター130の一端に結合する。XNTP 100は、XNTP基質及び重合後の娘鎖に特徴的な「拘束立体配置」で図示される。重合したXNTPの拘束立体配置は、エクスパンドマー生成物にみられる拡張立体配置の前駆体である。拘束立体配置から拡張立体配置への移行は、娘鎖の一次骨格内のホスホロアミデートのP-N結合の切断時に起こる。
エクスパンドマーの合成が、図1B及び図1Cに概説される。構築の間、モノマー性のXNTP基質145(XATP、XCTP、XGTP、及びXTTP)は、新生娘鎖150の伸長可能な終端上に、ガイドとして一本鎖テンプレート140を用いるテンプレート指示型重合のプロセスによって重合される。一般に、このプロセスは、プライマーから開始され、5'から3'の方向に進行する。一般に、DNAポリメラーゼ又は他のポリメラーゼは、娘鎖を形成するのに用いられ、条件は、テンプレート鎖の相補的なコピーが得られるように選択される。娘鎖が合成された後に、連結されたテザーは、娘鎖をさらに含む拘束エクスパンドマーを含む。娘鎖内のテザーは、XNTP基質の「拘束立体配置」を有する。テザーの拘束立体配置は、エクスパンドマー生成物に見られるような拡張立体配置の前駆体である。
図1Cに示されるように、拘束立体配置160から拡張立体配置165への移行は、娘鎖の一次骨格内の選択的に切断可能なホスホロアミデート結合の切断に起因する(単純化のために、影のない楕円形で図示される)。この実施態様において、テザーは、これらが連結された核酸塩基に対して特異的な1つ以上のレポーター又はレポーター構築体130A、130C、130G、又は130Tを含み、それにより、テンプレートの配列情報をコードする。このように、テザーは、エクスパンドマーの長さを増加させ、かつ親鎖の配列情報の線密度を低下させる手段を提供する。
図1Dは、ナノ細孔180を通ってこちら側の液溜め175から向こう側の液溜め185へと移動するエクスパンドマー165を示す。ナノ細孔を通過すると、直線化されたエクスパンドマーのレポーターのそれぞれ(本図においては、「G」、「C」、及び「T」と表示されている)は、それが連結した核酸塩基に対して特異的な、別個のかつ再現性のある電子信号を発生させる(重ねあわされたトレース(superimposed trace)190によって図示される)。
図2は、XNTPの一般化された構造をより詳細に表す。XNTP 200は、リンカーアーム部位220A及び220Bが、選択的に切断可能なホスホロアミデート結合230によって分離された、核酸塩基トリホスホロアミデート210から構成される。テザーは、連結基250A及び250Bでヌクレオシドトリホスホロアミデートに連結され、ここで、第1のテザー末端は、複素環260(ここでは、シトシンで表されるが、該複素環は、4つの標準的な核酸塩基、A、C、G、又はTのいずれか1つであり得る)に連結され、かつ第2のテザー末端は、核酸塩基骨格のα-リン酸270に連結される。当業者は、当技術分野において公知の多くの適切なカップリング化学を、最終XNTP基質産物を形成させるのに用いてもよいことを認めるであろう。例えば、テザーコンジュゲーションは、トリアゾール結合を介して達成され得る。
この実施態様において、テザー275は、エンハンサー280A及び280B、レポーターコード285A及び285B、並びに翻訳制御エレメント(TCE)290A及び290Bを含む、いくつかの機能的エレメントから構成される。これらの特徴のそれぞれは、ナノ細孔を通るエクスパンドマーの移動の間に、一意的かつ再現性のある電子信号の発生によってユニークな機能を果たす。テザー275は、ハイブリダイゼーションによる移動制御(translocation control by hybridization; TCH)のために設計される。図示されるように、TCEは、相補的なオリゴマー(CO)と二本鎖形成することができるハイブリダイゼーションの領域を提供し、かつレポーターコードに隣接して配置される。異なるレポーターコードは、ナノ細孔を通過するイオン流を異なる測定可能なレベルでブロックする大きさとされている。具体的なレポーターコードは、オリゴヌクレオチド合成に通常使用されるホスホロアミダイト化学を用いて効率的に合成することができる。レポーターは、商業的に入手できるライブラリーから特定のホスホロアミダイトの配列を選択することによって設計することができる。このようなライブラリーとしては、長さが1〜12又はそれを超えるエチレングリコール単位であるポリエチレングリコール、長さが1〜12又はそれを超える炭素単位である脂肪族、デオキシアデノシン(A)、デオキシシトシン(C)、デオキシグアノジン(deoxyguanodine)(G)、デオキシチミン(T)、塩基脱落(Q)が挙げられるが、これらに限定されない。レポーターコードに結合する二本鎖TCEは、イオン電流閉塞の一因ともなり、従って、レポーターコード及びTCEの組合せが、「レポーター」と呼ばれることもある。レポーターコードに続くものは、エンハンサーであり、これは、一実施態様において、スペルミンポリマーを含む。
図3は、α-ヘモリジンナノ細孔を移動させるプロセスにおいて切断されたエクスパンドマーの一実施態様を示す。この生物学的ナノ細孔は、2つの電解質の液溜めを分離し電気的に絶縁する、脂質二重層膜内に埋め込まれている。典型的な電解質は、7.0のpHに緩衝された1モル濃度のKClを有する。二重層を横切って小電圧、通常、100mVが印加される場合、ナノ細孔は、イオン電流の流れを制限し、かつ回路での主要な抵抗となる。エクスパンドマーレポーターは、特定のイオン電流閉塞レベルを与えるよう設計されており、配列情報を、一連のレポーターが、ナノ細孔を移動するときの、一連のイオン電流レベルを測定することによって読み取ることができる。
α-ヘモリジンナノ細孔は、通常、前庭側(vestibule side)から入り基部側(stem side)に出ることによって移動が起こる向きに置かれる。図3に示されるように、ナノ細孔は、初めに基部側からのエクスパンドマーを捕獲する向きに置かれる。この配向性は、初めに前庭に入る場合に起こる閉塞の人為的結果(blockage artifact)が少なくなるという理由で、TCH法を用いる際に有利である。別途指示されない限り、基部側を先にすることを、想定の移動方向とする。エクスパンドマーが移動すると、レポーターは、基部入口でその二本鎖TCEが停止するまで、基部に入る。二本鎖は、直径が〜2.4nmであり、その一方で、基部入口は、〜2.2nmであるため、レポーターは、二本鎖の相補鎖395が、解離(遊離)するまで基部に保持され、その後すぐに、移動は、次のレポーターに進む。エクスパンドマーがまだ移動中であるという理由で、遊離相補鎖がナノ細孔に入るのは非常に不利であり、遊離相補鎖は細孔から離れて拡散する。
一実施態様において、(二本鎖に続く)レポーターコードの各メンバーは、多くの商業的なライブラリーから選択することができるホスホロアミダイトの順序選択(ordered choice)によって形成される。構成する各ホスホロアミダイトは、ナノ細孔内でのその位置(二本鎖停止後に置かれる位置)、その排除体積(displacement)、その電荷、ナノ細孔とのその相互作用、その化学的及び熱的環境、並びに他の因子に応じて、正味のイオン抵抗に貢献する。各ホスホロアミダイト上の電荷は、部分的には、-1の名目電荷を有するリン酸イオンによるものであるが、対イオン遮蔽(counterion shielding)によって実際上減少している。二本鎖を引く力は、局所電場によって作用される、レポーターに沿ったこれらの有効電荷によるものである。各レポーターは、異なる電荷分布を有し得るため、これは、所与の印加電圧で異なる力を二本鎖に対して働かせることができる。レポーター骨格に沿って伝達される力は、レポーターを広げて、繰返し可能なブロッキング応答を与えるのにも役立つ。
本発明者らにより開発された拡張によるシーケンシング(SBX)方法体系は、ネイティブDNAと比較して、エクスパンドマーの配列リード効率及び正確度の著しい性能強化を提供する。しかしながら、はじめの天然DNAテンプレートの配列の測定可能なエクスパンドマー上への転写は、DNAポリメラーゼが、基質としてXNTPを利用する能力に頼っている(XNTPの一般化された構造は、図1A及び図2を参照して本明細書で解説される)。本発明者らは、大部分のDNAポリメラーゼが、XNTPを効率的に重合させないことを見出だした。しかしながら、本開示のPEMなどの適当な添加剤を含めると、エクスパンドマーへのXNTP重合の効率及び正確度が改善する。従って、本明細書で開示されるPEMを、SBX方法体系との関連で用いて、基質としてXNTPを用いるDNAポリメラーゼプライマー伸長反応を強化し得る。
代表的なプライマー伸長反応は、以下の試薬: 2pmol プライマー、2.2pmol 45merオリゴヌクレオチドテンプレート、50pmolの各XNTP(XATP、XCTP、XGTP、及びXTTP)、50mM Tris HCl、pH 6.79、200mM NaCl、20％ PEG、5％ NMS、0.5nmol ポリホスフェート60.19、0.3mM MnCl2、及び0.6μgの精製組換えDNAポリメラーゼタンパク質を含み得る。PEMは、通常、マイクロモル濃度からミリモル濃度の範囲の濃度でこの混合物に添加される。反応は、一本鎖結合タンパク質(SSB)、尿素、及びNMSなどの、追加の添加剤も含み得る。反応は、23℃で1時間実施される。反応生成物(すなわち、拘束エクスパンドマー)は、ホスホロアミデート結合を切断するように処理され、それにより、直線化されたエクスパンドマーを生じる。反応生成物を、4〜12％アクリルアミドゲル上でのゲル電気泳動を用いて分析して、異なる長さのエクスパンドマー生成物を決定し可視化する。
従って、一実施態様において、本開示は、PEM及びバッファー、特に、DNA重合反応を実施するのに適したバッファーを含む水性(含水)組成物を提供し、ここで、Tris HClが、例示的なこの種のバッファーである。一実施態様において、本開示は、PEM及びDNAポリメラーゼタンパク質を含む組成物を提供する。一実施態様において、本開示は、PEM、及びポリヌクレオチド、例えば、20〜90mer、20〜60mer、30〜90mer、又は30〜60merのオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。一実施態様において、本開示は、これらの成分のそれぞれを含む組成物、すなわち、PEM、バッファー、DNAポリメラーゼタンパク質、及びポリヌクレオチドを含む水性組成物を提供する。
XNTP重合の強化の正確度を調査するために、プライマー伸長生成物を、SBXプロトコルを用いてシーケンシングしてもよい。簡単に述べると、XNTP重合の拘束エクスパンドマー生成物を切断して、直線化されたエクスパンドマーを生成させる。これは、初めに、伸長反応を、100mM EDTA、2mM THPTA、及び2％ Tween-20を含有する溶液でクエンチすることによって達成される。その後、試料を、DMF中の1M NaHCO3及び1M 無水コハク酸の溶液を用いて、アミン修飾する。ホスホロアミデート結合の切断を、37％ HClを用いて行い、直線化されたエクスパンドマーを、QIAquickカラム(QIAGEN社)で精製する。
シーケンシングのために、2M NH4Cl及び100mM HEPES、pH 7.4を含有するバッファーB1中のDPhPE/ヘキサデカン二重層メンバー内にα-ヘモリジンを挿入することによって、タンパク質ナノ細孔を調製する。cisウェルを、0.4M NH4Cl、0.6M GuCl、及び100mM HEPES、pH 7.4を含有するバッファーB2で灌流する。エクスパンドマー試料を、70℃に2分間加熱し、完全に冷却し、その後、2μLの試料を、前記cisウェルに添加する。その後、90mV/390mV/10μsの電圧パルスを印加し、データを、Labview取得ソフトウェアによって取得する。
配列データを、単一のSBX反応からの配列リードの集団のヒストグラム表示によって解析する。解析ソフトウェアは、各配列リードをテンプレートの配列に整列させ、正しいテンプレート配列と整列されなかったリードの最後の配列の範囲を取り除く。
一実施態様において本開示は、XNTP重合の強化の正確度を増加させる方法であって、上述のように、本明細書で開示されるようなPEMを、DNA重合反応に添加することを含む、前記方法を提供する。
一実施態様において、本開示は、本明細書に記載されるような方法で使用し得る、キットを提供する。該キットは、少なくとも1種の本開示の化合物、及び以下a)分子クラウディング剤、b)水性バッファー、c)ポリメラーゼなどのタンパク質、d)例えば、プライマーとして機能し得るポリヌクレオチド、及び/又は例えば、テンプレートとして機能し得るポリヌクレオチドのうちの1つ以上を含むものである。
例えば、一実施態様において、本開示は、核酸テンプレートをシーケンシングするためのキットを提供する。該キットは、少なくとも1種の本開示の化合物、及びヌクレオチド類似体の混合物を含む。本開示の化合物を用いて、テンプレート依存性重合反応の間に娘鎖に取り込まれるヌクレオチド類似体の数及び正確度を、該少なくとも1種の本開示の化合物が存在しない場合の同一の重合反応と比較して増加させ得る。任意に、ヌクレオチド類似体の混合物は、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含み、ここで、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、ここで、該ポリマー性のテザー部位の第1末端は、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該重合体のエーテル部位の第2末端は、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている。任意に、該ヌクレオチド類似体の混合物は、検出可能な標識を含むヌクレオチド類似体を含み、ここで、該検出可能な標識は、発光標識、化学発光標識、蛍光標識、蛍光発生標識、発色団標識、又は発色性標識からなる群から選択される光学的に検出可能な標識である。任意に、前記キットは、Tris OAc、NH4OAc、PEG、水混和性有機溶媒(例えば、ジメチルホルムアミド(DMF)、N-メチル-2-ピロリドン(NMP)、アセトンなど)、ポリホスフェート60、NMS、及びMnCl2を含む水性バッファーを含む。任意に、前記キットは、一本鎖結合タンパク質を含む。任意に、前記キットは、尿素を含む。任意に、前記キットは、これらの成分のうちの2つ以上、例えば、挙げられた成分のうちの3つ、又は4つ、又は全てを含む。
前述のように、本開示は、式(Ia)、式(Ib)、式(Ic)、式(Id)、式(Ie)、式(If)、式(Ig)、式(Ih)、式(Ii)、式(Ij)、式(Ik)、式(Im)、式(In)、式(Io)、式(Ip)、式(Iq)、式(Ir)、及び(Is)のPEM化合物を含む、式(I)のPEM化合物を提供する。別の実施態様において、本開示は、式(II)
Figure 2021509584
 のPEM化合物を提供し、これは、同様に、本開示の組成物中に存在してもよく、本開示の方法で用いられてもよい。あるいは、式(II)のPEMは、Ar3(トリアゾール-Ar4)2として表され得る。式(II)において、Ar3は、括弧内に示される2個のトリアゾール環で置換された芳香族部位を表す。各トリアゾール環は、Ar4によって表される単環式芳香環で置換され、ここで、Ar4は、フェニル及びそのN含有類似体、例えば、ピリジニルから選択され得る。トリアゾール基に加えて、式(II)の化合物のAr4部位は、水素以外の任意の原子で置換されていても、置換されていなくてもよい。Ar4が、さらに置換されている場合、該1個以上の置換基は、G基として示され得る。一実施態様において、該G基は、以下の基:E-X、E-CO2R、E-CONH2、E-CHO、E-NR2、及びE-ORのうちの1つ又は任意の2つ以上から選択される。これらのG基において、Eは、直接の結合及び短いアルキレン鎖、すなわち、C1-C6、アルキレン鎖、例えば、メチレン(すなわち、-CH2-)、エチレン(すなわち、-CH2CH2-)、プロピレン(すなわち、-CH2CH2CH2-)及びブチレン(すなわち、-CH2CH2CH2CH2-)から選択され;Xは、フルオリド、クロリド、ブロミド、及びヨージドから選択されるハライドであり;かつRは、独立に、H及び短いアルキル基、すなわち、C1-C6アルキル基から選択される。式(II)の範囲内の化合物は、示された構造のキレート及び塩を含み、例えば、示された構造の銅キレートが、開示される化合物の範囲内に含まれる。以下の解説は、式(II)の化合物に関連する。
式(II)の化合物に関して、Ar3部位は、芳香族部位である。該芳香族部位は、炭素環式又はヘテロ環式の芳香族部位であり得、ここで、炭素環式芳香族部位においては、該芳香環原子のそれぞれは、炭素であり、一方で、ヘテロ環式芳香族部位においては、該芳香環原子の少なくとも1個は、窒素、酸素、又は硫黄である。例示的な芳香族部位は、炭素環式芳香族部位である。炭素環式部位は、1個(例えば、ベンゼン)、又は2個(例えば、ナフタレン、アズレン)、又は3個(例えば、アセナフチレン、フルオレン)、又は4個(例えば、フルオランテン、アセアントリレン)、又は5個(例えば、ペンタセン、ピセン)、又は6個(例えば、ヘキサセン)の芳香環を含んでもよく、ここで、便宜上、該Ar3基は、その非置換体(例えば、ベンゼン)を挙げることによって本明細書で例示され得るが、式(II)の化合物において、該Ar3基は、対応するジラジカル、すなわち、2つの環水素がトリアゾール基と置き換えられた該非置換体である。例えば、芳香族部位は、単環式炭素環式部位、すなわち、C6芳香族部位とも称されるフェニルであり得る。別の例として、芳香族部位は、二環式炭素環式部位、例えば、C10芳香族部位であるナフチルであり得る。
式(II)の化合物に関して、Ar3は、置換型及び無置換型芳香族部位の双方を含む。一実施態様において、Ar3は、置換型芳香族部位である。一実施態様において、Ar3は、無置換型芳香族部位であって、これは、非置換型芳香族部位とも呼ばれ得る。置換型芳香族部位においては、1個以上の水素原子が、置換基と置き換えられ、例えば、任意に、水素原子のうちの1個、又は2個、又は3個、又は4個、又は5個、又は6個が、置換基と置き換えられ得る。該置換基は、アルキル基、例えば、C1-C6アルキル基であってもよく、ここで、該アルキル基は、フルオリドなどの1個以上のハライドで任意に置換されて、ハロアルキル置換基を提供してもよい。更に、又はあるいは、例示的な置換基は、アミノ基、ヒドロキシ基、シアノ基、カルボキシ基、ニトロ基、チオ基、アルコキシ基、及びハロゲン基から選択され得る。
式(II)の化合物に関して、例示的な芳香族部位は、ヘテロ環式芳香族部位であり、これは、ヘテロアリール基と呼ばれることもある。該ヘテロ環式部位は、1個、又は2個、又は3個、又は4個、又は5個、又は6個のヘテロ原子、すなわち、窒素、硫黄、及び酸素原子から選択される炭素以外の原子を含むことに加えて、1個又は2個又は3個又は4個又は5個又は6個の芳香環を含み得る。任意に、該ヘテロ原子は、存在するのであれば、窒素である。例えば、該芳香族部位は、単環式ヘテロ環式部位、例えば、6員のC5芳香族部位であるピリジニル、又は6員のC4芳香族部位であるピラジニルであり得る。別の例として、前記芳香族部位は、二環式ヘテロ環式部位、例えば、10員のC9芳香族部位であるキノリニルもしくはイソキノリニル、又は例示的な10員のC8芳香族部位である1,5-ナフチリジニル、2,6-ナフチリジニル、もしくは2,7-ナフチリジニルであり得る。
従って、式(II)の化合物のヘテロアリール基は、5個以上の環員を含み、そのうちの1個以上が、これらに限定されないが、N、O、及びSなどのヘテロ原子である、芳香環化合物である。C2-ヘテロアリールと呼ばれるヘテロアリール基は、2個の炭素原子及び3個のヘテロ原子を有する5員環、2個の炭素原子及び4個のヘテロ原子を有する6員環などとすることができる。同様に、C4-ヘテロアリールは、1個のヘテロ原子を有する5員環、2個のヘテロ原子を有する6員環などとすることができる。炭素原子の数＋ヘテロ原子の数は、合計で、環原子の総数と等しくなる。式(II)中のヘテロアリール基としては、ピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、ピリジニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、インドリル、アザインドリル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、アザベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、イミダゾピリジニル、イソオキサゾロピリジニル、チアナフタレニル、プリニル、キサンチニル、アデニニル、グアニニル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、キノキサリニル、及びキナゾリニル基などの基が挙げられるが、これらに限定されない。このように、「ヘテロアリール」及び「ヘテロアリール基」という用語は、必ずしも全ての環ではない少なくとも1個の環が、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、インドリル、及び2,3-ジヒドロインドリルをはじめとする芳香族であるものなどの縮合環化合物を含む。
式(II)の化合物中のAr3基は、本明細書で説明されるように、芳香族部位を含むものであり、ここで、該芳香族部位は、同じく本明細書に記載されるように任意に置換されていてもよく、該置換は、2個のトリアゾール基(トリアゾール-Ar4)で置換されることに加えてのものである。例示的な式(II)の化合物のAr3の置換基は、フルオリド、クロリド、及びブロミドなどのハライド、メチル及びエチルなどの1〜6個の炭素原子を有するアルキル基、トリフルオロメチルなどの1〜6個の炭素原子を有するハロアルキル基、シアノ、ホルミル、及びカルボキサミドである。Ar3芳香族部位の任意の2個の炭素が、トリアゾール-Ar4部位で置換され得る。例えば、Ar3が、置換ベンゼンである場合、Ar3は、以下に示されるようにオルト、メタ、又はパラ位で置換され得る:
Figure 2021509584
 (式中、kは、芳香族部位上のどこで置換が起こり得るかを指定する)。
別の例として、式(II)の化合物におけるAr3が、置換ナフタレンである場合、Ar3は、任意の2個のナフチル炭素原子で置換されてよく、ここで、以下の構造が、置換の選択肢を示す:
Figure 2021509584
 (式中、kは、芳香族部位上のどこでトリアゾール置換が起こり得るかを示す)。
上記の例では、炭素環式芳香族Ar3基を例示的なAr3部位として用いて式(II)の化合物のAr3部位上のトリアゾール置換を説明した。しかしながら、同じ原理が、式(II)の化合物のヘテロ環式芳香族Ar3基上のトリアゾール置換にあてはまる。例えば、Ar3が、置換ピリジンである場合、2個のトリアゾール基は、ピリジン環上の以下の位置のいずれかに配置され得る:
Figure 2021509584
 (式中、kは、トリアゾール基が配置され得る位置を指定するのに用いられる)。
一実施態様において、式(II)の化合物におけるAr3芳香族部位は、1〜6個の環を含んでもよく、ここで、環原子のうちの最大で6個が、酸素、硫黄、及び窒素から選択されてもよく、残りは、炭素原子である。任意に、Ar3芳香族部位は、1〜5個の環を含んでもよく、ここで、環原子のうちの最大で5個が、酸素、硫黄、及び窒素から選択されてもよい。別の選択肢として、Ar3部位は、1〜4個の環を含んでもよく、ここで、環原子のうちの4個までが、酸素、硫黄、及び窒素から選択されてもよい。さらに別の選択肢として、Ar3部位は、1〜3個の環を含んでもく、ここで、環原子のうちの3個までが、酸素、硫黄、及び窒素から選択されてもよい。さらなる例として、Ar3部位は、1〜2個の環を含んでもよく、ここで、環原子のうちの3個までが、酸素、硫黄、及び窒素から選択されてもよい。いかなる場合でも、式(II)の化合物において、各環は独立に、5員環、すなわち、5個の環原子が該環を形成していてもよく、又は6員環もしくは7員環であってもよく、ある選択肢において、該環のそれぞれは、5又は6員環のいずれかである。
従って、例示的な一実施態様において、式(II)の化合物におけるAr3は、以下:
Figure 2021509584
 (式中、トリアゾール環は、Ar3上の位置kで置換される)
から選択される、単環式ヘテロ芳香族構造である。別の例示的な実施態様において、式(II)の化合物におけるAr3は、以下:
Figure 2021509584
 (式中、トリアゾール環は、Ar3上の位置kで置換される)
から選択される単環式炭素環式構造である。別の例示的な実施態様において、式(II)の化合物におけるAr3は、以下:
Figure 2021509584
 (式中、トリアゾール環は、Ar3上の位置kで置換される)
から選択される二環式炭素環式構造である。別の実施態様において、式(II)の化合物におけるAr3は、2個の6員環及び1個の5員環、並びに1個の窒素環原子を有し、かつ以下:
Figure 2021509584
 (式中、トリアゾール環は、Ar3上の位置kで置換される)
から選択される多環式ヘテロ環式構造である。さらに別の例示的な実施態様において、式(II)の化合物におけるAr3は、3個の6員環及び2個の窒素環原子を有し、かつ以下:
Figure 2021509584
 (式中、トリアゾール環は、Ar3上の位置kで置換される)
から選択される多環式ヘテロ環式構造である。
式(II)の化合物における各トリアゾール環は、Ar4によって表される単環式芳香環で置換されており、ここで、Ar4は、例えば、フェニル又はピリジニルであってよい。トリアゾール基に加えて、Ar4部位は、水素以外の原子で置換されていても、置換されていなくてもよい。Ar4が、さらに置換されている場合、式(II)の化合物における1個以上の置換基は、G基として表されることがある。一実施態様において、G基は、以下の基:E-X、E-CO2R、E-CONH2、E-CHO、E-NR2、及びE-ORのうちの1つ又は任意の2つ以上から選択される。これらのG基において、Eは、直接の結合及び短いアルキレン鎖、すなわち、C1-C6、アルキレン鎖、例えば、メチレン(すなわち、-CH2-)、エチレン(すなわち、-CH2CH2-)、プロピレン(すなわち、-CH2CH2CH2-)及びブチレン(すなわち、-CH2CH2CH2CH2-)から選択され;Xは、フルオリド、クロリド、ブロミド、及びヨージドから選択されるハライドであり;かつRは、独立に、H及び短いアルキル基、すなわち、C1-C6アルキル基から選択される。
以下は、式(II)の化合物に関する本開示の追加の例示的な実施態様である:
式(II)の化合物(そのキレート及び塩を含む):
Figure 2021509584
 (式中、
Ar3は、2個のトリアゾール環で置換された芳香族構造であり;かつ
Ar4は、フェニル及びピリジニルから選択される単環式芳香環であって、ここで、Ar4は、E-X、E-CO2R、E-CONH2、E-CHO、E-NR2、及びE-ORから選択される1個以上の置換基(G)で置換され得、
a. Eは、直接の結合、メチレン、エチレン、プロピレン、及びブチレンから選択され;
b. Xは、フルオリド、クロリド、ブロミド、及びヨージドから選択されるハライドであり;かつ
c. Rは、独立に、H及びC1-C6アルキルから選択される)。
1) Ar3が、以下:
Figure 2021509584
 (式中、トリアゾール環は、Ar3上の位置kで置換される)
から選択される単環式ヘテロ芳香族構造である、実施態様1記載の式(II)の化合物。
2) Ar3が、以下:
Figure 2021509584
 (式中、トリアゾール環は、Ar3上の位置kで置換される)
から選択される単環式炭素環式構造である、実施態様1記載の式(II)の化合物。
3) Ar3が、以下:
Figure 2021509584
 (式中、トリアゾール環は、Ar3上の位置kで置換される)
から選択される二環式炭素環式構造である、実施態様1記載の式(II)の化合物。
4) Ar3が、以下:
Figure 2021509584
 (式中、トリアゾール環は、Ar3上の位置kで置換される)
から選択される多環式ヘテロ環式構造である、実施態様1記載の式(II)の化合物。
5) Ar3が、以下:
Figure 2021509584
 (式中、トリアゾール環は、Ar3上の位置kで置換される)
から選択される多環式ヘテロ環式構造である、実施態様1記載の式(II)の化合物。
6) Ar4が、以下:
Figure 2021509584
 (式中、置換基Gは、ピリジニル環上に0個、1個、又は2個存在する)
から選択されるピリジニル環である、実施態様1〜6のいずれか1つ記載の式(II)の化合物。
7) Ar4が、以下の式:
Figure 2021509584
 (式中、置換基Gは、該フェニル環上に0個、1個、又は2個存在する)
のフェニル環である、実施態様1〜6のいずれか1つ記載の式(II)の化合物。
8) Ar4が、以下:
Figure 2021509584
 から選択される置換フェニル環である、実施態様1〜6のいずれか1つ記載の式(II)の化合物。
9) 前記Ar4上の置換が、1個のカルボン酸基及び1個のヒドロキシル基である、実施態様1〜9のいずれか1つ記載の式(II)の化合物。
10)前記Ar4上の置換が、1個のアミノ基である、実施態様1〜9のいずれか1つ記載の式(II)の化合物。
11) 前記Ar4上の置換が、1個のメトキシ基である、実施態様1〜9のいずれか1つ記載の式(II)の化合物。
12) 前記Ar4上の置換が、1個のカルボン酸基である、実施態様1〜9のいずれか1つ記載の式(II)の化合物。
13) 前記Ar4上の置換が、1個の-CH2-CO2-CH3基である、実施態様1〜9のいずれか1つ記載の式(II)の化合物。
14) キレートの形態の、実施態様1〜14のいずれか1つ記載の式(II)の化合物。
15) 前記キレートが、銅キレートである、実施態様15記載の式(II)の化合物。
16) 実施態様1〜16のいずれか1つ記載の式(II)の化合物、及びTris HClなどの水性バッファーを含む組成物。
17) 実施態様1〜16のいずれか1つ記載の式(II)の化合物、及び20〜60merのオリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを含む組成物。
18) 実施態様1〜16のいずれか1つ記載の式(II)の化合物、及びDNAポリメラーゼなどのタンパク質を含む組成物。
19) 実施態様1〜16のいずれか1つ記載の式(II)の化合物、及びヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物を含む組成物。
20) 核酸ポリメラーゼ反応を強化する方法であって:
a. 以下:
i. テンプレート核酸,
ii. 核酸ポリメラーゼ、
iii. ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物、及び
iv. 実施態様1〜16のいずれか1つ記載の少なくとも1種の式(II)の化合物
を含む核酸ポリメラーゼ反応組成物を形成させること;及び
b. 該核酸ポリメラーゼ反応組成物を、核酸重合反応を可能とする条件下でインキュベートすることであって、該実施態様1〜16のいずれか1つ記載の少なくとも1種の式(II)の化合物が、該核酸ポリメラーゼ反応の進行性、速度、又は忠実度を増加させる、前記インキュベートすること
を含む前記方法。
21) 実施態様1〜16のいずれか1つ記載の式(II)の化合物が、結果として得られる核酸生成物の長さを、該実施態様1〜16のいずれか1つ記載の式(II)の化合物を欠く核酸ポリメラーゼ反応と比較して増加させる、実施態様21記載の方法。
22) 前記実施態様1〜16のいずれか1つ記載の少なくとも1種の式(II)の化合物が、実施態様1〜16のいずれか1つ記載の複数の式(II)の化合物を含む、実施態様21記載の方法。
23) 前記核酸ポリメラーゼが、DNAポリメラーゼである、実施態様21記載の方法。
24) 前記DNAポリメラーゼが、DPO4又はそのバリアントである、実施態様24記載の方法。
25) 前記ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物が、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含むヌクレオチド類似体の混合物であり、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該ポリマー性のテザー部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている、実施態様21記載の方法。
26) 前記核酸重合反応が、ヌクレオチド類似体の拡張可能なポリマーを生じさせ、該拡張可能なポリマーが、前記テンプレート核酸の核酸塩基配列情報をコードする、実施態様21記載の方法。
27) 前記核酸重合反応を可能とする条件が、好適な重合バッファー及びオリゴヌクレオチドプライマーを含む、実施態様21記載の方法。
28) 前記好適なバッファーが、Tris OAc、NH4OAc、PEG、DMF、ポリホスフェート60、NMS、及びMnCl2を含む、実施態様21記載の方法。
29) 前記反応混合物が、一本鎖結合タンパク質をさらに含む、実施態様21記載の方法。
30) 前記反応混合物が、尿素をさらに含む、実施態様21記載の方法。
31) 前記ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物が、検出可能な標識を含むヌクレオチド類似体を含む、実施態様21記載の方法。
32) 前記検出可能な標識が、発光標識、化学発光標識、蛍光標識、蛍光発生標識、発色団標識、又は発色性標識からなる群から選択される光学的に検出可能な標識である、実施態様32記載の方法。
33) DNAポリメラーゼ反応の進行性、忠実度、又は速度を強化するのに適した組成物であって、実施態様1〜16のいずれか1つ記載の少なくとも1種の化合物、及びヌクレオチド類似体の混合物を含む、前記組成物。
34) 少なくとも実施態様1〜16のいずれか1つ記載の式(II)の化合物、及びヌクレオチド類似体の混合物を含む組成物であって、任意に、該実施態様1〜16のいずれか1つ記載の少なくとも1種の式(II)の化合物が、テンプレート依存性重合反応の間に娘鎖に取り込まれるヌクレオチド類似体の数及び正確度を、該実施態様1〜16のいずれか1つ記載の少なくとも1種の式(II)の化合物が存在しない同一の重合反応と比較して増加させる、前記組成物。
35) 前記ヌクレオチド類似体の混合物が、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含み、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該重合体のエーテル部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている、実施態様35記載の組成物。
36) Tris OAc、NH4OAc、PEG、DMF、ポリホスフェート60、NMS、及びMnCl2を含むバッファーをさらに含む、実施態様35記載の組成物。
37) 一本鎖結合タンパク質をさらに含む、実施態様35記載の組成物。
38) 尿素をさらに含む、実施態様35記載の組成物。
39) 前記ヌクレオチド類似体の混合物が、検出可能な標識を含むヌクレオチド類似体を含む、実施態様35記載の組成物。
40) 前記検出可能な標識が、発光標識、化学発光標識、蛍光標識、蛍光発生標識、発色団標識、又は発色性標識からなる群から選択される光学的に検出可能な標識である、実施態様40記載の組成物。
41) DNAテンプレートをシーケンシングする方法であって、以下の工程:
a. 以下:
i. DNAテンプレート、
ii. 該テンプレートと複合体を形成する複製プライマー、
iii. DNAポリメラーゼ、
iv. ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物、
v. 実施態様1〜16のいずれか1つ記載の少なくとも1種の式(II)の化合物
を含むDNAポリメラーゼ反応組成物を形成させる工程;
b. DNA重合反応を可能とする条件下で該DNAポリメラーゼ反応組成物をインキュベートする工程であって、該実施態様1〜16のいずれか1つ記載の少なくとも1種の式(II)の化合物が、該DNAポリメラーゼ反応の速度、忠実度、又は進行性を増加させる、前記工程;及び
c. 結果として得られるヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のポリマー内の該ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の配列を決定する工程
を含む前記方法。
42) 前記ヌクレオチド類似体の混合物が、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含み、
該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、
該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該重合体のエーテル部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている、実施態様42記載の方法。
43) 前記DNAポリメラーゼが、DPO4又はそのバリアントである、実施態様42記載の方法。
44) 前記結果として得られるヌクレオチド類似体のポリマーが、拡張可能なポリマーである、実施態様42記載の方法。
45) 前記拡張可能なポリマーを、ホスホロアミデート切断剤と接触させて、拡張されたヌクレオチド類似体のポリマーを生成させる工程をさらに含む、実施態様42記載の方法。
46) 前記ヌクレオチド類似体のそれぞれの前記ポリマー性のテザー部位が、該類似体の核酸塩基に対して一意的なレポーター部位を含む、実施態様42記載の方法。
47) 前記レポーター部位が、特有の電子信号を生じさせる、実施態様42記載の方法。
48) 前記ヌクレオチド類似体の配列を決定する工程が、ナノ細孔を通して前記拡張されたヌクレオチド類似体のポリマーを移動させる工程を含む、実施態様42記載の方法。
化合物は、当業者に公知の方法によって調製され得、ここで、そのような方法は、さまざまな参考書籍及びデータベースを通じて特定し得る。本開示の化合物の調製に役立つ反応物質の合成を詳述するか、又は該調製を記載する論文への参照を提供する適切な参考書籍及び学術論文、としては、例えば、「有機合成化学(Synthetic Organic Chemistry)」 John Wiley ＆ Sons社, New York; S. R. Sandlerらの文献「有機官能基の調製(Organic Functional Group Preparations)」、第2版, Academic Press, New York, 1983; H. O. Houseの文献「現代の合成反応(Modern Synthetic Reactions)」、第2版, W. A. Benjamin社、 Menlo Park, Calif 1972; T. L. Gilchristの文献「ヘテロ環の化学(Heterocyclic Chemistry)」、第2版, John Wiley ＆ Sons, New York, 1992; J. Marchの文献、「上級有機化学:反応、機構、及び構造(Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure)」、第4版, Wiley-Interscience, New York, 1992が挙げられる。本開示の化合物の調製に役立つ反応物質の合成を詳述するか、又は該調製を記載する論文への参照を提供する追加の適切な参考書籍及び学術論文としては、例えば、Fuhrhop, J及びPenzlin G.の文献「有機合成:概念、方法、出発材料(Organic Synthesis: Concepts, Methods, Starting Materials)」、第2改訂拡張版(1994) John Wiley ＆ Sons ISBN: 3-527-29074-5; Hoffman, R. V.の文献「有機化学、中級テキスト(Organic Chemistry, An Intermediate Text)」(1996) Oxford University Press, ISBN 0-19-509618-5; Larock, R. C.の文献「有機変換総覧:置換基調製ガイド(Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Functional Group Preparations)」、第2版、(1999) Wiley-VCH, ISBN: 0-471-19031-4; March, J.の文献「上級有機化学:反応、機構、及び構造(Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure)」、第4版、(1992) John Wiley ＆ Sons, ISBN: 0-471-60180-2; Otera, J.編の文献「現代のカルボニル化学(Modern Carbonyl Chemistry)」(2000) Wiley-VCH, ISBN: 3-527-29871-1; Patai, S.の文献「1992年版Pataiの官能基化学のガイド(Patai's 1992 Guide to the Chemistry of Functional Groups)」(1992) Interscience ISBN: 0-471-93022-9; Quin, L. D.らの文献「有機リン化学のガイド(A Guide to Organophosphorus Chemistry)」(2000) Wiley-Interscience, ISBN: 0-471-31824-8; Solomons, T. W. G.の文献「有機化学(Organic Chemistry)」、第7版(2000) John Wiley ＆ Sons, ISBN: 0-471-19095-0; Stowell, J. C.の文献「中級有機化学(Intermediate Organic Chemistry)」、第2版、(1993) Wiley-Interscience, ISBN: 0-471-57456-2; 「工業有機化学薬品:出発物質及び中間体:Ullmannの百科事典(Industrial Organic Chemicals: Starting Materials and Intermediates: An Ullmann's Encyclopedia)」(1999) John Wiley ＆ Sons, ISBN: 3-527-29645-X、全8巻; 「有機反応(Organic Reactions)」 (1942-2000) John Wiley ＆ Sons、全55巻超;及び、「置換基の化学(Chemistry of Functional Groups)」 John Wiley ＆ Sons、全73巻が挙げられる。
(実施例)
表7に示される化合物を、本明細書で開示される一般実施例により調製した。
(材料及び方法)
4-アジドサリチル酸及び2,6-ジブロモ-4-ピリジンカルボン酸は、Toronto Research Chemicals社(Toronto, ON, カナダ)から入手した。7-アミノ-2-ヒドロキシ-1,8-ナフチリジン-4-カルボン酸は、Enamine LLC (Monmouth, NJ)から入手した。トリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン(TBTA)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HATU)、1,3-ジエチニルベンゼン、2,6-ジエチニルピリジン、3,5-ジエチニルピリジン、3,6-ジエチニルカルバゾール、4-アジド安息香酸は、TCI America (Portland, OR, 米国)から入手した。4-メトキシ-2,6-ジブロモピリジン、4-ニトロ-2,6-ジブロモピリジン、及び2,6-ジブロモ-4-ピリジンカルボン酸は、Chem-Impex International社(Wood Dale, IL)から入手した。4-シアノ-2,6-ジブロモピリジンは、Ark Pharm社(Arlington Heights, IL)から入手した。テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)、エチニルトリメチルシラン、DMSO、アスコルビン酸ナトリウム、硫酸銅、メチル 2,6-ジクロロピリジン-4-カルボキシレート、エチル 2,6-ジブロモピリジン-4-カルボキシレート、4-メチル-2,6-ジクロロピリジン、2-クロロ-4-シアノピリジン、4-アミノ-2-(トリフルオロメチル)安息香酸、2-ブロモ-4-シアノピリジン、メチルアジド アセテート、4-アジドアニリン塩酸塩、4-メトキシフェニル アジド、及びEDTAは、Sigma-Aldrich社(St. Louis, MO, 米国)から入手した。TLC及びフラッシュクロマトグラフィー溶媒は、Sigma-Aldrich又はThermo Fisher Scientific社(Waltham, MA, 米国)から入手した。
フラッシュクロマトグラフィーは、Buchi社(New Castle, DE)のReveleris Prep Purification Systemで行った。このシステムに、Sorbent Technologies社(Norcross, GA)のC18 Spherical Silica Gel(カタログ番号.76646-01)を詰めポリプロピレンフリットで密閉した手充填カラム(hand packed column) (直径2.3cm×高さ8cm)を取り付けた。1〜1.5mLの試料を、カラムのヘッドに直接充填した。移動相は、水(A)及びアセトニトリル(B)とした。28ml/minの流速で、2分で0〜2％のBのグラジエントに、20分で2〜100％のBのグラジエントを続けた。UVを、220nm、260nm、及び280nmでモニターした。画分は、0.1AUのUV閾値で収集した。薄層クロマトグラフィーは、EMD Millipore社(Billireca, MA, 米国)のアルミニウム裏地TLC Silica 60 F254(カタログ番号. 1.05534.0001)で行った。
(表7)
Figure 2021509584
Figure 2021509584
Figure 2021509584
Figure 2021509584
Figure 2021509584
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Figure 2021509584
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Figure 2021509584
Figure 2021509584
(実施例1)
Figure 2021509584
 上記化合物1を、DMSO(150μL)中で4-アジドサリチル酸B(1.79mg、10μmol)及び2,6-ジエチニルピリジンA(0.67mg、5μmol)を混合することによって調製した。この溶液を、DMSO(95μL)中のTBTA(5.1mg、0.96μmol)及びアスコルビン酸ナトリウム(6.4mg、32μmol)の溶液と混合した。クリック反応を、攪拌しながら20mMの硫酸銅(5μL)を添加することによって開始させた。反応の程度を、TLC(94:5:1 酢酸エチル:メタノール:酢酸)によって分析し、アジド及びアルキンの消費に基づいて、反応は5分間で完結した。反応混合物の体積を、DMSO及び0.5M EDTA(100μL)で1mLとした。固体を分離し、追加のDMSO中に溶解させた。DMSO溶液を合わせ、(材料及び方法)において上述した通りフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ロータリーエバポレーターで蒸発させると、生成物は、50〜75％の収率でガラス状の固体を形成した。
Figure 2021509584
(実施例2)
Figure 2021509584
 上記化合物2を、4-アジドサリチル酸B及び3,5-ジエチニルピリジンCを用いて、実施例1の方法によって調製した。
Figure 2021509584
(実施例3)
Figure 2021509584
 上記化合物3を、4-アジドサリチル酸B及び1,3-ジエチニルベンゼンDを用いて、実施例1の方法によって調製した。
Figure 2021509584
(実施例4)
Figure 2021509584
 上記化合物4を、4-アジドサリチル酸B及び3,6-ジエチニルカルバゾールEを用いて、実施例1の方法によって調製した。
Figure 2021509584
(実施例5)
Figure 2021509584
 上記化合物5を、4-アジドアニリン塩酸塩F及び3,6-ジエチニルカルバゾールEを用いて、実施例1の方法によって調製した。
(実施例6)
Figure 2021509584
 上記化合物6を、4-アジド安息香酸G及び3,6-ジエチニルカルバゾールEを用いて、実施例1の方法によって調製した。
(実施例7)
Figure 2021509584
 上記化合物7を、4-アジドアニソールH及び3,6-ジエチニルカルバゾールEを用いて、実施例1の方法によって調製した。
（実施例8)
Figure 2021509584
 上記化合物8を、アジド酢酸メチルI及び3,6-ジエチニルカルバゾールEを用いて、実施例1の方法によって調製した。
(実施例9)
Figure 2021509584
 上記化合物9の調製を、Organomet. Chem., 653: 46-49(2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.)に記載されている薗頭条件を用いる4-メトキシ-2,6-ジブロモピリジン及びエチニルトリメチルシランからの4-メトキシ-2,6-ジエチニルピリジンJの合成で開始した。化合物9の合成は、4-アジドサリチル酸B及び化合物Jを、実施例1の方法によりクリック反応させることによって完結させた。
(実施例10)
Figure 2021509584
 上記化合物10の調製を、Organomet. Chem., 653: 46-49 (2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.)に記載される薗頭条件を用いる4-シアノ-2,6-ジブロモピリジン及びエチニルトリメチルシランからの4-シアノ-2,6-ジエチニルピリジンKの合成で開始した。化合物10の合成は、4-アジドサリチル酸B及び化合物Kを実施例1の方法によりクリック反応させることによって完結させた。
(実施例11)
Figure 2021509584
 上記化合物11の調製を、Organomet. Chem., 653: 46-49 (2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.)に記載される薗頭条件を用いる4-ニトロ-2,6-ジブロモピリジン及びエチニルトリメチルシランからの4-ニトロ-2,6-ジエチニルピリジンLの合成で開始した。化合物11の合成は、4-アジドサリチル酸B及び化合物Lを、実施例1の方法によりクリック反応させることによって完結させた。
(実施例12)
Figure 2021509584
 上記化合物12を、5-アジドサリチル酸M及び4-シアノ-2,6-ジエチニルピリジンKを用いて、実施例10の方法により調製した。
(実施例13)
Figure 2021509584
 上記化合物13を、Organomet. Chem., 653: 46-49 (2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.)に記載された薗頭を用いる4-メチル-2,6-ジクロロピリジン及びエチニルトリメチルシランからの4-メチル-2,6-ジエチニルピリジンNの合成で開始した。化合物11の合成は、実施例1の方法により、4-アジドサリチル酸B及び4-メチル-2,6-ジエチニルピリジンNをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例14)
Figure 2021509584
 上記化合物14を、Organomet. Chem., 653: 46-49 (2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.)に記載されている薗頭を用いるエチル 2,6-ジブロモピリジン-4-カルボキシレート及びエチニルトリメチルシランからのエチル 2,6-ジエチニルピリジン-4-カルボキシレートOの合成で開始した。化合物14の合成は、実施例1の方法により、4-アジドサリチル酸B及びエチル 2,6-ジエチニルピリジン-4-カルボキシレートOをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例15)
Figure 2021509584
 上記化合物15を、実施例14の方法によりクリック反応させた5-アジドサリチル酸M及びエチル 2,6-ジエチニルピリジン-4-カルボキシレートOを用いて調製した。
(実施例16)
Figure 2021509584
 上記化合物16を、Organomet. Chem., 653: 46-49(2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.)に記載されている薗頭を用いるメチル 2,6-ジクロロピリジン-4-カルボキシレート及びエチニルトリメチルシランからのメチル 2,6-ジエチニルピリジン-4-カルボキシレートPの合成で開始した。化合物16の合成は、実施例1の方法により、4-アジドサリチル酸B及びメチル 2,6-ジエチニルピリジン-4-カルボキシレートPをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例17)
Figure 2021509584
 化合物17(上記)の合成を、2,6-ジブロモ-4-ピリジンカルボン酸(0.2g、0.71mmol)、DIPEA(0.18g、1.42mmol)、及びHATU(0.27g、0.71mmol)をDMF(900ul)中で混合することで開始した。エチルアミン(0.154ml、1.78mmol)を直ちに加え、1時間混合した。TLCに基づいて反応を完結させ、酢酸エチル/ヘキサンのグラジエントを用いるシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。N-エチル-2,6-ジブロモ-4-カルボキサミドを、黄色固体として収率69％で単離した。N-エチル-2,6-エチヌル(ethynl)-4-カルボキサミド Qを、実施例16で記載した薗頭法を使用して、エチルトリメチルシランを用いて調製した。化合物17の合成は、実施例1の方法により、4-アジドサリチル酸B及びN-エチル-2,6-エチヌル(ethynl)-4-カルボキサミドQをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例18)
Figure 2021509584
 上記化合物18を、実施例17の方法により、メチルアミンを用いてアミドを形成させて調製した。
(実施例19)
Figure 2021509584
 上記化合物19を、実施例17の方法により、アンモニアを用いてアミドを形成させて調製した。
(実施例20)
Figure 2021509584
 上記化合物20を、App. Organomet. Chem. 31(12):e3824 (2017) DOI: 10.1002/aoc.3824に記載されている薗頭法を用いる2,6-ジクロロピラジン及びエチニルトリメチルシランからの2,6-ジエチニルピラジンTの合成で開始した。化合物20の合成は、実施例1の方法により、4-アジドサリチル酸B及び2,6-ジエチニルピラジンTをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例21)
Figure 2021509584
 上記化合物73の合成を、亜硝酸ナトリウム及び硫酸での4-アミノ-2-(トリフルオロメチル)安息香酸のジアゾ化、及びそれに続くアジドでの求核置換(Org. Synth. 1942、22、96 DOI: 10.15227/orgsyn.022.0096)で開始して、4-アジド-2-(トリフルオロメチル)安息香酸(U)を形成させ、それを、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。化合物73の合成は、実施例1に従い、4-アジド-2-(トリフルオロメチル)安息香酸U及びN-エチル-2,6-エチヌル-4-カルボキサミドQをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例22)
Figure 2021509584
 上記化合物74の合成を、亜硝酸ナトリウム及び硫酸での7-アミノ-2-ヒドロキシ-1,8-ナフチリジン-4-カルボン酸のジアゾ化、及びそれに続くアジドでの求核置換(Org. Synth. 1942、22、96 DOI: 10.15227/orgsyn.022.0096)で開始して、7-アジド-2-ヒドロキシ-1,8-ナフチリジン-4-カルボン酸(V)を形成させ、これを、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。化合物74の合成は、実施例1に従い、7-アジド-2-ヒドロキシ-1,8-ナフチリジン-4-カルボン酸V及びN-エチル-2,6-エチヌル-4-カルボキサミドQをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例23)
Figure 2021509584
 化合物28の合成を、2工程で完結させた。第1に、2,6-ジエチニルベンゼンDを、実施例3の方法により化学量論(stochiometric amount)の半分の4-アジドサリチル酸Bとクリック反応させて、4-(4-(3-エチニルフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-ヒドロキシ安息香酸を調製した。第2工程は、実施例1の方法により4-アジド安息香酸Gをクリック反応させて、4-(4-(3-(1-(4-カルボキシフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)フェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-ヒドロキシ安息香酸28を得ることであった。
(実施例24)
Figure 2021509584
 上記化合物43の調製を、Organomet. Chem., 653: 46-49 (2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.)に記載される薗頭条件を用いる4-シアノ-2-クロロピリジン及びエチニルトリメチルシランからの4-シアノ-2-エチニルピリジンWの合成で開始した。化合物43の合成は、実施例1の方法により、4-アジドサリチル酸B及び化合物Wをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例25)
Figure 2021509584
 上記化合物31の調製を、n-ヨードコハク酸イミド及び硝酸銀での処理、及びフラッシュクロマトグラフィーによる単離を含む、Tepperらの文献, Org. Lett., 2015, 17 (23), pp 5740-574 DOI: 10.1021/acs.orglett.5b02760の方法に従う、2,6-ジエチニルピリジンAからの2,6-ビス(ヨードエチニル)ピリジンXの合成で開始した。化合物31の合成は、実施例1の方法により、4-アジドサリチル酸B及び化合物Xをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例26)
Figure 2021509584
 上記化合物30を、App. Organomet. Chem. 31(12):e3824 (2017) DOI: 10.1002/aoc.3824に記載されている薗頭法を用いる2,6-ジブロモ-3,5-ジメチルピリジン及びエチニルトリメチルシランからの2,6-ジエチニル-3,5-ジメチルピリジンYの合成で開始した。化合物30の合成を、実施例1の方法によって、4-アジドサリチル酸B及び2,6-ジエチニル-3,5-ジメチルピリジンYをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例27)
Figure 2021509584
 上記化合物33を、App. Organomet. Chem. 31(12):e3824 (2017) DOI: 10.1002/aoc.3824に記載されている薗頭法を用いる9-アセチル-3,6-ジヨードカルバゾール及びエチニルトリメチルシランからの9-アセチル-3,6-ジエチニルカルバゾールZの合成で開始した。化合物33の合成は、実施例1の方法によって、4-アジドサリチル酸B及び9-アセチル-3,6-ジエチニルカルバゾールZをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例28)
Figure 2021509584
 化合物34(上記)の合成を、DMF(72ul)中にN-ヒドロキシコハク酸イミド 4-アジドサリチレート(40mg、0.145mmol)を混合することで開始し、これに、水(72ul)中のヒドロキシルアミン塩酸塩(30mg、0.43mmol)を加え、1晩混合した。生成物を、TLCで検出し、反応物を、塩化メチレン及び塩化メチレン-MeOHのグラジエントを用いるシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。4-アジド-N,2-ジヒドロキシベンズアミドAAを、収率57％で単離した。化合物34の合成は、実施例1の方法によって、4-アジド-N,2-ジヒドロキシベンズアミドAA及び2,6-ジエチニルピリジンAをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例29)
Figure 2021509584
 上記化合物44の合成を、亜硝酸ナトリウム及び硫酸での5-アミノ-2-ヒドロキシ-3-安息香酸のジアゾ化、及びそれに続くアジドでの求核置換(Org. Synth. 1942、22、96 DOI: 10.15227/orgsyn.022.0096)で開始し、5-アジド-2-ヒドロキシ-3-メチル安息香酸(BB)を形成させ、これを、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。化合物44の合成は、実施例1に従って、5-アジド-2-ヒドロキシ-3-安息香酸BBを2,6-ジエチニルピリジン-4-カルボキシレートPとクリック反応させることによって完結させた。
(実施例30)
Figure 2021509584
 化合物47(上記)の合成を、DMF(900ul)中で2,6-ジブロモ-4-ピリジンカルボン酸(0.2g、0.71mmol)、DIPEA(0.18g、1.42mmol)、及びHATU(0.27g、0.71mmol)を混合することで開始した。ブチニルアミン(0.154ml、1.78mmol)を直ちに加え、1時間混合した。TLCに基づいて反応を完結させ、酢酸エチル/ヘキサンのグラジエントを用いるシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。N-(ブタ-3-イン-1-イル)-2,6-ジブロモイソニコチンアミドを、固体として単離した。N-(ブタ-3-イン-1-イル)-2,6-ジエチニルイソニコチンアミドCCを、実施例16で記載した薗頭法を使用して、エチルトリメチルシランを用いて調製する。化合物47の合成は、実施例1の方法によって、4-アジドサリチル酸B及びN-(ブタ-3-イン-1-イル)-2,6-ジエチニルイソニコチンアミドCCをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例31)
Figure 2021509584
 上記化合物63を、App. Organomet. Chem. 31(12):e3824 (2017) DOI: 10.1002/aoc.3824に記載されている薗頭法を用いる2,7-ジブロモナフタレン及びエチニルトリメチルシランからの2,7-ジエチニルナフタレンDDの合成で開始した。化合物63の合成は、実施例1の方法によって、4-アジドサリチル酸B及び2,7-ジエチニルナフタレンDDをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例32)
Figure 2021509584
 上記化合物64を、App. Organomet. Chem. 31(12):e3824 (2017) DOI: 10.1002/aoc.3824に記載されている薗頭法を用いる2,3-ジブロモナフタレン及びエチニルトリメチルシランからの2,3-ジエチニルナフタレンEEの合成で開始した。化合物64の合成は、実施例1の方法によって、4-アジドサリチル酸B及び2,3-ジエチニルナフタレンEEをクリック反応させることによって完結させた。
(実施例33)
Figure 2021509584
 上記化合物71を、App. Organomet. Chem. 31(12):e3824 (2017) DOI: 10.1002/aoc.3824に記載されている薗頭法を用いる2,6-ジブロモ-4-ピリジンカルボン酸及びエチニルトリメチルシランからの2,6-ジエチニル-4-ピリジンカルボン酸の合成で開始した。2,6-ジエチニル-4-ピリジンカルボン酸を、HATU、DIPEA、及び1,4-ジアミノブタンで処理して、フラッシュクロマトグラフィーによる単離後に、N,N'-(ブタン-1,4-ジイル)ビス(2,6-ジエチニルイソニコチンアミド)(FF)を得る。化合物71の合成は、実施例1の方法によって、4-アジドサリチル酸B及びN,N'-(ブタン-1,4-ジイル)ビス(2,6-ジエチニルイソニコチンアミド)(FF)をクリック反応させることによって完結させた。
(実施例34)
Figure 2021509584
 上記化合物72の合成を、亜硝酸ナトリウム及び硫酸での4-アミノ-3,5,6-トリクロロピリジン-2-カルボン酸のジアゾ化、及びそれに続くアジドでの求核置換(Org. Synth. 1942、22、96 DOI: 10.15227/orgsyn.022.0096)で開始して、4-アジド-3,5,6-トリクロロピリジン-2-カルボン酸(GG)を形成さ、これを、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。化合物72の合成は、実施例1に従って、4-アジド-3,5,6-トリクロロピリジン-2-カルボン酸GGをN-エチル-2,6-エチヌル-4-カルボキサミドQとクリック反応させることによって完結させた。
(実施例35 XNTP重合の強化のためのPEMのスクリーニング)
本発明者らにより開発された拡張によるシーケンシング(SBX)方法体系は、ネイティブDNAと比較して、エクスパンドマーの配列リード効率及び正確度の著しい性能強化を提供する。しかしながら、はじめの天然DNAテンプレートの配列の測定可能なエクスパンドマー上への転写は、DNAポリメラーゼが基質としてXNTPを利用する能力に頼っている(XNTPの一般化された構造は、図1A及び図2を参照して本明細書で解説される)。本発明者らは、大部分のDNAポリメラーゼが、XNTPを効率的に重合させないことを見出だした。エクスパンドマーへのXNTP重合の効率及び正確度を改善しようとして、いくつかのPEMを、基質としてXNTPを用いるDNAポリメラーゼプライマー伸長反応を強化する能力に関してスクリーニングした。
代表的なプライマー伸長反応は、以下の試薬:2pmol プライマー、2.2pmol 45merオリゴヌクレオチドテンプレート、50pmolの各XNTP(XATP、XCTP、XGTP、及びXTTP)、50mM Tris HCl、pH 6.79、200mM NaCl、20％ PEG、5％ NMS、0.5nmol ポリホスフェート60.19、0.3mM MnCl2、及び0.6μgの精製組換えDNAポリメラーゼタンパク質を含み得る。反応は、23℃で1時間実施され得る。反応生成物(すなわち、拘束エクスパンドマー)を処理して、ホスホロアミデート結合を切断し、それにより、直線化されたエクスパンドマーを生じさせる。反応生成物を、4〜12％のアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動を用いて分析して、異なる長さのエクスパンドマー生成物を決定し可視化させ得る。上述のPEMスクリーニングのために、PEMを、通常、マイクロモル濃度からミリモル濃度の範囲で試験した。
驚くべきことに、いくつかのPEMが、XNTPを用いるDNAポリメラーゼ媒介性プライマー伸長を顕著にかつ再現性よく強化することが観察された。この強化を示す代表的なゲルを、図4及び図5に挙げる。図4を参照して、レーン1(PEM添加剤なし)にみられるように、DNAポリメラーゼは、こられの条件下で、最大でわずか約14個のXNTPを用いてテンプレートに結合したプライマーを伸長させる。しかしながら、プライマー伸長反応へある種のPEMを添加すると、例えば、レーン3(化合物4)、7(化合物3)、及び9(化合物1)にみられるように、ポリメラーゼが、かなり長い伸長生成物を合成することを可能とする。対照的に、いくつかの異なる芳香族化合物は、XNTP重合に対する作用をほとんど又は全く有さず(例えば、レーン2、4〜6、及び8を参照されたい)、このことは、PEM活性が、化合物1、3、及び4に特有であることを示す。
同様に、図5を参照して、PEM添加剤の非存在下では、DNAポリメラーゼは、まずまずのXNTPを用いるプライマー伸長活性を示す(レーン1、PEM添加剤なし)、その一方で、さまざまな濃度での化合物2の添加(レーン8〜10)は、プライマー伸長活性を顕著に強化する。ここでも、他の関連のない芳香族化合物は、作用を有しなかった(レーン2〜7)ために、このPEM活性は、化合物2に特有なものである。
(実施例36 PEMは、拡張によるシーケンシング(SBX)を強化する)
XNTP重合のPEM依存性強化の正確度を調査するために、プライマー伸長生成物を、SBXプロトコルを用いてシーケンシングした。簡単に述べると、XNTP重合の拘束エクスパンドマー生成物を切断して、直線化されたエクスパンドマーを生成させる。これは、はじめに、伸長反応を100mM EDTA、2mM THPTA、及び2％ Tween-20を含有する溶液でクエンチすることによって達成される。その後、試料を、DMF中の1M NaHCO3及び1M無水コハク酸の溶液でアミン修飾する。ホスホロアミデート結合の切断を、37％ HClを用いて行い、直線化されたエクスパンドマーを、QIAquickカラム(QIAGEN社)で精製する。
シーケンシングのために、2M NH4Cl及び100mM HEPES、pH 7.4を含有するバッファーB1中のDPhPE/ヘキサデカン二重層メンバー内にα-ヘモリジンを挿入することによって、タンパク質ナノ細孔を調製する。cisウェルを、0.4M NH4Cl、0.6M GuCl、及び100mM HEPES、pH 7.4を含有するバッファーB2で灌流する。エクスパンドマー試料を、70℃に2分間加熱し、完全に冷却し、その後、2μLの試料を、該cisウェルに添加する。その後、90mV/390mV/10μsの電圧パルスを印加し、Labview取得ソフトウェアでデータを取得する。
配列データを、単一のSBX反応からの配列リードの集団のヒストグラム表示によって解析する。この解析ソフトウェアは、各配列リードをテンプレートの配列に整列させ、正しいテンプレート配列と整列されなかったリードの最後の配列を取り除く。45merテンプレートのSBXシーケンシングの代表的なヒストグラムを、図6A(添加剤なしの対照)及び図6B(PEM化合物1の存在下でのSBX)に示す。見て分かるように、化合物1の非存在下では、配列リードは、テンプレートの塩基18あたりを超えると不正確となる。特に、SBX反応への化合物1の添加は、該45merテンプレートの全長にわたり配列リードの正確度を増加させた。
これらの結果から、PEM化合物1がさらに長いテンプレートのSBXを強化する能力を試験する追加の実験の着想を得た。図7A及び図7Bは、それぞれ、60mer及び80merテンプレートSBXシーケンシングのヒストグラムを示す。驚くべきことに、化合物1は、完全にこれらのより長いテンプレートのそれぞれの末端までの正確な配列リードを可能とした。これらの結果は、SBXがナノ細孔ベースの核酸配列情報を提供する能力を強力に増加させる新規PEMによる頑強かつ正確なXNTP重合活性の強化を実証する。
(実施例37 PEMは、長いエクスパンドマー生成物の合成を可能とする)
長さが最高80個のヌクレオチドのテンプレートをエクスパンドマーへと正確に複製するのに成功した後に、XNTP重合反応を、長さが88、127、227、及び277個のヌクレオチドからなる4つのより長いテンプレートを用いて行った。C4552(配列番号:1)と呼ばれるDPO4 DNAポリメラーゼのバリアントを、これらの重合反応で用い、反応条件は、PEM化合物1の存在下でのC4552活性に最適化した。他の好適なDPO4ポリメラーゼバリアントとしては、配列番号:2〜5のものが挙げられるが、これらに限定されない。1mMの化合物1に加えて、反応添加剤には、1mMの尿素及び2.75μgの一本鎖結合タンパク質(Eco SSB)が含まれていた。伸長反応は、最終体積が10μLの0.85pmolのテンプレート、0.5pmolのオリゴヌクレオチドプライマー、及び1nmolの各XNTPを用いて行われた。反応は、5％ NMS、3又は4nmolの量のポリホスフェートPP-60.20、及び2mMのMnCl2を追加した、50mMのTrisCl、pH 8.84、200mMのNH4OAc、及び20％のPEG8Kから構成されたバッファー中で実施された。1.2μgの精製組換えDNAポリメラーゼタンパク質を、各伸長反応で用い、反応を、23℃で1〜2時間実施した。より長いテンプレートを用いる代表的な伸長反応の結果を、図8に示す。特に、化合物1の存在下で、ポリメラーゼは、XNTPを重合させて、長さが88(レーン1及び6)〜277(レーン5及び10)個のヌクレオチドの範囲の長いテンプレートのそれぞれの完全なエクスパンドマーのコピーを生じさせることができた。レーン1〜5及び6〜10は、PP-60.20添加剤の量を除いて同一の伸長反応を表し、PP-60.20添加剤の量は、レーン1〜5では3nmol、レーン6〜10では4nmolであった。これらの結果は、DNAポリメラーゼによる非天然の高度に置換されたヌクレオチド類似体の重合を必要とする反応において化合物1によって付与される驚くべき利点を強調し、かつ本化合物及び他のPEMが、SBXシーケンシングプロトコルの可能性を大きく広げ得ることを示唆する。
(実施例38 次世代PEMは、XNTPの重合を強化して、長いエクスパンドマー生成物を生じさせる)
PEM化合物1で観察された有利な性質に基づいて、PEM化合物の次世代を、これに限定されないが、分子の水溶性などのある種の性質を改善する目的で設計した。代表的な次世代PEM構造は、実施例9〜34及び表7に記載される。
化合物9〜11のPEM活性を、HIV1、2、及び3ゲノムに由来する3種の100merテンプレートを用いるプライマー伸長アッセイで試験した。プライマー伸長反応には、以下の試薬: 75mM TrisCl、pH 8.44、175mM NH4OAc、20％ PEG8K、5％ NMS、0.8nmol PP-60.20、0.6mM MnCl2、2.3μg Tth一本鎖結合タンパク質(SSB)、0.5M又は1M 尿素、200pmol 各XNTP、1.1pmol テンプレート、1pmol オリゴヌクレオチドプライマー、1.2μg精製組換えC4552 DNAポリメラーゼ、及び0.5mM PEMを含めた。10μLのプライマー伸長反応を、23℃で30分間実施し、反応生成物を、ゲル電気泳動により分析した。プライマー伸長生成物を示す代表的なゲルを、図9に示す。レーン1(HIV1テンプレート)、2(HIV2テンプレート)、及び4(HIV3テンプレート、SSBなし、及び1M尿素)に示されるように、化合物1は、XNTPを、3つの異なる100merテンプレート(100merのゲル移動位置が、矢印で示される)の完全長エクスパンドマーコピーとする重合を可能とする。同様に、化合物9(レーン13〜16)、10(レーン9〜12)、及び11(レーン5〜8)のそれぞれは、前記3つの異なる100merテンプレートのそれぞれにおいて、少なくとも化合物1と同等に効率的にXNTP重合可能にする。これらの結果は、水溶性などの化合物のさまざまな物理化学的性質を増加させることによって、PEM活性が最適化され得ることを示唆する。
化合物12のPEM活性を、HIV2 100merテンプレートを用いるプライマー伸長アッセイで試験した。プライマー伸長反応には、以下の試薬: 50mM TrisCl、200mM NH4OAc、20％ PEG8K、5％ NMS、0.6nmol PP-60.20、0.6mM MnCl2、2.75μg/μl Eco 一本鎖結合タンパク質(SSB)、1M 尿素、50pmol 各XNTP、1.1pmol テンプレート、1pmol オリゴヌクレオチドプライマー、1.2μg/μl 精製組換えC4760 DNAポリメラーゼ(配列番号:2)、及び0.5、1、又は1.5mM PEMを含めた。10μLのプライマー伸長反応を、23℃で30分間実施し、反応生成物を、ゲル電気泳動により分析した。プライマー伸長生成物を示す代表的なゲルを、図10に示す。レーン5(0.5mM PEM)、6(1mM PEM)、及び7(1.5mM PEM)に示されるように、化合物12は、化合物10(レーン1)と同程度の様式で、XNTPを、100merテンプレート(該100merのゲル移動位置を、矢印で示す)の完全長エクスパンドマーコピーとする重合を可能とする。レーン2〜4は、強固なPEM活性を欠く構造的に関連する添加剤を用いた反応からのプライマー伸長生成物を示す。これらの結果は、PEM活性が、非常に特定的な化学構造によって決定され得ることを示唆する。
化合物13及び14のPEM活性を、HIV2 100merテンプレートを用いるプライマー伸長アッセイで試験した。プライマー伸長反応には、以下の試薬: 50mM TrisCl、200mM NH4OAc、20％ PEG8K、5％ NMS、0.6nmol PP-60.20、0.6mM MnCl2、2.75μg/μl Eco一本鎖結合タンパク質(SSB)、1M 尿素、50pmol 各XNTP、1.1pmol テンプレート、1pmol オリゴヌクレオチドプライマー、1.2μg/μl 精製組換えC4760 DNAポリメラーゼ(DPO4のバリアント、配列番号:2を参照されたい)、及び0.5、1、1.52、又は2.5mM PEMを含めた。10μLのプライマー伸長反応を、23℃で30分間実施し、反応生成物を、ゲル電気泳動により分析した。プライマー伸長生成物を示す代表的なゲルを、図11に示す(完全長HIV2 100merの位置を、矢印によって示す)。レーン5〜7(さまざまな濃度の化合物14)及び8〜10(さまざまな濃度の化合物13)に示されるように、これら次世代PEMのそれぞれは、化合物10(レーン1〜4)と同程度の様式で、XNTPを、100merテンプレートの完全長エクスパンドマーコピーとする重合を可能にする。
化合物15のPEM活性を、411mer増幅産物テンプレートを用いるプライマー伸長アッセイで試験した。プライマー伸長反応には、以下の試薬: 50mM TrisCl、200mM NH4OAc、20％ PEG8K、5％ NMS、3nmol PP-60.20、2mM MnCl2、2μg Kod一本鎖結合タンパク質(SSB)、1M 尿素、250pmol 各XNTP、1pmol テンプレート、1pmol オリゴヌクレオチドプライマー、1.2μg 精製組換えC4760 DNAポリメラーゼ(DPO4のバリアント、配列番号:2を参照されたい)、及び2(レーン2)又は3(レーン3)mM PEMを含めた。10μLのプライマー伸長反応を、37℃で20分間実施し、反応生成物を、ゲル電気泳動により分析した。プライマー伸長生成物を示す代表的なゲルを、図12に示す(277merの位置を、矢印で示す)。レーン2及び3(2つの異なる濃度での化合物15)に示されるように、この次世代PEMは、化合物14(レーン1)と同程度の様式で、XNTPを、411merテンプレートの非常に長いエクスパンドマーコピーとする重合を可能にする。注目すべきことに、これらの非常に長いエクスパンドマー生成物を合成することができるようになるためには、このポリメラーゼは、反応へのPEMの添加に完全に依存的である。さらに長い伸長生成物を、まざまな反応パラメーター、例えば、伸長時間及び/又はさまざまな添加剤の濃度を最適化することによって得ることができるであろう。
化合物16、17、及び18並びにそれらの組合せのPEM活性を、HIV2由来の100merテンプレートを用いるプライマー伸長アッセイで試験した。プライマー伸長反応には、以下の試薬: 50mM TrisCl、200mM NH4OAc、20％又は25％ PEG8K、5％ NMS、0.6nmol PP-60.20、0.6mM MnCl2、2μg Kod 一本鎖結合タンパク質(SSB)、1M 尿素、50pmol 各XNTP、1pmol テンプレート、1pmol オリゴヌクレオチドプライマー、1.2μg 精製組換えC4760 DNAポリメラーゼ(DPO4のバリアント、配列番号:2を参照されたい)、及び0.5〜2mM PEMを含めた。10μLのプライマー伸長反応を、37℃で30分間実施し、反応生成物を、ゲル電気泳動により分析した。プライマー伸長生成物を示す代表的なゲルを、図13に示す(100mer生成物の位置を、矢印で示す)。レーン2(2mMの化合物16)及び3〜6(0.5、1、2、及び3mMの化合物17)に示されるように、これら次世代PEMは、化合物14(レーン1)と同程度の様式で、XNTPを、100merテンプレートの非常に長いエクスパンドマーコピーとする重合を可能とする。加えて、2mMの化合物14と0.1mM(レーン7)又は0.3mM(レーン8及び9)の化合物17との組合せも、XNTPを、100merテンプレートの非常に長いエクスパンドマーコピーとする重合を可能とした。このことは、PEMの組合せが、各個のPEMのより少ない量での使用を可能とし得ることを示している。同様に、2mMの化合物16と0.1mM(レーン10)又は0.3mM(レーン11及び12)の化合物18の組合せも、各個PEMより少ない量の使用を可能として、XNTPを、100merテンプレートの完全長コピーへとする重合を可能にするようであった。
化合物19のPEM活性を、411mer増幅産物テンプレートを用いるプライマー伸長アッセイで試験した。プライマー伸長反応には、以下の試薬: 50mM TrisCl、200mM NH4OAc、20％ PEG8K、5％ NMS、3nmol PP-60.20、2mM MnCl2、2μg Kod一本鎖結合タンパク質(SSB)、1M 尿素、250pmol 各XNTP、0.5pmol テンプレート,0.5pmol オリゴヌクレオチドプライマー、1.2μg 精製組換えC4760 DNAポリメラーゼ(DPO4のバリアント、配列番号:2を参照されたい)、及び0.5(レーン2)、1(レーン3)、又は1.5mM(レーン4) PEMを含めた。10μLのプライマー伸長反応を、37℃で30分間実施し、反応生成物を、ゲル電気泳動により分析した。プライマー伸長生成物を示す代表的なゲルを、図14に示す(277mer生成物の位置を、矢印で示す)。レーン2〜4に示されるように、この次世代PEMは、化合物14(レーン1)よりも低効率な様式でではあるものの、XNTPを、411merテンプレートの非常に長いエクスパンドマーコピーとする重合を可能にする。これらの結果は、PEM活性が、PEMの構造及び/又はテンプレートの長さに特異的であり得ることを示唆する。
本明細書で開示される、特許文献及び非特許文献を含む全ての引例は、それぞれが、個々に組み込まれているかのように、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される術語は、特定の実施態様を説明するためのみのものであると理解されるべきであり、限定を意図するものではない。さらに、本明細書で明確に定義される場合を除き、本明細書で使用される術語は、関連分野で知られている従来の意味を与えられていることを理解するべきである。
本明細書の全体にわたり、「一実施態様」又は「実施態様」並びにその変形形態への言及は、該実施態様に関連して説明される特定の特徴、構造、又は特性が、少なくとも1つの実施態様に含まれることを意味する。従って、本明細書の全体にわたるさまざまな場所での句「一実施態様において」又は「実施態様において」の出現は、必ずしも全てが、同じ実施態様に言及しているわけではない。更に、特定の特徴、構造、又は特性は、1つ以上の実施態様において任意の適当な様式で組み合わせ得る。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「前記/該(the)」は、内容及び文脈が、明確にそうでないことを表す場合を除き、複数の、すなわち、1つ以上の指示物を含む。場合に応じて、内容及び文脈が、含まれる又は含まれないことを明確に示している場合を除き、「及び(and)」及び「又は(or)」という接続語が、一般に、「及び/又は」を含む最も広い意味で採用されることにも留意されたい。従って、選択(例えば、「又は(or)」)の使用は、選択肢のいずれか一方、双方、又はそれらの任意の組み合わせを意味するよう理解されるべきである。加えて、「及び」及び「又は」の組み合わせは、本明細書で「及び/又は」として記載される場合、関連事項又は概念の全てを含む実施態様、及び該関連事項又は概念の全てよりも少数を含む1つ以上の他の選択的実施態様を包含することが意図される。
文脈上そうではない必要がある場合を除き、本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体にわたって、「を含む(comprise)」という単語、並びに「有する(have)」及び「含む(include)」などのその同意語及び変形、並びに「を含む(comprises)」及び「を含む(comprising)」などのその変形は、オープンである包含的な意味で、例えば、「これらに限定されないが、〜を含む」という意味で解釈されるべきである。「本質的に〜からなる」という用語は、請求項の範囲を、明示された材料又は工程にか、又は特許請求された発明の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。
「例えば(e.g.)」という略語は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書では、非限定的な例を示すのに使用される。従って、「例えば(e.g.)」という略語は、「例えば(for example)」という用語と同義語である。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈により、そうでないことが明確に必要とされない限り、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「前記/該(the)」が、複数への言及を含むこと、「X及び/又はY」という用語が、「X」もしくは「Y」又は「X」及び「Y」の双方を意味すこと、及び名詞に続く「s」という文字が、該名詞の複数形及び単数形の双方を示すことも理解されるべきである。加えて、本発明の特徴又は態様が、マーカッシュ群で記載されている場合、これは、該発明が、該マーカッシュ群の任意の個々の成員及び成員の任意の部分群を包含し、またそれによって、該発明がそれらに関して説明されていること、及び出願人が、該マーカッシュ群の任意の個々の成員又は成員の任意の部分群に具体的に言及するように出願又は特許請求の範囲を改訂する権利を留保することを意図しており、当業者はそのことを認識する。
本文書内で用いられる見出しはいずれも、読み手による調査をはかどらせることのみに利用され、いかなる様式にも本発明又は特許請求の範囲を制限するよう解釈されるべきではない。従って、本明細書で提供される本開示の見出し及び要約書は、便宜上のみのものであり、実施態様の範囲又は意味を説明するものではない。
値の範囲が、本明細書で提供される場合、文脈により、そうでないことが明確に必要とされない限り、下限の単位の10分の1までの、該範囲の上限と下限との間に入る値のそれぞれ、及び該記載された範囲内の任意の他の記載された値又は間にある値が、本発明の範囲内に含まれることが理解される。該記載される範囲内の任意の具体的に排除された限度を条件として、こうしたより小さい範囲の上限及び下限は、独立に、より小さい範囲に含まれ得、また、本発明の範囲内に含まれる。記載された範囲が限度の一方又は双方を含む場合、これらの含まれる限度のいずれか又は双方を除く範囲もまた、本発明に含まれる。
例えば、本明細書で提供されるいかなる濃度範囲、百分率範囲、比の範囲、又は整数範囲も、別途示されない限り記載された範囲内の全ての整数の値、及び、適切な場合には、その分数(例えば、整数の10分の1及び100分の1)を含むよう理解されるべきである。また、ポリマーサブユニット、大きさ、又は厚さなどの、本明細書で記載される任意の物理的特徴に関する数値範囲はすべて、別途示されない限り、該記載された範囲内の全ての整数を含むよう理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約(about）」という用語は、別途示されない限り、示された範囲、値、又は構造の±20％を意味する。
これらに限定されないが、米国仮特許出願第62/614,120号、第62/656,696号、及び第62/717,549号を含む、本明細書で言及されかつ/又は出願データシートに列挙される、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、他国の特許、他国の特許出願、及び非特許刊行物は全て、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。そのような文書は、例えば、ここで記載される発明に関連して用いられ得る、該刊行物に記載された材料及び方法体系を説明し開示する目的のために引用により組み込まれ得る。上で及び文書全体で記載された刊行物は、本出願の出願日前にそれらが開示されたという理由のみで提供されている。本明細書におけるいかなるものも、本発明者らが、先行発明を理由として何らかの参照刊行物に先行する資格がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
本明細書で引用された又は触れられた全ての特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、並びに他の文書及び資料は、本発明が属する分野の当業者の技術水準を表すものであり、このような引用された文書及び資料はそれぞれ、あたかも、それが、個々にその全体が引用により組み込まれている、又はその全体が本明細書に記載されているのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれている。出願人は、任意のそのような特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、電子的に入手可能な情報、及び他の引用された資料又は文書から、全ての資料及び情報を本明細書に物理的に組み込む権利を留保する。
一般的に、以下の特許請求の範囲において、用いられる用語は、該特許請求の範囲を、本明細書及び特許請求の範囲に開示される特定の実施態様に限定するよう解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲とともに、全ての可能な実施態様を含むように解釈されるべきである。従って、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
更に、本特許の書面による説明部分は、全ての特許請求の範囲を含む。更に、全ての元の特許請求の範囲及び全ての優先権書類からの全ての特許請求の範囲を含む全ての特許請求の範囲は、本明細書の書面による説明部分に、その全体が引用により本明細書に組み込まれ、出願人は、全てのそのような特許請求の範囲を、本出願の書面による説明又は任意の他の部分に物理的に組み込む権利を留保する。従って、例えば、いかなる状況においても、請求項の厳密な言い回しが、本特許の書面による説明部分に、そのとおりの言葉で記載されていないという主張に基づいて、本特許が、証拠もなく該請求項に関する書面による説明を提供していないと解釈されてはならない。
特許請求の範囲は、法に従い解釈されるものである。しかしながら、任意の請求項又はその部分を解釈する際の主張される又は知覚される容易さ又は難しさにかかわらず、いかなる状況下でも、本特許に繋がる出願(単数)又は出願(複数)の手続きの間の請求項又はその一部のいかなる調整も補正も、先行技術の一部を形成しないその全ての等価物に対する何らかの権利を失っているものとして解釈されてはならない。
他の非限定的な実施態様は、以下の特許請求の範囲内である。本特許は、本明細書に具体的にかつ/又は明示的に開示される具体例や非限定的実施態様や方法に限定されるものとして解釈されてはならない。米国特許商標庁の審査官又は任意の他の当局者や被雇用者によって成された何らかの主張が、出願人による応答書に明確にかつ限定なしで無条件に明示的に採用されている場合を除き、いかなる状況であっても、そのような主張によって、本特許が限定されるものと解釈されてはならない。
本明細書において、本発明を、広範囲にかつ属レベルで(generically)説明してきた。該包括的な開示の範囲内のより狭い種(species)及び亜属(subgeneric grouping)のそれぞれもまた、本発明の一部を成す。これは、条件又は削除される材料が、本明細書に明確に記載されているかどうかにかかわらず、該属(genus)から任意の主題を除去する負の限定付きの本発明の包括的な説明を含む。

Claims (103)

  1. 核酸ポリメラーゼ反応を強化する方法であって:
    a. 以下:
    i. テンプレート核酸、
    ii. 核酸ポリメラーゼ、
    iii. ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物、及び
    iv. 少なくとも1種の式(I)の化合物
    を含む核酸ポリメラーゼ反応組成物を形成させること;及び
    b. 該核酸ポリメラーゼ反応組成物を、核酸重合反応を可能とする条件下でインキュベートすることであって、該少なくとも1種の式(I)の化合物が、該核酸ポリメラーゼ反応の進行性、速度、又は忠実度を増加させる、前記インキュベートすること
    を含み;
    該式(I)の化合物が:
    Figure 2021509584
     (式中、各出現において独立に:
    mは、1、2、又は3であり;
    nは、0、1、又は2であり;
    pは、0、1、又は2であり;
    Ar1は、任意に置換されたアリールであり;
    Ar2は、5員及び6員の単環式芳香環、並びに一緒に縮合した2個の5員及び/又は6員の単環式環を含む9及び10員の縮合二環式環から選択され、ここで、該2つの単環式環の少なくとも一方は、芳香環であり、ここで、
    Ar2は、ハライド、C1-C6アルキル、C1-C6ハロアルキル、E-CO2R0、E-CONH2、E-CHO、E-C(O)NH(OH)、E-N(R0)2、及びE-OR0から選択される1個以上の置換基で任意に置換され、ここで、
    Eは、直接の結合及びC1-C6アルキレンから選択され;かつ
    R0は、H、C1-C6アルキル、及びC1-C6ハロアルキルから選択され、
    Mは、水素、ハロゲン、及びC1-C4アルキルから選択され;かつ
    Lは、連結基である;)
    によって表されるか、又はその溶媒和物、水和物、互変異性体、キレート、もしくは塩である、前記方法。
  2. Ar1が、単環式炭素環式アリールである、請求項1記載の方法。
  3. Ar1が、単環式ヘテロ環式アリールである、請求項1記載の方法。
  4. Ar1が、二環式アリールである、請求項1記載の方法。
  5. Ar1が、三環式アリールである、請求項1記載の方法。
  6. Ar1が、非置換アリールである、請求項1記載の方法。
  7. Ar1が、置換アリールである、請求項1記載の方法。
  8. Ar2が、チオフェン、1,2-チアゾール、1,3-チアゾール、フラン、1,2-オキサゾール、1,3-オキサゾール、1H-ピロール、1H-ピラゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、1,2,4-トリアゾール、1,2,3-トリアゾール、及び1H-イミダゾールからなる群から選択される5員の単環式芳香環である、請求項1記載の方法。
  9. Ar2が、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、及びピラジンからなる群から選択される6員の単環式芳香環である、請求項1記載の方法。
  10. Ar2が、ベンゾフラン、1,3-ベンゾオキサゾール、フロ[3,2-b]ピリジン、フロ[3,2-c]ピリジン、フロ[2,3-c]ピリジン、フロ[2,3-b]ピリジン、インドール、1H-ベンゾイミダゾール、1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン、1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン、1H-ピロロ[2,3-c]ピリジン、1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン、ベンゾチオフェン、1,3-ベンゾチアゾール、チエノール[3,2-b]ピリジン、チエノ[3,2-c]ピリジン、チエノ[2,3-c]ピリジン、ベンゾオキサジアゾール、ベンゾチアジアゾール、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾトリアゾール、及びチエノ[2,3-b]ピリジンからなる群から選択される9員の縮合二環式芳香環系である、請求項1記載の方法。
  11. Ar2が、ナフチレン、キノリン、キナゾリン、キノキサリン、1,5-ナフチリジン、1,6-ナフチリジン、1,7-ナフチリジン、1,8-ナフチリジン、イソキノリン、フタラジン、2,6-ナフチリジン、及び2,7-ナフチリジンからなる群から選択される10員の縮合二環式芳香環系である、請求項1記載の方法。
  12. 前記Ar2上の置換が、カルボン酸を含む、請求項1記載の方法。
  13. Ar2上の置換が、トリフルオルメチル(trifluormethyl)を含む、請求項1記載の方法。
  14. Ar2上の置換が、ヒドロキシルを含む、請求項1記載の方法。
  15. Ar2上の置換が、ヒドロキシル、カルボン酸、及びトリフルオロメチルのうちの少なくとも2つを含む、請求項1記載の方法。
  16. 前記少なくとも1種の式(I)の化合物が、以下:
    Figure 2021509584
     から選択される式によって記述される、請求項15記載の方法。
  17. 前記式(I)の化合物が、キレートの形態にある、請求項1記載の方法。
  18. 前記キレートが、銅キレートである、請求項17記載の方法。
  19. 前記式(I)の化合物が、少なくとも4.9のlogPを有する、請求項1記載の方法。
  20. 前記式(I)の化合物が、以下:
    4,4'-(ピリジン-2,6-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(ピリジン-3,5-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(1,3-フェニレンビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((9H-カルバゾール-3,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((9H-カルバゾール-3,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ジアニリン;
    4,4'-((9H-カルバゾール-3,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ジ安息香酸;
    3,6-ビス(1-(4-メトキシフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)-9H-カルバゾール;
    4,4'-((4-メトキシピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-カルボキシピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-ニトロピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    5,5'-((4-シアノピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-メチルピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(エトキシカルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    5,5'-((4-(エトキシカルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(メトキシカルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(エチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(メチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-カルバモイルピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(ピラジン-2,6-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(1,4-フェニレンビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(1,3-フェニレンビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ジアニリン;
    4,4'-(1,3-フェニレンビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ジ安息香酸;
    4-(4-(3-(1-(4-メトキシフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)フェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)安息香酸;
    4,4'-(ピリジン-2,6-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ジアニリン;
    4,4'-(ピリジン-2,6-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ジ安息香酸;
    2,6-ビス(1-(4-メトキシフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)ピリジン;
    4-(4-(3-(1-(4-カルボキシフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)フェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-ヒドロキシ安息香酸;
    4-(4-(3-(1-(4-メトキシフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)フェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)安息香酸;
    4,4'-((3,5-ジメチルピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4l3-ピリジン-2,6-ジイル)ビス(5-ヨード-1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-アセトアミドピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((9-アセチル-9H-カルバゾール-3,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(ピリジン-2,6-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(N,2-ジヒドロキシベンズアミド);
    4,4'-(ピリジン-2,6-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシベンズアミド);
    4,4'-((4-カルボキシピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((1,10-フェナントロリン-2,9-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(トリフルオロメチル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((3-シアノピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((3-ニトロピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    3,3'-((4-シアノピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(tert-ブトキシカルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4-(4-(4-シアノピリジン-2-イル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-ヒドロキシ安息香酸;
    5-(4-(6-(4-(3-カルボキシ-4-ヒドロキシ-5-メチルフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-4-(メトキシカルボニル)ピリジン-2-イル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-ヒドロキシ-3-安息香酸;
    4,4'-((4-(ジメチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(シクロプロピルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ブタ-3-イン-1-イルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ブチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ジエチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(tert-ブチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(モルホリン-4-カルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(プロピルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(フェニルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-((2-アセトアミドエチル)カルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(4-シクロプロピルピペラジン-1-カルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(カルバムイミドイルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ピペリジン-1-カルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(シクロブチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((1,10-フェナントロリン-3,8-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(シクロペンチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ジプロピルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ジ-sec-ブチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(ナフタレン-2,7-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(ナフタレン-2,3-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ジブチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-((2-ヒドロキシエチル)カルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(シクロヘキシルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ベンジルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(4-メチルピペラジン-1-カルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4-(4-(3-(1-(4-メトキシフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)フェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)安息香酸;
    4,4',4'',4'''-((((ブタン-1,4-ジイルビス(アザンジイル))ビス(カルボニル))ビス(ピリジン-4,2,6-トリイル))テトラキス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))テトラキス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(エチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(3,5,6-トリクロロピコリン酸);
    4,4'-((4-(エチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-(トリフルオロメチル)安息香酸);
    7,7'-((4-(エチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ-1,8-ナフチリジン-4-カルボン酸);
    5,5'-((4-(エチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-(トリフルオロメチル)安息香酸);
    4,4'-((4-(エチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-フルオロ安息香酸);
    5,5'-((4-(エチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(3-フルオロ安息香酸);及び
    2-(1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-4-イル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)-6-(1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-7-イル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)-N-エチルイソニコチンアミド
    から選択される、請求項1記載の方法。
  21. 前記式(I)の化合物が、結果として得られる核酸生成物の長さを、該式(I)の化合物を欠く核酸ポリメラーゼ反応と比較して増加させる、請求項1〜20のいずれか1項記載の方法。
  22. 該少なくとも1種の式(I)の化合物が、複数の式(I)の化合物を含む、請求項1〜20のいずれか1項記載の方法。
  23. 前記核酸ポリメラーゼが、DNAポリメラーゼである、請求項1〜20のいずれか1項記載の方法。
  24. 前記DNAポリメラーゼが、DPO4又はそのバリアントである、請求項23記載の方法。
  25. 前記ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物が、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含むヌクレオチド類似体の混合物であり、
    該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、
    該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該ポリマー性のテザー部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている、請求項1〜20のいずれか1項記載の方法。
  26. 前記核酸重合反応が、ヌクレオチド類似体の拡張可能なポリマーを生じさせ、該拡張可能なポリマーが、前記テンプレート核酸の核酸塩基配列情報をコードする、請求項1〜20のいずれか1項記載の方法。
  27. 前記核酸重合反応を可能とする条件が、好適な重合バッファー及びオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項1〜20のいずれか1項記載の方法。
  28. 前記好適なバッファーが、Tris OAc、NH4OAc、PEG、水混和性有機溶媒、ポリホスフェート60、NMS、及びMnCl2のうちの少なくとも1種を含む、請求項1〜20のいずれか1項記載の方法。
  29. 前記反応混合物が、一本鎖結合タンパク質をさらに含む、請求項1〜20のいずれか1項記載の方法。
  30. 前記反応混合物が、尿素をさらに含む、請求項1〜20のいずれか1項記載の方法。
  31. 前記ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物が、検出可能な標識を含むヌクレオチド類似体を含む、請求項1〜20のいずれか1項記載の方法。
  32. 前記検出可能な標識が、発光標識、化学発光標識、蛍光標識、蛍光発生標識、発色団標識、又は発色性標識からなる群から選択される光学的に検出可能な標識である、請求項31記載の方法。
  33. DNAテンプレートをシーケンシングする方法であって、以下の工程:
    a. 以下:
    i. DNAテンプレート、
    ii. 該テンプレートと複合体を形成する複製プライマー、
    iii. DNAポリメラーゼ、
    iv. ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物、
    v. 少なくとも1種の式(I)の化合物
    を含むDNAポリメラーゼ反応組成物を形成させる工程;
    b. DNA重合反応を可能とする条件下で該DNAポリメラーゼ反応組成物をインキュベートする工程であって、該少なくとも1種の式(I)の化合物が、該DNAポリメラーゼ反応の速度、忠実度、又は進行性を増加させる、前記工程;及び
    c. 結果として得られるヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のポリマー内の該ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の配列を決定する工程;
    を含み、
    該式(I)の化合物が:
    Figure 2021509584
     (式中、各出現において独立に:
    mは、1、2、又は3であり;
    nは、0、1、又は2であり;
    pは、0、1、又は2であり;
    Ar1は、任意に置換されたアリールであり;
    Ar2は、5員及び6員の単環式芳香環、並びに一緒に縮合した2個の5員及び/又は6員の単環式環を含む9及び10員の縮合二環式環から選択され、ここで、該2つの単環式環の少なくとも一方は、芳香環であり、ここで、
    Ar2は、ハライド、C1-C6アルキル、C1-C6ハロアルキル、E-CO2R0、E-CONH2、E-CHO、E-C(O)NH(OH)、E-N(R0)2、及びE-OR0から選択される1個以上の置換基で任意に置換され、ここで、
    Eは、直接の結合及びC1-C6アルキレンから選択され;かつ
    R0は、H、C1-C6アルキル、及びC1-C6ハロアルキルから選択され、
    Mは、水素、ハロゲン、及びC1-C4アルキルから選択され;かつ
    Lは、連結基である;)
    であるか、又はその溶媒和物、水和物、互変異性体、キレート、もしくは塩である、前記方法。
  34. 前記ヌクレオチド類似体の混合物が、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含み、
    該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、
    該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該重合体のエーテル部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている、請求項33記載の方法。
  35. 前記DNAポリメラーゼが、DPO4又はそのバリアントである、請求項34記載の方法。
  36. 前記結果として得られるヌクレオチド類似体のポリマーが、拡張可能なポリマーである請求項35記載の方法。
  37. 前記拡張可能なポリマーを、ホスホロアミデート切断剤と接触させて、拡張されたヌクレオチド類似体のポリマーを生成させる工程をさらに含む、請求項36記載の方法。
  38. 前記ヌクレオチド類似体のそれぞれの前記ポリマー性のテザー部位が、該類似体の核酸塩基に対して一意的なレポーター部位を含む、請求項34記載の方法。
  39. 前記レポーター部位が、特有の電子信号を生じさせる、請求項34記載の方法。
  40. 前記ヌクレオチド類似体の配列を決定する工程が、ナノ細孔を通して前記拡張されたヌクレオチド類似体のポリマーを移動させる工程を含む、請求項34記載の方法。
  41. 式(I)の化合物:
    Figure 2021509584
     (式中、各出現において独立に:
    mは、1、2、又は3であり;
    nは、0、1、又は2であり;
    pは、0、1、又は2であり;
    Ar1は、任意に置換されたアリールであり;
    Ar2は、5員及び6員の単環式芳香環、並びに一緒に縮合した2個の5員及び/又は6員の単環式環を含む9及び10員の縮合二環式環から選択され、ここで、該2つの単環式環の少なくとも一方は、芳香環であり、ここで、
    Ar2は、ハライド、C1-C6アルキル、C1-C6ハロアルキル、E-CO2R0、E-CONH2、E-CHO、E-C(O)NH(OH)、E-N(R0)2、及びE-OR0から選択される1個以上の置換基で任意に置換され、ここで
    Eは、直接の結合及びC1-C6アルキレンから選択され;かつ
    R0は、H、C1-C6アルキル、及びC1-C6ハロアルキルから選択され、
    Mは、水素、ハロゲン、及びC1-C4アルキルから選択され;かつ
    Lは、連結基である;)
    又はその溶媒和物、水和物、互変異性体、キレート、もしくは塩。
  42. nが、0であり、かつmが、2である、以下の式:
    Figure 2021509584
     を有する、請求項41記載の化合物。
  43. Ar1が、単環式炭素環式アリールである、請求項41記載の化合物。
  44. Ar1が、以下:
    Figure 2021509584
     (式中、トリアゾール環は、Ar1上の位置kに配置される)
    から選択される、請求項43記載の化合物。
  45. Ar1が、単環式ヘテロ環式アリールである、請求項41記載の化合物。
  46. Ar1が、以下:
    Figure 2021509584
     (式中、トリアゾール環は、Ar1上の位置kに配置される)
    から選択される、請求項45記載の化合物。
  47. Ar1が、二環式アリールである、請求項41記載の化合物。
  48. Ar1が、以下:
    Figure 2021509584
     (式中、トリアゾール環は、Ar1上の位置kに配置される)
    から選択される二環式炭素環式アリールである、請求項47記載の化合物。
  49. Ar1が、以下:
    Figure 2021509584
     (式中、トリアゾール環は、Ar1上の位置kに配置される)
    から選択される二環式ヘテロ環式アリールである、請求項47記載の化合物。
  50. Ar1が、三環式アリールである、請求項41記載の化合物。
  51. Ar1が、以下:
    Figure 2021509584
     から選択される三環式炭素環式アリールである、請求項50記載の化合物。
  52. Ar1が、以下:
    Figure 2021509584
     (式中、トリアゾール環は、Ar1上の位置kに配置される)
    から選択される三環式ヘテロアリールである、請求項50記載の化合物。
  53. Ar1が、以下:
    Figure 2021509584
     (式中、前記トリアゾール環は、Ar1上の位置kに配置される)
    から選択される三環式ヘテロアリールである、請求項50記載の化合物。
  54. Ar1が、非置換アリールである、請求項41記載の化合物。
  55. Ar1が、置換アリールである、請求項41記載の化合物。
  56. Ar1上の少なくとも1個の置換基が、ハロゲン、ヒドロキシル、メルカプタン、ニトロ、及びニトリルからなる群から選択される、請求項55記載の化合物。
  57. Ar1上の少なくとも1個の置換基が、-SOR1、-S(O)2R1、-S(O)2NR2R3、-OR1、-OC(O)R3、-C(O)OR3、-C(O)R1、-C(O)NR2R3、-NR2R3、-N(R3)C(O)R1、及び-NS(O)2R3からなる群から選択され;かつ
    R1の各出現が、独立に、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のシクロアルキル、置換又は非置換のヘテロシクリル、置換又は非置換のアリール、及び置換又は非置換のヘテロアリールからなる群から選択され;かつ
    R2及びR3の各出現が、独立に、-H、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のシクロアルキル、置換又は非置換のヘテロシクリル、置換又は非置換のアリール、及び置換又は非置換のヘテロアリールからなる群から選択される、請求項55記載の化合物。
  58. Ar1上の少なくとも1個の置換基が、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のアルケニル、置換又は非置換のアルキニル、置換又は非置換のシクロアルキル、置換又は非置換のヘテロシクリル、置換又は非置換のアリール、置換又は非置換のヘテロアリール、置換又は非置換のアリールアルキル、置換又は非置換のヘテロアリールアルキル、置換又は非置換のハロアルキル、及び置換又は非置換のハロアルコキシからなる群から選択される、請求項55記載の化合物。
  59. Ar1上の少なくとも1個の置換基が、-R4-H(式中、R4は、1個以上のヘテロ原子で中断されたアルキレンであり、該ヘテロ原子は、X、S、NH、又はそれらの組み合わせである)からなる群から選択される、請求項55記載の化合物。
  60. Ar1上の少なくとも1個の置換基が、-O-(C1-6アルキル)、C1-6アルキル、C1-6ハロアルキル、-CO2-C1-6アルキル、-CONH-C1-6アルキル、-CONH2、CN;及び-NO2からなる群から選択される、請求項55記載の化合物。
  61. Ar2が、チオフェン、1,2-チアゾール、1,3-チアゾール、フラン、1,2-オキサゾール、1,3-オキサゾール、1H-ピロール、1H-ピラゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、1,2,4-トリアゾール、1,2,3-トリアゾール、及び1H-イミダゾールからなる群から選択される5員の単環式芳香環である、請求項41記載の化合物。
  62. Ar2が、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、及びピラジンからなる群から選択される6員の単環式芳香環である、請求項41記載の化合物。
  63. Ar2が、ベンゾフラン、1,3-ベンゾオキサゾール、フロ[3,2-b]ピリジン、フロ[3,2-c]ピリジン、フロ[2,3-c]ピリジン、フロ[2,3-b]ピリジン、インドール、1H-ベンゾイミダゾール、1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン、1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン、1H-ピロロ[2,3-c]ピリジン、1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン、ベンゾチオフェン、1,3-ベンゾチアゾール、チエノール[3,2-b]ピリジン、チエノ[3,2-c]ピリジン、チエノ[2,3-c]ピリジン、ベンゾオキサジアゾール、ベンゾチアジアゾール、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾトリアゾール、及びチエノ[2,3-b]ピリジンからなる群から選択される9員の縮合二環式芳香環系である、請求項41記載の化合物。
  64. Ar2が、ナフチレン、キノリン、キナゾリン、キノキサリン、1,5-ナフチリジン、1,6-ナフチリジン、1,7-ナフチリジン、1,8-ナフチリジン、イソキノリン、フタラジン、2,6-ナフチリジン、及び2,7-ナフチリジンからなる群から選択される10員の縮合二環式芳香環系である、請求項41記載の化合物。
  65. Ar2が、以下:
    Figure 2021509584
     (式中、置換基Gは、該ピリジニル環上に0個、1個、又は2個存在する)
    から選択されるピリジニル環である、請求項41記載の化合物。
  66. Ar2が、以下の式:
    Figure 2021509584
     (式中、置換基Gは、該フェニル環上に0個、1個、又は2個存在する)
    のフェニル環である、請求項41記載の化合物。
  67. Ar2が、以下
    Figure 2021509584
     から選択されるフェニル環である、請求項41記載の化合物。
  68. 前記Ar2上の置換が、アミノを含む、請求項41記載の化合物。
  69. 前記Ar2上の置換が、メトキシを含む、請求項41記載の化合物。
  70. 前記Ar2上の置換が、カルボン酸を含む、請求項41記載の化合物。
  71. 前記Ar2上の置換が、-CH2-CO2-CH3を含む、請求項41記載の化合物。
  72. Ar2上の置換が、トリフルオルメチル(trifluormethyl)を含む、請求項41記載の化合物。
  73. Ar2上の置換が、ヒドロキシルを含む、請求項41記載の化合物。
  74. Ar2上の置換が、1個のカルボン酸及び1個のヒドロキシルである、請求項41記載の化合物。
  75. Ar2上の置換が、1個のカルボン酸及び1個のトリフルオロメチルである、請求項41記載の化合物。
  76. キレートの形態である、請求項41記載の化合物。
  77. 前記キレートが、銅キレートである、請求項76記載の化合物。
  78. 少なくとも4.9のlogPを有する、請求項41記載の化合物。
  79. ヒドロキシル、カルボン酸、及びトリフルオロメチルのうちの少なくとも2つを含むAr2上の置換を有する、請求項41記載の化合物。
  80. 以下の式:
    Figure 2021509584
     の請求項79記載の化合物。
  81. 以下の式:
    Figure 2021509584
     の請求項79記載の化合物。
  82. 以下の式:
    Figure 2021509584
     の請求項79記載の化合物。
  83. 以下の式:
    Figure 2021509584
     の請求項79記載の化合物。
  84. 以下の式:
    Figure 2021509584
     の請求項79記載の化合物。
  85. 以下:
    4,4'-(ピリジン-2,6-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(ピリジン-3,5-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(1,3-フェニレンビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((9H-カルバゾール-3,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((9H-カルバゾール-3,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ジアニリン;
    4,4'-((9H-カルバゾール-3,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ジ安息香酸;
    3,6-ビス(1-(4-メトキシフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)-9H-カルバゾール;
    4,4'-((4-メトキシピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-カルボキシピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-ニトロピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    5,5'-((4-シアノピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-メチルピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(エトキシカルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    5,5'-((4-(エトキシカルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(メトキシカルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(エチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(メチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-カルバモイルピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(ピラジン-2,6-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(1,4-フェニレンビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(1,3-フェニレンビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ジアニリン;
    4,4'-(1,3-フェニレンビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ジ安息香酸;
    4-(4-(3-(1-(4-メトキシフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)フェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)安息香酸;
    4,4'-(ピリジン-2,6-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ジアニリン;
    4,4'-(ピリジン-2,6-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ジ安息香酸;
    2,6-ビス(1-(4-メトキシフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)ピリジン;
    4-(4-(3-(1-(4-カルボキシフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)フェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-ヒドロキシ安息香酸;
    4-(4-(3-(1-(4-メトキシフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)フェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)安息香酸;
    4,4'-((3,5-ジメチルピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4l3-ピリジン-2,6-ジイル)ビス(5-ヨード-1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-アセトアミドピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((9-アセチル-9H-カルバゾール-3,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(ピリジン-2,6-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(N,2-ジヒドロキシベンズアミド);
    4,4'-(ピリジン-2,6-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシベンズアミド);
    4,4'-((4-カルボキシピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((1,10-フェナントロリン-2,9-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(トリフルオロメチル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((3-シアノピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((3-ニトロピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    3,3'-((4-シアノピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(tert-ブトキシカルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4-(4-(4-シアノピリジン-2-イル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-ヒドロキシ安息香酸;
    5-(4-(6-(4-(3-カルボキシ-4-ヒドロキシ-5-メチルフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-4-(メトキシカルボニル)ピリジン-2-イル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-ヒドロキシ-3-安息香酸;
    4,4'-((4-(ジメチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(シクロプロピルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ブタ-3-イン-1-イルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ブチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ジエチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(tert-ブチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(モルホリン-4-カルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(プロピルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(フェニルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-((2-アセトアミドエチル)カルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(4-シクロプロピルピペラジン-1-カルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(カルバムイミドイルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ピペリジン-1-カルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(シクロブチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((1,10-フェナントロリン-3,8-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(シクロペンチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ジプロピルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ジ-sec-ブチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(ナフタレン-2,7-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-(ナフタレン-2,3-ジイルビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ジブチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-((2-ヒドロキシエチル)カルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(シクロヘキシルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(ベンジルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(4-メチルピペラジン-1-カルボニル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4-(4-(3-(1-(4-メトキシフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)フェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)安息香酸;
    4,4',4'',4'''-((((ブタン-1,4-ジイルビス(アザンジイル))ビス(カルボニル))ビス(ピリジン-4,2,6-トリイル))テトラキス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))テトラキス(2-ヒドロキシ安息香酸);
    4,4'-((4-(エチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(3,5,6-トリクロロピコリン酸);
    4,4'-((4-(エチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-(トリフルオロメチル)安息香酸);
    7,7'-((4-(エチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-ヒドロキシ-1,8-ナフチリジン-4-カルボン酸);
    5,5'-((4-(エチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-(トリフルオロメチル)安息香酸);
    4,4'-((4-(エチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(2-フルオロ安息香酸);
    5,5'-((4-(エチルカルバモイル)ピリジン-2,6-ジイル)ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(3-フルオロ安息香酸);及び
    2-(1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-4-イル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)-6-(1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-7-イル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)-N-エチルイソニコチンアミド
    から選択される、請求項41記載の化合物。
  86. 請求項41〜85のいずれか1項記載の化合物、及び分子クラウディング剤を含む組成物。
  87. 前記分子クラウディング剤が、ポリアルキレングリコールである、請求項86記載の組成物。
  88. 請求項41〜85のいずれか1項記載の化合物、及び水性バッファーを含む組成物。
  89. 前記水性バッファーが、Tris HClである、請求項88記載の組成物。
  90. 請求項41〜85のいずれか1項記載の化合物、及びポリヌクレオチドを含む組成物。
  91. 前記ポリヌクレオチドが、20〜60merオリゴヌクレオチドである、請求項90記載の組成物。
  92. 請求項41〜85のいずれか1項記載の化合物、及びタンパク質を含む組成物。
  93. 前記タンパク質が、DNAポリメラーゼである、請求項92記載の組成物。
  94. 請求項41〜85のいずれか1項記載の化合物、及びヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物を含む組成物。
  95. 請求項41〜85のいずれか1項記載の少なくとも1種の化合物、及びヌクレオチド類似体の混合物を含む、DNAポリメラーゼ反応の進行性、忠実度、又は速度を強化するための組成物。
  96. 請求項41〜85のいずれか1項記載の少なくとも1種の化合物、及びヌクレオチド類似体の混合物を含む組成物であって、該請求項41〜85のいずれか1項記載の少なくとも1種の化合物が、テンプレート依存性重合反応の間に娘鎖に取り込まれるヌクレオチド類似体の数及び正確度を、該請求項41〜85のいずれか1項記載の少なくとも1種の化合物がない場合の同一の重合反応と比較して増加させる、前記組成物。
  97. 前記ヌクレオチド類似体の混合物が、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含み、
    該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、
    該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該重合体のエーテル部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている、請求項96記載の組成物。
  98. Tris OAc、NH4OAc、PEG、水混和性有機溶媒、ポリホスフェート60、NMS、及びMnCl2のうちの少なくとも1つから選択されるバッファー成分をさらに含む、請求項96記載の組成物。
  99. 一本鎖結合タンパク質をさらに含む、請求項96記載の組成物。
  100. 尿素をさらに含む、請求項96記載の組成物。
  101. 前記ヌクレオチド類似体の混合物が、検出可能な標識を含むヌクレオチド類似体を含む、請求項96記載の組成物。
  102. 前記検出可能な標識が、発光標識、化学発光標識、蛍光標識、蛍光発生標識、発色団標識、又は発色性標識からなる群から選択される光学的に検出可能な標識である、請求項101記載の組成物。
  103. 請求項86〜102のいずれか1項記載の少なくとも1種の組成物を含む、核酸テンプレートをシーケンシングするためのキット。
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