JP7275148B2 - 副溝結合成分による核酸重合の強化 - Google Patents
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Description
本出願に関連する配列表が、紙での複写物の代わりにテキスト形式で提供され、これにより引用により本明細書に組み込まれる。該配列表が入ったテキストファイルの名称は、870225_422WO_SEQUENCE_LISTING.txtである。該テキストファイルは、3.3KBであり、2018年12月19日に作成されたものであり、EFS-Webを通じて電子的に提出されている。
本発明は、概して、核酸の重合のため及び/又は酵素の性能に影響を及ぼすための方法及び組成物に関する。
生体分子の測定は、現代の医学の基盤であり、医学研究において、より具体的には、診断及び治療において、並びに創薬において広く用いられる。核酸は、生物が機能し生殖するのに必要な情報をコードしており、本質的に、生命の設計図である。そのような設計図を決定することは、純粋な研究においても、応用科学においても有用である。医学においては、シーケンシングは、がん、心疾患、自己免疫障害、多発性硬化症、及び肥満症を含む種々の病態の診断のため、及びそれらの治療を開発するのに使用し得る。産業においては、シーケンシングを、改善された酵素プロセス又は人工生物を設計するのに使用することができる。生物学においては、このツールを、例えば、生態系の健全性を研究するのに使用することができ、従って、広い範囲で有用である。同様に、タンパク質及び他の生体分子の測定は、疾患及び病原体の伝播のマーカー及び理解を提供している。
手短にいうと、本開示は、核酸ポリメラーゼ活性を強化する方法及び組成物を提供する。ある実施態様において、ポリメラーゼ活性が、該ポリメラーゼに対する1つ以上の課題を持ち込む条件、例えば、ポリメラーゼの進行性を損なう非天然のヌクレオチド類似体基質又はテンプレートモチーフを含む条件下での重合反応において強化される。そのような強化は、重合反応に、当技術分野において「副溝結合物質」(MGB)として知られているクラスの化合物のうちの1つ以上の添加剤を追加することによって達成される。驚くべきことに、かつ有利なことに、本発明者らは、ある種のMGBが、ポリメラーゼ活性を、特に、非天然の高度に置換されたヌクレオチド類似体基質を用いた場合に、顕著に強化することを見出だした。
本開示の例示的な特徴、その性質、及びさまざまな利点が、添付の図面及び以下のさまざまな実施態様の詳細な説明から明らかとなるであろう。非限定的かつ非網羅的な実施態様が、添付の図面を参照して説明される。図面では、同様な標識又は参照番号は、特に明記されない限り、さまざまな図の全体にわたって同様な部分を指す。図面において要素の大きさ及び相対的な位置は、必ずしも縮尺に合わせて描かれたものではない。例えば、さまざまな要素の形状は、図面の見やすさを改善するよう選択、拡大、及び配置される。描かれている要素の特定の形状は、図面での認識の容易さのために選択されている。
以下の説明において、ある特定の詳細が、さまざまな実施態様の完全な理解を提供するように記載される。しかしながら、当業者は、本発明が、これらの詳細がなくても実践され得ることを理解するであろう。別の例においては、不必要で不明瞭化してしまう実施態様の説明を避けるために、周知の構造を示していないか又は詳細に説明していない。文脈上別段の必要性がある場合を除き、本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体にわたって、「を含む(comprise)」という用語、並びに「を有する(have)」、「を含む(include)」、「を含む(comprises)」及び「を含む(comprising)」などのその同意語及び変形形態は、オープンである包含的な意味で、すなわち、「これらに限定されないが、~を含む」として解釈されるべきである。「本質的に~からなる」という用語は、請求項の範囲を、明示された材料又は工程にか、又は特許請求された発明の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。さらに、本明細書で提示される見出しは、便宜上のみのものであり、特許請求された発明の範囲又は意味を説明するものではない。
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドとも呼ばれる「核酸」は、1つのヌクレオチドのペントースの3’位が、次のヌクレオチドの5’位に、ホスホジエステル基によって連結されている、共有結合的に連結されたヌクレオチドの連結である。核酸分子は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、又は双方の組合せであり得る。DNA(デオキシリボ核酸)及びRNA(リボ核酸)は、ヌクレオチド残基が、ホスホジエステル結合によって特定の配列に連結されている、生物学的に生じるポリヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、又は「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの線状骨格を有するいかなるポリマー化合物をも包含する。オリゴマーともよばれるオリゴヌクレオチドは、一般に、より短い鎖のポリヌクレオチドである。核酸は、一般に、シーケンシングの標的とされた場合には、「標的核酸」又は「標的配列」と呼ばれる。
MGBは、その想定される作用機構が、二重鎖DNAの副溝とのものである小分子DNA結合物質の多様な群である(総説については、例えば、Jerry L. Atwood編「超分子化学総覧II (Comprehensive Supramolecular Chemistry II)」内のJ.M. Withers, G. Padroni, S.M. Pauff, A.W. Clark, S.P. Mackay及びG.A. Burleyの文献「5.07-治療薬としてのDNA副溝結合物質(5.07 - DNA Minor Groove Binders as Therapeutic Agents)」、Elsevier, Oxford, 2017, Pages 149-178, ISBN 9780128031995, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-409547-2.12561-2を参照されたい)。一般的に、MGBの構造は、B型DNAの副溝の曲線を補完する曲がったコンホメーションを採用している。MGBは、任意の公知のMGBの任意の類似体又は誘導体であり得る。例示的なMGBとしては、Hoechst色素及び誘導体(例えば、Hoechst 33258、Hoechst 34580、Hoechst 33342)、ネトロプシン、ディスタマイシンA及びその合成類似体(例えば、レキシトロプシン及びチアゾトロプシンA)、(+)-CC-1065、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、トラベクチン(trabectin)及び類似体、ジアミジン(例えば、DAPI、ベレニル、ペンタミジン、DB293、及び3,6-ジアミノアクリジン塩酸塩)、並びにポリアミドが挙げられるが、これらに限定されない。MGBは、MilliporeSigma社(St. Louis, MO)など、多くの商業的供給業者から入手可能である。
MGBで強化することができる例示的なポリメラーゼ反応の1つは、Stratos Genomicsにより開発された「拡張によるシーケンシング」(SBX)プロトコルの基礎を成す「XNTP」として知られる非天然ヌクレオチド類似体の重合である(例えば、Kokorisらの文献、米国特許第7,939,259号、「拡張によるハイスループット核酸シーケンシング(High Throughput Nucleic Acid Sequencing by Expansion)」を参照されたい)。一般的には、SBXは、この生化学的重合を使用して、DNAテンプレートの配列を、「エクスパンドマー」と呼ばれる測定可能なポリマー上に転写する。転写された配列は、~10nm離された高い信号対ノイズのレポーターに、エクスパンドマー骨格に沿ってコード化され、高い信号対ノイズのよく区別された応答のために設計される。これらの差は、ネイティブDNAと比較して、エクスパンドマーの配列リード効率及び正確度における著しい性能強化を提供する。一般化されたSBXプロセスの概要を、図1A~図1Dに示す。
一実施態様において、本開示は、本明細書で開示される少なくとも1つのMGB、並びに複数のヌクレオチド及び/又はヌクレオチド類似体を含む組成物を提供する。別の実施態様において、本開示は、本明細書で開示される少なくとも1つのMGB、及びバッファーを含む組成物を提供する。別の実施態様において、本開示は、本明細書で開示される少なくとも1つのMGB、及びポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。別の実施態様において、本開示は、本明細書で開示される少なくとも1個、及びタンパク質を含む組成物であって、任意に、該タンパク質が、上述のポリメラーゼのうちのいずれかを含むポリメラーゼである、前記組成物を提供する。
(実施例1 XNTP重合の強化のための添加剤のスクリーニング)
本発明者らにより開発された拡張によるシーケンシング(SBX)方法体系は、ネイティブDNAと比較して、エクスパンドマーの配列リード効率及び正確度の著しい性能強化を提供する。しかしながら、はじめの天然DNAテンプレートの配列の測定可能なエクスパンドマー上への転写は、DNAポリメラーゼが基質としてXNTPを利用する能力に頼っている(XNTPの一般化された構造は、図1A及び図2を参照して本明細書で解説される)。本発明者らは、大部分のDNAポリメラーゼが、XNTPを効率的に重合させないことを見出だした。エクスパンドマーへのXNTP重合の効率及び正確度を改善しようとして、様々な添加剤を、基質としてXNTPを用いるDNAポリメラーゼプライマー伸長反応を強化する能力に関してスクリーニングした。
(表1)
(XNTP重合のMGB介在性強化の最適化)
実施例1に記載したプライマー伸長反応を用いて、タイトレーション実験を行って、XNTP重合の強化のためのMGBの最適量を決定した。代表的な実験の結果を、図5に示す。これらの結果は、最高濃度が、プライマー伸長の最も強固な強化を示す、試験された各MGB(Hoescht 33258、Hoescht 33342、及びネトロプシン、75~600μMの範囲)での用量依存的な強化を示している。さらなるタイトレーション実験は、0.6mMのHoescht 33258及び0.8mMのHoescht 33342が、XNTP重合の信頼できる強化を実際に示すことを示した。これらの作用を示す代表的なゲルを、図6に示す。
(MGBは、拡張によるシーケンシング(SBX)を強化する)
XNTP重合の強化の正確度を調査するために、プライマー伸長生成物を、SBXプロトコルを用いてシーケンシングした。簡単に述べると、XNTP重合の拘束エクスパンドマー生成物を切断して、直線化されたエクスパンドマーを生成させる。これは、はじめに、伸長反応を、100mM EDTA、2mM THPTA、及び2% Tween-20を含有する溶液でクエンチすることによって達成される。その後、試料を、DMF中の1M NaHCO3及び1M 無水コハク酸の溶液でアミン修飾する。ホスホロアミデート結合の切断を、37% HClを用いて行い、直線化されたエクスパンドマーを、QIAquickカラム(QIAGEN社)で精製する。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
(態様1)
核酸ポリメラーゼ反応を強化する方法であって:
a)以下:
(i)テンプレート核酸、
(ii)核酸ポリメラーゼ、
(iii)ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物、
(iv)少なくとも1つの副溝結合成分
を含む核酸ポリメラーゼ反応組成物を形成させること;及び
b)該核酸ポリメラーゼ反応組成物を、核酸重合反応を可能とする条件下でインキュベートすることであって、該少なくとも1つの副溝結合成分が、該核酸ポリメラーゼ反応の進行性、速度、又は忠実度を増加させる、前記インキュベートすること
を含む、前記方法。
(態様2)
前記少なくとも1つの副溝結合成分が、結果として得られる核酸生成物の長さを、該副溝結合成分を欠く核酸ポリメラーゼ反応と比較して増加させる、態様1記載の方法。
(態様3)
前記少なくとも1つの副溝結合成分が、ディスタマイシンA及びその合成類似体、ネトロプシン、(+)-CC-1065、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、トラベクチン(trabectin)及びその類似体、Hoechst色素及びその誘導体、レキシトロプシン、チアゾトロプシンA、ジアミジン、並びにポリアミドからなる群から選択される、態様1記載の方法。
(態様4)
前記少なくとも1つの副溝結合成分が、Hoechst色素である、態様3記載の方法。
(態様5)
前記少なくとも1つの副溝結合成分が、複数の副溝結合成分を含む、態様3記載の方法。
(態様6)
前記複数の副溝結合成分が、異なる構造クラスの副溝結合成分を含む、態様5記載の方法。
(態様7)
前記核酸ポリメラーゼが、DNAポリメラーゼである、態様1記載の方法。
(態様8)
前記DNAポリメラーゼが、DPO4又はそのバリアントである、態様7記載の方法。
(態様9)
前記ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物が、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含むヌクレオチド類似体の混合物であり、
該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、
該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該ポリマー性のテザー部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている、態様7記載の方法。
(態様10)
前記核酸重合反応が、ヌクレオチド類似体の拡張可能なポリマーを生じさせ、該拡張可能なポリマーが、前記テンプレート核酸の核酸塩基配列情報をコードする、態様9記載の方法。
(態様11)
前記核酸重合反応を可能とする条件が、好適な重合バッファー及びオリゴヌクレオチドプライマーを含む、態様10記載の方法。
(態様12)
前記好適なバッファーが、Tris OAc、NH 4 OAc、PEG、DMF、ポリホスフェート60、及びMnCl 2 を含む、態様11記載の方法。
(態様13)
前記反応混合物が、核酸インターカレート剤をさらに含む、態様1記載の方法。
(態様14)
前記反応混合物が、ポリアニオン認識成分をさらに含む、態様1記載の方法。
(態様15)
前記ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物が、検出可能な標識を含むヌクレオチド類似体を含む、態様1記載の方法。
(態様16)
前記検出可能な標識が、発光標識、化学発光標識、蛍光標識、蛍光発生標識、発色団標識、又は発色性標識からなる群から選択される光学的に検出可能な標識である、態様15記載の方法。
(態様17)
少なくとも1つの副溝結合成分、及びヌクレオチド類似体の混合物を含む、DNAポリメラーゼ反応の進行性、忠実度、又は速度を強化するための組成物。
(態様18)
少なくとも1つの副溝結合成分、及びヌクレオチド類似体の混合物を含む組成物であって、該少なくとも1つの副溝結合成分が、テンプレート依存性重合反応の間に娘鎖に取り込まれるヌクレオチド類似体の数及び正確度を、該少なくとも1つの副溝結合成分が存在しない同一の重合反応と比較して増加させる、前記組成物。
(態様19)
前記少なくとも1つの副溝結合成分が、ディスタマイシンA及びその合成類似体、ネトロプシン、(+)-CC-1065、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、トラベクチン(trabectin)及びその類似体、Hoechst色素及びその誘導体、レキシトロプシン、チアゾトロプシンA、ジアミジン、並びにポリアミドからなる群から選択される、態様17記載の組成物。
(態様20)
前記少なくとも1つの副溝結合成分が、Hoechst色素である、態様19記載の組成物。
(態様21)
前記少なくとも1つの副溝結合成分が、複数の副溝結合成分を含む、態様17記載の組成物。
(態様22)
前記複数の副溝結合成分が、異なる構造クラスの副溝結合成分を含む、態様21記載の組成物。
(態様23)
前記ヌクレオチド類似体の混合物が、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含み、
該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、
該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該重合体のエーテル部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている、態様17記載の組成物。
(態様24)
Tris OAc、NH 4 OAc、PEG、DMF、ポリホスフェート60、及びMnCl 2 を含むバッファーをさらに含む、態様23記載の組成物。
(態様25)
DNAインターカレート剤をさらに含む、態様17記載の組成物。
(態様26)
ポリアニオン認識成分をさらに含む、態様17記載の組成物。
(態様27)
前記ヌクレオチド類似体の混合物が、検出可能な標識を含むヌクレオチド類似体を含む、態様17記載の組成物。
(態様28)
前記検出可能な標識が、発光標識、化学発光標識、蛍光標識、蛍光発生標識、発色団標識、又は発色性標識からなる群から選択される光学的に検出可能な標識である、態様27記載の組成物。
(態様29)
DNAテンプレートをシーケンシングする方法であって、以下の工程:
a)以下:
(i)該DNAテンプレート、
(ii)該テンプレートと複合体を形成する複製プライマー、
(iii)DNAポリメラーゼ、
(iv)ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の混合物、
(v)少なくとも1つの副溝結合成分
を含むDNAポリメラーゼ反応組成物を形成させる工程;
b)該DNAポリメラーゼ反応組成物を、DNA重合反応を可能とする条件下でインキュベートする工程であって、該少なくとも1つの副溝結合成分が、該DNAポリメラーゼ反応の速度、忠実度、又は進行性を増加させる、前記工程;及び
c)結果として得られるヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のポリマー内の該ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の配列を決定する工程
を含む、前記方法。
(態様30)
前記少なくとも1つの副溝結合成分が、ディスタマイシンA及びその合成類似体、ネトロプシン、(+)-CC-1065、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、トラベクチン(trabectin)及びその類似体、Hoechst色素及びその誘導体、レキシトロプシン、チアゾトロプシンA、ジアミジン、並びにポリアミドからなる群から選択される、態様29記載の方法。
(態様31)
前記ヌクレオチド類似体の混合物が、ヌクレオシドトリホスホロアミデートを含み、
該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのそれぞれが、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンからなる群から選択される核酸塩基、並びにポリマー性のテザー部位を含み、
該ポリマー性のテザー部位の第1末端が、該核酸塩基に取り付けられ、かつ該重合体のエーテル部位の第2末端が、該ヌクレオシドトリホスホロアミデートのα-リン酸に取り付けられて、ホスホロアミデート結合の切断による該ヌクレオチド類似体の拡張が利用可能とされている、態様29記載の方法。
(態様32)
前記DNAポリメラーゼが、DPO4又はそのバリアントである、態様29記載の方法。
(態様33)
前記結果として得られるヌクレオチド類似体のポリマーが、拡張可能なポリマーである、態様29記載の方法。
(態様34)
前記拡張可能なポリマーを、ホスホロアミデート切断剤と接触させて、拡張されたヌクレオチド類似体のポリマーを生成させる工程をさらに含む、態様33記載の方法。
(態様35)
前記ヌクレオチド類似体のそれぞれの前記ポリマー性のテザー部位が、該類似体の核酸塩基に対して一意的なレポーター部位を含む、態様34記載の方法。
(態様36)
前記レポーター部位が、特有の電子信号を生じさせる、態様35記載の方法。
(態様37)
前記ヌクレオチド類似体の配列を決定する工程が、ナノ細孔を通して前記拡張されたヌクレオチド類似体のポリマーを移動させる工程を含む、態様36記載の方法。
Claims (6)
- 核酸ポリメラーゼ反応を強化する方法であって:
a)以下:
(i)テンプレート核酸、
(ii)核酸ポリメラーゼ、
(iii)XNTP、
(iv)少なくとも1つの副溝結合成分
を含む核酸ポリメラーゼ反応組成物を形成させること;及び
b)該核酸ポリメラーゼ反応組成物を、核酸重合反応を可能とする条件下でインキュベートすることであって、該少なくとも1つの副溝結合成分が、該核酸ポリメラーゼ反応の進行性、速度、又は忠実度を増加させる、前記インキュベートすること
を含み、
該少なくとも1つの副溝結合成分が、ディスタマイシンA及びその合成類似体、ネトロプシン、(+)-CC-1065、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、トラベクチン(trabectin)及びその類似体、Hoechst色素及びその誘導体、レキシトロプシン、チアゾトロプシンA、ジアミジン、並びにポリアミドからなる群から選択される、前記方法。 - 前記少なくとも1つの副溝結合成分が、結果として得られる核酸生成物の長さを、該副溝結合成分を欠く核酸ポリメラーゼ反応と比較して増加させる、請求項1記載の方法。
- 前記少なくとも1つの副溝結合成分が、Hoechst色素である、請求項1記載の方法。
- 前記少なくとも1つの副溝結合成分が、複数の副溝結合成分を含む、請求項1記載の方法。
- 前記核酸ポリメラーゼが、DNAポリメラーゼである、請求項1記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、DPO4である、請求項5記載の方法。
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