JP2024026147A - 単一分子配列決定における使用のための拡張可能ポリマーの固体合成のための方法、組成物、およびデバイス - Google Patents

単一分子配列決定における使用のための拡張可能ポリマーの固体合成のための方法、組成物、およびデバイス Download PDF

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Abstract

【課題】単一分子配列決定のための方法、組成物、およびデバイス、特に拡張可能ポリマー（例えば、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ）の固体合成およびプロセシングのための方法、組成物、およびデバイス、ならびにナノポアセンサを通過するときにより正確な配列情報を提供する新しい拡張可能ポリマー構築物を生成するための方法および組成物を提供する。【解決手段】核酸鋳型のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーの合成およびプロセシングの効率を改善して、ナノポア配列決定のための全長産物が濃縮された集団を生成するための新しい方法および装置、ならびに配列情報の精度を高める戦略を提供する。【選択図】図１Ｃ

Description

配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、８７０２２５＿４２４ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは５ＫＢで、２０２０年２月２０日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを用いて電子的に提出されている。
本発明は、一般に、単一分子配列決定のための新しい方法、組成物、およびデバイスに関し、より具体的には、拡張可能ポリマー（例えば、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ）の固体合成およびプロセシングのための改善された方法およびデバイスに関し、さらに、ナノポアセンサを通過したときにより正確な配列情報を提供する新しい拡張可能ポリマー構築物を生成するための方法および組成物に関する。
生体分子の測定は、現代医学の基礎であり、医学研究、より具体的には診断および治療、ならびに薬物開発において広く使用されている。核酸は、生物が機能し、再生するために必要な情報をコードし、本質的に生命の設計図である。そのような設計図を決定することは、純粋な研究および応用科学において有用である。医学では、配列決定は、癌、心疾患、自己免疫障害、多発性硬化症、および肥満を含む様々な病状の診断および治療法の開発に使用することができる。業界では、配列決定を使用して、改良された酵素プロセスまたは合成生物を設計することができる。生物学において、このツールは、例えば、生態系の健康を研究するために使用することができ、したがって、広範囲の有用性を有する。同様に、タンパク質および他の生体分子の測定は、疾患および病原性伝播のマーカーおよび理解を提供している。
個体の固有のＤＮＡ配列は、特定の疾患に対する感受性に関する貴重な情報を提供する。それはまた、早期検出のためのスクリーニングおよび／または予防処置を受ける機会を患者に提供する。さらに、患者の個々の設計図を考慮すると、臨床医は、薬物有効性を最大化するため、および／または薬物有害反応のリスクを最小化するために、個別化治療を投与することができるだろう。同様に、病原性生物の設計図を決定することは、感染症の新しい治療およびよりロバストな病原体監視につながり得る。低コストの全ゲノムＤＮＡ配列決定は、現代医学の基礎を提供するだろう。この目的を達成するために、配列決定技術は、スループット、精度、およびリード長に関して前進し続けなければならない。
過去１０年間にわたって、多数の次世代ＤＮＡ配列決定技術が、市販されるようになり、全ゲノムの配列決定のコストを劇的に削減した。これらには、合成による配列決定（「ＳＢＳ」）プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ，Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および類似体連結ベースのプラットフォーム（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が含まれる。多種多様な試料プロセシングおよび検出方法を利用する多くの他の技術が開発されている。例えば、ＧｎｕＢｉｏ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ケンブリッジ）は、ピコリットル反応容器を使用して数百万の目立たないプローブ配列決定反応を制御するが、Ｈａｌｃｙｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（カリフォルニア州レッドウッドシティ）は、透過型電子顕微鏡を使用した直接ＤＮＡ測定のための技術を開発しようと試みていた。
ナノポアベースの核酸配列決定は、広く研究されてきた説得力のあるアプローチである。Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３７７０－１３７７３，１９９６）は、脂質二重層に埋め込まれたアルファ溶血素ナノポアを介して電気的に転座した一本鎖ポリヌクレオチドを特徴付けた。ポリヌクレオチド転座の間、ナノポア開口の部分的閉塞は、イオン電流の減少として測定できることが実証された。しかしながら、ナノポアにおけるポリヌクレオチド配列決定は、有意なバックグラウンドノイズに浸された小さなシグナル差を有する狭い間隔の塩基（０．３４ｎｍ）を分解しなければならないことによって負担がかかる。ナノポアにおける一塩基分解能の測定課題は、典型的にマイクロ秒あたり１塩基のオーダーである、ポリヌクレオチドについて観察される急速な転座速度のために、より要求が厳しくなる。いくつか例を挙げると、電圧、塩組成、ｐＨ、温度、および粘度などの運転パラメータを調整することによって、転座速度を低下させることができる。しかしながら、そのような調整は、一塩基分解能を可能にするレベルまで転座速度を低下させることができなかった。
Ｓｔｒａｔｏｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓは、生化学的プロセスを使用してＤＮＡの配列を「Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ」と呼ばれる測定可能なポリマー上に転写する、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ（「ＳＢＸ」）と呼ばれる方法を開発した（Ｋｏｋｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第７，９３９，２５９号、「Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ」）。転写された配列は、約１０ｎｍ離れた高シグナル対ノイズレポーターにおいてＸｐａｎｄｏｍｅｒ骨格に沿ってコード化され、高シグナル対ノイズ、高分化応答のために設計される。これらの違いは、ネイティブＤＮＡと比較して、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの配列リード効率および精度の著しい性能向上を提供する。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、いくつかの次世代ＤＮＡ配列決定検出技術を可能にすることができ、ナノポア配列決定によく適している。
Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、合成後にＸｐａｎｄｏｍｅｒ骨格を拡張することを可能にする長い置換基を特徴とする、ＸＮＴＰと呼ばれる非天然ヌクレオチド類似体から生成される（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＫｏｋｏｒｉｓらによるＰＣＴ出願国際公開第２０１６／０８１８７１号パンフレットを参照されたい）。それらの非定型構造のために、ＸＮＴＰのＸｐａｎｄｏｍｅｒへの重合およびＸｐａｎｄｏｍｅｒのナノポア配列決定のための拡張形態へのプロセシングは、特に溶液中では非効率的なプロセスである。
したがって、核酸鋳型のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーの合成およびプロセシングの効率を改善して、ナノポア配列決定のための全長産物が濃縮された集団を生成するための新しい方法および装置、ならびに配列情報の精度を高める戦略は、当技術分野において価値があると理解するだろう。本発明は、これらのニーズを満たし、さらに関連する利点を提供する。
背景技術のセクションで説明した主題の全てが必ずしも先行技術ではなく、単に背景技術のセクションでの説明の結果として先行技術であると仮定すべきではない。これらの道筋に沿って、背景技術のセクションで説明されているか、またはそのような主題に関連する従来技術の問題の認識は、従来技術であると明示的に述べられていない限り、従来技術として扱われるべきではない。代わりに、背景技術のセクションにおける任意の主題の議論は、それ自体もまた発明的であり得る特定の問題に対する発明者のアプローチの一部として扱われるべきである。
簡単に記載すると、本開示は、単一分子ナノポア配列決定のための新しい方法、組成物
、およびデバイスを提供する。特定の実施形態では、本開示は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの固体合成およびプロセシングのための改良された方法、組成物、およびデバイス、ならびにより正確な配列情報を提供するＸｐａｎｏｄｍｅｒを合成するための方法および組成物を提供する。
一態様では、本開示は、固体基質上に核酸鋳型のコピーを合成する方法であって、ａ）リンカーを固体支持体上に固定化する工程であって、リンカーは、固体支持体に近位の第１の末端と、固体支持体に遠位の第２の末端とを含み、第１の末端はマレイミド部分に結合されており、第２の末端はアルキン部分に結合されており、マレイミド部分は固体支持体に架橋されている、固定化する工程と、ｂ）リンカーにオリゴヌクレオチドプライマーを結合させる工程であって、オリゴヌクレオチドプライマーが、核酸鋳型の３’末端の一部に相補的な核酸配列を含み、オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端が、アジド部分にカップリングされ、アジド部分が、アルキン部分と反応してトリアゾール部分を形成する、結合させる工程と、ｃ）核酸鋳型、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド基質、またはその類似体、適切な緩衝液、および任意に１つ以上の添加剤を含む反応混合物を提供する工程であって、核酸鋳型が、オリゴヌクレオチドプライマーに特異的にハイブリダイズする、提供する工程と、ｄ）プライマー伸長反応を行って核酸鋳型のコピーを生成することと、を含む方法を提供する。
特定の実施形態では、マレイミド部分は、光開始プロトン引き抜き反応によって固体基質に架橋される。他の実施形態では、固体基質は、ポリオレフィンを含み、別の実施形態では、ポリオレフィンは、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）またはポリプロピレンであってもよい。いくつかの実施形態では、核酸鋳型はＤＮＡ鋳型であり、ＤＮＡ鋳型のコピーは、拡張可能ポリマーであり、拡張可能ポリマーは、非天然ヌクレオチド類似体の鎖を含み、非天然ヌクレオチド類似体のそれぞれは、ホスホルアミデートエステル結合（例えば、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ）によって隣接する非天然ヌクレオチド類似体に作動可能に連結されている。他の実施形態では、リンカーは、第１の末端と第２の末端との間に介在するスペーサーアームをさらに含み、スペーサーアームは、エチレングリコールの１つ以上のモノマーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、切断可能な部分をさらに含む。他の実施形態において、固体支持体は、ビーズ、チューブ、キャピラリー、およびマイクロ流体チップからなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、核酸標的配列のコピーの３’末端を選択的に改変する方法であって、ａ）核酸標的配列の第１の配列に相補的な配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、核酸標的配列の第２の配列に相補的な配列を有する第２のオリゴヌクレオチドとを提供する工程であって、核酸標的配列の第１の配列が、核酸標的配列の第２の配列に対して３’であり、第１のオリゴヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼのための伸長プライマーを提供し、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端が、ジデオキシヌクレオシド５’三リン酸に作動可能に連結され、ジデオキシヌクレオシド５’三リン酸が、核酸ポリメラーゼの基質を提供する、提供する工程と、ｂ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、核酸標的配列、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド基質、またはその類似体、適切な緩衝液、および任意に１つ以上の添加剤を含む反応混合物を提供し、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、特異的に核酸標的配列にハイブリダイズする工程と、ｃ）プライマー伸長反応を行って、標的配列のコピーを生成する工程であって、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端が、核酸ポリメラーゼによって核酸標的配列のコピーの３’末端に作動可能に連結されている、生成する工程と、を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、ジデオキシヌクレオシド５’三リン酸は、可動性リンカーによって第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に作動可能に連結されている。他の実施
形態では、可動性リンカーは、１つ以上のヘキシル（Ｃ６）モノマーを含む。他の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の２’メトキシリボ核酸類似体を含む。さらに他の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端が、第１の固体支持体に固定化され、いくつかの実施形態では、方法は、第１の固体支持体を洗浄して、第２のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結された核酸標的のコピーを精製する工程を、さらに含む。別の実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドは、第１の固体支持体に固定化され、いくつかの実施形態において、方法は、第１の固体支持体から核酸標的配列のコピーを放出させる工程および核酸標的配列のコピーを第３のオリゴヌクレオチドと接触させる工程をさらに含み、第３のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドの配列と相補的な配列を有し、第３のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、第３のオリゴヌクレオチドの５’末端は、第２の固体支持体上に固定化され、さらに他の実施形態において、第２の固体支持体を洗浄して、３’末端において第２のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結された核酸標的配列のコピーを精製する工程を、さらに含む。他の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドは、核酸標的配列に対する第２のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させる１つ以上のヌクレオチド類似体を含む。さらに他の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドは、核酸標的配列の５’末端に作動可能に連結された異種核酸配列に相補的である。いくつかの実施形態では、核酸標的配列は一本鎖ＤＮＡであり、標的配列のコピーは、拡張可能ポリマーであり、拡張可能ポリマーは、非天然ヌクレオチド類似体の鎖を含み、非天然ヌクレオチド類似体のそれぞれは、ホスホルアミデートエステル結合によって隣接する非天然ヌクレオチド類似体に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１の固体支持体および第２の固体支持体は、ビーズ、チューブ、キャピラリー、およびマイクロ流体チップからなる群から選択される。
別の態様において、本開示は、一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリを生成する方法であって、鋳型構築物のそれぞれが、ＤＮＡ標的配列の同じ鎖の２つのコピーを含み、方法が、ａ）ＤＮＡ Ｙアダプターの集団を提供する工程であって、Ｙアダプターのそれぞれが、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドの３’領域および第２のオリゴヌクレオチドの５’領域が、配列相補性によって二本鎖領域を形成し、第１のオリゴヌクレオチドの５’領域および第２のオリゴヌクレオチドの３’領域が、一本鎖であり、オリゴヌクレオチドプライマーの結合部位を含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの一本鎖領域の末端が、任意に固体基質上に固定化されている、提供する工程と、ｂ）二本鎖ＤＮＡ分子の集団を提供する工程であって、二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれが、第１の鎖および第２の鎖を含み、二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれの第１の末端が、Ｙアダプターの二本鎖末端と適合する、提供する工程と、ｃ）キャッププライマーアダプターの集団を提供する工程であって、キャッププライマーアダプターのそれぞれが、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチドを含み、第２のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドと第３のオリゴヌクレオチドとの間に介在し、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチドが、化学分岐剤によって第１のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドの５’末端および第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結され、第１のオリゴヌクレオチドの配列の一部が、第３のオリゴヌクレオチドの配列の一部と同一であり、第２のオリゴヌクレオチドの配列の一部が、第１のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドの配列の一部の逆相補体であり、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端および第３のオリゴヌクレオチドの３’末端が、二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれの第２の末端と適合する二本鎖領域を形成する、提供する工程と、ｄ）二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれの第２の末端を、キャッププライマーアダプターのうちの１つの第２のオリゴヌクレオチドの５’末端および第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に連結する工程と、ｅ）二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれの第１の末端を、ＤＮＡ Ｙアダプターのうちの１つの二本鎖末端に連結する工程と、ｆ）
連結されたキャッププライマーアダプターのそれぞれの第１のオリゴヌクレオチドの３’末端からＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長する工程であって、連結された二本鎖ＤＮＡ分子の第１の鎖が、ＤＮＡポリメラーゼの鋳型を提供し、ＤＮＡポリメラーゼが、二本鎖ＤＮＡ分子の第１の鎖の配列とＹアダプターの第１のオリゴヌクレオチドの配列との逆相補体を含む第３の鎖を生成する、伸長する工程と、ｇ）連結されたＹアダプターの第１のオリゴヌクレオチドのそれぞれの５’末端からエキソヌクレアーゼで消化する工程であって、消化することが、第１のオリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡ分子の第１の鎖、およびキャッププライマーアダプターの第２のオリゴヌクレオチドを除去して、一本鎖鋳型構築物を生成し、一本鎖鋳型構築物のそれぞれが、二本鎖ＤＮＡ分子の第２の鎖の配列をそれぞれ含む２つの鋳型分子を含み、２つの鋳型分子が、キャッププライマーアダプターの第１のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドによって作動可能に連結されている、消化する工程と、を含む方法を提供する。
別の態様において、本開示は、一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリであって、鋳型構築物のそれぞれが、ＤＮＡ標的配列の同じ鎖の第１のコピーおよび第２のコピーを含み、標的配列の第１のコピーおよび第２のコピーが、作動可能に連結され、一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリが、上記の方法によって生成される、ライブラリを提供する。
別の態様において、本開示は、鏡像化されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ分子のライブラリを生成する方法であって、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ分子のそれぞれが、ＤＮＡ標的配列の同じ鎖の２つのコピーを含み、方法が、ａ）上の段落に記載した一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリを提供する工程と、ｂ）Ｙアダプターの第１の鎖の一本鎖部分に相補的な第１の伸長オリゴヌクレオチドの集団と、Ｙアダプターの第２の鎖の一本鎖部分に相補的な第２の伸長オリゴヌクレオチドの集団と、を提供する工程であって、第１または第２の伸長オリゴヌクレオチドが、任意に固体基質上に固定化される、提供する工程と、ｃ）一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリを第１の伸長オリゴヌクレオチドの集団および第２の伸長オリゴヌクレオチドの集団に特異的にハイブリダイズさせる工程と、ｄ）キャップ分岐構築物の集団を提供する工程であって、キャップ分岐構築物が、第２のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結された第１のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが、キャッププライマーアダプター構築物の第１のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドの配列の一部に相補的な配列を含み、キャップ分岐構築物の第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが、遊離５’ヌクレオシド三リン酸部分を提供する、提供する工程と、ｅ）キャップ分岐構築物の集団を、一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物の集団に特異的にハイブリダイズさせる工程と、ｆ）プライマー伸長反応を行って、ＤＮＡ標的配列の第１のコピーおよび第２のコピーのＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーを生成する工程であって、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒコピーが、キャップ分岐構築物によって作動可能に連結されている、生成する工程と、を含む、鏡像化されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ分子のライブラリを生成する方法、を提供する。
別の態様では、本開示は、固体支持体上にタグ付けされた二本鎖ＤＮＡアンプリコンのライブラリを生成する方法であって、ａ）二本鎖ＤＮＡ分子の集団を提供する工程であって、二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれが、第２の鎖に特異的にハイブリダイズした第１の鎖を含む、工程と、ｂ）順方向ＰＣＲプライマーおよび逆方向ＰＣＲプライマーを提供する工程であって、順方向ＰＣＲプライマーが、二本鎖ＤＮＡ分子の第２の鎖（ｓｔａｎｄ）の３’末端の一部に相補的な３’配列に作動可能に連結された第１の５’異種タグ配列を含み、逆方向ＰＣＲプライマーが、二本鎖ＤＮＡ分子の第１の鎖の３’末端の一部に相補的な３’配列に作動可能に連結された第２の５’異種タグ配列を含む、提供する工程と、ｃ）二本鎖ＤＮＡ分子の集団が増幅されて第１のＤＮＡアンプリコン産物の集団を生成し、第１のＤＮＡアンプリコン産物が、第１の末端に第１の異種配列タグを含み、第２の末端に第２の異種配列タグを含む、第１のＰＣＲ反応を行う工程と、ｄ）固体支持体上に固定
化された捕捉オリゴヌクレオチド構造を提供する工程であって、捕捉オリゴヌクレオチド構造が、第１の末端および第２の末端を含み、第１の末端が固体支持体に共有結合しており、第２の末端が、第１のＤＮＡアンプリコン産物の集団の第２の異種配列タグの一部に相補的な配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドを含み、捕捉オリゴヌクレオチド構造が、第１の末端と捕捉オリゴヌクレオチドとの間に介在した切断可能エレメントをさらに含む、提供する工程と、ｅ）第１のＤＮＡアンプリコン産物の集団と、第１の異種配列タグの一方の鎖の配列に相補的な配列を含む順方向プライマーと、第２の異種配列タグの一方の鎖に相補的な配列を含む逆方向プライマーと、を含む第２のＰＣＲ反応を行う工程であって、第１のＤＮＡアンプリコン産物の集団の第１の鎖が、捕捉オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、第２のＰＣＲ反応が、固定化ＤＮＡアンプリコン産物の集団を生成し、固定化ＤＮＡアンプリコン産物の第２の鎖が、固体支持体に作動可能に連結されている、第２のＰＣＲ反応を行う工程と、を含む方法を提供する。
別の態様において、本開示は、一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリを生成する方法であって、鋳型構築物のそれぞれが、ＤＮＡ標的配列の同じ鎖の２つのコピーを含み、方法が、ａ）上の段落に記載の固体支持体上に固定化されたＤＮＡアンプリコン産物のライブラリを提供する工程と、ｂ）キャッププライマーアダプターの集団を提供する工程であって、キャッププライマーアダプターのそれぞれが、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチドを含み、第２のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドと第３のオリゴヌクレオチドとの間に介在し、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチドが、化学分岐剤によって第１のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドの５’末端および第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結され、第１のオリゴヌクレオチドの配列の一部が、第３のオリゴヌクレオチドの配列の一部と同一であり、第２のオリゴヌクレオチドの配列の一部が、第１のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドの配列の一部の逆相補体であり、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端および第３のオリゴヌクレオチドの３’末端が、タグ付けされた固定化ＤＮＡアンプリコン産物のそれぞれの遊離末端と適合する二本鎖領域を形成する、提供する工程と、ｃ）固定化ＤＮＡアンプリコン産物のそれぞれの遊離末端を、キャッププライマーアダプターの第２のオリゴヌクレオチドの５’末端および第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に連結する工程と、ｄ）キャッププライマーアダプターの第１のオリゴヌクレオチドのそれぞれの３’末端からＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長する工程であって、固定化ＤＮＡアンプリコン産物の第２の鎖が、ＤＮＡポリメラーゼの鋳型を提供し、ＤＮＡポリメラーゼが、第３の鎖を生成し、第３の鎖が、第２の鎖のコピーである、伸長する工程と、ｅ）捕捉オリゴヌクレオチド構造のそれぞれの切断可能エレメントを切断する工程であって、切断することが、固体支持体からＤＮＡアンプリコン産物を放出し、ＤＮＡアンプリコン産物のそれぞれの第２の鎖上に遊離５’末端を生成する、切断する工程と、ｆ）ＤＮＡアンプリコン産物のそれぞれの切断された第２の鎖の遊離５’末端からエキソヌクレアーゼで消化する工程であって、消化することが、ＤＮＡアンプリコン産物の第２の鎖およびキャッププライマーアダプターの第２のオリゴヌクレオチドを除去して、一本鎖鋳型構築物のライブラリを生成し、一本鎖鋳型構築物のそれぞれが、キャッププライマーアダプターの第１のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドによって作動可能に連結されたＤＮＡアンプリコン産物の第１の鎖の２つのコピーを含む、消化する工程と、を含む一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリを生成する方法を提供する。
別の態様では、本開示は、一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリであって、鋳型構築物のそれぞれが、ＤＮＡ標的配列の同じ鎖の第１のコピーおよび第２のコピーを含み、ＤＮＡ標的配列の第１のコピーおよび第２のコピーが作動可能に連結されて、一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリが、前の段落に記載の方法によって生成される、ライブラリを提供する。
別の態様において、本開示は、鏡像化されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ分子のライブラリを生成する方法であって、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ分子のそれぞれが、ＤＮＡ標的配列の同じ鎖の２つのコピーを含み、方法が、ａ）上の段落に記載の一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリを提供する工程と、（ｂ）ＤＮＡアンプリコン産物の第２のタグに相補的な伸長オリゴヌクレオチドの集団を提供する工程であって、伸長オリゴヌクレオチドが、固体基質上に固定化されている、提供する工程と、ｃ）一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリを伸長オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズさせる工程と、ｄ）キャップ分岐構築物の集団を提供する工程であって、キャップ分岐構築物が、第２のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結された第１のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが、キャッププライマーアダプター構築物の第１のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドの配列の一部に相補的な配列を含み、キャップ分岐構築物の第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが、遊離５’ヌクレオシド三リン酸部分を提供する、提供する工程と、ｅ）キャップ分岐構築物の集団を、ＤＮＡ鋳型構築物の集団に特異的にハイブリダイズさせる工程と、ｆ）プライマー伸長反応を行って、ＤＮＡ標的配列の第１のコピーおよび第２のコピーのＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーを生成する工程であって、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒコピーが、キャップ分岐構築物によって作動可能に連結されている、生成する工程と、を含む鏡像化されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ分子のライブラリを生成する方法、を提供する。
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチド構造および伸長オリゴヌクレオチドが、同じ固体支持体上に固定化され、伸長オリゴヌクレオチドが、切断可能なヘアピン構造を含み、切断可能なヘアピン構造が、切断工程中に切断されて、ＤＮＡアンプリコン産物の結合部位を提供する。他の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチド構造が、マイクロ流体カードの第１のチャンバの第１の基質上に固定化され、伸長オリゴヌクレオチドが、マイクロ流体カードの第２のチャンバの第２の基質上に固定化され、第１のチャンバが、一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物の集団を生成するように構成され、第２のチャンバが、一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーの集団を生成するように構成される。さらに他の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチド構造が、ビーズ支持体上に固定化され、伸長オリゴヌクレオチドがＣＯＣチップ支持体上に固定化され、ビーズ支持体が、一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物の集団を生成するように構成され、ＣＯＣチップ支持体が、ＤＮＡ鋳型構築物のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーの集団を生成するように構成される。他の実施形態において捕捉オリゴヌクレオチド構造および伸長オリゴヌクレオチドが、ビーズ支持体上に固定化され、ビーズ支持体が、一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物の集団およびＤＮＡ鋳型構築物のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーの集団を生成するように構成される。別の実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドが、分岐オリゴヌクレオチド構造によって提供され、分岐オリゴヌクレオチド構造が、化学分岐剤によって第２の伸長オリゴヌクレオチドに作動可能に連結された第１の伸長オリゴヌクレオチドを含み、第１の伸長オリゴヌクレオチドが、リーダー配列と、コンセントレータ配列と、化学分岐剤とリーダー配列およびコンセントレータ配列との間に介在する第１の切断可能部分と、を含み、第２の伸長オリゴヌクレオチドが、第２の切断可能部分を含む。
本発明の上記および追加の特徴ならびにそれらを得る方法は明らかになり、本発明は以下のより詳細な説明を参照することによって最もよく理解されるであろう。本明細書に開示される全ての参考文献は、それぞれが個別に組み込まれているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
この簡単な概要は、以下の詳細な説明でさらに詳細に説明される簡略化した形式における特定の概念を紹介するために提供されている。特に明記されている場合を除き、この簡単な概要は、特許請求される主題の重要な、または本質的な特徴を特定することを意図す
るものではなく、特許請求される主題の範囲を限定することを意図するものでもない。
１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。１つの例示的な実施形態に関連して図示または説明された特徴は、他の実施形態の特徴と組み合わせることができる。したがって、本明細書に記載の様々な実施形態のいずれかを組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。実施形態の態様は、必要に応じて、本明細書で特定される様々な特許、出願、および刊行物の概念を使用して、さらに別の実施形態を提供するように修正することができる。他の特徴、目的、および利点は、説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本開示の例示的な特徴、その性質、および様々な利点は、添付の図面および様々な実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。非限定的かつ非網羅的な実施形態は、添付の図面を参照して説明されており、特に明記しない限り、様々な図を通して同様のラベルまたは参照番号は同様の部分を指す。図面のエレメントのサイズおよび相対位置は、必ずしも縮尺通りに描かれていない。例えば、様々なエレメントの形状は、描画の視認性を改善するために選択され、拡大され、位置決めされる。描かれているエレメントの特定の形状は、図面における認識を容易にするために選択されている。
一般化されたＸＮＴＰの主要な特徴および拡張による配列決定（ＳＢＸ）におけるそれらの使用を示す要約された概略図である。 一般化されたＸＮＴＰの主要な特徴および拡張による配列決定（ＳＢＸ）におけるそれらの使用を示す要約された概略図である。 一般化されたＸＮＴＰの主要な特徴および拡張による配列決定（ＳＢＸ）におけるそれらの使用を示す要約された概略図である。 一般化されたＸＮＴＰの主要な特徴および拡張による配列決定（ＳＢＸ）におけるそれらの使用を示す要約された概略図である。
ＸＮＴＰの一実施形態のさらなる詳細を示す概略図である。
生物学的ナノポアを通過するＸｐａｎｄｏｍｅｒの一実施形態を示す概略図である。
固相Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための表面化学の例示的な実施形態を示す概略図である。 固相Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための表面化学の例示的な実施形態を示す概略図である。 固相Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための表面化学の例示的な実施形態を示す概略図である。 固相Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための表面化学の例示的な実施形態を示す概略図である。 固相Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための表面化学の例示的な実施形態を示す概略図である。
耐酸性ビーズの官能化および耐酸性ビーズへの伸長オリゴヌクレオチド／ＤＮＡ鋳型複合体の固定化の一実施形態の一般化された例示を提供する概略図である。
末端キャッピング方法の一般化された例示を提供する概略図である。
プライマー伸長産物を示すゲルである。
末端キャップの例示的な実施形態の一般的な特徴の概略図である。 末端キャップの例示的な実施形態の一般的な特徴の概略図である。 末端キャップの例示的な実施形態の一般的な特徴の概略図である。 末端キャップの例示的な実施形態の一般的な特徴の概略図である。
固相Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成の一実施形態の工程を要約する概略図である。 固相Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成の一実施形態の工程を要約する概略図である。 固相Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成の一実施形態の工程を要約する概略図である。
固相Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成の別の実施形態の工程を要約する概略図である。 固相Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成の別の実施形態の工程を要約する概略図である。
末端キャッピングプロトコル中のポリメラーゼの「短絡」を防ぐための代替戦略を示す概略図である。 末端キャッピングプロトコル中のポリメラーゼの「短絡」を防ぐための代替戦略を示す概略図である。
鏡像化ライブラリ構築物およびＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための使用の一実施形態の工程を要約する概略図である。 鏡像化ライブラリ構築物およびＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための使用の一実施形態の工程を要約する概略図である。 鏡像化ライブラリ構築物およびＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための使用の一実施形態の工程を要約する概略図である。
キャップアダプター構築物の一実施形態の一般的な特徴の概略図である。
Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの鏡像化ライブラリを生成するためのワークフローの一実施形態を要約する。
ＤＮＡアンプリコンの固定化ライブラリを生成する一実施形態の工程を要約した概略図である。 ＤＮＡアンプリコンの固定化ライブラリを生成する一実施形態の工程を要約した概略図である。 ＤＮＡアンプリコンの固定化ライブラリを生成する一実施形態の工程を要約した概略図である。 ＤＮＡアンプリコンの固定化ライブラリを生成する一実施形態の工程を要約した概略図である。
は、鏡像化ライブラリＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物のための鏡像化鋳型構築物のライブラリの固体合成の一実施形態の工程を要約する概略図である。 は、鏡像化ライブラリＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物のための鏡像化鋳型構築物のライブラリの固体合成の一実施形態の工程を要約する概略図である。
は、鏡像化ライブラリＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための構築物のライブラリの固体合成の別の実施形態の工程を要約する概略図である。 は、鏡像化ライブラリＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための構築物のライブラリの固体合成の別の実施形態の工程を要約する概略図である。
は、異なる固体支持体を使用してＸｐａｎｄｏｍｅｒの鏡像化ライブラリを生成するためのワークフローの一実施形態を要約する。
分岐伸長オリゴヌクレオチド構造の一般化された特徴の概略図である。
分岐伸長オリゴヌクレオチドを用いたＸｐａｎｄｏｍｅｒの鏡像化ライブラリの固体合成の一実施形態の工程を要約する概略図である。 分岐伸長オリゴヌクレオチドを用いたＸｐａｎｄｏｍｅｒの鏡像化ライブラリの固体合成の一実施形態の工程を要約する概略図である。
プライマー伸長産物を示すゲルである。
プライマー伸長産物を示すゲルである。
ナノポアからの配列決定リードのヒストグラムアラインメントである。
末端キャッピングを有するプライマー伸長産物を示すゲルである。
末端キャッピングを有するプライマー伸長産物を示すゲルである。
ライブラリ断片に連結された三つ又アダプターの一実施形態を示す概略図である。
ライブラリ断片への三つ又アダプターの連結を示すゲルである。
Ｍ３鏡像化ライブラリ構築物を生成するためのＭ１鏡像化ライブラリ構築物の伸長および消化反応の一実施形態を示す概略図である。
伸長および消化反応の産物を示すゲルである。
Ｍ１鏡像化ライブラリ構築物の固体合成の一実施形態を示す概略図である。
Ｍ１鏡像化ライブラリ構築物の固体合成の産物を示すゲルである。
鏡像化ライブラリＸｐａｎｄｏｍｅｒを合成するための鋳型の一実施形態を示す概略図である。
鏡像化ライブラリ構築物の様々な段階の産物を示すゲルである。
鏡像化ライブラリＸｐａｎｄｏｍｅｒの配列の一部を示すナノポアトレースである。
耐酸性磁気ビーズ上で合成されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を示すゲルである。
耐酸性磁気ビーズ上でのＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物の合成および処理を示すゲルである。
本発明は、本発明の好ましい実施形態および本明細書に含まれる実施例の以下の詳細な説明を参照することによってより容易に理解され得る。別段の説明がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡなどの従来の技術を使用するであろう。上記技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ Ｅｄ．，１９８４），ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，ａｎｄ Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ，ｅｄｓ．，１９８７）を参照されたい。上記および下記の本明細書で言及される全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
１．定義
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドとも呼ばれる「核酸」は、１つのヌクレオチドのペントースの３’位が、ホスホジエステル基によって次の５’位に連結されている、共有結合した一連のヌクレオチドである。核酸分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、または両方の組み合わせであり得る。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ヌクレオチド残基が、ホスホジエステル結合によって特定の配列で連結された生物学的に存在するポリヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドの直鎖骨格を有する任意のポリマー化合物を包含する。オリゴマーとも呼ばれるオリゴヌクレオチドは、一般に、より短い鎖のポリヌクレオチドである。核酸は、配列決定を目的とする場合、一般に「標的核酸」、「標的配列」、「鋳型」または「ライブラリ断片」と呼ばれる。
「鋳型」という用語は、新しい鎖の遺伝子配列を設定するＤＮＡの鎖を指す。
本明細書中で使用されるとき、用語「鋳型依存方式」とは、プライマー分子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）の鋳型依存性伸長を伴うプロセスのことを指すことが意図される。用語「鋳型依存方式」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリヌクレオチド合成のことを指し、ポリヌクレオチドの新しく合成された鎖の配列は、周知の相補的塩基対合の規則（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．（１９８７）を参照されたい。）によって決定される。
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、別の核酸の配列に相補的であり、ＤＮＡ合成の出発点として働く核酸の短鎖を指す。好ましくは、プライマーは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくと
も１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、またはそれ以上の塩基長を有する。
本明細書で使用される「鎖」という用語は、ホスホジエステル結合によって互いに共有結合したヌクレオチドで構成される核酸を指す。核酸の一方の鎖は、水素結合を介して、すなわち塩基対合を介してのみ結合するヌクレオチドを含まないが、その鎖は水素結合を介して相補的鎖と塩基対合することができる。第１の鎖および第２の鎖が相補性を介して塩基対合する場合、第１の鎖は「プラス」鎖、「センス」鎖または「５’から３’」鎖と呼ばれることがあり、第２の鎖は「マイナス」鎖、「アンチセンス」鎖または「３’から５’」鎖と呼ばれることがある（またはその逆）。
本明細書で使用される「３’末端」という用語は、その末端でデオキシリボースの糖環に第３の炭素のヒドロキシル基を有するヌクレオチド鎖の末端を指す。
本明細書で使用される「５’末端」という用語は、その末端でデオキシリボースの糖環に第５の炭素を有するヌクレオチド鎖の末端を指す。
「相補的」という用語は、ヌクレオチドまたは核酸間、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の２本の鎖間、またはオリゴヌクレオチドプライマーと一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間、またはオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ分子中のその相補的配列との間などの二重鎖の形成を可能にする塩基対合を指す。相補的なヌクレオチドは、一般に、ＡおよびＴ（またはＡおよびＵ）、またはＣおよびＧである。２つの一本鎖ＤＮＡ分子は、一方の鎖のヌクレオチドが他方の鎖の約６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、通常、少なくとも約９０％～約９５％、さらには約９８％～約１００％と対合し、最適に整列され、比較され、適切なヌクレオチド挿入または欠失を有する場合、実質的に相補的であると言われる。２つのヌクレオチド領域間の同一性の程度は、コンピュータに実装されたアルゴリズムおよび当業者に広く知られている方法を使用して決定される。２つのヌクレオチド配列間の同一性は、好ましくはＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．，１９９０，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）を使用して決定される。
「ハイブリダイゼーション」は、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合的に結合して安定な二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを指す。「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には、約１Ｍ以下、より通常には約５００ｍＭ未満の塩濃度を含み、約２００ｍＭ未満であってもよい。「ハイブリダイゼーション緩衝液」は、５％ ＳＳＰＥなどの緩衝塩溶液、または当技術分野で公知の他のそのような緩衝液である。ハイブリダイゼーション温度は、５℃程度に低くてもよいが、典型的には２２℃を超え、より典型的には約３０℃を超え、典型的には３７℃を超える。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下、すなわち、プライマーがその標的部分配列にハイブリダイズするだろうが、他の非相補的配列にはハイブリダイズしないだろう条件下で行われることが多い。ストリンジェントな条件は、配列に依存しており、状況によって異なる。例えば、より長い断片は、短い断片よりも特異的ハイブリダイゼーションのためにより高いハイブリダイゼーション温度を必要とし得る。塩基組成および相補的鎖の長さ、有機溶媒の存在、および塩基不整合の程度を含む他の要因が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし得るので、パラメータの組み合わせは、任意の１つのパラメータ単独の絶対尺度よりも重要である。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列のＴｍよりも低い約５℃なるように選択される。例示的なストリンジェントな条件としては、ｐＨ約７．０～約８．３および少なくとも温度２５℃における少なくとも０．０１Ｍ～１Ｍ以下のナトリウムイオン濃度（または他の塩）の塩濃
度が挙げられる。
核酸は、それらが互いに機能的関係に置かれる場合、「作動可能に連結されている」。一般に、「作動可能に連結されている」とは、連結されている核酸配列が互いに近接していることを意味する。連結は、例えば、核酸リガーゼまたはポリメラーゼによって酵素的に達成され得る。
本明細書で使用される「二本鎖ＤＮＡライブラリ」という表現は、その末端の１つによって物理的に連結され、同じ分子の一部を形成し得るＤＮＡ分子（すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖）の両鎖を含むライブラリを指し得る。二本鎖ＤＮＡ分子のライブラリは、限定されないが、ゲノムＤＮＡ（核ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ等）、プラスミドＤＮＡ、または一本鎖核酸試料から得られた二本鎖ＤＮＡ分子（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ）であり得る。
本明細書中で使用されるとき、「核酸ポリメラーゼ」は、一般に、３’－ＯＨ ５’－三リン酸ヌクレオチド、オリゴマー、およびそれらの類似体を連結するための酵素である。ポリメラーゼには、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、クレノウ断片、サーモフィルス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｄｅｅｐ
ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、９０ Ｎ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、９０ Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｆｌ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｉ２９ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、真核ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＫＯＤ ＨｉＦｉ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＫＯＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータレプリカーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素が挙げられる。本発明によるポリメラーゼは、変異体、突然変異体、またはキメラポリメラーゼであり得る。
本明細書で使用される場合、「ＤＰＯ４型ＤＮＡポリメラーゼ」は、古細菌、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、または関連するＹファミリーＤＮＡポリメラーゼによって天然に発現されるＤＮＡポリメラーゼであり、一般に損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）として知られるプロセスによる損傷ＤＮＡの複製で機能する。ＹファミリーＤＮＡポリメラーゼは、ＤＰＯ４ポリメラーゼと相同である。例としては、原核生物酵素、ＰｏｌＩＩ、ＰｏｌＩＶ、ＰｏｌＶ、古細菌酵素、Ｄｂｈ、および真核生物酵素、Ｒｅｖ３ｐ、Ｒｅｖ１ｐ、Ｐｏｌ η、ＲＥＶ３、ＲＥＶ１、Ｐｏｌ ΙおよびＰｏｌ κ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらのキメラが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ＤＰＯ４変異体」は、修飾された組換えＤＰＯ４型ＤＮＡポリメラーゼであり、天然に存在する野生型ＤＰＯ４型ＤＮＡポリメラーゼと比較して１つ以上の突然変異、例えば、基質または別のポリメラーゼ特性としてかさ高いヌクレオチド類似体を利用する能力を高める１つ以上の突然変異を含み、野生型ＤＰＯ４型ＤＮＡポリメラーゼに対する追加の変更または改変、例えば、追加のペプチドまたはタンパク質
配列の１つ以上の欠失、挿入、および／または融合を（例えば、表面上にポリメラーゼを固定化するために、またはそうでなければポリメラーゼ酵素をタグ付けするために）含み得る。本発明によるＤＰＯ４変異体ポリメラーゼの例は、公開されたＰＣＴ特許出願国際公開第２０１７／０８７２８１Ａ１号およびＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴＵＳ２０１８／０３０９７２およびＰＣＴＵＳ２０１８／６４７９４に記載されているＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｕｌｆａｔａｒｉｃｕｓ ＤＰＯ４の変異体であり、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「核酸ポリメラーゼ反応」は、鋳型依存的に核酸の新しい鎖を作製するか、または既存の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を伸長するためのインビトロ方法を指す。本発明による核酸ポリメラーゼ反応は、プライマー伸長反応を含み、これは、組み込まれたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的であるように、プライマーの３’末端にヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の組み込みをもたらす。核酸ポリメラーゼ反応のプライマー伸長産物は、単一分子配列決定のために、またはさらなる核酸分子を合成するための鋳型としてさらに使用することができる。
本明細書で使用される「複数」という用語は、「少なくとも２つ」を指す。
「ＸＮＴＰ」は、鋳型依存性酵素重合と適合する拡張可能な５’三リン酸修飾ヌクレオチド基質である。ＸＮＴＰは、２つの異なる機能的構成要素を有する。すなわち、核酸塩基５’－トリホスホルアミデートと、各ヌクレオシドトリホスホルアミデート内で、ホスホルアミデート結合のヌクレオチド内切断による制御された拡張を可能にする位置に結合しているつなぎ鎖、である。本明細書で使用される場合、ＸＮＴＰは、例示的な「非天然の高度に置換されたヌクレオチド類似体基質」である。例示的なＸＮＴＰおよびそれを作製する方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、出願人が公開したＰＣＴ出願番号国際公開第２０１６／０８１８７１号に記載されている。
「Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ中間体」は、ＸＮＴＰから集められた中間産物（本明細書では「娘鎖」とも呼ばれる）であり、標的核酸鋳型を使用したＸＮＴＰのポリメラーゼ媒介鋳型指向性集合体によって形成される。新しく合成されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ中間体は、拘束Ｘｐａｎｄｏｍｅｒである。ＸＮＴＰによって提供されるホスホルアミデート結合が切断されるプロセス工程の下では、拘束Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、もはや拘束されず、つなぎ鎖が伸ばされるにつれて伸長するＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物である。
「Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ」または「Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物」は、それ自体がＸＮＴＰ基質の鋳型指向性集合体によって合成される拘束Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの増殖によって生成される合成分子構築物である。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、それが生成された標的鋳型に対して伸長している。それは、サブユニットの連結から構成され、各サブユニットはモチーフであり、各モチーフは、配列情報、つなぎ鎖、および任意に、基質の一部、または全部を含むライブラリのメンバーであり、それらの全ては、形成性基質構築物に由来する。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、標的鋳型よりも長くなるように拡張するように設計され、それによって標的鋳型の配列情報の線密度をその長さに沿って低下させる。さらに、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、任意に、レポーターのサイズおよび存在量を増加させるためのプラットフォームを提供し、次いで、検出のためのシグナル対ノイズを改善する。より低い線情報密度およびより強い信号は、分解能を高め、鋳型鎖の配列を検出および複合するための感度要件を低減する。
「つなぎ鎖」または「つなぎ鎖部材」は、ほぼ直線寸法を有し、２つの対向する末端のそれぞれに末端部分を有するポリマーまたは分子構築物を指す。つなぎ鎖は、末端部分に
結合を有するヌクレオシドトリホスホルアミデートに結合してＸＮＴＰを形成する。結合は、つなぎ鎖を「拘束された配置」に拘束するのに役立つ。つなぎ鎖は、「拘束された配置」および「拡張された配置」を有する。拘束された配置は、ＸＮＴＰおよび娘鎖またはＸｐａｎｄｏｍｅｒ中間体に見られる。つなぎ鎖の拘束された配置は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物に見られるように、拡張された配置の前駆体である。拘束された配置から拡張された配置への移行は、選択的に切断可能なホスホルアミデート結合の切断をもたらす。つなぎ鎖は、その長さに沿って、基質の配列情報をコードすることができる１つ以上のレポーターまたはレポーター構築物を含む。つなぎ鎖は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの長さを拡張し、それによって配列情報の線密度を低下させる手段を提供する。
「つなぎ鎖エレメント」または「つなぎ鎖セグメント」は、２つの末端を有するほぼ線形の寸法を有するポリマーであり、末端は、つなぎ鎖エレメントを連結するための末端連結を形成する。つなぎ鎖エレメントは、つなぎ鎖のセグメントである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール、ポリグリコール、ポリピリジン、ポリイソシアネート、ポリイソシアネート、ポリ（トリアリールメチル）メタクリレート、ポリアルデヒド、ポリピロリノン、ポリ尿素、ポリグリコールホスホジエステル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルエステル、ポリスチレン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリブチレート、ポリブタジエン、ポリブチロラクトン、ポリピロリジノン、ポリビニルホスホネート、ポリアセトアミド、多糖類、ポリヒアルラン酸塩、ポリアミド、ポリイミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリテレフタレート、ポリシラン、ポリウレタン、ポリエーテル、ポリアミノ酸、ポリグリシン、ポリプロリン、Ｎ－置換ポリリジン、ポリペプチド、側鎖Ｎ－置換ペプチド、ポリ－Ｎ－置換グリシン、ペプトイド、側鎖カルボキシル置換ペプチド、ホモペプチド、オリゴヌクレオチド、リボ核酸オリゴヌクレオチド、デオキシ核酸オリゴヌクレオチド、ワトソン－クリック塩基対合を防ぐために修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、ポリシチジル酸、ポリアデニル酸、ポリウリジル酸、ポリチミジン、ポリリン酸塩、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ポリエチレングリコール－ホスホジエステル、ペプチドポリヌクレオチド類似体、スレオシル－ポリヌクレオチド類似体、グリコール－ポリヌクレオチド類似体、モルフォリノ－ポリヌクレオチド類似体、ロックされたヌクレオチドオリゴマー類似体、ポリペプチド類似体、分岐ポリマー、コームポリマー、スターポリマー、樹枝状ポリマー、ランダム、グラジエントおよびブロックコポリマー、アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマー、基部ループを形成するポリマー、剛体セグメントと可動性セグメントが、含まれ得るが、これらに限定されない。
「レポーター」は、１つ以上のレポーターエレメントから構成される。レポーターは、標的核酸の遺伝情報を解析するのに役立つ。
「レポーター構築物」は、検出可能なシグナルを生成することができる１つ以上のレポーターを含み、検出可能なシグナルは一般に配列情報を含む。この信号情報は、「レポーターコード」と呼ばれ、続いて遺伝的配列データに復号される。レポーター構築物はまた、つなぎ鎖セグメントまたはポリマー、グラフトコポリマー、ブロックコポリマー、アフィニティーリガンド、オリゴマー、ハプテン、アプタマー、デンドリマー、連結基または親和性結合基（例えば、ビオチン）を含む他の構造的構成要素を含み得る。
「レポーターコード」は、レポーター構築物の測定シグナルからの遺伝情報である。レポーターコードは、配列特異的な遺伝情報データを提供するために復号される。
本明細書で使用される「固体支持体」、「固体状態」、「支持体」、および「基質」という用語は、互換的に使用され、剛性または半剛性の表面を有する材料または材料群を指
す。多くの実施形態において、固体支持体の少なくとも１つの表面は、実質的に平坦であり、例えば、ポリマーマイクロ流体カードまたはチップの表面であるだろう。いくつかの実施形態では、例えば、エッチングされたチャネル、トレンチ、ウェル、隆起領域、ピンなどとの異なる反応のためにカードまたはチップの領域を物理的に分離することが望ましい場合がある。他の実施形態によれば、固体支持体は、不溶性ビーズ、樹脂、ゲル、膜、ミクロスフェア、または、例えば、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）および／もしくはポリスチレンから配置される他の幾何学的配置の形態をとるであろう。
本明細書で使用される「固定化される」という用語は、伸長、増幅、連結、および本明細書に記載される他のプロセスの条件下で安定な会合を提供する様式での分子（例えば、リンカー、アダプター、オリゴヌクレオチド）と支持体との間の会合、結合、または結合を指す。そのような結合は、共有結合または非共有結合であり得る。非共有結合には、静電相互作用、親水相互作用、および疎水相互作用が含まれる。共有結合は、原子間の電子対の共有を特徴とする共有結合の形成である。そのような共有結合は、分子と支持体との間に直接存在し得るか、クロスリンカーによって、または支持体もしくは分子もしくはその両方に特異的な反応性基を含めることによって形成され得る。分子の共有結合は、支持体に固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンなどの結合パートナー、およびアビジンまたはストレプトアビジンへのビオチン化分子の非共有結合を使用して達成することができる。固定はまた、共有結合性および非共有結合性の相互作用の組み合わせを含み得る。
本明細書で使用される場合、「クリック反応」という用語は、当技術分野で認識されており、これは、最も認識されている銅触媒アジド－アルキン［３＋２］環化付加などの極めて信頼性が高く自己指向性の有機反応の集合体を説明する。クリックケミストリー反応の非限定的な例は、例えば、Ｈ．Ｃ．Ｋｏｌｂ，Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ，Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００１，４０，２００４ ａｎｄ Ｅ．Ｍ．Ｓｌｅｔｔｅｎ，Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００９，４８，６９７４において見出され、その開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
例示的なクリックケミストリー反応は、アジド－アルキンＨｕｉｓｇｅｎ付加環化である（例えば、室温で銅（Ｃｕ）触媒を使用する）。（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，ｅｔ ａｌ．２００２ Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ’ｌ Ｅｄ．４１（１４）：２５９６－２５９９；Ｔｏｒｎｏｅ，ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７（９）：３０５７－３０６４．）クリックケミストリーの他の例としては、チオール－エンクリック反応、ディールス・アルダー反応、および逆電子要求ディールス・アルダー反応、イソニトリル（イソシアニド）とテトラジンとの間の［４＋１］環化付加が挙げられる。（例えば、Ｈｏｙｌｅ，ｅｔ ａｌ．２０１０ Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ’ｌ Ｅｄ．４９（９）：１５４０－１５７３；Ｂｌａｃｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ．２００８ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０（４１）：１３５１８－１３５１９；Ｄｅｖａｒａｊ，ｅｔ ａｌ．２００８ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９（１２）：２２９７－２２９９；Ｓｔｏｃｋｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．９，７３０３－７３０５を参照されたい。）
「アルキン」という用語は、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する炭化水素を指す。本明細書で使用される場合、「末端アルキン」という用語は、少なくとも１個の水素原子が三重に結合した炭素原子に結合しているアルキンを指す。
本明細書で使用される「アジド」または「アジド基の」という用語は、式（－－Ｎ３）の基を指す。
「トリアゾール」という用語は、２個の炭素原子および３個の窒素原子の５員環を有する分子式Ｃ２Ｈ３Ｎ３を有する複素環式化合物のいずれかを指す。アルキン部分とアジド部分との間の化学クリック反応の産物は、トリアゾール部分である。
拡張による配列決定
固体合成によって増強できる例示的なプライマー伸長反応の１つは、Ｓｔｒａｔｏｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって開発された「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ」（ＳＢＸ）プロトコルの基礎を形成する「ＸＮＴＰ」として知られる非天然ヌクレオチド類似体の重合である（例えば、Ｋｏｋｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第７，９３９，２５９号、「Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ」を参照のこと）。一般に、ＳＢＸは、この生化学的重合を使用して、ＤＮＡ鋳型の配列を「Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ」と呼ばれる測定可能なポリマー上に転写する。転写された配列は、約１０ｎｍ離れた高シグナル対ノイズレポーターにおいてＸｐａｎｄｏｍｅｒ骨格に沿ってコード化され、高シグナル対ノイズ、高分化応答のために設計される。これらの違いは、ネイティブＤＮＡと比較して、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの配列リード効率および精度の著しい性能向上を提供する。ＳＢＸプロセスの一般化された概要を図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄに示す。
ＸＮＴＰは、鋳型依存性酵素重合と適合する拡張可能な５’三リン酸修飾ヌクレオチド基質である。非常に単純化されたＸＮＴＰが、図１Ａに示されており、これは、これらのヌクレオチド類似体の固有の特徴を強調する。ＸＮＴＰ １００は、２つの異なる機能領域を有する。すなわち、５’α－ホスフェート１１５を核酸塩基１０５に連結する選択的に切断可能なホスホルアミデート結合１１０と、ホスホルアミデート結合のヌクレオチド内切断による制御された拡張を可能にする位置でヌクレオシドトリホスホルアミデート内に結合されるつなぎ鎖１２０である。ＸＮＴＰのつなぎ鎖は、選択的に切断可能なホスホルアミデート結合によって分離されたリンカーアーム部分１２５Ａおよび１２５Ｂから構成される。各リンカーは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｏｋｏｒｉｓらによる米国特許第８，３２４，３６０号明細書に開示されているように、連結基（ＬＧ）を介してレポーター１３０の一末端に結合する。ＸＮＴＰ １００は、重合後のＸＮＴＰ基質および娘鎖に特徴的な「拘束された配置」に示されている。重合ＸＮＴＰの拘束された配置は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物に見られるように、拡張された配置の前駆体である。拘束された配置から拡張された配置への移行は、娘鎖の一次骨格内のホスホルアミデートのＰ－－Ｎ結合の切断時に起こる。
Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの合成を図１Ｂおよび図１Ｃに要約する。集合中、モノマーＸＮＴＰ基質１４５（ＸＡＴＰ、ＸＣＴＰ、ＸＧＴＰ、およびＸＴＴＰ）は、ガイドとして一本鎖鋳型（配列番号１）１４０を使用する鋳型指向重合のプロセスによって新生娘鎖１５０の伸長可能末端で重合される。一般に、このプロセスは、プライマーから開始され、５’から３’方向に進行する。一般に、ＤＮＡポリメラーゼまたは他のポリメラーゼを使用して娘鎖を形成し、鋳型鎖の相補的コピーが得られるように条件を選択する。娘鎖が合成された後、カップリングされたつなぎ鎖は、娘鎖をさらに含む拘束されたＸｐａｎｄｏｍｅｒを含む。娘鎖中のつなぎ鎖は、ＸＮＴＰ基質の「拘束された配置」を有する。つなぎ鎖の拘束された配置は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物に見られるように、拡張された配置の前駆体である。
図１Ｃに示されるように、拘束された配置１６０から拡張された配置１６５への移行は、娘鎖の一次骨格内の選択的に切断可能なホスホルアミデート結合（単純化のために陰影のない楕円によって示されている）の切断に起因する。この実施形態では、つなぎ鎖は、それらが連結されている核酸塩基に特異的な１つ以上のレポーター構築物またはレポーター
構築物１３０Ａ、１３０Ｃ、１３０Ｇ、または１３０Ｔを含み、それによって鋳型の配列情報をコードする。このようにして、つなぎ鎖は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの長さを拡張し、親鎖の配列情報の線密度を低下させる手段を提供する。
図１Ｄは、シスリザーバ１７５からトランスリザーバ１８５にナノポア１８０を通って移動するＸｐａｎｄｏｍｅｒ １６５を示す。ナノポアを通過すると、線形化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒのレポーター（この図では、「Ｇ」、「Ｃ」、および「Ｔ」とラベル付けされている）のそれぞれは、それが連結されている核酸塩基に特異的な別個の再現性のある電子シグナル（重畳トレース１９０によって示される）を生成する。
図２は、ＸＮＴＰの一般化された構造をより詳細に示す。ＸＮＴＰ ２００は、選択的に切断可能なホスホルアミデート結合２３０によって分離されたリンカーアーム部分２２０Ａおよび２２０Ｂを有する核酸塩基トリホスホルアミデート２１０から構成される。つなぎ鎖は、連結基２５０Ａおよび２５０Ｂでヌクレオシドトリホスホルアミデートに連結され、第１のつなぎ鎖末端はヘテロ環２６０（ここではシトシンによって表されるが、複素環は、４つの標準的な核酸塩基、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれか１つであってもよい。）に連結され、第２のつなぎ鎖末端は、核酸塩基骨格のアルファリン酸２７０に連結される。当業者は、当技術分野で公知の多くの適切なカップリング化学物質を使用して最終的なＸＮＴＰ基質産物を形成することができ、例えば、つなぎ鎖結合がトリアゾール結合によって達成され得ることを理解するであろう。
この実施形態では、つなぎ鎖２７５は、エンハンサー２８０Ａおよび２８０Ｂ、レポーターコード２８５Ａおよび２８５Ｂ、ならびに翻訳制御エレメント（ＴＣＥ）２９０Ａおよび２９０Ｂを含むいくつかの機能エレメントから構成される。これらの特徴のそれぞれは、ナノポアを通り抜けるＸｐａｎｄｏｍｅｒの転座、および固有の再現性のある電子シグナルの生成中に独特の機能を果たす。つなぎ鎖２７５は、ハイブリダイゼーション（ＴＣＨ）による転座制御のために設計されている。図示のように、ＴＣＥは、相補的オリゴマー（ＣＯ）に二重鎖化することができ、レポーターコードに隣接して配置されるハイブリダイゼーションの領域を提供する。異なるレポーターコードは、異なる測定可能なレベルでナノポアを通るイオン流を遮断するようなサイズである。オリゴヌクレオチド合成に典型的に使用されるホスホラミダイト化学を使用して、特定のレポーターコードを効率的に合成することができる。レポーターは、市販のライブラリから特定のホスホラミダイトの配列を選択することによって設計することができる。そのようなライブラリには、１～１２またはそれを超えるエチレングリコール単位の長さを有するポリエチレングリコール、１～１２またはそれを超える炭素単位の長さを有する脂肪族、デオキシアデノシン（Ａ）、デオキシシトシン（Ｃ）、デオキシグアノジン（Ｇ）、デオキシチミン（Ｔ）、脱塩基（Ｑ）が含まれるが、これらに限定されない。レポーターコードに関連する二重鎖化ＴＣＥもイオン電流遮断に寄与するので、レポーターコードとＴＣＥとの組み合わせは、「レポーター」と呼ぶことができる。レポーターコードに続いて、一実施形態ではスペルミンポリマーを含むエンハンサーが存在する。
図３はα－溶血素ナノポアを転位させるプロセスにおける切断されたＸｐａｎｄｏｍｅｒの一実施形態を示す。この生物学的ナノポアは、電解質の２つの貯蔵部を分離し電気的に隔離する脂質二重層膜に埋め込まれる。典型的な電解質は、ｐＨ７．０に緩衝された１モルのＫＣｌを有する。典型的には１００ｍＶの小さい電圧が、二重層にわたって印加されるとき、ナノポアは、イオン電流の流れを制限し、回路内の一次抵抗である。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒレポーターは、特定のイオン電流遮断レベルを与えるように設計されており、レポーターの配列が、ナノポアを転座するときにイオン電流レベルの配列を測定することによって配列情報を読み取ることができる。
α－溶血素ナノポアは、典型的には配向しているので、転座は、前庭部側に入り、基部側から出ることによって起こる。図３に示すように、ナノポアは、最初に基部側からＸｐａｎｄｏｍｅｒを捕捉するように配向される。この配向は、ＴＣＨ法を使用すると、最初に前庭部に入るときに発生する閉塞アーチファクトが少なくなるので有利である。特に指示しない限り、基部側が最初に想定される転座方向となるであろう。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒが転座すると、レポーターは、その二重鎖化されたＴＣＥが基部入口で停止するまで基部に入る。二重鎖は直径が約２．４ｎｍであるのに対して、基部入口は約２．２ｎｍであるので、レポーターは、二本鎖の相補鎖３９５が解離する（放出される）まで基部に保持され、その後、転座が次のレポーターに進む。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒはまだ転座しており、ポアから拡散しているので、遊離相補的鎖がナノポアに入ることが非常に望ましくない。
一実施形態では、（二重鎖に続く）レポーターコードの各メンバーは、多くの市販ライブラリから選択することができるホスホラミダイトの順序付き選択によって形成される。各構成成分ホスホラミダイトは、ナノポア内のその位置（二重鎖停止後に位置する）、その変位、その電荷、ナノポアとのその相互作用、その化学的および熱的環境ならびに他の要因に従って正味のイオン抵抗に寄与する。各ホスホラミダイト上の電荷は、部分的には、－１の公称電荷を有するが、対イオン遮蔽によって効果的に低減されるリン酸イオンに起因する。二重鎖を引っ張る力は、局所電場によって作用されるレポーターに沿ったこれらの有効電荷に起因する。各レポーターは異なる電荷分布を有することができるので、所与の印加電圧に対して二重鎖に異なる力を及ぼすことができる。レポーター骨格に沿って伝達される力はまた、レポーターを引き伸ばして反復可能なブロッキング応答を与えるのに役立つ。
配列決定のために、２Ｍ ＮＨ４Ｃｌおよび１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含有する緩衝液Ｂ１中のＤＰｈＰＥ／ヘキサデカン二重層メンバーにα－溶血素を挿入することによって、タンパク質ナノポアを調製する。シスウェルを、０．４Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、０．６Ｍ ＧｕＣｌ、および１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含有する緩衝液Ｂ２で灌流する。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ試料を７０℃に２分間加熱し、完全に冷却し、次いで、試料２μＬをシスウェルに添加する。次いで、９０ｍＶ／３９０ｍＶ／１０μｓの電圧パルスを印加し、Ｌａｂｖｉｅｗ取得ソフトウェアを用いてデータを取得する。
配列データは、単一のＳＢＸ反応からの配列リードの集団のヒストグラム表示によって分析される。分析ソフトウェアは、各配列リードを鋳型の配列に整列し、正しい鋳型配列と整列しないリードの末端の配列の範囲をトリミングする。
２．本発明の実施形態
本発明は、以下の例示的な実施形態に記載されるような特定の方法、装置、および組成物を使用することができる。
Ａ．固体合成
本発明者らによって開発された拡張による配列決定（ＳＢＸ）方法論は、ネイティブＤＮＡと比較して、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの配列リード効率および精度における著しい性能向上を提供する。しかし、鋳型ＤＮＡの高品質の全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒコピーが濃縮された試料は、溶液中で生成することが困難であり得る。有利には、試行錯誤によって、本発明者らは、ワークフローの様々な工程（例えば、プライマー伸長反応および／または合成後プロセシング工程）を固体支持体に適合させることによって、全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの合成および／またはプロセシングの効率を高めることができることを見出した。固体プラットフォームは、様々な反応条件の最適化を改善することが見出されている。
Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの固体合成は、当技術分野で公知の任意の適切な支持体プラットフォームを使用して実施され得る。特定の実施形態では、固体支持体は、従来のビーズ、チューブ、キャピラリー、またはマイクロ流体チップまたはカードであってもよい。本明細書でさらに論じるように、本発明のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマー、すなわち伸長部、または「Ｅ－オリゴ」が、支持体に結合して、固体Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成を開始する。
表面化学
複数の表面化学を使用して、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド／鋳型複合体を固体支持体上に固定化することができる。適切な表面化学の特定の例示的な実施形態を図４Ａ～図４Ｅに示す。図４Ａに示される実施形態は、従来のストレプトアビジン／ビオチン相互作用化学を使用し、末端ビオチン部分４１０Ａを含むリンカーによる固体支持体４００の官能化を示す。この実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマー４２０の５’末端は、末端ビオチン部分４１０Ｂを含む第２のリンカーに結合している。プライマー－鋳型複合体４２５（ポリメラーゼ媒介Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成を示すこの描写において）の支持体への結合は、ストレプトアビジン部分４３０によって媒介される。本明細書に開示されるリンカー部分は、支持体が相補的オリゴヌクレオチドまたは核酸複製酵素によるオリゴヌクレオチドの全体的な結合および認識を著しく妨害しないように、オリゴヌクレオチドを支持体に連結するのに十分な長さであり得る。したがって、リンカーは、スペーサーユニットも含むことができる。スペーサーは、例えば、オリゴヌクレオチドを切断部位または標識から離す。
あるいは、図４Ｂに示される実施形態は、クリック反応を介したプライマーと基質との共有結合による、プライマー－鋳型複合体４２５の固体支持体（すなわち、「基質」）４００への固定化を示す。この実施形態では、共有結合は、固体支持体に架橋されたマレイミド－ＰＥＧ－アルキンリンカー４２３によって媒介される。基質に遠位のリンカーの末端によって提供されるアルキン部分４２９は、プライマーの５’末端によって提供されるアジド基４３５と反応することができる。基質上に核酸を固定化するために単純なクリックケミストリーを利用する能力は、従来の固体核酸合成プロトコルを超える利点を提供する。例えば、核酸は、クリックコンジュゲーションの前に（例えば、化学的または酵素的に）予め合成され、精製され得る。さらに、異なるオリゴヌクレオチドの組み合わせを単一の支持体上に固定化することができる。固体支持体に結合したオリゴヌクレオチド構造の複数の配置が本発明によって企図される。図４Ｃは、本明細書中で論じられるように、プライマー－鋳型複合体のデンドリマーが、クリックケミストリーによって支持体上にどのように形成され得るかを示す。
第１の末端にマレイミド部分を提供し、第２の末端にアルキン部分を提供する任意の適切なリンカーを本発明に従って使用することができる。リンカーの２つの反応性基間の化学鎖は、本明細書では「スペーサーアーム」と呼ばれ得る。スペーサーアームの長さは、コンジュゲートがどの程度可動性であるかを決定するだろう、また、特定の用途に最適化することができる。典型的には、スペーサーアームは、炭化水素鎖またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む。図４Ｄは、アルキン部分４２９およびマレイミド部分４２７を提供する例示的なマレイミド－ＰＥＧ－アルキンリンカー４２３、プロパルギル－ＰＥＧ４－マレイミドを示す。図４Ｅは、共有結合を生成するクリック反応によって、末端アジド部分が５’末端に連結した伸長オリゴヌクレオチドを固体支持体上にどのように固定化できるかを示す。この実施形態では、固体支持体は、支持体に近位端に末端マレイミド部分を含み、支持体に遠位端に末端アルキン基を含むリンカーを架橋することによって官能化されている。
本発明によれば、マレイミド部分を反応性基に変換し、その後、触媒を含まない光化学（例えば、光開始）プロトン引き抜き反応によって固体表面、例えばポリオレフィン表面に架橋することができる。この反応は、従来のコンジュゲーション方法論が依拠する開始工程を単純化する。従来の架橋技術は、マレイミド化学基がスルフヒドリル反応性の標的化（－ＳＨ）官能基であることを教示している。しかしながら、本発明者らは、有利には、マレイミド基が、プロトン引き抜き反応による活性化後に剛性ポリオレフィン基質に架橋され得ることを発見した。重要なことに、マレイミド媒介架橋は、酸性条件下ならびにクリック反応中に安定であることが分かっている。適切なポリオレフィン表面には、ポリプロピレンまたは環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）から製造された基質が含まれるが、これらに限定されない。
基質、例えば、ＣＯＣチップをアルキン部分で官能化するために、例示的な触媒を含まない光化学的プロトン引き抜き反応は、１）ＤＭＳＯまたはＤＭＦなどの有機溶媒でチップをプライミングする工程と、２）例えばＤＭＳＯおよび水に可溶化された、一末端にマレイミド部分を有するリンカー、例えばプロパルギルマレイミドを加える工程と、３）チップをＵＶランプ下でインキュベートする工程と、３）特定の実施形態ではＤＭＳＯ、ＤＭＦ、およびＮａ２ＨＰＯ４、Ｔｗｅｅｎ－２０、およびＳＤＳの溶液を含み得る一連の溶媒でチップを洗浄する工程と、４）クリック反応の前に、チップを水および／またはＰＢＳなどの水溶液で洗浄する工程と、を含み得る。
これらの実施形態は、伸長オリゴヌクレオチドの５’末端、すなわち支持体に連結されたプライマーを示しているが、代替の実施形態では、表面化学を、オリゴヌクレオチドの３’、例えば、本明細書でさらに論じられる末端キャップ構造の末端オリゴヌクレオチド（または末端オリゴヌクレオチドの逆相補体である配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端）を支持体に連結するように適合させることができることを理解されたい。
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドと固体支持体との間の連結は、切断可能であり、プライマー伸長産物が、合成後に支持体から放出されることを可能にする。切断可能なリンカーおよびそのようなリンカーを切断する方法は公知であり、当業者の知識を使用して提供される方法に使用することができる。例えば、切断可能なリンカーは、酵素、触媒、化合物、温度、電磁放射線、または光によって切断することができる。任意に、切断可能なリンカーは、ベータ脱離によって加水分解可能な部分、酸加水分解によって切断可能な部分、酵素的に切断可能な部分、または光切断可能な部分を含む。いくつかの実施形態では、適切な切断可能部分は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能な光切断可能（ＰＣ）スペーサーまたはリンカーホスホラミダイトである。
本発明者らは、有利には、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの固体合成およびプロセシングが、４００塩基を超えるナノポア配列リードが得られるように、ワークフローにおける多くの工程の最適化を可能にすることを見出した。特定の実施形態では、固体合成は、支持体として耐酸性磁気ビーズを使用して実施され得る。ビーズ構造の幾何学的形状は、好ましい鋳型結合および迅速な溶液中反応速度、表面積の増加、磁気収集などを含むいくつかの利点を提供する。ビーズの耐酸性は、ビーズをＸｐａｎｄｏｍｅｒプロセシング反応に特に適した支持体にする。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成用の耐酸性磁気ビーズを調製する方法の一実施形態を図５に示す。ここで、耐酸性磁気ビーズ５１０（例えば、ＴｕｒｂｏＢｅａｄｓ（登録商標）Ｐｅｇアミン）は、リンカー５２０で官能化されて官能化ビーズ５３０を生成し、末端アルキン基を提供する。ビーズは、任意の形態のアミン型カップリングまたは化学縮合を使用して官能化され得る。一実施形態では、ビーズは、ビーズの表面によって提供されるアミンとのＮＨＳ－エステル結合によって官能化され得る。クリックケミストリーにより、５’アジド部分を提供する伸長オリゴヌクレオチド（「Ｅ－オリゴ」）５４０が、官能化ビーズ５３０に共有結合して、支持体結合Ｅ－オリゴ５５０を生成する。ビーズ
に結合したＥ－オリゴは、例えばプライマー伸長反応のために一本鎖鋳型５６０にハイブリダイズして、鋳型のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーを生成することができる。有利には、ホスホルアミデート結合の酸媒介性切断を含むその後のＸｐａｎｄｏｍｅｒプロセシング工程は、同じビーズ支持体上で実施することができる。
末端キャッピング
この実施形態では、核酸鋳型の一本鎖コピーは、鋳型の一部に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド「キャップ」の３’末端から５’末端で作動可能に連結される（例えば、接続または結合される）。オリゴヌクレオチドキャップへの一本鎖コピーの連結は、鋳型依存性の間にオリゴヌクレオチドキャップの５’末端に達するときに核酸ポリメラーゼによって媒介される。オリゴヌクレオチドキャップは、本明細書では代替的に「末端キャップ」、「キャップ付きブロッカーオリゴヌクレオチド」、または「エンドタグ」と呼ばれる。末端キャップは、望ましくない長さのコピー、例えば、不完全なまたは切断された産物を含み得る産物の不均一な集団から定義された長さを有する核酸鋳型のコピーを同定および／または単離するための分子タグとして機能する。
代替的な実施形態では、鋳型核酸は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。末端キャップは、鋳型核酸の任意の部分に（すなわち、「末端キャップ標的配列」に）ハイブリダイズして、規定のまたは所望の長さ、すなわち、「標的配列」を有する鋳型の領域のコピーを選択的に改変、例えば、「タグ付け」するように設計され得る。いくつかの実施形態では、末端キャップは、標的配列の完全なまたはほぼ完全なコピーを「タグ付け」するために、標的配列の５’末端付近の配列にハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態では、末端キャップ標的配列は、鋳型核酸の天然核酸配列の一部である。他の実施形態では、末端キャップ標的配列は、鋳型核酸に連結または接続されている異種配列（例えば、アダプターまたはリンカー）である。
特定の実施形態では、一本鎖核酸鋳型のコピーは、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒであり、末端キャップは、鋳型ＤＮＡのライブラリ断片の５’末端にハイブリダイズするように設計されている。有利には、ライブラリ断片の全長コピーが濃縮されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物の集団は、本発明のナノポアベースの配列決定システムから改善された配列情報または「リード」を提供する。
末端キャッピング戦略の一実施形態の概要を図６Ａに簡略化した形で示す。この実施形態では、末端キャッピングは、本明細書では標的配列鋳型６１０によって表されるＤＮＡ標的配列のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーの選択的タグ付けを可能にする。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、適切なＤＮＡポリメラーゼ、ＸＮＴＰ基質ならびに他の伸長試薬および添加剤を用いて一本鎖鋳型にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマー６２０（すなわち、伸長または「Ｅ－オリゴ」）から開始されるプライマー伸長反応によって合成される。本発明者らは、特にプライマー伸長反応が１つ以上のＰＥＭ添加剤（ＰＥＭ添加剤は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」と題する、本出願人の係属中の特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／６７７６３号に記載されている）を含む場合、ＤＰＯ４ポリメラーゼの変異体が、ＸＮＴＰを基質として利用して鋳型依存的にＸｐａｎｄｏｍｅｒを合成することができることを見出した。プライマー伸長産物は、伸長産物に組み込まれたオリゴヌクレオチドが検出可能な色素６３０に連結されている場合、ゲル電気泳動によって可視化され得る。
末端キャップ構造の一実施形態の一般的な特徴は、図６Ａの概略番号４に示されている。この実施形態では、末端キャップ６４０は、標的配列鋳型の５’末端付近の配列に相補的
であり、特異的にハイブリダイズする末端オリゴヌクレオチド６４５（本明細書では「ブロッカー」オリゴヌクレオチドと呼ばれ得る）を含む。末端キャップはまた、ＤＮＡポリメラーゼによって基質として利用され得るジデオキシリボヌクレオシド類似体（すなわち、「キャップ」）に結合した５’三リン酸基６４７を含む。プライマー伸長反応、例えば、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成反応の間、ＤＮＡポリメラーゼは、結合した伸長オリゴヌクレオチドから伸長中のＸｐａｎｄｏｍｅｒを鋳型依存的に合成する。鋳型の末端に達すると、ＤＮＡポリメラーゼは、末端キャップに遭遇し、５番目の模式図に示されているように、キャップの三リン酸基とＸｐａｎｄｏｍｅｒの３’末端ＸＮＭＰとの間にホスホジエステル結合を形成することによって、末端オリゴヌクレオチドの５’末端をＸｐａｎｄｏｍｅｒの３’末端に連結させる。対照的に、遊離５’三リン酸基を欠く末端オリゴヌクレオチドは、図６Ａの３番目の模式図のオリゴヌクレオチド６４５に示されるように、ＤＮＡポリメラーゼによってＸｐａｎｄｏｍｅｒに連結することができない。
特定の実施形態では、末端キャップを検出可能な色素６３０に連結して、例えばゲル電気泳動によって標的配列の末端キャップされたコピーを可視化することができる。図６Ｂは、１００ｍｅｒ鋳型のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーが末端キャップ（図６Ａの第４の模式図に対応するレーン１～４）またはプライマー（図６Ａの第１の模式図に対応するレーン５～８）のいずれかで標識されている例示的なゲルを示す。末端キャッピングは、遊離５’三リン酸基を欠くブロッカーオリゴヌクレオチド６４５（図６Ａの第２および第３の模式図に対応する、図示されていないデータ）を用いてプライマー伸長反応を行った場合の蛍光シグナルの欠如によって示されるように、末端オリゴヌクレオチドに結合した５’ヌクレオシド三リン酸基の利用可能性に依存する。
いくつかの実施形態では、本明細書でさらに詳細に記載されるように、末端キャップまたは末端キャップの末端オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを固体支持体に連結して、全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物の単離または精製（例えば、「捕捉」）を可能にすることができる。
末端または「ブロッカー」オリゴヌクレオチドは、鋳型核酸中の末端キャップ標的配列と強くハイブリダイズするように設計されている。オリゴヌクレオチドの長さおよび／またはオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドモノマーの化学構造などの特徴は、所望のハイブリダイゼーション強度を達成するために最適化され得る。一般的に言えば、末端オリゴヌクレオチド－標的配列鋳型の融解温度は、最適なハイブリッド形成のために少なくとも３７℃であるだろうが、より低い融解温度も可能である。ある特定の実施形態において、末端オリゴヌクレオチドの長さは、約１０～約３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、結合効率を高めるために、ヌクレオチド類似体、例えば１つ以上の２’メトキシリボヌクレオチド、ＬＮＡ（すなわち、「ロックド」核酸類似体）、またはＧクランプが、末端オリゴヌクレオチドに組み込まれる。１つの実施形態において、２’メトキシリボヌクレオチドにおける末端ヌクレオチドの実質的に全てのヌクレオチド。
例示的な末端キャップ構造の特定の特徴の詳細を図７Ａ～図７Ｄに示す。図７Ａおよび図７Ｂは、オリゴヌクレオチドの５’末端が、可動性リンカー７１０に連結している末端オリゴヌクレオチド（配列番号２）７００を示す。可動性リンカーは、図７Ｃを参照してさらに説明するように、修飾５’ヌクレオシド三リン酸キャップ（すなわち、「キャップ」）への共有結合を可能にするクリック反応のための基質を提供する末端アジド部分７２０を含む。２３ｍｅｒ末端オリゴヌクレオチド７００の５’末端に結合した可動性リンカー７１０Ａおよび７１０Ｂの例示的な実施形態を、それぞれ図７Ａおよび図７Ｂに示す。可動性リンカーは、例えば、適切な長さのアルキルおよび／またはＰＥＧ部分から構成される不活性直鎖ポリマーであり得る。一実施形態では、可動性リンカーは、Ｃ６ブロモヘキスホスホラミダイトから形成される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド
の５’末端は、１つ以上のＧクランプヌクレオチド類似体を含み得る。
合成の例示的な方法において、末端オリゴヌクレオチドは、完成したオリゴヌクレオチドの５’－ヒドロキシルがブロモヘキシルホスホラミダイト（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能）にカップリングされる従来の自動化ホスホラミダイト化学によって合成される。固体支持体をアジ化ナトリウムで処理して、ブロモ基をアジドに変換する。最後に、図７Ｂに示されるように、オリゴヌクレオチドを脱保護し、固体支持体から切断して、アジドオリゴヌクレオチドを得る。
図７Ｃは、本明細書で「ｄｄＮＴＰ－Ｏ」（この描写ではｄｄＣＴＰ－０によって表される）と呼ばれる修飾５’ヌクレオシド三リン酸キャップ７４０の一実施形態を示す。キャップの複素環部分は、クリック反応を介した末端オリゴヌクレオチドのアジドへの結合を媒介するために、オクタジインルアーム７４７を介して連結された末端アルキン部分７４５で修飾される。特定の実施形態において、得られた末端キャップのアルキニルヌクレオシド三リン酸（すなわち、キャップ７４０）は、末端オリゴヌクレオチドの５’末端の鋳型と塩基対合することができる。アルキニルヌクレオシド三リン酸キャップは、ＬｕｄｗｉｇおよびＥｃｋｓｔｅｉｎによって記載される方法または５’－三リン酸合成の他の方法を使用して合成することができ、例えば、Ａ．Ｒ．Ｋｏｒｅ，Ａ．Ｒ，Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ Ｂ．，Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１０（６），９０３－３４（２０１３）を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
図７Ｄは、三リン酸キャップ７４０（すなわち、アルキニルヌクレオシド三リン酸キャップ）を末端オリゴヌクレオチド（配列番号２）７００に作動可能に連結するクリック反応によって形成された完全な末端キャップ構造７８０の一実施形態を示す。理論に束縛されるものではないが、末端キャップの可動性リンカー７１０Ｂは、三リン酸基７５０がＤＮＡポリメラーゼの活性部位に入り、プライマー伸長反応中に末端キャップとＸｐａｎｄｏｍｅｒの３’末端との間のホスホジエステル結合の形成のための基質として機能することができるように、構造に十分な立体的柔軟性または自由度を提供すると仮定される。ＤＰＯ４ ＤＮＡポリメラーゼの変異体は、末端キャップ構造をＸｐａｎｄｏｍｅｒの３’末端に結合するのに特によく適している。
本発明の特定の実施形態では、代替的な末端キャップ構造およびＸｐａｎｄｏｍｅｒの３’末端に末端オリゴヌクレオチドを結合する手段が企図される。一実施形態では、ソラレン架橋連結法が利用される。簡潔には、末端オリゴヌクレオチドの５’末端を修飾してソラレン部分を提示し、これを紫外線（ＵＶＡ）照射に曝露すると、チミンとモノ付加物および共有結合性鎖間架橋（ＩＣＬ）を形成することができる。したがって、ソラレン修飾末端オリゴヌクレオチドは、ＵＶＡ放射線に曝露されると、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ中の３’チミンに化学的に架橋され得る。有利には、ソラレン架橋は酸切断に耐性がある。
他の実施形態では、ソラレン修飾末端オリゴヌクレオチドは、固体基質への結合および固体基質からの放出を可能にするための他の特徴を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端は、ヌクレアーゼ酵素の切断部位を含むリンカー核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、切断部位は、ＲＮａｓｅによって認識され、切断される。任意の適切なＲＮａｓｅ認識部位が、例えば、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、またはＲＮａｓｅ Ｔ１のために使用され得る。他の態様において、切断部位は、ニッキングエンドヌクレアーゼまたはトリプシンによって認識され、切断される。リンカーの３’末端を介して固体支持体に結合した場合、末端オリゴヌクレオチドは、適切なヌクレアーゼでの酵素処理によって選択的に放出され得る。
末端のタグ付け
末端キャッピングの代替戦略として、本発明者らは、合成後にリーダー配列をＸｐａｎｄｏｍｅｒの３’末端に作動可能に連結する（例えば、連結または共有結合する）組成物および方法を考案した。このようにして、実質的に全長のＸｐａｎｄｏｍｅｒのみが、３’リーダー配列を含むであろう。これはＸｐａｎｄｏｍｅｒをナノプレセンサーに通すために必要である。一実施形態では、末端タグ構造は、本質的に、レポーターコードエレメントが、リーダーおよびエンハンサーエレメントによって置き換えられ、転座制御エレメントが、ポリＧオリゴマーによって置き換えられた修飾Ｘｐａｎｄｏｍｅｒである。ホスホルアミデート結合と末端タグのポリＧオリゴマーエレメントの両方が、酸不安定性である。したがって、酸処理時に、末端タグの５’半分は、リーダーおよびエンハンサーエレメントのうちの１つを含むＸｐａｎｄｏｍｅｒと会合したままであるだろう。これは、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの３’末端からのナノポア貫通を可能にする。
一実施形態において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを末端タグ付けする方法は、１）基質結合伸長オリゴヌクレオチドがリーダー配列およびエンハンサー配列を欠く固体状態のＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成を行う工程と、２）実質的に全長のＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物の集団を提供するのに十分な期間にわたって伸長反応を行う工程と、３）基質に結合した産物を洗浄して、全ての伸長試薬を除去する工程と、４）末端タグ構造およびＸｐａｎｄｏｍｅｒの３’末端への末端タグのポリメラーゼ媒介結合に必要な他の反応成分を基質に添加する工程と、を含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、伸長反応の前に末端ブロッカーヌクレオチドを鋳型にハイブリダイズさせ、伸長後および洗浄および末端タグ付加反応の前に末端ブロッカーヌクレオチドを除去する工程を含み得る。
Ｂ．末端キャッピングによる固体合成
本明細書に記載の末端キャッピング方法論は、当技術分野で公知の任意の適切な支持体プラットフォームを使用して固体Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成ワークフローと統合することができる。特定の実施形態では、固体支持体は、従来のビーズ、チューブ、キャピラリー、またはマイクロ流体チップであってもよい。一実施形態では、固体支持体は耐酸性磁気ビーズである。本明細書でさらに論じるように、本発明のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーを支持体に結合させることができる。他の実施形態において、末端キャップの末端オリゴヌクレオチドまたはその逆相補体は、支持体に結合され得る。
支持体（ＡＦＳ）から離れるＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成ワークフロー
この実施形態において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成は、支持体に結合したプライマー－鋳型複合体から開始され、支持体から離れて、鋳型の反対側（すなわち、３’）の末端にハイブリダイズした末端キャップ構造に向かって伸長する。ＡＦＳモデルの初期構成が図８Ａに示されており、３つの模式図のそれぞれが同一の特徴を示している。この実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマー８１０の５’末端は、リンカー８３０によって固体支持体８２０に結合される。一本鎖鋳型８４０は、標準的な水素結合を介してプライマーにハイブリダイズされる。同様に、末端キャップオリゴヌクレオチド８５０は、標準的な水素結合を介して鋳型の５’末端にハイブリダイズし、遊離５’三リン酸基８５５を提供する。核酸重合（すなわち、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成）の方向性を矢印で示す。
プライマー８１０から開始するＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成反応の例示的な産物を図８Ｂに示す。上および中央の模式図は、プライマー８１０に共有結合し、水素結合によって鋳型８４０にハイブリダイズした全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒコピー８７０を示す。全長Ｘｐａｎｄ
ｏｍｅｒ産物はまた、ホスホジエステル結合を介して末端キャップオリゴヌクレオチド８５０に共有結合している。下の模式図は、プライマーに共有結合したままであるが、重要なことに、末端キャップオリゴヌクレオチド８５０に連結されていない不完全なＸｐａｎｄｏｍｅｒコピー８６０を描いている。
本明細書の他の箇所で論じられるように、合成後、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを処理し、酸で処理して、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを図８Ｂに示される拘束型から図８Ｃに示される拡張された線形化型に移行させる。ここでは、支持体に結合したＸｐａｎｄｏｍｅｒから解離した鋳型８４０が示されている。上の模式図は、固体支持体８２０および末端キャップオリゴヌクレオチド８５０に依然として共有結合している線形化した、全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ８７５を示す。中央の模式図は、完全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒが、切断されて線形化断片８６５Ａおよび８６９が生成された酸処理に対する代替結果を示す。断片８６５Ａは、固体支持体に連結したままであり、一方、断片８６９は、支持体から溶液中に放出される。下の模式図は、同様に固体支持体に結合した線形化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒフラグメント８６５Ｂを示す。図８Ｄは、洗浄後、完全長線形化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ８７５ならびに線形化断片８６５Ａおよび８６５Ｂが、固体支持体に結合したままであることを示す。重要なことに、全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ８７５のみが末端キャップオリゴヌクレオチド８５０に連結されている。
図８Ｅは、末端キャップオリゴヌクレオチド８５０を分子タグとして使用して、不完全な断片を含む不均一な集団から全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物を単離または「探し出す」ことができる方法を示す。図８Ｄに示されるように初期支持体に結合したままのＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物は、光分解によって支持体から放出される。本明細書の他の箇所に記載されるように、オリゴヌクレオチドプライマーと初期固体支持体との結合は、光感受性であるように設計される。放出されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ８６５および８７５は、オリゴヌクレオチドプライマー８１０と共有結合したままであり、全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ８７５は、末端キャップオリゴヌクレオチド８５０と共有結合したままである。全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを単離するために、試料を、末端キャップオリゴヌクレオチド８５０の逆相補体であるオリゴヌクレオチド８８０とコンジュゲートしている第２の固体支持体８９０と接触させる。図に示されるように、完全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ８７５のみが、オリゴヌクレオチド８５０と８８０との間の水素結合を介して固体支持体に結合するだろう。図８Ｆに示すように、全ての不完全なＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を固体支持体から洗い流し、単離された完全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ８７５を残し、次いでこれを支持体から溶出させて、例えば、単分子ナノポア配列決定に使用することができる。この実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドは、ナノポアの局在化および転座に必要な特徴（例えば、リーダーおよびコンセントレータエレメント）を含む。
代替的な実施形態では、末端キャップオリゴヌクレオチドは、ナノポア貫通のためのリーダーおよびコンセントレータの特徴を含むように修飾されるが、伸長オリゴヌクレオチドは、これらの特徴を欠く。この実施形態では、全長伸長産物のみが、リーダーおよびコンセントレータエレメントに連結されるだろう。したがって、配列情報を生成するためにナノポアを通って転座することができる。
別の実施形態において、伸長オリゴヌクレオチド構造は、ナノポア貫通のためのリーダーおよびコンセントレータの特徴を含むように修飾されるが、末端キャップオリゴヌクレオチドはこれらの特徴を欠く。この実施形態では、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成および末端キャッピング反応を溶液中で行ってもよい。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成後、末端キャップ産物は、試料をビーズ支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドと接触させることによって、例えば、ビオチン－ストレプトアビジン化学によって精製されてよく、ここで、オリゴヌクレオチドは、末端キャップオリゴヌクレオチドの配列の一部の逆相補体である配列を含
む。このようにして、伸長オリゴヌクレオチド構造（リーダーおよびコンセントレータの特徴を提供する）および末端キャップの両方を含むＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物のみがナノポアセンサを貫通して配列情報を提供するだろう。
支持体（ＴＳ）Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成ワークフローに向けて
本発明の代替実施形態では、末端キャップ構造の末端オリゴヌクレオチドは、基質に共有結合している。この実施形態では、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成は、末端キャップ構造の末端オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマー－鋳型複合体から開始され、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成の方向性は支持体に向かう。ＴＳモデルの初期構成が、図９Ａに示されており、２つの支持体結合末端キャップ９８０のそれぞれは同一の特徴を示している。この実施形態では、末端オリゴヌクレオチド９５０の３’末端は、光切断性リンカー９３０によって固体支持体９２０に結合している。末端キャップ９８０は、遊離５’三リン酸９５５を提供する。
末端キャップの末端オリゴヌクレオチドの配列は、一本鎖標的核酸鋳型の５’末端の配列の逆相補体であるように設計される。図９Ｂは、標準的な塩基対合による標的核酸鋳型９４０の５’末端と末端キャップの末端オリゴヌクレオチドとの間の会合を示す。この実施形態では、伸長オリゴヌクレオチド９１０は、鋳型の３’末端の相補的配列にハイブリダイズする。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成は、プライマー９１０の３’末端から開始し、支持体結合末端キャップに向かって進行する。このモデルにおける核酸重合（すなわち、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成）の方向性を矢印で示す。
プライマー９１０から開始するＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成反応の例示的な産物を図９Ｃに示す。一番上の模式図は、ホスホジエステル結合を介してプライマー９１０および末端キャップオリゴヌクレオチド９５０に共有結合した全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒコピー９７０を示す。下の模式図は、プライマーに共有結合したままであるが、重要なことに、末端キャップの末端オリゴヌクレオチド９５０に連結されていない不完全なＸｐａｎｄｏｍｅｒコピー９６０を描いている。
本明細書の他の箇所で論じられているように、合成後、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを処理し、酸で処理して、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを図９Ｃに示されている拘束型から図９Ｄに示されているような拡張された線形化型に移行させる。ここで、鋳型８４０および不完全なＸｐａｎｄｏｍｅｒ９６０は、支持体から解離し、結合した材料から洗い流されている。上の模式図は、末端キャップの末端オリゴヌクレオチド９５０によって固体支持体９２０に共有結合した線形化した、全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ９７５を示す。重要なことに、全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒコピーのみが固体支持体に結合したままである。これらは、その後、光切断性部分９３０の光媒介性切断によって放出され、ナノポア配列決定に使用することができる。
いくつかの状況では、例えば、ＤＮＡポリメラーゼが末端キャップ構造を鋳型の不完全なコピーに通常より早く結合する場合、末端キャッピングプロセス中に切断された副産物が形成され得る。この現象は、本明細書ではポリメラーゼの「短絡」と呼ばれる。短絡を防止するために、本発明者らは、末端キャップ構造のＸｐａｎｄｏｍｅｒへの組み込みを遅延させ、それによって鋳型の実質的に全長コピーの合成を促進するためのいくつかの戦略を考案した。図１０Ａに概説される一実施形態では、ブロッカーヌクレオチド１０１０は、一本鎖鋳型１０２０の３’末端付近の領域にハイブリダイズする。ブロッカーオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによる成長中のＸｐａｎｄｏｍｅｒへの組み込みを防ぐように設計されている。いくつかの実施形態では、ブロッカーオリゴヌクレオチドの５’末端は、５’三リン酸基を欠き、したがって、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの３’末端に連結す
ることができない。したがって、ポリメラーゼが、ブロッカーオリゴヌクレオチドに到達すると、オリゴヌクレオチド１０３０の伸長が停止する。この時点で、ブロッカーオリゴヌクレオチドを、例えば熱融解によって鋳型から除去し、ＤＮＡポリメラーゼによって実質的に全長のＸｐａｎｄｏｍｅｒ１０５０に連結することができる末端キャップオリゴヌクレオチド１０４０で置き換えることができる。より長いＸｐａｎｄｏｍｅｒと鋳型とのハイブリダイゼーションに影響を与えずに、短いブロッカーオリゴヌクレオチドの解離をもたらす適切な融解温度を計算することができる。
別の実施形態では、図１０Ｂに示すように、ブロッカーオリゴヌクレオチド１０１５は、５’リン酸基を提供するように設計される。上述のように、ＤＮＡポリメラーゼは、成長中のＸｐａｎｄｏｍｅｒにブロッカーオリゴヌクレオチドを組み込むことができず、したがって、ポリメラーゼが、ブロッカーに遭遇すると合成が停止する。この実施形態では、ブロッカーは、例えばエキソヌクレアーゼ媒介消化によって除去することができる。エキソヌクレアーゼ処理後、末端キャップオリゴヌクレオチド１０４０が、鋳型にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって実質的に全長のＸｐａｎｄｏｍｅｒ１０５０に連結する。
Ｃ．末端キャッピングで構築された鏡像化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒのライブラリ
この一般化された実施形態は、オリゴヌクレオチドに基づくリンカーによってタンデムに連結された核酸標的配列（すなわち、鋳型）の同じ鎖の２つの一本鎖コピーを、各個々の構築物が組み込む鋳型構築物のライブラリを作製するために、使用することができる新規な方法および核酸組成物を記載する。そのような鋳型構築物のライブラリは、本明細書では「鏡像化ライブラリ」と呼ばれる。鏡像化ライブラリは、本明細書に開示される末端キャッピング戦略を使用する新規なＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成プロトコルのための鋳型を提供する。簡潔には、鋳型構築物のそれぞれから単一のＸｐａｎｄｏｍｅｒポリマーを合成して、キャップ分岐剤構造への共有結合によって作動可能に連結された標的の同じ鎖の２つのコピーを含むＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を生成する。標的配列の２つのコピーはそれぞれ、本明細書に記載の末端キャッピング方法論を用いて合成中にキャップ分岐剤構造に連結される。有利には、鏡像化ライブラリ構築物から合成されたＸｐａｎｄｏｍｅｒは、ナノポアを通過するときに単一の標的配列の２つの配列リードを提供する。第１および第２のリードの配列間の相違は、潜在的な配列決定エラーを示し、除外され得るか、または品質スコアリングもしくは不一致解消の何らかの方法に供され得る。
鏡像化ライブラリ鋳型構築物は、それぞれが特徴的な前駆体構築物を作製する一連の酵素反応によって生成される。図１１Ａは、「Ｍ１」と呼ばれる鏡像化ライブラリ鋳型構築物前駆体の一実施形態１１００の基本的な構造的特徴を示す。Ｍ１前駆体は、Ｙアダプター構築物１１１０、ライブラリ断片１１２０、およびキャッププライマーアダプター構築物（本明細書では「三つ又」と呼ばれる）１１３０の操作可能な連結によって（すなわち、共有結合の形成によって連結または結合することによって）形成される。この実施形態では、Ｙアダプター１１１０は、３’から５’のオリゴヌクレオチド鎖１１１１および５’から３’のオリゴヌクレオチド鎖１１１３を含み、本明細書では慣例によりそれぞれ「マイナス」鎖および「プラス」鎖と呼ばれる。アダプター鎖１１１１および１１１３は、ライブラリ断片に近位のＹアダプターの「基部」の一部で特異的にハイブリダイズするが、ライブラリ断片に遠位の「アーム」部分は一本鎖のままである。Ｙアダプターの二本鎖基部の一部を、ライブラリ断片に連結させることができる。この実施形態では、アダプター鎖１１１３の３’末端は、ここでは遊離「Ｔ」によって表される不対ヌクレオチドを有し、これは、連結を容易にするためにライブラリ断片によって提供される遊離ヌクレオチドと塩基対を形成することができる。Ｙアダプターのアームは、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成の後の段階で使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（すなわち、伸長オリゴ）の結合部
位を含む、鏡像化ライブラリのワークフローにいくつかの有用な特徴を提供するように操作することができる。いくつかの実施形態では、Ｙアダプター鎖の一方または両方の一本鎖領域の末端は、本明細書に記載されるように、クリック反応を介した官能化固体支持体へのＹアダプターの固定化を可能にするアジド基を提供する。他の実施形態では、Ｙアダプターの一方または両方の鎖は、例えば、固体支持体からの構築物の放出を可能にする選択的に切断可能エレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書にさらに記載されるように、マイナス鎖１１１１は、固体支持体に連結され、プラス鎖１１１３は、エキソヌクレアーゼ消化のための５’ヌクレオチド基質を提供する。
ライブラリ断片１１２０は、一実施形態では、当技術分野で認識されている技術によって作製され得る両鎖に５’リン酸末端および３’ヌクレオチド突出を有する二本鎖核酸である。ライブラリ断片は、本明細書では「核酸標的配列」とも呼ばれ、ＳＢＸによる配列決定の標的である。ライブラリ断片は、「プラス」鎖１１２０Ａおよび「マイナス」鎖１１２０Ｂを含む。いくつかの実施形態では、マイナス鎖の３’末端は、アダプター鎖１１１３の３’末端の不対ヌクレオチドと塩基対を形成する不対ヌクレオチド（ここでは遊離「Ａ」によって表される）を提供し得る。他の実施形態では、プラス鎖の３’末端はまた、キャッププライマーアダプター１１３０への連結を容易にするための不対ヌクレオチド（ここでは遊離「Ｔ」によって表される）を提供する。ライブラリ断片は、既知の配列または未知の配列を含み得る。ＳＢＸの場合、ライブラリ断片の長さは、約５０、１００、２００、５００、または１０００塩基対までであり得る。いくつかの実施形態において、ライブラリ断片の長さは、約１００～約２００塩基対である。
キャッププライマーアダプター構築物１１３０は、化学分岐剤によって作動可能に連結された３本のオリゴヌクレオチド鎖１１３１Ａ、１１３３、および１１３１Ｂを含む。鎖１１３１Ｂおよび１１３３の配列は、相補的であり、ハイブリダイズし得る。鎖１１３１Ａの配列は、１１３１Ｂと同一であり、この鎖はキャッププライマーアダプター１１３０内で一本鎖のままであり得る（または場合によっては鎖１１３３にハイブリダイズし得る）。いくつかの実施形態では、鎖１１３１Ｂの３’末端は、ライブラリ断片のプラス鎖１１２０Ａの３’末端の不対ヌクレオチドと塩基対を形成する不対ヌクレオチド（ここでは遊離「Ａ」によって表される）を提供する。
キャッププライマーアダプターは、標準的な自動化ホスホラミダイトベースのオリゴヌクレオチド合成によって生成され得る。いくつかの実施形態では、鎖１１３３は、最初に５’から３’方向に合成され、続いて、対称化学分岐剤（例えば、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ ＣＬＰ－５２１５）が組み込まれ、鎖１１３１Ａおよび１１３１Ｂの５’から３’同時合成が可能になる。いくつかの実施形態では、分岐剤と鎖１１３１Ａおよび１１３１Ｂの５’末端との間に標準的な親水性スペーサー（例えば、ＰＥＧ６スペーサー）を組み込むことにより、これらの鎖が、鎖１１３３上で折り返されて、キャッププライマーアダプターの特徴的な「三つ又」構造を形成することを可能にする可動性リンカーが提供される。キャッププライマーアダプターのオリゴヌクレオチドおよび分岐剤構成要素の両方の長さおよび組成は、特定の用途のために最適化することができる。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１５～２５ヌクレオチド長であり、以下に説明するようにキャップ分岐構築物との効率的なハイブリダイゼーションを可能にする。
鏡像化ライブラリ鋳型構築物は、溶液中または固体支持体上に形成され得る。一実施形態において、鏡像化ライブラリ鋳型構築物は、以下の例示的な工程に従って最初にＭ１前駆体を生成することによって固体支持体上に形成される。１）Ｙアダプター鎖１１１１は、クリック反応を用いて官能化固体支持体（例えば、マイクロ流体チップまたはビーズ）上に固定化され、次いで、Ｙアダプター鎖１１１３は、アダプター鎖１１１１に特異的にハイブリダイズする。２）キャッププライマーアダプター１１３０を、プラス鎖１１２０Ａ
の３’末端の鎖１１３３の５’末端への溶液中酵素連結および１１２０Ｂのマイナス鎖の５’末端の断片１１３１Ａの３’末端への連結によってライブラリ断片１１２０に結合させる。３）次いで、連結したライブラリ断片－キャッププライマーアダプター構造を、Ｙアダプター１１１０の二本鎖の一部の末端への酵素連結によって支持体に結合させる。
Ｍ１鏡像化ライブラリ鋳型構築物前駆体１１００は、図１１Ｂに示す「Ｍ３」１１５０と呼ばれる最終鏡像化ライブラリ鋳型構築物を形成するための基質を提供する。一実施形態では、鋳型構築物１１５０は、２つの酵素工程：プラス鎖１１２０Ａの相補体を生成する第１のＤＮＡ重合工程、続いてこの同じプラス鎖を除去する第２のエキソヌクレアーゼ工程によって生成され得る。第１の工程の間、キャッププライマーアダプター鎖１１３１Ａは、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、鎖置換熱安定性ポリメラーゼによって、鎖１１２０Ａを鋳型として使用して矢印で示す方向に３’末端から伸長される。これにより、本明細書では鋳型構築物前駆体「Ｍ２」１１４０と呼ばれる三本鎖構造が、生成される。Ｍ２前駆体は、マイナス鎖１１２０Ｂと同じ配列を有する娘鎖１１２０Ｃを含む。第２の工程の間、Ｍ２前駆体の中央のオリゴヌクレオチド鎖は、エキソヌクレアーゼの５’リン酸基質を提供するＹアダプター鎖１１１３の５’末端から開始するエキソヌクレアーゼ消化によって酵素的に除去される。したがって、元のプラス鎖１１２０Ａ全体が、キャッププライマーアダプター鎖１１３３と同様に除去される。得られた産物は、一緒に連結されたままであるキャッププライマーアダプターの鎖１１３１Ａおよび１１３１Ｂによって連結されたライブラリ断片の元のマイナス鎖の２つの同一のコピー１１２０Ｂおよび１１２０Ｃを含む鏡像化ライブラリ鋳型構築物「Ｍ３」１１５０である。Ｍ３鏡像化ライブラリ構築物１１５０は、ライブラリ断片１１２０の同じ鎖の２つのコピーを含む単一のＸｐａｎｄｏｍｅｒを合成するための鋳型として使用することができる。
本明細書で論じるように、Ｍ３構築物は、それぞれがナノポア配列決定、すなわち拡張による配列決定（ＳＢＸ）のための標的配列の同じ鎖の２つのコピーを含むＸｐａｎｄｏｍｅｒの合成のための鋳型として機能する。いくつかの実施形態では、鏡像化ライブラリ構築物のＳＢＸを固体支持体上で行い、本明細書に記載の末端キャッピングプロトコルを使用する。図１１Ｃに示されるこの実施形態では、伸長オリゴヌクレオチド１１７０および１１８０の５’末端は、本明細書に記載されるように、クリックケミストリーによって固体支持体１１９０に連結される。これらの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドは、クリック結合を媒介するための５’アジド基を含む。他の実施形態では、１つの伸長オリゴヌクレオチドのみが支持体に連結され、他方の伸長オリゴヌクレオチドはナノポアを貫通するためのリーダー配列を含む。各伸長オリゴヌクレオチドは、Ｍ３鋳型構築物のＹアダプターエレメントの一本鎖部分の１つと特異的にハイブリダイズするように設計される。特定の実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドは、固体支持体とオリゴヌクレオチド配列の５’末端との間に介在する光切断可能エレメントまたは酸切断可能エレメントを含み、基質からの最終的なＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物の光または酸媒介放出を可能にし得る。Ｍ３鋳型構築物１１５０は、伸長オリゴヌクレオチド中の相補的配列とＭ３構築物のＹアダプターの一部のアームとの間の標準的なハイブリダイゼーションによって、固定化された伸長オリゴヌクレオチド１１７０および１１８０にハイブリダイズされる。キャップ分岐構築物１１９５は、Ｍ３構築物にハイブリダイズする。キャップ分岐剤１１９５は、鏡像化ライブラリ構築物１１５０の両方の鎖の５’末端に相補的であり、ハイブリダイズする２つの同一のオリゴヌクレオチド１１９７Ａおよび１１９７Ｂを含む。末端オリゴヌクレオチドアーム１１９７Ａおよび１１９７Ｂはそれぞれ、遊離５’三リン酸基を提供する。キャップ分岐剤構造は、２本の鎖１１９７Ａおよび１１９７Ｂが、化学分岐剤によって連結されている従来のホスホラミダイト化学によって合成され得る。
図１２は、キャップ分岐剤の構造的特徴のさらなる詳細を示す。この実施形態では、キャップ分岐剤１２９５は、分岐剤構造１２２０と、トリアゾール部分（「Ｒ」）を含む末端
オリゴヌクレオチドアーム１２３０Ａおよび１２３０Ｂと、末端キャップ（「ｄｄＣＴＰ」）と、オリゴヌクレオチド（配列番号３）とを含む。キャップ分岐剤は、本明細書ではＰＥＧ６ポリマーによって例示される３’末端部分から開始する標準的なホスホラミダイト化学によって合成される。末端部分の５’末端に対称的な化学分岐剤を添加して、本明細書ではＰＥＧ６ポリマーによって例示される分岐剤スペーサーの並行合成を可能にする。いくつかの実施形態では、スペーサーの長さおよび組成は、特定の用途のために最適化することができる。特定の実施形態では、スペーサーは、Ｃ２、Ｃ６、またはＰＥＧ３のモノマーを含んでもよい。末端オリゴヌクレオチドアーム１２３０Ａおよび１２３０Ｂは、分岐剤アームの５’末端から伸長する。末端オリゴヌクレオチドの配列は、Ｍ３鋳型構築物の５’末端にハイブリダイズするように設計され、その配列はキャッププライマーアダプターによって提供される。いくつかの実施形態において、末端オリゴヌクレオチドは、約１５～約５０ヌクレオチド長であり、１つ以上のメトキシヌクレオチド類似体を含む。末端オリゴヌクレオチドの５’末端は、本明細書中ではｄｄＣＴＰによって例示される末端キャップ構造（ただし、他の核酸塩基のいずれも特定の実施形態では置換され得る）に連結され、これにより、末端キャッピングによる末端オリゴヌクレオチドへの新生Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの結合が可能になる。末端キャッピング方法の詳細は、本明細書において、図７Ａ～図７Ｄを参照して論じられる。末端キャップは、末端キャップによって提供されるアルキン部分と、末端オリゴヌクレオチドによって提供されるアジド部分との間のクリック反応の産物であるトリアゾール部分（「Ｒ」）を介して、末端オリゴヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、キャップ分岐剤は、他のリンカー構造、例えば、末端キャップと末端オリゴヌクレオチドとの間に配置されたスペルミンポリマーを含むように設計され、例えば、立体的柔軟性の増加および末端キャップへの結合を提供する。
引き続き図１１Ｃを参照すると、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成反応が行われ、これは伸長オリゴヌクレオチド１１７０および１１８０の３’末端で開始し、（矢印によって示されるように）同じ方向に進行し、キャップ分岐剤１１９５の末端オリゴヌクレオチド１１９７Ａおよび１１９７Ｂの５’末端で終了し、その上でポリメラーゼが本明細書に記載の末端キャッピング方法に従って完全なＸｐａｎｄｏｍｅｒコピー１１９９Ａおよび１１９９Ｂをキャップ分岐剤に結合する。一実施形態では、第１の伸長オリゴヌクレオチドが光切断性リンカーエレメントを含み、第２の伸長オリゴヌクレオチドが酸不安定性リンカーエレメントを含む。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの酸処理は、同時にＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーを「拘束」から「開」配置１０００に移行し、伸長オリゴヌクレオチド中の酸不安定性リンカーを切断するだろう。次いで、ライブラリ断片の２つの連結したＸｐａｎｄｏｍｅｒ１１９９Ａおよび１１９９Ｂを含む得られた産物を、第２の伸長オリゴヌクレオチドの光切断性リンカーの光分解によって支持体から除去することができる。いくつかの実施形態では、放出された鏡像化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ１０００が、第２の固体支持体に結合した伸長オリゴヌクレオチドの一方に相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする最終精製工程が行われる。
Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを合成するためのＭ１、Ｍ２、およびＭ３鏡像化ライブラリ構築物およびＳＢＸの生成のための反応条件は、試行錯誤によって最適化することができる。いくつかの実施形態では、これらの構築物は、図１３に概説される以下のワークフローによって生成され得る。工程１において、Ｍ１前駆体は、Ｙアダプター、ライブラリインサート、およびＴｒｉｄｅｎｔの連結によって生成される。ＹＡＤ１：ＹＡＤ２：インサート：Ｔｒｉｄｅｎｔのモル比は、特定の条件または用途に最適化することができる。いくつかの実施形態では、最初にアルキン官能化チップ上にＹアダプターを集めることによって、マイクロ流体チップ上にＭ１前駆体を生成することができる。一実施形態では、末端アジド基を提供する第１のＹアダプター鎖は、以下の例示的なプロトコルに従って、クリックケミストリーによって官能化チップに結合される。１）３．０ｍＭ ＴＨＰＴＡ、６．０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウム、１ｍＭ ＣｕＳＯ４、５．０ｍＭ アミノグアニジン
、および１０％ ＤＭＦまたはＤＭＳＯを含む触媒混合物を調製し、１０％ ＤＭＦまたはＤＭＳＯ、２５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１μＭ アジド－Ｙアダプターオリゴヌクレオチド鎖１、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ アミノグアニジン、および６．０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムを含む基質混合物を調製する。２）触媒混合物１１μｌを基質混合物４４μｌに添加し、この反応物 ５０μｌをＣＯＣチップなどのアルキン官能化マイクロ流体チップに添加し、室温で２０分間インキュベートする。３）チップを溶液Ｉ０００２（０．３Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．５％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）３００μｌ、３７℃で５分間洗浄し、次いで緩衝液Ａ．１（０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ６．５、１Ｍ尿素、５％ ＮＭＳおよび２％
ＰＥＧ８０００）９００μｌで洗浄する。クリック結合に続いて、緩衝液Ａ．１中に第２のオリゴヌクレオチド １００ｐｍｏｌを含むハイブリダイゼーション混合物を調製することによって、第２のＹアダプター鎖を基質に結合した第１の鎖にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション混合物を９０℃で１５秒間インキュベートし、次いで７２℃に冷却する。次いで、混合物を予熱したチップに添加し、チップを、サーモサイクラーを用いて３２℃まで５分間冷却する。次いで、チップを緩衝液Ａ．１で洗浄する。次に、ライブラリインサートおよびＴｒｉｄｅｎｔアダプターを、結合したＹアダプターに連結する。インサート断片を、１００ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を含む緩衝液中、９０℃で３分間変性させ、次いで、サーモサイクラーを使用して５分間かけて５０℃まで低下させる。二本鎖インサート ２０ｐｍｏｌ、Ｔｒｉｄｅｎｔアダプター ５０ｐｍｏｌ、３ｍＭ ＡＴＰ、２Ｕ／μｌのＴ４ ＰＮＫ、および２００Ｕ／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む１×連結緩衝液（６６ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴおよび７．５％ ＰＥＧ６０００）中の連結混合物を調製する。連結反応を１６℃で１５分間行い、次いで、反応物を、Ｙアダプターが結合しているチップに加える。チップを１６℃で１５分間インキュベートする。次いで、連結混合物を除去し、５’デアデニラーゼ（５０，０００Ｕ／ｍｌ）３μｌを連結混合物に添加し、連結混合物をチップに戻し、チップを１６℃で１５分間インキュベートする。次いで、チップを緩衝液Ｉ０００２ ４ｍｌで３７℃で５分間洗浄する。次にチップを水で洗浄し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ中４℃で保存することができる。
工程２では、Ｍ１前駆体を伸長してＭ２前駆体を調製する。一実施形態では、１．０Ｘポリメラーゼ緩衝液、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２８Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼ、および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含む伸長反応において、チップ結合Ｍ１ 約２．５～１０ｐｍｏｌが使用される。適切なＤＮＡポリメラーゼは、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼまたはＫＡＰＡ ＨｉＦｉである。チップをサーモサイクラーに入れ、９５℃で１分間、続いて９０から９８℃で１０から４０サイクルの２０秒間、続いて７６℃で６秒間インキュベートする。チップを水で洗浄して過剰な試薬を除去する。次いで、０．０５Ｕ／μｌ～０．８０Ｕ／μｌのプロテイナーゼＫを含む水溶液を水中に添加し、５５℃で５分間、続いて９５℃で５分間インキュベートすることによって、チップをプロテイナーゼＫで処理する。チップを水で洗浄する。
工程３において、Ｍ３鋳型構築物はエキソヌクレアーゼ消化によって生成される。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼ緩衝液中に０．４５Ｕ／μｌのラムダ型エキソヌクレアーゼを含むエキソヌクレアーゼ消化混合物をチップに添加し、３７℃で５分間、続いて７５℃で１０分間インキュベートする。チップを緩衝液１０００２で洗浄した後、水で洗浄し、次いで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓを含有する緩衝液中に保存する。
工程４において、結合したＭ３構築物が、光切断によって放出される。いくつかの実施形態では、チップは、ＵＶ硬化ランプ（例えば、Ｐｈｏｓｅｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＦｉｒｅＦｌｙランプ）を用いて１５秒間、ＵＶ光（例えば、３６５ｎｍ）に曝露される。放出されたＭ３構築物は、チップから液体を吸引することによって回収される。
工程５において、Ｍ３鋳型構築物のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーをＳＢＸ法によって生成する。いくつかの実施形態では、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、工程１に記載されるように、クリックケミストリーを用いて第１の伸長オリゴヌクレオチド（例えば、「Ｅ５２」ＥＯ）が、共有結合したマイクロ流体チップ上で生成される。このＥＯは、本明細書では「捕捉オリゴ」と呼ばれることがある。捕捉オリゴヌクレオチドは、Ｍ３鋳型、第２の伸長オリゴヌクレオチド、およびキャップ分岐剤構造をハイブリダイゼーションによってチップ上に集めるために使用される。捕捉チップを緩衝液Ａ１（０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ６．５、１Ｍ尿素、５％ ＮＭＳ、および２％ ＰＥＧ８０００）で洗浄し、６５℃でインキュベートする。Ｍ３構築物 約５ｐｍｏｌ～約３０ｐｍｏｌ、第２の伸長オリゴヌクレオチド（例えば、「Ｅ６ ＥＯ」；実際の量は、チップに結合したＥ５２捕捉オリゴの量によって決定されるであろう。）約２０ｐｍｏｌ～約８０ｐｍｏｌ、およびキャップ分岐剤
約２０ｐｍｏｌ～８０ｐｍｏｌを含むハイブリダイゼーション混合物を調製する（実際の量は、ＥＯの量とほぼ同じであろう）。ハイブリダイゼーション混合物を９５℃で１５秒間インキュベートし、次いでチップに添加し、６５℃で３０秒間インキュベートし、０．１℃／秒の速度で３７℃まで降下させ、ここで５分間保持する。チップインキュベーション温度は、その場で、ハイブリダイゼーションアダプタプレートを取り付けた標準的なサーモサイクラーによって制御される。
Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成のために、緩衝液Ｐ（０．６ｍＭ ＭｎＣｌ２および０．１８μｇ／μｌ ＤＰＯ４ ＤＮＡポリメラーゼ変異体）を緩衝液Ｘ（ＰＰ－６０．２２ ８０μＭおよび各ＸＮＴＰ ８０μＭ）と混合し、続いて緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．８４、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ６．８８、２０％ ＰＥＧ８Ｋ、５％ＮＭＳ、０．２μｇ／μｌ ＳＳＢ、０．５Ｍベタイン、０．２５Ｍ 尿素、１ｍＭ ＰＥＭ
ＡＺ－８，８、および４ｍＭ ＰＥＭ添加剤）を添加することによって、伸長混合物を調製する。伸長混合物をチップに添加し、２０～４５℃で１５分間～６０分間インキュベートする。チップを緩衝液Ｂ（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＨＰＯ４、５％ Ｔｒｉｔｏｎ、および１０％ ＤＭＦ）で洗浄する。
工程６において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを切断し、０～７５％ＡＣＮに溶出する。一実施形態において、捕捉オリゴヌクレオチドは、光切断可能エレメントを含む。チップからＸｐａｎｄｏｍｅｒを放出するために、チップを１５分間ＵＶ光に曝露する。次いで、チップを３７℃で２分間インキュベートし、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ試料をピペットで除去する。
ナノポア配列決定のために、一方または両方の伸長オリゴヌクレオチドは、ナノポアを通り抜けるＸｐａｎｄｏｍｅｒの貫通を促進するように設計されたリーダー配列を含む。リーダー配列の特定の実施形態のさらなる詳細は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、出願人による米国特許第９，６７０，５２６号「Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ ａ Ｔａｒｇｅｔ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｏｒ Ｓｅｎｓｉｎｇ ｂｙ ａ Ｎａｎｏｐｏｒｅ」に開示されている。一実施形態において、例示的な伸長オリゴヌクレオチドの配列は、以下によって表される。ＲＤ１０（ＰＣ）Ｌ２５Ｚ６［ＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＡＡＣＧＧＡ（配列番号４）］（式中、「Ｒ」は、クリックケミストリーによる官能化固体基質への結合を可能にする５’－アジド基を表す。「Ｄ」は、ポリＰＥＧ６スペーサーを表す。「ＰＣ」は、固体基質からの放出を可能にする光切断性スペーサーを表す。「Ｌ」は、ナノポア転座中にリーダー配列として機能するポリＣ２スペーサーを表す。「Ｚ」は、ポリＣ１２スペーサーを表し、ＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＡＡＣＧＧＡ（配列番号４）は、標的配列にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの伸長プライマーとして機能するオリゴヌクレオチドを表す。他の実施形態では、ＰＣスペーサーは、酸不安定性スペーサー、例えば、［ｄＴ ｐ－エトキシ］［ＤＭＳ（Ｏ）ＭＴ－ＮＨ２－Ｃ６またはグレンアミダイト１０－１９０７］ホスホラミダイトで置き換えられてもよい。伸長オリゴヌクレオチド
に設計される各ホスホラミダイトモノマー（すなわち、「スペーサー」）の数は、可変であり、特定の用途に最適化され得る。鏡像化ライブラリ合成中、リーダー配列は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成を開始する伸長オリゴヌクレオチドの一方または他の実施形態では、両方に含まれ得る。特定の実施形態では、リーダー配列は、基質に共有結合していない第１の伸長オリゴヌクレオチドによって提供され、基質に結合している第２の伸長オリゴヌクレオチドは、リーダー配列を欠く。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの合成およびプロセシングに続いて、第２の伸長オリゴヌクレオチドに結合していない任意の切断産物を洗浄によって基質から除去することができる。基質からのＸｐａｎｄｏｍｅｒの放出後、第１の伸長オリゴヌクレオチドに結合していない切断産物は、リーダー配列を欠き、有利には、配列データを提供するためにナノポアを貫通することができない。
Ｄ．次世代のＹＡＤフリーの鏡像化ライブラリ構築物および方法
本明細書で説明される鏡像化ライブラリのワークフローのいくつかの特徴は、特定の実験的要求に利点を提供するための修正および／または最適化に適している。図１１Ａ～図１１Ｃに示す実施形態では、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ伸長オリゴヌクレオチドの結合部位および固相結合のための官能基は、酵素的連結によってライブラリ断片に連結されるＹアダプターによって提供される。代替的な「次世代」実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドの結合部位は、代わりに、ＰＣＲを介してライブラリ断片に連結されたオリゴヌクレオチドプライマーによって提供される。このアプローチは、標的配列の増幅と、ＹＡＤをライブラリ断片に連結する連結工程の排除との両方を可能にする。プライマー配列をライブラリ断片に組み込んだ後、得られたＰＣＲ産物は、「テール付き」または「タグ付き」ライブラリ断片（あるいは、「タグ付き標的配列」）と呼ばれる。いくつかの実施形態では、固相結合のための官能化末端基は、ＰＣＲ増幅後にライブラリタグと特異的にハイブリダイズするように設計された「捕捉オリゴ」と本明細書で呼ばれるオリゴヌクレオチド配列を含む別個のオリゴヌクレオチド構造によって提供される。一般論として、これらの実施形態は、本明細書では「ＹＡＤフリー」鏡像化ライブラリ構築物と呼ばれる。
ライブラリ断片、すなわち、ＤＮＡ標的配列のＹＡＤフリータグ付けおよび捕捉の一実施形態を図１４に示す。この実施形態では、ライブラリ断片は、プラス鎖（配列番号５）１４１０Ａおよびマイナス鎖（配列番号６）１４１０Ｂを有する二本鎖１００ｍｅｒ１４１０によって例示される。順方向ＰＣＲプライマーおよび逆方向ＰＣＲプライマーは、それらの５’末端で異種配列に連結された標的配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を含むように設計される。一実施形態では、プライマー（配列番号７）１４２０は、ライブラリ断片のプラス鎖１４１０Ａ中の相補的配列に特異的にハイブリダイズする３’オリゴヌクレオチド配列と、タグ付きライブラリ断片の捕捉を可能にするタグをＰＣＲ産物に導入する５’異種配列とを含む。この実施形態では、５’異種配列は「ＵＰ３８」と呼ばれ、捕捉オリゴヌクレオチド構造およびＸｐａｎｄｏｍｅｒ伸長オリゴヌクレオチドの両方に存在する同じ配列である。いくつかの実施形態では、プライマー（配列番号８）１４２５は、標的配列のマイナス鎖１４１０Ｂの相補的配列と特異的にハイブリダイズする３’オリゴヌクレオチド配列と、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成中に組み込まれるキャップアダプター構造の結合部位を提供する５’異種配列と、を含む。図１４Ａは、一本鎖プラス鎖１４１０Ａ（配列番号５）およびマイナス鎖１４１０Ｂ（配列番号６）にハイブリダイズしたＰＣＲプライマーを示す。ライブラリ断片のＰＣＲ増幅により、ＰＣＲプライマーの異種配列テールによって配列が決定される第１のタグ（配列番号１１）１４３８および第２のタグ（配列番号９のヌクレオチド１～２２）１４３９を含むタグ付き断片１４３０（プラス鎖（配列番号９）１４３０Ａおよびマイナス鎖（配列番号１０）１４３０Ｂ）が生成される。プライマー１４２０および１４２５を設計する場合、当技術分野で十分に確立されている標準的なプライマー設計の原則に従う。
タグ付けされたライブラリ断片の捕捉のために、捕捉オリゴヌクレオチド構造を、例えば、本明細書に記載のクリックケミストリーによって固体支持体に共有結合させる。一般化捕捉オリゴヌクレオチド構造の一実施形態は、以下のように表すことができる。［アジド］ＤｎＬｎＺｎ（ＳＣＬ）（ＣＯ）、ここで、アジドは、官能化固体支持体（例えば、アジド基または二重ビオチン基で官能化されている）への共有結合（すなわち、固定化）のための手段を提供する。Ｄは、ＰＥＧ６を表し、Ｌは、Ｃ２を表し、Ｚは、Ｃ６を表し、Ｄ、Ｌ、およびＺのポリマーは、可動性リンカー構造を形成することができる。（ＳＬＣ）は、選択的に切断可能なリンカーを表し、これは、この実施形態では、ウラシル残基の多量体である。（ＣＯ）は、捕捉オリゴのオリゴヌクレオチド配列である。この実施形態では、ＣＯ配列は、ＵＰ３８異種配列（配列番号１１）と同じ配列であり、ライブラリ断片のプラス鎖のタグ配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、可動性リンカーは、ＰＥＧ６モノマー、例えば、Ｄ１６のみから形成され、本明細書で論じるように、ビーズまたはマイクロ流体チップ上でＰＣＲ反応を行う場合に利点を提供する。
タグ付けされたライブラリ断片を捕捉するために、第２のＰＣＲ反応が実施され、第２のＰＣＲ反応は、捕捉オリゴヌクレオチドを提供する固体支持体上で実施される。ライブラリ断片の捕捉を簡略化して図１４Ｂに示す。ここで、捕捉オリゴヌクレオチド構造１４４０は、固体支持体１４４５上に固定化されている。捕捉オリゴヌクレオチド構造は、ライブラリ断片のマイナス鎖１４３０Ｂ中のタグ（配列番号１１）１４３８の配列と同一の３’オリゴヌクレオチド配列を含む。二本鎖ライブラリ断片が変性されると、プラス鎖１４３０Ａは、捕捉オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。捕捉オリゴヌクレオチドは、ここでは１４３０Ｃ（配列番号１０）で表されるプラス鎖１４３０Ａの相補体のコピーを合成するためのプライマーを提供する。適切な数のＰＣＲサイクルは、固体支持体上に固定化された二本鎖ライブラリ断片１４５０を生成する。
ライブラリ断片の溶液中でのタグ付けの後、タグ付けされたアンプリコン産物のオンチップ捕捉のための反応条件は、試行錯誤によって最適化することができる。一実施形態では、溶液中ＰＣＲタグ付け反応を以下のように実行することができる。１～１５ａｍｏｌの合成鋳型ＤＮＡ（または他の実施形態では、剪断天然ライブラリＤＮＡ）、２μＭの各プライマー、３５０μＭのｄＮＴＰ、１×ＫＯＤ緩衝液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ ＮＨ４ＳＯ４、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）、０．０５Ｕ／μｌ ＫＯＤポリメラーゼを含む反応混合物を調製する。反応を９５℃で２分間、続いて１０秒間は９５℃／８秒間は６８℃／８秒間は７２℃の３０サイクルでサイクルし、７２℃で１回の３’伸長を行う。約２５ｐｍｏｌのタグ付けされたアンプリコンの最終収率を、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（ＱＩＡＧＥＮから入手可能）によって精製することができる。
一実施形態では、捕捉チップは、以下のように調製することができる。１０％ ＤＭＦ、３ｍＭ ＴＨＰＴＡ、２５ｍＭ Ｎａ３ＰＯ４、５ｍＭ アミノグアニジン、６ｍＭ ＮａＡｓｃおよび１ｍＭ ＣｕＳＯ４を含むクリック反応によって、１００ｐｍｏｌのＵＰ３８捕捉オリゴヌクレオチドをアルキン官能化チップに共有結合させる。反応を室温で２０分間行い、次いで、チップを洗浄し、続いてＢＳＡ不動態化する（ＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍｌの非アセチル化ＢＳＡを室温で約１時間）。
一実施形態では、オンチップＰＣＲ反応を以下のように実行することができる。約１００ｐｍｏｌに結合したＵＰ３８捕捉オリゴヌクレオチドを含むチップに、約１×１０６コピーのタグ付けされたアンプリコン産物、２００ｐｍｏｌのＵＰ３９プライマーおよび５ｐｍｏｌのＵＰ３８プライマーを添加する。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨＳ Ｕ＋、１Ｘ ＲｅａｄｙＭｉｘ緩衝液（２．５ｍＭ Ｍｇ）、０．１μｇ／ｍｌ非アセチル化ＢＳＡ、１Ｍ
ベタイン、２％ ＤＭＳＯ、１％ ＰＥＧ、および０．５％ Ｔｗｅｅｎを含むＰＣＲ
混合物を添加する。ＰＣＲサイクリング条件は以下の通りである。９８℃で２分間、１分間で１００℃／１２秒間で４８℃／３０秒間で６７℃／２分間で８０℃を３５サイクル、続いて８０℃で最後の２分間；次いで、チップを、１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を含有する緩衝液中で洗浄する。
固体支持体上に捕捉されたタグ付けされたライブラリ断片は、本明細書中で論じられるように、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための鋳型を提供するＭ３鏡像化ライブラリ鋳型構築物の生成のための基質を提供する。Ｍ３およびＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物のためのいくつかの代替ワークフローが本発明によって企図される。以下は、代替の「次世代」鏡像化ライブラリワークフローの特定の実施形態の非限定的な説明である。
バイスタンダー伸長オリゴヌクレオチドを利用する単一支持体鏡像化ライブラリ作製。
この実施形態では、Ｍ３鏡像化ライブラリ鋳型構築物とＸｐａｎｄｏｍｅｒの両方が、同じ固体支持体、例えば、ビーズまたはマイクロ流体チップ上で合成される。Ｍ３生成のための捕捉オリゴヌクレオチドおよびＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための伸長オリゴヌクレオチドの両方が、支持体上に固定化される。いくつかの実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲベースの捕捉中にライブラリ断片とのハイブリダイゼーションを防ぐヘアピン構造を形成するように設計されており、したがって本明細書では「バイスタンダー」オリゴヌクレオチドと呼ばれる。バイスタンダーオリゴヌクレオチドは、以下でさらに論じるように、タグ付けされたライブラリ断片の捕捉後に、機能的伸長オリゴヌクレオチドに選択的に変換され得る。
図１５Ａおよび１５Ｂは、バイスタンダー伸長オリゴヌクレオチドを用いた単一支持体合成の基本的特徴を示す。図１５Ａでは、タグ付けされたライブラリ断片１５１０が、固体支持体１５０５上に固定化されて示されている。ライブラリ断片のＰＣＲに基づくタグ付けおよび捕捉オリゴヌクレオチド構造１５１５による固体支持体への連結は、本明細書中および図１４を参照して記載されるように行われる。一実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチド構造は、以下の配列を有し得る。５’［アジド］Ｄ１６（ＵＵＵＵＵ）（ＵＰ３８）３’（式中、アジド基は固体支持体への結合を媒介し、「Ｄ」はＰＥＧ６リンカーを表し、「Ｕ」はデオキシウラシルを表し、「ＵＰ３８」は捕捉オリゴヌクレオチド配列を表す）。Ｕ５配列は、例えば、ＮＥＢから入手可能なＵＳＥＲ（登録商標）（Ｕｒａｃｉｌ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）によって選択的に切断可能であり、これは、ウラシル残基の位置に単一のヌクレオチドギャップを生成し、得られた脱塩基部位を切断する。バイスタンダー伸長オリゴヌクレオチド１５２０Ａおよび１５２０Ｂも支持体上に固定化される。バイスタンダーオリゴヌクレオチドの配列は、ＰＣＲ中にライブラリ断片とのハイブリダイゼーションを防ぐ二本鎖ヘアピン構造を形成するように設計される。一実施形態では、バイスタンダーオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有し得る。５’［アジド］ＤｎＬｎＺｎ［ＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＡＡＣＧＧＡＧＡＵＵＴＣＣＧＴＴＣＧ（配列番号１２）］Ｘ ３’であり、「Ｄ」、「Ｌ」、および「Ｚ」部分は、本明細書でさらに論じるように、ＳＢＸ中に特定の機能を果たすポリマーを形成する。一方、３’末端ＴＣＣＧＴＴＣＧ配列は、内部ＣＧＡＡＣＧＧＡ配列と塩基対に折り畳まれ、したがって介在するＧＡＵＵ配列が一本鎖のままであるヘアピン構造を形成する。一本鎖ウラシル含有配列は、ＵＳＥＲ（登録商標）で切断することができる。バイスタンダーオリゴヌクレオチドの末端「Ｘ」部分は、ＰＣＲ中にオリゴヌクレオチドからの伸長を妨げる「ブロッカー」（例えば、ＰＥＧまたはＣ３スペーサーブロッカー）を表す。
Ｍ１前駆体構築物１５３０を形成するために、三つ又アダプター１５２５を固定化ライブラリ断片に連結する。いくつかの実施形態では、これは、最初にライブラリ断片の遊離３’末端に「Ａ」テールを付加することによって達成されてよく、これは、Ｔｒｉｄｅｎｔ
構築物によって提供される遊離３’「Ｔ」と塩基対を形成する。例示的なＡ－テーリング反応は、１０ｐｍｏｌ ＰＣＲアンプリコン、１×ＭｏｌＴａｑ緩衝液、１ｍＭ ｄＡＴＰ、および２．５Ｕ ＭｏｌＴａｑを含み、７２℃で３０分間実行することができる。例示的な連結反応は、４０ｐｍｏｌの三つ又構築物、１×連結緩衝液、３ｍＭ ＡＴＰ、２Ｕ／μｌのＴ４ ＰＮＫ、および３０Ｕ／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを含み、室温で２０分間実行し、続いて１５０Ｕの５’デアデニラーゼを添加し、１０分間インキュベートすることができる。次いで、Ｍ１前駆体を伸長させて、本明細書に記載されるように、および図１１Ｂを参照して、ＤＮＡポリメラーゼを有する三本鎖Ｍ２構築物を形成する。
図１５Ｂは、バイスタンダー伸長オリゴヌクレオチドおよび文字「Ｕ」によって指定される捕捉オリゴヌクレオチド中の選択的に切断可能なウラシル部分を有するＭ２前駆体構築物１５４０を示す。Ｍ３鋳型構築物１５５０を作製するために、Ｍ２前駆体をＵＳＥＲ（登録商標）で切断してウラシル部分にニックを入れる。これにより、１）伸長オリゴヌクレオチド中のヘアピン構造の切断、および２）捕捉オリゴヌクレオチドの切断が起こり、Ｍ２構築物の中間鎖に遊離５’末端が生成する。同時に、Ｍ２前駆体をエキソヌクレアーゼ処理に供し、１）バイスタンダーオリゴヌクレオチドの末端ＴＣＣＧＴＴＧＣ配列を消化して伸長オリゴヌクレオチド配列を露出させ、２）Ｍ２複合体の中間鎖を５’末端から３’末端まで消化する。次いで、露出した伸長オリゴヌクレオチドは、Ｍ３鋳型構築物の３’末端によって提供される相補的配列と特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ニッキングおよびエキソヌクレアーゼ消化反応は、１ｘ ラムダエキソ緩衝液（６７ｍＭ グリシン－ＫＯＨ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、２０％ ＰＥＧ８０００、０．１５Ｕ／μｌ ＵＳＥＲ（登録商標）、および０．４Ｕ／μｌラムダエキソヌクレアーゼを含む反応混合物でＭ２前駆体を３７℃で１５分間処理することによって実施され得る。ニッキングおよびエキソヌクレアーゼ消化反応の後、その後のホスファターゼ反応を行って、バイスタンダーオリゴヌクレオチドのＵＳＥＲ（登録商標）切断によって残った３’リン酸を除去して、それをＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための官能性伸長オリゴヌクレオチドにする。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ反応は、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（５０ｍＭ 酢酸カリウム、２０ｍＭ 酢酸トリス、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ）、０．１Ｕ／μＬのＱｕｉｃｋウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）を含む反応混合物を用いて３７℃で５分間行い、続いて８０℃で２分間熱不活性化してもよい。
Ｍ３構築物は、本明細書中および図１１Ｃを参照して記載されるように実施され得る、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための鋳型を提供する。伸長オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、本開示全体を通して記載されるように、支持体からの選択的放出およびナノポア転座のためのさらなる特徴を提供し得る。
オンカード２ゾーン化鏡像化ライブラリ生成
この実施形態では、マイクロ流体チップ、すなわちカードは、ライブラリ断片の捕捉およびＭ３鋳型構築物の生成のための第１のゾーンと、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための第２のゾーンと、を含む、鏡像化ライブラリのワークフローのための２つの物理的に別個のゾーンを有するように設計される。このようにワークフローを２つのゾーンに分離することは、例えば、バイスタンダー伸長オリゴヌクレオチドの必要性をなくすなど、いくつかの利点を提供する。
２ゾーンカード構成の一実施形態を図１６Ａに示す。ここで、カード１６００は、それぞれ「ゾーン１」および「ゾーン２」と呼ばれる物理的に別個の区画１６１０および１６２０に分けられる。ゾーン１１６１０は、Ｍ３鋳型構築物の生成専用であり、ゾーン２１６２０は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成専用である。本明細書に記載のＵＰ３８プライマーなど
の捕捉オリゴヌクレオチド構造は、例えば、クリックケミストリーによってゾーン１の表面に固定化される。同様にして、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための伸長オリゴヌクレオチドをゾーン２の表面に固定化する。いくつかの実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドは、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物の選択的放出のための光切断可能、酸切断可能、または酵素的に切断可能なエレメントを含み得る。Ｍ３鋳型構築物の生成は、本明細書に記載のゾーン１で行われる。簡潔には、タグ付けされたライブラリ断片およびＰＣＲ混合物をゾーン１に添加し、オンチップＰＣＲを実施して、タグ付けされたライブラリ断片を捕捉オリゴヌクレオチドに連結する。Ｍ１前駆体は、ライブラリ断片をＡ－テーリングし、続いて三つ又アダプターを連結することによって形成される。Ｔｒｉｄｅｎｔアダプターは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて、Ｍ２前駆体を生成する。Ｍ２前駆体構築物をウラシル切断に供し、続いてエキソヌクレアーゼ消化に供して捕捉オリゴヌクレオチドを切断し、中間鎖を除去し、それによりＭ３鋳型構築物１６１５を生成する。
図１６Ｂは、カードのゾーン１からゾーン２へのＭ３鋳型前駆体の転移を示し、その後、それは伸長オリゴヌクレオチド１６２５Ａおよび１６２５Ｂに特異的にハイブリダイズする。キャップアダプター構造１６３０は、Ｍ３鋳型構築物に特異的にハイブリダイズし、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成は、矢印によって示される方向に伸長オリゴヌクレオチドから開始される。キャップアダプターの構造およびＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための反応条件の詳細は、本開示を通して記載される。
別の実施形態では、ゾーン１に結合した捕捉オリゴヌクレオチドは、ウラシル残基の代わりに光切断可能エレメントを含むように設計される。この実施形態では、Ｍ２前駆体をＵＶ光で処理すると、捕捉オリゴヌクレオチドが切断され、エキソヌクレアーゼ消化のための５’基質が提供されて、Ｍ３鋳型構築物が生成される。光切断の間、ゾーン２区画は、ＵＶ遮断界面によって露出から保護され得る。光切断可能エレメントを含む例示的な捕捉オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有し得る。［アジド］Ｄ１０＿Ｌ３０＿Ｚ６＿ＰＣ＿ＵＰ０３８、式中、Ｄ、Ｌ、およびＺ部分のポリマー、例えば、「スペーサー」は、可動性リンカーを形成し、「ＰＣ」は、光切断可能エレメントを表し、ＵＰ０３８は、ライブラリ断片のタグ配列とハイブリダイズするように設計された、配列５’ＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＡＡＣＧＧＡＧＡＣＴ ３’（配列番号１３）を有するオリゴヌクレオチドを表す。
ビーズベースの鏡像化ライブラリ生成
この実施形態は、Ｍ３鋳型構築物が、ビーズベースの支持体上で実施される一連の工程によって生成されるワークフローを記載する。この実施形態では、図４Ａを参照して論じたように、様々な構築物をストレプトアビジン－ビオチン結合によってビーズに結合させる。ビーズは、固体基質として特定の利点を提供し、例えば、それらはＰＣＲ条件に適しており、非常にスケーラブルであり、したがって他の基質よりも高い産物収率を提供する。
ビーズベースワークフローの一実施形態を図１７に要約する。有利には、ビーズを工程間で洗浄して過剰な試薬を除去することができる。工程１では、本明細書中および図１４Ａを参照して記載されるように、ライブラリ断片を溶液中ＰＣＲによってタグ付けする。工程２では、オンビーズＰＣＲを実施して、捕捉オリゴヌクレオチド上にタグ付けされたライブラリ断片を生成する。この実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、ＳＡビーズに結合するためのビオチン部分を含む。任意の適切なＳＡビーズ基質、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅＣ１ ＳＡを使用することができる。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｕｒａｃｉｌ＋ポリメラーゼを使用する３５サイクルＰＣＲ反応は、最大１０６コピーの入力から最大１～２０ｐｍｏｌのビーズ結合アンプリコンを生成する。工程２に続いて、ビーズをプロテイ
ナーゼＫで５５℃で５分間処理し、次いでＰＣＲ後洗浄（１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で洗浄する。別の実施形態では、ビオチン化捕捉オリゴヌクレオチドを使用して溶液中ＰＣＲを行い、続いてスピンカラムに基づくＰＣＲ精製を行うことができる。次いで、精製ビオチン化アンプリコンをｔ０ＳＡビーズに結合させることができる。工程３において、３’Ａ「テール」をライブラリ断片に追加し、続いて５’Ｔオーバーハングを含むＴｒｉｄｅｎｔアダプターを連結する。例示的なＡ－テーリング反応は、２．５ＵのＭｏｌＴａｑ酵素および１ｍＭのｄＡＴＰを含み、６５℃で３０分間インキュベートされる。例示的な連結反応には、Ｔｒｉｄｅｎｔアダプター構築物（「Ｔ」オーバーハングを有する）、３０Ｕ／μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、２Ｕ／μｌ Ｔ４ ＰＮＫ、および３Ｕ／μｌ ５’脱アデニラーゼが含まれ、室温で２０分間インキュベートされる。工程４において、Ｔｒｉｄｅｎｔアダプターを伸長させてＭ２前駆体を生成させる。例示的な伸長反応は、Ｒｏｃｈｅから市販されている１×ＲｅａｄｙＭｉｘ中のＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｕ＋ポリメラーゼを含む。工程４に続いて、ビーズを再びプロテイナーゼＫで処理し、洗浄する。工程５において、Ｍ３鋳型構築物は、Ｍ２前駆体中のウラシル部分をニッキングして構築物の中間鎖に遊離５’末端を生成し、続いてこの鎖をエキソヌクレアーゼ消化することによって生成される。例示的なニッキング／消化反応は、０．１Ｕ／μｌのＵＳＥＲ（登録商標）および０．３Ｕ／μｌのラムダエキソヌクレアーゼを含み、３７℃で１５分間インキュベートされる。次いで、ビーズを７５℃で１０分間インキュベートすることによって、エキソヌクレアーゼを不活性化することができる。工程６において、遊離Ｍ３鋳型前駆体およびキャップアダプター構築物を、共有結合した伸長オリゴヌクレオチドを含むマイクロ流体チップに添加する。Ｍ３構築物は、伸長オリゴヌクレオチドおよびキャップアダプターに特異的にハイブリダイズする。工程７では、本開示全体を通して記載されるように、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成およびプロセシング反応を行う。最終的なＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物は、光切断によってチップから放出され得る。代替の実施形態では、工程６および７は、ビーズベースの支持体上で実行することもできる。
分岐伸長オリゴヌクレオチドを用いた固体状態のＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成
本明細書で論じられるように、本発明者らによって開発された拡張による配列決定（ＳＢＸ）プロトコルは、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成、プロセシング、およびナノポア転座の間に固有の機能を果たすいくつかの特徴を含むＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための伸長オリゴヌクレオチド（ＥＯ）を利用する。例えば、特定の実施形態では、ＥＯの５’末端は、ナノポアを介して最終的なＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物のスレッド化を開始する「リーダー」配列を提供する。リーダー配列は、Ｃ２のポリマー（本明細書では「Ｌ」として表される）、例えば、Ｌ２５を含み得る。いくつかの状況では、全長コピーのみがナノポアを貫通する鏡像化されたＸｐａｎｄｏｍｅｒの集団を生成し、配列情報を生成することが望ましいであろう。この目的を達成するために、本発明者らは、化学分岐剤によって連結された第１および第２の伸長オリゴヌクレオチドを含む分岐伸長オリゴヌクレオチドを設計した。この実施形態では、ＥＯのうちの１つのみがリーダー配列を含み、各ＥＯは固有の選択的に切断可能なエレメントを含む。分岐ＥＯの一実施形態を図１８に示す。
図１８は、分岐剤１８１５によって連結された第１のＥＯ１８１０および第２のＥＯ１８２０を含む分岐ＥＯ１８００を示す。分岐ＥＯ１８００は、非対称化学分岐剤を使用した従来のホスホラミダイト化学によって合成することができる。この実施形態では、第１のＥＯ１８１０のみが、「Ｌ」単位のポリマー（「Ｌ」は、Ｃ２スペーサーを表す）によって表されるリーダー配列を含む。同様に、第１のＥＯのみが「Ｚ」単位のポリマーを含む（「Ｚ」はＣ１２スペーサーを表す）。Ｚ単位のポリマーはまた、ナノポア転座において役割を果たす。この実施形態では、第１のＥＯは、例えばＵＳＥＲ（登録商標）を介したＥＯの選択的切断を可能にするウラシル（「Ｕ」）残基のポリマーを含み、第２のＥＯは
、ＵＶ媒介切断のための光切断可能エレメント（「ＰＣ－スペーサー」）を含む。各ＥＯの３’オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１４）の配列は同じであり、Ｍ３鋳型構築物とハイブリダイズするように設計されている。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、１つ以上の２’－ＯＭｅ塩基類似体を使用して合成される。本発明者らは、有利には、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成に使用されるＤＰＯ４ポリメラーゼの変異体が、基質として２’－ＯＭｅ類似体を利用することができることを見出した。分岐ＥＯは、基質へのクリック結合のための５’末端アジド基を含む。この例示的な実施形態に示されるＬ、Ｚ、Ｄ、およびＵポリマーの長さは、限定することを意図するものではない。本発明は、様々な適切なポリマー長および分岐ＥＯ構造を企図すると理解される。
図１９Ａおよび図１９Ｂは、分岐ＥＯがどのようにしてナノポア配列決定のための全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの集団の生成および単離を可能にするかを示す。工程１において、Ｍ３鋳型構築物１９１０を、支持体１９３０に結合した分岐ＥＯ１９２０にハイブリダイズさせる。分岐構造の一方のＥＯのみがリーダー配列１９２５を含む。工程２において、キャップアダプター構造１９４０をＭ３鋳型構築物にハイブリダイズさせる。工程３において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒコピー１９５０Ａおよび１９５０Ｂは、オリゴヌクレオチドプライマー１９２７Ａおよび１９２７Ｂからの伸長によって合成される。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの３’末端は、本明細書中に記載されるように、末端キャッピングによってキャッププライマー構築物の遊離末端に連結される。工程４において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、第１の伸長オリゴヌクレオチドを選択的に切断し、リーダー配列１９２５を露出させるＵＳＥＲ（登録商標）処理に供される。工程５において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、切断され、「拘束された」配置から「伸長した」配置に移行するように処理される。この工程では、不完全なまたは切断されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ副産物を洗い流すことができる。工程６において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、第２の伸長オリゴヌクレオチドの光切断によって基質から放出される。有利には、全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ１９５０のみが、リーダー配列１９２５を含み、ナノポアを貫通して配列情報を提供する。
特許文献および非特許文献を含む本明細書に開示される全ての文献は、それぞれが個別に組み込まれているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定することを意図するものではないことを理解するべきである。本明細書で具体的に定義されない限り、本明細書で使用される用語は、関連技術で知られているその従来の意味を与えられるべきであることをさらに理解されたい。
本明細書全体を通して「一実施形態」または「実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して様々な場所での「一実施形態において」または「実施形態において」という句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指すとは限らない。さらにまた、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせられることができる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容および文脈が、明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象、すなわち１つ以上を含む。また、接続的用語「および（ａｎｄ）」および「または（ｏｒ）」は、一般に、内容および文脈が場合によって包括性または排他性を明確に指示しない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を含むために最も広い意味で用いられることに留意されたい。したがって、代替形態（例えば、「または」）の使用は、代替形態のいずれか、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。さらに、本明細書で「および／または」と記載されている場合の「および」および「また
は」の構成は、全ての関連する項目またはアイデアを含む実施形態、および全てより少ない関連する項目またはアイデアを含む１つ以上の他の代替実施形態を包含することを意図している。
文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、明細書および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などのその同義語および変形、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、オープンで包括的な意味、例えば、「含むが、限定されない」と解釈されるべきである。「本質的に、」という用語は、特定の材料もしくは工程、または特許請求される発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに特許請求の範囲を限定する。
略語「例えば、（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、非限定的な例を示すために本明細書で使用される。したがって、略語「例えば、（ｅ．ｇ．）」は、用語「例えば、（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数への言及を含み、用語「Ｘおよび／またはＹ」は、「Ｘ」もしくは「Ｙ」または「Ｘ」と「Ｙ」の両方を意味し、名詞に続く文字「ｓ」は、その名詞の複数形と単数形の両方を示すことも理解されたい。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載されている場合、本発明は、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーおよびメンバーの任意のサブグループに関しても包含し、それによって記載されることが意図され、当業者であれば認識するであろうし、出願人は、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの任意のサブグループを具体的に指すように、本出願または特許請求の範囲を修正する権利を留保する。
この文書内で使用される任意の見出しは、読者によるその検討を促進するために利用されているにすぎず、本発明または特許請求の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。したがって、本明細書で提供される見出しおよび開示の要約は、便宜上のものであり、実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。
ある範囲の値が本明細書で提供される場合、文脈が別段明確に示さない限り、その範囲の上限と下限との間における、下限の単位の１０分の１までの、各介在値、および、その記載された範囲内の任意の他の記載値または介在値は、本発明に包含されることと理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限が、より小さい範囲に独立して含まれ得ることも、記載された範囲内のいずれかの特に除外された限界に従うことを条件として、本開示に包含される。記載された範囲が制限の一方または双方を含む場合は、包含された制限の一方または双方を除いた範囲もまた、本発明に含まれる。
例えば、本明細書で提供される任意の濃度範囲、割合範囲、比率範囲、または整数範囲は、特に記載がない限り、列挙された範囲内のあらゆる整数、および適切な場合、それらの分数（整数の１０分の１および１００分の１など）の値を含むと理解すべきである。また、ポリマーサブユニット、サイズ、または厚さなどの任意の物理的特徴に関する本明細書に列挙された任意の数の範囲は、特に明記しない限り、列挙された範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特に明記しない限り、示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。
本明細書中で言及されるおよび／または出願データシートにおいてリスト化される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。そのような文献は、例えば、本明細書に記載された発明に関連して使用され得る刊行物に記載された材料および方法
論を説明および開示する目的で、参照により組み込まれ得る。上記および本文全体で説明されている刊行物は、本出願の出願日より前の開示のためにのみ提供されている。本明細書中のいかなるものも、本開示が先行発明によってそのような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。
本明細書で参照または言及される全ての特許、出版物、科学論文、ウェブサイト、ならびに他の文書および資料は、本発明が関係する当業者の技術レベルを示しており、そのような参照された各文書および資料は、参照によりその全体が個別に組み込まれているか、またはその全体が、本明細書に記載されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。出願人は、そのような特許、出版物、科学論文、ウェブサイト、電子的に利用可能な情報、および他の参照される資料または文書からのありとあらゆる資料および情報を本明細書に物理的に組み込む権利を留保する。
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲と共に全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
さらに、この特許の記述の部分は、全ての特許請求の範囲を含む。さらに、全ての元の特許請求の範囲ならびに任意のおよび全ての優先権書類からの全ての特許請求の範囲を含む全ての特許請求の範囲は、参照によりその全体が本明細書の明細書の明細書部分に組み込まれ、出願人は、そのような特許請求の範囲のいずれかおよび全てを明細書または本出願の他の部分に物理的に組み込む権利を留保する。したがって、例えば、特許は、いかなる状況下でも、請求項の正確な文言が特許の明細書の部分のｈａｅｃ ｖｅｒｂａに記載されていないという主張に対して、請求項の明細書を提供していないと解釈されることはない。
特許請求の範囲は、法律に従って解釈される。しかしながら、請求項またはその一部の解釈が容易または困難であると主張または認識されているにもかかわらず、いかなる状況下でも、本特許につながる出願または出願の遂行中の請求項またはその一部の調整または修正は、先行技術の一部を形成しないそのありとあらゆる等価物に対する権利を放棄したと解釈されてはならない。
他の非限定的な実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。特許は、本明細書に具体的および／または明示的に開示された特定の例または非限定的な実施形態または方法に限定されると解釈されてはならない。いかなる状況下においても、本特許は、いかなる審査官または特許商標庁の他の役人もしくは従業員によってなされた陳述によっても限定されると解釈されてはならない。ただし、そのような陳述が具体的に、かつ、出願人による応答書面において明示的に採用された資格または留保がない場合を除く。
本発明は、本明細書において広く一般的に記載されている。一般的な開示に含まれるより狭い種および亜属の群のそれぞれも、本発明の一部を形成する。これは、切除された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の主題を除去するという条件または否定的限定を伴う本発明の一般的な説明を含む。
実施例１
固体Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成－マイクロ流体チップへのオリゴヌクレオチドの伸長直接コンジュゲーション
この実施例は、ＸＮＴＰヌクレオチド類似体から構成される一本鎖ポリヌクレオチド鋳型の拡張可能なコピーであり、改善されたナノポア配列決定のための固有の特徴を有するＸｐａｎｄｏｍｅｒの固体合成を記載する。チップへの伸長オリゴヌクレオチド（「Ｅ－オリゴ」）の共有結合によって官能化されたマイクロ流体チップ基質上で、固体Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成を行った。ＸＮＴＰによる結合Ｅ－オリゴのポリメラーゼ媒介伸長は、チップに結合したままであり、効率的かつ制御された方法で洗浄、処理、および放出され得るＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を生成する。
この実験で利用されたＥ－オリゴ（「Ｅ５２ ＳＩＭＡ ＰＣアジド」）は、以下の特徴を含んでいた。ＰＥＧ－６モノマーのポリマーと、それに続く５’アジド基、光切断性スペーサー、「リーダー」ポリマー配列、「コンセントレータ」ポリマー配列、蛍光標識ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドプライマー。リーダーポリマーおよびコンセントレータポリマーは、例えば、ナノポアセンサを介したＸｐａｎｄｏｍｅｒ転座の効率を改善するように機能し、「Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ ａ ｔａｒｇｅｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｏｒ ｓｅｎｓｉｎｇ ｂｙ ａ ｎａｎｏｐｏｒｅ」と題された出願人による米国特許第９，６７０，５２６号にさらに詳細に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ａ．チップの機能化
Ｚｅｏｎｏｒ（シクロオレフィン熱可塑性ポリマー）から製造された市販の連続フローＰＣＲチップをこの実験における固体支持体として使用した。本明細書に記載の光抽象化プロトコルによる直接コンジュゲーションを使用して、チップをアルキン部分で官能化した。簡単に説明すると、チップを３５０μＬの８０％ ＤＭＳでプライミングした。次いで、８０％ ＤＭＳＯ中の６０μＬの１０ｍＭプロパルギルマレイミドを加え、チップを２０Ｗ ＵＶランプ下で２０分間インキュベートした。次いで、チップを８０％ ＤＭＳＯ
３００μＬ、１００％ ＤＭＦ ３００μＬ、水３００μＬ、３００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４ ３００μＬ、１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、および０．５％ ＳＤＳの溶液で連続的に洗浄し、３７℃で５分間インキュベートした。チップを最終的に水３００μＬで洗浄し、続いて３×ＰＢＳ ３００μＬで洗浄した。
Ｂ．クリック反応
クリック反応のための溶液を以下のように調製した：１）水５．０μＬ、１００ｍＭ ＴＨＰＴＡ １．５μＬ、１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム １．５μＬ、１０ｍＭ ＣｕＳＯ４ ０．５μＬ、１００ｍＭアミノグアニジン ０．５μＬ、および１００％ ＤＭＦ １．０μＬを混合することによって触媒混合物を調製し、室温で５～１５分間インキュベートした。２）水２９．２２μＬ、１００％ ＤＭＦ ４．００μＬ、１０００ｍＭリン酸ナトリウム １．２５μＬ、ｐＨ７．０、２５．６μＭ伸長オリゴヌクレオチド（２０ｐｍｏｌのＥ５２ ＳＩＭＡ ＰＣアジド）０．７８μＬ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２ １．２５μＬ、１００ｍＭアミノグアニジン ２．０μＬ、および１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム １．５μＬを混合することによって、基質混合物を調製した。３）基質混合物を触媒混合物に添加し、ボルテックスした。官能化チップを水３００μＬで洗浄し、クリック反応混合物５０μＬを添加し、続いて室温で２０分間インキュベートした。
Ｃ．伸長反応
伸長反応には、Ｅ－オリゴに対する２０ｐｍｏｌ：２０ｐｍｏｌのＤＮＡ鋳型の比を使用した。鋳型は、ＨＩＶ２ゲノムに由来する一本鎖１００ｍｅｒ配列であった。Ｅ－オリゴ
プライマーの配列は、５’ＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＡＡＣＧＧＡ ３’（配列番号４）であった。一本鎖ＤＮＡ鋳型分子を、２０ｐｍｏｌ鋳型をチップと共に３７℃で５分間インキュベートし、続いてＭＥＢ緩衝液 ３００μＬで洗浄することによって、支持体に結合したＥ－オリゴにハイブリダイズさせた。
伸長反応には以下の試薬が含まれていた。４ｎｍｏｌ ＸＮＴＰ、０．０８ｍＭ ポリリン酸塩、０．６ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．５Ｍ ベタイン、０．２５Ｍ 尿素、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）１０μｇ、ＤＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｃ４７６０）９μｇ、１．４ｍＭ ＰＥＭコンボ（ＡＺ８－８およびＡＺ４３－４３）。最終反応体積を５％ ＮＭＳで５０μＬにし、伸長を４２℃で行った。
伸長後、チップを処理および洗浄して伸長試薬を除去し、結合したＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を光切断（Ｆｉｒｅｆｌｙ ＵＶ硬化ランプによる１５分間の処理）によってチップから放出し、切断したＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物が、４０％アセトニトリル ６０μＬで、チップから溶出した。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物を、１×ＴＡＥ緩衝液を含む２．５％ Ｎｕｓｉｅｖｅゲル中で１レーンあたり約約０．７５ｐｍｏｌの産物を泳動することによって、ゲル電気泳動によって分析した。代表的なゲルを図２０に示し、固体Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成の産物をレーン３に示し、全長産物を矢印で示す。参考のために、同一の鋳型を使用して溶液中で行われたＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成反応の産物をレーン１に示す。レーン３で観察されたバンドの狭さは、固体Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成が、部分的または切断型産物の減少を伴って、分布を改善し得ることを示唆している（レーン１の不鮮明なバンドの見かけのより大きなサイズは、溶液ベースの伸長反応で使用されるＥ－オリゴの組成の違いを反映している）。レーン２は、使用した鋳型が、Ｅ－オリゴにハイブリダイズしない陰性対照であり、レーン４は、異なる反応条件下で行われた固体伸長の産物を示す陽性対照である。これらの結果は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒのゾル合成の概念実証を示す。
実施例２
拡張による配列決定のための固体Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成（ＳＢＸ）
この実施例は、２２２ｍｅｒ鋳型のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーの固体合成およびプロセシング、続いてナノポアセンサーシステムを使用した産物の配列決定を記載する。配列決定前のワークフローの全ての工程を、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ中間体および基質に結合した最終産物を用いて行った。このプロトコルは、溶液ベースのワークフローを超える多くの利点、例えば、反応のそれぞれのための純粋な試薬を減少した体積で順次添加する能力を提供する。この実験では、Ｅ－オリゴの直接共有結合によってプライミングされたマイクロ流体チップ基質上でＸｐａｎｄｏｍｅｒ伸長反応を行った。チップの機能化およびＥ－オリゴのクリック結合を実施例１に記載のように行った。
Ａ．伸長反応
伸長反応は、Ｅ－オリゴに対するＤＮＡ鋳型のモル比１０ｐｍｏｌ：２０ｐｍｏｌで行った。使用した鋳型は、ＨＩＶ２ゲノム由来の一本鎖２２２ｍｅｒ配列であり、使用したＥ－オリゴは、実施例１に記載のＥ５２オリゴであった。一本鎖ＤＮＡ鋳型分子を、１０ｐｍｏｌ鋳型をチップと共に５００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、５％ ＮＭＳ、１Ｍ尿素および２％ ＰＥＧ８Ｋの溶液中３７℃で５分間インキュベートし、続いてＭＥＢ緩衝液 ３００μＬで洗浄することによって、結合したＥ－オリゴにハイブリダイズさせた。伸長反応の前に、チップを５０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、５％ ＮＭＳ、１０％ ＰＥＧ８Ｋおよび１Ｍ尿素の溶液 ３００μＬで洗浄した。
伸長反応には以下の試薬が含まれていた。４ｎｍｏｌ ＸＮＴＰ、０．０８ｍＭ ポリリン酸塩、０．６ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．５Ｍ ベタイン、０．２５Ｍ 尿素、一本鎖結合
タンパク質（ＳＳＢ）１０μｇ、ＤＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｃ４７６０）９μｇ、１．０ｍＭ ＡＺ－８，８および４ｍＭ ＡＺ－４３，４３ ＰＥＭ添加剤。５％ ＮＭＳおよび５０Ｍｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．８４、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ６．７３および２０％ ＰＥＧからなる緩衝液を用いて、最終反応体積を５０μＬにした。伸長反応を４２℃で３０分間行った。
伸長後、チップを、Ｄ２Ｏ中に１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、３％ ＳＤＳ、１５％ ＤＭＦ、および５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する洗浄溶液 ３００μＬで、３回洗浄した。
Ｂ．Ｘｐａｎｄｏｍｅｒプロセシング
結合した伸長産物を最初に酸で処理して、例えば図１Ｃに示すように、分子を直線化するためにＸｐａｎｄｏｍｅｒ中のホスホラミダイト結合を切断した。Ｄ２Ｏ中の７．５Ｍ ＤＣｌの溶液 ２００μＬをチップに添加し、室温で３０分間インキュベートすることによって、酸媒介性切断を達成した。次いで、結合した産物を中和し、１００ｍＭ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．０、１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、３％ ＳＤＳ、１５％ ＤＭＦおよび５ｍＭ ＥＤＴＡのＤ２Ｏ溶液 ９００μＬを添加することによって洗浄した。次いで、２００μｍｏｌの無水コハク酸（シリンジに別々に装填）をチップに直接添加しながら、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．０、１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、３％ ＳＤＳ、１５％ ＤＭＦ、５ｍＭ
ＥＤＴＡのＤ２Ｏ溶液 ３００μＬを添加し、続いて２３℃で５分間インキュベートすることによって、結合産物を修飾した。次いで、修飾産物を、Ｈ２Ｏ中の１５％ ＡＣＮおよび５％ ＤＭＳＯの溶液 ５００μＬで洗浄した。
Ｃ．チップからのＸｐａｎｄｏｍｅｒの放出
結合したＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物は、光切断によってチップ基質から放出された。チップに１５％ ＡＣＮと５％ ＤＭＳＯのＨ２Ｏ溶液 ６０μＬを添加した後、ＵＶ硬化ランプを用いて１５分間照射した。放出されたＸｐａｎｄｏｍｅｒが、５％ ＤＭＳおよび１５％アセトニトリルの溶液を用いてチップから溶出た。まず、図２１Ａに示すように、溶出した物質をゲル電気泳動により分析した。試料の１５％を、矢印で示す全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物を含むゲル（０．５×ＴＢＥ中２．５％ ＮｕＳｉｅｖｅアガロース）のレーン３に流した。参考のために、同じ鋳型を使用した溶液ベースのＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成反応の産物をレーン１および２に示す。図から分かるように、固相合成は、溶液ベースの合成と比較してより狭いバンドを生成し、試料中の全長産物の割合がより大きいことを示している。
ナノポア配列決定
配列決定のために、２Ｍ ＮＨ４Ｃｌおよび１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含有する緩衝液Ｂ１中のＤＰｈＰＥ／ヘキサデカン二重層メンバーに、α－溶血素を挿入することによって、タンパク質ナノポアを調製する。シスウェルを、０．４Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、０６Ｍ ＧｕＣｌ、および１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含有する緩衝液Ｂ２で灌流する。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ試料を７０℃に２分間加熱し、完全に冷却し、次いで、２μＬ試料をシスウェルに添加する。次いで、９０ｍＶ／３９０ｍＶ／１０μｓの電圧パルスを印加し、Ｌａｂｖｉｅｗ取得ソフトウェアを用いてデータを取得する。
配列データは、単一のＳＢＸ反応からの配列リードの集団のヒストグラム表示によって分析される。分析ソフトウェアは、各配列リードを鋳型の配列に整列し、正しい鋳型配列と
整列しないリードの末端の配列の範囲をトリミングする。２２２ｍｅｒ鋳型のナノポア配列決定の代表的なヒストグラムを図２１Ｂに示す。特に、固体合成およびプロセシングは、ナノポアセンサによって読み取られた場合、２２２ｍｅｒ分子の全長にわたって非常に正確な配列リードを生成するＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を生成した。
実施例３
末端キャッピングによるＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成
この実施例は、合成中のＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物の末端キャッピングおよび異なる反応添加剤を用いたプロセスを最適化するための試みを記載する。以下の実験で使用した鋳型は、ＨＩＶ２ゲノム由来の１２１ｍｅｒ配列であり、使用したＥ－オリゴ（「ＥＯ」）は、以下の特徴を有するＥ５２ ＥＯであった。リーダーポリマー、コンセントレータポリマー、および配列５’ＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＡＡＣＧＧＡ ３’（配列番号４）を有するオリゴヌクレオチドプライマーによる５’ＳＩＭＡ（蛍光タグ）。末端キャップは、以下の配列、５’Ｋ［ＧＣＧＴＴＡＧＧＴＣＣＣＡＧＴＧＴＴＴＡＣ（配列番号１５）］Ｘ ３’を有する末端オリゴヌクレオチドを含み、式中、Ｋは、Ｇクランプを表し、Ｘは、ＰＥＧ３部分を表す。末端オリゴヌクレオチドは、鋳型の５’末端と相補的であり、ハイブリダイズする。末端オリゴヌクレオチドの５’末端は、図７Ａの特徴７１０Ａに示されるリンカーを介してｄｄＣＴＰキャップに連結され、完全な末端キャップ構造を形成する。
この実験では、５つの伸長反応を行い、そのそれぞれが、以下の試薬を含んでいた。Ｅ－オリゴに対する鋳型のモル比１：１、２ｍＭ ＡＺ－８、８および１０ｍＭ ＡＺ－４３、４３ ＰＥＭ添加剤、５％ ＮＭＳ、１．８μｇ ＤＮＡポリメラーゼ、０．０８ｍＭ
ＸＮＴＰ、０．０８ｍＭ ポリリン酸塩、および０．６ｍＭ ＭｎＣｌ２。反応２～５は、鋳型およびＥＯに対して２倍モル過剰の末端キャップを含んでいたが、反応１は末端キャップを含まなかった。反応はまた、以下のように様々な添加剤を含んでいた。反応１：０．５Ｍ ベタイン、０．２５Ｍ 尿素、および一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）２μｇ；反応２：０．５Ｍ ベタイン、０．２５Ｍ 尿素、およびＳＳＢ ２μｇ；反応３：０．２５Ｍ 尿素；反応４：０．５Ｍ ベタインおよび０．２５Ｍ 尿素；反応５：０．２５Ｍ 尿素およびＳＳＢ ２μｇ。それぞれの最終反応体積は１０μＬであり、反応は４２℃で行った。
伸長反応の産物は、図２２に示すように、ゲル電気泳動により分析した。レーン１は、末端キャップを含まない反応１の産物を示す。この反応において、ＳＩＭＡ色素はＥＯに連結しており、伸長産物は１２１ｍｅｒのＸｐａｎｄｏｍｅｒである。レーン２～５は、それぞれ末端キャップを含む反応２～５の産物をそれぞれ示す。これらの反応では、反応１とは対照的に、ＳＩＭＡ色素が末端キャップに連結している。図から分かるように、反応２～５のそれぞれにおいて、末端キャップは、ＤＮＡポリメラーゼによってＸｐａｎｄｏｍｅｒに首尾よく連結されており、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒが、ＤＮＡ鋳型の完全なコピーを表すことを示している。末端キャップの末端オリゴヌクレオチドを伸長産物に組み込むことにより、反応２～５の産物は、１００ｍｅｒのＸｐａｎｄｏｍｅｒであり、反応１の１２１ｍｅｒよりも迅速にゲル上を移動する。これらの結果は、ゲル上の著しく密なＸｐａｎｄｏｍｅｒバンドを示し、試験した実験条件下で末端キャッピング反応が非常に効率的であることを示している。重要なことに、末端キャッピングは、例えば、ナノポア配列決定のために全長Ｘｐａｎｄｏｍｅｒをタグ付けおよび捕捉する手段を提供する。
実施例４
末端キャッピングを用いた固体Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成
この実施例は、全長産物の末端キャッピングと組み合わせた２２２ｍｅｒのＸｐａｎｄｏｍｅｒの固体合成を記載する。実施例１に記載されるように、基質への伸長オリゴヌクレオチド（「Ｅ－オリゴ」）の共有結合によって官能化されたマイクロ流体チップ基質上で
固体合成を行った。鋳型の全長コピーが完了すると、ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型の５’末端にハイブリダイズした末端キャップに遭遇し、末端キャップの５’末端をＸｐａｎｄｏｍｅｒの３’末端に結合する。末端キャップに結合した蛍光色素は、ゲル電気泳動による鋳型の全長コピーの可視化を可能にする。
Ａ．伸長および末端キャッピング反応。
以下の実験で使用した鋳型は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノム由来の２４３ｍｅｒ配列であり、使用したＥ－オリゴ（「ＥＯ」）は、光切断性リンカーおよび配列５’ＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＡＡＣＧＧＡ ３’（配列番号４）を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含むＥ５２ ＥＯであった。末端キャップは、以下の配列、５’Ｋ［ＧＣＧＴＴＡＧＧＴＣＣＣＡＧＴＧＴＴＴＡＣ（配列番号１５）］３’を有する末端オリゴヌクレオチドを含み、式中、ＫはＧクランプを表す。末端オリゴヌクレオチドは、鋳型の５’末端と相補的であり、ハイブリダイズする。末端オリゴヌクレオチドの５’末端は、図７Ａの特徴７１０Ａに示されるリンカーを介してｄｄＣＴＰキャップに連結され、完全な末端キャップ構造を形成する。
この実験では、同じ鋳型、プライマー、および末端キャップを用いて４つのオンチップ伸長反応を行った。反応１は、以下の試薬を含んでいた。鋳型：ＥＯ：１６：２０：３２の末端キャップモル比、０．０８ｍＭ ＸＮＴＰ、１ｍＭ ＡＺ－８、８および４ｍＭ ＡＺ－４３、４３ ＰＥＭ、ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＰＯ４変異体Ｃ４７６０）９μｇ、ＳＳＢ １０μｇ、０．６ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０８ｍＭ ポリリン酸塩、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．８４、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ６．７３、２０％ ＰＥＧ、５％ ＮＭＳ、０．２５Ｍ 尿素、０．５Ｍ ベタイン。５０μＬの反応を４２℃で実行した。反応２は、以下の試薬を含んでいた。鋳型：ＥＯ：６：１０：１２の末端キャップモル比、０．０８ｍＭ ＸＮＴＰ、１ｍＭ ＡＺ－８、８および４ｍＭ ＡＺ－４３、４３ ＰＥＭ、９μｇ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ４７６０）、ＳＳＢ １０μｇ、０．６ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０８ｍＭ ポリリン酸塩、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．８４、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ６．７３、２０％ ＰＥＧ、５％ ＮＭＳ、０．２５Ｍ 尿素、０．５Ｍ ベタイン。２０μＬの反応を３７℃で実行した。反応３は、以下の試薬を含んでいた。鋳型：ＥＯ：６：１０：１２の末端キャップモル比、０．０８ｍＭ ＸＮＴＰ、１ｍＭ ＡＺ－８、８および４ｍＭ ＡＺ－４３、４３ ＰＥＭ、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ４７６０）９μｇ、ＳＳＢ １０μｇ、０．６ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０８ｍＭ ポリリン酸塩、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．８４、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ６．７３、２０％ ＰＥＧ、５％ｎｍ、０．２５Ｍ 尿素、０．５Ｍ ベタイン。２５μＬの反応を４２℃で行った。反応４は、以下の試薬を含んでいた。鋳型：ＥＯ：１０：１０：２０の末端キャップモル比、０．０８ｍＭ ＸＮＴＰ、１ｍＭ ＡＺ－８、８および４ｍＭ ＡＺ－４３、４３ ＰＥＭ、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ４７６０）９μｇ、ＳＳＢ １０μｇ、０．６ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０８ｍＭ ポリリン酸塩、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．８４、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ６．７３、２０％ ＰＥＧ、５％ ＮＭＳ、０．２５Ｍ 尿素、０．５Ｍ ベタイン。２５μＬの反応を４２℃で行った。
伸長反応の産物を、図２３に示すように、２．５％ ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル上でのゲル電気泳動によって分析した。レーン１～４は、それぞれ末端キャップを含む反応１～４の産物をそれぞれ示す。これらの反応では、ＳＩＭＡ色素が末端キャップに連結される。図から分かるように、各反応において、末端キャップはＤＮＡポリメラーゼによってＸｐａｎｄｏｍｅｒに首尾よく連結されており、ＸｐａｎｄｏｍｅｒがＤＮＡ鋳型の完全なコピーを表すことを示している。これらの結果は、ゲル上の著しく密なＸｐａｎｄｏｍｅｒバンドを示し、末端キャッピング反応も固体合成中に非常に効率的であることを示し
ている。興味深いことに、伸長およびキャッピングの効率は、反応中に存在する添加剤の性質によって影響されるようである。これらの結果は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの固体合成が試行錯誤によって最適化され得ることを示している。
実施例５
鏡像化ライブラリ構築物－ライブラリインサートへのＴｒｉｄｅｎｔアダプターの連結この実施例は、本発明の鏡像化ライブラリ構築物を生成する際の最初の工程を記載し、ここで、三つ又アダプターは、二本鎖ＤＮＡのライブラリ断片に連結される。図２４Ａは、この実験で使用した構築物の基本的な構造的特徴を示す。ライブラリ断片は、ＨＩＶ２ゲノムに由来する二本鎖６０ｍｅｒ配列であり、「マイナス」鎖（図のトップ鎖に対応する）および「プラス」鎖（図のボトム鎖に対応する）は、３’一塩基オーバーハングを組み込む。ライブラリ鎖の極性は、図中に「５’」の番号で示されている。三つ又アダプターは、図２４Ａに示すように、３本のＤＮＡ鎖で構成されており、各鎖の極性は「３’」の番号で示されている。三つ又のトップ鎖およびボトム鎖は、同一の配列を有する２４ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであるが、中間鎖を含むオリゴヌクレオチドの配列は、トップ鎖配列およびボトム鎖配列の逆相補体である。トップ鎖およびボトム鎖はまた、ライブラリ断片への指向性連結を可能にする３’一塩基オーバーハングを有する。３本の鎖の５’末端は、化学分岐剤によって一緒に連結されて、三つ又アダプターを形成し、中間鎖およびボトム鎖は二本鎖ハイブリッドを形成し、一方、トップ鎖は一本鎖のままである。
この実験では、連結反応を、５：１のモル比の三つ又アダプター対ライブラリ断片を用いて溶液中で行った。１５μＬの最終反応体積は、以下の試薬を含んでいた。リガーゼ反応緩衝液、３ｍＭ ＡＴＰ、６％グリセロール、６％ １、２－プロパンジオール、０．１μＭ ライブラリ断片、０．５μＭ 三つ又アダプター、１Ｕ／μＬ ＰＮＫおよび１２０Ｕ／μＬ ＤＮＡリガーゼ。反応を１５℃で５分間行い、ＳＹＢＲで染色した６％ ＴＢＥ－Ｕゲル中のゲル電気泳動によって連結産物を分析して産物を可視化した。代表的なゲルを図２４Ｂに示し、連結されていない三つ又およびライブラリ参照断片をレーン１に流し、連結反応の産物をレーン２に流した。図から分かるように、連結された三つ又／ライブラリ断片産物は、連結されていない産物と明確に区別可能である。注目すべきことに、連結されていないライブラリ断片に対応するバンドは、レーン２において非常に薄く、このことは、ライブラリ断片の大部分が、三つ又／ライブラリ連結に変換されていることを示している。
実施例６
鏡像化ライブラリ構築物－鏡像化ライブラリ構築物を生成するための三つ又アダプターおよびエキソヌクレアーゼ消化からの伸長
この実施例は、図２５Ａに簡略化された形で示されている、鏡像化ライブラリ構築物を生成する際の伸長および消化工程を説明する。伸長工程では、Ｍ１構築物の三つ又アダプターの一本鎖のトップ鎖をＤＮＡポリメラーゼによる伸長プライマーとして使用し、ライブラリ断片を鋳型としてＤＮＡの新しい鎖を合成する。Ｍ１構築物の伸長は、図中にＭ２構築物を生成する。次いで、消化工程のために、Ｍ２の元の鋳型鎖（５’表記で示す）をエキソヌクレアーゼ処理によって除去して、Ｍ３構築物を生成する。Ｍ３は、ライブラリ断片「プラス」鎖の２つの同一の一本鎖コピーを含み、「鏡像化ライブラリ構築物」と呼ばれる。
伸長反応は、以下の試薬を用いて行った。Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｏｌ反応緩衝液中、０．３ｐｍｏｌ Ｍ１連結産物、０．２ｍＭ ｄＮＴＰＳ、および０．４Ｕ／μＬ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ－））。エキソヌクレアーゼ活性の非存在ならびに強い鎖置換活性に基づいて、Ｖｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ－）を伸長反応のためのＤＮＡポリメラーゼとして選択した。伸長反応（総体積５μＬ）を、９５℃で２分間の初期
変性工程に供し、続いて９５℃で１５秒間および７２℃で６秒間の２５サイクルに供した。変性／伸長サイクルの後、反応をクエンチし、変性させ、ゲル上で実行して伸長産物を可視化した。
消化反応のために、０．３ｐｍｏｌのＭ２伸長産物をラムダエキソヌクレアーゼ反応緩衝液中のラムダエキソヌクレアーゼ（１Ｕ／μＬ）で処理した。エキソ添加後、消化反応（総体積１０μＬ）を５分間行った。消化産物を上記のようにゲル電気泳動によって分析した。代表的な実験の結果を図２５Ｂに示す。ゲルのレーン１は、Ｍ１参照産物（０．２ｐｍｏｌ生成物／レーン）を示し、レーン２および３はそれぞれ伸長および消化反応の産物を示す。レーン２の大きなバンドは、Ｍ１連結産物のより大きなＭ２伸長産物への変換の成功を実証し、一方、レーン３のより小さなバンドは、Ｍ２伸長産物のＭ３消化産物への変換の成功を実証する。
実施例７
Ｍ１鏡像化ライブラリ構築物の固体合成
この実施例は、固体支持体上にＭ１構築物を構築するためのワークフローを記載する。ワークフローを簡略化して図２６Ａに示す。以下の実験では、Ｙアダプター（「ＹＡＤ」）を、クリックケミストリーを用いて支持体に最初に共有結合させた。次いで、ライブラリ断片および三つ又アダプターを結合ＹＡＤに連結して、支持体上にＭ１構築物を生成した。ＹＡＤと支持体との間の感光性結合の切断によって、Ｍ１が最終的に支持体から放出された。
Ａ．固体支持体へのＹＡＤのクリック結合
Ｚｅｏｎｏｒ（シクロオレフィン熱可塑性ポリマー）から製造された市販の連続フローＰＣＲチップをこの実験における固体支持体として使用した。アッセイは、実施例１に記載の通り行った。銅クリック反応を以下のように行った。３ｍＭ ＴＨＰＴＡ、６ｍＭ アスコルビン酸ナトリウム、１ｍＭ ＣｕＳＯ４、５ｍＭ アミノグアニジン、および１０％ ＤＭＦを混合することによって触媒混合物６０μＬを調製した。１０％ ＤＭＦ、２５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、（アジド部分に連結された）ＹＡＤの５０ｍｏｌ Ｅ６オリゴヌクレオチドアーム、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ アミノグアニジンおよび６ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムを混合することによって基質混合物１２０μＬを調製した。次いで、触媒混合物３０μＬを基質混合物に添加し、このクリック混合物７５μＬをチップに添加し、続いて室温で３０分間インキュベートした。
Ｂ．Ｍ１構築物の伸長
クリック反応後、チップを水および溶液「１０００２」（３００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．５％ ＳＤＳおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄した。溶液「ＣＨＢ００２」（５００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、２％ ＰＥＧ８Ｋ、１Ｍ 尿素および５％ ＮＭＳ）２５μＬおよび１００ｐｍｏｌ Ｅ５２オリゴヌクレオチドを混合することによって、Ｅ５２ ＹＡＤ混合物（Ｙアダプターの第２のオリゴヌクレオチドアームを含む）５０μＬを調製し、チップに適用した。チップを３０℃で２０分間インキュベートして、Ｅ５２オリゴヌクレオチドをＥ６オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。次いで、チップをＣＨＢ００２ ３００μＬで３回洗浄した。
ライブラリ断片および三つ又アダプターを基質結合ＹＡＤに連結するために、１５ｐｍｏｌ ライブラリインサート（ＨＩＶ２ ６０ｍｅｒ）、５０ｐｍｏｌ 三つ又アダプター、１１ｍＭのＡＴＰ、１Ｕ／μＬのＴ４ ＰＮＫおよび平滑末端／Ｔ４リガーゼマスター混合物（ＮＥＢから入手可能）を合わせることによって、連結反応混合物５０μＬを調製
した。連結混合物をチップに添加し、続いて１６℃で１５分間インキュベートした。次いで、連結混合物をチップから取り出し、５’デアデニラーゼ（５万Ｕ／ｍＬ）５μＬを加えた。その後、連結混合物をチップに戻し、続いて１６℃で１５分間インキュベートした。次いで、チップをＣＨＢ００２ ３００μＬで２回洗浄し、次いで水３００μＬで洗浄した。次いで、１０００２ ３００μＬを添加し、チップを３７℃で５分間インキュベートした。次いで、チップをＣＨＢ００２ ３００μＬで３回洗浄し、次いで水３００μＬで洗浄した。次いで、全ての液体をチップから除去し、水７５μＬを添加した。
結合産物をチップから放出するために、チップをＦｉｒｅＦｌｙ硬化ランプで１５分間ＵＶ光に曝露することによって、チップへのＹＡＤの感光性連結を切断した。放出された産物がチップから溶出され、回収された材料の１％をゲル電気泳動によって分析した。代表的なゲルを図２６Ｂに示す。レーン１の試料は、光切断によってチップから回収された材料の１％に相当するが、レーン２～５の試料は、溶液中で合成された精製された非切断のＭ１の対照滴定である。図から分かるように、固体合成プロトコルは、完全に集められたＭ１鏡像化ライブラリ産物を首尾よく生成する。
実施例８
鏡像化ライブラリ構築物の拡張による配列決定
この実施例は、拡張による鏡像化ライブラリ配列決定（ＳＢＸ）の概念実証を示す。この実験における出発材料は、実施例７に記載のＨＩＶ２ ６０ｍｅｒライブラリ断片の周りに構築されたＭ１産物であった。Ｍ２産物を生成するための伸長条件は以下の通りであった。Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反応緩衝液中約７．５ｐｍｏｌ Ｍ１産物、０．２ｍＭ ｄＮＴＰおよび０．１６Ｕ／μＬ Ｖｅｎｔポリメラーゼ。反応物 ３７．３μＬを９５℃で２分間インキュベートし、次いで９５℃で１５秒間および７２℃で６秒間の２５サイクルに供した。Ｍ３産物を生成するためのＭ２消化条件は以下の通りであった。伸長反応物 ３６．６８μＬを、ラムダエキソ緩衝液中０．２６Ｕ／μＬ ラムダエキソヌクレアーゼで処理した。反応を３７℃で５分間行い、次いで、熱不活性化して、Ｍ３鏡像化ライブラリ構築物を生成した。
Ｍ３産物のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーの生成を固体合成によって行った。最初の工程として、図２７に示すように、Ｍ３消化産物をマイクロ流体チップにハイブリダイズさせた。この実験では、Ｍ３ ＹＡＤのトップアームにハイブリダイズするように設計されたＥ５２オリゴヌクレオチドのクリック結合によってチップをプライミングした。Ｅ５２オリゴヌクレオチドは、図２７の矢印によって示されるように、Ｍ３構築物のトップ鎖のコピーを合成するためのプライマーを提供する。Ｍ３消化産物をチップにハイブリダイズさせ、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ伸長のための鋳型を作製するために、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ６．６２、２％ ＰＥＧ８Ｋおよび０．２５Ｍ 尿素で構成されるハイブリダイゼーション緩衝液中で、消化反応物 ４２．７５μＬを、１０ｐｍｏｌ Ｅ６オリゴヌクレオチド（ＹＡＤのボトム鎖アームにハイブリダイズし、Ｍ３構築物のボトム鎖のコピーを合成するためのプライマーを提供するように設計されている）および１０ｐｍｏｌ キャップオリゴヌクレオチド（Ｍ３三つ又アダプターにハイブリダイズし、Ｍ３ライブラリ断片の各コピーの末端キャッピングのための遊離５’三リン酸を提供するように設計されている）と混合した。ハイブリダイゼーション反応物 ５０μＬを９５℃で１５秒間インキュベートし、次いで、６５℃に加温したチップに添加した。次いで、チップを３７℃にし、５分間インキュベートした。
鏡像化ライブラリのワークフローからの試料を示す代表的なゲルを図２８に示す。ゲルのレーン１～３は、精製されたＭ１産物（それぞれ０．５、０．１、および、０．１５ｐｍｏｌのＭ１）の参照試料を示す。レーン４は、Ｍ２産物を生成する伸長反応の１．３％を表し、レーン５は、Ｍ３産物を生成する消化反応の１．２％を表す。レーン６は、ハイブ
リダイゼーション後にチップ上に保持されたＭ３材料の５％を表す。重要なことに、消化反応中に二次産物が存在するにもかかわらず、完全なＭ３産物のみがチップ上に保持された。
増殖による配列決定のために、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成およびプロセシングの全ての工程をマイクロ流体チップ上で実行した。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ伸長条件は、以下の通りであった。６％ ＮＭＰ、１：４のモル比のＡＺ、８～８対ＡＺ、４３～４３ ＰＥＭ、０．２５Ｍ 尿素、０．５Ｍ ベタイン、８０μＭ ＸＮＴＰ、ＳＳＢ １０μｇ、およびＣ４７６０ポリメラーゼを、４２℃で３０分間。伸長後、チップを洗浄した。次いで、チップを７．５Ｍ ＤＣｌ ２００μＬで２３℃で３０分間処理することによって、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを切断した。次いで、チップを中和し、洗浄した。次いで、１２５ｍＭ 無水コハク酸 ３００μＬを添加し、２３℃で５分間インキュベートすることによって、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを修飾した。洗浄後、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒをチップから光切断し（１５秒間のＵＶ処理）、１００μＭ ＮａＰＯ４、１５％ ＡＣＮおよび５％ ＤＭＳＯを含有する溶液 １００μＬで溶出した。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物のナノポア配列決定を、実施例２に記載されるように行った。この試料からの代表的なナノポアトレースを図２９に示す。トレースは、ＨＩＶ２ライブラリ断片（配列番号１６）の配列を反映する２つの同一の配列リード、「リード１」および「リード２」の一部を示す。リードは、図では「ミラー」と呼ばれる、キャップオリゴ構造によって生成される信号によって分離される。
実施例９
耐酸性磁気ビーズ上の末端キャッピングを用いた固体Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成
この実施例は、ビーズ上のＸｐａｎｄｏｍｅｒの固体合成が、溶液中での合成と少なくとも同程度に効率的であることを実証する。４つの異なるＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成反応を行った。１）溶液中合成（伸長オリゴヌクレオチド上の蛍光ＳＩＭＡ色素）；２）末端キャッピングなしのビーズ上合成（伸長オリゴヌクレオチド上の色素）；３）末端キャッピングによるオンビーズ合成（末端キャップ末端オリゴヌクレオチド上の色素）；４）末端キャップの代わりにブロッカーオリゴヌクレオチドを用いたオンビーズ合成。この実験で使用した伸長オリゴヌクレオチドは、以下の配列を有していた。５’［アジド］Ｄ１０［ＰＣ－スペーサー］Ｌ２５Ｚ６［ＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＡＡＣＧＧＡ（配列番号４）］３’、（式中、「ＰＣ」は、光切断性スペーサーを表す。；「Ｄ」は、ＰＥＧ６スペーサーを表す。「Ｌ」は、Ｃ２スペーサーを表す。「Ｚ」は、Ｃ１２スペーサーを示す）。本明細書および図５を参照して考察するように、ビーズをアルキン基で官能化し、伸長オリゴヌクレオチドに共有結合させた。４ｐｍｏｌのオンビーズ伸長オリゴヌクレオチドを４ｐｍｏｌの１００ｍｅｒ鋳型ＤＮＡ＋／－末端キャップオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。反応３に含まれる末端キャップは、以下の配列を有していた。３’ ｄｄＣＴＰＲＫ［ＧＣＧＴＴＡＧＧＴＣＣＣＡＧＴＴＴＴＡＣ（配列番号１７）］Ｗ ５’および反応４に含まれるブロッカーオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有していた。３’ ＲＫ［ＧＣＧＴＴＡＧＧＴＣＣＣＡＧＴＧＴＴＴＴＡＣ（配列番号１８）］×５’、式中、「Ｒ」は、アミダイトを表し、「Ｋ」は、Ｇクランプを表し、「Ｗ」は、ＳＩＭＡ色素を表し、「Ｘ」は、ＰＥＧ３を表す。鋳型ＤＮＡに対して２倍モル過剰のキャップまたはブロッカーオリゴを使用した。全ての伸長反応は、以下を含んでいた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、２０％ ＰＥＧ、１Ｍ 尿素（反応４については０．２５Ｍ）、５％ ＮＭＳ、１０ｍＭ ＰＥＭ、０．２６μｇ／ｕｌ ＤＰＯ４ポリメラーゼ変異体、１．６ｍＭ ＭｎＣｌ２、１００μＭ ｄＸＴＰおよび３００μＭ ポリリン酸。反応３および４には０．０２％ Ｔｗｅｅｎも含まれ、反応４には０．５Ｍ ベタインも含まれていた。伸長反応を３７℃で６０分間行い、図３０に示すように、伸長産物をゲル電気泳動によって分析した。図から分かるように、オンビーズ伸長（レーン２）は、溶液中伸長（レーン１）と同程度に効率的である。さらに、末端キャッピングオンビーズ（レーン３、末端キャップ上の色素）も非常に効率的である。
実施例１０
耐酸性磁気ビーズ上での固体Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの合成およびプロセシング
この実施例は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの効率的なオンビーズ合成およびプロセシングを実証する。プライマー伸長反応後、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物を酸処理によって処理してホスホルアミデート結合を切断し、拡張したポリマーを生成した。拡張産物を光切断によってビーズから放出し、ゲル電気泳動によって分析した。
ビーズ官能化および伸長オリゴヌクレオチド連結を実施例９に記載のように行った。鋳型ＤＮＡを、１：１のモル比（それぞれ４ｐｍｏｌ）で伸長オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。伸長反応は、以下を含んでいた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、５０ｍＭ ＴＭＡＣｌ、５０ｍＭ ＧｕＣｌ、２０％ ＰＥＧ、０．１Ｍ 尿素、６％ ＮＭＰ、１５ｍＭ ＰＥＭ、０．２６μｇ／ｕｌ ＤＰＯ４ポリメラーゼ変異体、１．４ｍＭ ＭｎＣｌ２、１００μＭ ｄＸＴＰ、０．０５μｇ／μｌ Ｋｏｄ一本鎖結合タンパク質、０．０２％ ＳＤＳ、および３００μＭポリリン酸。伸長反応を３７℃で６０分間行った。次いで、試料を緩衝液Ｂ（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＨＰＯ４、５％ Ｔｒｉｔｏｎ、および１５％ ＤＭＦ）で洗浄し、プロテイナーゼＫで５５℃で５分間処理し、緩衝液Ｂで再び洗浄した。図３１に示すように、試料を７．５Ｍ ＤＣｌ／１％ Ｔｒｉｔｏｎで酸切断し、緩衝液Ｂで中和し、緩衝液Ｂ中の無水コハク酸で修飾した。次いで、試料を緩衝液Ｅ（４０％ ＡＣＮ）で洗浄し、続いて光切断（ＵＶ光への１’曝露）し、放出されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を回収し、ゲル電気泳動によって分析した。レーン１は、溶液中で合成および処理されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を表し、レーン２～４は、溶出緩衝液（レーン２の１００ｍＭ ＰＩ；レーン３内の１００ｍＭ ＧｕＨＣｌ；レーン４の１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ）に含まれる異なる添加剤を含む耐酸性磁気ビーズ上で合成および処理されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を表す。観察され得るように、オンビーズワークフローは、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒバンドがより密であるため、溶液中ワークフローよりも改善された結果を示し、試料が全長産物について濃縮されていることを示している。
２０１９年２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／８０８，７６８号および２０１９年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／８２６，８０５号を含むがこれらに限定されない、本明細書で言及されたおよび／または出願データシートに列挙された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような文献は、例えば、本明細書に記載された発明に関連して使用され得る刊行物に記載された材料および方法論を説明および開示する目的で、参照により組み込まれ得る。
本発明は、一般に、単一分子配列決定のための新しい方法、組成物、およびデバイスに関し、より具体的には、拡張可能ポリマー（例えば、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ（登録商標））の固体合成およびプロセシングのための改善された方法およびデバイスに関し、さらに、ナノポアセンサを通過したときにより正確な配列情報を提供する新しい拡張可能ポリマー構築物を生成するための方法および組成物に関する。
「ＸＮＴＰ」は、鋳型依存性酵素重合と適合する拡張可能な５’三リン酸修飾ヌクレオチド基質である。ＸＮＴＰは、２つの異なる機能的構成要素を有する。すなわち、核酸塩基５’－トリホスホルアミデートと、各ヌクレオシドトリホスホルアミデート内で、ホスホルアミデート結合のヌクレオチド内切断による制御された拡張を可能にする位置に結合しているつなぎ鎖、である。例示的なＸＮＴＰおよびそれを作製する方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、出願人が公開したＰＣＴ出願番号国際公開第２０１６／０８１８７１号に記載されている。

Claims (35)

  1. 固体支持体上に核酸鋳型のコピーを合成する方法であって、
    （ａ）リンカーを前記固体支持体上に固定化する工程であって、前記リンカーは、前記固体支持体に近位の第１の末端と、前記固体支持体に遠位の第２の末端とを含み、前記第１の末端はマレイミド部分に結合されており、前記第２の末端はアルキン部分に結合されており、前記マレイミド部分は前記固体支持体に架橋されている、固定化する工程と、
    （ｂ）前記リンカーにオリゴヌクレオチドプライマーを結合させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記核酸鋳型の３’末端の一部に相補的な核酸配列を含み、前記オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端が、アジド部分にカップリングされ、前記アジド部分が、前記アルキン部分と反応してトリアゾール部分を形成する、結合させる工程と、
    （ｃ）前記核酸鋳型、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド基質、またはその類似体、適切な緩衝液、および任意に１つ以上の添加剤を含む反応混合物を提供する工程であって、前記核酸鋳型が、前記オリゴヌクレオチドプライマーに特異的にハイブリダイズする、提供する工程と、
    （ｄ）プライマー伸長反応を行って前記核酸鋳型の前記コピーを生成する工程と、を含む方法。
  2. 前記マレイミド部分が、光開始プロトン引き抜き反応によって前記固体基質に架橋される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記固体基質が、ポリオレフィンから構成される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ポリオレフィンが、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）またはポリプロピレンである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記核酸鋳型が、ＤＮＡ鋳型である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ＤＮＡ鋳型のコピーが、拡張可能ポリマーであり、前記拡張可能ポリマーが、非天然ヌクレオチド類似体の鎖を含み、非天然ヌクレオチド類似体のそれぞれが、ホスホルアミデートエステル結合によって隣接する非天然ヌクレオチド類似体に作動可能に連結されている、請求項５に記載の方法。
  7. 前記拡張可能ポリマーが、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記リンカーが、前記第１の末端と前記第２の末端との間に介在するスペーサーアームをさらに含み、前記スペーサーアームが、エチレングリコールの１つ以上のモノマーを含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記リンカーが、切断可能部分をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記固体支持体が、ビーズ、チューブ、キャピラリー、およびマイクロ流体チップからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  11. 核酸標的配列のコピーの３’末端を選択的に改変する方法であって、
    （ａ）前記核酸標的配列の第１の配列に相補的な配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、前記核酸標的配列の第２の配列に相補的な配列を有する第２のオリゴヌクレオチドとを提供する工程であって、前記核酸標的配列の前記第１の配列が、前記核酸標的配列の前記第２の配列に対して３’であり、前記第１のオリゴヌクレオチドが、核酸ポリメラー
    ゼのための伸長プライマーを提供し、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端が、ジデオキシヌクレオシド５’三リン酸に作動可能に連結され、前記ジデオキシヌクレオシド５’三リン酸が、前記核酸ポリメラーゼの基質を提供する、提供する工程と、
    （ｂ）前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチド、前記核酸標的配列、前記核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド基質、またはその類似体、適切な緩衝液、および任意に１つ以上の添加剤を含む反応混合物を提供する工程であって、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記核酸標的配列に特異的にハイブリダイズする、提供する工程と、
    （ｃ）プライマー伸長反応を行って、前記標的配列の前記コピーを生成する工程であって、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端が、前記核酸ポリメラーゼによって前記核酸標的配列の前記コピーの３’末端に作動可能に連結されている、生成する工程と、を含む方法。
  12. 前記ジデオキシヌクレオシド５’三リン酸が、可動性リンカーによって前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に作動可能に連結されている、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記可動性リンカーが、１つ以上のヘキシル（Ｃ６）モノマーを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記第２のオリゴヌクレオチドが、１つ以上の２’メトキシリボ核酸類似体を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記第２のオリゴヌクレオチドの３’末端が、第１の固体支持体に固定化されている、請求項１１に記載の方法。
  16. 前記第１の固体支持体を洗浄して、前記第２のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結された前記核酸標的の前記コピーを精製する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記第１のオリゴヌクレオチドが、第１の固体支持体に固定化されている、請求項１１に記載の方法。
  18. 前記核酸標的配列の前記コピーを前記第１の固体支持体から放出させる工程、および前記核酸標的配列の前記コピーを第３のオリゴヌクレオチドと接触させる工程をさらに含み、前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記配列と相補的な配列を有し、前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、前記第３のオリゴヌクレオチドの５’末端が、第２の固体支持体上に固定化される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記第２の固体支持体を洗浄して、３’末端で前記第２のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結された前記核酸標的配列の前記コピーを精製する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記核酸標的配列に対する前記第２のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させる１つ以上のヌクレオチド類似体を含む、請求項１１に記載の方法。
  21. 前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記核酸標的配列の５’末端に作動可能に連結された異種核酸配列に相補的である、請求項１１に記載の方法。
  22. 前記核酸標的配列が、一本鎖ＤＮＡであり、前記標的配列の前記コピーが、拡張可能ポ
    リマーであり、前記拡張可能ポリマーが、非天然ヌクレオチド類似体の鎖を含み、前記非天然ヌクレオチド類似体のそれぞれが、ホスホルアミデートエステル結合によって隣接する非天然ヌクレオチド類似体に作動可能に連結されている、請求項１１に記載の方法。
  23. 前記第１の固体支持体および前記第２の固体支持体が、ビーズ、チューブ、キャピラリー、およびマイクロ流体チップからなる群から選択される、請求項１１または請求項１８に記載の方法。
  24. 一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリを生成する方法であって、前記鋳型構築物のそれぞれが、ＤＮＡ標的配列の同じ鎖の２つのコピーを含み、前記方法が、
    （ａ）ＤＮＡ Ｙアダプターの集団を提供する工程であって、前記Ｙアダプターのそれぞれが、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴヌクレオチドの３’領域および前記第２のオリゴヌクレオチドの５’領域が、配列相補性によって二本鎖領域を形成し、前記第１のオリゴヌクレオチドの５’領域および前記第２のオリゴヌクレオチドの３’領域が、一本鎖であり、オリゴヌクレオチドプライマーの結合部位を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖領域の末端が、任意に固体基質上に固定化されている、提供する工程と、
    （ｂ）二本鎖ＤＮＡ分子の集団を提供する工程であって、前記二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれが、第１の鎖および第２の鎖を含み、前記二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれの第１の末端が、前記Ｙアダプターの前記二本鎖末端と適合する、提供する工程と、
    （ｃ）キャッププライマーアダプターの集団を提供する工程であって、前記キャッププライマーアダプターのそれぞれが、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチドを含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第３のオリゴヌクレオチドとの間に介在し、前記第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチドが、化学分岐剤によって前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの５’末端および前記第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結され、前記第１のオリゴヌクレオチドの配列の一部が、前記第３のオリゴヌクレオチドの配列の一部と同一であり、前記第２のオリゴヌクレオチドの配列の一部が、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの配列の一部の逆相補体であり、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端および前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端が、前記二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれの第２の末端と適合する二本鎖領域を形成する、提供する工程と、
    （ｄ）前記二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれの前記第２の末端を、前記キャッププライマーアダプターのうちの１つの前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端および前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に連結する工程と、
    （ｅ）前記二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれの前記第１の末端を、前記ＤＮＡ Ｙアダプターのうちの１つの前記二本鎖末端に連結する工程と、
    （ｆ）前記連結されたキャッププライマーアダプターのそれぞれの前記第１のオリゴヌクレオチドの３’末端からＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長する工程であって、前記連結された二本鎖ＤＮＡ分子の前記第１の鎖が、前記ＤＮＡポリメラーゼの鋳型を提供し、前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記二本鎖ＤＮＡ分子の前記第１の鎖の配列と前記Ｙアダプターの前記第１のオリゴヌクレオチドの配列との逆相補体を含む第３の鎖を生成する、伸長する工程と、
    （ｇ）前記連結されたＹアダプターの前記第１のオリゴヌクレオチドのそれぞれの５’末端からエキソヌクレアーゼで消化する工程であって、前記消化することが、前記第１のオリゴヌクレオチド、前記二本鎖ＤＮＡ分子の前記第１の鎖、および前記キャッププライマーアダプターの前記第２のオリゴヌクレオチドを除去して、一本鎖鋳型構築物を生成し、前記一本鎖鋳型構築物のそれぞれが、前記二本鎖ＤＮＡ分子の前記第２の鎖の配列をそれぞれが含む２つの鋳型分子を含み、前記２つの鋳型分子が、前記キャッププライマーア
    ダプターの前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドによって作動可能に連結されている、消化する工程と、を含む方法。
  25. 一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリであって、前記鋳型構築物のそれぞれが、ＤＮＡ標的配列の同じ鎖の第１のコピーおよび第２のコピーを含み、前記標的配列の前記第１のコピーおよび前記第２のコピーが作動可能に連結されており、前記一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリが、請求項２４に記載の方法によって生成される、一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリ。
  26. 鏡像化されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ分子のライブラリを生成する方法であって、前記Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ分子のそれぞれが、ＤＮＡ標的配列の同じ鎖の２つのコピーを含み、前記方法が、
    （ａ）請求項２５に記載の一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物の前記ライブラリを提供する工程と、
    （ｂ）前記Ｙアダプターの前記第１の鎖の前記一本鎖部分に相補的な第１の伸長オリゴヌクレオチドの集団と、前記Ｙアダプターの前記第２の鎖の前記一本鎖部分に相補的な第２の伸長オリゴヌクレオチドの集団と、を提供する工程であって、前記第１の伸長オリゴヌクレオチドまたは前記第２の伸長オリゴヌクレオチドが、任意に固体基質上に固定化される、提供する工程と、
    （ｃ）一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物の前記ライブラリを前記第１の伸長オリゴヌクレオチドの前記集団および前記第２の伸長オリゴヌクレオチドの前記集団に特異的にハイブリダイズさせる工程と、
    （ｄ）キャップ分岐構築物の集団を提供する工程であって、前記キャップ分岐構築物が、第２のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結された第１のオリゴヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記キャッププライマーアダプター構築物の前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの配列の一部に相補的な配列を含み、前記キャップ分岐構築物の前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドが、遊離５’ヌクレオシド三リン酸部分を提供する、提供する工程と、
    （ｅ）前記キャップ分岐構築物の集団を、前記一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物の集団に特異的にハイブリダイズさせる工程と、
    （ｆ）プライマー伸長反応を行って、前記ＤＮＡ標的配列の前記第１のコピーおよび前記第２のコピーのＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーを生成する工程であって、前記Ｘｐａｎｄｏｍｅｒコピーが、前記キャップ分岐構築物によって作動可能に連結されている、生成する工程と、を含む方法。
  27. 固体支持体上にタグ付けされた二本鎖ＤＮＡアンプリコンのライブラリを生成する方法であって、
    （ａ）二本鎖ＤＮＡ分子の集団を提供する工程であって、前記二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれが、第２の鎖に特異的にハイブリダイズした第１の鎖を含む、提供する工程と、
    （ｂ）順方向ＰＣＲプライマーおよび逆方向ＰＣＲプライマーを提供する工程であって、前記順方向ＰＣＲプライマーが、前記二本鎖ＤＮＡ分子の前記第２の鎖（ｓｔａｎｄ）の３’末端の一部に相補的な３’配列に作動可能に連結された第１の５’異種タグ配列を含み、前記逆方向ＰＣＲプライマーが、前記二本鎖ＤＮＡ分子の前記第１の鎖の３’末端の一部に相補的な３’配列に作動可能に連結された第２の５’異種タグ配列を含む、提供する工程と、
    （ｃ）二本鎖ＤＮＡ分子の前記集団が増幅されて第１のＤＮＡアンプリコン産物の集団を生成し、前記第１のＤＮＡアンプリコン産物が、第１の末端に前記第１の異種配列タグを含み、第２の末端に第２の異種配列タグを含む、第１のＰＣＲ反応を行う工程と、
    （ｄ）固体支持体上に固定化された捕捉オリゴヌクレオチド構造を提供する工程であっ
    て、前記捕捉オリゴヌクレオチド構造が、第１の末端および第２の末端を含み、前記第１の末端が前記固体支持体に共有結合しており、前記第２の末端が、前記第１のＤＮＡアンプリコン産物の集団の前記第２の異種配列タグの一部に相補的な配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記捕捉オリゴヌクレオチド構造が、前記第１の末端と前記捕捉オリゴヌクレオチドとの間に介在した切断可能エレメントをさらに含む、提供する工程と、
    （ｅ）前記第１のＤＮＡアンプリコン産物の集団と、前記第１の異種配列タグの一方の鎖の配列に相補的な配列を含む順方向プライマーと、前記第２の異種配列タグの一方の鎖に相補的な配列を含む逆方向プライマーと、を含む第２のＰＣＲ反応を行う工程であって、前記第１のＤＮＡアンプリコン産物の集団の第１の鎖が、前記捕捉オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、前記第２のＰＣＲ反応が、固定化ＤＮＡアンプリコン産物の集団を生成し、前記固定化ＤＮＡアンプリコン産物の第２の鎖が、前記固体支持体に作動可能に連結されている、第２のＰＣＲ反応を行う工程と、を含む方法。
  28. 一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリを生成する方法であって、前記鋳型構築物のそれぞれが、ＤＮＡ標的配列の同じ鎖の２つのコピーを含み、前記方法が、
    （ａ）請求項２７に記載の固体支持体上に固定化されたＤＮＡアンプリコン産物のライブラリを提供する工程と、
    （ｂ）キャッププライマーアダプターの集団を提供する工程であって、前記キャッププライマーアダプターのそれぞれが、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチドを含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第３のオリゴヌクレオチドとの間に介在し、前記第１のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチド、および前記第３のオリゴヌクレオチドが、化学分岐剤によって前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの５’末端および前記第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結され、前記第１のオリゴヌクレオチドの配列の一部が、前記第３のオリゴヌクレオチドの配列の一部と同一であり、前記第２のオリゴヌクレオチドの配列の一部が、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの配列の一部の逆相補体であり、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端および前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端が、前記タグ付けされた固定化ＤＮＡアンプリコン産物のそれぞれの遊離末端と適合する二本鎖領域を形成する、提供する工程と、
    （ｃ）前記固定化ＤＮＡアンプリコン産物のそれぞれの遊離末端を、前記キャッププライマーアダプターの前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端および前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に連結する工程と、
    （ｄ）前記キャッププライマーアダプターの前記第１のオリゴヌクレオチドのそれぞれの３’末端からＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長する工程であって、前記固定化ＤＮＡアンプリコン産物の前記第２の鎖が、前記ＤＮＡポリメラーゼの鋳型を提供し、前記ＤＮＡポリメラーゼが第３の鎖を生成し、前記第３の鎖が前記第２の鎖のコピーである、伸長する工程と、
    （ｅ）前記捕捉オリゴヌクレオチド構造のそれぞれの前記切断可能エレメントを切断する工程であって、前記固体支持体から前記ＤＮＡアンプリコン産物を放出し、前記ＤＮＡアンプリコン産物のそれぞれの前記第２の鎖上に遊離５’末端を生成する、切断する工程と、
    （ｆ）前記ＤＮＡアンプリコン産物のそれぞれの切断された前記第２の鎖の前記遊離５’末端からエキソヌクレアーゼで消化する工程であって、前記ＤＮＡアンプリコン産物の前記第２の鎖および前記キャッププライマーアダプターの前記第２のオリゴヌクレオチドを除去して、一本鎖鋳型構築物のライブラリを生成し、前記一本鎖鋳型構築物のそれぞれが、前記キャッププライマーアダプターの前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドによって作動可能に連結された前記ＤＮＡアンプリコン産物の前記第１の鎖の２つのコピーを含む、消化する工程と、を含む方法。
  29. 一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリであって、前記鋳型構築物のそれぞれが、ＤＮＡ標的配列の同じ鎖の第１のコピーおよび第２のコピーを含み、前記ＤＮＡ標的配列の前記第１のコピーおよび前記第２のコピーが作動可能に連結されており、前記一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリが、請求項２８に記載の方法によって生成される、一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリ。
  30. 鏡像化されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ分子のライブラリを生成する方法であって、前記Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ分子のそれぞれが、ＤＮＡ標的配列の同じ鎖の２つのコピーを含み、前記方法が、
    （ａ）請求項２９に記載の一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のライブラリを提供する工程と、
    （ｂ）前記ＤＮＡアンプリコン産物の前記第２のタグに相補的な伸長オリゴヌクレオチドの集団を提供する工程であって、前記伸長オリゴヌクレオチドが、固体基質上に固定化されている、提供する工程と、
    （ｃ）前記一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物を前記伸長オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズさせる工程と、
    （ｄ）キャップ分岐構築物の集団を提供する工程であって、前記キャップ分岐構築物が、第２のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結された第１のオリゴヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記キャッププライマーアダプター構築物の前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの配列の一部に相補的な配列を含み、前記キャップ分岐構築物の前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドが、遊離５’ヌクレオシド三リン酸部分を提供する、提供する工程と、
    （ｅ）前記キャップ分岐構築物の集団を前記ＤＮＡ鋳型構築物の集団と特異的にハイブリダイズさせる工程と、
    （ｆ）プライマー伸長反応を行って、前記ＤＮＡ標的配列の第１のコピーおよび第２のコピーのＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーを生成する工程であって、前記Ｘｐａｎｄｏｍｅｒコピーが、前記キャップ分岐構築物に作動可能に連結されている、生成する工程と、を含む方法。
  31. 前記捕捉オリゴヌクレオチド構造および前記伸長オリゴヌクレオチドが、同じ固体支持体上に固定化され、前記伸長オリゴヌクレオチドが、切断可能なヘアピン構造を含み、前記切断可能なヘアピン構造が、前記切断する工程中に切断されて、前記ＤＮＡアンプリコン産物の結合部位を提供する、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記捕捉オリゴヌクレオチド構造が、マイクロ流体カードの第１のチャンバの第１の基質上に固定化され、前記伸長オリゴヌクレオチドが、前記マイクロ流体カードの第２のチャンバの第２の基質上に固定化され、前記第１のチャンバが、前記一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物の集団を生成するように構成され、前記第２のチャンバが、前記一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーの集団を生成するように構成される、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記捕捉オリゴヌクレオチド構造が、ビーズ支持体上に固定化され、前記伸長オリゴヌクレオチドがＣＯＣチップ支持体上に固定化され、前記ビーズ支持体が、一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物の集団を生成するように構成され、前記ＣＯＣチップ支持体が、前記ＤＮＡ鋳型構築物のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーの集団を生成するように構成される、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記捕捉オリゴヌクレオチド構造および前記伸長オリゴヌクレオチドが、ビーズ支持体上に固定化され、前記ビーズ支持体が、前記一本鎖ＤＮＡ鋳型構築物の集団および前記ＤＮＡ鋳型構築物のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーの集団を生成するように構成される、請求項
    ３０に記載の方法。
  35. 前記伸長オリゴヌクレオチドが、分岐オリゴヌクレオチド構造によって提供され、前記分岐オリゴヌクレオチド構造が、化学分岐剤によって第２の伸長オリゴヌクレオチドに作動可能に連結された第１の伸長オリゴヌクレオチドを含み、前記第１の伸長オリゴヌクレオチドが、リーダー配列と、コンセントレータ配列と、前記化学分岐剤と前記リーダー配列および前記コンセントレータ配列との間に介在する第１の切断可能部分と、を含み、前記第２の伸長オリゴヌクレオチドが、第２の切断可能部分を含む、請求項３０に記載の方法。
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