CN111771001A - 通过芳香族化合物增强核酸聚合 - Google Patents

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迪伦·奥康奈尔
德鲁·古德曼
莱西·莫里尔
贾格德斯瓦兰·钱德拉塞卡
肯德尔·伯格
萨曼莎·韦卢奇
杰西卡·韦卢奇
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Abstract

本发明涉及用于改善核酸聚合的化合物、方法和组合物，包括通过体外引物延伸进行的DNA复制以生成用于例如对DNA模板进行基于纳米孔的单分子测序的聚合物。提供了含聚合增强部分的核酸聚合酶反应组合物，其允许用核苷酸类似物增强DNA聚合酶活性，导致引物延伸产物的长度增加以用于测序应用。

Description

通过芳香族化合物增强核酸聚合
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且在此通过引用并入说明书。含有序列表的文本文件的名称为870225_423WO_序列_LISTING.txt。文本文件为14.9KB，创建于2018年12月19日，并且正在经由EFS-Web电子提交。
发明领域
本发明一般地涉及新型化学实体，更具体涉及任选地具有无机组分的新型有机分子，包括其组合物，及其制造和利用方法，特别是在影响酶性能中的制造和利用方法。
背景
生物分子的测量是现代医学的基础，并且广泛用于医学研究中，以及更尤其是用于诊断和治疗以及药物开发中。核酸编码生物活动和繁殖必需的信息，并且实质上是生命的蓝图。确定此类蓝图可用于纯粹的研究以及应用科学中。在医学中，测序可以用于诊断多种疾病和开发针对多种病状(包括癌症、心脏病、自身免疫性病症、多发性硬化和肥胖)的治疗方法。在工业中，测序可以用来设计改进的酶促过程或合成生物体。在生物学中，该工具例如可用于研究生态系统的健康，并因此具有广泛的实用性。类似地，蛋白质和其他生物分子的测量也提供了疾病和病原体繁殖的标志物以及对疾病和病原体繁殖的理解。
个体独特的DNA序列提供了有关其对某些疾病的易感性的有价值信息。它还为患者提供了用于早期检测的筛选和/或接受预防性治疗的机会。此外，鉴于患者的个人蓝图，临床医生将能够施用个性化疗法，以最大化药物功效和/或最小化不良药物反应的风险。类似地，确定致病生物体的蓝图可以产生传染病的新治疗和更稳健的病原体监测。低成本的全基因组DNA测序将为现代医学奠定基础。为了实现这一目标，必须在通量、精确度和读取长度方面不断发展测序技术。
在过去的十年中，大量的下一代DNA测序技术已经可商购获得，并且大大降低了对整个基因组进行测序的成本。这些包括边合成边测序("SBS")平台(Illumina,Inc.,454Life Sciences,Ion Torrent,Pacific Biosciences)和类似的连接基平台(CompleteGenomics,Life Technologies Corporation)。正在开发利用各种各样的样品处理和检测方法的许多其他技术。例如，GnuBio,Inc.(Cambridge,Mass.)使用微微升反应容器控制数百万个离散的探针测序反应，而Halcyon Molecular(Redwood City,Calif.)则尝试开发使用透射电子显微镜进行直接DNA测量的技术。
基于纳米孔的核酸测序是一种已被广泛研究的引人注目的方法。Kasianowicz等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:13770-13773,1996)表征单链多核苷酸，因为它们通过包埋在脂质双层中的α溶血素纳米孔电移位。证明了在多核苷酸移位期间，可以将纳米孔孔径的部分堵塞测量为离子电流降低。然而，纳米孔中的多核苷酸测序的负担是必须用浸入显著的本底噪声中的小信号差解析紧密间隔的碱基(0.34nm)。由于观察到多核苷酸的快速移位速率(通常每微秒大约1个碱基)，对纳米孔中单碱基分辨率的测量挑战变得更加苛刻。可以通过调整运行参数(诸如电压、盐组合物、pH、温度和粘度)来降低移位速度。然而，此类调整不能将移位速度降低到允许单碱基分辨率的水平。
Stratos Genomics已经开发了一种称为边扩增边测序("SBX")的方法，其使用生物化学过程以将DNA的序列转录在称为"Xpandomer"的可测量聚合物上(Kokoris等人，美国专利No.7,939,259,"High Throughput Nucleic Acid Sequencing by Expansion")。经转录的序列沿着Xpandomer主链编码在高信噪比报告子中，其间距约为10nm并且经设计用于高信噪比、高分化的响应。这些差异相对于天然DNA提供了Xpandomer的序列读段效率和精确度的显著性能增强。Xpandomer可以启用若干种下一代DNA测序检测技术并且非常适合于纳米孔测序。
Xpandomer从非天然核苷酸类似物(称为XNTP)中生成，其特征在于使得Xpandomer主链能够在合成之后扩增的冗长取代基(参见Kokoris等人，经公开的PCT申请WO2016/081871，在本文中通过引用整体并入)。由于它们的非典型结构，XNTP以及其他核苷酸类似物(如，经修饰具有可检测标记部分的核苷酸类似物)作为目前可用的DNA聚合酶的底物引入了新的挑战。Kokoris等人公开的PCT申请WO2017/087281和WO2018/204717(在本文中通过引用整体并入)描述了利用非天然的大体积核苷酸类似物作为底物，具有增强的引物延伸活性的经工程化的DP04聚合酶变体。
在DNA模板本身中，某些核苷酸序列基序已知会给DNA聚合酶带来额外的复制挑战。特别地，结果是数轮的均聚物或短重复DNA序列，其可触发滑链错配或“复制滑移”。复制滑移被认为涵盖以下步骤：(i)通过复制机制拷贝第一重复序列，(ii)复制停滞和聚合酶从新合成的末端中解离，(iii)使新合成的链未配对并且其与第二重复序列配对，和(iv)恢复DNA合成。复制机制停滞在重复区域内因此导致引物和模板的错配。在体内，复制期间两条DNA链的错配可导致DNA重排，诸如各种长度的缺失或复制。在体外，复制滑移导致在滑移事件的位点处的复制错误。聚合酶持续性或精确度的此类减少显著损害了特定的应用或所需的遗传操作。
因此，在包括一种或多种具有非典型结构的试剂的条件下增强聚合酶反应的新方法和组合物(例如，在边扩增边测序(SBX)以及生物技术和生物医学内的其他应用(诸如DNA扩增、常规测序、标记、检测、克隆等))中是必要的，并会在现有技术中找到价值。本发明满足了这些需求并提供了进一步的相关优势。
在背景部分中讨论的所有主题不一定是现有技术，并且不应仅仅由于其在背景部分中的讨论而被认为是现有技术。沿着这些思路，除非明确指出是现有技术，否则不应将在背景部分中讨论的或与此类主题相关的现有技术中的任何问题识别为现有技术。相反，背景部分中对任何主题的讨论都应视为发明人解决特定问题的方法的一部分，而这本身也可能具有创造性。
概述
简言之，本公开提供了增强核酸聚合酶活性的化合物、组合物及期用途。在某些实施方案中，在向聚合酶引入一种或多种挑战的条件(如，包括损害聚合酶持续性的非天然核苷酸类似物底物或模板基序的条件)下聚合酶活性在聚合反应中增强。这种增强通过用本文公开的一种或多种化合物补充聚合反应来实现，所述化合物在本文中被任选地称为聚合酶增强分子或PEM。
在一方面，PEM是式(I)的化合物，包括其溶剂化物、水合物、互变异构体、螯合物或盐，
Figure BDA0002648854970000041
其中，在每次出现时独立地：m是1、2或3；n是0、1或2；p是0、1或2；Ar1是并任选取代的芳基；Ar2选自5-和6-元单环芳族环及包含两个稠合在一起的5-和/或6-元单环的9-和10-元稠合双环，其中两个稠合单环中的至少一个是芳族环，其中Ar2被选自以下的一个或多个取代基任选取代：卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、E-CO2R0、E-CONH2、E-CHO、E-C(O)NH(OH)、E-N(R0)2和E-OR0，其中E选自直连键和C1-C6亚烷基；和R0选自H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基；M选自氢、卤素和C1-C4烷基；以及L是连接基团。
在一方面，本公开提供了增强核酸聚合酶反应的方法，所述方法包括以下步骤：形成包含模板核酸、核酸聚合酶、核苷酸和/或核苷酸类似物的混合物、至少一种PEM的核酸聚合酶反应组合物；和在允许核酸聚合反应的条件下孵育核酸聚合酶反应组合物。PEM增加了核酸聚合酶反应的持续性、速率和/或保真度。在一个实施方案中，与缺乏PEM的核酸聚合酶反应相比，至少一种PEM增加所得核酸产物的长度。
在另外的实施方案中，核酸聚合酶是DNA聚合酶。在某些实施方案中，DNA聚合酶是DPO4或其变体。在其他实施方案中，核苷酸或核苷酸类似物的混合物是包含核苷氨基三磷酸酯的核苷酸类似物的混合物，其中核苷氨基三磷酸酯中的每一种包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合系链部分(polymeric tether moiety)，其中聚合系链部分的第一端连接至核碱基以及聚合系链部分的第二端连接至核苷氨基三磷酸酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割来提供核苷酸类似物的扩增。在一些实施方案中，核酸聚合反应产生核苷酸类似物的可扩增聚合物，其中可扩增聚合物编码模板核酸的核碱基序列信息。在其他实施方案中，用于允许核酸聚合反应的条件包括适合的聚合缓冲液和寡核苷酸引物。在另外的实施方案中，适合的缓冲液包含以下中的一种或多种，例如以下中每一种：Tris OAc，NH4OAc，PEG，水溶性有机溶剂诸如DMF、NMP和丙酮，多磷酸盐60和MnCl2。在其他实施方案中，反应混合物还包含核酸嵌入剂。在其他实施方案中，反应混合物还包含聚阴离子识别部分。在另外的实施方案中，核苷酸或核苷酸类似物的混合物包括包含可检测标记的核苷酸类似物。在其他实施方案中，可检测标记是选自由以下组成的组的光学可检测标记：发光标记、化学发光标记、荧光标记、发荧光标记、发色团标记或显色标记。
在另一方面，本公开提供了包含至少一种PEM和核苷酸类似物的混合物的组合物。该组合物如当与聚合酶组合时是有用的，其中至少一种PEM相对于缺少所述至少PEM的相同聚合反应增加在模板-依赖性聚合反应期间掺入子链的核苷酸类似物的数目和精确度。在其他实施方案中，所述至少一种PEM包括多种PEM。
任选地，核苷酸类似物的混合物包含核苷氨基三磷酸酯，其中核苷氨基三磷酸酯中的每一种包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合系链部分，其中聚合系链部分的第一端连接至核碱基以及聚合系链部分的第二端连接至核苷氨基三磷酸酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割来提供核苷酸类似物的扩增。在其他实施方案中，组合物还包含缓冲液，包括以下中的至少一种、如至少两种、至少三种、至少四种等或每一种：Tris OAc、NH4OAc、PEG、水混溶性有机溶剂诸如DMF和NMP、多磷酸盐60、N-甲基琥珀酰亚胺(NMS)和MnCl2。在其他实施方案中，组合物还包含单链结合蛋白(SSB)。在其他实施方案中，组合物还包含脲。在某些实施方案中，核苷酸类似物的混合物包含含可检测标记的核苷酸类似物。在一些实施方案中，可检测标记是选自由以下组成的组的光学可检测标记：发光标记、化学发光标记、荧光标记、发荧光标记、发色团标记或显色标记。
在另一方面，本发明提供了用于对DNA模板进行测序的方法，该方法包括以下步骤：形成包含DNA模板、与模板复合的复制引物、DNA聚合酶、核苷酸或核苷酸类似物的混合物及至少一种PEM的DNA聚合酶反应组合物，在允许DNA聚合反应的条件下孵育DNA聚合酶反应组合物，其中至少一种PEM增加DNA聚合酶反应的速率、保真度或持续性。该方法还可包括测定所得的核苷酸类似物聚合物所得的核苷酸或核苷酸类似物聚合物中核苷酸或核苷酸类似物的序列。PEM可被描述为式(I)的化合物。在一些实施方案中，至少一种PEM选自式(II)的化合物。在其他实施方案中，核苷酸类似物的混合物包含核苷氨基三磷酸酯，其中核苷氨基三磷酸酯中的每一种包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合系链部分，其中聚合系链部分的第一端连接至核碱基且聚合系链部分的第二端连接至核苷氨基三磷酸酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割来提供核苷酸类似物的扩增。在其他实施方案中，DNA聚合酶是DPO4或其变体。在其他实施方案中，所得的核苷酸类似物聚合物是可扩增聚合物。在其他实施方案中，该方法还包括使可扩增聚合物与氨基磷酸酯切割剂接触以产生核苷酸类似物的扩增聚合物的步骤。在某些实施方案中，核苷酸类似物中的每一种的聚合系链部分包含类似物的核碱基独特的报告子部分。在其他实施方案中，报告子部分产生特征性电信号。在其他实施方案中，测定核苷酸类似物的序列的步骤包括核苷酸类似物的扩增聚合物通过纳米孔移位的步骤。
因此，在一个实施方案中，本公开提供了包含PEM和多核苷酸的组合物。在另一个实施方案中，本公开提供了包含PEM和多肽(如多肽诸如酶)的组合物，其中酶可以是核酸聚合酶。
以下是本公开的一些示例性特定且编号的实施方案。在下面显示的某些示例性Ar1结构中，表示为“k”的位置是其中括号(即“()”)内的三唑环在m为2时与Ar1环键合的位置。此外，除非另外特别提及，否则以化学式标识的每个原子可以是此原子的任何同位素。例如，名称C(碳)包括12C、13C或14C及其混合物，特别是自然丰度同位素混合物，而H(氢)包括1H、2H和3H及其混合物，并且O(氧)包括16O和18O及其混合物，并且N(氮)包括14N和15N及其混合物，对于其他原子类推：
1)式(I)的化合物，或其溶剂化物、水合物、互变异构体、螯合物或盐
Figure BDA0002648854970000071
其中，在每次出现时独立地：m是1、2或3；n是0、1或2；p是0、1或2；Ar1是经任选取代的芳基；Ar2选自5-和6-元单环芳族环以及包含两个稠合在一起的5-和/或6-元单环的9-和10-元稠合双环，其中稠合在一起的所述两个单环中的至少一个是芳族环，其中Ar2被选自以下的一个或多个取代基任选取代：卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、E-CO2R0、E-CONH2、E-CHO、E-C(O)NH(OH)、E-N(R0)2和E-OR0，其中E选自直连键(direct bond)和C1-C6亚烷基；和R0选自H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基；M选自氢、卤素和C1-C4烷基；和L是连接基团。
2)如实施方案1所述的化合物，其中n是0并且m是2，其具有式
Figure BDA0002648854970000072
3)如实施方案1或2所述的化合物，其中Ar1是单环碳环芳基。
4)如实施方案1或2或3所述的化合物，其中m是2并且Ar1选自：
Figure BDA0002648854970000081
5)如实施方案1或2所述的化合物，其中Ar1是单环杂环芳基。
6)如实施方案1或2或5所述的化合物，其中m是2并且Ar1选自：
Figure BDA0002648854970000082
7)如实施方案1或2所述的化合物，其中Ar1是双环芳基。
8)如实施方案1或2所述的化合物，其中m是2并且Ar1是选自以下的双环碳环芳基：
Figure BDA0002648854970000083
9)如实施方案1或2所述的化合物，其中Ar1是选自以下的双环杂环芳基：
Figure BDA0002648854970000084
10)如实施方案1或2所述的化合物，其中Ar1是三环芳基。
11)如实施方案1或2所述的化合物，其中Ar1是选自以下的三环碳环芳基：
Figure BDA0002648854970000091
12)如实施方案1或2所述的化合物，其中Ar1是选自以下的三环杂芳基：
Figure BDA0002648854970000092
13)如实施方案1或2所述的化合物，其中Ar1是选自以下的三环杂芳基：
Figure BDA0002648854970000093
14)如实施方案1-13中任一项所述的化合物，其中Ar1是未取代的芳基。
15)如实施方案1-13中任一项所述的化合物，其中Ar1是经取代的芳基。
16)如实施方案15所述的化合物，其中Ar1上的至少一个取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、硫醇、硝基和腈。
17)如实施方案15所述的化合物，其中Ar1上的至少一个取代基选自由以下组成的组：--SOR1、--S(O)2R1、--S(O)2NR2R3、--OR1、--OC(O)R3、--C(O)OR3、--C(O)R1、--C(O)NR2R3、--NR2R3、--N(R3)C(O)R1和--NS(O)2R3；和其中每次出现的R1独立地选自由以下组成的组：取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基、和取代或未取代的杂芳基；以及每次出现的R2和R3独立地选自由以下组成的组：--H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基、和取代或未取代的杂芳基。
18)如实施方案15所述的化合物，其中Ar1上的至少一个取代基选自由以下组成的组：取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的卤代烷基、和取代或未取代的卤代烷氧基。
19)如实施方案15所述的化合物，其中Ar1上的至少一个取代基选自由–R4-H组成的组，其中R4是一种或多种杂原子中断的亚烷基，其中杂原子是O、S、NH或其组合。
20)如实施方案15所述的化合物，其中Ar1上的至少一个取代基选自由以下组成的组：-O-(C1-6烷基)、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、-CO2-C1-6烷基、-CONH-C1-6烷基、-CONH2、CN和-NO2。
21)如实施方案1-20中任一项所述的化合物，其中Ar2是选自由以下组成的组的5-元单环芳族环：噻吩、1,2-噻唑、1,3-噻唑、呋喃、1,2-噁唑、1,3-噁唑、1H-吡咯、1H-吡唑、噁二唑、噻二唑、1,2,4-三唑、1,2,3-三唑和1H-咪唑。
22)如实施方案1-20中任一项所述的化合物，其中Ar2是选自由以下组成的组的6-元单环芳族环：苯、吡啶、哒嗪、嘧啶和吡嗪。
23)如实施方案1-20中任一项所述的化合物，其中Ar2是选自由以下组成的组的9-元稠合双环芳族环系：苯并呋喃、1,3-苯并噁唑、呋喃并[3,2-b]吡啶、呋喃并[3,2-c]吡啶、呋喃并[2,3-c]吡啶、呋喃并[2,3-b]吡啶、吲哚、1H-苯并咪唑、1H-吡咯并[3,2-b]吡啶、1H-吡咯并[3,2-c]吡啶、1H-吡咯并[2,3-c]吡啶、1H-吡咯并[2,3-b]吡啶、苯并噻吩、1,3-苯并噻唑、噻吩并[3,2-b]吡啶、噻吩并[3,2-c]吡啶、噻吩并[2,3-c]吡啶、苯并噁二唑、苯并噻二唑、苯并异噁唑、苯并三唑和噻吩并[2,3-b]吡啶。
24)如实施方案1-20中任一项所述的化合物，其中Ar2是选自由以下组成的组的10-元稠合双环芳族环系：萘、喹啉、喹唑啉、喹喔啉、1,5-萘啶、1,6-萘啶、1,7-萘啶、1,8-萘啶、异喹啉、酞嗪、2,6-萘啶和2,7-萘啶。
25)如实施方案1-20中任一项所述的化合物，其中Ar2是选自以下的吡啶基环：
Figure BDA0002648854970000111
其中取代基G在吡啶基环上存在0、1或2次。
26)如实施方案1-20中任一项所述的化合物，其中Ar2是下式的苯基环：
Figure BDA0002648854970000112
其中取代基G在苯基环上存在0、1或2次。
27)如实施方案1-20中任一项所述的化合物，其中Ar2是选自以下的取代的苯基环：
Figure BDA0002648854970000113
28)如实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中Ar2上的取代包括氨基。
29)如实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中Ar2上的取代包括甲氧基。
30)如实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中Ar2上的取代包括羧酸。
31)如实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中Ar2上的取代包括–CH2-CO2-CH3。
32)如实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中Ar2上的取代包括三氟甲基。
33)如实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中Ar2上的取代包括羟基。
34)如实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中Ar2上的取代是一个羧酸和一个羟基。
35)如实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中Ar2上的取代是一个羧酸和一个三氟甲基。
36)如实施方案1-24中任一项所述的化合物，其具有在Ar2上的取代，包括羟基、羧酸和三氟甲基中的至少两种。
37)如实施方案1-20中任一项所述的化合物，其具有下式：
Figure BDA0002648854970000121
38)如实施方案1-20中任一项所述的化合物，其具有下式：
Figure BDA0002648854970000122
39)如实施方案1-20中任一项所述的化合物，其具有下式：
Figure BDA0002648854970000123
40)如实施方案1-20中任一项所述的化合物，其具有下式：
Figure BDA0002648854970000124
41)如实施方案1-20中任一项所述的化合物，其具有下式：
Figure BDA0002648854970000131
42)如实施方案1-41中任一项所述的化合物，其呈螯合物的形式。
43)如实施方案42所述的化合物，其中螯合物是铜螯合物。
44)如实施方案1-41中任一项所述的化合物，其logP为至少4.9。
45)一种组合物，其包含如实施方案1-44中任一项所述的化合物和分子拥挤剂(crowding agent)。
46)如实施方案45所述的化合物，其中分子拥挤剂是聚亚烷基二醇。
47)一种组合物，其包含如实施方案1-44中任一项所述的化合物和水性缓冲液。
48)如实施方案47所述的化合物，其中水性缓冲液包括水和Tris HCl。
49)一种组合物，其包含如实施方案1-44中任一项所述的化合物和多核苷酸。
50)如实施方案49所述的化合物，其中多核苷酸是单链多核苷酸。
51)一种组合物，其包含如实施方案1-44中任一项所述的化合物和蛋白。
52)如实施方案51所述的化合物，其中所述蛋白是DNA聚合酶。
53)一种组合物，其包含如实施方案1-44中任一项所述的化合物以及核苷酸或核苷酸类似物的混合物。
54)一种增强核酸聚合酶反应的方法，所述方法包括：
a.形成核酸聚合酶反应组合物，其包含：
i.模板核酸,
ii.核酸聚合酶，
iii.核苷酸或核苷酸类似物的混合物，和
iv.至少一种如实施方案1-44中任一项所述的化合物；和
b.在允许核酸聚合反应的条件下孵育核酸聚合酶反应组合物，其中至少一种如实施方案1-44中任一项所述的化合物增加核酸聚合酶反应的持续性、速率或保真度。
55)如实施方案54所述的方法，其中与缺乏如实施方案1-44中任一项所述的化合物的核酸聚合酶反应相比，如实施方案1-44中任一项所述的化合物增加所得核酸产物的长度。
56)如实施方案54所述的方法，其中至少一种如实施方案1-44中任一项所述的化合物包括多种如实施方案1-44中任一项所述的化合物。
57)如实施方案54所述的方法，其中核酸聚合酶是DNA聚合酶.
58)如实施方案57所述的方法，其中DNA聚合酶是DPO4或其变体。
59)如实施方案54所述的方法，其中核苷酸或核苷酸类似物的混合物是包含核苷氨基三磷酸酯的核苷酸类似物的混合物，其中核苷氨基三磷酸酯中的每一种包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合系链部分，其中聚合系链部分的第一端连接至核碱基以及聚合系链部分的第二端连接至核苷氨基三磷酸酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割来提供核苷酸类似物的扩增。
60)如实施方案54所述的方法，其中核酸聚合反应产生核苷酸类似物的可扩增聚合物，其中所述可扩增聚合物编码所述模板核酸的核碱基序列信息。
61)如实施方案54所述的方法，其中用于允许核酸聚合反应的条件包括适合的聚合缓冲液和寡核苷酸引物。
62)如实施方案54所述的方法，其中适合的缓冲液包含选自以下组的组分：TrisOAc、NH4OAc、PEG、水溶性有机溶剂、多磷酸盐60、NMS和MnCl2。
63)如实施方案54所述的方法，其中反应混合物还包含单链结合蛋白。
64)如实施方案54所述的方法，其中反应混合物还包含脲。
65)如实施方案54所述的方法，其中核苷酸或核苷酸类似物的混合物包含含可检测标记的核苷酸类似物。
66)如实施方案65所述的方法，其中可检测标记是选自由以下组成的组的光学可检测标记：发光标记、化学发光标记、荧光标记、发荧光标记、发色团标记或显色标记。
67)一种用于增强DNA聚合酶反应的持续性、保真度或速率的组合物，其包含至少一种如实施方案1-44中任一项所述的化合物以及核苷酸类似物的混合物。
68)一种包含至少一种如实施方案1-44中任一项所述的化合物以及核苷酸类似物的混合物的组合物，其中相对于缺少所述至少一种如实施方案1-44中任一项所述的化合物的相同聚合反应，至少一种如实施方案1-44中任一项所述的化合物增加在模板-依赖性聚合反应期间掺入子链的核苷酸类似物的数目和精确度。
69)如实施方案68所述的组合物，其中核苷酸类似物的混合物包含核苷氨基三磷酸酯，其中核苷氨基三磷酸酯中的每一种包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合系链部分，其中聚合系链部分的第一端连接至核碱基和聚合系链部分的第二端连接至核苷氨基三磷酸酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割来提供核苷酸类似物的扩增。
70)如实施方案68或69所述的组合物，其还包含含选自以下的一种或多种组分的缓冲液：Tris OAc、NH4OAc、PEG、水溶性有机溶剂、多磷酸盐60、NMS和MnCl2。
71)如实施方案68或69所述的组合物，其还包含单链结合蛋白。
72)如实施方案68或69所述的组合物，其还包含脲。
73)如实施方案68或69所述的组合物，其中核苷酸类似物的混合物包含含可检测标记的核苷酸类似物。
74)如实施方案73所述的组合物，其中可检测标记是选自由以下组成的组的光学可检测标记：发光标记、化学发光标记、荧光标记、发荧光标记、发色团标记或显色标记。
75)一种用于对核酸模板进行测序的试剂盒，其包括至少一种如实施方案67–74中任一项所述的组合物。
76)一种用于对DNA模板进行测序的方法，所述方法包括以下步骤：
a.形成DNA聚合酶反应组合物，其包含：
i.DNA模板，
ii.与所述模板复合的复制引物，
iii.DNA聚合酶，
iv.核苷酸或核苷酸类似物的混合物，
v.至少一种如实施方案1-44中任一项所述的化合物，
b.在允许DNA聚合反应的条件下孵育DNA聚合酶反应组合物，其中至少一种如实施方案1-44中任一项所述的化合物增加DNA聚合酶反应的速率、保真度或持续性；和
c.测定所得的核苷酸或核苷酸类似物聚合物中核苷酸或核苷酸类似物的序列。
77)如实施方案76所述的方法，其中核苷酸类似物的混合物包含核苷氨基三磷酸酯，其中核苷氨基三磷酸酯中的每一种包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合系链部分，其中聚合系链部分的第一端连接至核碱基并且聚合系链部分的第二端连接至核苷氨基三磷酸酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割来提供核苷酸类似物的扩增。
78)如实施方案76或77所述的方法，其中DNA聚合酶是DPO4或其变体。
79)如实施方案76或77所述的方法，其中所得的核苷酸类似物聚合物是可扩增聚合物。
80)如实施方案79所述的方法，其还包括使可扩增聚合物与氨基磷酸酯键切割剂接触以产生核苷酸类似物的扩增聚合物的步骤。
81)如实施方案76或77所述的方法，其中每种核苷酸类似物的聚合系链部分包含类似物的核碱基独特的报告子部分。
82)如实施方案77所述的方法，其中报告子部分产生特征性电信号。
83)如实施方案77所述的方法，其中测定核苷酸类似物的序列的步骤包括核苷酸类似物的扩增聚合物通过纳米孔移位的步骤。
本发明的上述和另外的特征以及获得它们的方式将变得显而易见，并且通过参考以下更详细的描述将最好地理解本发明。本文公开的所有参考文献通过引用整体并入本文，就如同每个被单独并入一样。
提供本概述以简化形式介绍某些概念，这些概念将在下面的详述中进一步详细描述。除非另有明确说明，否则本概述并不旨在标识所要求保护的主题的关键或必要特征，也不旨在限制所要求保护的主题的范围。
一种或多种实施方案的细节在以下描述中阐述。结合一个示例性实施方案示出或描述的特征可以与其他实施方案的特征结合。因此，可以将本文描述的各种实施方案中的任一种组合以提供另外的实施方案。如果有必要采用本文所标识的各种专利、申请和出版物的概念，则可以修改实施方案的各方面，以提供另外实施方案。根据说明书、附图和权利要求书，其他特征、目的和优点将是显而易见的。
附图简述
本公开的示例性特征、其性质和各自优势从附图和以下各种实施方案的详述中将显而易见。参照附图描述非限制性和非穷举性实施方案，其中类似标记或参考数字是指贯穿各个视图的类似部分，除非另有说明。附图中要素的尺寸和相对位置不必按比例绘制。例如，选择、放大和定位各种要素的形状以提高图形可读性。为了便于识别附图，已选择了所绘制要素的特定形状。
图1A、1B、1C和1D是说明通用XNTP的主要特征及其在边扩增边测序(SBX)中的用途的缩编示意图。
图2是说明XNTP的一个实施方案的更多细节的示意图。
图3是说明通过生物纳米孔的Xpandomer的一个实施方案的示意图。
图4是显示引物延伸产物的凝胶。
图5是显示引物延伸产物的凝胶。
图6A和6B是纳米孔-来源的序列的对齐读取(reads)群的直方图显示。
图7A和7B是纳米孔-来源的序列的对齐读取群的直方图显示。
图8是显示引物延伸产物的凝胶。
图9是显示引物延伸产物的凝胶。
图10是显示引物延伸产物的凝胶。
图11是显示引物延伸产物的凝胶。
图12是显示引物延伸产物的凝胶。
图13是显示引物延伸产物的凝胶。
图14是显示引物延伸产物的凝胶。
发明详述
通过参考以下本发明的优选实施方案的详述和本文包括的实施例，可以更容易地理解本发明。除非另有解释，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
在一方面，本公开内容的PEM是式(I)的化合物，以及其溶剂化物、水合物、互变异构体、螯合物或盐，
Figure BDA0002648854970000181
其中，在每次出现时独立地：
m是1、2或3；
n是0、1或2；
p是0、1或2；
Ar1是经任选取代的芳基；
Ar2选自5-和6-元单环芳族环以及包含两个稠合在一起的5-和/或6-元单环的9-和10-元稠合双环，其中两个单环中的至少一个是芳族环，其中
Ar2被选自以下的一个或多个取代基任选取代：卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、E-CO2R0、E-CONH2、E-CHO、E-C(O)NH(OH)、E-N(R0)2和E-OR0，其中
E选自直连键和C1-C6亚烷基；和
R0选自H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基，
M选自氢、卤素和C1-C4烷基；和
L是连接基团。
如在说明书和所附权利要求书中使用的，除非有相反的说明，否则以下术语具有所指出的含义。
本文命名的某些化学基团之前带有速记符号，表示在指定化学基团中存在的碳原子总数。例如，C1-C4烷基，其可以可替换地写为C1-4烷基，描述了具有至少一个碳原子且至多多达4个碳原子的烷基，而C4-C12环烷基烷基(同样可以写为C4-12环烷基烷基)描述总共具有4至12个碳原子的环烷基烷基基团。速记符号中的碳原子总数不包括所述基团的取代基中可能存在的碳原子。例如，C1-C6烷基是指含有一至六个碳原子的烷基基团；C1-C6卤代烷基是指含有一至六个碳原子的卤代烷基基团；C1-C6亚烷基是指含有一至六个碳原子的亚烷基二基。
除了如在说明书和所附权利要求书中所用的前述内容，除非有相反的说明，否则以下术语具有所指示的含义：
"烷基"是指仅由碳和氢原子组成、不含有不饱和度、并且任选地具有指定数量的碳原子(如具有1至12个碳原子、1至8个碳原子或1至6个碳原子或1到4个碳原子)，以及通过单键连接至分子的其余部分的直链或支链烃链基。实例是甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基等。当将不饱和度引入烷基基团中时，所得的基团可被称为不饱和烷基基团，其中不饱和烷基基团通常被称为烯基基团(具有至少一个碳-碳双键)和炔基基团(具有至少一个碳-碳三键)。在一个实施方案中，在指定时，本文公开的化合物中的烷基基团可以是或包括不饱和烷基基团。
"烯基"是指仅由碳和氢原子组成、含有至少一个双键、任选地具有指定的碳数(如，两个至十二个碳原子，或两个至八个碳原子，或两个至六个碳原子，或两个至四个碳原子)，并且通过单键连接至分子的剩余部分的直链或支链烃链基基团，如乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基等。
"炔基"是指仅由碳和氢原子组成、含有至少一个三键、任选地具有指定的碳数(如，具有两个至十二个碳原子，或两个至八个碳原子，或两个至六个碳原子，或两个至四个碳原子)，并且通过单键连接至分子的剩余部分的直链或支链烃链基基团，如，乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基等。
"卤素"是指溴、氯、氟或碘。
"卤代烷基"是指如上所定义的烷基基团，其被如上所定义的一个或多个卤代基取代，如三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1-氟甲基-2-氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1-溴甲基-2-溴乙基等。类似地，“卤代烯基"是指被一个或多个如本文所定义的卤代基取代的如本文所定义的烯基基团，以及“卤代炔基”是指如本文所定义的的炔基基团，其被如本文所定义的一个或多个卤代基取代。
"亚烷基"或"亚烷基链"是指将分子的剩余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，其仅由碳和氢组成、不含不饱和度并且任选地具有指定数目的碳原子。实例是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚正丁基等。亚烷基链通过单键连接至分子的剩余部分并且通过单键连接至基团。亚烷基链至分子的剩余部分和基团的连接点可以通过链中的一个碳或任两个碳进行。类似于烷基基团，可将不饱和度引入亚烷基链中，以提供不饱和亚烷基链。如果将不饱和度引入亚烷基链中，则所得的基团可称为不饱和亚烷基或链，其中不饱和亚烷基链通常称为亚烯基(具有至少一个碳-碳双键)和亚炔基(具有至少一个碳-碳三键)。在一个实施方案中并且在指定时，本文公开的化合物中的亚烷基链可以是或包括不饱和亚烷基链。
"亚烯基"或"亚烯基链"是指将分子的剩余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，其仅由碳和氢组成、含有至少一个双键并且任选地具有指定数目的碳原子(如，2至12个碳原子)。亚烯基基团的实例是亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基等。亚烯基链通过单键连接至分子的剩余部分，并通过双键或单键连接至基团。亚烯基链至分子的剩余部分和基团的连接点可以通过链中的一个碳或任两个碳进行。
"芳基"是指包含至少5个环原子的、任选包含1-6个选自O、S和N的杂环原子和至少一个芳族环的环系基团。5-元单环芳族环含有5个选自碳和杂原子的环原子，而6-元单环芳族环含有6个选自碳和杂原子的环原子。具有5个单元的示例性单环芳族环是吡咯和具有6个成员的示例性单环芳族环是吡啶。芳基基团可以是如单环、双环、三环或四环环体系，其可包括稠合或桥接环体系。碳环芳基基团在环原子处仅含有碳，其中实例包括但不限于来源于醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、薁、苯、
Figure BDA0002648854970000211
荧蒽、芴、不对称引达省、对称引达省、茚满、茚、萘、非那烯、菲、七曜烯、芘和三亚苯的芳基基团。在一个实施方案中，芳基是苯基或萘基，并且在另一个实施方案中，是苯基。当芳基基团包括非碳环原子(如氧、硫和氮)时，该芳基基团可被称为杂芳基基团。杂芳基基团可以是如单环、双环、三环或四环环系，其可以包括稠合或桥接的环系。杂芳基基团中的氮、碳或硫原子可被任选氧化；氮原子可被任选季铵化。
"融合"是指在环之间含有融合物的环体系，其中融合物是指共有两个相邻环原子的环。含有融合在一起的两个5-和/或6-元单环的融合环是指双环体系，其中每个环是单环并且独立具有5或6个环原子，并且两个环融合使得它们共有两个环原子。例如，萘是从融合在一起的两个6-元单环(苯)形成的10-元融合环体系。萘是其中其含有两个(bi＝2)环的双环。作为另一个实例，1,3-苯并噻唑，其是从稠合在一起的一个6-元环(苯)和一个5-元环(1,3-噻唑)形成的9-元稠环体系。1,3-苯并噻唑是其中含有两个环的双环。
"碳环基"是指由3至18个碳原子组成的稳定3-至18-元芳族或非-芳族环基团。除非在说明书中另外特别说明，否则碳环基基团可以是单环、双环、三环或四环环体系，其可以包括稠合或桥接的环体系，并且可以是部分或完全饱和的。非芳族碳环基基团包括环烷基，而芳族碳环基基团包括芳基。
"环烷基"是指仅由碳和氢原子组成的的稳定非-芳族单环或多环烃基，其可包括稠合或桥接环体系，具有三至十五个碳原子(优选具有三至十个碳原子)，并且是饱和的或不饱和的且通过单键连接至分子的剩余部分。单环基团包括例如、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环基团包括例如金刚烷基、降冰片基、萘烷基、7,7-二甲基-双环-[2.2.1]庚烷基等。
"杂环基"是指由两个至十二个碳原子以及一至六个选自氮、氧和硫的杂原子组成的稳定的3-至18-元芳族或非-芳族环基。除非在说明书中另有明确说明，否则杂环基基团可以是单环、双环、三环或四环环体系，其可以包括稠合或桥接的环体系；并且杂环基基团中的氮、氧或硫原子可以被任选氧化；氮原子可以被任选季铵化；以及杂环基基团可以是部分或完全饱和的。非-芳族杂环基基团的实例包括但不限于二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、吡唑并嘧啶基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噁烷基、三噻烷基、三嗪烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫代吗啉基、1-氧代-硫代吗啉基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。
任选地，尽管仅在指定时，本文公开的PEM化合物中的烷基、烯基、亚烷基、亚烯基、碳环基、环烷基、芳基、杂环基和杂芳基中的每一种可被选自由以下组成的组的一种或多种未取代的(如烷基基团上的烷基取代基未被进一步取代，即烷基取代基是未取代的烷基)取代基取代：烷基、烯基、卤代基、卤代烷基、卤代烯基、氰基、氧代基、硫代、硝基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、--Rb—ORa、--Rb--OC(O)—Ra、--Rb--N(Ra)2、--Rb--C(O)Ra、--Rb--C(O)ORa、--Rb--C(O)N(Ra)2、--Rb--N(Ra)C(O)ORc、--Rb--N(Ra)C(O)Rc、--Rb--N(Ra)S(O)tRc(其中t是1至2)、--Rb—N＝C(ORa)Ra、--Rb--S(O)tORc(其中t是1至2)、--Rb--S(O)sRc(其中s是0至2)和–Rb--S(O)tN(Ra)2(其中t是1至2)，其中每个Ra独立为氢、烷基、烯基、卤代烷基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基；每种Rb独立为直连键或直链或支链亚烷基或亚烯基链；和每个Rc是烷基、烯基、卤代烷基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基。
"氨基"是指--NH2基团。"氰基"是指--CN基团。"羟基"是指--OH基团。"硝基"是指--NO2基团。"氧代基"是指＝O取代基。"硫代"是指＝S取代基。"三氟甲基"是指--CF3基团。"三氟甲氧基"是指--OCF3基团。硫醇(Mercaptan)，也被称为巯基(thiol)，是指–SH基团。
"酰基"是指基团--C(O)R，其还可被写为–C(＝O)R，其中R是烷基、芳烷基、碳环基、芳基、杂芳基或杂环基。例如，当R是甲基时，酰基基团可被称为乙酰基。
"烷氧基"是指式–OR的基团，其中R是烷基或卤代烷基基团。在一个实施方案中，烷氧基基团含有多达六个碳原子。代表性烷氧基基团包括甲氧基和乙氧基。被卤代基取代的烷氧基可在本文中称为卤代烷氧基，其包括例如三氟甲氧基、三氯甲氧基等。
"亚杂烯基"或"亚杂烯基链"是指连接分子的剩余部分至基团、由碳和氢及至少一个选自N、O和S的杂原子组成的直链或支链二价烃链。
"卤代烷氧基"是指被如上所定义的一个或多个卤代基取代的烷氧基基团，如三氟甲氧基、二氟甲氧基、三氯甲氧基、2,2,2-三氟乙氧基、3-溴-2-氟丙基氧基等。卤代烷氧基基团的烷氧基部分可如本文对烷氧基基团所定义被任选取代。
"N-杂环基"是指含有至少一个氮的杂环基基团。N-杂环基基团可如上文对杂环基基团所定义被任选取代。
"杂环基烷基"是指式--RbRh的基团，其中Rb是如上所述的亚烷基链并且Rh是如上所定义的杂环基基团，并且如果杂环基是含氮杂环基，则杂环基可在氮原子处连接至烷基基团。杂环基烷基基团的亚烷基链可如上对亚烷基链所定义被任选取代。杂环基烷基基团的杂环基部分可如本文对杂环基基团所定义被任选取代。
"N-杂芳基"是指如上定义且含有至少一个氮并且杂芳基基团至分子的剩余部分的连接点通过杂芳基基团中的氮原子进行的杂芳基基团。N-杂芳基基团可如本文对杂芳基基团所定义被任选取代。
"杂芳基烷基"是指式--RbRi的基团，其中Rb是如上所定义的亚烷基链并且Ri是如本文所定义的杂芳基基团。杂芳基烷基基团的杂芳基部分可如本文对杂芳基基团所定义被任选取代。杂芳基烷基基团的亚烷基链部分可如本文对亚烷基链所定义被任选取代。类似地，芳基烷基基团是指杂芳基烷基基团，其中杂芳基部分被相应的碳环芳基基团替代，即杂原子被碳取代，其中对氢取代进行必要的调整。
"羟基烷基"是指式--RbOH的基团，其中Rb是如本文所定义的亚烷基链。--OH(羟基(hydroxyl)又称羟基(hydroxy))基团可连接至亚烷基链中的任何碳。杂芳基烷基基团的亚烷基链部分可另外如上文对亚烷基链所定义被任选取代。
本文所述的具有酸性或碱性基团的PEM化合物通常可以用作游离酸或游离碱。可替代地，具有酸性或碱性基团的PEM化合物可以盐，如酸或碱加成盐的形式使用。游离氨基化合物的酸加成盐可以通过本领域众所周知的方法制备，并且可以由有机酸和无机酸形成。适合的有机酸包括马来酸、富马酸、苯甲酸、抗坏血酸、琥珀酸、甲磺酸、乙酸、三氟乙酸、草酸、丙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、扁桃酸、肉桂酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、乙醇酸、谷氨酸和苯磺酸。适合的无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和硝酸。碱加成盐包括那些与羧酸根阴离子形成的盐，并且包括与有机和无机阳离子(诸如选自碱和碱土金属(例如，锂、钠、钾、镁、钡和钙)的那些)形成的盐，以及铵粒子和其经取代的衍生物(例如，二苄基铵、苄基铵、2-羟基乙基铵等)。因此，本文描述的PEM化合物的术语"盐"意在涵盖任何和所有盐形式。
本文公开的PEM化合物可呈螯合物的形式。螯合物是指含有在两个或多个点处键合至中心金属原子的有机配体(诸如三唑-Ar基团)的化合物。
关于立体异构体，本文所述的PEM化合物可具有一个或多个手性(或不对称)中心，并因此可产生对映异构体、非对映异构体和可以在绝对立体化学的方面被定义为(R)-或(S)-的其他立体异构体形式。当本文所述的化合物含有烯烃双键或其他几何不对称中心时并且除非另有说明，否则化合物意在包括E和Z几何异构体(如，顺式或反式)。同样，除非另有说明，否则所有可能的异构体以及其外消旋和光学纯形式及所有互变异构形式也意在包括在内。因此，包括各种立体异构体及其混合物包括"对映异构体"，其是指两种立体异构体，其分子是彼此不可重叠的镜像。因此，该化合物可以任何异构体形式出现，包括外消旋体、外消旋混合物，以及作为单独的对映异构体或非对映异构体。
此外，PEM化合物的某些晶体形式可能以多晶型物存在，其包括在本文中。此外，某些PEM化合物也可能与水或其他有机溶剂形成溶剂化物。此类溶剂化物类似地包括在本文所述的化合物的范围内。
如本领域的技术人员将理解的，任何上述化合物可以掺入放射性同位素。因此，还考虑使用与本文描述的那些相同的同位素标记的化合物，其中一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界通常发现的原子质量或质量数的原子代替。可以掺入这些化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素。因此，提及诸如氢(H)或碳(C)旨在涵盖其所有同位素。例如，指定C(碳)包括12C、13C或14C及其混合物，而H(氢)包括1H、2H和3H及其混合物，和O(氧)包括16O和18O及其混合物，和N(氮)包括14N和15N及其混合物，对于其他原子类推。同位素标记的PEM化合物可用于在用于分析等时追踪PEM化合物或其部分。
在式(I)的PEM化合物中，Ar1是芳基基团，被称为芳族部分。芳族部分可以是碳环或杂环芳族部分，其中每个芳族环原子是碳环芳族部分中的碳，而至少一个芳族环原子是杂环芳族部分中的氮、氧或硫。
在一个实施方案中，Ar1可以包含1-6个环，其中多达六个环原子可选自氧、硫和氮，剩余部分是碳原子。任选地，Ar1部分可包含1-5个环，其中多达五个环原子可选自氧、硫和氮。作为另一选择，Ar1基团可包含1-4个环，其中最多四个环原子可选自氧、硫和氮。作为又一选择，Ar1部分可包含1-3个环，其中最多三个环原子可选自氧、硫和氮。作为另一个实例，Ar1可包含1-2个环，其中最多三个环原子可选自氧、硫和氮。在任何情况下，每个环可以独立地是一个五元环，即五个环原子形成环，或六元环，或七元环，而在一个选择中，每个环是五元环或六元环。
示例性芳族部分是碳环芳族部分。碳环部分可含有一个(如，苯)或两个(如，萘、薁)或三个(如，苊烯、芴)或四个(如，荧蒽、醋蒽烯)或五个(如，并五苯、苉)或六个(如，并六苯)芳族环，其中为了方便起见，Ar1基团可以在本文中以其未取代的形式(如，苯)命名来示例，尽管在本文公开的化合物中Ar1基团是相应基团，如，当m是2并且Ar1在其他方面未取代时，用三唑基团代替了两个环氢。例如，芳族部分可为单环碳环部分，即苯基，还被称为C6芳族部分。作为另一个实例，芳族部分可以是双环碳环部分，如萘基，其是C10芳族部分。
示例性Ar1芳族部分是杂环芳族部分，其还可被称为杂芳基基团。杂环部分除了含有1或2或3或4或5或6个杂原子(即除了碳之外的原子，选自氮、硫和氧原子)之外还可含有一个或两个或三个或四个或五个或六个芳族环。任选地，杂原子如果存在则是氮。例如，芳族部分可为单环杂环部分，如吡啶基，其是六元C5芳族部分，或吡嗪基，其是六元C4芳族部分。作为另一个实例，芳族部分可以是双环杂环部分，如喹啉基或异喹啉基，其是十元C9芳族部分，或1,5-萘啶基、2,6-萘啶基或2,7-萘啶基，其是示例性十元C8芳族部。
因此，杂芳基基团是含有5或更多个环成员的芳族环化合物，其中的一个或多个是杂原子诸如但不限于N、O和S。指定为C2-杂芳基的杂芳基基团可以是具有两个碳原子和三个杂原子的5-元环，具有两个碳原子和四个杂原子的6-元环，以此类推。类似地，C4-杂芳基可以是含一个杂原子的5-元环、含两个杂原子的6-元环，以此类推。碳原子数+杂原子数总和等于总环原子数。杂芳基基团包括但不限于基团诸如吡咯基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、吡啶基、硫苯基、苯并硫苯基、苯并呋喃基、吲哚基、氮杂吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、氮杂苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、咪唑并吡啶基、异噁唑并吡啶基、硫杂萘基、嘌呤基、黄嘌呤基、腺嘌呤基、鸟嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、喹喔啉基和喹唑啉基基团。因此，术语"杂芳基"和"杂芳基基团"包括融合环化合物，诸如其中至少一个环但不必然是所有环是芳族，包括四氢喹啉基、四氢异喹啉基、吲哚基和2,3-二氢吲哚基。
当m是2，使得Ar1必需被两个三唑-Ar2部分取代时，Ar1芳族部分中的任两个碳原子都可以被这两个三唑-Ar2部分之一取代。例如，当Ar1是取代的苯时，Ar1可以在邻位、间位或对位取代，如下所示，其中k表示在芳族部分上可发生取代的位置：
Figure BDA0002648854970000271
作为另一个实例，当Ar1是取代的萘且m为2时，Ar1可以在任两个萘基碳原子处被取代，其中以下结构显示取代选项，其中k显示由(三唑-Ar2)提供的三唑取代基可以发生在芳族部分上的位置：
Figure BDA0002648854970000272
前述实例使用碳环芳族Ar1基团作为说明性Ar1部分说明了Ar1上的三唑取代。然而，相同的原理适用于杂环芳族Ar1基团上的三唑取代。例如，当Ar1是取代的吡啶并且m是2时，(三唑-Ar2)的两个三唑基团可位于吡啶环上的以下位置中任一个处，其中k用于指定三唑基团可位于的位置：
Figure BDA0002648854970000273
因此，在一个示例性实施方案中，Ar1是选自以下的单环杂芳结构：
Figure BDA0002648854970000281
其中三唑环在Ar1上的位置k处被取代。在另一个示例性实施方案中，Ar1是选自以下的单环碳环结构：
Figure BDA0002648854970000282
Figure BDA0002648854970000283
其中三唑环在Ar1上的位置k处被取代。在另一个示例性实施方案中，Ar1是选自以下的双环碳环结构：
Figure BDA0002648854970000284
Figure BDA0002648854970000285
其中三唑环在Ar1上的位置k处被取代。在另一个实施方案中，Ar1是多环杂环结构，其具有两个六元环和一个五元环以及一个氮环原子，并选自
Figure BDA0002648854970000286
Figure BDA0002648854970000287
其中三唑环在Ar1上的位置k处被取代。在又一个示例性实施方案中，Ar1是多环杂环结构，其具有三个六元环和两个氮环原子并选自：
Figure BDA0002648854970000288
Figure BDA0002648854970000291
其中三唑环在Ar1上的位置k处被取代。
Ar1包括如本文所述的取代的和非取代的芳族部分。在一个实施方案中，Ar1是取代的芳族部分。在一个实施方案中，Ar1是非取代的芳族部分，其还被称为未取代的芳族部分。在取代的芳族部分中，键合至环原子的一个或多个氢原子已被取代基所取代，例如，任选地1、或2、或3、或4、或5、或6个氢原子可被取代基替代。Ar1上的取代基不是指当m等于1时必需存在的三唑-Ar2部分，或当m等于2时必需存在的两个三唑-Ar2部分，或当m等于3时必需存在的三个三唑-Ar2部分。
在一个实施方案中，Ar1上的取代基将由选自氘、卤素(F、Cl、Br、I)、碳、氮、氧和硫的原子组成，并且任选地还将含有氢，并且还将含有形成抗衡离子的另外原子(如果存在的话)。氘和卤素被认为是单价原子，而碳、氮、氧和硫由于能够同时形成一个以上的共价键，因此被认为是多价原子。除了单价原子，Ar1上的取代基可具有多个多价原子，如1-25个多价原子、或1-20个多价原子、或1-15个多价原子、或1-10个多价原子、或1-5个多价原子，原子任选地选自碳、氮、氧和硫。下面提供了最多10个多价原子的取代基的示例。用类推的方法本领域普通技术人员已知其他取代基，包括具有最多25个多价原子的取代基。
在一个实施方案中，Ar1上的取代基含有0个多价原子。在该实施方案中，键合至环原子的氢被另一种单价原子(诸如氘、氟、氯、溴或碘)替代。
在一个实施方案中，Ar1上的取代基含有1个多价原子。在该实施方案中，键合至Ar1的环原子的一个或多个氢原子被单个多价原子替代，其中多价原子上的开放化合价填充有一个或多个单价原子，实例是：羟基(OH)、巯基(SH)、氨基(NH2)、甲基(CH3)和亚甲基(＝CH2)，包括其完全或部分卤素化和氘化形式，如CF3。
在一个实施方案中，Ar1上的取代基含有2个多价原子。在该实施方案中，键合至Ar1的环原子的一个或多个氢原子被第一多价原子替代，所述第一多价原子继而键合至第二多价原子，因此提供从两个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放化合价填充有一个或多个单价原子。这些取代基的实例是本领域普通技术人员所熟知的。特定实例包括乙基(CH2CH3)、亚乙基(CH＝CH2)、乙炔基(C≡CH)、亚乙基(＝CHCH3)、氨基甲基(CH2NH2)、氨基亚甲基(＝CHNH2)、硫代亚甲基(＝CHSH)、羟基亚甲基(＝CHOH)、羟基甲基(CH2OH)、硫代甲基(CH2SH)、N-甲基胺(NHCH3)、甲基硫化物(SCH3)、甲氧基(OCH3)、腈(CN)、甲酰基(C(O)H)、硫代甲酰基(C(S)H)、N-羟基(N-OH)、羟胺(ONH2)、肼(NHNH2)、二嗪(N＝NH)、重氮基(N≡N)，包括其完全或部分卤素化和氘化形式，如OCF3和CH2CD3。
在一个实施方案中，Ar1上的取代基含有3个多价原子。在该实施方案中，键合至Ar1的环原子的一个或多个氢原子被第一多价原子替代，所述第一多价原子继而直接或间接键合至第二和第三多价原子中的每一个；因此，第一多价原子键合至第二多价原子，和第三多价原子键合至第一和第二多价原子中的一个或两个，因此提供从三个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放化合价填充有一个或多个单价原子。这些取代基的实例是本领域普通技术人员熟知的，并且提供在本文中，如硝基、甲基酮、羧基。
在一个实施方案中，Ar1上的取代基含有4个多价原子。在该实施方案中，键合至Ar1的环原子的一个或多个氢原子被第一多价原子替代，所述第一多价原子继而直接或间接键合至第二、第三和第四多价原子中的每一个，因此提供由四个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放化合价填充有一个或多个单价原子。这些取代基的实例是本领域普通技术人员公知的并且在本文中提供，如甲酯(CO2CH3)、N-甲基甲酰胺(C(O)NHCH3)和乙酰胺(NHC(O)CH3)。
在一个实施方案中，Ar1上的取代基含有5个多价原子。在该实施方案中，键合至Ar1的环原子的一个或多个氢原子被第一多价原子替代，所述第一多价原子继而直接或间接键合至第二、第三、第四和第五多价原子中的每一个，因此提供由五个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放化合价填充有一个或多个单价原子。这些取代基的实例是本领域普通技术人员公知的并且在本文中提供，如乙酯(CO2CH2CH3)、S-乙基硫代磷酸酯(C(O)SCH2CH3)、N-乙基甲酰胺(C(O)NHCH2CH3)和N,N-二甲基甲酰胺(C(O)N(CH3)2)。
在一个实施方案中，Ar1上的取代基含有6个多价原子。在该实施方案中，键合至Ar1的环原子的一个或多个氢原子被第一多价原子替代，所述第一多价原子继而直接或间接键合至第二、第三、第四、第五和第六多价原子中的每一个，因此提供由六个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放化合价填充有一个或多个单价原子。这些取代基的实例是本领域普通技术人员公知的，并且在本文中提供，如N-环丙基甲酰胺(C(O)NH-环丙基)、N-丙基甲酰胺(C(O)NHCH2CH2CH3)、N-(2-羟乙基)甲酰胺(C(O)NHCH2CH2OH)和N-氨基亚氨基甲基(carbamimido)甲酰胺(C(O)NHC(＝NH)NH2)。
在一个实施方案中，Ar1上的取代基含有7个多价原子。在该实施方案中，键合至Ar1的环原子的一个或多个氢原子被第一多价原子替代，所述第一多价原子继而直接或间接键合至第二、第三、第四、第五、第六和第七多价原子中的每一个，因此提供由七个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放化合价填充有一个或多个单价原子。这些取代基的实例是本领域普通技术人员公知的，并且在本文中提供，如，N-(n-丁基)甲酰胺(C(O)NHCH2CH2CH2CH3)、N-(叔丁基)甲酰胺(C(O)NHC(CH3)3)、N,N-二乙基甲酰胺(C(O)N(CH2CH3)2)和N-环丁基甲酰胺(C(O)NH(环丁基))。
在一个实施方案中，Ar1上的取代基含有8个多价原子。在该实施方案中，键合至Ar1的环原子的一个或多个氢原子被第一多价原子替代，所述第一多价原子继而直接或间接键合至第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八多价原子中的每一个，因此提供由八个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放化合价填充有一个或多个单价原子。这些取代基的实例是本领域普通技术人员公知的，并且在本文中提供，如N-环戊基甲酰胺(C(O)NH(环戊基))、(哌啶-1-基)甲酮(C(O)-哌啶-1-基)和(吗啉-4-基)甲酮(C(O)-吗啉-4-基)。
在一个实施方案中，Ar1上的取代基含有9个多价原子。在该实施方案中，键合至Ar1的环原子的一个或多个氢原子被第一多价原子替代，所述第一多价原子继而直接或间接键合至第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和第九个多价原子中的每一个，因此提供由九个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放化合价填充有一个或多个单价原子。这些取代基的实例是本领域普通技术人员公知的，并且在本文中提供，如二-(异丙基)酯(C(O)O(CH(CH3)2)2、二-(正丙基)酯(C(O)O(CH2CH2CH3)2)、N-环己基甲酰胺(C(O)NH(环己基))、(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮(C(O)(4-甲基哌嗪-1-基)、2-(乙酰基氨基)乙基甲酰胺(C(O)NHCH2CH2NHC(O)CH3)和N-苯基甲酰胺(C(O)NH(苯基))。
在一个实施方案中，Ar1上的取代基含有10个多价原子。在该实施方案中，键合至Ar1的环原子的一个或多个氢原子被第一多价原子替代，所述第一多价原子继而直接或间接键合至第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九和第十个多价原子中的每一个，因此提供由十个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放化合价填充有一个或多个单价原子。这些取代基的实例是本领域普通技术人员公知的，并且在本文中提供，如N-苄基甲酰胺(C(O)NHCH2(苯基))。
在一个实施方案中，Ar1是经取代的芳基，其中Ar1上的至少一个取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、硫醇、硝基和腈。
在一个实施方案中，Ar1是经取代的芳基，其中Ar1上的至少一个取代基选自由以下组成的组：--SOR1、--S(O)2R1、--S(O)2NR2R3、--OR1、--OC(O)R3、--C(O)OR3、--C(O)R1、--C(O)NR2R3、--NR2R3、--N(R3)C(O)R1和--NS(O)2R3；以及其中每次出现的R1独立地选自由以下组成的组：取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基；以及每次出现的R2和R3独立地选自由以下组成的组：--H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基。
在一个实施方案中，Ar1是取代的芳基，其中Ar1上的至少一个取代基选自由以下组成的组：取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的卤代烷基和取代或未取代的卤代烷氧基。
在一个实施方案中，Ar1是取代的芳基，其中Ar1上的至少一个取代基选自由–R4-H组成的组，其中R4是一个或多个杂原子中断的亚烷基，其中杂原子是O、S、NH或其组合。
Ar1基团将包含如本文解释的芳族部分，其中此芳族部分可还如本文所述被任选取代，所述取代除了被(三唑-Ar2)m基团取代之外。在一个实施方案中，Ar1的示例性取代基是卤素(诸如氟、氯和溴)，具有1-6个碳原子的烷基基团(诸如甲基和乙基)，具有1-6个碳原子的卤代烷基基团(诸如三氟甲基、氰基、甲酰基和甲酰胺)。在另一个实施方案中，Ar1的示例性取代基是硝基(-NO2)，氰基(-CN)，羧酸(-COOH或其盐)，甲酰胺(-C(O)NH2)，C1-C6烷氧基(包括甲氧基)，C1-C6烷基(包括甲基)，C1-C6卤代烷基诸如三氟甲基，C1-C6杂烷基包括酰胺诸如–NHC(O)(C1-C6烷基)、-NHC(O)(C1-C6杂烷基)、-C(O)NH(C1-C6烷基)、-C(O)NH(C1-C6杂烷基)、–C(O)N(C1-C6烷基)(C1-C6烷基)、-C(O)N(C1-C6烷基)(C1-C6杂烷基)和–C(O)N(C1-C6杂烷基)(C1-C6杂烷基)，包括–NHC(O)CH3、C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-NHC(O)CH2CH3、C(O)NHCH2CH3、-C(O)N(CH3)CH2CH3、-C(O)N(CH2CH3)2、-C(O)NH(C1-C6环烷基)和–NHC(O)(C1-C6环烷基)(如C(O)NH(环丙基)、-NHC(O)-环丙基、C(O)NH(环己基)、NHC(O)-环己基)、C(O)NHCH2CH2CH2CH3、-C(O)NH(C(CH3)3)、-C(O)NH(CH2CH2OH)，酮诸如–C(O)(C1-C6烷基)(包括–C(O)CH3)、-C(O)(环烷基)(包括–C(O)-环己基)和C(O)-(杂环烷基)，其中杂环烷基可以是如吗啉基、哌啶基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基，酯诸如–CO2-(C1-C6烷基)(包括–CO2CH3、-CO2CH2CH3、-CO2CH2CH2CH3、-CO2CH2(CH3)2)和硫代酯诸如C(O)-S-(C1-C6烷基)(包括–C(O)-S-CH3和–C(O)-S-CH2CH3)。
在一个实施方案中，Ar1是经取代的芳基，其中Ar1上的至少一个取代基选自由以下组成的组：-O-(C1-6烷基)、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、-CO2-C1-6烷基、-CONH-C1-6烷基、-CONH2、CN；和-NO2。
在一个实施方案中，当n不等于0时，Ar1上的取代将包括一个或多个三唑-Ar2基团。在一个实施方案中，Ar1上的任选取代包括确切一个三唑-Ar2基团，使得本文公开的化合物任选具有确切两个三唑-Ar2基团(当m是1时)，或任选地具有确切三个三唑-Ar2基团(当m是2时)，如例如4,4'-((4-(丁-3-炔-1-基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)所示，其是本文鉴定的化合物47。在另一个实施方案中，Ar1上的任选取代包括确切两个三唑-Ar2基团，使得本文公开的化合物任选地具有确切三个三唑-Ar2基团(当m等于1时)，或任选地具有确切四个三唑Ar2基团(当m等于2时)，如由4,4',4”,4”'-((((丁烷-1,4-二基双(氮烷二基))双(羰基))双(吡啶-4,2,6-三基))四(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))四(2-羟苯甲酸)所示，其是本文鉴定的化合物71。
在式(I)的化合物中，符号m表示与Ar1直连键合的–三唑-Ar2基团的最小数目。在式(I)中，m选自1、2或3，因此Ar1分别直连键合至至少1、2或3个三唑-Ar2基团。这些选项显示在表1内的式(Ia)、(Ib)和(Ic)中，其中的每一个都是本文公开的PEMS的实施方案。
表1
Figure BDA0002648854970000341
Figure BDA0002648854970000351
任选地，在式(I)的化合物中，n等于0，在这种情况下本文公开的化合物可由式
Figure BDA0002648854970000352
描述，其中Ar1可以或不可以被取代，但如果Ar1被取代，则Ar1未被三唑-Ar2基团取代。任选地，m是1、2或3，使得Ar1分别被1、2或3个三唑-Ar2基团取代。这些选项作为式(Id)、(Ie)和(If)显示于表2中，其中的每一种是本文公开的PEMS的实施方案。
表2
Figure BDA0002648854970000353
Figure BDA0002648854970000361
任选地，在式(I)的化合物中，n等于1，在这种情况下本文公开的PEM可由式
Figure BDA0002648854970000362
表示，其中p可为0、1或2，以便提供可由如表3所示的化学式(Ig)、(Ih)和(Ii)所述的化合物，其中这些式中的每一种是本文公开的PEMS的实施方案。
表3
Figure BDA0002648854970000363
Figure BDA0002648854970000371
在式(I)的PEM的各个实施方案中，n等于1并且m等于2，以便提供如表4中所示的式(Ij)、(Ik)和(Im)的化合物，其中这些式中的每一种是本文公开的PEMS的实施方案。
表4
Figure BDA0002648854970000372
Figure BDA0002648854970000381
任选地，在式(I)的PEM化合物中，n等于2，在这种情况下本文公开的化合物可由式
Figure BDA0002648854970000382
描述，其中p可以是0、1或2，以便提供可由分别如表5所示的化学式(In)、(Io)和(Ip)所述的化合物。表5中的每个式是本文公开的PEM化合物的实施方案。
表5
Figure BDA0002648854970000383
Figure BDA0002648854970000391
在多个PEM实施方案中，在式(I)的化合物中n等于2，并且m等于2，以便提供如表6所示的式(Iq)、(Ir)和(Is)的化合物。表6所述的每个式是本文公开的PEM化合物的实施方案。
表6
Figure BDA0002648854970000392
当n是1或2时，式(I)的化合物将包含接头L，其中接头基团将必需存在于本文公开的PEM化合物中的Ar1基团共价连接至任选地存在于本文公开的PEM化合物中的一个或多个三唑-Ar2臂(即，一个或多个三唑-Ar2基团，其在所示式中的括号{}内)。在一个实施方案中，接头L可为直连键。在另一个实施方案中，接头不是直连键，而是一个或多个原子，特别是选自碳、氧、硫的原子。在另一个实施方案中，接头可为亚烷基基团(如，C1-C6亚烷基)或经取代的亚烷基。接头可为亚杂烷基接头，其是指取代或未取代的亚烷基，其还包含在母链的一个或多个末端位置内和/或处放置的至少一个选自氧、氮或硫的杂原子(如1、2、3或4个杂原子)。在一个实施方案中，L是长度为2至10个碳原子的亚杂烷基基团，其中一个或多个碳原子被至少一个选自氧、氮和硫的杂原子替代。在一个实施方案中，L可以是具有至少一个N、O或S杂原子的亚杂烷基接头，其中亚杂烷基可以是直链或环状的，并且被任选取代，其中示例性取代基包括氧代基、--OH、C1-4烷基和C1-4烷氧基。亚杂烷基接头基团的实例包括含酰胺的亚杂烷基基团，诸如–C(O)NH-亚烷基-和–C(O)NH-亚烷基-NHC(O)-，其中亚烷基任选为C1-C6亚烷基。亚杂烷基基团的其他实例包括含酯的亚杂烷基基团诸如–C(O)O-亚烷基-和–C(O)O-亚烷基-OC(O)-，其中在一个实施方案中，亚烷基是未取代的C1-C6亚烷基，和在另一个实施方案中，亚烷基是经取代的C1-C6亚烷基。在一个实施方案中，接头是水解稳定的，以便当将PEM放入水中时，它不会分解或降解或以其他方式断裂。
接头L通常不必太长；在一个实施方案中，它含有1至约25个原子(从此原子计数中排除氢和卤素)，其中除了氢和卤素之外，接头还可以任选地由选自碳、氮、氧和硫的原子组成。在各个其他实施方案中，接头具有少于25个原子(氢和卤素除外)，如其含有1至约20个原子，或1至约15个原子，或1至约10个原子，或1至约5个原子，在每种情况下都从此原子计数中排除氢和卤素，其中经计数的原子可以任选地选自碳、氧、氮和硫。
在一个实施方案中，式(I)的化合物中的三唑环除了直连键合至Ar1和Ar2之外还可被取代。通常本文公开的化合物可任选地描述为包括化学式
Figure BDA0002648854970000401
其中Ar1和Ar2在本文的其他地方定义，并且M可以是氢(在这种情况下，三唑环仅被Ar1和Ar2取代)，或M可为卤素取代基，如氟、氯、溴或碘。在一个实施方案中，本文公开的化合物具有仅被Ar1和Ar2取代的三唑环，即M是氢。在另一个实施方案中，本文公开的化合物具有被Ar1、Ar2和卤素取代的三唑环。在另一个实施方案中，本文公开的化合物包含碘-取代的三唑环，即M是碘。在另一个实施方案中，本文公开的化合物在三唑环上具有M-取代基，其中M选自氢和碘。
因此，在一个实施方案中，本公开提供了下式的化合物：
Figure BDA0002648854970000411
其中Ar1和Ar2在本文的其他地方定义，并且M选自氢和卤素。任选地，如上所述，M可以是氢，或在另一个选项中，M可以是如卤素，诸如碘，如用化合物4,4'-((4l3-吡啶-2,6-二基)双(5-碘-1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)所示。当如在以上结构中，本文公开的化合物具有多于一个M-取代的三唑环时，M在每次出现时独立选择。然而，在一个实施方案中，M在每次出现时在本文公开的化合物中是相同原子。例如，本文提供了化合物，其中M在每次出现的M处是氢。在另一个实例中，本文提供了化合物，其中M在每次出现的M处是碘。
式(I)的化合物包含至少一个三唑-Ar2部分。在一个实施方案中，本文公开的化合物包含两个或多个三唑-Ar2部分，诸如式
Figure BDA0002648854970000412
的化合物。当本文公开的化合物包含两个或大于两个三唑-Ar2部分时，Ar2部分可在每次出现时任选地具有相同的化学结构。然而，当本文公开的PEM化合物含有多个三唑-Ar2部分时，在一个实施方案中，那些Ar2部分不必彼此相同，并且实际上它们可以不同。Ar2部分可以在Ar2环原子方面和/或Ar2环原子上的取代方面彼此不同。例如，如果一个Ar2基团是苯基并且另一个Ar2基团是吡啶基，则两个Ar2基团在构成Ar2基团的环原子方面不同。作为另一个实例，如果两个Ar2基团是苯基，但一个苯基被羧基取代，而另一个苯基被甲氧基取代，例如如在4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酸中，则化合物被认为具有两个不同的Ar2基团。作为又一个实例，两个Ar2基团可以是彼此的位置异构体，如在两个Ar2基团都是苯基并且两个苯基环被羟基和羧基取代时，但羟基和/或羧基基团的位置在两个苯基环上是不同的，例如如果在一个苯基环上，三唑相对于羧基基团位于3位(间位)而在另一个苯基环上，三唑相对于羧基基团位于4位(对位)，则两个Ar2基团被认为是位置异构体和不相同的。在一个实施方案中，Ar2环在所有方面在每次出现时在本文公开的化合物中是相同的。在一个实施方案中，Ar2环原子在Ar2每次出现处是相同的，但Ar2环上的取代在Ar2每次出现处是不相同的。在另一个实施方案中，Ar2环原子在Ar2每次出现处是不相同的，并且Ar2环上的取代可以相同或可以不相同。
式(I)的化合物包含至少一个Ar2部分，其中在一个实施方案中，Ar2是选自苯基和吡啶基的单环芳族环，其可任选被取代。在一个实施方案中，Ar2是单环6-元芳族环，其中实例是苯基、吡啶基和吡嗪基，其中针对Ar2基团任选地包括在环原子上的取代基。在另一个实施方案中，Ar2是5-元单环芳族环，其可被任选取代。在另一个实施方案中，Ar2是5-或6-元芳族环，其可被任选取代。在另一个实施方案中，Ar2是包含两个稠合在一起的5-和/或6-元单环的9-或10-元稠合双环，其中两个单环中的至少一个是芳族环。在另一个实施方案中，Ar2是包含两个稠合在一起的5-和/或6-元单环的9-或10-元稠合双环，其中两个单环都是芳族环。在一个实施方案中，Ar2可以是这些选项中的任一种，即Ar2选自(a)5-元单环芳族环、(b)6-元单环芳族环、(c)包含稠合在一起的一个5-元和一个6-元单环的9-元稠合双环，其中两个单环中的至少一个并且任选地两个单环是芳族环，和(d)10-元稠合双环，其包含稠合在一起的两个6-元单环，其中两个单环中的至少一个并且任选地两个单环是芳族环，
在式(I)的化合物中，任选地，Ar2是选自由以下组成的组的5-元单环芳族环：噻吩、1,2-噻唑、1,3-噻唑、呋喃、1,2-噁唑、1,3-噁唑、1H-吡咯、1H-吡唑、噁二唑、噻二唑、1,2,4-三唑、1,2,3-三唑和1H-咪唑。
在式(I)的化合物中，任选地，Ar2是选自由以下组成的组的6-元单环芳族环：苯、吡啶、哒嗪、嘧啶和吡嗪。
在式(I)的化合物中，任选地，Ar2是选自由以下组成的组的9-元稠合双环芳族环体系：苯并呋喃、1,3-苯并噁唑、呋喃并[3,2-b]吡啶、呋喃并[3,2-c]吡啶、呋喃并[2,3-c]吡啶、呋喃并[2,3-b]吡啶、吲哚、1H-苯并咪唑、1H-吡咯并[3,2-b]吡啶、1H-吡咯并[3,2-c]吡啶、1H-吡咯并[2,3-c]吡啶、1H-吡咯并[2,3-b]吡啶、苯并噻吩、1,3-苯并噻唑、噻吩并l[3,2-b]吡啶、噻吩并[3,2-c]吡啶、噻吩并[2,3-c]吡啶、苯并噁二唑、苯并噻二唑、苯并异噁唑、苯并三唑和噻吩并[2,3-b]吡啶。
在式(I)的化合物中，任选地，Ar2是选自由以下组成的组的10-元稠合双环芳族环体系：萘、喹啉、喹唑啉、喹喔啉、1,5-萘啶、1,6-萘啶、1,7-萘啶、1,8-萘啶、异喹啉、酞嗪、2,6-萘啶和2,7-萘啶。
如上所提及，本文公开的化合物包含至少一个Ar2基团，其中Ar2基团包含至少一个芳族环并且任选地在芳族环上包含一个或多个取代基。在一个实施方案中，Ar2在芳族环上包含至少一个，即一个或多个取代基，诸如1-5、或1-4、或1-3或1-2个取代基。任选地，Ar2在芳族环上包含确切一个取代基。在另一个选项中，Ar2在芳族环上包含确切两个取代基。在又一个选项中，Ar2在芳族环上包含确切三个取代基。在另一个选项中，Ar2在芳族环上包含确切四个取代基。在一个任选的实施方案中，Ar2在芳族环上包含两个或多个取代基。
在一个实施方案中，Ar2的环原子上的一个或多个取代基选自任选命名“G”的取代基，其中取代基选自E-M、E-CO2R、E-CONH2、E-CHO、E-NR2和E-OR，其中(a)E选自直连键、亚甲基、亚乙基、亚丙基和亚丁基；(b)M是选自氟、氯、溴和碘的卤素；和(c)R独立选自H和C1-C6烷基。在另一个实施方案中，Ar2的环原子上的一个或多个取代基选自卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、E-CO2R0、E-CONH2、E-CHO、E-C(O)NH(OH)、E-N(R0)2和E-OR0，其中E选自直连键和选自以下的亚烷基基团：C1-C6亚烷基、如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基；并且R0选自H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基。任选地，亚烷基基团可为取代的亚烷基基团。
在一个实施方案中，Ar2上的取代包括氨基(–NH2)。在一个实施方案中，Ar2上的取代包括烷氧基，如C1-C6烷氧基。例如，在一个实施方案中，Ar2上的取代包括甲氧基。在一个实施方案中，Ar2上的取代包括羧酸或亚烷基-羧酸。例如，在一个实施方案中，式(I)的PEM化合物的Ar2上的取代包括羧酸。在一个实施方案中，Ar2上的取代包括羧酸酯或亚烷基-羧酸酯。例如，在一个实施方案中，式(I)的PEM化合物的Ar2上的取代包括–CH2-CO2-CH3。在一个实施方案中，Ar2上的取代包括卤代烷基基团，如C1-C6卤代烷基基团。例如，在一个实施方案中，式(I)的PEM化合物的Ar2上的取代包括三氟甲基。在一个实施方案中，Ar2上的取代包括羟基或羟基-取代的烷基，如羟基-取代的C1-C6烷基。例如，在一个实施方案中，式(I)的化合物的Ar2上的取代包括羟基(-OH)。
在一个实施方案中，Ar2上的取代包括选自羧酸和亚烷基-羧酸的一个基团，如C1-C6亚烷基-羧酸，和选自羟基和羟基-取代的烷基的另一个基团，如用一个羟基取代的C1-C6烷基。例如，在一个实施方案中，Ar2上的取代是或包括一个羧酸和一个羟基。任选地，在这种情况下，式(I)的化合物可以是式(I)的PEM化合物的任一种，包括式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ii)、(Ij)、(Ik)、(Im)、(In)、(Io)、(Ip)、(Iq)、(Ir)和(Is)，并且Ar2环可以是六元碳环或杂环芳族环，如苯基、吡啶基或吡嗪基。
在一个实施方案中，Ar2上的取代包括选自羧酸和亚烷基-羧酸的一个基团(如C1-C6亚烷基-羧酸)，和选自卤代烷基的一个基团(如C1-C6卤代烷基)。例如，在一个实施方案中，Ar2上的取代是或包括一个羧酸基团和一个三氟甲基基团。任选地，在这种情况下，式(I)的化合物可以是式(I)的PEM化合物中的任一种，包括式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ii)、(Ij)、(Ik)、(Im)、(In)、(Io)、(Ip)、(Iq)、(Ir)和(Is)，并且Ar2环可以是六元碳环或杂环芳族环，如苯基、吡啶基或吡嗪基。
在一个实施方案中，Ar2上的取代包括选自羟基和羟基-取代的烷基的一个基团，如用一个羟基取代的C1-C6烷基，和选自卤代烷基的另一个基团，如C1-C6卤代烷基。例如，在一个实施方案中，Ar2上的取代是或包括一个羟基基团和一个三氟甲基基团。任选地，在这种情况下，式(I)的化合物可以是式(I)的PEM化合物的任一种，其包括式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ii)、(Ij)、(Ik)、(Im)、(In)、(Io)、(Ip)、(Iq)、(Ir)和(Is)，并且Ar2环可以是六元碳环或杂环芳族环，如苯基、吡啶基或吡嗪基。
在一个实施方案中，式(I)的Ar2环上的取代包括以下中的至少一种：a)羧酸和亚烷基-羧酸，如C1-C6亚烷基-羧酸；b)羟基和羟基-取代的烷基，如用一个羟基取代的C1-C6烷基；和c)卤代烷基，如C1-C6卤代烷基。例如，羧酸、羟基和三氟甲基中的至少一种。任选地，在这种情况下，式(I)的化合物可以是式(I)的PEM化合物中的任一种，包括式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ii)、(Ij)、(Ik)、(Im)、(In)、(Io)、(Ip)、(Iq)、(Ir)和(Is)，并且Ar2环可以是六元碳环或杂环芳族环，如苯基、吡啶基或吡嗪基。
在一个实施方案中，式(I)的Ar2环上的取代包括以下中的至少两个：a)羧酸和亚烷基-羧酸，如C1-C6亚烷基-羧酸；b)羟基和羟基-取代的烷基，如用一个羟基取代的C1-C6烷基；和c)卤代烷基，如C1-C6卤代烷基。例如，羧酸、羟基和三氟甲基中的至少两个。任选地，在这种情况下，式(I)的化合物可以是式(I)的PEM化合物中的任一种，包括式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ii)、(Ij)、(Ik)、(Im)、(In)、(Io)、(Ip)、(Iq)、(Ir)和(Is)，并且Ar2环可以是六元碳环或杂环芳族环，如苯基、吡啶基或吡嗪基。
在一个实施方案中，式(I)的Ar2环上的取代包括以下中的所有三种：a)羧酸和亚烷基-羧酸，如C1-C6亚烷基-羧酸；b)羟基和羟基-取代的烷基，如用一个羟基取代的C1-C6烷基；和c)卤代烷基，如C1-C6卤代烷基。即，Ar2可被羧酸、羟基和三氟甲基取代。任选地，在这种情况下，式(I)的化合物可以是式(I)的PEM化合物中的任一种，包括式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ii)、(Ij)、(Ik)、(Im)、(In)、(Io)、(Ip)、(Iq)、(Ir)和(Is)，并且Ar2环可以是六元碳环或杂环芳族环，如苯基、吡啶基或吡嗪基。
例如，在一个实施方案中，Ar2基团是选自以下的经取代的苯基基团：
Figure BDA0002648854970000451
如所提及的，在一个实施方案中，本文公开的PEM化合物可在Ar2上具有羟基和羧酸取代。这两个基团可位于Ar2环上的不同位置处。例如，在一个实施方案中，本文提供了由下式所述的式(I)PEM化合物：
Figure BDA0002648854970000461
在另一个实施方案中，本文公开的式(I)PEM化合物在Ar2上具有羟基和羧酸取代，如下式中所提供的：
Figure BDA0002648854970000462
在又一个实施方案中，本文公开的式(I)PEM化合物在Ar2上具有羟基和羧酸取代，如下式所示：
Figure BDA0002648854970000463
在一个实施方案中，本文公开的式(I)PEM化合物在Ar2上具有至少羟基和羧酸取代，以及可具有在Ar2上的其他取代。例如，Ar2可被羟基、羧酸和烷基(如，C1-C6烷基)取代以提供如下式的化合物：
Figure BDA0002648854970000464
如前提及的，在一个实施方案中，本文公开的式(I)PEM化合物可在Ar2上具有卤代烷基和羧酸取代，而不是如在以上结构中所示的羟基和羧酸。作为一个实例，本文公开的PEM化合物可由下式描述：
Figure BDA0002648854970000465
式(I)的PEM化合物包括溶剂化物，其包括其水合物、螯合物和盐形式。在一些情况下，PEM化合物可以是无定形的，而在其他情况下PEM化合物可以是晶体。此外，一些晶体形式的化合物可作为无定形物存在，其在本文中考虑。此外，一些化合物还可与水或其他有机溶剂形成溶剂化物。此类溶剂化物被类似地包括在本文所述的化合物的范围内。
式(I)的PEM化合物可以是呈螯合物的形式，诸如铜螯合物。铜螯合物可通过合并本文公开的PEM化合物与硫酸铜来形成。式(I)的PEM化合物可呈盐的形式，酸加成盐或碱加成盐，其取决于Ar1和Ar2基团上的取代基。
PEM结构包括其所有稳定的立体异构体形式。因此，本文所述的PEM化合物可具有一个或多个手性(或不对称)中心并可因此产生对映异构体、非对映异构体和可以在绝对立体化学的方面被定义为(R)-或(S)-的其他立体异构体形式。当本文所述的化合物含有烯烃双键或其他几何不对称中心时并且除非另有说明，否则化合物意在包括E和Z几何异构体(如，顺式或反式)。同样，除非另有说明，否则所有可能的异构体以及其外消旋和光学纯形式及所有互变异构形式也意在包括在内。因此，预期各种立体异构体及其混合物包括"对映异构体"，其是指两种立体异构体，其分子是彼此不可重叠的镜像。因此，该化合物可以任何异构体形式出现，包括外消旋体、外消旋混合物，以及作为单独的对映异构体或非对映异构体。
本文公开的PEM化合物通常是水溶性的。水溶解度的一个量度是化合物的logP值。LogP值可使用软件基于化合物的化学结构计算。例如，CHEMDRAW化学绘图软件(Cambridgesoft Limited，PerkinElmer Holdings的子公司)可计算经绘制的化学结构的logP值。在一个实施方案中，本文公开的PEM化合物具有至少4.9的logP。
本文公开的化合物，例如如上所述的式(I)的PEM化合物和如下所述的式(II)的PEM化合物可通常通过在Cu(I)催化剂的存在下式Ar1(C≡CH)2的二乙炔基化合物与式Ar2-N3的叠氮化物化合物反应来合成。还参见Crowley J.D.,McMorran D.A.(2012)“Click-Triazole”Coordination Chemistry:Exploiting 1,4-Disubstituted-1,2,3-Triazolesas Ligands.In:
Figure BDA0002648854970000481
J.(eds.)Click Triazoles.Topics in HeterocyclicChemistry,第28卷Springer,Berlin,Heidelberg doi.org/10.1007/7081_2011_67。
特定和类似的反应物也可以通过Chemical Abstract Service of the AmericanChemical Society制备的已知化学品的索引进行识别，该索引可在大多数公共和大学图书馆中获得，以及通过在线数据库(可联系American Chemical Society,Washington,D.C.获取更多详细信息)获得。可以通过定制化学合成工厂来制备目录中已知但不可商购获得的化学品，在该工厂中许多标准化学品供应公司(如上面列出的那些)都提供定制合成服务。本文公开的药用盐的制备和选择的参考文献是P.H.Stahl&C.G.Wermuth"Handbook ofPharmaceutical Salts,"Verlag Helvetica Chimica Acta,Zurich,2002。
式Ar1(C≡CH)的化合物可从如TCI America(Portland,Oregon,USA)商购获得，其销售如1,3-二乙炔基苯、1,4-二乙炔基苯、2,6-二乙炔基吡啶和3,6-二乙炔基咔唑。
通常，乙炔基芳香族化合物可以经由使用可从MilliporeSigma Corp.(St.Louis,MO,USA)获得的二甲基(重氮甲基)膦酸酯从芳基醛经由Seyferth-Gilbert同素化制备乙炔基芳香族化合物。可替代地，可以由二甲基-1-重氮-2-氧代丙基膦酸酯(Ohira-Bestmann试剂)原位生成二甲基(重氮甲基)膦酸酯。参见，如Seyforth等人,J.Org.Chem.36(10):1379–1386(1971).doi:10.1021/jo00809a014和Bestman等人,Synlett.1996(06):521–522(1996).doi:10.1055/s-1996-5474。
制备乙炔基芳香族化合物的另一种途径使得能够在钯催化剂存在下，将卤代芳香族化合物与(叔丁基二甲基甲硅烷基)乙炔进行薗头偶联。乙炔基芳族在随后脱保护之后形成甲硅烷基基团。参见，例如Sonogashira,Organomet.Chem.,653:46–49(2002).doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0。
以下反应(I)、(II)和(III)说明了二乙炔基芳香族化合物的示例性制备。在反应(I)中，将2,6-二溴吡啶-4-胺转化为相应的2,6-二乙炔基吡啶-4-胺化合物。在反应(II)中，将2,6-二碘-4-硝基苯胺转化为相应的2,6-二乙炔基-4-硝基苯胺。在反应(III)中，将2-羟基-3,5-二碘苯甲酸转化为相应的3,5-二乙炔基-2-羟苯甲酸。在每种情况下，转化都通过所示的中间体二-三甲基甲基甲硅烷基(TMS)化合物进行。
Figure BDA0002648854970000491
这些反应产物中的每一种，即2,6-二乙炔基吡啶-4-胺和2,6-二乙炔基-4-硝基苯胺，和3,5-二乙炔基-2-羟苯甲酸，可以在制备本文公开的PEM中用作Ar1的前体。因此，它们中的每一种表示Ar1(C≡CH)2化合物，其可以与式Ar2-N3的叠氮化物化合物在Cu(I)催化剂的存在下反应以提供PEM。反应(I)、(II)和(III)说明了将前体制备为本文公开的经取代的Ar1部分。
式Ar2-N3的化合物同样可商购获得，例如从TCI America(Portland,Oregon,USA)、Synthonix(Wake Forest,North Carolina,USA)、SigmaAldrich(St.Louis,Missouri,USA)、Toronto Research Chemicals(Toronto,Canada)和AnaSpec(Fremont,California,USA)可商购获得。通常，可以通过对亲电子化合物(诸如烷基、苄基或烯丙基碘或溴)用叠氮化钠进行亲核置换来制备式Ar2-N3的叠氮化物。
通常，从可商购的化学品和/或由化学文献中记载的化合物开始，可以根据本领域技术人员已知的有机合成技术来制备本文所述的反应中所用的化合物。"可商购的化学品"可获自标准商业来源，包括Across Organics(Pittsburgh Pa.)、Aldrich Chemical(Milwaukee Wis.，包括Sigma Chemical和Fluka)、Apin Chemicals Ltd.(Milton ParkUK)、Avocado Research(Lancashire U.K.)、BDH Inc.(Toronto,Canada)、Bionet(Cornwall,U.K.)、Chemservice Inc.(West Chester Pa.)、Crescent Chemical Co.(Hauppauge N.Y.)、Eastman Organic Chemicals、Eastman Kodak Company(RochesterN.Y.)、Fisher Scientific Co.(Pittsburgh Pa.)、Fisons Chemicals(LeicestershireUK)、Frontier Scientific(Logan Utah)、ICN Biomedicals,Inc.(Costa Mesa Calif.)、Key Organics(Cornwall U.K.)、Lancaster Synthesis(Windham N.H.)、MaybridgeChemical Co.Ltd.(Cornwall U.K.)、Parish Chemical Co.(Orem Utah)、Pfaltz&Bauer,Inc.(Waterbury Conn.)、Polyorganix(Houston Tex.)、Pierce Chemical Co.(RockfordIll.)、Riedel de Haen AG(Hanover,Germany)、Spectrum Quality Product,Inc.(NewBrunswick,N.J.)、TCI America(Portland Oreg.)、Trans World Chemicals,Inc.(Rockville Md.)和Wako Chemicals USA,Inc.(Richmond Va.)。
在一个实施方案中，本文公开的PEM化合物，如式(I)的PEM化合物或式(II)的PEM化合物存在于组合物中。例如，本文公开的PEM化合物可存在于还包含水性缓冲液的组合物中。在一个实施方案中，本文公开的PEM化合物存在于包含生物分子(诸如多肽和/或多核苷酸)的组合物中。多肽可为酶，诸如DNA聚合酶。以下定义可有助于理解这些组合物及其某些用途。
如本文所用，“核酸”，也称为多核苷酸，是共价连接的核苷酸系列，其中一个核苷酸的戊糖的3'位置通过磷酸二酯基团连接至下一个的5'位置。核酸分子可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或两者的组合。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是生物学存在的多核苷酸，其中核苷酸残基通过磷酸二酯键联连接在特定序列中。如本文所用，术语“核酸”、"多核苷酸"或"寡核苷酸"涵盖了具有核苷酸的直链主链的任何聚合物化合物。寡核苷酸，也称为寡聚物，是通常更短链的多核苷酸。如果被靶向测序，则通常将核酸称为"靶核酸"或"靶序列"。
如本文所用，术语"模板依赖性方式"意在指代涉及引物分子的模板依赖性延伸(如，由DNA聚合酶进行DNA合成)的过程。术语"模板依赖性方式"是指RNA或DNA的多核苷酸合成，其中新合成的多核苷酸链的序列由互补碱基配对的众所周知的规则决定(参见，例如Watson,J.D.等人,In:Molecular Biology of the Gene,第4版,W.A.Benjamin,Inc.,Menlo Park,Calif.(1987))。
如本文所用，"核酸聚合酶"是通常用于连结3'-OH 5'-三磷酸核苷酸、寡聚物及其类似物的酶。聚合酶包括但不限于、DNA-依赖性DNA聚合酶、DNA-依赖性RNA聚合酶、RNA-依赖性DNA聚合酶、RNA-依赖性RNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、T3 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、DNA聚合酶1、Klenow片段、Thermophilusaquaticus DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、
Figure BDA0002648854970000511
DNA聚合酶(New England Biolabs)、Deep
Figure BDA0002648854970000512
DNA聚合酶(New England Biolabs)、Bst DNA聚合酶大片段、Stoeffel片段、9°NDNA聚合酶、9°N DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、RepliPHIPhi29聚合酶、Tli DNA聚合酶、真核DNA聚合酶β、端粒酶、TherminatorTM聚合酶(NewEngland Biolabs)、KOD HiFiTM DNA聚合酶(Novagen)、KOD1 DNA聚合酶、Q-β复制酶、末端转移酶、AMV逆转录酶、M-MLV逆转录酶、Phi6逆转录酶、HIV-1逆转录酶。根据本发明的聚合酶可以是变体、突变体或嵌合性聚合酶。
如本文所用，“DPO4-型DNA聚合酶"是由古生菌硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)天然表达的DNA聚合酶，或相关的Y-家族DNA聚合酶，其通常由称为跨损伤合成(TLS)的过程用于复制经损伤的DNA的复制中。Y-家族DNA聚合酶与DPO4聚合酶同源；实例包括原核酶PolII、PolIV、PolV，古细菌酶Dbh及真核酶Rev3p、Rev1p、Polη、REV3、REV1、Pol
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和PolκDNA聚合酶，以及其嵌合体。经修饰的重组DPO4-型DNA聚合酶包含相对于天然存在的野生型DPO4-型DNA聚合酶的一种或多种突变，例如增加利用大体积的核苷酸类似物作为底物的能力或另一种聚合酶性质的一种或多种突变，并且可包括野生型DPO4-型DNA聚合酶上的另外的改变或修饰，诸如另外的肽或蛋白序列的一种或多种缺失、插入和/或融合(如，用于固定聚合酶在表面上或以其他方式标记聚合酶)。根据本发明的变体聚合酶的实例是公开的PCT专利申请WO2017/087281 A1及PCT专利申请PCTUS2018/030972和PCTUS2018/64794的硫磺矿硫化叶菌DPO4的变体，其在此通过引用整体并入。
如本文所用，"核酸聚合酶反应"是指以模板依赖性方式用于制备新核酸链或延长现有核酸(如，DNA或RNA)的体外方法。根据本发明，核酸聚合酶反应包括引物延伸反应，其导致掺入核苷酸或核苷酸类似物至引物3'-末端，使得经掺入的核苷酸或核苷酸类似物与靶多核苷酸的相应核苷酸互补。核酸聚合酶反应的引物延伸产物可进一步用于单分子测序或作为模板以合成另外的核酸分子。
引物延伸反应试剂通常包括(i)聚合酶；(ii)缓冲液；和(iii)一种或多种可延伸的核苷酸或核苷酸类似物。引物缓冲液反应可用于在特定的实验条件下测量所得核酸产物的长度并通过借由如凝胶电泳比较经延伸的引物产物长度来确定各种聚合酶反应添加剂(如，PEM)对聚合酶活性的作用。
如本文所用，“增强核酸聚合酶反应”是指添加剂(如PEM)使核酸聚合酶能够合成其长度比不存在PEM时长至少一个亚基的引物延伸产物的能力。
如本文所用的核酸聚合酶反应的速率是指核酸聚合酶延伸聚合物链的平均速度。如本文所用，术语“速度”和"延长速率"可交换使用。Hogrefe等人(Methods in Enzymol.第334卷，第91-116页(2001))的核苷酸掺入测定可用于测量聚合速率。简而言之，可将聚合酶活性测量为掺入32P-dCTP至活化的鲑鱼精DNA中的速率(购自Pharmacia；对于活化方案，参见C.C.Richardson,Procedures in Nucl.Acid Res.(Cantoni和Davies编辑),第263-276页(1966)，在第264页)。反应缓冲液可以是例如50mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM MgCl2、1mM二硫代苏糖醇(DTT)、50μg/ml牛血清白蛋白(BSA)和4％(v/v)甘油。使用的核苷酸底物和DNA明显过量，通常是被测定的聚合酶的Km的至少10倍，如200μgM的每种dATP、dTTP和dGTP，195μgM dCTP加上5μg M经标记的dCTP以及250μg/ml活化的DNA。。将反应物在冰上猝灭，并将反应混合物的等分试样点样到离子交换过滤器(如，Whatman DE81)上。冲洗未掺入的核苷酸，然后进行闪烁计数以测量掺入的放射性。
如本文所用，"增加速率"是指与缺乏如本文所定义的增加速率的PEM的聚合反应相比，5-10％、10-50％或50-100％或更大的增加。
如本文所用，"持续性"是指在聚合酶与其模板之间的单次接触期间由核酸聚合酶导致的聚合程度，即其继续作用于底物而不是从底物解离的性质。聚合程度是指由聚合酶在聚合酶与其模板之间的单次接触期间添加的核苷酸或核苷酸类似物的数目。持续性可取决于聚合酶的性质、模板的序列、核苷酸或核苷酸类似物底物的结构以及反应条件，例如盐浓度、温度或特定添加剂的存在。
如本文所用，"增加持续性"是指与缺乏如本文所定义的增加持续性的PEM的聚合反应相比，增加5-10％、10-50％或50-100％或更多。用于测量核酸聚合酶持续性的方法是本领域公知的，例如如Sambrook等人1989,In Molecular Cloning,第2版,CSH Press,7.79-7.83和13.8中所述，如美国公开专利申请2002/0119467中、公开的PCT申请WO01/92501及美国专利5,972,603中所述，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用的术语"保真度"是指由模板-依赖性核酸聚合酶进行的核酸聚合的精确度。DNA聚合酶的保真度通过误差率(掺入不正确的核苷酸(即未以模板依赖性方式掺入的核苷酸)的频率)来测量。DNA聚合酶的保真度或误差率可使用本领域已知的测定进行测量(参见例如，Lundburg等人,1991Gene,108:1-6)。如本文所用，"增加保真度"是指与缺乏如本文所定义的增加保真度的添加剂的聚合反应相比，增加5-10％、10-50％或50-100％或更多。
如本文所用的术语"多个"是指"至少两个"。
"XNTP"是与模板依赖性酶促聚合相容的可扩增的5'三磷酸修饰的核苷酸底物。XNTP具有两种不同的功能性组件；即，核碱基5'-氨基三磷酸酯以及系链，所述系链在允许通过氨基磷酸酯键的核苷酸内切割进行可控扩增的位置处连接在每个核苷氨基三磷酸酯内。XNTP是如本文所用的示例性“非天然、高度取代的核苷酸类似物底物”。示例性XNTP和其制备方法描述于如申请人公开的PCT申请WO2016/081871中，其在本文中通过引用整体并入。
"Xpandomer中间体"是由XNTP组装的中间产物(在本文中还被称为"子链")，并通过聚合酶-介导的模板定向XNTP组装使用靶核酸模板形成。新合成的Xpandomer中间体是受约束的Xpandomer。在将XNTP提供的氨基磷酸酯键切割的过程步骤中，受约束的Xpandomer不再受约束，并且是随着系链伸出而延伸的Xpandomer产物。
"Xpandomer"或"Xpandomer产物"是通过受约束的Xpandomer的扩展产生的合成分子构建体，其自身是通过模板引导的XNTP底物的组装而合成的。Xpandomer相对于产生它的靶模板是延长的。它由一连串的亚基、系链以及任选的部分或所有底物组成，每个亚基是一个基序，每个基序是一个文库成员，其包含序列信息，所有这些都是来源于形成性底物构建体。Xpandomer被设计为扩增至比靶模板更长，从而降低了靶模板沿其长度的序列信息的线性密度。此外，Xpandomer任选地提供平台来增加报告子的大小和丰度，这进而改善信噪比以用于检测。较低的线性信息密度和较强的信号会提高分辨率，并降低检测和解码模板链序列的灵敏度要求。
"系链"或"系链成员"是指具有大体上线性尺寸且在两个相对末端中的每个处具有末端部分的聚合物或分子构建体。系链利用在末端部分的键联(linkage)连接至核苷氨基三磷酸酯，以形成XNTP。键联用于将系链约束为“约束构型”。系链具有“约束构型”和“扩展构型”。约束构型存在于XNTP和子链或Xpandomer中间体中。系链的约束构型是如Xpandomer产物中发现的扩展构型的前体。从约束构型转变为扩展构型导致可选择性切割的氨基磷酸酯键的切割。系链沿其长度包含可编码底物的序列信息的一个或多个报告子或报告子构建体。系链提供了一种方法来扩展Xpandomer的长度，并从而降低序列信息线性密度。
"系链元件"或"系链区段"是含两个末端的具有大致线性尺寸的聚合物，其中末端形成用于连接系链元件的末端键联。系链元件是系链的区段。此类聚合物可包括但不限于：聚乙烯二醇(polyethylene glycols)，聚乙二醇(polyglycols)，聚吡啶，聚异氰酸酯，聚异氰酸酯，聚(三芳基甲基)甲基丙烯酸酯，聚醛，聚吡咯啉酮，聚脲，聚二醇磷酸二酯，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，聚丙烯酰胺，聚乙烯脂，聚苯乙烯，聚酰胺，聚氨酯，聚碳酸酯，聚丁酸酯，聚丁二烯，聚丁内酯，聚吡咯烷酮，聚乙烯基膦酸酯，聚乙酰胺，多糖，聚透明质酸，聚酰胺，聚酰亚胺，聚酯，聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚对苯二甲酸酯，聚硅烷，聚氨酯，聚醚，聚氨基酸，聚甘氨酸，聚脯氨酸，N-取代的聚赖氨酸，多肽，侧链N-取代的肽，聚-N-取代的甘氨酸，类肽，侧链羧基-取代的肽，同型肽，寡核苷酸，核糖核酸寡核苷酸，脱氧核酸寡核苷酸，经修饰以防止Watson-Crick碱基配对的寡核苷酸，寡核苷酸类似物，聚胞苷酸，聚腺苷酸，聚尿苷酸，聚胸苷，聚磷酸盐，多核苷酸，聚核糖核苷酸，聚二醇-磷酸二酯，肽多核苷酸类似物，苏氨酰基-多核苷酸类似物，二醇-多核苷酸类似物，吗啉代-多核苷酸类似物，锁核苷酸寡聚物类似物，多肽类似物，支链聚合物，梳形聚合物，星形聚合物，树枝状聚合物，无规、梯度和嵌段共聚物，阴离子聚合物，阳离子聚合物，形成茎-环的聚合物，刚性区段和柔性区段。
"报告子"由一个或多个报告子元件组成。报告子用于解析靶核酸的遗传信息。
"报告子构建体"包含可产生一种或多种可检测信号的一种或多种报告子，其中一种或多种可检测信号通常含有序列信息。该信号信息被称为"报告子代码"并随后被解码为遗传序列数据。报告子构建体还可以包含系链区段或其他建构组件，包括聚合物、接枝共聚物、嵌段共聚物、亲和力配体、寡聚物、半抗原、适体、树枝状聚合物、键联基团或亲和力结合基团(如生物素)。
"报告子代码"是来自报告子构建体的测量信号的遗传信息。报告子代码被解码以提供序列特异性遗传信息数据。
因此，在一个实施方案中，本文提供了包含如本文公开的PEM和缓冲液的组合物。在另一个实施方案中，本文提供了包含如本文公开的PEM和多种核苷酸和/或核苷酸类似物的组合物。在另一个实施方案中，本文提供了包含如本文公开的PEM和多核苷酸的组合物。在另一个实施方案中，本文提供了包含如本文公开的PEM和蛋白的组合物，其中任选地所述蛋白是聚合酶，包括上述的任一种聚合酶。
在一个实施方案中，本文提供了包含本文公开的PEM化合物(如式(I)的PEM化合物或式(II)的PEM化合物)和分子拥挤剂的组合物。在通常的术语中，分子拥挤剂包括一系列大型中性聚合物。可用的分子排挤试剂的实例包括但不限于聚乙烯二醇(PEG)、聚蔗糖、右旋糖酐或聚乙烯醇。示例性分子排挤试剂和制剂示于美国专利号7,399,590中，其通过引用并入本文。在一个实施方案中，分子拥挤剂是任选具有4,000-10,000的数均分子量的聚亚烷基二醇。在一个实施方案中，分子拥挤剂是聚亚烷基二醇的衍生物，如聚亚烷基二醇的一个或两个末端羟基基团呈酯或醚基团的形式。在一个实施方案中，分子拥挤剂是惰性的水溶性聚合物。
在一个实施方案中，本文提供了包含本文公开的PEM化合物和水性缓冲液的组合物。在一个实施方案中，PEM化合物具有式(I)。在另一个实施方案中，PEM化合物具有式(II)。在一个选项中，组合物的pH为约6至8.5，并且缓冲液有助于稳定组合物的pH。示例性缓冲液是Tris HCl。其他适合的缓冲液包括这些领域中已知的那些，如磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸钠缓冲液、碳酸钠缓冲液等。
在一个实施方案中，本文提供了包含本文公开的PEM化合物(如式(I)的PEM化合物)和多核苷酸的组合物。在一个选项中，多核苷酸是单链，如单链DNA或单链RNA。当多核苷酸意在用作引物时，多核苷酸是单链DNA分子。当意在用作引物时，多核苷酸可具有约10-60mer寡核苷酸，如20-30个寡核苷酸的长度。多核苷酸可以可选地用作模板，在这种情况下其可以是单链DNA或单链RNA，并且可具有30个碱基至数千个碱基和以上值的长度，如10k个碱基和以上值。
在一个实施方案中，本文提供了包含本文公开的PEM化合物(如式(I)的PEM化合物)和蛋白的组合物。例如，蛋白可为酶、核酸聚合酶、DNA聚合酶。适合的DNA聚合酶的一个实例是如本文讨论的DPO4聚合酶的变体。
在一个实施方案中，本文提供了包含至少一种本文公开的PEM化合物(如式(I)的PEM化合物)以及核苷酸或核苷酸类似物的混合物的组合物，其中相对于不存在至少一种化合物的相同聚合反应，所述至少一种化合物增加了在模板-依赖性聚合反应期间掺入子链的核苷酸类似物的数目和精确度。任选地，核苷酸类似物的混合物包含核苷氨基三磷酸酯，其中核苷氨基三磷酸酯中的每一种包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合系链部分，其中聚合系链部分的第一端连接至核碱基并且聚合系链部分的第二端连接至核苷氨基三磷酸酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割来提供核苷酸类似物的扩增。任选地，组合物还包括包包含以下中的一种或多种的缓冲液：Tris OAc，NH4OAc，PEG，水混溶性有机溶剂诸如二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或丙酮，多磷酸盐60，NMS和MnCl2。任选地，组合物还包含单链结合蛋白。任选地，组合物包含脲。任选地，核苷酸类似物的混合物包含含可检测标记的核苷酸类似物，其中可检测标记任选是以下中的一种：发光、化学发光、荧光、发荧光、发色团或显色标记。在一个实施方案中，组合物包含这些选项中的两个或多个，如这些选项中的全部。
在本文公开的一方面，如本文公开的PEM及其组合物可用于增强核酸聚合反应或改善所得核酸的性质，如反应产物的长度或精确度。聚合反应包括如引物延伸反应、PCR、诱变、等温扩增、DNA测序和探针标记。此类方法是本领域公知的。可以通过以下机制刺激核苷酸掺入来提供增强，诸如增加聚合酶的持续性(即，减少聚合酶从模板上的解离)、增加底物结合或酶促催化的速率以及增加核苷酸掺入的精确度或保真度。此外，可以通过减少核酸模板中的障碍诸如二级结构和双链体DNA来提供增强。通过添加PEM克服或改善此类障碍可以使聚合反应更准确或更有效地发生，或者允许使用较低的变性/延伸温度或等温温度。
在一些实施方案中，PEM可与另一种添加剂类别组合使用以增强聚合酶反应。一个示例性类别的添加剂是小沟结合蛋白(MGB)。在一个实施方案中，MGB选自由以下组成的组：偏端霉素A及其合成类似物、纺锤菌素、(+)-CC-1065、倍癌霉素、吡咯并苯二氮
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trabectin及其类似物、Hoechst染料及其衍生物、lexitropsin、thiazotropsin A、二脒和聚酰胺。在某些实施方案中，至少一种小沟结合部分是Hoechst染料。关于使用MGB来增强聚合酶反应的更多信息可见于申请人的标题为ENHANCEMENT OF NUCLEIC ACIDPOLYMERIZATION BY MGBS的同时提交申请。
可用PEM增强的一个示例性聚合酶反应是称为“XNTP”的非天然核苷酸类似物的聚合，其形成由Stratos Genomics开发的“边扩增边测序”(SBX)方案的基础(参见，如Kokoris等人,美国专利No.7,939,259,"High Throughput Nucleic Acid Sequencing byExpansion")。在通常的术语中，SBX使用该生物化学聚合来将DNA模板的序列转录在称为"Xpandomer"的可测量的聚合物上。经转录的序列沿着Xpandomer主链编码在高信噪比报告子中，其间距约为10nm并且经设计用于高信噪比、高分化的响应。这些差异相对于天然DNA提供了Xpandomer的序列读取效率和精确度的显著性能增强。SBX过程的一般性概述描绘于图1A、1B、1C和1D中。
XNTP是与模板依赖性酶促聚合相容的可扩增的5'三磷酸修饰的核苷酸底物。高度简化的XNTP示于1A中，其强调了这些核苷酸类似物的独特特征：XNTP 100具有两个不同的功能区；即，可选择性切割的氨基磷酸酯键110(将5’α-磷酸115连接至核碱基105)和系链120(其在核苷氨基三磷酸酯内连接在允许通过氨基磷酸酯键的核苷酸内切割进行可控扩增的位置处)。XNTP的系链由通过可选择性切割的氨基磷酸酯键分开的接头臂部分125A和125B组成。每个接头经由连接基团(LG)连接至报告子130的一个末端，如Kokoris等人的美国专利号8,324,360中所述，其在本文中通过引用整体并入。以“约束构型”说明了XNTP，其特征是XNTP底物和聚合后的子链。如在Xpandomer产物中发现，聚合的XNTP的受约束的构型是扩展构型的前体。从受约束的构型到扩展构型的转变发生在子链的主要主链内氨基磷酸酯的P--N键断开之后。
Xpandomer的合成概述于图1B和1C中。在组装期间，使用单链模板140作为引导，通过模板定向聚合过程，将单体XNTPI底物145(XATP、XCTP、XGTP和XTTP)聚合在新生子链150的可延伸末端上。通常，该过程从引物开始，并朝5'至3'方向进行。通常，使用DNA聚合酶或其他聚合酶形成子链，并选择条件，以便获得模板链的互补拷贝。在合成子链后，偶联的系链包含受约束的Xpandomer，所述受约束的Xpandomer进一步包含子链。子链中的系链具有XNTP底物的"受约束的构型"。系链的受约束的构型是扩展构型的前体，如在Xpandomer产物中发现。
如图1C所示，从受约束的构型160到扩展构型165的转变是由于子链的主要主链内的可选择性切割的氨基磷酸酯键(为简化起见，用无阴影的椭圆表示)的切割所致。在该实施方案中，系链包括它们所连接的核碱基特异性的一个或多个报告子或报告子构建体130A、130C、130G或130T，从而编码模板的序列信息。以这种方式，系链提供了一种扩展Xpandomer的长度并降低母链的序列信息的线性密度的方法。
图1D示出了通过纳米孔180，Xpandomer 165从顺式贮器175移位至反式贮器185。在穿过纳米孔后，线性化Xpandomer的每个报告子(在该图示中标记为“G”、“C”和“T”)生成独特且可复制的电子信号(由叠加迹线190所示)，其是与它连接的核碱基特异的。
图2更详细地描绘了XNTP的普遍结构。XNTP 200由具有通过可选择性切割的氨基磷酸酯键230分开的接头臂部分220A和220B的核碱基三氨基磷酸根210组成。系链在连接基团250A和250B处连结至核苷氨基三磷酸酯，其中第一系链端连接至杂环260(本文以胞嘧啶代表，尽管杂环可能是四个标准核碱基A、C、G或T中的任一个)，并且第二系链端连接至核碱基主链的α磷酸酯270。本领域技术人员将理解，可以使用本领域中已知的许多适合的偶联化学来形成最终的XNTP底物产物，例如可以通过三唑键联来完成系链缀合。
在该实施方案中，系链275由几个功能性元件组成，包括增强子280A和280B，报告子代码285A和285B，以及翻译控制元件(TCE)290A和290B。这些特征中的每一种在Xpandomer通过纳米孔移位以及产生独特且可再现的电子信号期间都具有独特的功能。系链275经设计用于通过杂交(TCH)进行移位控制。如所描述的，TCE提供了可以与互补寡聚物(CO)成对的杂交区，并定位于邻近报告子代码。确定不同报告子代码的大小，以阻止离子以不同的可测量水平流过纳米孔。特定的报告子代码可以使用通常用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺化学有效地合成。可以通过从可商购获得的文库中选择一系列特定的亚磷酰胺来设计报告子。此类文库包括但不限于长度为1至12或更多个乙烯乙二醇单元的聚乙烯乙二醇、长度为1至12或更多个碳单元的脂肪族、脱氧腺苷(A)、脱氧胞嘧啶(C)、脱氧鸟苷(G)、脱氧胸腺嘧啶(T)、无碱基(Q)。与报告子代码缔合的双链TCE还有助于离子电流阻塞，因此报告子代码和TCE的组合可以称为“报告子”。在报告子代码之后是增强子，其在一个实施方案中包括精胺聚合物。
图3显示了切割的Xpandomer在α-溶血素纳米孔移位的过程中的一个实施方案。该生物纳米孔被嵌入脂质双层膜中，该脂质双层膜将两个电解质池分开并电隔离。典型的电解质具有1摩尔的KCl(缓冲至pH为7.0)。当在双层上施加通常为100mV的小电压时，纳米孔会限制离子电流的流动，并且是电路中的主要电阻。Xpandomer报告子被设计为提供特定的离子电流阻滞水平，并且当报告子的序列移位纳米孔时，可通过测量离子电流水平的序列来读取序列信息。
通常将α-溶血素纳米孔定向，以便通过进入vestibule侧并离开茎侧而发生移位。如图3所示，纳米孔被定向为首先从茎侧捕获Xpandomer。使用TCH方法时，该定向是有利的，因为它导致在首先进入vestibule时发生较少的堵塞人为产物。除非另有说明，否则茎侧首先将是假定的移位方向。当Xpandomer移位时，报告子进入茎，直到其双链TCE停在茎入口处。双链体的直径为～2.4nm而茎入口是～2.2nm，使得将报告子保持在茎中直至双链体的互补链395解离(释放)，于是移位进行至下一个报告子。由于Xpandomer仍在移位并从孔中扩散出去，因此非常不利于游离互补链进入纳米孔。
在一个实施方案中，报告子代码(在双链体之后)的每个成员由有序选择的亚磷酰胺形成，可以从许多商业文库中选择亚磷酰胺。每种组成型亚磷酰胺都根据其在纳米孔中的位置(位于双链体终止之后)、其位移、其电荷、其与纳米孔的相互作用、其化学和热环境以及其他因素，而有助于净离子电阻。每个亚磷酰胺上的电荷部分由于标称电荷为-1的磷酸根离子，但可通过抗衡离子屏蔽有效地减少。施加在双链体上的力是由于沿报告子的这些有效电荷所引起的，这些有效电荷受到局部电场的作用。由于每个报告子可以具有不同的电荷分布，因此对于给定的施加电压，它可以在双链体上施加不同的力。沿着报告子主链传递的力还用于使报告子伸出来，以提供可重复的阻塞响应。
由本发明人开发的边扩增边测序(SBX)方法相对于天然DNA提供了Xpandomer的序列读取效率和精确度的显著的性能增强。然而，将天然DNA模板的序列初始转录在可测量的Xpandomer上依赖于DNA聚合酶利用XNTP作为底物的能力(本文参考图1A和图2讨论了XNTP的普遍结构)。发明人已经发现大多数DNA聚合酶没有有效地聚合XNTP。然而，纳入适合的添加剂(诸如本文公开的PEM)提高了XNTP聚合至Xpandomer中的效率和精确度。因此，使用XNTP作为底物，可在SBX方法中使用如本文公开的PEM以增强DNA聚合酶引物延伸反应。
代表性引物延伸反应可包括以下试剂：2pmol引物、2.2pmol 45mer寡核苷酸模板、50pmol每种XNTP(XATP、XCTP、XGTP和XTTP)、50mM Tris HCl,pH 6.79、200mM NaCl、20％PEG、5％NMS、0.5nmol多磷酸盐60.19、0.3mM MnCl2和0.6μg纯化的重组DNA聚合酶蛋白。将PEM以通常在微摩尔至毫摩尔范围内的浓度添加至该混合物。反应还可包括另外的添加剂，诸如单链结合蛋白(SSB)、脲和NMS。反应在23℃下运行1小时。反应产物(即受约束的Xpandomer)经处理以切割氨基磷酸酯键，从而产生线性Xpandomer。使用凝胶电泳在4-12％丙烯酰胺凝胶上分析反应产物，以解析和可视化不同长度的Xpandomer产物。
因此，在一个实施方案中，本文提供了包含PEM和缓冲液(特别是适用于进行DNA聚合反应的缓冲液)的水性(含水)组合物，其中Tris HCl是该类型的示例性缓冲液。在一个实施方案中，本公开提供了包含PEM和DNA聚合酶蛋白的组合物。在一个实施方案中，本公开提供了包含PEM和多核苷酸的组合物，如20-90聚体、20-60聚体、30-90聚体、或30-60聚体、寡核苷酸。在一个实施方案中，本公开提供了包含这些组分中的每一种的组合物，即包含PEM、缓冲液、DNA聚合酶蛋白和多核苷酸的水性组合物。
为了研究XNTP聚合增强的精确度，可以使用SBX方案对引物延伸产物进行测序。简而言之，将XNTP聚合的受约束的Xpandomer产物切割以产生线性Xpandomer。这通过用含100mM EDTA、2mM THPTA和2％Tween-20的溶液首先猝灭延伸反应实现。然后将样品用1MNaHCO3和1M琥珀酸酐在DMF中的溶液进行胺改性。氨基磷酸酯键的切割用37％HCl进行并将线性Xpandomer用QIAquick柱(QIAGEN,Inc.)纯化。
对于测序，通过将α-溶血素在缓冲液B1(含2M NH4Cl和100mM HEPES,pH 7.4)中插入DPhPE/十六烷双层成员来制备蛋白纳米孔。将顺式孔(cis well)用缓冲液B2(含有0.4MNH4Cl，0.6M GuCl和100mM HEPES,pH 7.4.)灌注。将Xpandomer样品加热至70℃持续2分钟，完全冷却，然后添加2μL样品至顺式孔。然后施加90mV/390mV/10μs的电压脉冲，并经由Labview采集软件采集数据。
通过来自单个SBX反应的序列读取群的直方图展示，分析了序列数据。分析软件将每个序列读取与模板的序列比对，并在读段的末尾修整与正确模板序列未对齐的序列范围。。
在一个实施方案中，本文提供了增加XNTP聚合的增强的精确度的方法，其中该方法包括添加如本文公开的PEM至如上所述的DNA聚合反应。
在一个实施方案中，本文提供了试剂盒，其中试剂盒可用于如本文所述的方法中。试剂盒将包括本文公开的至少一种化合物，和以下中的一种或多种：a)分子拥挤剂、b)水性缓冲液、c)蛋白诸如聚合酶、d)可用作例如引物的多核苷酸和/或可用作例如模板的多核苷酸。
例如，在一个实施方案中，本文提供了用于对核酸模板进行测序的试剂盒。试剂盒包括本文公开的至少一种化合物以及核苷酸类似物混合物。相对于缺乏至少一种本文公开的化合物的相同的聚合反应，本文公开的化合物可用于增加在模板-依赖性聚合反应期间掺入子链的核苷酸类似物的数目和精确度。任选地，核苷酸类似物的混合物包含核苷氨基三磷酸酯，其中核苷氨基三磷酸酯中的每一种包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合系链部分，其中聚合系链部分的第一端连接至核碱基并且聚合系链部分的第二端连接至核苷氨基三磷酸酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割来提供核苷酸类似物的扩增。任选地，核苷酸类似物的混合物包含含可检测标记的核苷酸类似物，其中可检测标记是选自由以下组成的组的光学可检测标记：发光标记、化学发光标记、荧光标记、发荧光标记、发色团标记或显色标记。任选地，试剂盒包括水性缓冲液，所述水性缓冲液包含Tris OAc，NH4OAc，PEG，水混溶性有机溶剂诸如二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、丙酮等，多磷酸盐60，NMS和MnCl2。任选地，试剂盒包括单链结合蛋白。任选地，试剂盒包括脲。任选地，试剂盒包括这些组分中的两种或多种，如所命名的组分中的3种、或4种或所有。
如前提及的，本文提供了式(I)的PEM化合物，包括式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ii)、(Ij)、(Ik)、(Im)、(In)、(Io)、(Ip)、(Iq)、(Ir)和(Is)的PEM化合物。在另一个实施方案中，本文提供了式(II)
Figure BDA0002648854970000631
的PEM化合物，其同样可存在于本文公开的组合物中和用于本文公开的方法中。式(II)的PEM可以可选地表示为Ar3(三唑-Ar4)2。在式(II)中，Ar3表示被显示于括号中的两个三唑环取代的芳族部分。每个三唑环用由Ar4表示的单环芳族环取代，其中Ar4可选自苯基及其含N类似物，如吡啶基。除了三唑基团之外，式(II)的化合物的Ar4部分可以被除了氢之外的原子取代或可以不被除了氢之外的原子取代。如果Ar4被进一步取代，则一个或多个取代基可被表示为G基团。在一个实施方案中，G基团选自以下基团中的一种或任两种或多种：E-X、E-CO2R、E-CONH2、E-CHO、E-NR2和E-OR。在这些G基团中，E选自直连键和短亚烷基链，即C1-C6、亚烷基链、如亚甲基(即-CH2-)、亚乙基(即-CH2CH2-)、亚丙基(即-CH2CH2CH2-)和亚丁基(即-CH2CH2CH2CH2-)；X是选自氟(fluoride)、氯(chloride)、溴(bromide)和碘(iodide)的卤素(halide)；并且R独立选自H和短烷基基团，即C1-C6烷基基团。式(II)的范围内的化合物包括所示结构的螯合物和盐，如所示结构的铜螯合物包含在所公开的化合物的范围内。以下讨论涉及式(II)的化合物。
对于式(II)的化合物，Ar3部分是芳族部分。芳族部分可以是碳环或杂环芳族部分，其中每个芳族环原子是碳环芳族部分中的碳，而至少一个芳族环原子是杂环芳族部分中的氮、氧或硫。示例性芳族部分是碳环芳族部分。碳环部分可含有一个(如，苯)或两个(如，萘、薁)或三个(如，苊烯、芴)或四个(如，荧蒽、醋蒽烯)或五个(如，并五苯、苉)或六个(如，并六苯)芳族环，其中为了方便起见，Ar3基团可以在本文中通过命名其未取代形式(如，苯)来例举，尽管在式(II)的化合物中Ar3基团是相应的二基，即被三唑基团替代两个环氢的未取代形式。例如，芳族部分可以是单环碳环部分，即苯基，还被称为C6芳族部分。作为另一个实例，芳族部分可以是双环碳环部分，如萘基，其是C10芳族部分。
对于式(II)的化合物，Ar3包含经取代和未取代的芳族部分两者。在一个实施方案中，Ar3是经取代的芳族部分。在一个实施方案中，Ar3是非取代的芳族部分，其还可被称为未取代的芳族部分。在经取代的芳族部分中，一个或多个氢原子被取代基替代，例如任选地，1、或2、或3、或4、或5、或6个氢原子可被取代基替代。取代基可以是烷基基团，如C1-C6烷基基团，其中烷基基团可被一个或多个卤素诸如氟取代，以提供卤代烷基取代基。另外或可选地，示例性取代基可选自氨基、羟基、氰基、羧基、硝基、硫代基、烷氧基和卤素基团。
对于式(II)的化合物，示例性芳族部分是杂环芳族部分，其还可称为杂芳基基团。杂环部分除了含有1或2或3或4或5或6个杂原子(即除了碳之外的原子，其选自氮、硫和氧原子)之外还可含有一个或两个或三个或四个或五个或六个芳族环。任选地，杂原子如果存在，则是氮。例如，芳族部分可为单环杂环部分，如吡啶基，其是六元C5芳族部分，或吡嗪基，其是六元C4芳族部分。作为另一个实例，芳族部分可以是双环杂环部分，如喹啉基或异喹啉基，其是十元C9芳族部分，或1,5-萘啶基、2,6-萘啶基或2,7-萘啶基，其是示例性十元C8芳族部分。
因此，式(II)的化合物的杂芳基基团是含有5个或更多个环成员的芳族环化合物，其中一个或多个是杂原子诸如但不限于、N、O和S。指定为C2-杂芳基的杂芳基基团可以是含两个碳原子和三个杂原子的5-元环，含两个碳原子和四个杂原子的6-元环，以此类推。类似地，C4-杂芳基可以是含一个杂原子的5-元环、含两个杂原子的6-元环，以此类推。碳原子数加上杂原子数总和等于环原子的总数。式(II)中的杂芳基基团包括但不限于基团，诸如吡咯基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、吡啶基、硫苯基、苯并硫苯基、苯并呋喃基、吲哚基、氮杂吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、氮杂苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、咪唑并吡啶基、异噁唑并吡啶基、硫杂萘基、嘌呤基、黄嘌呤基、腺嘌呤基、鸟嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、喹喔啉基和喹唑啉基基团。因此，术语"杂芳基"和"杂芳基基团"包括稠环化合物诸如其中至少一个环但不必然所有环是芳族的，包括四氢喹啉基、四氢异喹啉基、吲哚基和2,3-二氢吲哚基。
式(II)的化合物中的Ar3基团将包括如本文所解释的芳族部分，其中此芳族部分可还如本文所述被任选取代，所述取代是除了被两个三唑基团(三唑–Ar4)取代之外的另外取代。式(II)的化合物的Ar3的示例性取代基是卤素诸如氟、氯和溴、具有1-6个碳原子的烷基基团诸如甲基和乙基、具有1-6个碳原子的卤代烷基基团诸如三氟甲基、氰基、甲酰基和甲酰胺。Ar3芳族部分的任何两个碳可以被三唑-Ar4部分取代。例如，当Ar3是取代的苯时，Ar3可以在邻、间或对位中被取代，如下所示，其中k表示取代可在芳族部分上发生的位置：
Figure BDA0002648854970000651
作为另一个实例，当Ar3是在式(II)的化合物中经取代的萘时，Ar3可在任两个萘基碳原子处被取代，其中以下结构显示了取代选项，其中k表示三唑取代可发生在芳族部分上的位置：
Figure BDA0002648854970000652
前述实例使用碳环芳族Ar3基团作为说明性的Ar3部分说明了在式(II)的化合物的Ar3部分上的三唑取代。然而，相同的原理也适用于式(II)的化合物的杂环芳族Ar3基团上的三唑取代。例如，当Ar3是经取代的吡啶时，两个三唑基团可以位于吡啶环上的任何以下位置，其中k用于指定三唑基团可以定位的位置：
Figure BDA0002648854970000661
在一个实施方案中，式(II)的化合物中的Ar3芳族部分可包含1-6个环，其中多达六个环原子可选自氧、硫和氮，剩余的是碳原子。任选地，Ar3芳族部分可包含1-5个环，其中多达五个环原子可选自氧、硫和氮。作为另一选项，Ar3部分可包含1-4个环，其中多达四个环原子可选自氧、硫和氮。作为又一选项，Ar3部分可包含1-3个环，其中多达三个环原子可选自氧、硫和氮。作为另一个实例，Ar3部分可包含1-2个环，其中多达三个环原子可选自氧、硫和氮。在任何情况下，在式(II)的化合物中，每个环可以独立地是五元环，即，五个环原子形成环，或六元环或七元环，而在一个选项中，每个环是五-或六元环。
因此，在一个示例性实施方案中，式(II)的化合物中的Ar3是选自以下的单环杂芳族结构：
Figure BDA0002648854970000662
其中三唑环在Ar3上的位置k处被取代。在另一个示例性实施方案中，式(II)的化合物中的Ar3是选自以下的单环碳环结构：
Figure BDA0002648854970000663
其中三唑环在Ar3上的位置k处被取代。在另一个示例性实施方案中，式(II)的化合物中的Ar3是选自以下的双环碳环结构：
Figure BDA0002648854970000664
Figure BDA0002648854970000665
Figure BDA0002648854970000671
其中三唑环在Ar3上的位置k处被取代。在另一个实施方案中，式(II)的化合物中的Ar3是多环杂环结构，其具有两个六元环和一个五元环及一个氮环原子并选自
Figure BDA0002648854970000672
Figure BDA0002648854970000673
其中三唑环在Ar3上的位置k处被取代。在又一个示例性实施方案中，式(II)的化合物中的Ar3是多环杂环结构，其具有三个六元环和两个氮环原子并选自
Figure BDA0002648854970000674
Figure BDA0002648854970000675
其中三唑环在Ar3上的位置k处被取代。
式(II)的化合物中的每种三唑环被由Ar4表示的单环芳族环取代，其中Ar4可以是如苯基或吡啶基。除了三唑基团之外，Ar4部分可以或可以不被除氢之外的原子取代。如果Ar4被进一步取代，则式(II)的化合物中的一个或多个取代基被表示为G基团。在一个实施方案中，G基团选自以下基团中的一种或任两种或多种：E-X、E-CO2R、E-CONH2、E-CHO、E-NR2和E-OR。在这些G基团中，E选自直连键和短亚烷基链，即C1-C6、亚烷基链、如亚甲基(即-CH2-)、亚乙基(即-CH2CH2-)、亚丙基(即-CH2CH2CH2-)和亚丁基(即-CH2CH2CH2CH2-)；X是选自氟、氯、溴和碘的卤素；和R独立选自H和短烷基基团，即C1-C6烷基基团。
以下是涉及式(II)的化合物的本文公开的另外示例性实施方案：
一种式(II)的化合物,包括其螯合物和盐：
Figure BDA0002648854970000681
其中
Ar3是被两个三唑环取代的芳族结构；和
Ar4是选自苯基和吡啶基的单环芳族环，其中Ar4可被选自以下的一个或多个取代基(G)取代：E-X、E-CO2R、E-CONH2、E-CHO、E-NR2和E-OR，其中
a.E选自直连键、亚甲基、亚乙基、亚丙基和亚丁基；
b.X是选自氟、氯、溴和碘的卤素；和
c.R独立选自H和C1-C6烷基。
1)如实施方案1所述的式(II)化合物，其中Ar3是选自以下的单环杂芳族结构：
Figure BDA0002648854970000682
其中三唑环在Ar3上的位置k处被取代。
2)如实施方案1所述的式(II)化合物，其中Ar3是选自以下的单环碳环结构：
Figure BDA0002648854970000683
其中三唑环在Ar3上的位置k处被取代。
3)如实施方案1所述的式(II)化合物，其中Ar3是选自以下的双环碳环结构：
Figure BDA0002648854970000691
其中三唑环在Ar3上的位置k处被取代。
4)如实施方案1所述的式(II)化合物，其中Ar3是选自以下的多环杂环碳环结构：
Figure BDA0002648854970000692
其中三唑环在Ar3上的位置k处被取代。
5)如实施方案1所述的式(II)化合物，其中Ar3是选自以下的多环杂环结构：
Figure BDA0002648854970000693
其中三唑环在Ar3上的位置k处被取代。
6)如实施方案1-6中任一项所述的式(II)化合物，其中Ar4是选自以下的吡啶基环：
Figure BDA0002648854970000694
其中取代基G在吡啶基环上出现0、1或2次。
7)如实施方案1-6中任一项所述的式(II)化合物，其中Ar4是下式的苯基环：
Figure BDA0002648854970000701
其中取代基G在苯基环上出现0、1或2次。
8)如实施方案1-6中任一项所述的式(II)化合物，其中Ar4是选自以下的经取代的苯基环：
Figure BDA0002648854970000702
9)如实施方案1-9中任一项所述的式(II)化合物，其中Ar4上的取代是一个羧酸基团和一个羟基基团。
10)如实施方案1-9中任一项所述的式(II)化合物，其中Ar4上的取代是一个氨基基团。
11)如实施方案1-9中任一项所述的式(II)化合物，其中Ar4上的取代是一个甲氧基基团。
12)如实施方案1-9中任一项所述的式(II)化合物，其中Ar4上的取代是一个羧酸基团。
13)如实施方案1-9中任一项所述的式(II)化合物，其中Ar4上的取代是一个–CH2-CO2-CH3基团。
14)如实施方案1-14中任一项所述的式(II)化合物，其呈螯合物的形式。
15)如实施方案15所述的式(II)化合物，其中螯合物是铜螯合物。
16)一种组合物，其包含如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物和水性缓冲液诸如Tris HCl。
17)一种组合物，其包含如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物和多核苷酸诸如20-60聚体寡核苷酸。
18)一种组合物，其包含如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物和蛋白诸如DNA聚合酶。
19)一种组合物，其包含如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物以及核苷酸或核苷酸类似物的混合物。
20)一种增强核酸聚合酶反应的方法，所述方法包括：
a.形成核酸聚合酶反应组合物，其包含：
i.模板核酸，
ii.核酸聚合酶，
iii.核苷酸或核苷酸类似物的混合物，和
iv.至少一种如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物；和
b.在允许核酸聚合反应的条件下孵育核酸聚合酶反应组合物，其中至少一种如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物增加核酸聚合酶反应的持续性、速率或保真度。
21)如实施方案21所述的方法，其中与缺乏如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物的核酸聚合酶反应相比，如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物增加所得核酸产物的长度。
22)如实施方案21所述的方法，其中至少一种如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物包含多种如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物。
23)如实施方案21所述的方法，其中核酸聚合酶是DNA聚合酶。
24)如实施方案24所述的方法，其中DNA聚合酶是DPO4或其变体。
25)如实施方案21所述的方法，其中核苷酸或核苷酸类似物的混合物是包含核苷氨基三磷酸酯的核苷酸类似物的混合物，其中核苷氨基三磷酸酯中的每一种包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合系链部分，其中聚合系链部分的第一端连接至核碱基并且聚合系链部分的第二端连接至核苷氨基三磷酸酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割来提供核苷酸类似物的扩增。
26)如实施方案21所述的方法，其中核酸聚合反应产生核苷酸类似物的可扩增聚合物，其中可扩增聚合物编码模板核酸的核碱基序列信息。
27)如实施方案21所述的方法，其中用于允许核酸聚合反应的条件包括适合的聚合缓冲液和寡核苷酸引物.
28)如实施方案21所述的方法，其中适合的缓冲液包含Tris OAc、NH4OAc、PEG、DMF、多磷酸盐60、NMS和MnCl2。
29)如实施方案21所述的方法，其中反应混合物还包含单链结合蛋白。
30)如实施方案21所述的方法，其中反应混合物还包含脲。
31)如实施方案21所述的方法，其中核苷酸或核苷酸类似物的混合物包含含可检测标记的核苷酸类似物。
32)如实施方案32所述的方法，其中可检测标记是选自由以下组成的组的光学可检测标记：发光标记、化学发光标记、荧光标记、发荧光标记、发色团标记或显色标记。
33)一种用于增强DNA聚合酶反应的持续性、保真度或速率的组合物，其包含至少一种如实施方案1-16中任一项所述的化合物和核苷酸类似物的混合物。
34)一种包含至少一种如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物和核苷酸类似物的混合物的组合物，任选地，其中相对于缺少至少一种如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物的相同聚合反应，所述至少一种如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物增加在模板-依赖性聚合反应期间掺入子链的核苷酸类似物的数目和精确度。
35)如实施方案35所述的组合物，其中核苷酸类似物的混合物包含核苷氨基三磷酸酯，其中核苷氨基三磷酸酯中的每一种包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合系链部分，其中聚合系链部分的第一端连接至核碱基并且聚合系链部分的第二端连接至核苷氨基三磷酸酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割来提供核苷酸类似物的扩增。
36)如实施方案35所述的组合物，其还包含缓冲液，所述缓冲液包含Tris OAc、NH4OAc、PEG、DMF、多磷酸盐60、NMS和MnCl2。
37)如实施方案35所述的组合物，其还包含单链结合蛋白。
38)如实施方案35所述的组合物，其还包含脲。
39)如实施方案35所述的组合物，其中核苷酸类似物的混合物包含含可检测标记的核苷酸类似物。
40)如实施方案40所述的组合物，其中可检测标记是选自由以下组成的组的光学可检测标记：发光标记、化学发光标记、荧光标记、发荧光标记、发色团标记或显色标记。
41)一种用于对DNA模板进行测序的方法，所述方法包括以下步骤：
a.形成DNA聚合酶反应组合物，其包含：
i.DNA模板，
ii.与所述模板复合的复制引物，
iii.DNA聚合酶，
iv.核苷酸或核苷酸类似物的混合物，
v.至少一种如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物，
b.在允许DNA聚合反应的条件下孵育DNA聚合酶反应组合物，其中至少一种如实施方案1-16中任一项所述的式(II)化合物增加DNA聚合酶反应的速率、保真度或持续性；和
c.测定所得的核苷酸或核苷酸类似物聚合物中的核苷酸或核苷酸类似物的序列。
42)如实施方案42所述的方法，其中核苷酸类似物的混合物包含核苷氨基三磷酸酯，其中核苷氨基三磷酸酯中的每一种包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合系链部分，其中聚合系链部分的第一端连接至核碱基并且聚合系链部分的第二端连接至核苷氨基三磷酸酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割来提供核苷酸类似物的扩增。
43)如实施方案42所述的方法，其中DNA聚合酶是DPO4或其变体。
44)如实施方案42所述的方法，其中所得的核苷酸类似物聚合物是可扩增聚合物。
45)如实施方案42所述的方法，其还包括使可扩增聚合物与氨基磷酸酯切割剂接触以产生核苷酸类似物的扩增聚合物的步骤。
46)如实施方案42所述的方法，其中每种核苷酸类似物的聚合系链部分包含类似物的核碱基独特的报告子部分。
47)如实施方案42所述的方法，其中报告子部分产生特征性电子信号。
48)如实施方案42所述的方法，其中测定核苷酸类似物的序列的步骤包括使核苷酸类似物的扩增聚合物通过纳米孔移位的步骤。
化合物可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备，其中此类方法可以通过各种参考书和数据库进行确定。对可用于制备本文公开的化合物的反应物的合成进行详述或者提供对描述该制备的文章的参考的适合参考书和论文包括例如"Synthetic OrganicChemistry,"John Wiley&Sons,Inc.,New York；S.R.Sandler等人,"Organic FunctionalGroup Preparations,"第2版,Academic Press,New York,1983；H.O.House,"ModemSynthetic Reactions",第2版,W.A.Benjamin,Inc.Menlo Park,Calif 1972；T.L.Gilchrist,"Heterocyclic Chemistry",第2版,John Wiley&Sons,New York,1992；J.March,"Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms and Structure,"第4版,Wiley-Interscience,New York,1992。对可用于制备本文公开的化合物的反应物的合成进行详述或者提供对描述该制备的文章的参考的另外适合的参考书和论文包括例如Fuhrhop,J.和Penzlin G."Organic Synthesis:Concepts,Methods,StartingMaterials",第2版、修改版和补版(1994)John Wiley&Sons ISBN:3-527-29074-5；Hoffman,R.V."Organic Chemistry,An Intermediate Text"(1996)Oxford UniversityPress,ISBN 0-19-509618-5；Larock,R.C."Comprehensive Organic Transformations:AGuide to Functional Group Preparations"第2版(1999)Wiley-VCH,ISBN:0-471-19031-4；March,J."Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure"第4版(1992)John Wiley&Sons,ISBN:0-471-60180-2；Otera,J.(编辑)"Modern CarbonylChemistry"(2000)Wiley-VCH,ISBN:3-527-29871-1；Patai,S."Patai's 1992 Guide tothe Chemistry of Functional Groups"(1992)Interscience ISBN:0-471-93022-9；Quin,L.D.等人"A Guide to Organophosphorus Chemistry"(2000)Wiley-Interscience,ISBN:0-471-31824-8；Solomons,T.W.G."Organic Chemistry"第7版(2000)John Wiley&Sons,ISBN:0-471-19095-0；Stowell,J.C.,"Intermediate Organic Chemistry"第2版(1993)Wiley-Interscience,ISBN:0-471-57456-2；"Industrial Organic Chemicals:Starting Materials and Intermediates:An Ullmann's Encyclopedia"(1999)JohnWiley&Sons,ISBN:3-527-29645-X,在8卷中；"Organic Reactions"(1942-2000)JohnWiley&Sons,在超过55卷中；和"Chemistry of Functional Groups"John Wiley&Sons,在73卷中。
实施例
如表7所示的化合物根据本文公开的一般实施例制备。
材料和方法.4-叠氮基水杨酸和2,6-二溴-4-吡啶羧酸来自Toronto ResearchChemicals,Inc.(Toronto,ON,Canada)。7-氨基-2-羟基-1,8-萘啶-4-羧酸来自EnamineLLC(Monmouth,NJ)。Tris[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU),1,3-二乙炔基苯,2,6-二乙炔基吡啶、3,5-二乙炔基吡啶、3,6-二乙炔基咔唑、4-叠氮基苯甲酸来自TCI America(Portland,OR,USA)。4-甲氧基-2,6-二溴吡啶、4-硝基-2,6-二溴吡啶和2,6-二溴-4-吡啶羧酸来自Chem-Impex International,Inc.(Wood Dale,IL)。4-氰基-2,6-二溴吡啶来自Ark Pharm,Inc.(Arlington Heights,IL)。四(三苯基膦)钯(0)、乙炔基三甲基硅烷、DMSO、抗坏血酸钠、硫酸铜、2,6-二氯吡啶-4-羧酸甲酯、2,6-二溴吡啶-4-羧酸乙酯、4-甲基-2,6-二氯吡啶、2-氯-4-氰基吡啶、4-氨基-2-(三氟甲基)苯甲酸、2-溴-4-氰基吡啶、乙酸甲基叠氮酯、4-叠氮基苯胺盐酸盐、4-甲氧基苯基叠氮化物和EDTA来自Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis,MO,USA)。TLC和快速色谱溶剂来自Sigma-Aldrich或Thermo FisherScientific Inc.(Waltham,MA,USA)。
快速色谱在来自Buchi Corp.(New Castle,DE)的Reveleris Prep PurificationSystem上进行。该系统装有手动填充的柱子(2.3cm直径X 8cm高度)，其填充了来自SorbentTechnologies,Inc(Norcross,GA)的C18球形硅胶(目录号76646-01)，并用聚丙烯熔料密封。将1至1.5mL的样品直接上样在柱头上。流动相为水(A)和乙腈(B)。在28ml/min的流速下，2分钟内0至2％梯度的B，然后20分钟内2至100％梯度的B。在220nm、260nm和280nm处监测UV。在0.1AU的紫外线阈值下收集级分。薄层色谱使用来自EMD Millipore Corp.(Billireca,MA,USA)的铝衬TLC硅胶60F254(目录号1.05534.0001)进行。
表7
Figure BDA0002648854970000761
Figure BDA0002648854970000771
Figure BDA0002648854970000781
Figure BDA0002648854970000791
Figure BDA0002648854970000801
Figure BDA0002648854970000811
Figure BDA0002648854970000821
Figure BDA0002648854970000831
Figure BDA0002648854970000841
Figure BDA0002648854970000851
Figure BDA0002648854970000861
实施例1
Figure BDA0002648854970000871
通过将4-叠氮基水杨酸B(1.79mg,10μmol)和2,6-二乙炔基吡啶A(0.67mg,5μmol)在DMSO(150μL)中混合来制备上述化合物1。将该溶液与TBTA(5.1mg,0.96μmol)和抗坏血酸钠(6.4mg,32μmol)于DMSO(95μL)中的溶液混合。通过在搅拌下添加20mM硫酸铜(5μL)引发点击反应。通过TLC(94:5:1乙酸乙酯:甲醇:乙酸)分析反应的程度，并且基于叠氮化物和炔烃的消耗，反应在5分钟内完成。用DMSO和0.5M EDTA(100μL)将反应混合物体积调至1mL。分离出固体并溶解在另外的DMSO中。如上文材料和方法中所述，将DMSO溶液合并并通过快速色谱纯化。旋转蒸发后，该产物以50至75％的产率形成玻璃状固体。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δppm 3.29(2H,br.s.,(O(18)H和O(33)H)),7.17-7.29(4H,m,(C(7)H,C(11)H,C(28)H,C(32)H))7.85(2H,d,J＝8.11(C(10)H和C(31)H)),8.06(3H,s,(C(15)H,C(16)H,C(17)H))9.36(2H,s,(C(5)H和C(25)H))。
实施例2
Figure BDA0002648854970000881
根据实施例1的方法使用4-叠氮基水杨酸B和3,5-二乙炔基吡啶C制备上述的化合物2。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δppm 3.29(2H,br.s.,(O(18)H和O(33)H))7.17-7.29(4H,m,(C(7)H,C(11)H,C(28)H,C(31)H))7.85(2H,d,J＝8.11Hz,(C(10)H和C(31)H))8.06(3H,s,,(C(13)H,C(15)H,C(17)H))9.36(2H,s,(C(5)H和C(25)H))。
实施例3
Figure BDA0002648854970000882
根据实施例1的方法使用4-叠氮基水杨酸B和1,3-二乙炔基苯D制备上述的化合物3。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δppm 3.29(2H,br.s.,(O(18)H和O(33)H))7.16-7.27(4H,m,(C(7)H,C(11)H,C(28)H,C(32)H))7.57-7.67(1H,m,(C(16)H))7.80-7.88(2H,m,(C(10)H和C(31)H))7.94(2H,d,J＝7.63Hz,(C(15)H和C(17)H)8.57(1H,s,(C(13)H))9.35(2H,s,(C(5)H和C(25)H)。
实施例4
Figure BDA0002648854970000891
根据实施例1的方法使用4-叠氮基水杨酸B和3,6-二乙炔基咔唑E制备上述的化合物4。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δppm 3.29(2H,br.s.,(O(25)H和O(40)H))7.16-7.27(4H,m,(C(7)H,C(11)H,C(35)H,C(39)H))7.61(2H,d,J＝8.34Hz,(C(10)H和C(38)H))7.84(2H,d,J＝7.87Hz,(C(22)H和C(24)H))8.02(2H,d,J＝8.34Hz,(C(21)H和C(23)H))8.79(2H,s,(C(13)H和C(19)H))9.28(2H,s,(C(5)H和C(32)H))11.53(1H,s,(N(16)H)。
实施例5
Figure BDA0002648854970000892
根据实施例1的方法使用4-叠氮基苯胺盐酸盐F和3,6-二乙炔基咔唑E制备上述的化合物5。
实施例6
Figure BDA0002648854970000901
根据实施例1的方法使用4-叠氮基苯甲酸G和3,6-二乙炔基咔唑E制备上述的化合物6。
实施例7
Figure BDA0002648854970000902
根据实施例1的方法使用4-叠氮基苯甲醚H和3,6-二乙炔基咔唑E制备上述的化合物7。
实施例8
Figure BDA0002648854970000903
根据实施例1的方法使用叠氮基乙酸甲酯I和3,6-二乙炔基咔唑E制备上述的化合物8。
实施例9
Figure BDA0002648854970000911
使用Organomet.Chem.,653:46–49(2002)doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0)中所述的薗头条件从4-甲氧基-2,6-二溴吡啶和乙炔基三甲基硅烷合成4-甲氧基-2,6-二乙炔基吡啶J来开始制备上述的化合物9。化合物9的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和化合物J完成。
实施例10
Figure BDA0002648854970000912
使用Organomet.Chem.,653:46–49(2002)doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0)中所述的薗头条件从4-氰基-2,6-二溴吡啶和乙炔基三甲基硅烷合成4-氰基-2,6-二乙炔基吡啶K来开始制备上述的化合物10。化合物10的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和化合物K完成。
实施例11
Figure BDA0002648854970000921
使用Organomet.Chem.,653:46–49(2002)doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0)中所述的薗头条件从4-硝基-2,6-二溴吡啶和乙炔基三甲基硅烷合成4-硝基-2,6-二乙炔基吡啶L来开始制备上述的化合物11。化合物11的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和化合物L完成。
实施例12
Figure BDA0002648854970000922
根据实施例10的方法使用5-叠氮基水杨酸M和4-氰基-2,6-二乙炔基吡啶K制备上述的化合物12。
实施例13
Figure BDA0002648854970000931
使用Organomet.Chem.,653:46–49(2002).doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0)中所述的薗头条件从4-甲基-2,6-二氯吡啶和乙炔基三甲基硅烷合成4-甲基-2,6-二乙炔基吡啶N来开始制备上述的化合物13。化合物11的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和4-甲基-2,6-二乙炔基吡啶N完成。
实施例14
Figure BDA0002648854970000932
使用Organomet.Chem.,653:46–49(2002).doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0)中所述的薗头条件从2,6-二溴吡啶-4-羧酸乙酯和乙炔基三甲基硅烷合成2,6-二乙炔基吡啶-4-羧酸乙酯O来开始制备上述的化合物14。化合物14的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和2,6-二乙炔基吡啶-4-羧酸乙酯O完成。
实施例15
Figure BDA0002648854970000941
使用根据实施例14的方法点击的5-叠氮基水杨酸M和2,6-二乙炔基吡啶-4-羧酸乙酯O制备以上显示的化合物15。
实施例16
Figure BDA0002648854970000942
Figure BDA0002648854970000951
使用Organomet.Chem.,653:46–49(2002).doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0)中所述的薗头条件从2,6-二氯吡啶-4-羧酸甲酯和乙炔基三甲基硅烷合成2,6-二乙炔基吡啶-4-羧酸甲酯P来开始上述的化合物16。化合物16的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和2,6-二乙炔基吡啶-4-羧酸甲酯P完成。
实施例17
Figure BDA0002648854970000952
化合物17(上示)的合成用在DMF(900ul)中混合2,6-二溴-4-吡啶羧酸(0.2g,0.71mmol)、DIPEA(0.18g,1.42mmol)和HATU(0.27g,0.71mmol)开始。立即添加乙胺(0.154ml,1.78mmol)并混合1小时。反应通过TLC完成并通过快速色谱在硅胶上使用乙酸乙酯/己烷梯度来纯化。N-乙基-2,6-二溴-4-甲酰胺被分离为69％的产率的黄色固体。N-乙基-2,6-二乙炔基-4-甲酰胺Q用乙基三甲基硅烷使用实施例16中所述的薗头方法制备。化合物17的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和N-乙基-2,6-二乙炔基-4-甲酰胺Q来完成。
实施例18
Figure BDA0002648854970000961
根据实施例17的方法，用甲胺制备以上所示的化合物18以形成酰胺。
实施例19
Figure BDA0002648854970000962
根据实施例17的方法，用氨制备以上所示的化合物19以形成酰胺。
实施例20
Figure BDA0002648854970000963
使用App.Organomet.Chem.31(12):e3824(2017)DOI:10.1002/aoc.3824中所述的薗头方法从2,6-二氯吡嗪和乙炔基三甲基硅烷合成2,6-二乙炔基吡嗪T来开始上述的化合物20。化合物20的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和2,6-二乙炔基吡嗪T完成。
实施例21
Figure BDA0002648854970000971
上示化合物73的合成通过用亚硝酸钠和硫酸对4-氨基-2-(三氟甲基)苯甲酸进行重氮化开始，然后用叠氮化物进行亲核置换(Org.Synth.1942,22,96 DOI:10.15227/orgsyn.022.0096)以形成4-叠氮基-2-(三氟甲基)苯甲酸(U)，将其经由快速色谱来纯化。化合物73的合成通过根据实施例1点击4-叠氮基-2-(三氟甲基)苯甲酸U和N-乙基-2,6-二乙炔基-4-甲酰胺Q来完成。
实施例22
Figure BDA0002648854970000972
上述化合物74的合成通过用亚硝酸钠和硫酸对7-氨基-2-羟基-1,8-萘啶-4-羧酸进行重氮化开始，然后用叠氮化物进行亲核置换(Org.Synth.1942,22,96 DOI:10.15227/orgsyn.022.0096)以形成7-叠氮基-2-羟基-1,8-萘啶-4-羧酸(V)，将其经由快速色谱来纯化。化合物74的合成通过根据实施例1点击7-叠氮基-2-羟基-1,8-萘啶-4-羧酸V和N-乙基-2,6-二乙炔基-4-甲酰胺Q来完成。
实施例23
Figure BDA0002648854970000981
化合物28的合成分两步完成。首先，根据实施例3的方法，用一半的化学计量量的4-叠氮基水杨酸B点击2,6-二乙炔基苯D，以制备4-(4-(3-乙炔基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-羟苯甲酸。第二步是根据实施例1的方法点击4-叠氮基苯甲酸G以得到4-(4-(3-(1-(4-羧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-羟苯甲酸28。
实施例24
Figure BDA0002648854970000982
使用Organomet.Chem.,653:46–49(2002).doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0中所述的薗头条件从4-氰基-2-氯吡啶和乙炔基三甲基硅烷合成4-氰基-2-乙炔基吡啶W来开始上述的化合物43的制备。化合物43的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和化合物W完成。
实施例25
Figure BDA0002648854970000991
按照Tepper等人，Org.Lett.,2015,17(23),第5740–574页DOI:10.1021/acs.orglett.5b02760的方法(其涉及用n-碘琥珀酰亚胺和硝酸银处理以及通过快速色谱进行分离)从2,6-二乙炔基吡啶A合成2,6-双(碘乙炔基)吡啶X来开始上述的化合物31的制备。化合物31的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和化合物X来完成。
实施例26
Figure BDA0002648854970000992
使用App.Organomet.Chem.31(12):e3824(2017)DOI:10.1002/aoc.3824中所述的薗头方法从2,6-二溴-3,5-二甲基吡啶和乙炔基三甲基硅烷合成2,6-二乙炔基-3,5-二甲基吡啶Y来开始上示的化合物30。化合物30的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和2,6-二乙炔基-3,5-二甲基吡啶Y完成。
实施例27
Figure BDA0002648854970001001
使用App.Organomet.Chem.31(12):e3824(2017)DOI:10.1002/aoc.3824中所述的薗头方法从9-乙酰基-3,6-二碘咔唑和乙炔基三甲基硅烷合成9-乙酰基-3,6-二乙炔基咔唑Z来开始上示的化合物33。化合物33的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和9-乙酰基-3,6-二乙炔基咔唑Z完成。
实施例28
Figure BDA0002648854970001002
Figure BDA0002648854970001011
化合物34(上示)的合成开始于在DMF(72ul)中混合N-羟基琥珀酰亚胺4-叠氮基水杨酸酯(40mg,0.145mmol)，向其中添加在水(72ul)中的羟胺盐酸盐(30mg,0.43mmol)，并混合过夜。通过TLC检测产物，并将反应物通过硅胶快速色谱使用亚甲基氯和亚甲基氯-MeOH的梯度纯化。以57％的产率分离4-叠氮基-N,2-二羟基苯甲酰胺AA。化合物34的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基-N,2-二羟基苯甲酰胺AA和2,6-二乙炔基吡啶A来完成。
实施例29
Figure BDA0002648854970001012
以上所示的化合物44的合成开始于用亚硝酸钠和硫酸对5-氨基-2-羟基-3-甲基苯甲酸进行重氮化，然后是用叠氮化物进行亲核置换(Org.Synth.1942,22,96 DOI:10.15227/orgsyn.022.0096)以形成5-叠氮基-2-羟基-3-甲基苯甲酸(BB)，将其经由快速色谱进行纯化。化合物44的合成通过根据实施例1点击5-叠氮基-2-羟基-3-甲基苯甲酸BB 与2,6-二乙炔基吡啶-4-羧酸酯P来完成。
实施例30
Figure BDA0002648854970001021
化合物47(上示)的合成开始于将2,6-二溴-4-吡啶羧酸(0.2g,0.71mmol)、DIPEA(0.18g,1.42mmol)和HATU(0.27g,0.71mmol)混合于DMF(900ul)中。立即添加丁炔胺(0.154ml,1.78mmol)并混合1小时。反应通TLC过完成并通过硅胶快速色谱使用乙酸乙酯/己烷梯度纯化。分离呈固体的N-(丁-3-炔-1-基)-2,6-二溴异烟酰胺。使用实施例16所述的薗头方法，用乙基三甲基硅烷制备N-(丁-3-炔-1-基)-2,6-二乙炔基异烟酰胺CC。化合物47的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和N-(丁-3-炔-1-基)-2,6-二乙炔基异烟酰胺CC来完成。
实施例31
Figure BDA0002648854970001022
以上所示的化合物63开始于使用App.Organomet.Chem.31(12):e3824(2017)DOI:10.1002/aoc.3824中所述的薗头方法从2,7-二溴萘和乙炔基三甲基硅烷合成2,7-二乙炔基萘DD。化合物63的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和2,7-二乙炔基萘DD来完成。
实施例32
Figure BDA0002648854970001031
以上所示的化合物64开始于使用App.Organomet.Chem.31(12):e3824(2017)DOI:10.1002/aoc.3824中所述的薗头方法从2,3-二溴萘和乙炔基三甲基硅烷合成2,3-二乙炔基萘EE。化合物64的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和2,3-二乙炔基萘EE来完成。
实施例33
Figure BDA0002648854970001032
Figure BDA0002648854970001041
以上所示的化合物71开始于使用App.Organomet.Chem.31(12):e3824(2017)DOI:10.1002/aoc.3824中所述的薗头方法从2,6-二溴-4-吡啶羧酸和乙炔基三甲基硅烷合成2,6-二乙炔基-4-吡啶羧酸。通过快速色谱进行分离之后，2,6-二乙炔基-4-吡啶羧酸用HATU、DIPEA和1,4-二氨基丁烷处理以得到N,N'-(丁烷-1,4-二基)双(2,6-二乙炔基异烟酰胺)(FF)。化合物71的合成通过根据实施例1的方法点击4-叠氮基水杨酸B和N,N'-(丁烷-1,4-二基)双(2,6-二乙炔基异烟酰胺)(FF)完成。
实施例34
Figure BDA0002648854970001042
以上所示的化合物72的合成开始于使用亚硝酸钠和硫酸对4-氨基-3,5,6-三氯吡啶-2-羧酸进行重氮化，然后用叠氮化物进行亲核置换(Org.Synth.1942,22,96 DOI:10.15227/orgsyn.022.0096)以形成4-叠氮基-3,5,6-三氯吡啶-2-羧酸(GG)，将其经由快速色谱进行纯化。化合物72的合成通过根据实施例1点击4-叠氮基-3,5,6-三氯吡啶-2-羧酸GG与N-乙基-2,6-二乙炔基-4-甲酰胺Q来完成。
实施例35
筛选对XNTP聚合增强的PEM
由发明人开发的边扩增边测序(SBX)方法相对于天然DNA提供了Xpandomer的序列读取效率和精确度的显著性能增强。然而，将天然DNA模板的序列初始转录在可测量的Xpandomer上依赖于DNA聚合酶利用XNTP作为底物的能力(本文参考图1A和图2讨论了XNTP的通用结构结构)。本申请发明人发现，大多数DNA聚合酶不能有效地聚合XNTP。为了提高XNTP聚合为Xpandomer的效率和精确度，筛选了若干种PEM使用XNTP作为底物增强DNA聚合酶引物延伸反应的能力。
代表性引物延伸反应可包括以下试剂：2pmol引物、2.2pmol 45聚体(mer)寡核苷酸模板、各50pmol的XNTP(XATP、XCTP、XGTP和XTTP)、50mM Tris HCl,pH 6.79、200mM NaCl、20％PEG、5％NMS、0.5nmol多磷酸盐60.19、0.3mM MnCl2和0.6μg经纯化的重组DNA聚合酶蛋白。在23℃下运行反应1小时。处理反应产物(即，受约束的Xpandomer)以切割氨基磷酸酯键，从而生成线性Xpandomer。使用凝胶电泳在4-12％丙烯酰胺凝胶上分析反应产物，以分辨和可视化不同长度的Xpandomer产物。对于上述的PEM筛选，通常在微摩尔至毫摩尔范围内对PEM进行测试。
令人惊讶的是，观察到若干种PEM都显著并可重现地增强了DNA聚合酶-介导的用XNTP进行的引物延伸。证明这种增强的代表性凝胶在图4和5中呈现。参考图4，从泳道1(无PEM添加剂)中可以看出，DNA聚合酶在这些条件下将模板结合的引物延伸至最多仅约14个XNTP。然而，添加某些PEM至引物延伸反应使得聚合酶能够合成相当更长的延伸产物，如可在泳道3(化合物4)、7(化合物3)和9(化合物1)中所见。相反，若干种不同的芳香族化合物对XNTP聚合基本没有作用或没有作用(参见，如泳道2、4–6和8)，这表明PEM活性是化合物1、3和4特异的。
类似地，参考图5，在PEM添加剂不存在下，DNA聚合酶显示了用XNTP进行的适度引物延伸活性(泳道1，无PEM添加剂)，而添加各种浓度的化合物2(泳道8-10)显著增强了引物延伸活性。再次，该PEM活性是化合物2特异的，因为其他非相关的芳香族化合物不具有作用(泳道2-7)。
实施例36
PEM增强边扩增边测序(SBX)
为了研究PEM-依赖性的对XNTP聚合的增强的精确度，使用SBX方案对引物延伸产物进行测序。简而言之，切割XNTP聚合的受约束的Xpandomer产物以生成线性Xpandomer。这首先通过用含有100mM EDTA、2mM THPTA和2％Tween-20的溶液猝灭延伸反应来完成。然后将样品用1M NaHCO3和1M琥珀酸酐在DMF中的溶液进行胺改性。氨基磷酸酯键的切割用37％HCl进行，并将线性Xpandomer用QIAquick柱(QIAGEN,Inc.)纯化。
对于测序，通过将α-溶血素在缓冲液B1(含2M NH4Cl和100mM HEPES,pH 7.4)中插入DPhPE/十六烷双层成员来制备蛋白纳米孔。将顺式孔用缓冲液B2(含有0.4M NH4Cl，0.6MGuCl和100mM HEPES,pH 7.4.)灌注。将Xpandomer样品加热至70℃持续2分钟，完全冷却，然后添加2μL样品至顺式孔。然后施加90mV/390mV/10μs的电压脉冲，并经由Labview采集软件采集数据。
通过来自单个SBX反应的序列读取群的直方图展示，分析了序列数据。分析软件将每个序列读取与模板的序列对齐，并在读取的末端修整与正确模板序列未对齐的序列范围。45聚体(mer)模板的SBX测序的代表性直方图呈现在6A(无添加剂对照)和图6B(在存在PEM化合物1的情况下的SBX)中。可以看出，在不存在化合物1的情况下，超过模板约碱基18的序列读取是不精确的。值得注意的是，添加化合物1至SBX反应在整个长度的45聚体模板上都增加了序列读取的精确度。
这些结果激发了另外实验来测试PEM化合物1增强甚至更长模板的SBX的能力。图7A和7B分别显示了60聚体和80聚体模板的SBX测序的直方图。令人惊讶的是，化合物1使得精确序列读取能够完全至这些更长模板中的每一种的末端。这些结果证明了新型PEM对XNTP聚合活性的稳健且精确的增强，这显著提高了SBX提供基于纳米孔的核酸序列信息的能力。
实施例37
PEM使得能够合成长Xpandomer产物
成功地将长达80个核苷酸的模板精确复制至Xpandomer中后，使用四个更长的模板(长度由88、127、227和277个核苷酸组成)进行了XNTP聚合反应。在这些聚合反应中使用了称为C4552(SEQ ID NO:1)的DPO4 DNA聚合酶变体，并在存在PEM化合物1的情况下针对C4552活性优化了反应条件。其他适合的DPO4聚合酶变体包括但不限于SEQ ID NO:2-5的那些。除了1mM化合物1之外，反应添加剂包括1mM脲和2.75μg单链结合蛋白(Eco SSB)。延伸反应用0.85pmol模板、0.5pmol寡核苷酸引物和各1nmol XNTP(最终体积为10μL)进行。反应在由50mM TrisCl,pH 8.84、200mM NH4OAc和20％PEG8K组成的缓冲液(补充有5％NMS、量为3或4nmol的多磷酸盐PP-60.20和2mM MnCl2)中运行。1.2μg经纯化的重组DNA聚合酶蛋白用于每个延伸反应中，并将反应在23℃下运行1-2h。使用较长模板的代表性延伸反应的结果示于图8中。值得注意的是，在化合物1的存在下，聚合酶能够聚合XNTP以生成每个更长模板的完整Xpandomer拷贝，范围为长度为88个(泳道1和6)至277个(泳道5和10)核苷酸。泳道1-5和6-10代表相同的延伸反应，除了PP-60.20添加剂的量，其在泳道1-5中为3nmol，在泳道6-10中是4nmol。这些结果强调了化合物1在需要由DNA聚合酶进行非天然的高取代核苷酸类似物的聚合的反应中赋予的令人惊讶的优势，并且表明该化合物以及其他PEM能够大大扩展SBX测序方案的潜力。
实施例38
下一代PEM增强XNTP聚合以生成长Xpandomer产物
基于用PEM化合物1观察到的有利性质，设计了下一代PEM化合物，其目的是改善某些性质，包括但不限于分子的水溶解度。代表性的下一代PEM结构描述于实施例9-34和表7中。
使用来源于HIV1、2和3个基因组的三种100聚体模板，在引物延伸测定中测试化合物9–11的PEM活性。引物延伸反应包括以下试剂：75mM TrisCl,pH 8.44、175mM NH4OAc、20％PEG8K、5％NMS、0.8nmol PP-60.20、0.6mM MnCl2、2.3μg Tth单链结合蛋白(SSB)、0.5M或1M脲、各200pmol XNTP、1.1pmol模板、1pmol寡核苷酸引物、1.2μg经纯化的重组C4552DNA聚合酶及0.5mM PEM。使10μL引物延伸反应在23℃下运行30分钟，并通过凝胶电泳分析反应产物。显示引物延伸产物的代表性凝胶呈现于图9中。如泳道1(HIV1模板)、2(HIV2模板)和4(HIV3模板，无SSB和1M脲)所示，化合物1使得XNTP能够聚合为三个不同100聚体模板的全长Xpandomer拷贝(由箭头指示的100聚体的凝胶迁移位置)。同样，化合物9(泳道13-16)、10(泳道9-12)和11(泳道5-8)中的每种能够至少如化合物1一样有效地使得XNTP聚合在三种不同的100聚体模板的每一种上。这些结果表明PEM活性可通过增加化合物的各种物理化学性质(诸如水溶解度)来优化。
使用HIV2 100聚体模板，在引物延伸测定中测试化合物12的PEM活性。引物延伸反应包括以下试剂：50mM TrisCl、200mM NH4OAc、20％PEG8K、5％NMS、0.6nmol PP-60.20、0.6mM MnCl2、2.75μg/μl Eco单链结合蛋白(SSB)、1M脲、各50pmol XNTP、1.1pmol模板、1pmol寡核苷酸引物、1.2μg/μl经纯化的重组C4760 DNA聚合酶(SEQ ID NO:2)和0.5、1或1.5mM PEM。使10μL引物延伸反应在23℃下运行30分钟，并将反应产物通过凝胶电泳分析。显示了引物延伸产物的代表性凝胶呈现在图10中。如泳道5(0.5mM PEM)、6(1mM PEM)和7(1.5mM PEM)中所示，化合物12能够以与化合物10相当的方式(泳道1)使得XNTP聚合为100聚体模板的全长Xpandomer拷贝(由箭头指示100聚体的凝胶迁移位置)。泳道2-4显示了来自用缺乏稳健PEM活性的结构相关添加剂进行的反应的引物延伸产物。这些结果表明PEM活性可由非常特定的化学结构确定。
使用HIV2 100聚体模板，在引物延伸测定中测试化合物13和14的PEM活性。引物延伸反应包括以下试剂：50mM TrisCl、200mM NH4OAc、20％PEG8K、5％NMS、0.6nmol PP-60.20、0.6mM MnCl2、2.75μg/μl Eco单链结合蛋白(SSB)、1M脲、各50pmol XNTP、1.1pmol模板、1pmol寡核苷酸引物、1.2μg/μl经纯化的重组C4760 DNA聚合酶(DPO4的变体，参见SEQID NO:2)，及0.5、1、1.52或2.5mM PEM。使10μL引物延伸反应在23℃下运行30分钟，并将反应产物通过凝胶电泳分析。显示了引物延伸产物的代表性凝胶呈现在图11中(全长HIV2100聚体的位置由箭头指示)。如泳道5-7(各种浓度的化合物14)和8-10(各种浓度的化合物13)中所示，这些下一代PEM中的每一种使得XNTP能够以与化合物10相当的方式(泳道1-4)聚合为100聚体模板的全长Xpandomer拷贝。
使用411聚体扩增子模板在引物延伸测定中测试化合物15的PEM活性。引物延伸反应包括以下试剂：50mM TrisCl、200mM NH4OAc、20％PEG8K、5％NMS、3nmol PP-60.20、2mMMnCl2、2μg Kod单链结合蛋白(SSB)、1M脲、各250pmol XNTP、1pmol模板、1pmol寡核苷酸引物、1.2μg经纯化的重组C4760 DNA聚合酶(DPO4的变体，参见SEQ ID NO:2)及2(泳道2)或3(泳道3)mM PEM。使10μL引物延伸反应在37℃下运行20分钟，并将反应产物通过凝胶电泳分析。显示了引物延伸产物的代表性凝胶呈现在图12中(277聚体的位置由箭头指示)。如泳道2和3(化合物15，在两个不同的浓度下)所示，该下一代PEM能够以与化合物14相当的方式(泳道1)使得XNTP聚合为上述411聚体模板的冗长的Xpandomer拷贝。值得注意的是，聚合酶完全依赖于向反应中添加PEM，以便能够合成这些冗长的Xpandomer产物。通过优化各种反应参数，如各种添加剂的延伸时间和/或浓度，可以获得甚至更长的延伸产物。
使用来源于HIV2的100聚体模板，在引物延伸测定中测试化合物16、17和18及其组合的PEM活性。引物延伸反应包括以下试剂：50mM TrisCl、200mM NH4OAc、20％或25％PEG8K、5％NMS、0.6nmol PP-60.20、0.6mM MnCl2、2μg Kod单链结合蛋白(SSB)、1M脲、各50pmol XNTP、1pmol模板、1pmol寡核苷酸引物、1.2μg经纯化的重组C4760 DNA聚合酶(DPO4的变体，参见SEQ ID NO:2)，和0.5-2mM PEM。使10μL引物延伸反应在37℃下运行30分钟，并将反应产物通过凝胶电泳分析。显示了引物延伸产物的代表性凝胶呈现在图13中(100聚体产物的位置由箭头指示)。如泳道2(2mM化合物16)和3-6(0.5、1、2和3mM化合物17)中所示，这些下一代PEM能够以与化合物14相当的方式(泳道1)使得XNTP聚合为100聚体模板的冗长的Xpandomer拷贝。此外，2mM化合物14和0.1mM(泳道7)或0.3mM(泳道8和9)化合物17的组合也使得XNTP能够聚合为100聚体模板的冗长的Xpandomer拷贝，指示PEM的组合可允许使用更低剂量的每种单独的PEM。类似地，2mM化合物16和0.1mM(泳道10)或0.3mM(泳道11和12)化合物18的组合也看起来允许使用更低剂量的每种单独的PEM以使得XNTPS能够聚合为100聚体模板的全长拷贝。
使用411聚体扩增子模板，在引物延伸测定中测试化合物19的PEM活性。引物延伸反应包括以下试剂：50mM TrisCl、200mM NH4OAc、20％PEG8K、5％NMS、3nmol PP-60.20、2mMMnCl2、2μg Kod单链结合蛋白(SSB)、1M脲、各250pmol的XNTP、0.5pmol模板、0.5pmol寡核苷酸引物、1.2μg经纯化的重组C4760 DNA聚合酶(DPO4的变体，参见SEQ ID NO:2)和0.5(泳道2)、1(泳道3)或1.5mM(泳道4)PEM。使10μL引物延伸反应在37℃下运行30分钟，并将反应产物通过凝胶电泳分析。显示了引物延伸产物的代表性凝胶呈现在图14中(277聚体产物的位置由箭头指示)。如泳道2-4中所示，这种下一代PEM使得XNTP能够聚合为411聚体模板的冗长Xpandomer拷贝，尽管以不如化合物14(泳道1)有效的方式。这些结果表明，PEM活性可能是PEM结构和/或模板长度特异性的。
本文公开的所有参考文献，包括专利参考文献和非专利参考文献，在此通过引用整体并入，就好像每个参考文献都单独并入一样。
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在本文提供一定范围的值的情况下，应理解此范围的上限和下限之间的每个居间数值(至下限单位的十分之一，除非本文另外清楚地规定)以及所述范围内的任意其它所述或居间的数值都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，也包括在本发明内，受制于在规定范围中任何明确排除的限值。当所述范围包括上下限值之一或两者时，排除那些所包括的限值之一或两者的范围也包括在本发明中。
例如，本文提供的任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应被理解为包括列举的范围内的任何整数值，并且当适当时包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)，除非另外指出。此外，除非另外指出，否则本文所列举的涉及任何物理特征的任何数字范围诸如聚合物亚基、大小或厚度应被理解为包括列举的范围内的任何整数。如本文所用，除非另外指出，否则术语"约"意指指定范围、值或结构的±20％。
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此外，该专利的书面描述部分包括所有权利要求。此外，所有权利要求，包括所有原始权利要求和来自任何和所有优先权文件的所有权利要求，均特此以引用方式整体并入说明书的书面描述部分，并且申请人保留将任何和所有此类权利要求以物理方式并入本申请的书面描述或任何其他部分的权利。因此，例如，在任何情况下均不得将专利武断地解释为未针对权利要求提供书面描述，断言该权利要求的确切措辞未在专利的书面描述部分中以同样的词汇阐明。
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在本文中已经广泛地和概括地描述了本发明。落入一般公开内容内的每个较窄的种类和亚类分组也构成本发明的一部分。这包括对本发明的类属描述，但有条件或否定的限制，可以类属中去除任何主题，而不管是否在本文中专门叙述了删除的材料。
序列表
<110> Stratos Genomics, Inc.
Kendall Berg
Samantha Vellucci
Jessica Vellucci
<120> 通过芳香族化合物增强核酸聚合
<130> 870225.423WO
<140> PCT
<141> 2018-12-27
<150> US 62/717,549
<151> 2018-08-10
<150> US 62/656,696
<151> 2018-04-12
<150> US 62/614,120
<151> 2018-01-05
<160> 5
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 340
<212> PRT
<213> 硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)
<400> 1
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Glu Leu Asp Ile Ala Asp Val Gln Gly Ile Pro Tyr Phe Thr Ala Glu
180 185 190
Lys Leu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Lys Leu Val Asp Thr Leu Ser Ile
195 200 205
Glu Phe Asp Lys Leu Lys Gly Met Ile Gly Glu Ala Lys Ala Lys Tyr
210 215 220
Leu Ile Ser Leu Ala Arg Asp Glu Tyr Asn Glu Pro Ile Arg Thr Arg
225 230 235 240
Val Arg Lys Ser Ile Gly Arg Thr Val Thr Met Lys Arg Asn Ser Arg
245 250 255
Asn Leu Glu Glu Ile Lys Pro Tyr Leu Phe Arg Ala Ile Glu Glu Ser
260 265 270
Tyr Tyr Lys Leu Asp Lys Arg Ile Pro Lys Ala Ile His Val Val Ala
275 280 285
Trp Lys Ser Tyr Trp Asn Ser Gln Tyr Arg Trp Ser Trp Phe Pro His
290 295 300
Gly Ile Ser Lys Glu Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Val Gln Leu Leu Gln
305 310 315 320
Gln Ile Leu Lys Lys Asp Lys Arg Lys Ile Arg Arg Ile Gly Val Arg
325 330 335
Phe Ser Lys Phe
340

Claims (103)

1.增强核酸聚合酶反应的方法，所述方法包括：
a.形成核酸聚合酶反应组合物，其包含：
i.模板核酸，
ii.核酸聚合酶，
iii.核苷酸或核苷酸类似物的混合物，和
iv.至少一种式(I)的化合物；以及
b.在允许核酸聚合反应的条件下孵育所述核酸聚合酶反应组合物，其中所述至少一种式(I)的化合物增加所述核酸聚合酶反应的持续性、速率或保真度；
其中所述式(I)的化合物由下式或其溶剂化物、水合物、互变异构体、螯合物或盐表示，，
Figure FDA0002648854960000011
其中，在每次出现时独立地：
m是1、2或3；
n是0、1或2；
p是0、1或2；
Ar1是任选取代的芳基；
Ar2选自5-和6-元单环芳族环以及包含两个稠合在一起的5-和/或6-元单环的9-和10-元稠合双环，其中所述两个单环中的至少一个是芳族环，其中
Ar2被选自以下的一个或多个取代基任选取代：卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、E-CO2R0、E-CONH2、E-CHO、E-C(O)NH(OH)、E-N(R0)2和E-OR0，其中
E选自直连键和C1-C6亚烷基；以及
R0选自H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基，
M选自氢、卤素和C1-C4烷基；以及
L是连接基团。
2.如权利要求1所述的方法，其中Ar1是单环碳环芳基。
3.如权利要求1所述的方法，其中Ar1是单环杂环芳基。
4.如权利要求1所述的方法，其中Ar1是双环芳基。
5.如权利要求1所述的方法，其中Ar1是三环芳基。
6.如权利要求1所述的方法，其中Ar1是未取代的芳基。
7.如权利要求1所述的方法，其中Ar1是取代的芳基。
8.如权利要求1所述的方法，其中Ar2是选自由以下组成的组的5-元单环芳族环：噻吩、1,2-噻唑、1,3-噻唑、呋喃、1,2-噁唑、1,3-噁唑、1H-吡咯、1H-吡唑、噁二唑、噻二唑、1,2,4-三唑、1,2,3-三唑和1H-咪唑。
9.如权利要求1所述的方法，其中Ar2是选自由以下组成的组的6-元单环芳族环：苯、吡啶、哒嗪、嘧啶和吡嗪。
10.如权利要求1所述的方法，其中Ar2是选自由以下组成的组的9-元稠合双环芳族环体系：苯并呋喃、1,3-苯并噁唑、呋喃并[3,2-b]吡啶、呋喃并[3,2-c]吡啶、呋喃并[2,3-c]吡啶、呋喃并[2,3-b]吡啶、吲哚、1H-苯并咪唑、1H-吡咯并[3,2-b]吡啶、1H-吡咯并[3,2-c]吡啶、1H-吡咯并[2,3-c]吡啶、1H-吡咯并[2,3-b]吡啶、苯并噻吩、1,3-苯并噻唑、噻吩并[3,2-b]吡啶、噻吩并[3,2-c]吡啶、噻吩并[2,3-c]吡啶、苯并噁二唑、苯并噻二唑、苯并异噁唑、苯并三唑和噻吩并[2,3-b]吡啶。
11.如权利要求1所述的方法，其中Ar2是选自由以下组成的组的10-元稠合双环芳族环体系：亚萘基、喹啉、喹唑啉、喹喔啉、1,5-萘啶、1,6-萘啶、1,7-萘啶、1,8-萘啶、异喹啉、酞嗪、2,6-萘啶和2,7-萘啶。
12.如权利要求1所述的方法，其中Ar2上的取代包括羧酸。
13.如权利要求1所述的方法，其中Ar2上的取代包括三氟甲基。
14.如权利要求1所述的方法，其中Ar2上的取代包括羟基。
15.如权利要求1所述的方法，其中Ar2上的取代包括羟基、羧酸和三氟甲基中的至少两种。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述至少一种式(I)的化合物由选自以下的式描述：
Figure FDA0002648854960000031
17.如权利要求1所述的方法，其中所述式(I)的化合物呈螯合物的形式。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述螯合物是铜螯合物。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述式(I)的化合物的logP为至少4.9。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述式(I)的化合物选自：
4,4'-(吡啶-2,6-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(吡啶-3,5-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(1,3-亚苯基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((9H-咔唑-3,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((9H-咔唑-3,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))二苯胺；
4,4'-((9H-咔唑-3,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))二苯甲酸；
3,6-双(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-9H-咔唑；
4,4'-((4-甲氧基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-羧基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-硝基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
5,5'-((4-氰基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-甲基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
5,5'-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(甲氧基羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(甲基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-氨甲酰基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(吡嗪-2,6-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(1,4-亚苯基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(1,3-亚苯基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))二苯胺；
4,4'-(1,3-亚苯基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))二苯甲酸；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酸；
4,4'-(吡啶-2,6-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))二苯胺；
4,4'-(吡啶-2,6-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))二苯甲酸；
2,6-双(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶；
4-(4-(3-(1-(4-羧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-羟苯甲酸；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酸；
4,4'-((3,5-二甲基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4l3-吡啶-2,6-二基)双(5-碘-1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-乙酰氨基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((9-乙酰基-9H-咔唑-3,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(吡啶-2,6-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(N,2-二羟基苯甲酰胺)；
4,4'-(吡啶-2,6-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟基苯甲酰胺)；
4,4'-((4-羧基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((1,10-菲咯啉-2,9-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(三氟甲基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((3-氰基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((3-硝基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
3,3'-((4-氰基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(叔丁氧基羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4-(4-(4-氰基吡啶-2-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-羟苯甲酸；
5-(4-(6-(4-(3-羧基-4-羟基-5-甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-羟基-3-甲基苯甲酸；
4,4'-((4-(二甲基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(环丙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(丁-3-炔-1-基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(丁基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(二乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(叔丁基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(吗啉-4-羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(丙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(苯基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-((2-乙酰氨基乙基)氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(4-环丙基哌嗪-1-羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(氨基亚氨基甲基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(哌啶-1-羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(环丁基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((1,10-菲咯啉-3,8-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(环戊基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(二丙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(二-仲丁基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(萘-2,7-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(萘-2,3-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(二丁基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-((2-羟乙基)氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(环己基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(苄基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酸；
4,4',4”,4”'-((((丁烷-1,4-二基双(氮烷二基))双(羰基))双(吡啶-4,2,6-三基))四(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))四(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(3,5,6-三氯吡啶甲酸)；
4,4'-((4-(乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
7,7'-((4-(乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟基-1,8-萘啶-4-甲酸)；
5,5'-((4-(乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4,4'-((4-(乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-氟苯甲酸)；
5,5'-((4-(乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(3-氟苯甲酸)；和
2-(1-(1H-苯并[d]咪唑-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-6-(1-(1H-苯并[d]咪唑-7-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-N-乙基异烟酰胺。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中与缺乏所述式(I)的化合物的核酸聚合酶反应相比，所述式(I)的化合物增加了所得核酸产物的长度。
22.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述至少一种式(I)的化合物包括多种式(I)的化合物。
23.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述核酸聚合酶是DNA聚合酶。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述DNA聚合酶是DPO4或其变体。
25.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述核苷酸或核苷酸类似物的混合物是包含核苷氨基三磷酸酯的核苷酸类似物的混合物，其中所述核苷氨基三磷酸酯中的每一种包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合系链部分，其中所述聚合系链部分的第一端连接至所述核碱基并且所述聚合系链部分的第二端连接至所述核苷氨基三磷酸酯的α磷酸酯以通过切割氨基磷酸酯键来提供所述核苷酸类似物的扩增。
26.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述核酸聚合反应产生核苷酸类似物的可扩增聚合物，其中所述可扩增聚合物编码所述模板核酸的核碱基序列信息。
27.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中允许核酸聚合反应的条件包括适合的聚合缓冲液和寡核苷酸引物。
28.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述适合的缓冲液包含以下中的至少一种：Tris OAc、NH4OAc、PEG、水混溶性有机溶剂、多磷酸盐60、NMS和MnCl2。
29.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述反应混合物还包含单链结合蛋白。
30.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述反应混合物还包含脲。
31.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述核苷酸或核苷酸类似物的混合物包含含有可检测标记的核苷酸类似物。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述可检测标记是选自由以下组成的组的光学可检测标记：发光标记、化学发光标记、荧光标记、发荧光标记、发色团标记或显色标记。
33.对DNA模板进行测序的方法，所述方法包括以下步骤：
a.形成DNA聚合酶反应组合物，其包含：
i.DNA模板，
ii.与所述模板复合的复制引物，
iii.DNA聚合酶，
iv.核苷酸或核苷酸类似物的混合物，
v.至少一种式(I)的化合物，
b.在允许DNA聚合反应的条件下孵育所述DNA聚合酶反应组合物，其中所述至少一种式(I)的化合物增加所述DNA聚合酶反应的速率、保真度或持续性；和
c.测定所得的核甘酸或核甘酸类似物的聚合物中的所述核苷酸或核苷酸类似物的序列；
其中所述式(I)的化合物是：
Figure FDA0002648854960000101
或其溶剂化物、水合物、互变异构体、螯合物或盐，
其中，在每次出现时独立地：
m是1、2或3；
n是0、1或2；
p是0、1或2；
Ar1是任选取代的芳基；
Ar2选自5-和6-元单环芳族环以及包含两个稠合在一起的5-和/或6-元单环的9-和10-元稠合双环，其中所述两个单环中的至少一个是芳族环，其中
Ar2被选自以下的一个或多个取代基任选地取代：卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、E-CO2R0、E-CONH2、E-CHO、E-C(O)NH(OH)、E-N(R0)2和E-OR0，其中
E选自直连键和C1-C6亚烷基；以及
R0选自H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基，
M选自氢、卤素和C1-C4烷基；以及
L是连接基团。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述核苷酸类似物的混合物包含核苷氨基三磷酸酯，其中所述核苷氨基三磷酸酯中的每一种包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合系链部分，其中所述聚合系链部分的第一端连接至所述核碱基并且所述聚合系链部分的第二端连接至所述核苷氨基三磷酸酯的α磷酸酯以通过切割氨基磷酸酯键来提供所述核苷酸类似物的扩增。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述DNA聚合酶是DPO4或其变体。
36.如权利要求35所述的方法，其中所得的核苷酸类似物的聚合物是可扩增聚合物。
37.如权利要求36所述的方法，其还包括使所述可扩增聚合物与氨基磷酸酯切割剂接触以产生核苷酸类似物的扩增聚合物的步骤。
38.如权利要求34所述的方法，其中所述核苷酸类似物中的每一种的聚合系链部分包含所述类似物的核碱基所特有的报告子部分。
39.如权利要求34所述的方法，其中所述报告子部分产生特征性电子信号。
40.如权利要求34所述的方法，其中测定所述核苷酸类似物序列的所述步骤包括使所述核苷酸类似物的扩增聚合物通过纳米孔移位的步骤。
41.式(I)的化合物或其溶剂化物、水合物、互变异构体、螯合物或盐，
Figure FDA0002648854960000111
其中，在每次出现时独立地：
m是1、2或3；
n是0、1或2；
p是0、1或2；
Ar1是任选取代的芳基；
Ar2选自5-和6-元单环芳族环以及包含两个稠合在一起的5-和/或6-元单环的9-和10-元稠合双环，其中所述两个单环中的至少一个是芳族环，其中
Ar2被选自以下的一个或多个取代基任选取代：卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、E-CO2R0、E-CONH2、E-CHO、E-C(O)NH(OH)、E-N(R0)2和E-OR0，其中
E选自直连键和C1-C6亚烷基；以及
R0选自H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基，
M选自氢、卤素和C1-C4烷基；以及
L是连接基团。
42.如权利要求41所述的化合物，其中n是0并且m是2，其具有下式：
Figure FDA0002648854960000121
43.如权利要求41所述的化合物，其中Ar1是单环碳环芳基。
44.如权利要求43所述的化合物，其中Ar1选自：
Figure FDA0002648854960000122
其中三唑环位于Ar1上的位置k处。
45.如权利要求41所述的化合物，其中Ar1是单环杂环芳基。
46.如权利要求45所述的化合物，其中Ar1选自：
Figure FDA0002648854960000123
其中三唑环位于Ar1上的位置k处。
47.如权利要求41所述的化合物，其中Ar1是双环芳基。
48.如权利要求47所述的化合物，其中Ar1是选自以下的双环碳环芳基：
Figure FDA0002648854960000124
其中三唑环位于Ar1上的位置k处。
49.如权利要求47所述的化合物，其中Ar1是选自以下的双环杂环芳基：
Figure FDA0002648854960000131
其中三唑环位于位于Ar1上的位置k处。
50.如权利要求41所述的化合物，其中Ar1是三环芳基。
51.如权利要求50所述的化合物，其中Ar1是选自以下的三环碳环芳基：
Figure FDA0002648854960000132
52.如权利要求50所述的化合物，其中Ar1是选自以下的三环杂芳基：
Figure FDA0002648854960000133
其中三唑环位于Ar1上的位置k处。
53.如权利要求50所述的化合物，其中Ar1是选自以下的三环杂芳基：
Figure FDA0002648854960000134
Figure FDA0002648854960000141
其中所述三唑环位于Ar1上的位置k处。
54.如权利要求41所述的化合物，其中Ar1是未取代的芳基。
55.如权利要求41所述的化合物，其中Ar1是取代的芳基。
56.如权利要求55所述的化合物，其中Ar1上的至少一个取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、硫醇、硝基和腈。
57.如权利要求55所述的化合物，其中Ar1上的至少一个取代基选自由以下组成的组：--SOR1、--S(O)2R1、--S(O)2NR2R3、--OR1、--OC(O)R3、--C(O)OR3、--C(O)R1、--C(O)NR2R3、--NR2R3、--N(R3)C(O)R1和--NS(O)2R3；和其中
每次出现的R1独立地选自由以下组成的组：取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基、和取代或未取代的杂芳基；以及
每次出现的R2和R3独立地选自由以下组成的组：--H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基、和取代或未取代的杂芳基。
58.如权利要求55所述的化合物，其中Ar1上的至少一个取代基选自由以下组成的组：取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的卤代烷基、以及取代或未取代的卤代烷氧基。
59.如权利要求55所述的化合物，其中Ar1上的至少一个取代基选自–R4-H，其中R4是一个或多个杂原子中断的亚烷基，其中所述杂原子是X、S、NH或其组合。
60.如权利要求55所述的化合物，其中Ar1上的至少一个取代基选自由以下组成的组：-O-(C1-6烷基)、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、-CO2-C1-6烷基、-CONH-C1-6烷基、-CONH2、CN；和-NO2。
61.如权利要求41所述的化合物，其中Ar2是选自由以下组成的组的5-元单环芳族环：噻吩、1,2-噻唑、1,3-噻唑、呋喃、1,2-噁唑、1,3-噁唑、1H-吡咯、1H-吡唑、噁二唑、噻二唑、1,2,4-三唑、1,2,3-三唑和1H-咪唑。
62.如权利要求41所述的化合物，其中Ar2是选自由以下组成的组的6-元单环芳族环：苯、吡啶、哒嗪、嘧啶和吡嗪。
63.如权利要求41所述的化合物，其中Ar2是选自由以下组成的组的9-元稠合双环芳族环体系：苯并呋喃、1,3-苯并噁唑、呋喃并[3,2-b]吡啶、呋喃并[3,2-c]吡啶、呋喃并[2,3-c]吡啶、呋喃并[2,3-b]吡啶、吲哚、1H-苯并咪唑、1H-吡咯并[3,2-b]吡啶、1H-吡咯并[3,2-c]吡啶、1H-吡咯并[2,3-c]吡啶、1H-吡咯并[2,3-b]吡啶、苯并噻吩、1,3-苯并噻唑、噻吩并[3,2-b]吡啶、噻吩并[3,2-c]吡啶、噻吩并[2,3-c]吡啶、苯并噁二唑、苯并噻二唑、苯并异噁唑、苯并三唑和噻吩并[2,3-b]吡啶。
64.如权利要求41所述的化合物，其中Ar2是选自由以下组成的10-元稠合双环芳族环体系：亚萘基、喹啉、喹唑啉、喹喔啉、1,5-萘啶、1,6-萘啶、1,7-萘啶、1,8-萘啶、异喹啉、酞嗪、2,6-萘啶和2,7-萘啶。
65.如权利要求41所述的化合物，其中Ar2是选自以下的吡啶基环：
Figure FDA0002648854960000151
其中所述取代基G在所述吡啶基环上存在0、1或2次。
66.如权利要求41所述的化合物，其中Ar2是下式的苯基环
Figure FDA0002648854960000152
其中所述取代基G在所述苯基环上存在0、1或2次。
67.如权利要求41所述的化合物，其中Ar2是选自以下的苯基环：
Figure FDA0002648854960000161
68.如权利要求41所述的化合物，其中所述Ar2上的取代包括氨基。
69.如权利要求41所述的化合物，其中所述Ar2上的取代包括甲氧基。
70.如权利要求41所述的化合物，其中所述Ar2上的取代包括羧酸。
71.如权利要求41所述的化合物，其中所述Ar2上的取代包括–CH2-CO2-CH3。
72.如权利要求41所述的化合物，其中Ar2上的取代包括三氟甲基。
73.如权利要求41所述的化合物，其中Ar2上的取代包括羟基。
74.如权利要求41所述的化合物，其中Ar2上的取代是一个羧酸和一个羟基。
75.如权利要求41所述的化合物，其中Ar2上的取代是一个羧酸和一个三氟甲基。
76.如权利要求41所述的化合物，其呈螯合物的形式。
77.如权利要求76所述的化合物，其中所述螯合物是铜螯合物。
78.如权利要求41所述的化合物，其logP为至少4.9。
79.如权利要求41所述的化合物，其在Ar2上具有包括羟基、羧酸和三氟甲基中的至少两种的取代。
80.如权利要求79所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002648854960000162
81.如权利要求79所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002648854960000171
82.如权利要求79所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002648854960000172
83.如权利要求79所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002648854960000173
84.如权利要求79所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002648854960000174
85.如权利要求41所述的化合物，其选自：
4,4'-(吡啶-2,6-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(吡啶-3,5-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(1,3-亚苯基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((9H-咔唑-3,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((9H-咔唑-3,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))二苯胺；
4,4'-((9H-咔唑-3,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))二苯甲酸；
3,6-双(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-9H-咔唑；
4,4'-((4-甲氧基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-羧基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-硝基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
5,5'-((4-氰基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-甲基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
5,5'-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(甲氧基羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(甲基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-氨甲酰基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(吡嗪-2,6-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(1,4-亚苯基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(1,3-亚苯基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))二苯胺；
4,4'-(1,3-亚苯基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))二苯甲酸；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酸；
4,4'-(吡啶-2,6-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))二苯胺；
4,4'-(吡啶-2,6-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))二苯甲酸；
2,6-双(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶；
4-(4-(3-(1-(4-羧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-羟苯甲酸；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酸；
4,4'-((3,5-二甲基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4l3-吡啶-2,6-二基)双(5-碘-1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-乙酰氨基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((9-乙酰基-9H-咔唑-3,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(吡啶-2,6-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(N,2-二羟基苯甲酰胺)；
4,4'-(吡啶-2,6-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟基苯甲酰胺)；
4,4'-((4-羧基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((1,10-菲咯啉-2,9-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(三氟甲基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((3-氰基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((3-硝基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
3,3'-((4-氰基吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(叔丁氧基羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4-(4-(4-氰基吡啶-2-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-羟苯甲酸；
5-(4-(6-(4-(3-羧基-4-羟基-5-甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-羟基-3-甲基苯甲酸；
4,4'-((4-(二甲基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(环丙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(丁-3-炔-1-基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(丁基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(二乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(叔丁基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(吗啉-4-羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(丙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(苯基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-((2-乙酰氨基乙基)氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(4-环丙基哌嗪-1-羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(氨基亚氨基甲基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(哌啶-1-羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(环丁基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((1,10-菲咯啉-3,8-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(环戊基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(二丙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(二-仲丁基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(萘-2,7-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-(萘-2,3-二基双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(二丁基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-((2-羟乙基)氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(环己基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(苄基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟苯甲酸)；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酸；
4,4',4”,4”'-((((丁烷-1,4-二基双(氮烷二基))双(羰基))双(吡啶-4,2,6-三基))四(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))四(2-羟苯甲酸)；
4,4'-((4-(乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(3,5,6-三氯吡啶甲酸)；
4,4'-((4-(乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
7,7'-((4-(乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-羟基-1,8-萘啶-4-甲酸)；
5,5'-((4-(乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4,4'-((4-(乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(2-氟苯甲酸)；
5,5'-((4-(乙基氨甲酰基)吡啶-2,6-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(3-氟苯甲酸)；和
2-(1-(1H-苯并[d]咪唑-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-6-(1-(1H-苯并[d]咪唑-7-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-N-乙基异烟酰胺。
86.组合物，其包含如权利要求41-85中任一项所述的化合物和分子拥挤剂。
87.如权利要求86所述的组合物，其中所述分子拥挤剂是聚亚烷基二醇。
88.组合物，其包含如权利要求41-85中任一项所述的化合物和水性缓冲液。
89.如权利要求88所述的组合物，其中所述水性缓冲液是Tris HCl。
90.组合物，其包含如权利要求41-85中任一项所述的化合物和多核苷酸。
91.如权利要求90所述的组合物，其中所述多核苷酸是20-60聚体寡核苷酸。
92.组合物，其包含如权利要求41-85中任一项所述的化合物和蛋白。
93.如权利要求92所述的组合物，其中所述蛋白是DNA聚合酶。
94.组合物，其包含如权利要求41-85中任一项所述的化合物以及核苷酸或核苷酸类似物的混合物。
95.用于增强DNA聚合酶反应的持续性、保真度或速率的组合物，其包含至少一种如权利要求41-85中任一项所述的化合物以及核苷酸类似物的混合物。
96.包含至少一种如权利要求41-85中任一项所述的化合物以及核苷酸类似物的混合物的组合物，其中所述至少一种如权利要求41-85中任一项所述的化合物相对于缺少所述至少一种如权利要求41-85中任一项所述的化合物的相同聚合反应增加在模板-依赖性聚合反应期间掺入子链的核苷酸类似物的数目和精确度。
97.如权利要求96所述的组合物，其中所述核苷酸类似物的混合物包含核苷氨基三磷酸酯，其中所述核苷氨基三磷酸酯中的每一种包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合系链部分，其中所述聚合系链部分的第一端连接至所述核碱基并且所述聚合系链部分的第二端连接至所述核苷氨基三磷酸酯的α磷酸酯以通过切割氨基磷酸酯键来提供所述核苷酸类似物的扩增。
98.如权利要求96所述的组合物，其还包含选自以下中的至少一种的缓冲液组分：TrisOAc、NH4OAc、PEG、水混溶性有机溶剂、多磷酸盐60、NMS和MnCl2。
99.如权利要求96所述的组合物，其还包含单链结合蛋白。
100.如权利要求96所述的组合物，其还包含脲。
101.如权利要求96所述的组合物，其中所述核苷酸类似物的混合物包含含可检测标记的核苷酸类似物。
102.如权利要求101所述的组合物，其中所述可检测标记是选自由以下组成的组的光学可检测标记：发光标记、化学发光标记、荧光标记、发荧光标记、发色团标记或显色标记。
103.用于对核酸模板进行测序的试剂盒，其包括至少一种如权利要求86-102中任一项所述的组合物。
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