CN114144520A - 通过芳香族化合物增强核酸聚合 - Google Patents

通过芳香族化合物增强核酸聚合 Download PDF

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CN114144520A
CN114144520A CN202080053441.1A CN202080053441A CN114144520A CN 114144520 A CN114144520 A CN 114144520A CN 202080053441 A CN202080053441 A CN 202080053441A CN 114144520 A CN114144520 A CN 114144520A
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M·S·科科里斯
J·塔博恩
M·纳巴维
A·雅各布斯
D·奥康奈尔
D·古德曼
L·梅里尔
J·钱德拉塞克尔
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F Hoffmann La Roche AG
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明涉及化合物、方法和组合物，用于改进核酸聚合，包括通过体外引物延伸的DNA复制以产生例如用于DNA模板的基于纳米孔的单分子测序的聚合物。核酸聚合酶反应组合物具有聚合增强部分，其允许增强DNA聚合酶与核苷酸类似物的活性，使得用于测序应用的引物延伸产物的长度增加。

Description

通过芳香族化合物增强核酸聚合
技术领域
本发明总体上涉及新的化学实体，更具体地涉及任选地具有无机组分的新的有机分子(包括其组合物)及其制造和利用方法(特别是在影响酶性能方面)。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并在此通过引用并入说明书。包含序列表的文本文件的名称是870225_425WO_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为15KB，创建于2020年6月19日，正在通过EFS-Web以电子方式提交。
背景技术
生物分子的测量是现代医学的基础，广泛用于医学研究，更具体地用于诊断和治疗，以及药物开发。核酸编码生命体活动和繁殖所必需的信息，本质上是生命的蓝图。确定此类蓝图在纯研究和应用科学中都有用。在医学中，测序可用于诊断和研发用于各种病症的治疗方法，包括癌症、心脏病、自身免疫性疾病、多发性硬化症和肥胖症。在工业中，测序可用于设计改进的酶促过程或合成生物。例如，在生物学中，该工具可用于研究生态系统的健康，因此具有广泛的用途。类似地，蛋白质和其他生物分子的测量提供了标志物和对疾病和病原传播的了解。
个体独特的DNA序列提供了有关他们对某些疾病的易感性的宝贵信息。它还为患者提供了筛查以早期发现和/或接受预防性治疗的机会。此外，根据患者的个人蓝图，临床医生将能够施用个性化疗法，以最大限度地提高药物疗效和/或最大限度地降低药物不良反应的风险。类似地，确定病原生物的蓝图可以为传染病提供新的治疗和更稳健的病原体监测。低成本的全基因组DNA测序将为现代医学奠定基础。为了实现该目标，测序技术必须在通量、准确性和读段长度方面不断进步。
在过去的十年中，大量的下一代DNA测序技术已经可商购，已大大降低了全基因组测序的成本。这些包括边合成边测序(″SBS″)平台(Illumina，Inc.，454 Life Sciences，Ion Torrent，Pacific Biosciences)和基于类似连接的平台(Complete Genomics，LifeTechnologies Corporation)。许多其他技术正在开发中，这些技术利用了各种各样的样品处理和检测方法。例如，GnuBio公司(Cambridge，Mass.)使用皮升反应容器来控制数百万个谨慎的探针测序反应，而Halcyon Molecular(Redwood City，Calif.)正在尝试开发使用透射电子显微镜进行直接DNA测量的技术。
基于纳米孔的核酸测序是一种已被广泛研究的引人注目的方法。Kasianowicz等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：13770-13773，1996)在单链多核苷酸电易位通过嵌入脂双层中的α溶血素纳米孔时，表征了单链多核苷酸。已经证明，在多核苷酸易位期间，可以测量纳米孔孔口的部分堵塞作为离子电流降低的量度。然而，纳米孔中的多核苷酸测序因必须解析紧密间隔的碱基(0.34nm)而承受沉浸在显著背景噪音中的小信号差异。由于观察到多核苷酸的快速易位速率，通常大约为每微秒1个碱基，因此纳米孔中单碱基分辨率的测量挑战变得更加苛刻。可以通过调整运行参数(例如电压、盐成分、pH、温度和粘度等)来降低易位速度。然而，这种调整无法将易位速度降低到允许单碱基分辨率的水平。
Stratos Genomics开发了一种称为扩展测序(“SBX”)的方法，该方法使用生化过程将DNA序列转录到称为“Xpandomer”的可测量聚合物上(Kokoris等人，美国专利号7,939,259″High Throughput Nucleic Acid Sequencing by Expansion″)。转录的序列沿Xpandomer主链在高信噪比报告子中编码，所述报告子相隔约10nm，专为高信噪比、分化良好的反应而设计。这些差异在Xpandomer相对于天然DNA的序列读取效率和准确性方面提供了显著的性能增强。Xpandomer可以实现多种下一代DNA测序检测技术，并且非常适合纳米孔测序。
Xpandomer由称为XNTP的非天然核苷酸类似物产生，其特征在于长的取代基使Xpandomer主链能够在合成后扩展(参见Kokoris等人的已公布的PCT申请号WO2016/081871，通过引用以其整体并入本文)。由于它们的非典型结构，XNTP以及其他核苷酸类似物(例如，用可检测标记物部分修饰的核苷酸类似物)作为当前可用的DNA聚合酶的底物引入了新的挑战。已公开的Kokoris等人的PCT申请号WO2017/087281和WO2018/204717(通过引用以其整体并入本文)描述了利用非天然、大核苷酸类似物作为底物的工程化的具有增强的引物延伸活性的DP04聚合酶变体。
在DNA模板本身内，已知某些核苷酸序列基序对DNA聚合酶提出了额外的复制挑战。特别重要的是均聚物或短重复DNA序列的运行，这会引发滑链错配或“复制滑移”。复制滑移被认为涵盖以下步骤：(i)通过复制机制拷贝第一重复序列，(ii)复制暂停及聚合酶从新合成的末端解离，(iii)新合成链的解除配对及其与第二重复序列的配对，以及(iv)DNA合成的重新开始。因此，重复区域内复制机制的停滞会导致引物和模板的错位。在体内，复制过程中两条DNA链的错位会导致DNA重排，例如不同长度的缺失或重复。在体外，复制滑移会导致滑移事件部位的复制错误。这种聚合酶持续合成能力或准确性的降低显著损害了特定应用或所需的遗传操纵。
因此，在包括一种或多种具有非典型结构的试剂的条件下增强聚合酶反应的新的方法和组合物是必要的(例如，在扩展测序(SBX)和生物技术和生物医学中的其他应用(例如DNA扩增、常规测序、标记、检测、克隆等)中)，并且会在本领域中体现出价值。本发明满足这些需要并提供进一步的相关优点。
背景部分中讨论的所有主题都不一定是现有技术，不应仅仅因为其在背景部分中的讨论而被假定为现有技术。沿着这些思路，除非明确说明是现有技术，否则对背景部分中讨论的或与此类主题相关的现有技术中的问题的任何认识不应被视为现有技术。相反，背景部分中对任何主题的讨论都应被视为发明人解决特定问题的方法的一部分，其本身也可能具有创造性。
发明内容
简而言之，本公开提供了增强核酸聚合酶活性的化合物、组合物及其用途。在某些实施例中，聚合酶活性在聚合反应中在向聚合酶引入一种或多种挑战的条件(例如，包括损害聚合酶持续合成能力的非天然核苷酸类似物底物或模板基序的条件)下增强。这种增强是通过用一种或多种本公开的化合物补充聚合反应来实现的，其在本文中可以任选地称为聚合酶增强分子或PEM。
在一方面，PEM是式(I)化合物
Figure BDA0003485831380000041
或其溶剂化物、水合物、互变异构体、螯合物或盐，其中：
m为1、2或3；
m′为1、2或3；
n为0、1或2；
p为0、1或2；
当X为C时W为N，或者当X为N时W为C；
Figure BDA0003485831380000042
为单键或双键，其中所述双键开始于W或X中为碳的任一者处；
L为连接基团；
M在每次出现时独立地选自氢、卤素和C1-C4烷基；
Ar1在每次出现时独立地选自任选地经取代的吡啶、吡嗪、哒嗪、呋喃、噻吩、萘、芴、菲、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、萘啶、菲咯啉、嘌呤和咔唑，其中：Ar1的取代基在每次出现时独立地选自卤素、-OH、-CN、-NO2、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6环烷基、-OR0、-CONH2、-C(O)NR1R1′、-NR1R1′、-NR1C(O)R3、-C(O)SR3、-COR3、-OC(O)R3、-C(O)OR3、硫醇、-R4-H、-SOR1、-S(O)2R1、-S(O)2NR1R1′和-NS(O)2R3；
R0在每次出现时独立地选自C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂芳基；
R1和R1′在每次出现时独立地选自H、羟基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳基烷基和经取代或未经取代的杂芳基、-C(＝NH)NH2、-CH2CO2R0、-CH2C(O)NHCH2CO2H、-CH2CH2OH、-CH2CH2NHC(O)R3、-CH2C(O)NHCH2CO2H、
Figure BDA0003485831380000051
并且
其中R1和R1′可以一起形成杂环，包括但不限于氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、
Figure BDA0003485831380000052
R2在每次出现时独立地选自C2-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、和经取代或未经取代的卤代烷氧基；
R3在每次出现时独立地选自H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的卤代烷氧基、以及胍；
R4在每次出现时独立地选自被一个或多个杂原子间断的亚烷基，其中所述杂原子为O、S、NH或其组合；
Y在每次出现时独立地选自Ar2、-(CH2)3PO(OEt)2或-CH2CO2Me；
Ar2在每次出现时独立地选自经取代的5元和6元单环芳香环和包含两个在一起的单环的9元和10元稠合双环，其中两个单环中至少一个为芳香环，其中：Ar2被G1、G2、G3、G4和G5取代，其中：当Ar2是经单取代的时，G1在每次出现时独立地选自氧代、-NH2、-COR3、-E-CO2H、-C(O)NR1R1′、-E-PO(OR1)2和被G2、G3、G4和G5取代的芳基；G2、G3、G4和G5在每次出现时独立地选自不存在或选自包含以下的基团：卤素、-CN、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-E-CO2H、-E-CHO、-E-C(O)R3、-E-C(O)NH(OH)、-E-C(O)NHR1、-E-CONR1R1′、-E-NR1R1′和-E-OR2，其中E在每次出现时独立地选自直接键和C1-C6亚烷基。
在一方面，本公开提供了增强核酸聚合酶反应的方法，所述方法包括形成核酸聚合酶反应组合物的步骤，所述核酸聚合酶反应组合物包括模板核酸、核酸聚合酶、核苷酸和/或核苷酸类似物的混合物、至少一种PEM；并且在允许核酸聚合反应的条件下孵育核酸聚合酶反应组合物。PEM增加了核酸聚合酶反应的持续合成能力、速率和/或保真度。在一个实施例中，与缺乏PEM的核酸聚合酶反应相比，所述至少一种PEM增加了所得核酸产物的长度。
在另外的实施例中，所述核酸聚合酶是DNA聚合酶。在某些实施例中，所述DNA聚合酶是DPO4或其变体。在其他实施例中，所述核苷酸或核苷酸类似物的混合物是包含核苷三磷酸氨基酯的核苷酸类似物的混合物，其中每个核苷三磷酸氨基酯包括选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合物系链部分，其中聚合物系链部分的第一末端连接到核碱基，聚合物系链部分的第二末端连接到核苷三磷酸氨基酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割提供核苷酸类似物的扩展。在一些实施例中，所述核酸聚合反应产生核苷酸类似物的可扩展聚合物，其中所述可扩展聚合物编码模板核酸的核碱基序列信息。在其他实施例中，所述允许核酸聚合反应的条件包括合适的聚合缓冲剂和寡核苷酸引物。在进一步的实施例中，所述合适的缓冲剂包括以下中的一种或多种，例如以下中的每一种：TrisOAc、NH4OAc、PEG、水混溶性有机溶剂(例如DMF、NMP和丙酮)、多磷酸盐60和MnCl2。在其他实施例中，所述反应混合物进一步包括核酸插入剂。在其他实施例中，所述反应混合物进一步包括多阴离子识别部分。在进一步的实施例中，所述核苷酸或核苷酸类似物的混合物包括含有可检测标记物的核苷酸类似物。在又其他实施例中，所述可检测标记物是选自由发光、化学发光、发荧光、荧光、发色或生色标记物组成的组的光学可检测标记物。
在另一方面，本公开提供了包括至少一种PEM和核苷酸类似物的混合物的组合物。这种组合物是有用的，例如，当与聚合酶组合时，其中相对于不存在至少PEM的相同聚合反应，至少一种PEM增加了在模板依赖性聚合反应期间掺入子链的核苷酸类似物的数量和准确性。在其他实施例中，所述至少一种PEM包括多种PEM。
任选地，所述核苷酸类似物的混合物包含核苷三磷酸氨基酯，其中每个核苷三磷酸氨基酯包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合物系链部分，其中聚合物系链部分的第一末端连接到核碱基，聚合物系链部分的第二末端连接到核苷三磷酸氨基酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割提供核苷酸类似物的扩展。在其他实施例中，所述组合物进一步包括以下中的至少一种，例如以下中的两种、三种、四种等或每一种缓冲剂：Tris OAc、NH4OAc、PEG、水混溶性有机溶剂(例如DMF和NMP)、多磷酸盐60、N-甲基琥珀酰亚胺(NMS)和MnCl2。在其他实施例中，所述组合物进一步包括单链结合蛋白(SSB)。在其他实施例中，所述组合物进一步包括脲。在某些实施例中，所述核苷酸类似物的混合物包括含有可检测标记物的核苷酸类似物。在一些实施例中，所述可检测标记物是选自由发光、化学发光、发荧光、荧光、发色或生色标记物组成的组的光学可检测标记物。
在另一方面，本发明提供了一种对DNA或RNA模板进行测序的方法，该方法包括形成DNA聚合酶反应组合物的步骤，该反应组合物包括DNA或RNA模板、与模板复合的复制引物、DNA聚合酶、核苷酸或核苷酸类似物的混合物和至少一种PEM，在允许DNA聚合反应的条件下孵育DNA聚合酶反应组合物，其中至少一种PEM提高DNA聚合酶反应的速率、保真度或持续合成能力。本方法进一步包括确定所得核苷酸或核苷酸类似物聚合物中核苷酸或核苷酸类似物的序列。可以将PEM描述为式(I)化合物。在一些实施例中，所述至少一种PEM选自式(II)化合物。在其他实施例中，所述核苷酸类似物的混合物包含核苷三磷酸氨基酯，其中每个核苷三磷酸氨基酯包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合物系链部分，其中聚合物系链部分的第一末端连接到核碱基，聚合物系链部分的第二末端连接到核苷三磷酸氨基酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割提供核苷酸类似物的扩展。在其他实施例中，所述DNA聚合酶是DPO4或其变体。在其他实施例中，所得的核苷酸类似物的聚合物是可扩展聚合物。在其他实施例中，所述方法进一步包括使可扩展聚合物与氨基磷酸酯切割剂接触以产生核苷酸类似物的经扩展的聚合物的步骤。在某些实施例中，每个核苷酸类似物的聚合物系链部分包含所述类似物的核碱基所特有的报告部分。在其他实施例中，所述报告部分产生特征电子信号。在又其他实施例中，确定核苷酸类似物序列的步骤包括将核苷酸类似物的可扩展聚合物转移通过纳米孔的步骤。
因此，在一个实施例中，本公开提供了一种包含PEM和多核苷酸的组合物。在另一个实施例中，本公开提供了一种包含PEM和多肽(例如诸如酶的多肽，其中酶可以是核酸聚合酶)的组合物。
以下是本公开的一些示例性具体的和编号的实施例。此外，除非另有具体说明，化学式中标识的每个原子可以是该原子的任何同位素。例如，名称C(碳)包括12C、13C或14C及其混合物，特别是天然丰度同位素混合物，而H(氢)包括1H、2H和3H及其混合物，以及O(氧)包括16O和18O及其混合物，以及N(氮)包括14N和15N及其混合物，等等。其他原子类似：
1)一种式(I)化合物
Figure BDA0003485831380000081
或其溶剂化物、水合物、互变异构体、螯合物或盐，其中：
m为1、2或3；
m′为1、2或3；
n为0、1或2；
p为0、1或2；
当X为C时W为N，或者当X为N时W为C；
Figure BDA0003485831380000091
为单键或双键，其中所述双键开始于W或X中为碳的任一者处；
L为连接基团；
M在每次出现时独立地选自氢、卤素和C1-C4烷基；
Ar1在每次出现时独立地选自任选地经取代的吡啶、吡嗪、哒嗪、呋喃、噻吩、萘、芴、菲、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、萘啶、菲咯啉、嘌呤和咔唑，其中：Ar1的取代基在每次出现时独立地选自卤素、-OH、-CN、-NO2、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6环烷基、-OR0、-CONH2、-C(O)NR1R1′、-NR1R1′、-NR1C(O)R3、-C(O)SR3、-COR3、-OC(O)R3、-C(O)OR3、硫醇、-R4-H、-SOR1、-S(O)2R1、-S(O)2NR1R1′和-NS(O)2R3；
R0在每次出现时独立地选自C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂芳基；
R1和R1′在每次出现时独立地选自H、羟基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳基烷基、和经取代或未经取代的杂芳基、-C(＝NH)NH2、-CH2CO2R0、-CH2C(O)NHCH2CO2H、-CH2CH2OH、-CH2CH2NHC(O)R3、-CH2C(O)NHCH2CO2H、
Figure BDA0003485831380000101
并且
其中R1和R1′可以一起形成杂环，包括但不限于氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、
Figure BDA0003485831380000102
R2在每次出现时独立地选自C2-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、和经取代或未经取代的卤代烷氧基；
R3在每次出现时独立地选自H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的卤代烷氧基、以及胍；
R4在每次出现时独立地选自被一个或多个杂原子间断的亚烷基，其中所述杂原子为O、S、NH或其组合；
Y在每次出现时独立地选自Ar2、-(CH2)3PO(OEt)2或-CH2CO2Me；
Ar2在每次出现时独立地选自经取代的5元和6元单环芳香环和包含两个在一起的单环的9元和10元稠合双环，其中两个单环中至少一个为芳香环，其中：Ar2被G1、G2、G3、G4和G5取代，其中：当Ar2是经单取代的时，G1在每次出现时独立地选自氧代、-NH2、-COR3、-E-CO2H、-C(O)NR1R1′、-E-PO(OR1)2和被G2、G3、G4和G5取代的芳基；G2、G3、G4和G5在每次出现时独立地选自不存在或选自包含以下的基团：卤素、-CN、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-E-CO2H、-E-CHO、-E-C(O)R3、-E-C(O)NH(OH)、-E-C(O)NHR1、-E-CONR1R1′、-E-NR1R1′和-E-OR2，其中E在每次出现时独立地选自直接键和Cl-C6亚烷基。
2)根据实施例1所述的化合物，其中Ar1为单环杂环芳基。
3)根据实施例2所述的化合物，其中Ar1选自：
Figure BDA0003485831380000111
其中三唑环位于Ar1上的位置k。
4)根据实施例1所述的化合物，其中Ar1为双环芳基。
5)根据实施例4所述的化合物，其中Ar1为双环碳环芳基，其选自：
Figure BDA0003485831380000112
其中三唑环位于Ar1上的位置k。
6)根据实施例4所述的化合物，其中Ar1为双环杂环芳基，选自：
Figure BDA0003485831380000113
其中三唑环位于Ar1上的位置k。
7)根据实施例1所述的化合物，其中Ar1为三环芳基。
8)根据实施例7所述的化合物，其中Ar1为三环碳环芳基，选自：
Figure BDA0003485831380000114
9)根据实施例7所述的化合物，其中Ar1为三环杂芳基，选自：
Figure BDA0003485831380000121
其中三唑环位于Ar1上的位置k。
10)根据实施例7所述的化合物，其中Ar1为三环杂芳基，选自
Figure BDA0003485831380000122
其中三唑环位于Ar1上的位置k。
11)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2是经取代的5元单环芳香环，其选自由以下项组成的组：噻吩、1，2-噻唑、1，3-噻唑、呋喃、1，2-噁唑、1，3-噁唑、1H-吡咯、1H-吡唑、噁二唑、噻二唑、1，2，4-三唑、1，2，3-三唑和1H-咪唑。
12)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2是6元单环芳香环，其选自由以下项组成的组：苯、吡啶、哒嗪、嘧啶和吡嗪。
13)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2是9元稠合双环芳香环体系，其选自由以下项组成的组：苯并呋喃、1，3-苯并噁唑、呋喃并[3，2-b]吡啶、呋喃并[3，2-c]吡啶、呋喃并[2，3-c]吡啶、呋喃并[2，3-b]吡啶、吲哚、1H-苯并咪唑、1H-吡咯并[3，2-b]吡啶、1H-吡咯并[3，2-c]吡啶、1H-吡咯并[2，3-c]吡啶、1H-吡咯并[2，3-b]吡啶、苯并噻吩、1，3-苯并噻唑、噻吩并[3，2-b]吡啶、噻吩并[3，2-c]吡啶、噻吩并[2，3-c]吡啶、苯并噁二唑、苯并噻二唑、苯并异噁唑、苯并三唑和噻吩并[2，3-b]吡啶。
14)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2是10元稠合双环芳香环体系，其选自由以下项组成的组：亚萘基、喹啉、喹唑啉、喹喔啉、1，5-萘啶、1，6-萘啶、1，7-萘啶、1，8-萘啶、异喹啉、酞嗪、2，6-萘啶和2，7-萘啶。
15)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2是选自以下的吡啶基环：
Figure BDA0003485831380000131
其中所述取代基G(G1、G2、G3、G4和G5如上文所定义)在吡啶基环上出现0、1或2次。
16)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2是式
Figure BDA0003485831380000132
的苯基环，其中所述取代基G(G1、G2、G3、G4和G5如上文所定义)在苯基环上出现0、1或2次。在一个实施例中，G是被G2、G3、G4和G5取代的芳基(例如苯基)。
17)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2是选自
Figure BDA0003485831380000133
的苯基环。
18)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2上的取代包括氨基。
19)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2上的取代包括甲氧基。
20)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2上的取代包括甲酸。
21)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2上的取代包括-CH2-CO2-CH3。
22)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2上的取代包括三氟甲基。
23)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2上的取代包括羟基。
24)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2上的取代是一个甲酸和一个羟基。
25)根据实施例1所述的化合物，其中Ar2上的取代是一个甲酸和一个三氟甲基。
26)根据实施例1所述的化合物为螯合物的形式。
27)根据实施例26所述的化合物，其中所述螯合物是铜螯合物。
28)根据实施例1所述的化合物，其logP为至少4.9。
29)根据实施例1所述的化合物，其中n为0且m为2，其具有以下结构(III)或(IV)之一：
Figure BDA0003485831380000141
30)根据实施例1所述的化合物，其在Ar2上具有取代，所述取代包括羟基、甲酸甲酰胺和三氟甲基中的至少两个。
31)根据实施例1所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)之一：
Figure BDA0003485831380000142
32)根据实施例1所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构(X)、(XI)或(XII)之一：
Figure BDA0003485831380000143
Figure BDA0003485831380000151
33)根据实施例1所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构(XIII)、(XIV)或(XV)之一：
Figure BDA0003485831380000152
Figure BDA0003485831380000161
34)根据实施例1所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)或(XXII)之一：
Figure BDA0003485831380000162
Figure BDA0003485831380000171
35)根据实施例1所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构(XXIII)、(XXIV)或(XXV)之一：
Figure BDA0003485831380000181
36)根据实施例1所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构(XXVI)、(XXVII)或(XXVIII)之一：
Figure BDA0003485831380000182
Figure BDA0003485831380000191
37)根据实施例1所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构(XXIX)、(XXX)、(XXXI)或(XXXII)之一：
Figure BDA0003485831380000192
Figure BDA0003485831380000201
38)根据实施例1所述的化合物，其选自以下中的任一种：
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(吡啶-3，5-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯甲酸；
4，4′-((4-甲氧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-羧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-硝基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
5，5′-((4-氰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-甲基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
5，5′-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(甲氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(甲基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-氨基甲酰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(吡嗪-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(1，3-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯胺；
4，4′-(1，3-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯甲酸；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯甲酸；
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯甲酸；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯甲酸；
4，4′-((3，5-二甲基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4l3-吡啶-2，6-二基)双(5-碘-1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-乙酰氨基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((9-乙酰基-9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(N，2-二羟基苯甲酰胺)；
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酰胺)；
4，4′-((4-羧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((1，10-菲咯啉-2，9-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(三氟甲基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((3-氰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((3-硝基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
3，3′-((4-氰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(叔丁氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4-(4-(4-氰基吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-羟基苯甲酸；
5-(4-(6-(4-(3-羧基-4-羟基-5-甲基苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-4-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-羟基-3-甲基苯甲酸；
4，4′-((4-(二甲基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(环丙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(丁-3-炔-1-基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(二乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(叔丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(吗啉-4-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(丙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(苯基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-((2-乙酰氨基乙基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(4-环丙基哌嗪-1-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(甲脒基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(哌啶-1-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(环丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((1，10-菲咯啉-3，8-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(环戊基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(二丙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(二仲丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(萘-2，7-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(萘-2，3-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(二丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-((2-羟基乙基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(环己基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(苄基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯甲酸；
4，4′，4″，4″′-((((丁烷-1，4-二基双(氮烷二基))双(羰基))双(吡啶-4，2，6-三基))四(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))四(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3，5，6-三氯吡啶甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
7，7′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基-1，8-萘啶-4-甲酸)；
5，5′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-氟苯甲酸)；
5，5′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-氟苯甲酸)；
4，4′-((4-(甲基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(吗啉-4-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(二乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-氨基甲酰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(氮杂环丁烷-1-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基(甲基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
N-乙基-2，6-双(1-(4-(2，2，2-三氟乙酰基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)异烟酰胺；
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(环丙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
5，5′-((4-(二乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
5，5′-((4-(吗啉-4-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-(哒嗪-3，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
5，5′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-(三氟甲基)苯甲酸)；
3，3′-(((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(4，1-亚苯基))二丙酸；
4，4′-(((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(4，1-亚苯基))二丁酸；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二邻苯二甲酸；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-甲氧基苯甲酸)；
5，5′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二间苯二甲酸；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-羟基苯甲酸)；
(3-(4-(6-(1-(3-(二乙氧基磷酰基)丙基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙基)膦酸二乙酯；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-甲基苯甲酸)；
2，2′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-((2-羟基乙基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-硝基苯甲酸)；
4，4′-((4-((3，3，3-三氟丙基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
(4-(4-(4-(乙基氨基甲酰基)-6-(1-(4-膦酰基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯基)膦酸；
4，4′，4″，4″′-((((丁烷-1，4-二基双(氮烷二基))双(羰基))双(吡啶-4，2，6-三基))四(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))四(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))二乙酸；
2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))二乙酸二甲酯；
(2S，2′S)-2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))二琥珀酸；
2，2′-((2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))双(乙酰基))双(氮烷二基))二乙酸；
2，6-双(1-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-N-乙基异烟酰胺；
4，4′-(噻吩-2，5-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；和
4，4′-(呋喃-2，5-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)。
39)一种化合物，其选自以下中的任意一种：
4，4′-(1，3-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯胺；
3，6-双(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-9H-咔唑；
4，4′-(1，4-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(1，3-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯胺；
4，4′-(1，3-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯甲酸；
1，3-双(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯；
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯胺；
4-(4-(3-(1-(4-羧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-羟基苯甲酸；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯甲酸；
4，4′-((4-羧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
2-(1-(1H-苯并[d]咪唑-4-基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-6-(1-(1H-苯并[d]咪唑-7-基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-N-乙基异烟酰胺；
4，4′-((4-羧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((5-羧基-1，3-亚苯基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((5-羧基-1，3-亚苯基)双(1H-1，2，3-三唑-1，4-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((5-(乙基氨基甲酰基)-1，3-亚苯基)双(1H-1，2，3-三唑-1，4-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
3′-(4-(4-(乙基氨基甲酰基)-6-(1-(3′-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-3-基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-3-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-4-甲酸；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-氰基苯甲酸)；以及
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-氯苯甲酸)。
40)一种包含根据实施例1-39中任一项所述的化合物和分子拥挤剂的组合物。
41)根据实施例41所述的组合物，其中所述分子拥挤剂是聚亚烷基二醇。
42)一种组合物，其包含根据权利要求实施例1-39中任一项所述的化合物，和水性缓冲剂。
43)根据实施例43所述的组合物，其中所述水性缓冲剂是Tris HCl。
44)一种组合物，其包含根据实施例1-39中任一项所述的化合物，和多核苷酸。
45)根据实施例44所述的组合物，其中所述多核苷酸是20-60mer寡核苷酸。
46)一种组合物，其包含根据实施例1-39中任一项所述的化合物，和蛋白质。
47)根据实施例46所述的组合物，其中所述蛋白质是DNA聚合酶。
48)一种组合物，其包含根据实施例1-39中任一项所述的化合物，和核苷酸或核苷酸类似物的混合物。
49)一种用于增强DNA聚合酶反应的持续合成能力、保真度或速率的组合物，其包含至少一种根据实施例1-39中任一项所述的化合物，和核苷酸类似物的混合物。
50)一种包含至少一种根据实施例1-39中任一项所述的化合物和核苷酸类似物的混合物的组合物，其中相对于不存在至少一种根据实施例1-39中任一项所述的化合物的相同聚合反应而言，所述至少一种根据实施例1-39中任一项所述的化合物增加了在模板-依赖性聚合反应期间掺入子链的核苷酸类似物的数量和准确性。
51)根据实施例50所述的组合物，其中所述核苷酸类似物的混合物包含核苷三磷酸氨基酯，其中每个核苷三磷酸氨基酯包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合物系链部分，其中聚合物系链部分的第一末端连接到核碱基，聚合物系链部分的第二末端连接到核苷三磷酸氨基酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割提供核苷酸类似物的扩展。
52)根据实施例51所述的组合物，其进一步包含选自以下中的缓冲剂组分：TrisOAc、NH4OAc、PEG、水混溶性有机溶剂、多磷酸盐60、NMS和MnCl2中的至少一种。
53)根据实施例51所述的组合物，其进一步包含单链结合蛋白。
54)根据实施例51所述的组合物，其进一步包含脲。
55)根据实施例51所述的组合物，其中所述核苷酸类似物的混合物包含含有可检测标记物的核苷酸类似物。
56)根据实施例55所述的组合物，其中所述可检测标记物是选自由发光、化学发光、发荧光、荧光、发色或生色标记物组成的组的光学可检测标记物。
57)一种用于对核酸模板进行测序的试剂盒，其包含至少一种根据实施例40-56中任一项所述的组合物。
58)一种增强核酸聚合酶反应的方法，所述方法包括：
a.形成核酸聚合酶反应组合物，其包含：
i.模板核酸，
ii核酸聚合酶，
iii.核苷酸或核苷酸类似物的混合物，和
iv.至少一种根据实施例1-39中任一项所述的化合物；并且
b.在允许核酸聚合反应的条件下孵育核酸聚合酶反应组合物，其中所述至少一种根据实施例1-39中任一项所述的化合物增加了核酸聚合酶反应的持续合成能力、速率或保真度。
59)根据实施例58所述的方法，其中与缺乏根据实施例1-39中任一项所述的化合物的核酸聚合酶反应相比，根据实施例1-39中任一项所述的化合物增加了所得核酸产物的长度。
60)根据实施例58所述的方法，其中所述至少一种根据实施例1-39中任一项所述的化合物包含多种根据实施例1-39中任一项所述的化合物。
61)根据实施例58所述的方法，其中所述核酸聚合酶是DNA聚合酶。
62)根据实施例61所述的方法，其中所述DNA聚合酶是DPO4或其变体。
63)根据实施例58所述的方法，其中所述核苷酸或核苷酸类似物的混合物是包含核苷三磷酸氨基酯的核苷酸类似物的混合物，其中每个核苷三磷酸氨基酯包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合物系链部分，其中聚合物系链部分的第一末端连接到核碱基，聚合物系链部分的第二末端连接到核苷三磷酸氨基酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割提供核苷酸类似物的扩展。
64)根据实施例58所述的方法，其中所述核酸聚合反应产生核苷酸类似物的可扩展聚合物，其中所述可扩展聚合物编码模板核酸的核碱基序列信息。
65)根据实施例58所述的方法，其中所述允许核酸聚合反应的条件包括合适的聚合缓冲剂和寡核苷酸引物。
66)根据实施例58所述的方法，其中所述合适的缓冲剂包含选自下组的组分：TrisOAc、NH4OAc、PEG、水混溶性有机溶剂、多磷酸盐60、NMS和MnCl2。
67)根据实施例58所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含单链结合蛋白。
68)根据实施例58所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含脲。
69)根据实施例58所述的方法，其中所述核苷酸或核苷酸类似物的混合物包含含有可检测标记物的核苷酸类似物。
70)根据实施例69所述的方法，其中所述可检测标记物是选自由发光、化学发光、发荧光、荧光、发色或生色标记物组成的组的光学可检测标记物。
71)一种对DNA或RNA模板进行测序的方法，所述方法包括以下步骤：
a.形成DNA聚合酶反应组合物，其包含：
i.DNA或RNA模板，
ii.与模板复合的复制引物，
iii.DNA聚合酶，
iv.核苷酸或核苷酸类似物的混合物，
v.至少一种根据实施例1-39中任一项所述的化合物，
b.在允许DNA聚合反应的条件下孵育DNA聚合酶反应组合物，其中所述至少一种根据实施例1-39中任一项所述的化合物增加了DNA聚合酶反应的速率、保真度或持续合成能力；以及
c.确定所得核苷酸或核苷酸类似物聚合物中核苷酸或核苷酸类似物的序列。
72)根据实施例71所述的方法，其中所述核苷酸类似物的混合物包含核苷三磷酸氨基酯，其中每个核苷三磷酸氨基酯包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合物系链部分，其中聚合物系链部分的第一末端连接到核碱基，聚合物系链部分的第二末端连接到核苷三磷酸氨基酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割提供核苷酸类似物的扩展。
73)根据实施例71或72所述的方法，其中所述DNA聚合酶是DPO4或其变体。
74)根据实施例71或72所述的方法，其中所得核苷酸类似物的聚合物是可扩展聚合物。
75)根据实施例74所述的方法，进一步包括使可扩展聚合物与氨基磷酸酯切割剂接触以产生核苷酸类似物的经扩展的聚合物的步骤。
76)根据实施例71或72所述的方法，其中每个核苷酸类似物的聚合物系链部分包含所述类似物的核碱基所特有的报告部分。
77)根据实施例72所述的方法，其中所述报告部分产生特征电子信号。
78)根据实施例72所述的方法，其中确定核苷酸类似物序列的步骤包括将核苷酸类似物的可扩展聚合物转移通过纳米孔的步骤。
本发明的上述和附加特征以及获得它们的方式将变得显而易见，并且通过参考以下更详细的描述将最好地理解本发明。在此公开的所有参考文献均通过引用整体并入本文，就好像每篇文献均单独并入一样。
提供该简要概述以简化形式介绍某些概念，这些概念将在下面的详细说明中进一步详细描述。除非另有明确说明，该简要概述不旨在确定要求保护的主题的关键或基本特征，也不旨在限制要求保护的主题的范围。
一个或多个实施例的细节在以下描述中阐述。结合一个示例性实施例示出或描述的特征可以与其他实施例的特征组合。因此，本文描述的各种实施例中的任一个可以组合以提供进一步的实施例。如有必要，可对实施例的各个方面进行修改从而采用如本文所识别的各类专利、应用和公开的概念来提供其他进一步的实施例。从描述、附图和权利要求中，其他特征、目的和优点将是显而易见的
附图说明
本公开的示例性特征、其性质和各种优点将从附图和各种实施例的以下详细描述中显而易见。参考附图描述了非限制性和非穷尽的实施例，其中除非另有说明，否则在各个视图中相同的标签或附图标记指相同的部件。图中元件的尺寸和相对位置不一定按比例绘制。例如，选择、放大和定位各种元件的形状以提高图的易读性。为便于在图中识别，已选择所绘元件的特定形状。
图1A、1B、1C和1D是说明概括性XNTP的主要特征及其在扩展测序(SBX)中使用的简明示意图。
图2是说明XNTP的一个实施例的更多细节的示意图。
图3是说明Xpandomer穿过生物纳米孔的一个实施例的示意图。
图4是显示引物延伸产物的凝胶。
图5是显示引物延伸产物的凝胶。
图6A和图6B是纳米孔衍生序列的比对读段群的直方图显示。
图7A和图7B是纳米孔衍生序列的比对读段群的直方图显示。
图8是显示引物延伸产物的凝胶。
图9是显示引物延伸产物的凝胶。
图10是显示引物延伸产物的凝胶。
图11是显示引物延伸产物的凝胶。
图12是显示引物延伸产物的凝胶。
图13是显示引物延伸产物的凝胶。
图14是显示引物延伸产物的凝胶。
具体实施方式
通过参考以下对本发明的优选实施例和本文包括的实例的详细描述，可以更容易地理解本发明。除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。
在一方面，本公开的PEM是式(I)化合物
Figure BDA0003485831380000331
或其溶剂化物、水合物、互变异构体、螯合物或盐，其中：
m为1、2或3；
m′为1、2或3；
n为0、1或2；
p为0、1或2；
当X为C时W为N，或者当X为N时W为C；
Figure BDA0003485831380000332
为单键或双键，其中所述双键开始于W或X中为碳的任一者处；
L为连接基团；
M在每次出现时独立地选自氢、卤素和C1-C4烷基；
Ar1在每次出现时独立地选自任选地经取代的吡啶、吡嗪、哒嗪、呋喃、噻吩、萘、芴、菲、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、萘啶、菲咯啉、嘌呤和咔唑，其中：
Ar1的取代基在每次出现时独立地选自卤素、-OH、-CN、-NO2、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6环烷基、-OR0、-CONH2、-C(O)NR1R1′、-NR1R1′、-NR1C(O)R3、-C(O)SR3、-COR3、-OC(O)R3、-C(O)OR3、硫醇、-R4-H、-SOR1、-S(O)2R1、-S(O)2NR1R1′和-NS(O)2R3；并且其中
R0在每次出现时独立地选自C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂芳基；
R1和R1′在每次出现时独立地选自H、羟基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基烷基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳基烷基和经取代或未经取代的杂芳基、-C(＝NH)NH2、-CH2CO2R0、-CH2C(O)NHCH2CO2H、-CH2CH2OH、-CH2CH2NHC(O)R3、-CH2C(O)NHCH2CO2H、
Figure BDA0003485831380000341
并且
其中R1和R1′可以一起形成杂环，包括但不限于氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、
Figure BDA0003485831380000342
R2在每次出现时独立地选自C2-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、和经取代或未经取代的卤代烷氧基；
R3在每次出现时独立地选自H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的卤代烷氧基、以及胍；
R4在每次出现时独立地选自被一个或多个杂原子间断的亚烷基，其中所述杂原子为O、S、NH或其组合；
Y在每次出现时独立地选自Ar2、-(CH2)3PO(OEt)2或-CH2CO2Me；
Ar2在每次出现时独立地选自经取代的5元和6元单环芳香环和包含两个在一起的单环的9元和10元稠合双环，其中两个单环中至少一个为芳香环，其中：
Ar2经G1、G2、G3、G4和G5取代，其中：
当Ar2是经单取代的时，G1在每次出现时独立地选自氧代、-NH2、-COR3、-E-CO2H、-C(O)NR1R1′、-E-PO(OR1)2和被G2、G3、G4和G5取代的芳基；并且
G2、G3、G4和G5在每次出现时独立地选自不存在或选自包含以下的基团：卤素、-CN、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-E-CO2H、-E-CHO、-E-C(O)R3、-E-C(O)NH(OH)、-E-C(O)NHR1、-E-CONR1R1′、-E-NR1R1′和-E-OR2；
其中E在每次出现时独立地选自直接键和C1-C6亚烷基。
如在说明书和所附权利要求中使用的，除非另有说明，否则以下术语具有所示的含义。
本文命名的某些化学基团前面有一个简写符号，表示在指定化学基团中发现的碳原子总数。例如；C1-C4烷基，可替代地写成C1-4烷基，描述了具有至少一个至多达4个碳原子的烷基基团，而C4-C12环烷基烷基(同样可记为C4-12环烷基烷基)描述了具有总计4至12碳原子的环烷基烷基。简写符号中的碳总数不包括可能存在于所述基团的取代基中的碳。例如，C1-C6烷基是指含有一至六个碳原子的烷基基团；C1-C6卤代烷基是指含有一至六个碳原子的卤代烷基基团；C1-C6亚烷基是指含有一至六个碳原子的亚烷基二元自由基。
除了前述，如在说明书和所附权利要求中使用的，除非另有说明，否则以下术语具有所示的含义：
“烷基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，不含不饱和度，并且任选地具有指定数量的碳原子，例如具有一至十二个碳原子、一至八个碳原子或一至六个碳原子或一至四个碳原子，并通过单键连接到分子的其余部分。实例诸如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1，1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基等。当烷基基团中引入不饱和度时，所得基团可称为不饱和烷基基团，其中不饱和烷基基团通常称为烯基基团(具有至少一个碳碳双键)和炔基基团(具有至少一个碳碳三键)。在一个实施例中，并且当指定时，本公开的化合物中的烷基基团可以是或包括不饱和烷基基团。
“烯基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，含有至少一个双键，任选地具有指定数量的碳，例如，二至十二个碳原子或二至八个碳原子或二至六个碳原子或二至四个碳原子，并且通过单键连接到分子的其余部分，例如，乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、五-1，4-二烯基等。
“炔基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，含有至少一个三键，任选地具有指定数量的碳，例如，二至十二个碳原子或二至八个碳原子或二至六个碳原子或二至四个碳原子，并且通过单键连接到分子的其余部分，例如，乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、五-1，4-二烯基等。
“卤代”是指溴、氯、氟或碘。
“卤代烷基”是指被一个或多个如上文所定义的卤代基团取代的如上文所定义的烷基基团，例如三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2，2，2-三氟乙基、1-氟甲基-2-氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1-溴甲基-2-溴乙基等。同样，“卤代烯基”是指被一个或多个如本文所定义的卤代基团取代的如本文所定义的烯基基团，“卤代炔基”是指被一个或多个如本文所定义的卤代基团取代的如本文所定义的炔基基团。
“亚烷基”或“亚烷基链”是指将分子的其余部分连接到仅由碳和氢组成的不包含不饱和度并且任选地具有指定数目的碳原子的基团的直链或支链二价烃链。实例诸如亚甲基、乙烯、丙烯、正丁烯等。亚烷基链通过单键连接到分子的其余部分，并通过单键连接到基团。亚烷基链与分子的其余部分和与基团的连接点可以通过链内的一个碳或任何两个碳。与烷基基团类似，可以将不饱和度引入亚烷基链中，以提供不饱和亚烷基链。当亚烷基链中引入不饱和度时，所得基团可称为不饱和亚烷基基团或链，其中不饱和亚烷基链通常称为亚烯基基团(具有至少一个碳碳双键)和亚炔基基团(具有至少一个碳碳三键)。在一个实施例中，并且当指定时，本公开的化合物中的亚烷基链可以是或包括不饱和亚烷基链。
“亚烯基”或“亚烯基链”是指将分子的其余部分连接到仅由碳和氢组成的包含至少一个双键并且任选地具有指定数目的碳原子(例如二至十二个碳原子)的基团的直链或支链二价烃链。亚烯基基团的实例包括亚乙烯基、亚丙烯基、正亚丁烯基等。亚烯基链通过单键连接到分子的其余部分，并通过双键或单键连接到基团。亚烯基链与分子的其余部分和与基团的连接点可以通过链内的一个碳或任何两个碳。
“芳基”是指包含至少5个环原子，任选地包含1-6个选自O、S和N的杂环原子和至少一个芳香环的环体系基团。5元单环芳香环含有5个选自碳和杂原子的环原子，而6元单环芳香环含有6个选自碳和杂原子的环原子。具有5个成员的示例性单环芳香环是吡咯并且具有六个成员的示例性单环芳香环是吡啶。芳基基团可以是例如单环、双环、三环或四环环体系，其可以包括稠合或桥接环体系。碳环芳基基团在环原子上仅含有碳，其中实例包括但不限于衍生自醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、薁、苯、
Figure BDA0003485831380000371
荧蒽、芴、不对称引达省、对称引达省、茚满、茚、萘、非那烯、菲、七曜烯、芘和三亚苯的芳基基团。在一个实施例中，芳基是苯基或萘基，且在另一个实施例中是苯基。当芳基基团包括非碳环原子，例如氧、硫和氮时，该芳基基团可称为杂芳基基团。杂芳基基团可以是例如单环、双环、三环或四环环体系，其可以包括稠合或桥接环体系。杂芳基基团中的氮、碳或硫原子可以任选被氧化；氮原子可以任选地被季铵化。
“芳基烷基”基团是如上定义的烷基、烯基或炔基基团，其中其氢原子被如上定义的芳基基团替换。示例性芳烷基基团包括苄基(-CH2苯基)、苯基乙基(-CH2CH2苯基)和苯基乙烯(-CH＝CH苯基)基团和稠合(环烷基芳基)烷基基团例如4-乙基-茚满基。芳烷基基团可在芳基部分，烷基、烯基或炔基部分，或两者上被取代。
“稠合”是指环之间含有稠合的环体系，其中稠合是指共享两个相邻环原子的环。含有两个稠合在一起的5元和/或6元单环的稠合环是指双环环体系，其中每个环是单环并且独立地具有5或6个环原子，并且两个环稠合是因为它们共享两个环原子。例如，萘是由两个6元单环(苯)稠合在一起形成的10元稠合环体系。萘是双环的，因为它包含两个(bi＝2)环。作为另一个实例，1，3-苯并噻唑是由一个6元环(苯)和一个5元环(1，3-噻唑)稠合在一起形成的9元稠合环体系。1，3-苯并噻唑是双环的，因为它包含两个环。
“碳环基”是指由3至18个碳原子组成的稳定的3元至18元芳香族或非芳香环基团。除非说明书中另有具体说明，否则碳环基团可以是单环、双环、三环或四环环体系，其可包括稠合或桥接环体系，并且可以是部分或完全饱和的。非芳香族碳环基团包括环烷基，而芳香族碳环基团包括芳基。
“环烷基”是指仅由碳和氢原子组成的稳定的非芳香族单环或多环烃基团，其可包括稠合或桥接环体系，具有三至十五个碳原子，优选具有三至十个碳原子，并且其是饱和的或不饱和的，并通过单键连接到分子的其余部分。单环基团包括，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环基团包括例如金刚烷基、降冰片基、十氢萘基、7，7-二甲基-双环-[2.2.1]庚烷基等。
“杂环基”是指稳定的3元至18元芳香族或非芳香环基团，其由二至十二个碳原子和一至六个选自由氮、氧和硫组成的组的杂原子组成。除非说明书中另有具体说明，所述杂环基基团可以是单环、双环、三环或四环环体系，其可包括稠合或桥接环体系；所述杂环基中的氮、碳或硫原子可任选被氧化；所述氮原子可以任选地被季铵化；并且所述杂环基基团可以部分或完全饱和。非芳香族杂环基基团的实例包括但不限于二氧戊环基、噻吩基[1，3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶基、吡咯烷基、吡唑烷基、吡唑嘧啶基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三氧噁烷基、三噻烷基、三氮杂环己烷基(triazinanyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基、噻吗啉基、1-氧代-硫代吗啉基和1，1-二氧代-硫代吗啉基。
任选地，但仅在详细说明时，本公开的PEM化合物中的烷基、烯基、亚烷基、亚烯基、碳环基、环烷基、芳基、杂环基和杂芳基中的每一个可以被一个或多个未经取代的(例如，烷基基团上的烷基取代基未被进一步取代，即烷基取代基是未经取代的烷基)选自由以下组成的组的取代基取代：烷基、烯基、卤代、卤代烷基、卤代烯基、氰基、氧代、硫代、硝基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、--Rb-ORa、--Rb--OC(O)-Ra、--Rb--N(Ra)2、--Rb--C(O)Ra、--Rb--C(O)ORa、--Rb--C(O)N(Ra)2、--Rb--N(Ra)C(O)ORc、--Rb--N(Ra)C(O)Rc、--Rb--N(Ra)S(O)tRc(其中t为1至2)、--Rb-N＝C(ORa)Ra，--Rb--S(O)tORc(其中t为1至2)、--Rb--S(O)sRc(其中s为0至2)和-Rb--S(O)tN(Ra)2(其中t为1至2)，其中每个Ra独立地是氢、烷基、烯基、卤代烷基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基；Rb各自独立地是直接键或直链或支链亚烷基或亚烯基链；且每个Rc为烷基、烯基、卤代烷基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基。
“氨基”是指--NH2基团。“氰基”是指--CN基团。“羟基”是指--OH基团。“硝基”是指--NO2基团。“氧代”是指＝O取代基。“硫代”是指＝S取代基。“三氟甲基”是指--CF3基团。“三氟甲氧基”是指--OCF3基团。硫醇，也称为巯基，是指-SH基团。
“酰基”是指基团--C(O)R，也可以写成-C(＝O)R，其中R是烷基、芳烷基、碳环基、芳基、杂芳基或杂环基。例如，当R为甲基时，酰基基团可称为乙酰基。
“烷氧基”是指式--OR的基团，其中R是烷基或卤代烷基基团。在一个实施例中，所述烷氧基基团含有至多六个碳原子。示例性烷氧基基团包括甲氧基和乙氧基。被卤素取代的烷氧基在本文中可称为卤代烷氧基，其包括例如三氟甲氧基、三氯甲氧基等。
“杂亚烯基”或“杂亚烯基链”是指将分子的其余部分连接到由碳和氢以及至少一个选自N、O和S的杂原子组成的基团的直链或支链二价烃链。
“卤代烷氧基”是指被一个或多个如上定义的卤代基团取代的烷氧基基团，例如三氟甲氧基、二氟甲氧基、三氯甲氧基、2，2，2-三氟乙氧基、3-溴-2-氟丙氧基等。卤代烷氧基基团的烷氧基部分可以任选地被取代，如上文对烷氧基基团的定义。
“N-杂环基”是指含有至少一个氮的杂环基基团。N-杂环基基团可以任选地被取代，如上文对杂环基基团所述。
“杂环基烷基”是指式--RbRh的基团，其中Rb是如上定义的亚烷基链并且Rh是如上定义的杂环基基团，并且如果杂环基是含氮杂环基，则杂环基可以连接到氮原子上的烷基基团。杂环基烷基基团的亚烷基链可以任选地被取代，如上文对亚烷基链的定义。杂环基烷基基团的杂环基部分可以任选地被取代，如上文对杂环基基团的定义。
“N-杂芳基”是指含有至少一个氮的如上定义的杂芳基基团，其中杂芳基基团与分子的其余部分的连接点是通过杂芳基基团中的氮原子。N-杂芳基基团可以任选地被取代，如上文对杂芳基基团所述。
“杂芳基烷基”是指式--RbRi的基团，其中Rb是如上定义的亚烷基链并且Ri是如本文定义的杂芳基基团。杂芳基烷基基团的杂芳基部分可以任选地被取代，如本文对杂芳基基团的定义。杂芳基烷基基团的亚烷基链部分可以任选地被取代，如本文对亚烷基链的定义。同样，芳基烷基基团是指杂芳基烷基基团，其中杂芳基部分被相应的碳环芳基基团替换，即杂原子被碳替换，并根据氢取代的需要进行调整。
“羟基烷基”是指式--RbOH的基团，其中Rb是如本文所定义的亚烷基链。--OH(羟基，又名羟基)基团可以连接到亚烷基链中的任何碳原子。杂芳基烷基基团的亚烷基链部分可以另外任选地被取代，如上文对亚烷基链的定义。
本文所述的具有酸性或碱性基团的PEM化合物通常可用作游离酸或游离碱。可替代地，具有酸性或碱性基团的PEM化合物可以以盐的形式使用，例如酸或碱加成盐。游离氨基化合物的酸加成盐可以通过本领域公知的方法制备，并且可以由有机和无机酸形成。合适的有机酸包括马来酸、富马酸、苯甲酸、抗坏血酸、琥珀酸、甲磺酸、乙酸、三氟乙酸、草酸、丙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、葡糖酸、乳酸、扁桃酸、肉桂酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、乙醇酸、谷氨酸和苯磺酸。合适的无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和硝酸。碱加成盐包括与甲酸阴离子形成的那些盐并且包括与有机和无机阳离子形成的盐，例如选自碱金属和碱土金属(例如，锂、钠、钾、镁、钡和钙)的那些盐，以及铵离子及其经取代衍生物(例如，二苄基铵、苄基铵、2-羟乙基铵等)。因此，本文描述的PEM化合物的术语“盐”旨在涵盖任何和所有盐形式。
本公开的PEM化合物可以为螯合物的形式。螯合物是指含有在两个或多个点与中心金属原子键合的有机配体(例如三唑-Ar基团)的化合物。
关于立体异构体，本文所述的PEM化合物可以具有一个或多个手性(或不对称)中心，因此可以产生对映体、非对映体和其他可以根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-的立体异构形式。当本文所述的化合物含有烯键式双键或其它几何不对称中心时，除非另有说明，否则旨在表示这些化合物同时包含E和Z几何异构体两者(例如，顺式或反式)。同样，除非另有说明，所有可能的异构体，以及它们的外消旋和旋光纯形式，并且也旨在包括所有互变异构形式。因此预期各种立体异构体及其混合物包括“对映体”，其是指其分子是彼此不可重叠的镜像的两种立体异构体。因此，化合物可以任何异构形式存在，包括外消旋物、外消旋混合物以及作为单独的对映体或非对映体存在。
此外，PEM化合物的一些结晶形式可以以多晶型物的形式存在，这也在本文中被考虑。此外，一些PEM化合物也可能与水或其他有机溶剂形成溶剂化物。此类溶剂化物类似地包括在本文所述的化合物的范围内。
正如本领域技术人员所理解的，任何上述化合物都可以掺入放射性同位素。因此，还考虑使用与本文所述的那些相同的同位素标记的化合物，其中一个或多个原子被原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数的原子所替换。可以掺入这些化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素。因此，提及一种元素，例如氢(H)或碳(C)，旨在涵盖其所有同位素。例如，名称C(碳)包括12C、13C或14C及其混合物，而H(氢)包括1H、2H和3H及其混合物，以及O(氧)包括16O和18O及其混合物，以及N(氮)包括14N和15N及其混合物，等等，其他原子类似。同位素标记的PEM化合物可用于在测定等过程中追踪PEM化合物或其部分。
在式(I)的PEM化合物中，Ar1是芳基基团，也称为芳香族部分。芳香族部分可以是碳环或杂环芳香族部分，其中每个芳香环原子是碳环芳香族部分中的碳，而芳香环原子中的至少一个是杂环芳香族部分中的氮、氧或硫。
在一个实施例中，Ar1可以包含1-6个环，其中至多六个环原子可选自氧、硫和氮，其余为碳原子。任选地，Ar1部分可以包含1-5个环，其中至多五个环原子可以选自氧、硫和氮。作为另一种选择，Ar1基团可以包含1-4个环，其中至多四个环原子可以选自氧、硫和氮。作为又另一种选择，Ar1部分可以包含1-3个环，其中至多三个环原子可以选自氧、硫和氮。作为另一个实例，Ar1可以包含1-2个环，其中最多三个环原子可以选自氧、硫和氮。在任何情况下，每个环可以独立地是五元环(即五个环原子形成环)或六元环或七元环，而在一种选择中，每个环是五元环或六元环。
示例性芳香族部分是碳环芳香族部分。碳环部分可含有一个(例如苯)或两个(例如萘、薁)或三个(例如苊烯、芴)或四个(例如荧蒽、醋蒽烯)或五个(例如并五苯、茜)或六个(例如并六苯)芳香环，其中为方便起见，本文中可以通过命名其未取代的形式(例如苯)来举例说明Ar1基团，尽管在本公开的化合物中Ar1基团是相应的基团，例如，当m为2并且Ar1是另外未被取代的时，两个环氢被三唑基团替换。例如，所述芳香族部分可以是单环碳环部分，即苯基，也称为C6芳香族部分。作为另一个实例，芳香族部分可以是双环碳环部分，例如萘基，其是C10芳香族部分。
示例性的Ar1芳香族部分是杂环芳香族部分，其也可称为杂芳基基团。杂环部分除了含有1或2或3或4或5或6个杂原子(即除碳以外的选自氮、硫和氧的原子外)还可含有一个或两个或三个或四个或五个或六个芳香环。任选地，所述杂原子(如果存在的话)是氮。例如，芳香族部分可以是单环杂环部分，例如吡啶基(其是六元C5芳香族部分)或吡嗪基(其是六元C4芳香族部分)。作为另一个实例，芳香族部分可以是双环杂环部分，例如喹啉基或异喹啉基(它们是十元C9芳香族部分)或1，5-萘啶基、2，6-萘啶基或2，7-萘啶基(它们是示例性十元C8芳香族部分)。
因此，杂芳基是含有5个或更多个环成员的芳香环化合物，其中一个或多个是杂原子，例如但不限于N、O和S。被指定为C2-杂芳基的杂芳基基团可以是具有两个碳原子和三个杂原子的五元环、具有两个碳原子和四个杂原子的六元环等等。同样，C4-杂芳基可以是具有一个杂原子的5元环、具有两个杂原子的6元环，等等。碳原子数加上杂原子数的总和等于环原子的总数。杂芳基基团包括但不限于例如吡咯基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、吡啶基、苯硫基、苯并苯硫基、苯并呋喃基、吲哚基、氮杂吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、氮杂苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、咪唑吡啶基、异噁唑吡啶基、噻萘基(thianaphthalenyl)、嘌呤基、黄苷基、腺嘌呤基、鸟嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、喹喔啉基和喹唑啉基基团的基团。因此，术语“杂芳基”和“杂芳基基团”包括稠合环化合物，例如其中至少一个环但不一定所有环是芳香族的，包括四氢喹啉基、四氢异喹啉基、吲哚基和2，3-二氢吲哚基。
当m为2时，使得Ar1必须被两个三唑-Ar2部分取代，Ar1芳香族部分的任何两个碳可以被这两个三唑-Ar2部分之一取代。例如，当Ar1是经取代的苯时，Ar1可以在邻位、间位或对位被取代，如下所示，其中k表示取代可能发生在芳香族部分的位置：
Figure BDA0003485831380000431
作为另一个实例，当Ar1是经取代的萘并且m为2时，Ar1可以在任何两个萘基碳原子上被取代，其中以下结构显示了取代选项，k显示了由(三唑-Ar2)提供的三唑取代可能发生在芳香族部分的位置：
Figure BDA0003485831380000441
前述实例使用碳环芳香族Ar1基团作为说明性Ar1部分说明了Ar1上的三唑取代。然而，相同的原理适用于杂环芳香族Ar1基团上的三唑取代。例如，当Ar1为经取代的吡啶且m为2时，(三唑-Ar2)的两个三唑基团可位于吡啶环上的以下任一位置，其中k用于指定三唑基团可位于的位置：
Figure BDA0003485831380000442
因此，在一个示例性实施例中，Ar1是选自
Figure BDA0003485831380000443
的单环杂芳香族结构，其中三唑环在Ar1上的位置k处被取代。在另一个示例性实施例中，Ar1是选自
Figure BDA0003485831380000444
的单环碳环结构，其中三唑环在Ar1上的位置k处被取代。在另一个示例性实施例中，Ar1是选自
Figure BDA0003485831380000445
Figure BDA0003485831380000446
的双环碳环结构，其中三唑环在Ar1上的位置k处被取代。在另一个实施例中，Ar1是具有两个六元环和一个五元环以及一个氮环原子的多环杂环结构，并且选自
Figure BDA0003485831380000451
Figure BDA0003485831380000452
其中三唑环在Ar1上的位置k处被取代。在又另一个示例性实施例中，Ar1是具有三个六元环和两个氮环原子的多环杂环结构，并且选自
Figure BDA0003485831380000453
其中三唑环在Ar1上的位置k处被取代。
Ar1包括如本文所述的经取代和未取代的芳香族部分。在一个实施例中，Ar1是经取代的芳香族部分。在一个实施例中，Ar1是非取代的芳香族部分，其也可称为未经取代的芳香族部分。在经取代的芳香族部分中，一个或多个本应与环原子键合的氢原子已被取代基替换，例如，任选地1或2或3或4或5或6个氢原子可以被取代基替换。Ar1上的取代基不是指当m等于1时必然存在的三唑-Ar2部分，或当m等于2时必然存在的两个三唑-Ar2部分，或当m等于3时必然存在的三个三唑Ar2部分。
在一个实施例中，Ar1上的取代基将由选自氘、卤素(F、Cl、Br、I)、碳、氮、氧和硫的原子组成，并且任选地还将含有氢，并且还将含有形成抗衡离子(如果存在)的另外的原子。氘和卤化物被认为是单价原子，而碳、氮、氧和硫，因为它们能够同时形成一个以上的共价键而被认为是多价原子。除了单价原子之外，Ar1上的取代基可以具有多个多价原子，例如1-25个多价原子或1-22个多价原子或1-15个多价原子或1-10个多价原子或1-5个多价原子，这些原子任选地选自碳、氮、氧和硫。下面提供了具有多达10个多价原子的取代基的说明。其他取代基，包括具有至多25个多价原子的取代基，是本领域普通技术人员已知的。
在一个实施例中，Ar1上的取代基含有0个多价原子。在该实施例中，与环原子键合的氢被另一个单价原子替换，例如氘、氟、氯、溴或碘。
在一个实施例中，Ar1上的取代基含有1个多价原子。在该实施例中，与Ar1的环原子键合的一个或多个氢原子被单个多价原子替换，其中多价原子上的开放价被一个或多个单价原子填充，例如羟基(OH)、巯基(SH)、氨基(NH2)、甲基(CH3)和亚甲基(＝CH2)，包括其完全或部分卤化和氘化的形式，例如CF3。
在一个实施例中，Ar1上的取代基含有2个多价原子。在该实施例中，与Ar1的环原子键合的一个或多个氢原子被第一多价原子替换，该第一多价原子进而与第二多价原子键合，因此提供由两个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放价被一个或多个单价原子填充。这些取代基的实例是本领域普通技术人员众所周知的。具体实例包括乙基(CH2CH3)、乙烯(CH＝CH2)、乙炔基(C≡CH)、亚乙基(＝CHCH3)、氨基甲基(CH2NH2)、氨基亚甲基(＝CHNH2)、硫亚甲基(＝CHSH)、羟基亚甲基(＝CHOH)、羟基甲基(CH2OH)、巯甲基(CH2SH)、N-甲基胺(NHCH3)、甲基硫(SCH3)、甲氧基(OCH3)、腈(CN)、甲酰基(C(O)H)、硫醛基(C(S)H)、N-羟基(N-OH)、羟胺(ONH2)、肼(N H2NH2)、二嗪(N＝NH)、重氮化合物(N≡N)，包括其完全或部分卤化和氘化的版本，例如OCF3和CH2CD3。
在一个实施例中，Ar1上的取代基含有3个多价原子。在该实施例中，与Ar1的环原子键合的一个或多个氢原子被第一多价原子替换，该第一多价原子进而直接或间接地与第二和第三多价原子中的每一个键合；因此，第一多价原子与第二多价原子键合，并且第三多价原子与第一和第二个多价原子中的一个或两个键合，从而提供由三个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放价被一个或多个单价原子填充。这些取代基的实例是本领域普通技术人员众所周知的并且在本文中提供，例如硝基、甲基酮、羧基。
在一个实施例中，Ar1上的取代基含有4个多价原子。在该实施例中，与Ar1的环原子键合的一个或多个氢原子被第一多价原子替换，该第一多价原子进而直接或间接地与第二、第三和第四多价原子中的每一个键合，因此提供由四个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放价被一个或多个单价原子填充。这些取代基的实例是本领域普通技术人员众所周知的并且在本文中提供，例如甲酯(CO2CH3)、N-甲基甲酰胺(C(O)NHCH3)和乙酰胺(NHC(O)CH3)。
在一个实施例中，Ar1上的取代基含有5个多价原子。在该实施例中，与Ar1的环原子键合的一个或多个氢原子被第一多价原子替换，该第一多价原子进而直接或间接地与第二、第三、第四和第五多价原子中的每一个键合，因此提供由五个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放价被一个或多个单价原子填充。这些取代基的实例是本领域普通技术人员众所周知的并且在本文中提供，例如乙基酯(CO2CH2CH3)、S-乙基硫代碳酸酯(C(O)SCH2CH3)、N-乙基甲酰胺(C(O)NHCH2CH3)和N，N-二甲基甲酰胺(C(O)N(CH3)2)。
在一个实施例中，Ar1上的取代基含有6个多价原子。在该实施例中，与Ar1的环原子键合的一个或多个氢原子被第一多价原子替换，该第一多价原子进而直接或间接地与第二、第三、第四、第五和第六多价原子中的每一个键合，因此提供由六个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放价被一个或多个单价原子填充。这些取代基的实例是本领域普通技术人员众所周知的并且在本文中提供，例如N-环丙基甲酰胺(C(O)NH-环丙基)、N-丙基甲酰胺(C(O)NHCH2CH2CH3)、N-(2-羟基乙基)甲酰胺(C(O)NHCH2CH2OH)和N-甲脒甲酰胺(C(O)NHC(＝NH)NH2)。
在一个实施例中，Ar1上的取代基含有7个多价原子。在该实施例中，与Ar1的环原子键合的一个或多个氢原子被第一多价原子替换，该第一多价原子进而直接或间接地与第二、第三、第四、第五、第六和第七多价原子中的每一个键合，因此提供由七个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放价被一个或多个单价原子填充。这些取代基的实例是本领域普通技术人员众所周知的并且在本文中提供，例如N-(正丁基)甲酰胺(C(O)NHCH2CH2CH2CH3)、N-(叔丁基)甲酰胺(C(O)NHC(CH3)3)、N，N-二乙基甲酰胺(C(O)N(CH2CH3)2)和N-环丁基甲酰胺(C(O)NH(环丁基))。
在一个实施例中，Ar1上的取代基含有8个多价原子。在该实施例中，与Ar1的环原子键合的一个或多个氢原子被第一多价原子替换，该第一多价原子进而直接或间接地与第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八多价原子中的每一个键合，因此提供由八个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放价被一个或多个单价原子填充。这些取代基的实例是本领域普通技术人员众所周知的并且在本文中提供，例如N-环戊基甲酰胺(C(O)NH(环戊基))、(哌啶-1-基)甲酮(C(O)-哌啶-1-基)和(吗啉-4-基)甲酮(C(O)-吗啉-4-基)。
在一个实施例中，Ar1上的取代基含有9个多价原子。在该实施例中，与Ar1的环原子键合的一个或多个氢原子被第一多价原子替换，该第一多价原子进而直接或间接地与第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和第九多价原子中的每一个键合，因此提供由九个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放价被一个或多个单价原子填充。这些取代基的实例是本领域普通技术人员众所周知的并且在本文中提供，例如二-(异丙基)酯(C(O)O(CH(CH3)2)2、二-(正丙基)酯(C(O)O(CH2CH2CH3)2)、N-环己基甲酰胺(C(O)NH(环己基))、(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮(C(O)(4-甲基哌嗪-1-基)、2-(乙酰基氨基)乙基甲酰胺(C(O)NHCH2CH2NHC(O)CH3)和N-苯基甲酰胺(C(O)NH(苯基))。
在一个实施例中，Ar1上的取代基含有10个多价原子。在该实施例中，与Ar1的环原子键合的一个或多个氢原子被第一多价原子替换，该第一多价原子进而直接或间接地与第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九和第十多价原子中的每一个键合，因此提供由十个多价原子形成的取代基，其中多价原子上的开放价被一个或多个单价原子填充。这些取代基的实例是本领域普通技术人员众所周知的并且在本文中提供，例如N-苄基甲酰胺(C(O)NHCH2(苯基))。
在一个实施例中，Ar1是经取代的芳基，其中Ar1上的至少一个取代基选自由卤素、羟基、硫醇、硝基和腈组成的组。
在一个实施例中，Ar1是经取代的芳基，其中Ar1上的至少一个取代基选自：卤素、-OH、-CN、-NO2、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6环烷基、-OR0、-CONH2、-C(O)NR1R1′、-NR1R1′、-NR1C(O)R3、-C(O)SR3、-COR3、-OC(O)R3、-C(O)OR3、硫醇、-R4-H、-SOR1、-S(O)2R1、-S(O)2NR1R1′和-NS(O)2R3；并且其中(a)R0在每次出现时独立地选自C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基和经取代或未经取代的杂芳基；(b)R1和R1′在每次出现时独立地选自H、羟基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳基烷基和经取代或未经取代的杂芳基、-C(＝NH)NH2、-CH2CO2R0、-CH2C(O)NHCH2CO2H、-CH2CH2OH、-CH2CH2NHC(O)R3、-CH2C(O)NHCH2CO2H、
Figure BDA0003485831380000491
Figure BDA0003485831380000492
(c)其中R1和R1′可以一起形成杂环，包括但不限于氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、
Figure BDA0003485831380000493
(d)R2在每次出现时独立地选自C2-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基和经取代或未经取代的卤代烷氧基；(e)R3在每次出现时独立地选自H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基和经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的卤代烷氧基和胍；(f)R4在每次出现时独立地选自被一个或多个杂原子间断的亚烷基，其中所述杂原子是O、S、NH或其组合。
在一个实施例中，Ar1是经取代的芳基，其中Ar1上的至少一个取代基选自由以下项组成的组：经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的芳基烷基、经取代或未经取代的杂芳基烷基、经取代或未经取代的卤代烷基和经取代或未经取代的卤代烷氧基。
Ar1基团将包括如本文所解释的芳香族部分，其中该芳香族部分可以任选地如本文所述的取代，该取代是除了被(三唑-Ar2)m基团取代之外的。在一个实施例中，Ar1的示例性取代基是卤化物(例如氟化物、氯化物和溴化物)、具有1-6个碳原子的烷基基团(例如甲基和乙基)、具有1-6个碳原子的卤代烷基基团(例如三氟甲基)、氰基、甲酰基和甲酰胺。在另一个实施例中，Ar1的示例性取代基是硝基(-NO2)、氰基(-CN)、甲酸(-COOH或其盐)、甲酰胺(-C(O)NH2)、C1-C6烷氧基(包括甲氧基)、C1-C6烷基(包括甲基)、C1-C6卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C6杂烷基(包括酰胺(例如-NHC(O)(C1-C6烷基)、-NHC(O)(C1-C6杂烷基)、-C(O)NH(C1-C6烷基)、-C(O)NH(C1-C6杂烷基)、-C(O)N(C1-C6烷基)(C1-C6烷基)、-C(O)N(C1-C6烷基)(C1-C6杂烷基)和-C(O)N(C1-C6杂烷基)(C1-C6杂烷基)，包括-NHC(O)CH3、C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-NHC(O)CH2CH3、C(O)NHCH2CH3、-C(O)N(CH3)CH2CH3、-C(O)N(CH2CH3)2、-C(O)NH(C1-C6环烷基)和-NHC(O)(C1-C6环烷基)(例如，C(O)NH(环丙基)、-NHC(O)-环丙基、C(O)NH(环己基)、NHC(O)-环己基)、C(O)NHCH2CH2CH2CH3、-C(O)NH(C(CH3)3)、-C(O)NH(CH2CH2OH))、酮(例如-C(O)(C1-C6烷基)(包括-C(O)CH3)、-C(O)(环烷基)(包括-C(O)-环己基和C(O)-(杂环烷基)，其中所述杂环烷基可以是例如吗啉基、哌啶基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基))、酯(例如-CO2-(C1-C6烷基)，包括-CO2CH3、-CO2CH2CH3、-CO2CH2CH2CH3、-CO2CH2(CH3)2)和硫酯(例如C(O)-S-(C1-C6烷基)，包括-C(O)-S-CH3和-C(O)-S-CH2CH3)。
在一个实施例中，Ar1是经取代的芳基，其中Ar1上的至少一个取代基选自由以下项组成的组：-O-(C1-6烷基)、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、-CO2-C1-6烷基、-CONH-C1-6烷基、-CONH2、CN；和-NO2。
当n是1或2时，式(I)化合物将包括连接基L。在一个实施例中，连接基L可以是直接键。在另一个实施例中，所述连接基不是直接键，而是一个或多个原子，特别是选自碳、氮、氧、硫的原子。在另一个实施例中，所述连接基可以是亚烷基基团(例如C1-C6亚烷基)或经取代的亚烷基。所述连接基可以是杂亚烷基连接基，其是指经取代的或非取代的亚烷基，其进一步包括至少一个选自氧、氮或硫的杂原子(例如，1、2、3或4个杂原子)，所述杂原子在和/或置于母链的一个或多个末端位置。在一个实施例中，L是长度为2至10个碳原子的杂亚烷基，其中一个或多个碳原子被至少一个选自氧、氮和硫的杂原子替换。在一个实施例中，L可以是具有至少一个N、O或S杂原子的杂亚烷基连接基，其中杂亚烷基可以是直链或环化的并且任选地经取代的，其中示例性取代基包括氧代、--OH、C1-4烷基和C1-4烷氧基。杂亚烷基连接基团的实例包括含有酰胺的杂亚烷基基团，例如-C(O)NH-亚烷基-和-C(O)NH-亚烷基-NHC(O)-，其中亚烷基任选地是C1-C6亚烷基。杂亚烷基基团的其他实例包括含有酯的杂亚烷基基团，例如-C(O)O-亚烷基-和-C(O)O-亚烷基-OC(O)-，其中在一个实施例中，亚烷基是未经取代的C1-C6亚烷基，且在另一个实施例中，亚烷基是经取代的C1-C6亚烷基。在一种实施例中，连接基是水解稳定的，因此当将PEM放入水中时它不会分解或降解或以其他方式破裂。
连接基L通常不需要太长；在一个实施例中其含有1至约25个原子(原子计数排除氢和卤素)，其中除了氢和卤素之外，连接基可以任选地由选自碳、氮、氧和硫的原子组成。在各种其他实施例中，连接基具有少于25个原子(不包括氢和卤素)，例如，它含有1至约20个原子或1至约15个原子或1至约10个原子或1至约5个原子，在每种情况下，从原子计数中排除氢和卤素，其中计数的原子可以任选地选自碳、氧、氮和硫。
在一个实施例中，式(I)化合物中的三唑环除了直接键合至Ar1和Ar2之外还可以被取代。一般而言，本公开的化合物可以任选地被描述为包括化学式
Figure BDA0003485831380000511
其中Ar1和Ar2在本文别处定义，并且M可以是氢(在这种情况下三唑环仅被Ar1和Ar2取代)、C1-C4烷基，或者M可以是卤化物取代基，例如氟化物、氯化物、溴化物或碘化物。在一个实施例中，本公开的化合物具有仅被Ar1和Ar2取代的三唑环，即，M是氢。在又另一个实施例中，本公开的化合物具有被Ar1、Ar2和C1-C4烷基取代的三唑环。在另一个实施例中，本公开的化合物具有被Ar1、Ar2和卤化物取代的三唑环。在另一个实施例中，本公开的化合物包括碘化物取代的三唑环，即，M是碘化物。在另一个实施例中，本公开的化合物在三唑环上具有M-取代基，其中M选自氢和碘化物。
因此，在一个实施例中，本公开提供了式
Figure BDA0003485831380000512
化合物，其中Ar1和Ar2在本文别处定义，并且M选自氢、C1-C4烷基和卤化物。任选地，如上所述，M可以是氢，或者在另一种选择中，M可以是例如卤化物，例如碘化物，如化合物4，4′-((吡啶-2，6-二基)双(5-碘-1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)所示。当如在上述结构中，本公开的化合物具有多于一个M-取代的三唑环时，M在每次出现时独立地选择。然而，在一个实施例中，M在本公开的化合物中每次出现时是相同的原子。例如，本公开提供了其中在每次出现M时M是氢的化合物。在另一个实例中，本公开提供了其中在每次出现M时M是碘化物的化合物。
式(I)化合物包括至少一个三唑-Ar2部分。在一个实施例中，本公开化合物包括两个或更多个三唑-Ar2部分，例如式
Figure BDA0003485831380000521
化合物。当本公开的化合物包括两个或多于两个的三唑-Ar2部分时，Ar2部分可以任选地在每次出现时具有相同的化学结构。然而，当本公开的PEM化合物含有多个三唑-Ar2部分时，在一个实施例中，这些Ar2部分不一定彼此相同，实际上它们可以不相同。Ar2部分可以在Ar2环原子方面和/或Ar2环原子上的取代方面彼此不同。例如，如果一个Ar2基团是苯基而另一个Ar2基团是吡啶基，则这两个Ar2基团在组成Ar2基团的环原子方面不同。作为另一个实例，如果两个Ar2基团都是苯基，但是一个苯基被羧基取代而另一个苯基被甲氧基取代，例如，4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯甲酸，则认为该化合物具有两个不同的Ar2基团。又另一个实例，两个Ar2基团可以是彼此的位置异构体，如当两个Ar2基团都是苯基，并且两个苯环都被羟基和羧基取代，但羟基和/或羧基基团在两个苯环上的位置不同时，例如，如果在一个苯环上，三唑位于相对于羧基基团的3位(间位)，而在另一个苯环上，三唑位于相对于羧基基团的4位(对位)，则两个Ar2基团被认为是位置异构体且不相同。在一个实施例中，Ar2环在本公开的化合物中在每次出现时在所有方面中都是相同的。在一个实施例中，Ar2环原子在Ar2每次出现时相同，但Ar2环上的取代在Ar2每次出现时不相同。在另一个实施例中，Ar2环原子在Ar2每次出现时不相同，并且Ar2环上的取代可以相同也可以不同。
式(I)化合物包括至少一个Ar2部分，其中在一个实施例中Ar2是选自苯基和吡啶基的单环芳香环，其可以任选地被取代。在一个实施例中，Ar2是单环6元芳香环，其中实例诸如苯基、吡啶基和吡嗪基，其中Ar2基团再次任选地包括环原子上的取代基。在另一个实施例中，Ar2是5元单环芳香环，其可以任选地被取代。在另一个实施例中，Ar2是5元或6元芳香环，其可以任选地被取代。在另一个实施例中，Ar2是包含稠合在一起的两个5元和/或6元单环的9元或10元稠合双环，其中两个单环中的至少一个是芳香环。在另一个实施例中，Ar2是包含稠合在一起的两个5元和/或6元单环的9元或10元稠合双环，其中两个单环都是芳香环。在一个实施例中，Ar2可以是这些选项中的任一种，即，Ar2选自(a)5元单环芳香环，(b)6元单环芳香环，(c)包含一个5元和一个6元单环稠合在一起的9元稠合双环，其中两个单环中的至少一个和任选的两个单环是芳香环，且(d)包含两个6元单环稠合在一起的10元稠合双环，其中两个单环中的至少一个和任选的两个单环是芳环，
在式(I)化合物中，任选地，Ar2是5元单环芳香环，其选自由以下项组成的组：噻吩、1，2-噻唑、1，3-噻唑、呋喃、1，2-噁唑、1，3-噁唑、1H-吡咯、1H-吡唑、噁二唑、噻二唑、1，2，4-三唑、1，2，3-三唑和1H-咪唑。
在式(I)化合物中，任选地，Ar2是选自苯、吡啶、哒嗪、嘧啶和吡嗪组成的组的6元单环芳香环。
在式(I)化合物中，任选地，Ar2是9元稠合双环芳香环体系，其选自由以下项组成的组：苯并呋喃、1，3-苯并噁唑、呋喃并[3，2-b]吡啶、呋喃并[3，2-c]吡啶、呋喃并[2，3-c]吡啶、呋喃并[2，3-b]吡啶、吲哚、1H-苯并咪唑、1H-吡咯并[3，2-b]吡啶、1H-吡咯并[3，2-c]吡啶、1H-吡咯并[2，3-c]吡啶、1H-吡咯并[2，3-b]吡啶、苯并噻吩、1，3-苯并噻唑、噻吩并[3，2-b]吡啶、噻吩并[3，2-c]吡啶、噻吩并[2，3-c]吡啶、苯并噁二唑、苯并噻二唑、苯并异噁唑、苯并三唑和噻吩并[2，3-b]吡啶。
在式(I)化合物中，任选地，Ar2是10元稠合双环芳香环体系，其选自由以下项组成的组：亚萘基、喹啉、喹唑啉、喹喔啉、1，5-萘啶、1，6-萘啶、1，7-萘啶、1，8-萘啶、异喹啉、酞嗪、2，6-萘啶和2，7-萘啶。
如上所述，本公开的化合物包括至少一个Ar2基团，其中Ar2基团包括至少一个芳香环并且任选地在芳香环上包括一个或多个取代基。在一个实施例中，Ar2在芳香环上包括至少一个，即一个或多个取代基，例如1-5或1-4或1-3或1-2个取代基。任选地，Ar2在芳香环上恰好包括一个取代基。在另一种选择中，Ar2在芳香环上恰好包括两个取代基。在又另一种选择中，Ar2在芳香环上恰好包括三个取代基。在进一步的选择中，Ar2在芳香环上恰好包括四个取代基。在一个任选的实施例中，Ar2在芳香环上包括两个或更多个取代基。
在一个实施例中，Ar2的环原子上的一个或多个取代基选自任选地命名为“G”的取代基，其中所述取代基选自卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-E-CO2H、-E-CHO、-E-C(O)R3、-E-C(O)NH(OH)、-E-C(O)NHR1、-E-CONR1R1′、-E-NR1R1′和-E-OR2；其中(a)E选自直接键和C1-C6亚烷基；(b)R0在每次出现时独立地选自C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基和经取代或未经取代的杂芳基；(c)R1和R1′在每次出现时独立地选自H、羟基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳基烷基和经取代或未经取代的杂芳基、-C(＝NH)NH2、-CH2CO2R0、-CH2C(O)NHCH2CO2H、-CH2CH2OH、-CH2CH2NHC(O)R3、-CH2C(O)NHCH2CO2H、
Figure BDA0003485831380000541
Figure BDA0003485831380000542
(d)其中R1和R1′可以一起形成杂环，包括但不限于氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、
Figure BDA0003485831380000543
(e)R2在每次出现时独立地选自C2-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基和经取代或未经取代的卤代烷氧基；(f)R3在每次出现时独立地选自H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基和经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的卤代烷氧基、和胍。
在一个实施例中，Ar2上的取代包括氨基(-NH2)。在一个实施例中，Ar2上的取代包括烷氧基，例如C1-C6烷氧基。例如，在一个实施例中，Ar2上的取代包括甲氧基。在一个实施例中，Ar2上的取代包括甲酸或亚烷基-甲酸。例如，在一个实施例中，式(I)的PEM化合物在Ar2上的取代包括甲酸。在一个实施例中，Ar2上的取代包括甲酸酯，或亚烷基-甲酸酯。例如，在一个实施例中，式(I)的PEM化合物在Ar2上的取代包括-CH2-CO2-CH3。在一个实施例中，Ar2上的取代包括卤代烷基基团，例如C1-C6卤代烷基基团。例如，在一个实施例中，式(I)的PEM化合物在Ar2上的取代包括三氟甲基。在一个实施例中，Ar2上的取代包括羟基或羟基-取代的烷基，例如羟基-取代的C1-C6烷基。例如，在一个实施例中，式(I)化合物在Ar2上的取代包括羟基(-OH)。
在一个实施例中，Ar2上的取代包括选自甲酸和亚烷基-甲酸的一个基团(例如，C1-C6亚烷基-甲酸)和选自羟基和羟基-取代的烷基的另一个基团(例如，被一个羟基取代的C1-C6烷基)。例如，在一个实施例中，Ar2上的取代是或包括一个甲酸或一个羟基。
在一个实施例中，Ar2上的取代包括选自甲酸和亚烷基-甲酸的一个基团(例如C1-C6亚烷基-甲酸)和选自卤代烷基的一个基团(例如C1-C6卤代烷基)。例如，在一个实施例中，Ar2上的取代是或包括一个甲酸基团和一个三氟甲基基团。
在一个实施例中，Ar2上的取代包括选自羟基和羟基-取代的烷基的一个基团(例如被羟基取代的C1-C6烷基)和选自卤代烷基的另一个基团(例如C1-C6卤代烷基)。例如，在一个实施例中，Ar2上的取代是或包括一个羟基基团和一个三氟甲基基团。
在一个实施例中，式(I)的Ar2环上的取代包括至少以下之一：a)甲酸和亚烷基-甲酸，例如C1-C6亚烷基-甲酸；b)羟基和羟基-取代的烷基，例如被一个羟基取代的C1-C6烷基；和c)卤代烷基，例如C1-C6卤代烷基。例如，甲酸、羟基和三氟甲基中的至少一个。
在一个实施例中，式(I)的Ar2环上的取代包括以下中的至少两个：a)甲酸和亚烷基-甲酸，例如C1-C6亚烷基-甲酸；b)羟基和羟基-取代的烷基，例如被一个羟基取代的C1-C6烷基；和c)卤代烷基，例如C1-C6卤代烷基。例如，甲酸、羟基和三氟甲基中的至少两个。
在一个实施例中，式(I)的Ar2环上的取代包括以下三个全部：a)甲酸和亚烷基-甲酸，例如C1-C6亚烷基-甲酸；b)羟基和羟基-取代的烷基，例如被一个羟基取代的C1-C6烷基；和c)卤代烷基，例如C1-C6卤代烷基。即，Ar2可以被甲酸、羟基和三氟甲基取代。
例如，在一个实施例中，Ar2基团是选自以下中的经取代的苯基：
Figure BDA0003485831380000561
在一个实施例中，Ar2基团为经取代的苯基，其中苯基基团的取代基是进一步被G2、G3、G4和G5取代的芳基，并且在更具体的实施例中，苯基基团的取代基是进一步被G2、G3、G4和G5取代的苯基，例如进一步被G2或被G2和G3取代的苯基。
如上所述，在一个实施例中，本公开的PEM化合物可以在Ar2上具有羟基和甲酸取代。这两个基团可能位于Ar2环上的不同位置。例如，在一个实施例中，本公开提供了由下式描述的式(I)PEM化合物：
Figure BDA0003485831380000562
在又另一个实施例中，本公开的式(I)PEM化合物在Ar2上具有羟基和甲酸取代，如下式提供的：
Figure BDA0003485831380000563
在又另一个实施例中，本公开的式(I)PEM化合物在Ar2上具有羟基和甲酸取代，如下式所示：
Figure BDA0003485831380000564
在一个实施例中，本公开的式(I)PEM化合物在Ar2上至少具有羟基和羧基取代，并且可以在Ar2上具有其他取代。例如，Ar2可以被羟基、甲酸和烷基，例如C1-C6烷基取代，以提供例如下式的化合物：
Figure BDA0003485831380000571
如前所述，在一个实施例中，本公开的式(I)PEM化合物可以在Ar2上具有卤代烷基和甲酸取代，而不是如以上结构中所示的羟基和甲酸。作为一个实例，本公开的PEM化合物可以由下式描述：
Figure BDA0003485831380000572
式(I)的PEM化合物包括溶剂化物，包括其水合物、螯合物和盐形式。在一些情况下，PEM化合物可以是无定形的，而在其他情况下，PEM化合物可以是结晶的。此外，所述化合物的一些结晶形式可以以多晶型物的形式存在，这也在本文中被考虑。此外，一些化合物也可能与水或其他有机溶剂形成溶剂化物。此类溶剂化物类似地包括在本文所述的化合物的范围内。
式(I)的PEM化合物可以为螯合物的形式，例如铜螯合物。铜螯合物可通过将本公开的PEM化合物与硫酸铜结合而形成。取决于Ar1和Ar2基团上的取代基，式(I)的PEM化合物可以是盐(酸加成盐或碱加成盐)的形式。
PEM结构包括其所有稳定的立体异构形式。因此，本文所述的PEM化合物可以具有一个或多个手性(或不对称)中心，因此可以产生对映体、非对映体和其他可以根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-的立体异构形式。当本文所述的化合物含有烯键式双键或其它几何不对称中心时，除非另有说明，否则旨在表示这些化合物同时包含E和Z几何异构体两者(例如，顺式或反式)。同样，除非另有说明，所有可能的异构体，以及它们的外消旋和旋光纯形式，并且也旨在包括所有互变异构形式。因此预期各种立体异构体及其混合物包括“对映体”，其是指其分子是彼此不可重叠的镜像的两种立体异构体。因此，化合物可以任何异构形式存在，包括外消旋物、外消旋混合物以及作为单独的对映体或非对映体存在。
本公开的PEM化合物通常是水溶性的。水溶性的一种度量是化合物的logP值。LogP值可以使用商业软件基于化合物的化学结构计算。例如，CHEMDRAW化学绘图软件(Cambridgesoft Limited，PerkinElmer Holdings的子公司)可以计算绘制的化学结构的logP值。在一个实施例中，本公开的PEM化合物具有至少4.9的logP。
本公开的化合物，例如如上所述的式(I)的PEM化合物，通常可以通过式Ar1(C≡CH)2的二乙炔基化合物与式Ar2-N3的叠氮化物化合物在Cu(I)催化剂存在下反应来合成。还参见Crowley J.D.，McMorran D.A.(2012)“Click-Triazole”Coordination Chemistry：Exploiting 1，4-Disubstituted-1，2，3-Triazoles as Ligands.In：
Figure BDA0003485831380000581
J.(编辑)Click Triazoles.Topics in Heterocyclic Chemistry，第28卷.Springer，Berlin，Heidelberg doi.org/10.1007/7081_2011_67。
特定的和类似的反应物也可以通过美国化学学会化学文摘服务编制的已知化学品的索引来识别，这些索引可在大多数公共和大学图书馆中获得，以及通过在线数据库获得(可以联系华盛顿特区美国化学学会，以获取更多详细信息)。已知但未在目录中可商购的化学品可由定制化学合成公司制备，其中许多标准化学品供应公司(例如，上面列出的那些)提供定制合成服务。本公开的药用盐的制备和选择的参考文献是P.H.Stahl&C.G.Wermuth″Handbook of Pharmaceutical Salts，″Verlag Helvetica Chimica Acta，Zurich，2002。
式Ar1(C≡CH)化合物可从例如TCI America(美国俄勒冈州波特兰)商购获得，其销售例如1，3-二乙炔基苯、1，4-二乙炔基苯、2，6-二乙炔基吡啶和3，6-二乙炔基咔唑。
通常，乙炔基芳香族化合物可以使用可从MilliporeSigma Corp.(美国密苏里州圣路易斯)获得的(重氮甲基)膦酸二甲酯由芳基醛经由Seyferth-Gilbert同系化反应制备。可替代地，可以从1-重氮-2-氧代丙基膦酸二甲酯(Ohira-Bestmann试剂)原位生成(重氮甲基)膦酸二甲酯。参见例如，Seyforth等人.，J.Org.Chem.36(10)：1379-1386(1971).doi：10.1021/j000809a014和Bestman等人.，Synlett.1996(06)：521-522(1996).doi：10.1055/s-1996-5474。
另一种制备乙炔基芳香族化合物的途径是在钯催化剂存在下使卤代芳香族化合物与(叔丁基二甲基甲硅烷基)乙炔进行Sonogashira偶联。乙炔基芳香族在随后脱保护甲硅烷基时形成。参见例如，Sonogashira，Organomet.Chem.，653：46-49(2002).doi：10.1016/s0022-328x(02)01158-0。
以下反应(I)、(II)和(III)说明了二乙炔基芳香族化合物的示例性制备。在反应(I)中，2，6-二溴吡啶-4-胺转化为相应的2，6-二乙炔基吡啶-4-胺化合物。在反应(II)中，2，6-二碘-4-硝基苯胺转化为相应的2，6-二乙炔基-4-硝基苯胺。在反应(III)中，2-羟基-3，5-二碘苯甲酸转化为相应的3，5-二乙炔基-2-羟基苯甲酸。在每种情况下，转化都通过中间体二三甲基甲硅烷基(TMS)化合物进行，如图所示。
Figure BDA0003485831380000591
这些反应产物中的每一种，即2，6-二乙炔基吡啶-4-胺和2，6-二乙炔基-4-硝基苯胺和3，5-二乙炔基-2-羟基苯甲酸，都可以作为制备本公开的PEM中Ar1的前体。因此，它们中的每一个代表Ar1(C≡CH)2化合物，其可以在Cu(I)催化剂存在下与式Ar2-N3的叠氮化物化合物反应以提供PEM。反应(I)、(II)和(III)说明了本公开的经取代的Ar1部分的前体的制备。
式Ar2-N3化合物同样也是可商购的，例如，可购自TCI America(美国俄勒冈州波特兰)、Synthonix(美国北卡罗来纳州维克森林)、SigmaAldrich(美国密苏里州圣路易斯)、Toronto Research Chemicals(加拿大多伦多)和AnaSpec(美国加利福尼亚州费利蒙市)。通常，式Ar2-N3的叠氮化物可以通过用叠氮化钠对亲电子化合物例如烷基、苄基或烯丙基碘或烯丙基溴进行亲核置换来制备。
一般而言，本文所述的反应中使用的化合物可根据本领域技术人员已知的有机合成技术从可商购化学品和/或从化学文献中所述的化合物开始制备。“可商购的化学品”可以获得自来自以下中的标准商业来源：Across Organics(宾夕法尼亚州匹兹堡)、AldrichChemical(威斯康星州密尔沃基市，包括Sigma Chemical and Fluka)、Apin ChemicalsLtd(英国米尔顿庄园)、Avocado Research(英国兰开夏郡)、BDH Inc.(加拿大多伦多)、Bionet(英国康沃尔郡)、Chemservice Inc.(宾夕法尼亚州威彻斯特)、Crescent ChemicalCo.(纽约州霍波格)、Eastman Organic Chemicals、Eastman Kodak Company(纽约州罗契斯特市)、Fisher Scientific Co.(宾夕法尼亚州匹兹堡)、Fisons Chemicals(英国莱斯特郡)、Frontier Scientific(犹他州洛根)、ICN Biomedicals，Inc.(加利福尼亚州科斯塔梅萨)、Key Organics(英国康沃尔郡)、Lancaster Synthesis(新罕布什尔州温德汉姆)、Maybridge Chemical Co.Ltd.(英国康沃尔郡)、Parish Chemical Co.(犹他州奥瑞姆)、Pfaltz&Bauer，Inc.(康涅狄格州沃特伯里)、Polyorganix(德克萨斯州休斯敦)、PierceChemical Co.(伊利诺州罗克福德)、Riedel de Haen AG(德国汉诺威市)、SpectrumQuality Product，Inc.(新泽西州新布伦瑞克)、TCI America(奥勒冈州波特兰)、TransWorld Chemicals，Inc.(马里兰州罗克维尔市)和Wako Chemicals USA，Inc.(弗吉尼亚州里士满)。
在一个实施例中，本公开的PEM化合物，例如式(I)的PEM化合物存在于组合物中。例如，本公开的PEM化合物可以存在于还包含水性缓冲剂的组合物中。在一个实施例中，本公开的PEM化合物存在于包含生物分子(例如多肽和/或多核苷酸)的组合物中。多肽可以是酶，例如DNA聚合酶。以下定义可能有助于理解这些组合物及其某些用途。
如本文所用，“核酸”，也称为多核苷酸，是共价连接的一连串核苷酸，其中一个核苷酸的戊糖的3’位置通过磷酸二酯基团连接到下一个的5’位置。核酸分子可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或两者的组合。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是生物存在的多核苷酸，其中核苷酸残基通过磷酸二酯键以特定序列连接。如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”或“寡核苷酸”包括具有核苷酸的线性主链的任何聚合物化合物。寡核苷酸，也称为寡聚物，通常是较短的链状多核苷酸。如果被靶向用于测序，核酸通常被称为“靶核酸”或“靶序列”。
如本文所用，术语“模板依赖性方式”旨在指涉及引物分子的模板依赖性延伸的过程(例如，通过DNA聚合酶合成DNA)。术语“模板依赖方式”是指RNA或DNA的多核苷酸合成，其中新合成的多核苷酸链的序列由众所周知的互补碱基配对规则决定(参见，例如，Watson，J.D.等人，In：Molecular Biology of the Gene，4th Ed.，W.A.Benjamin，Inc.，MenloPark，Calif.(1987))。
如本文所用，“核酸聚合酶”是通常用于连接3′-OH 5′-三磷酸核苷酸、寡聚物和其类似物的酶。聚合酶包括但不限于DNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶、RNA依赖性RNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、T3 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、DNA聚合酶1、Klenow片段、嗜热菌DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、
Figure BDA0003485831380000611
DNA聚合酶(New England Biolabs)、Deep
Figure BDA0003485831380000612
DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)、Bst DNA聚合酶大片段、Stoeffel片段、90 N DNA聚合酶、90 N DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、RepliPHI Phi29聚合酶、Tli DNA聚合酶、真核DNA聚合酶β、端粒酶、TherminatorTM聚合酶(New England Biolabs)、KOD HiFiTMDNA聚合酶(Novagen)、KOD1DNA聚合酶、Q-β复制酶、末端转移酶、AMV逆转录酶、M-MLV逆转录酶、Phi6逆转录酶、HIV-1逆转录酶。根据本发明的聚合酶可以是变体、突变体或嵌合聚合酶。
如本文所用，“DPO4-型DNA聚合酶”是由古细菌、硫化叶菌天然表达的DNA聚合酶或相关Y家族DNA聚合酶，其通常通过称为跨损伤合成(TLS)的过程在受损DNA的复制中起作用。Y家族DNA聚合酶与DPO4聚合酶同源；实例包括原核酶PolII、PolIV、PolV、古细菌酶Dbh和真核酶Rev3p、Rev1p、Polη、REV3、REV1、Pol
Figure BDA0003485831380000613
和PolK DNA聚合酶，及其嵌合体。修饰的重组DPO4型DNA聚合酶包括相对于天然存在的野生型DPO4型DNA聚合酶的一个或多个突变，例如，增加了利用大核苷酸类似物作为底物或另一种聚合酶特性的能力的一个或多个突变，并且可以包括对野生型DPO4型DNA聚合酶的附加改变或修饰，例如一个或多个缺失、插入和/或附加肽或蛋白质序列的融合(例如，用于将聚合酶固定在表面上或以其他方式标记聚合酶)。根据本发明的变体聚合酶的实例是在已公开的PCT专利申请WO2017/087281 A1和PCT专利申请号PCTUS2018/030972和PCTUS2018/64794中描述的硫化叶菌DPO4的变体，这些专利通过引用以其整体并入本文。
如本文所用，“核酸聚合酶反应”是指以依赖模板的方式制备新的核酸链或延长现有核酸(例如，DNA或RNA)的体外方法。根据本发明，核酸聚合酶反应包括引物延伸反应，其导致核苷酸或核苷酸类似物掺入引物的3’末端，使得掺入的核苷酸或核苷酸类似物与靶多核苷酸的相应核苷酸互补。核酸聚合酶反应的引物延伸产物可进一步用于单分子测序或作为模板以合成附加的核酸分子。
引物延伸反应试剂通常包括(i)聚合酶；(ii)缓冲剂；和(iii)一种或多种可延伸的核苷酸或核苷酸类似物。引物延伸反应可用于在特定实验条件下测量所得核酸产物的长度，并通过(例如借助凝胶电泳)比较延伸引物产物的长度来确定各种聚合酶反应添加剂(例如PEM)对聚合酶活性的影响。
如本文所用，“增强核酸聚合酶反应”是指添加剂(例如PEM)使核酸聚合酶能够合成引物延伸产物的长度比不存在PEM时长至少一个亚单位的能力。
如本文所用，核酸聚合酶反应的速率是指核酸聚合酶延伸聚合物链的平均速度。如本文所用，术语“速度”和“伸长率”可互换使用。Hogrefe等人的核苷酸掺入测定(Methodsin Enzymol.Vol.334，pp.91-116(2001))可用于测量聚合速率。简而言之，聚合酶活性可以通过32P-dCTP掺入活化的鲑鱼精子DNA(购自Pharmacia；激活方案参见，Procedures inNucl.Acid Res.(Cantoni和Davies编辑)，p.263-276(1966)at p.264)来测量。反应缓冲剂可以是例如50mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇(DTT)、50μg/ml牛血清白蛋白(BSA)和4％(v/v)甘油。大量使用核苷酸底物和DNA，通常至少是被检测聚合酶Km的10倍，例如，dATP、dTTP和dGTP各200μM，195μM dCTP加上5μIM标记的dCTP，以及250μg/ml活化的DNA。在冰上猝灭反应，并将反应混合物的等分试样点在离子交换过滤器(例如，WhatmanDE81)上。洗涤未掺入的核苷酸，然后闪烁计数以测量掺入的放射性。
如本文所用，“增加速率”是指与缺少如本文所定义的增加速率的PEM的聚合反应相比增加5％-10％、10％-50％或50％-100％或更多。
如本文所用，“持续合成能力”是指核酸聚合酶在聚合酶与其模板之间的单次接触期间聚合的程度，即其继续作用于底物而不是从底物解离的特性。聚合程度是指在聚合酶与其模板的单次接触期间由聚合酶添加的核苷酸或核苷酸类似物的数量。持续合成能力取决于聚合酶的性质、模板的序列、核苷酸或核苷酸类似物底物的结构和反应条件，例如盐浓度、温度或特定添加剂的存在。
如本文所用，“增加持续合成能力”是指与缺少如本文所定义的增加持续合成能力的PEM的聚合反应相比增加5％-10％、10％-50％或50％-100％或更多。用于测量核酸聚合酶的持续合成能力的方法是本领域公知的，例如，如Sambrook等人.1989，InMolecularCloning，2nd Edition，CSH Press，7.79-7.83 and 13.8所述，如美国公开专利申请号2002/0119467，公开PCT申请号WO01/92501和美国专利号5,972,603中所述，它们的全部内容以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“保真度”是指通过模板依赖性核酸聚合酶的核酸聚合的准确性。DNA聚合酶的保真度通过错误率(掺入不准确核苷酸的频率，即未以模板依赖性的方式掺入的核苷酸)来测量。DNA聚合酶的保真度或错误率可以使用本领域已知的测定来测量(参见例如Lundburg等人，1991 Gene，108：1-6)。如本文所用，“增加保真度”是指与缺少如本文所定义的增加保真度的添加剂的聚合反应相比增加5％-10％、10％-50％或50％-100％或更多。
如本文所用，术语“多个”是指“至少两个”。
“XNTP”是与模板依赖性酶促聚合相容的可扩展的、5’三磷酸修饰的核苷酸底物。XNTP有两个不同的功能组分；即，核碱基5′-三磷酸氨基酯和连接在每个核苷三磷酸氨基酯中的系链，其位置允许通过氨基磷酸酯键的核苷酸内切割来控制扩展。如本文所用，XNTP是示例性的“非天然、高度取代的核苷酸类似物底物”。示例性的XNTP及其制造方法描述于例如申请人公开的PCT申请号WO2016/081871，其全文以引用方式并入本文。
“Xpandomer中间体”是由XNTP组装的中间产物(在本文中也称为“子链”)，并且是使用靶核酸模板通过XNTP的聚合酶介导的模板导向组装形成。新合成的Xpandomer中间体是受约束的Xpandomer。在由XNTP提供的氨基磷酸酯键被切割的工艺步骤下，受约束的Xpandomer不再受约束，并且是随着系链的伸展而延伸的Xpandomer产物。
“Xpandomer”或“Xpandomer产物”是通过受约束的Xpandomer扩增产生的合成分子构建体，其本身通过XNTP底物的模板导向组装来合成。Xpandomer相对于产生它的靶模板被拉长。它由亚单位串联组成，每个亚单位是一个基序，每个基序是文库的成员，包括序列信息、系链和任选的部分或全部底物，所有这些都来自形成性底物构建体。Xpandomer被设计成扩展到比靶模板更长，从而降低靶模板的序列信息沿其长度的线性密度。此外，Xpandomer任选地提供了一个用于增加报告子的尺寸和丰度的平台，从而提高检测的信噪比。较低的线性信息密度和较强的信号提高了分辨率并降低了检测和解码模板链序列的灵敏度要求。
“系链”或“系链成员”是指具有大体线性尺寸并且在两个相对末端的每一个处具有末端部分的聚合物或分子构建体。系链通过在末端部分的键连接到核苷三磷酸酯以形成XNTP。键用于将系链约束在“受约束构型”中。系链具有“受约束构型”和“扩展构型”。受约束构型见于XNTP和子链或Xpandomer中间体中。系链的受约束构型是扩展构型的前体，如Xpandomer产物中所见。从受约束构型到扩展构型的转变导致可选择性切割的氨基磷酸酯键的切割。系链包含一个或多个沿其长度的可以编码底物的序列信息的报告子或报告子构建体。系链提供了一种方法来扩展Xpandomer的长度，从而降低序列信息的线性密度。
“系链元件”或“系链链段”是具有两个末端的大体线性尺寸的聚合物，其中末端形成用于连接系链元件的末端键。系链元件是系链的链段。此类聚合物可包括但不限于：聚乙二醇、聚二醇、聚吡啶、聚异氰化物、聚异氰酸酯、聚(三芳基甲基)甲基丙烯酸酯、聚醛、聚吡咯烷酮、聚脲、聚乙二醇磷酸二酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯酯、聚苯乙烯、聚酰胺、聚氨酯、聚碳酸酯、聚丁酸酯、聚丁二烯、聚丁内酯、聚吡咯烷酮、聚乙烯膦酸酯、聚乙酰胺、多糖、聚透明质酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸酯、聚硅烷、聚氨酯、聚醚、聚氨基酸、聚甘氨酸、聚脯氨酸、N-取代的聚赖氨酸、多肽、侧链N-取代的肽、聚-N-取代的甘氨酸、类肽、侧链羧基取代的肽、同型肽、寡核苷酸、核糖核酸寡核苷酸、脱氧核酸寡核苷酸、被修饰以防止Watson-Crick碱基配对的寡核苷酸、寡核苷酸类似物、聚胞苷酸、聚腺苷酸、聚尿苷酸、聚胸苷、聚磷酸酯、多核苷酸、多核糖核苷酸、聚乙二醇-磷酸二酯、肽多核苷酸类似物、苏氨酸-多核苷酸类似物、乙二醇-多核苷酸类似物、吗啉代-多核苷酸类似物、锁核苷酸寡聚物类似物、多肽类似物、分支聚合物、梳形聚合物、星形聚合物、树枝状聚合物、无规聚合物、梯度和嵌段共聚物、阴离子聚合物、阳离子聚合物、形成茎环的聚合物、刚性链段和柔性链段。
“报告子”由一个或多个报告者元件组成。报告子用于分析靶核酸的遗传信息。
“报告子构建体”包含一个或多个可产生可检测信号的报告子，其中可检测信号通常包含序列信息。该信号信息被称为“报告子代码”，随后被解码为基因序列数据。报告子构建体还可包含系链链段或其他结构组分，包括聚合物、接枝共聚物、嵌段共聚物、亲和配体、低聚物、半抗原、适体、树枝状聚合物、连接基团或亲和结合基团(例如，生物素)。
“报告子代码”是来自报告子构建体的测量信号的遗传信息。报告子代码被解码以提供序列特异性遗传信息数据。
因此，在一个实施例中，本公开提供了一种包含如本文公开的PEM和缓冲剂的组合物。在另一个实施例中，本公开提供了包含如本文公开的PEM和多种核苷酸和/或核苷酸类似物的组合物。在另一个实施例中，本公开提供了包含如本文公开的PEM和多核苷酸的组合物。在另一个实施例中，本公开提供了包含如本文公开的PEM和蛋白质的组合物，其中任选地该蛋白质是聚合酶，包括上述任何聚合酶。
在一个实施例中，本公开提供了一种组合物，其包含本公开的PEM化合物(例如式(I)的PEM化合物)和分子拥挤剂。一般而言，分子拥挤剂包括一系列大的中性聚合物。有用的分子拥挤试剂的实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚蔗糖、葡聚糖或聚乙烯醇。示例性分子拥挤试剂和配制品在美国专利号7,399,590中所述，其通过引用并入本文。在一个实施例中，分子拥挤剂是聚亚烷基二醇，任选地具有4,000-10,000的数均分子量。在一个实施例中，分子拥挤剂是聚亚烷基乙二醇的衍生物，例如，聚亚烷基二醇的末端羟基之一或两个是酯基或醚基的形式。在一个实施例中，分子拥挤剂是一种惰性水溶性聚合物。
在一个实施例中，本公开提供了一种包含本公开的PEM化合物和水性缓冲剂的组合物。在一个实施例中，PEM化合物具有式(I)。在一种选择中，组合物具有约6至8.5的pH，并且缓冲剂有助于稳定组合物的pH。示例性缓冲剂是Tris HCl。其他合适的缓冲剂包括本领域已知的那些，例如磷酸盐缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、乙酸钠缓冲剂、碳酸钠缓冲剂等。
在一个实施例中，本公开提供了一种组合物，其包含本公开的PEM化合物(例如式(I)的PEM化合物)和多核苷酸。在一种选择中，多核苷酸是单链的，例如单链DNA或单链RNA。当多核苷酸旨在用作引物时，多核苷酸是单链DNA分子。当旨在用作引物时，多核苷酸可具有约10-60mer寡核苷酸的长度，例如20-30个寡核苷酸。多核苷酸可替代地用作模板，在这种情况下它可以是单链DNA或单链RNA，并且可以具有从30个碱基到千碱基及以上值的长度，例如10k碱基及以上。
在一个实施例中，本公开提供了一种组合物，其包含本公开的PEM化合物(例如式(I)的PEM化合物)和蛋白质。例如，蛋白质可以是酶、核酸聚合酶、DNA聚合酶。合适的DNA聚合酶的一个实例是如本文所讨论的DPO4聚合酶的变体。
在一个实施例中，本公开提供了一种组合物，其包含至少一种本公开的PEM化合物，例如式(I)的PEM化合物，以及核苷酸或核苷酸类似物的混合物，其中相对于不存在至少一种化合物的相同聚合反应，所述至少一种化合物增加了在依赖模板的聚合反应期间掺入子链的核苷酸类似物的数量和准确性。任选地，所述核苷酸类似物的混合物包括核苷三磷酸氨基酯，其中每个核苷三磷酸氨基酯具有选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的核碱基和聚合物系链部分，其中聚合物系链部分的第一末端连接到核碱基，聚合物系链部分的第二末端连接到核苷三磷酸氨基酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割提供核苷酸类似物的扩展。任选地，所述组合物进一步包括包含以下一种或多种的缓冲剂：Tris OAc、NH4OAc、PEG、水混溶性有机溶剂(例如二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或丙酮)、多磷酸盐60、NMS和MnCl2。任选地，所述组合物还包括单链结合蛋白。任选地，所述组合物包括脲。任选地，核苷酸类似物的混合物包括包含可检测标记物的核苷酸类似物，其中可检测标记物任选地是发光、化学发光、发荧光、荧光、发色或生色之一。在一个实施例中，组合物包括这些选项中的两个或更多个，例如，所有这些选项。
在本公开的一方面，本文公开的PEM及其组合物可用于增强核酸聚合反应或改善所得核酸的性质，例如反应产物的长度或准确性。聚合反应包括例如引物延伸反应、PCR、诱变、等温扩增、DNA测序和探针标记。此类方法在本技术领域中是众所周知的。可以通过诸如增加聚合酶的持续合成能力(即减少聚合酶与模板的解离)、增加底物结合或酶催化的速率以及增加核苷酸掺入的准确性或保真度等机制刺激核苷酸掺入来提供增强。此外，可以通过减少核酸模板中的障碍(例如二级结构和双链体DNA)来提供增强。通过添加PEM克服或改善这些障碍可以使聚合反应更准确或有效地发生，或者允许使用较低的变性/延伸温度或等温温度。
在一些实施例中，PEM可以与另一种添加剂类别组合使用以增强聚合酶反应。一类示例性的添加剂是小沟结合蛋白(MGB)。在一个实施例中，MGB选自由以下组成的组：偏端霉素A及其合成类似物、纺锤菌素、(+)-CC-1065、倍癌霉素、吡咯并苯二氮卓类、trabectin及其类似物、Hoechst染料及其衍生物、lexitropsin、thiazotropsin A、二脒和聚酰胺。在某些实施例中，所述至少一个小沟结合部分是Hoechst染料。有关使用MGB增强聚合酶反应的更多信息，请参见申请人共同提交的名为ENHANCEMENT OF NUCLEIC ACID POLYMERIZATIONBY MGBS的申请。
可以用PEM增强的一种示例性聚合酶反应是称为“XNTP”的非天然核苷酸类似物的聚合，其构成了由Stratos Genomics开发的“扩展测序”(SBX)方案的基础(参见，例如，Kokoris等人，美国专利号7,939,259，″High Throughput Nucleic Acid Sequencing byExpansion″)。一般而言，SBX使用这种生化聚合将DNA模板的序列转录到称为“Xpandomer”的可测量聚合物上。转录的序列沿Xpandomer主链在高信噪比报告子中编码，所述报告子相隔约10nm，专为高信噪比、分化良好的反应而设计。这些差异在Xpandomer相对于天然DNA的序列读取效率和准确性方面提供了显著的性能增强。SBX过程的概述在图lA、图1B、图1C和图1D中描述。
XNTP是与模板依赖性酶促聚合相容的可扩展的、5’三磷酸修饰的核苷酸底物。高度简化的XNTP在图1A中示出，其强调了这些核苷酸类似物的独特特征：XNTP 100具有两个不同的功能区；即：可选择性切割的氨基磷酸酯键110，将5’α-磷酸115连接到核碱基105；以及连接在核苷三磷酸氨基酯内的某些位置处的系链120，该位置允许通过氨基磷酸酯键的核苷酸内切割来控制扩展。XNTP的系链包含被可选择性切割的氨基磷酸酯键分开的连接臂部分125A和125B。每个连接基通过连接基团(LG)连接到报告子130的一端，如公开于Kokoris等人的美国专利号8,324,360，其通过引用以其整体并入本文。XNTP 100以“受约束构型”说明，这是XNTP底物和聚合后子链的特征。聚合XNTP的受限构型是扩展构型的前体，如Xpandomer产物中所见。从受限构型到扩展构型的转变发生在子链的主要主链内的氨基磷酸酯的P-N键断裂时。
Xpandomer的合成总结在图1B和图1C中。在组装期间，单体XNTP底物145(XATP、XCTP、XGTP和XTTP)通过使用单链模板140作为向导的模板导向聚合过程在新生子链150的可延伸末端聚合。通常，该过程从引物开始并沿5′到3′方向进行。通常，使用DNA聚合酶或其他聚合酶来形成子链，并且选择条件以便获得模板链的互补拷贝。在合成子链之后，偶联的系链包含进一步包含子链的受约束Xpandomer。子链中的系链具有XNTP底物的“受约束构型”。系链的受约束构型是扩展构型的前体，如Xpandomer产物中所见。
如图1C所示，从受约束的构型160到展开的构型165的转变是由于子链的主要主链内可选择性切割的氨基磷酸酯键(为简单起见用无阴影椭圆表示)的切割引起的。在该实施例中，系链包含一个或多个对它们所连接的核碱基具有特异性的报告子或报告子构建体，130A、130C、130G或130T，从而编码模板的序列信息。以这种方式，系链提供了一种手段来扩展Xpandomer的长度并降低母链序列信息的线性密度。
图1D说明Xpandomer 165通过纳米孔180从顺式储器175易位到反式储器185。通过纳米孔后，线性化Xpandomer的每个报告子(在此图示中，标记为“G”、“C”和“T”)产生独特且可重复的电子信号(由叠加迹线190表示)，对它所连接的核碱基具有特异性。
图2更详细地描绘了XNTP的概括结构。XNTP 200包含具有连接臂部分220A和220B的核碱基三磷酸氨基酯210，这两个连接臂部分被可选择性切割的氨基磷酸酯键230分开。系链在连接基团250A和250B处与核苷三磷酸酯相连，其中第一系链末端连接到杂环260(此处由胞嘧啶表示，尽管杂环可以是四种标准核碱基A、C、G、或T中的任一个)，并且第二系链末端连接到核碱基主链的α磷酸酯270。本领域技术人员将理解，可以使用本领域已知的许多合适的偶联化学以形成最终的XNTP底物产物，例如，系链偶联可以通过三唑键来完成系链缀合。
在该实施例中，系链275包含若干功能元件，包括增强子280A和280B、报告子代码285A和285B以及翻译控制元件(TCE)290A和290B。这些特征中的每一个都在Xpandomer通过纳米孔易位并产生独特且可重复的电子信号期间执行独特的功能。系链275被设计用于通过杂交(TCH)进行易位控制。如图所示，TCE提供了一个杂交区域，该区域可以与互补寡聚物(CO)形成双链体，并位于报告子代码附近。不同的报告子代码的大小可以阻止离子以不同的可测量水平流过纳米孔。使用通常用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺化学可以有效地合成特定的报告子代码。可以通过从市售文库中选择特定亚磷酰胺的序列来设计报告子。此类文库包括但不限于长度为1个至12个或更多乙二醇单元的聚乙二醇、长度为1个至12个或更多碳单元的脂肪族、脱氧腺苷(A)、脱氧胞嘧啶(C)、脱氧鸟苷(G)、脱氧胸腺嘧啶(T)、无碱基(Q)。与报告子代码相关的双链体TCE也有助于离子流阻塞，因此报告子代码和TCE的组合可以称为“报告子”。报告子代码之后是增强子，在一个实施例中其包括精胺聚合物。
图3显示了在易位α-溶血素纳米孔的过程中切割的Xpandomer的一个实施例。该生物纳米孔嵌入脂质双层膜中，该膜将两个电解质储库分开并电隔离。典型的电解质具有缓冲至7.0的pH值的1摩尔KCl。当在双层上施加小电压(通常为100mV)时，纳米孔会限制离子电流的流动，并且是电路中的主要电阻。Xpandomer报告子设计用于提供特定的离子电流阻塞水平，并且可以通过测量离子电流水平序列随着报告子序列易位纳米孔来读取序列信息。
α-溶血素纳米孔通常是定向的，因此通过进入前庭侧并离开茎侧发生易位。如图3所示，纳米孔被定向以首先从茎侧捕获Xpandomer。使用TCH方法时，这种定向是有利的，因为它会减少首先进入前庭时发生的阻塞伪影。除非另有说明，茎侧首先是假定的易位方向。随着Xpandomer移位，报告子进入茎，直到其双链体TCE在茎入口处停止。双链体的直径为约2.4nm，而茎的入口为约2.2nm，因此报告子被保持在茎中，直到双链体的互补链395解离(释放)，然后易位进行到下一个报告子。游离互补链极不利于进入纳米孔，因为Xpandomer仍在转移并从孔中扩散开。
在一个实施例中，报告子代码的每个成员(在双链体之后)由可选自许多商业文库的亚磷酰胺的有序选择形成。每种成分的亚磷酰胺根据其在纳米孔中的位置(位于双链体终止之后)、其位移、其电荷、其与纳米孔的相互作用、其化学和热环境以及其他因素对净离子电阻做出贡献。每个亚磷酰胺上的电荷部分归因于具有-1的标称电荷但被抗衡离子屏蔽有效减少的磷酸根离子。拉动双链体的力是由于这些沿报告子的有效电荷受到局部电场的作用。由于每个报告分子可以具有不同的电荷分布，因此对于给定的施加电压，它可以对双链体施加不同的力。沿报告子主链传输的力还用于将报告子拉长以提供可重复的阻断响应。
由本发明人开发的扩展测序(SBX)方法在Xpandomer相对于天然DNA的序列读取效率和准确性方面提供了显著的性能增强。然而，天然DNA模板序列初始转录为可测量的Xpandomer依赖于DNA聚合酶利用XNTP作为底物的能力(XNTP的一般结构在本文中参考图1A和图2讨论)。发明人已发现大多数DNA聚合酶不能有效地聚合XNTP。然而，包含合适的添加剂，例如本公开的PEM，提高了XNTP聚合成Xpandomer的效率和准确性。因此，本文公开的PEM可以在SBX方法的背景下使用以增强使用XNTP作为底物的DNA聚合酶引物延伸反应。
代表性引物延伸反应可包括以下试剂：2pmol引物、2.2pmol 45mer寡核苷酸模板、50pmol的每种XNTP(XATP、XCTP、XGTP和XTTP)、50mM Tris HCl、pH 6.79、200mM NaCl、20％PEG、5％NMS、0.5nmol多磷酸盐60.19、0.3mM MnCl2和0.6μg纯化的重组DNA聚合酶蛋白。通常以微摩尔到毫摩尔范围内的浓度将PEM添加到该混合物中。反应还包括额外的添加剂，例如单链结合蛋白(SSB)、脲和NMS。反应在23℃下运行1小时。处理反应产物(即受约束的Xpandomer)以切割氨基磷酸酯键，从而产生线性化的Xpandomer。使用4％-12％丙烯酰胺凝胶上的凝胶电泳分析反应产物，以解析和显示不同长度的Xpandomer产物。
因此，在一个实施例中，本公开提供了一种水性(含水)组合物，其包含PEM和缓冲剂，特别是适合进行DNA聚合反应的缓冲剂，其中Tris HCl是这种类型的示例性缓冲剂。在一个实施例中，本公开提供了一种包含PEM和DNA聚合酶蛋白的组合物。在一个实施例中，本公开提供了一种组合物，其包含PEM和多核苷酸，例如20-90mer、20-60mer、30-90mer或30-60mer的寡核苷酸。在一个实施例中，本公开提供了包含这些组分中的每一种的组合物，即包含PEM、缓冲剂、DNA聚合酶蛋白和多核苷酸的水性组合物。
为了研究增强XNTP聚合的准确性，可以使用SBX协议对引物延伸产物进行测序。简而言之，将受约束的XNTP聚合的Xpandomer产物切割以产生线性化的Xpandomer。这是通过首先用含有100mM EDTA、2mM THPTA和2％Tween-20的溶液猝灭延伸反应来实现的。然后用1M NaHCO3和1M琥珀酸酐的DMF溶液对样品进行胺改性。氨基磷酸酯键的切割用37％HCl进行，用QIAquick柱(QIAGEN，Inc.)纯化线性化的Xpandomer。
对于测序，通过将α-溶血素插入缓冲剂B1中的DPhPE/十六烷双层成员中来制备蛋白质纳米孔，其中缓冲剂B1含有2M NH4Cl和100mM HEPES，pH 7.4。顺式孔灌注缓冲剂B2，其中缓冲剂B2含有0.4M NH4Cl、0.6M GuCl和100mM HEPES，pH 7.4。将Xpandomer样品加热至70℃2分钟，完全冷却，然后将2μL样品加入顺式孔中。然后施加90mV/390mV/10μs的电压脉冲，并通过Labview获取软件获取数据。
通过来自单个SBX反应的序列读段群的直方图显示来分析序列数据。分析软件将每个序列读段与模板序列对准，并修整与正确模板序列不对准的读段末端的序列范围。
在一个实施例中，本公开提供了一种提高增强XNTP聚合的准确性的方法，其中该方法包括将如本文公开的PEM添加到如上所述的DNA聚合反应中。
在一个实施例中，本公开提供了一种试剂盒，其中该试剂盒可用于本文所述的方法中。所述试剂盒将包括至少一种本公开的化合物，和以下一种或多种：a)分子拥挤剂，b)水性缓冲剂，c)蛋白质如聚合酶，d)可用作例如引物的多核苷酸和/或可用作例如模板的多核苷酸。
例如，在一个实施例中，本公开提供了一种用于对核酸模板进行测序的试剂盒。所述试剂盒包括至少一种本公开的化合物和核苷酸类似物的混合物。相对于不存在至少一种本公开的化合物的相同聚合反应，本公开的化合物可用于增加在依赖模板的聚合反应过程中掺入子链中的核苷酸类似物的数量和准确度。任选地，所述核苷酸类似物的混合物包含核苷三磷酸氨基酯，其中每个核苷三磷酸氨基酯包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合物系链部分，其中聚合物系链部分的第一末端连接到核碱基，聚合物系链部分的第二末端连接到核苷三磷酸氨基酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割提供核苷酸类似物的扩展。任选地，核苷酸类似物的混合物包括包含可检测标记物的核苷酸类似物，其中所述可检测标记物是选自由发光、化学发光、发荧光、荧光、发色或生色标记物组成的组的光学可检测标记物。任选地，所述试剂盒包括包含以下中的水性缓冲剂：Tris OAc、NH4OAc、PEG、水混溶性有机溶剂(例如二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、丙酮等)、多磷酸盐60、NMS和MnCl2。任选地，所述的试剂盒包括单链结合蛋白。任选地，所述的试剂盒包括脲。任选地，该试剂盒包括这些组分中的两个或更多个，例如，3个或4个，或所有指定的组分。
化合物可通过本领域普通技术人员已知的方法制备，其中此类方法可通过各种参考书和数据库确定。详述可用于制备本公开化合物的反应物的合成或提供对描述制备的文章的参考的合适的参考书和论文包括例如″Synthetic Organic Chemistry，″John Wiley&Sons，Inc.，New York；S.R.Sandler等人，″Organic Functional Group Preparations，″第2版，Academic Press，New York，1983；H.O.House，″Modem Synthetic Reactions″，第2版，W.A.Benjamin，Inc.Menlo Park，Calif 1972；T.L.Gilchrist，″HeterocyclicChemistry″，第2版，John Wiley&Sons，New York，1992；J.March，″Advanced OrganicChemistry：Reactions，Mechanisms and Structure，″第4版，Wiley-Interscience，NewYork，1992。详细说明可用于制备本公开的化合物的反应物的合成的其他合适的参考书和论文，或提供对描述制备的文章的参考，包括例如Fuhrhop，J.和Penzlin G.″OrganicSynthesis：Concepts，Methods，Starting Materials″，第2版，修订增补版(1994)JohnWiley&Sons ISBN：3-527-29074-5；Hoffman，R.V.″Organic Chemistry，An IntermediateText″(1996)牛津大学出版社，ISBN 0-19-509618-5；Larock，R.C.″ComprehensiveOrRanic Transformations：A Guide to Functional Group Preparations″第2版(1999)Wiley-VCH，ISBN：0-471-19031-4；March，J.″Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure″第4版(1992)John Wiley&Sons，ISBN：0-471-60180-2；Otera，J.(editor)″Modern Carbonyl Chemistry″(2000)Wiley-VCH，ISBN：3-527-29871-1；Patai，S.″Patai′s 1992 Guide to the Chemistry of Functional Groups″(1992)Interscience ISBN：0-471-93022-9；Quin，L.D.等人.″A Guide to OrganophosphorusChemistry″(2000)Wiley-Interscience，ISBN：0-471-31824-8；Solomons，T.W.G.″OrganicChemistry″第7版(2000)John Wiley&Sons，ISBN：0-471-19095-0；Stowell，J.C.，″Intermediate Organic Chemistry″第2版(1993)Wiley-Interscience，ISBN：0-471-57456-2；″Industrial Organic Chemicals：Starting Materials and Intermediates：AnUllmann′s Encyclopedia″(1999)John Wiley&Sons，ISBN：3-527-29645-X，in 8volumes；″Organic Reactions″(1942-2000)John Wiley&Sons，in over 55 volumes；和″Chemistry of Functional Groups″John Wiley&Sons，in 73 volumes。
实例
根据本文公开的一般实例制备如表1中所示的化合物。
材料和方法.4-叠氮基水杨酸和2，6-二溴-4-吡啶甲酸购自Toronto ResearchChemicals，Inc.(加拿大安大略省多伦多)。4-叠氮基-2-(三氟甲基)苯甲酸、3-氨基-5-羟基苯甲酸和4-氨基间苯二甲酸购自Matrix Scientific(美国南卡罗来纳州哥伦比亚)。3-氨基-6-(三氟甲基)苯甲酸盐酸盐、1-(4-氨基苯基)-2，2，2-三氟乙-1-酮、甘氨酰甘氨酸甲酯盐酸盐、3，3，3-三氟丙-1-胺和3-氨基丙-1-基膦酸二乙酯购自Enamine LLC(美国新泽西州蒙茅斯章克申)。Tris[(1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟-磷酸盐(HATU)、1，3-二乙炔基苯、2，6-二乙炔基吡啶、3，5-二乙炔基吡啶、3，6-二乙炔基咔唑、4-叠氮苯甲酸、环丙胺、6-氨基-2-萘甲酸、4-氨基邻苯二甲酸、4-氨基-3-羟基苯甲酸、4-氨基-2-甲基苯甲酸、4-氨基-2，3，5，6-四氟苯甲酸、4-氨基-2-硝基苯甲酸、n-(2-氨基乙基)乙酰胺、4-(氨基苯基)膦酸、2，6-二氯-9H-嘌呤、天冬氨酸二甲酯盐酸盐、4-氨基-2-(三氟甲基)苯甲腈、3，5-二氨基苯甲酸和2，5-二溴呋喃购自TCI America(美国奥勒冈州波特兰)。4-甲氧基-2，6-二溴吡啶、4-硝基-2，6-二溴吡啶和2，6-二溴-4-吡啶甲酸、甘氨酸甲酯盐酸盐购自Chem-Impex International，Inc.(伊利诺伊州伍德戴尔市)。四(三苯基膦)钯(0)、三甲基硅乙炔、DMSO、DMF、MeOH、EtOAc、抗坏血酸钠、硫酸铜、二异丙胺、EDTA、吗啉、二乙胺、氢氧化铵、乙胺、乙醇、氮杂环丁烷、n-乙基-n-乙胺、2，6-二氯吡啶-4-甲酸甲酯、2，6-二溴吡啶-4-甲酸乙酯、4-甲基-2，6-二氯吡啶、2-氯-4-氰基吡啶、4-氨基-2-(三氟甲基)苯甲酸、2-溴-4-氰基吡啶、叠氮乙酸甲酯、4-叠氮苯胺盐酸盐、4-甲氧基苯基叠氮4-氨基-2-氟苯甲酸、正丁胺、3-氨基-5-(三氟甲基)苯甲酸、3-(4-氨基苯基)丙酸、4-(4-氨基苯基)-丁酸、4-氨基-2-甲氧基苯甲酸、2-氨基-3-(三氟甲基)苯甲酸、氨基乙醇、1，4-二氨基丁烷和2，5-二溴噻吩购自Sigma-Aldrich Corp.(美国密苏里州圣路易斯)。TLC和快速色谱法溶剂购自Sigma-Aldrich或Thermo FisherScientific Inc.(美国马塞诸塞州沃尔瑟姆)。
快速色谱法在购自Buchi Corp.(美国特拉华州纽卡斯尔)的Reveleris制备型纯化系统上进行。该系统装配有填充有来自Sorbent Technologies，Inc(佐治亚州诺克罗斯)的C18球形硅胶(Cat.No.76646-01)并用聚丙烯熔块密封的手工填充柱(直径2.3cm X高8cm)。将1到1.5mL的样品直接加载到柱顶部上。流动相为水(A)和乙腈(B)。梯度为在2分钟内从0到2％B，然后在20分钟内从2％到100％B，流速为28ml/min。在220nm、260nm和280nm处监测UV。在0.1AU的UV阈值下收集级分。使用来自EMD Millipore Corp.(美国马塞诸塞州比尔里卡)的铝背衬TLC Silica Gel 60 F254(Cat.No.1.05534.0001)进行薄层色谱。ESI质谱由Numega Resonance Lab(美国加利福尼亚州圣地亚哥)使用Perkin Elmer PE-SCIEXAPI-150质谱仪在正负模式下进行。
表1
Figure BDA0003485831380000761
Figure BDA0003485831380000771
Figure BDA0003485831380000781
Figure BDA0003485831380000791
Figure BDA0003485831380000801
Figure BDA0003485831380000811
Figure BDA0003485831380000821
Figure BDA0003485831380000831
Figure BDA0003485831380000841
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Figure BDA0003485831380000871
Figure BDA0003485831380000881
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Figure BDA0003485831380000961
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Figure BDA0003485831380001001
Figure BDA0003485831380001011
Figure BDA0003485831380001021
Figure BDA0003485831380001031
Figure BDA0003485831380001041
Figure BDA0003485831380001051
实例1
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001052
通过在DMSO(150μL)中混合4-叠氮基水杨酸B(1.79mg，10μmol)和2，6-二乙炔基吡啶A(0.67mg，5μmol)制备化合物1。将该溶液与TBTA(5.1mg，0.96μmol)和抗坏血酸钠(6.4mg，32μmol)在DMSO(95μL)中的溶液混合。通过在搅拌下添加20Mm硫酸铜(5μL)来引发点击反应。通过TLC(94∶5∶1 乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸)分析反应程度，基于叠氮化物和炔烃的消耗，反应在5分钟内完成。用DMSO和0.5M EDTA(100μL)使反应混合物体积达到1Ml。分离固体并溶解在另外的DMSO中。合并DMSO溶液并通过快速色谱法纯化，如上文材料和方法中所述。产物在旋转蒸发时形成玻璃状固体，产率为50％至75％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δppm3.29(2H，br.S.，(O(18)H和O(33)H))，7.17-7.29(4H，m，(C(7)H，C(11)H，C(28)H，C(32)H))7.85(2H，d，J＝8.11(C(10)H和C(31)H))，8.06(3H，s，(C(15)H，C(16)H，C(17)H))9.36(2H，s，(C(5)H和C(25)H))。
实例2
4，4′-(吡啶-3，5-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001061
根据实例1的方法，使用4-叠氮基水杨酸B和3，5-二乙炔基吡啶C制备化合物2。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δppm 3.29(2H，br.S.，(O(18)H和O(33)H))7.17-7.29(4H，m，(C(7)H，C(11)H，C(28)H，C(31)H))7.85(2H，d，J＝8.11Hz，(C(10)H和C(31)H))8.06(3H，s，，(C(13)H，C(15)H，C(17)H))9.36(2H，s，(C(5)H和C(25)H))。
实例3
4，4′-(1，3-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001062
根据实例1的方法，使用4-叠氮基水杨酸B和1，3-二乙炔基苯D制备化合物3。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δppm 3.29(2H，br.S.，(O(18)H和O(33)H))7.16-7.27(4H，m，(C(7)H，C(11)H，C(28)H，C(32)H))7.57-7.67(1H，m，(C(16)H))7.80-7.88(2H，m，(C(10)H和C(31)H))7.94(2H，d，J＝7.63Hz，(C(15)H和C(17)H)8.57(1H，s，(C(13)H))9.35(2H，s，(C(5)H和C(25)H)。
实例4
4，4′-((9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001071
根据实例1的方法，使用4-叠氮基水杨酸B和3，6-二乙炔基咔唑E制备化合物4。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δppm 3.29(2H，br.S.，(O(25)H和O(40)H))7.16-7.27(4H，m，(C(7)H，C(11)H，C(35)H，C(39)H))7.61(2H，d，J＝8.34Hz，(C(10)H和C(38)H))7.84(2H，d，J＝7.87Hz，(C(22)H和C(24)H))8.02(2H，d，J＝8.34Hz，(C(21)H和C(23)H))8.79(2H，s，(C(13)H和C(19)H))9.28(2H，s，(C(5)H和C(32)H))11.53(1H，s，(N(16)H)。
实例5
4，4′-((9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯胺的合成
Figure BDA0003485831380001072
根据实例1的方法，使用4-叠氮苯胺盐酸盐F和3，6-二乙炔基咔唑E制备化合物5。
实例6
4，4′-((9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯甲酸的合成
Figure BDA0003485831380001081
根据实例1的方法，使用4-叠氮苯甲酸G和3，6-二乙炔基咔唑E制备化合物6。
实例7
3，6-双(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-9H-咔唑的合成
Figure BDA0003485831380001082
根据实例1的方法，使用4-叠氮苯甲醚H和3，6-二乙炔基咔唑E制备化合物7。
实例8
2，2′-((9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二乙酸二甲酯的合成
Figure BDA0003485831380001083
根据实例1的方法，使用叠氮乙酸甲酯I和3，6-二乙炔基咔唑E制备化合物8。
实例9
4，4′-((4-甲氧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001091
化合物9的制备开始于由4-甲氧基-2，6-二溴吡啶和三甲基硅乙炔使用Sonogashira所述的条件合成4-甲氧基-2，6-二乙炔基吡啶J(Organomet.Chem.，653：46-49(2002).doi：10.1016/s0022-328x(02)01158-0)。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和化合物J完成化合物9的合成。
实例10
4，4′-((4-羧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001092
化合物10的制备开始于由4-氰基-2，6-二溴吡啶和三甲基硅乙炔使用Sonogashira所述的条件合成4-氰基-2，6-二乙炔基吡啶K(Organomet.Chem.，653：46-49(2002)。doi：10.1016/s0022-328x(02)01158-0)。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和化合物K完成化合物10的合成。
实例11
4，4′-((4-硝基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001101
化合物11的制备开始于由4-硝基-2，6-二溴吡啶和三甲基硅乙炔使用Sonogashira所述的条件合成4-硝基-2，6-二乙炔基吡啶L(Organomet.Chem.，653：46-49(2002).doi：10.1016/s0022-328x(02)01158-0)。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和化合物L完成化合物11的合成。
实例12
5，5′-((4-氰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001102
根据实例10的方法，使用5-叠氮基水杨酸M和4-氰基-2，6-二乙炔基吡啶K制备化合物12。
实例13
4，4′-((4-甲基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001111
化合物13开始于由4-甲基-2，6-二氯吡啶和三甲基硅乙炔使用Sonogashira所述的条件合成4-甲基-2，6-二乙炔基吡啶N(Organomet.Chem.，653：46-49(2002).doi：10.1016/s0022-328x(02)01158-0)。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和4-甲基-2，6-二乙炔基吡啶N完成化合物11的合成。
实例14
4，4′-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001112
Figure BDA0003485831380001121
化合物14开始于由2，6-二溴吡啶-4-甲酸乙酯和三甲基硅乙炔使用Sonogashira所述的条件合成2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸乙酯O(Organomet.Chem.，653：46-49(2002).doi：10.1016/s0022-328x(02)01158-0)。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸乙酯O完成化合物14的合成。
实例15
5，5′-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001122
根据实例14的方法，使用5-叠氮基水杨酸M和2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸乙酯O点击制备化合物15。
实例16
4，4′-((4-(甲氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001123
Figure BDA0003485831380001131
化合物16开始于由2，6-二氯吡啶-4-甲酸甲酯和三甲基硅乙炔使用Sonogashira所述的条件合成2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸甲酯P(Organomet.Chem.，653：46-49(2002)。doi：10.1016/s0022-328x(02)01158-0)。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸甲酯P完成化合物16的合成。
实例17
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001132
化合物17的合成开始于在DMF(900ul)中混合2，6-二溴-4-吡啶甲酸(0.2g，0.71mmol)、DIPEA(0.18g，1.42mmol)和HATU(0.27g，0.71mmol)。立即添加乙胺(0.154ml，1.78mmol)并混合1小时。通过TLC检测到反应完成并通过硅胶快速层析法使用乙酸乙酯/己烷的梯度进行纯化。将N-乙基-2，6-二溴-4-甲酰胺分离为黄色固体，产率为69％。N-乙基-2，6-二乙炔基-4-甲酰胺Q是用乙基三甲基硅烷使用实例16中描述的Sonogashira方法制备的。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和N-乙基-2，6-二乙炔基-4-甲酰胺Q完成化合物17的合成。
实例18
4，4′-((4-(甲基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001141
根据实例17的方法，用甲胺制备化合物18以形成酰胺。
实例19
4，4′-((4-氨基甲酰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001142
根据实例17的方法，用氨制备化合物19以形成酰胺。
实例20
4，4′-(吡嗪-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001143
Figure BDA0003485831380001151
化合物20开始于由2，6-二氯吡嗪和三甲基硅乙炔使用Bhowmick，S.等人所述的Sonogashira方法合成2，6-二乙炔基吡嗪T(App.Organomet.Chem.31(12)：e3824(2017))。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和2，6-二乙炔基吡嗪T完成化合物20的合成。
实例21
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001152
化合物73的合成开始于4-氨基-2-(三氟甲基)苯甲酸与亚硝酸钠和硫酸的重氮化，然后用叠氮化物进行亲核置换(Org.合成1942，22，96)以形成4-叠氮基-2-(三氟甲基)苯甲酸(U)，将其经快速色谱法纯化。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基-2-(三氟甲基)苯甲酸U和N-乙基-2，6-二乙炔基-4-甲酰胺Q完成化合物73的合成。
实例22
7，7′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基-1，8-萘啶-4-甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001161
化合物74的合成开始于7-氨基-2-羟基-1，8-萘啶-4-甲酸与亚硝酸钠和硫酸的重氮化，然后用叠氮化物进行亲核置换(Org.合成1942，22，96)以形成7-叠氮基-2-羟基-1，8-萘啶-4-甲酸(V)，将其经快速色谱法纯化。根据实例1的方法，通过点击7-叠氮基-2-羟基-1，8-萘啶-4-甲酸V和N-乙基-2，6-二乙炔基-4-甲酰胺Q完成化合物74的合成。
实例23
4-(4-(3-(1-(4-羧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-羟基苯甲酸的合成
Figure BDA0003485831380001162
化合物28的合成分两步完成。首先，将2，6-二乙炔苯D与亚吡啶量一半的4-叠氮基水杨酸B根据实例3的方法点击以制备4-(4-(3-乙炔基苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-羟基苯甲酸。第二步根据实例1的方法点击4-叠氮苯甲酸G以给出4-(4-(3-(1-(4-羧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-羟基苯甲酸28。
实例24
4-(4-(4-氰基吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-羟基苯甲酸的合成
Figure BDA0003485831380001171
化合物43的制备开始于由4-氰基-2-氯吡啶和三甲基硅乙炔使用Sonogashira所述的条件合成4-氰基-2-乙炔基吡啶W(Organomet.Chem.，653：46-49(2002).doi：10.1016/s0022-328x(02)01158-0)。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和化合物W完成化合物43的合成。
实例25
4，4′-((吡啶-2，6-二基)双(5-碘-1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001172
化合物31的制备开始于按照Tepper等人的方法由2，6-二乙炔基吡啶A合成2，6-双(碘乙炔基)吡啶(Org.Lett.，2015，17(23)，pp 5740-574)，其中涉及用N-碘代琥珀酰亚胺和硝酸银处理并通过快速色谱分离。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和化合物X完成化合物31的合成。
实例26
4，4′-((3，5-二甲基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001181
化合物30开始于由2，6-二溴-3，5-二甲基吡啶和三甲基硅乙炔使用Bhowmick，S.等人所述的Sonogashira方法合成2，6-二乙炔基-3，5-二甲基吡啶Y(App.Organomet.Chem.31(12)：e3824(2017))。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和2，6-二乙炔基-3，5-二甲基吡啶Y完成化合物30的合成。
实例27
4，4′-((9-乙酰基-9H-咔唑-3，6-二-基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001182
化合物33开始于由9-乙酰基-3，6-二碘咔唑和三甲基硅乙炔使用Bhowmick，S.等人所述的Sonogashira方法合成9-乙酰基-3，6-二乙炔基咔唑Z(App.Organomet.Chem.31(12)：e3824(2017))。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和9-乙酰基-3，6-二乙炔基咔唑Z完成化合物33的合成。
实例28
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(N，2-二羟基苯甲酰胺)的合成
Figure BDA0003485831380001191
化合物34的合成开始于混合N-羟基琥珀酰亚胺4-叠氮基水杨酸盐(40mg，0.145mmol)的DMF(72ul)溶液，向其中添加羟胺盐酸盐(30mg，0.43mmol)的水(72ul)溶液并混合过夜。通过TLC检测到产物，将反应通过硅胶快速层析法纯化，使用二氯甲烷和亚甲基吡啶-MeOH的梯度。分离4-叠氮基-N，2-二羟基苯甲酰胺AA，产率为57％。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基-N，2-二羟基苯甲酰胺AA和2，6-二乙炔基吡啶A完成化合物34的合成。
实例29
5-(4-(6-(4-(3-羧基-4-羟基-5-甲基苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-4-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-羟基-3-甲基苯甲酸的合成
Figure BDA0003485831380001192
Figure BDA0003485831380001201
化合物44的合成开始于5-氨基-2-羟基-3-甲基苯甲酸与亚硝酸钠和硫酸的重氮化，然后用叠氮化物进行亲核置换(Org.合成1942，22，96)以形成5-叠氮基-2-羟基-3-甲基苯甲酸(BB)，将其经快速色谱法纯化。根据实例1的方法，通过点击5-叠氮基-2-羟基-3-甲基苯甲酸BB与2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸酯P完成化合物44的合成。
实例30
4，4′-((4-(丁-3-炔-1-基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001202
化合物47的合成开始于在DMF(900ul)中混合2，6-二溴-4-吡啶甲酸(0.2g，0.71mmol)、DIPEA(0.18g，1.42mmol)和HATU(0.27g，0.71mmol)。立即添加丁炔胺(0.154ml，1.78mmol)并混合1小时。通过TLC检测到反应完成并通过硅胶快速层析法使用乙酸乙酯/己烷的梯度进行纯化。分离N-(丁-3-炔-1-基)-2，6-二溴异烟酰胺成固体。N-(丁-3-炔-1-基)-2，6-二乙炔基异烟酰胺CC是用乙基三甲基硅烷使用实例16中描述的Sonogashira方法制备的。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和N-(丁-3-炔-1-基)-2，6-二乙炔基异烟酰胺CC完成化合物47的合成。
实例31
4，4′-(萘-2，7-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001211
化合物63开始于由2，7-二溴萘和三甲基硅乙炔使用Bhowmick，S.等人所述的Sonogashira方法合成2，7-二乙炔基萘DD(App.Organomet.Chem.31(12)：e3824(2017))。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和2，7-二乙炔基萘DD完成化合物63的合成。
实例32
4，4′-(萘-2，3-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001212
化合物64开始于由2，3-二溴萘和三甲基硅乙炔使用Bhowmick，S.等人所述的Sonogashira方法合成2，3-二乙炔基萘EE(App.Organomet.Chem.31(12)：e3824(2017)。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和2，3-二乙炔基萘EE完成化合物64的合成。
实例33
4，4′，4″，4″′-((((丁烷-1，4-二基双(氮烷二基))双(羰基))双(吡啶-4，2，6-三基))四(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))四(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001221
化合物71开始于由2，6-二溴-4-吡啶甲酸和三甲基硅乙炔使用Bhowmick，S.等人所述的Sonogashira方法合成2，6-二乙炔基-4-吡啶甲酸(App.Organomet.Chem.31(12)：e3824(2017))。用HATU、DIPEA和1，4-二氨基丁烷处理2，6-二乙炔基-4-吡啶甲酸以在通过快速色谱法分离后给出N，N′-(丁烷-1，4-二基)双(2，6-二乙炔基异烟酰胺)(FF)。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基水杨酸B和N，N′-(丁烷-1，4-二基)双(2，6-二乙炔基异烟酰胺)(FF)完成化合物71的合成。
实例34
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3，5，6-三氯吡啶甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001231
化合物72的合成开始于4-氨基-3，5，6-三氯吡啶-2-甲酸与亚硝酸钠和硫酸的重氮化，然后用叠氮化物进行亲核置换(Org.合成1942，22，96)以形成4-叠氮基-3，5，6-三氯吡啶-2-甲酸(GG)，将其经快速色谱法纯化。根据实例1的方法，通过点击4-叠氮基-3，5，6-三氯吡啶-2-甲酸GG与N-乙基-2，6-二乙炔基-4-甲酰胺Q完成化合物72的合成。
实例35
4，4′-((4-(甲基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001232
根据实例17，使用2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸与甲基胺的HATU偶联制备N-甲基-2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酰胺HH。在实例1中使用二乙炔基HH和叠氮化物U使用铜点击方法制备化合物79。化合物79质谱(ESI阴离子模式)：C27H16F6N8O5计算值：646.47；实测值：645[M-H+]。
实例36
4，4′-((4-(吗啉-4-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001241
根据实例17，使用2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸与吗啉的HATU偶联制备N-吗啉代-2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酰胺II。在实例1中使用二乙炔基II和叠氮化物U使用铜点击方法制备化合物80。化合物80质谱(ESI阴离子模式)：C30H20F6N8O6计算值：702.53；实测值：701.1[M-H+]
实例37
4，4′-((4-(二乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001251
根据实例17，使用2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸与N，N-二乙胺的HATU偶联制备N，N-二乙基氨基-2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酰胺JJ。在实例1中使用二乙炔基JJ和叠氮化物U使用铜点击方法制备化合物81。化合物81质谱(ESI阴离子模式)：C30H22F6N8O5计算值：688.55；实测值：687[M-H+]
实例38
4，4′-((4-氨基甲酰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001252
根据实例17，使用2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸与氨的HATU偶联制备2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酰胺KK。在实例1中使用二乙炔基KK和叠氮化物U使用铜点击方法制备化合物82。化合物82质谱(ESI阴离子模式)：C26H14F6N8O5计算值：632.44；实测值：631.1[M-H+]
实例39
4，4′-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001261
在实例1中使用2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸乙酯O和叠氮化物U使用铜点击方法制备化合物83。化合物83质谱(ESI阴离子模式)：C28H17F6N7O6计算值：661.48；实测值：659.9[M-H+]。
实例40
4，4′-((4-(氮杂环丁烷-1-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001262
根据实例17，使用2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸与氮杂环丁烷的HATU偶联制备N-氮杂环丁烷基-2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酰胺LL。在实例1中使用二乙炔基LL和叠氮化物B使用铜点击方法制备化合物84。化合物84质谱(ESI阴离子模式)：C27H20N8O7计算值：568.51；实测值：567[M-H+]。
实例41
4，4′-((4-(乙基(甲基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001271
根据实例17，使用2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸与N-甲基-N-乙胺的HATU偶联制备N-甲基-N-乙基-2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酰胺MM。在实例1中使用二乙炔基MM和叠氮化物B使用铜点击方法制备化合物85。化合物85质谱(ESI阴离子模式)：C27H22N8O7计算值：570.52；实测值：569.1[M-H+]。
实例42
N-乙基-2，6-双(1-(4-(2，2，2-三氟乙酰基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)异烟酰胺的合成
Figure BDA0003485831380001281
用亚硝酸钠和硫酸重氮化1-(4-氨基苯基)-2，2，2-三氟乙-1-酮，然后用叠氮化物置换(Org.合成1942，22，96 DOI：10.15227/orgsyn.022.0096)以形成1-(4-叠氮苯基)-2，2，2-三氟乙-1-酮NN，将其经快速色谱法纯化。在实例1中使用叠氮化物NN和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物86。化合物86质谱(ESI阴离子模式)：C28H18F6N8O3计算值：628.5；实测值：627[M-H+]。
实例43
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001282
在实例1中使用叠氮化物U和2，6-二乙炔基吡啶A使用铜点击方法制备化合物87。化合物87质谱(ESI阴离子模式)：C25H13F6N7O4计算值：589.41；实测值：588.1[M-H+]。
实例44
4，4′-((4-(环丙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001291
根据实例17，使用2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸与环丙基胺的HATU偶联制备N-环丙基氨基-2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酰胺OO。在实例1中使用二乙炔基OO和叠氮化物U使用铜点击方法制备化合物88。化合物88质谱(ESI阴离子模式)：C29H18F6N8O5计算值：672.50；实测值：671.1[M-H+]。
实例45
4，4′-((4-(丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001292
Figure BDA0003485831380001301
根据实例17，使用2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸与1-氨基丁烷的HATU偶联制备N-丁基氨基-2，6--二-乙炔基吡啶-4-甲酰胺PP。在实例1中使用二乙炔基PP和叠氮化物U使用铜点击方法制备化合物89。化合物89质谱(ESI阴离子模式)：C30H22F6N8O5计算值：688.55；实测值：687.1[M-H+]。
实例46
5，5′-((4-(二乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001302
根据实例22完成5-氨基-2-(三氟甲基)苯甲酸的重氮化作用以制备5-叠氮基-2-(三氟甲基)苯甲酸QQ。在实例1中使用叠氮化物QQ和二乙炔基JJ使用铜点击方法制备化合物90。化合物90质谱(ESI阴离子模式)：C30H22F6N8O5计算值：688.55；实测值：687.1[M-H+]。
实例47
5，5′-((4-(吗啉-4-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001311
在实例1中使用叠氮化物QQ和二乙炔基II使用铜点击方法制备化合物91。化合物91质谱(ESI阴离子模式)：C30H20F6N8O6计算值：702.53；实测值：701[M-H+]。
实例48
4，4′-(哒嗪-3，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001312
根据描述于实例9的Sonogashira方法，使用3，6-二溴哒嗪制备3，6-二乙炔基哒嗪。在实例1中使用叠氮化物B和3，6-二乙炔基哒嗪使用铜点击方法制备化合物92。化合物92质谱(ESI阴离子模式)：C22H14N8O6计算值：486.1；实测值：485[M-H+]。
实例49
5，5′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001313
Figure BDA0003485831380001321
根据实例22完成3-氨基-5-(三氟甲基)苯甲酸的重氮化作用以制备3-叠氮基-5-(三氟甲基)苯甲酸RR。在实例1中使用叠氮化物RR和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物93。化合物93质谱(ESI阴离子模式)：C28H18F6N8O5计算值：660.49；实测值：659[M-H+]。
实例50
4，4′-((4-羧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001322
在实例1中使用叠氮化物U和2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸使用铜点击方法制备化合物94。化合物94质谱(ESI阴离子模式)：C26H13F6N7O6计算值：633.42；实测值：632[M-H+]。
实例51
3，3′-(((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(4，1-亚苯基))二丙酸的合成
Figure BDA0003485831380001331
根据实例22完成3-(4-氨基苯基)丙酸的重氮化作用以制备3-(4-叠氮基苯基)丙酸SS。在实例1中使用叠氮化物SS和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物95。化合物95质谱(ESI阴离子模式)：C30H28N8O5计算值：580.61；实测值：579[M-H+]。
实例52
4，4′-(((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(4，1-亚苯基))二丁酸的合成
Figure BDA0003485831380001332
Figure BDA0003485831380001341
根据实例22完成4-(4-氨基苯基)丁酸的重氮化作用以制备4-(4-叠氮基苯基)丁酸TT。在实例1中使用叠氮化物TT和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物96。化合物96质谱(ESI阴离子模式)：C32H32N8O5计算值：608.66；实测值：607[M-H+]。
实例53
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二邻苯二甲酸的合成
Figure BDA0003485831380001342
根据实例22完成4-氨基邻苯二甲酸的重氮化作用以制备4-叠氮基邻苯二甲酸UU。在实例1中使用叠氮化物UU和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物97。化合物97质谱(ESI阴离子模式)：C28H20N8O9计算值：612.52；实测值：611.1[M-H+]。
实例54
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-甲氧基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001351
根据实例22完成4-氨基-2-甲氧基苯甲酸的重氮化作用以制备4-叠氮基-2-甲氧基苯甲酸VV。在实例1中使用叠氮化物VV和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物98。化合物98质谱(ESI阴离子模式)：C28H24N8O7计算值：584.55；实测值：583[M-H+]。
实例55
5，5′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二间苯二甲酸的合成
Figure BDA0003485831380001352
根据实例22完成4-氨基间苯二甲酸的重氮化作用以制备4-叠氮基间苯二甲酸WW。在实例1中使用叠氮化物WW和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物99。化合物99质谱(ESI阴离子模式)：C28H20N8O9计算值：612.52；实测值：611[M-H+]。
实例56
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-羟基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001361
根据实例22完成4-氨基-3-羟基苯甲酸的重氮化作用以制备4-叠氮基-3-羟基苯甲酸XX。在实例1中使用叠氮化物XX和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物100。化合物100质谱(ESI阴离子模式)：C26H20N8O7计算值：556.50；实测值：555.1[M-H+]。
实例57
(3-(4-(6-(1-(3-(二乙氧基磷酰基)丙基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙基)膦酸二乙酯的合成
Figure BDA0003485831380001362
Figure BDA0003485831380001371
根据实例22完成O，O-二乙基(3-氨基丙基)膦酸酯的重氮化作用以制备O，O-二乙基(3-叠氮基丙基)膦酸酯YY。在实例1中使用叠氮化物YY和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物101。化合物101质谱(ESI阴离子模式)：C26H42N8O7P2计算值：640.62；实测值：639.3[M-H+]。
实例58
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-甲基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001372
根据实例22完成4-氨基-2-甲基苯甲酸的重氮化作用以制备4-氨基-2-甲基苯甲酸ZZ。在实例1中使用叠氮化物ZZ和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物102。化合物102质谱(ESI阴离子模式)：C28H24N8O5计算值：552.55；实测值：551.1[M-H+]。
实例59
4，4′-((5-羧基-1，3-亚苯基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001381
在实例1中使用叠氮化物Q和3，5-二乙炔基苯甲酸使用铜点击方法制备化合物103。化合物103质谱(ESI阴离子模式)：C27H14F6N6O6计算值：632.44；实测值：631[M-H+]。
实例60
2，2′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001382
根据实例22完成2-氨基-3-(三氟甲基)苯甲酸的重氮化作用以制备2-叠氮基-3-(三氟甲基)苯甲酸AAA。在实例1中使用叠氮化物AAA和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物104。化合物104质谱(ESI阴离子模式)：C28H18F6N8O5计算值：660.49；实测值：659[M-H+]。
实例61
4，4′-((4-((2-羟基乙基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001391
根据实例17，使用2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸与氨基乙醇的HATU偶联制备N-(2-羟基乙基)氨基-2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酰胺BBB。在实例1中使用二乙炔基BBB和叠氮化物U使用铜点击方法制备化合物105。化合物105质谱(ESI阴离子模式)：C28H18F6N8O6计算值：676.49；实测值：675[M-H+]。
实例62
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-硝基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001392
根据实例22完成4-氨基-2-硝基苯甲酸的重氮化作用以制备4-叠氮基-2-硝基苯甲酸CCC。在实例1中使用叠氮化物CCC和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物106。化合物106质谱(ESI阴离子模式)：C26H18N10O9计算值：614.49；实测值：613[M-H+]。
实例63
4，4′-((4-((3，3，3-三氟丙基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001401
根据实例17，使用2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酸与3，3，3-三氟丙-1-胺的HATU偶联制备N-(3，3，3-三氟丙基)-2，6-二乙炔基吡啶-4-甲酰胺DDD。在实例1中使用二乙炔基DDD和叠氮化物U使用铜点击方法制备化合物107。化合物107质谱(ESI阴离子模式)：C29H17F9N8O5计算值：728.49；实测值：727[M-H+]。
实例64
4，4′，4″，4″′-((((丁烷-1，4-二基双(氮烷二基))双(羰基))双(吡啶-4，2，6-三基))四(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))四(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001411
在实例1中使用二乙炔基FF和叠氮化物U使用铜点击方法制备化合物108。化合物108质谱(ESI阴离子模式)：C56H34F12N16O10计算值：1318.97；实测值：1316.9[M-H+]。
实例65
(4-(4-(4-(乙基氨基甲酰基)-6-(1-(4-膦酰基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯基)膦酸的合成
Figure BDA0003485831380001412
根据实例22完成(4-氨基苯基)膦酸的重氮化作用以制备(4-叠氮基苯基)膦酸EEE。在实例1中使用叠氮化物EEE和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物109。化合物109质谱(ESI阴离子模式)：C24H22N8O7P2计算值：596.44；实测值：595[M-H+]。
实例66
2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))二乙酸的合成
Figure BDA0003485831380001421
根据描述于实例17中的HATU缩合方法偶联叠氮化物U与甘氨酸甲酯制备甲基(4-叠氮基-2-(三氟甲基)苯甲酰基)甘氨酸FFF。用1N NaOH皂化甲酯FFF随后中和以给出(4-叠氮基-2-(三氟甲基)苯甲酰基)甘氨酸GGG。在实例1中使用二乙炔基Q和叠氮化物GGG使用铜点击方法制备化合物110。化合物110质谱(ESI阴离子模式)：C32H24F6N10O7计算值：774.60；实测值：773[M-H+]。
实例67
2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))二乙酸二甲酯的合成
Figure BDA0003485831380001431
在实例1中使用叠氮化物FFF和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物111。化合物111质谱(ESI阴离子模式)：C34H28F6N10O7计算值：802.65；实测值：801.1[M-H+]。
实例68
(2S，2′S)-2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))二琥珀酸的合成
Figure BDA0003485831380001432
根据描述于实例17中的HATU缩合方法制备(4-叠氮基-2-(三氟甲基)苯甲酰基)天冬氨酸酯HHH，叠氮化物U与天冬氨酸二甲酯偶联以给出(4-叠氮基-2-(三氟甲基)苯甲酰基)天冬氨酸二甲酯。用1N NaOH皂化二甲酯随后中和以给出HHH。在实例1中使用二乙炔基Q和叠氮化物HHH使用铜点击方法制备化合物112。化合物112质谱(ESI阴离子模式)：C36H28F6N10O11计算值：890.67；实测值：889[M-H+]。
实例69
2，2′-((2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))双(乙酰基))双(氮烷二基))二乙酸的合成
Figure BDA0003485831380001441
根据描述于实例17中的HATU缩合方法偶联叠氮化物U与甘氨酰甘氨酸甲酯制备(4-叠氮基-2-(三氟甲基)苯甲酰基)甘氨酰甘氨酸III。用1NNaOH皂化甲酯随后中和以给出(4-叠氮基-2-(三氟甲基)苯甲酰基)-甘氨酰甘氨酸III。在实例1中使用二乙炔基Q和叠氮化物III使用铜点击方法制备化合物113。化合物113质谱(ESI阴离子模式)：C36H30F6N12O9计算值：888.70；实测值：887[M-H+]。
实例70
2，6-双(1-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-N-乙基异烟酰胺的合成
Figure BDA0003485831380001451
根据实例22完成4-氨基-2-(三氟甲基)苯甲腈的重氮化作用以制备4-叠氮基-2-(三氟甲基)苯甲腈JJJ。在实例1中使用叠氮化物JJJ和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物114。化合物114质谱(ESI阴离子模式)：C28H16F6N10O计算值：622.50；实测值：621[M-H+]。
实例71
4，4′-((5-羧基-1，3-亚苯基)双(1H-1，2，3-三唑-1，4-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001452
根据实例22完成3，5-二氨基苯甲酸的重氮化作用以制备3，5-二叠氮基苯甲酸KKK。根据描述于实例9的Sonogashira方法，使用4-溴-2-(三氟甲基)苯甲酸制备4-乙炔基-2-(三氟甲基)苯甲酸LLL。在实例1中使用双叠氮化物KKK和单乙炔基LLL使用铜点击方法制备化合物115。化合物115质谱(ESI阴离子模式)：C27H14F6N6O6计算值：632.44；实测值：631[M-H+]。
实例72
4，4′-((5-(乙基氨基甲酰基)-1，3-亚苯基)双(1H-1，2，3-三唑-1，4-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001461
根据描述于实例17中的HATU缩合方法偶联双叠氮化物酸KKK与乙胺制备3，5-二叠氮基-N-乙基苯甲酰胺MMM。在实例1中使用单乙炔基LLL和双叠氮化物MMM使用铜点击方法制备化合物116。化合物116质谱(ESI阴离子模式)：C29H19F6N7O5计算值：659.51；实测值：658.1[M-H+]。
实例73
4，4′-(噻吩-2，5-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001471
根据描述于实例9的Sonogashira方法，使用2，5-二溴噻吩制备2，5-二乙炔基噻吩NNN。在实例1中使用叠氮化物U和二乙炔基NNN使用铜点击方法制备化合物117。化合物117质谱(ESI阴离子模式)：C24H12F6N6O4计算值：594.45；实测值：593[M-H+]。
实例74
4，4′-(呋喃-2，5-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001472
根据描述于实例9的Sonogashira方法，使用2，5-二溴呋喃制备2，5-二乙炔基呋喃OOO。在实例1中使用叠氮化物U和二乙炔基OOO使用铜点击方法制备化合物118。化合物118质谱(ESI阴离子模式)：C24H12F6N6O5计算值：578.39；实测值：577[M-H+]。
实例75
3′-(4-(4-(乙基氨基甲酰基)-6-(1-(3′-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-3-基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-3-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-4-甲酸--二氧化碳的合成(1/1)
Figure BDA0003485831380001481
3′-氨基-3-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-4-甲酸的合成开始于混合4-溴-2-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(142mg，0.5mmol)、3-氨基苯基硼酸(137mg，1mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(35mg，0.1mmol)和K2CO3(138mg，2mmol)，添加甲醇(2ml)。将溶液在45℃下加热1.5小时。通过蒸发除去甲醇。将残余固体溶解在二甲基甲酰胺(1ml)中并通过硅胶色谱纯化，使用RevelerisPrep，用EtOAc/己烷流动相洗脱。基于UV收集合适的级分并蒸发以给出3′-氨基-3-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-4-甲酸甲酯(101mg，产率为68％)。
根据实例22完成3′-氨基-3-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-4-甲酸甲酯的重氮化作用以制备3′-叠氮基-3-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-4-甲酸甲酯。用KOH皂化甲酯，用0.25HCl中和并用EtOAc恢复以给出3′-叠氮基-3-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-4-甲酸PPP。在实例1中使用叠氮化物PPP和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物119。化合物119质谱(ESI阴离子模式)：C40H26N8O5计算值：812.69。
实例76
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-氰基苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001491
根据实例22完成4-氨基-2-氰基苯甲酸的重氮化作用以制备4-叠氮基-2-氰基苯甲酸QQQ。在实例1中使用叠氮化物QQQ和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物120。化合物120质谱(ESI阴离子模式)：C28H18N10O5计算值：574.50。
实例77
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-氯苯甲酸)的合成
Figure BDA0003485831380001492
根据实例22完成4-氨基-2-氯苯甲酸的重氮化作用以制备4-叠氮基-2-氯苯甲酸RRR。在实例1中使用叠氮化物RRR和二乙炔基Q使用铜点击方法制备化合物121。化合物121质谱(ESI阴离子模式)：C26H18Cl2N8O5计算值：593.38。
实例78
用于增强XNTP聚合的PEM的筛选
由本发明人开发的扩展测序(SBX)方法在Xpandomer相对于天然DNA的序列读取效率和准确性方面提供了显著的性能增强。然而，天然DNA模板序列初始转录为可测量的Xpandomer依赖于DNA聚合酶利用XNTP作为底物的能力(XNTP的一般结构在本文中参考图1A和图2讨论)。发明人已发现大多数DNA聚合酶不能有效地聚合XNTP。为了提高XNTP聚合成Xpandomer的效率和准确性，筛选了几种PEM，以增强使用XNTP作为底物的DNA聚合酶引物延伸反应的能力。
代表性引物延伸反应可包括以下试剂：2pmol引物、2.2pmol 45mer寡核苷酸模板、50pmol的每种XNTP(XATP、XCTP、XGTP和XTTP)、50Mm Tris HCl、Ph 6.79、200Mm NaCl、20％PEG、5％NMS、0.5nmol多磷酸盐60.19、0.3Mm MnCl2和0.6μg纯化的重组DNA聚合酶蛋白。反应可以在23℃下运行1小时。处理反应产物(即受约束的Xpandomer)以切割氨基磷酸酯键，从而产生线性化的Xpandomer。可以使用4％-12％丙烯酰胺凝胶上的凝胶电泳分析反应产物，以解析和显示不同长度的Xpandomer产物。对于上述PEM筛选，PEM通常以微摩尔至毫摩尔范围内进行测试。
令人惊讶的是，观察到几种PEM显著且可重复地增强了DNA聚合酶介导的使用XNTP的引物延伸。证明这种增强的示例性凝胶示于图4和图5。参考图4所示，正如在泳道1(无PEM添加剂)中所见，在这些条件下，DNA聚合酶将模板结合引物延伸至仅约14个XNTP。然而，在引物延伸反应中添加某些PEM使聚合酶能够合成更长的延伸产物，例如，在泳道3(化合物4)、7(化合物3)和9(化合物1)中可以看到。相比之下，几种不同的芳香族化合物对XNTP聚合几乎没有影响或没有影响(参见，例如，泳道2、4-6和8)，表明PEM活性对化合物1、3和4具有特异性。
类似地，参考图5所示，在不存在PEM添加剂的情况下，DNA聚合酶对XNTP显示出适度的引物延伸活性(泳道1，无PEM添加剂)，而添加不同浓度的化合物2(泳道8-10)显著增强了引物延伸活性。同样，这种PEM活性对化合物2具有特异性，因为其他不相关的芳香族化合物没有影响(泳道2-7)。
实例79
PEM增强扩展测序(SBX)
为了研究XNTP聚合的PEM依赖性增强的准确性，使用SBX协议对引物延伸产物进行测序。简而言之，将受约束的XNTP聚合的Xpandomer产物切割以产生线性化的Xpandomer。这是通过首先用含有100Mm EDTA、2Mm THPTA和2％Tween-20的溶液猝灭延伸反应来实现的。然后用1M NaHCO3和1M琥珀酸酐的DMF溶液对样品进行胺改性。氨基磷酸酯键的切割用37％HCl进行，用QIAquick柱(QIAGEN，Inc.)纯化线性化的Xpandomer。
对于测序，通过将α-溶血素插入缓冲剂B1中的DphPE/十六烷双层成员中来制备蛋白质纳米孔，其中缓冲剂B1含有2M NH4Cl和100Mm HEPES，Ph 7.4。顺式孔灌注缓冲剂B2，其中缓冲剂B2含有0.4MNH4Cl、0.6M GuCl和100Mm HEPES，Ph 7.4。将Xpandomer样品加热至70℃2分钟，完全冷却，然后将2μL样品加入顺式孔中。然后施加90Mv/390Mv/10μs的电压脉冲，并通过Labview获取软件获取数据。
通过来自单个SBX反应的序列读段群的直方图显示来分析序列数据。分析软件将每个序列读段与模板序列对准，并修整与正确模板序列不对准的读段末端的序列范围。45mer模板的SBX测序的示例性直方图显示在图6A中(无添加剂对照)和图6B(在PEM化合物1存在下的SBX)。可以看出，在不存在化合物1的情况下，序列读数在模板的碱基18附近不准确。值得注意的是，将化合物1添加到SBX反应中提高了45mer模板整个长度的序列读数的准确性。
这些结果激发了更多的实验来测试PEM化合物1增强甚至更长模板的SBX的能力。图7A和7B分别显示了60mer和80mer模板的SBX测序的直方图。令人惊讶的是，化合物1能够进行准确的序列读取，完整地至每个较长模板的末尾。这些结果表明，新型PEM可以稳健而准确地增强XNTP聚合活性，该PEM有力地提高了SBX提供基于纳米孔的核酸序列信息的能力。
实例80
PEM能够合成长Xpandomer产物
在成功将长达80个核苷酸的模板准确复制到Xpandomer中后，XNTP聚合反应使用四个更长的模板进行，由长度88、127、227和277个核苷酸组成。DPO4 DNA聚合酶的变体，称为C4552(SEQ ID NO：1)，用于这些聚合反应中，并且在PEM化合物1存在下针对C4552活性优化反应条件。其他合适的DPO4聚合酶变体包括但不限于SEQ ID NO：2-5的那些。除了1Mm化合物1，反应添加剂还包括1Mm脲和2.75μg单链结合蛋白(Eco SSB)。使用0.85pmol模板、0.5pmol寡核苷酸引物和1nmol每种XNTP，最终体积为10μL，进行延伸反应。反应在由50MmTrisCl、Ph 8.84、200Mm NH4Oac和20％PEG8K组成的缓冲剂中进行，并补充有5％NMS、3或4nmol的多磷酸盐PP-60.20和2Mm MnCl2。在每个延伸反应中使用1.2μg纯化的重组DNA聚合酶蛋白，并且反应在23℃下运行1-2小时。使用较长模板的示例性延伸反应的结果显示在图8中。值得注意的是，在化合物1的存在下，聚合酶能够聚合XNTP以生成每个较长模板的完整Xpandomer拷贝，长度范围从88(泳道1和6)到277(泳道5和10)个核苷酸。泳道1-5和6-10代表相同的延伸反应，除了PP-60.20添加剂的量，在泳道1-5中为3nmol，在泳道6-10中为4nmol。这些结果强调了化合物1在需要通过DNA聚合酶聚合非天然、高度取代的核苷酸类似物的反应中所赋予的惊人优势，并表明该化合物以及其他PEM可以极大地扩展SBX测序方案的潜力。
实例81
下一代PEM增强XNTPs的聚合以产生长Xpandomer产物
基于对PEM化合物1观察到的有利特性，设计了下一代PEM化合物，目的是改善某些特性，包括但不限于分子的水溶性。实例9-34和表7中描述了示例性下一代PEM结构。
使用源自HIV1、2和3基因组的三个100mer模板，在引物延伸测定中测试了化合物9-11的PEM活性。引物延伸反应包括以下试剂：75Mm TrisCl、Ph 8.44、175Mm NH4Oac、20％PEG8K、5％NMS、0.8nmol PP-60.20、0.6Mm MnCl2、2.3μg Tth单链结合蛋白(SSB)、0.5M或1M脲、200pmol每种XNTP、1.1pmol模板、1pmol寡核苷酸引物、1.2μg纯化的重组C4552 DNA聚合酶和0.5Mm PEM。10μL引物延伸反应在23℃下运行30分钟，并通过凝胶电泳分析反应产物。显示引物延伸产物的示例性凝胶示于图9中。如泳道1(HIV1模板)、2(HIV2模板)和4(HIV3模板，无SSB和1M脲)所示，化合物1能够将XNTP聚合成三种不同100mer模板的全长Xpandomer拷贝(箭头指示100mer的凝胶迁移位置)。同样，化合物9(泳道13-16)、10(泳道9-12)和11(泳道5-8)中的每一种都能在三种不同的100mer模板中的每一种上至少与化合物1一样有效地进行XNTP聚合。这些结果表明，可以通过增加化合物的各种物理化学性质(例如水溶性)来优化PEM活性。
使用HIV2 100mer模板在引物延伸测定中测试化合物12的PEM活性。引物延伸反应包括以下试剂：50Mm TrisCl，200Mm NH4Oac，20％PEG8K，5％NMS，0.6nmol PP-60.20，0.6MmMnCl2，2.75μg/μl Eco单链结合蛋白(SSB)，1M脲，50pmol每种XNTP，1.1pmol模板，1pmol寡核苷酸引物，1.2μg/μl纯化的重组C4760 DNA聚合酶(SEQ ID NO：2)，和0.5、1或1.5Mm PEM。10μL引物延伸反应在23℃下运行30分钟，并通过凝胶电泳分析反应产物。显示引物延伸产物的示例性凝胶示于图10中。如泳道5(0.5Mm PEM)、6(1Mm PEM)和7(1.5Mm PEM)所示，化合物12能够以与化合物10(泳道1)相当的方式将XNTP聚合成100mer模板的全长Xpandomer拷贝(100mer的凝胶迁移位置由箭头指示)。泳道2-4显示了来自与结构相关的添加剂的反应的引物延伸产物，该添加剂缺乏强劲的PEM活性。这些结果表明PEM活性可能由非常特定的化学结构决定。
使用HIV2 100mer模板在引物延伸测定中测试化合物13和14的PEM活性。引物延伸反应包括以下试剂：50Mm TrisCl，200Mm NH4Oac，20％PEG8K，5％NMS，0.6nmol PP-60.20，0.6Mm MnCl2，2.75μg/μl Eco单链结合蛋白(SSB)，1M脲，50pmol每种XNTP，1.1pmol模板，1pmol寡核苷酸引物，1.2μg/μl纯化的重组C4760 DNA聚合酶(DPO4的变体，参见SEQ ID NO：2)，和0.5、1、1.52或2.5Mm PEM。10μL引物延伸反应在23℃下运行30分钟，并通过凝胶电泳分析反应产物。显示引物延伸产物的示例性凝胶示于图11中(全长HIV2 100mer的位置由箭头指示)。如泳道5-7(不同浓度的化合物14)和8-10(不同浓度的化合物13)所示，这些下一代PEM中的每一个都能够以与化合物10(泳道1-4)相当的方式将XNTP聚合成100mer模板的全长Xpandomer拷贝。
使用411mer扩增子模板在引物延伸测定中测试化合物15的PEM活性。引物延伸反应包括以下试剂：50Mm TrisCl、200Mm NH4Oac、20％PEG8K、5％NMS、3nmol PP-60.20、2MmMnCl2、2μg Kod单链结合蛋白(SSB)、1M脲、250pmol每种XNTP、1pmol模板、1pmol寡核苷酸引物、1.2μg纯化的重组C4760 DNA聚合酶(DPO4的变体，参见SEQ ID NO：2)和2(泳道2)或3(泳道3)Mm PEM。10μL引物延伸反应在37℃下运行20分钟，并通过凝胶电泳分析反应产物。显示引物延伸产物的示例性凝胶示于图12中(277mer的位置由箭头指示)。如泳道2和3(两种不同浓度的化合物15)所示，这种下一代PEM能够以与化合物14(泳道1)相当的方式将XNTP聚合成411mer模板的长Xpandomer拷贝。值得注意的是，聚合酶完全依赖于向反应中添加PEM，以便能够合成这些长的Xpandomer产物。通过优化各种反应参数(例如延伸时间和/或各种添加剂的浓度)可以获得甚至更长的延伸产物。
使用源自HIV2的100mer模板在引物延伸测定中测试化合物16、17和18及其组合的PEM活性。引物延伸反应包括以下试剂：50Mm TrisCl、200Mm NH4Oac、20％或25％PEG8K、5％NMS、0.6nmol PP-60.20、0.6Mm MnCl2、2μg Kod单链结合蛋白(SSB)、1M脲、50pmol每种XNTP、1pmol模板、1pmol寡核苷酸引物、1.2μg纯化的重组C4760 DNA聚合酶(DPO4的变体，参见SEQ ID NO：2)和0.5-2Mm PEM。10μL引物延伸反应在37℃下运行30分钟，并通过凝胶电泳分析反应产物。显示引物延伸产物的示例性凝胶示于图13中(100mer产物的位置由箭头指示)。如泳道2(2Mm化合物16)和3-6(0.5、1、2和3Mm化合物17)所示，这些下一代PEM使XNTP能够以与化合物14(泳道1)相当的方式聚合成100mer模板的长Xpandomer拷贝。此外，2Mm化合物14和0.1Mm(泳道7)或0.3Mm(泳道8和9)化合物17的组合也使XNTP聚合成100mer模板的长Xpandomer拷贝，表明PEM的组合可能允许使用每个单独PEM的较低剂量。类似地，2Mm化合物16和0.1Mm(泳道10)或0.3Mm(泳道11和12)化合物18的组合似乎也允许使用较低剂量的每个单独的PEM使XNTPS聚合成100mer模板的全长拷贝。
使用411mer扩增子模板在引物延伸测定中测试化合物19的PEM活性。引物延伸反应包括以下试剂：50Mm TrisCl，200Mm NH4Oac，20％PEG8K，5％NMS，3nmol PP-60.20，2MmMnCl2，2μg Kod单链结合蛋白(SSB)，1M脲，250pmol每种XNTP，0.5pmol模板，0.5pmol寡核苷酸引物，1.2μg纯化的重组C4760 DNA聚合酶(DPO4的变体，参见SEQ ID NO：2)，和0.5(泳道2)、1(泳道3)或1.5Mm(泳道4)PEM。10μL引物延伸反应在37℃下运行30分钟，并通过凝胶电泳分析反应产物。显示引物延伸产物的示例性凝胶示于图14中(277mer产物的位置由箭头指示)。如泳道2-4所示，这种下一代PEM能够将XNTP聚合成411mer模板的长的Xpandomer拷贝，尽管其效率低于化合物14(泳道1)。这些结果表明PEM活性可能特定于PEM的结构和/或模板的长度。
实例82
第三代PEM化合物
为了进一步探索PEM结构和聚合酶增强活性之间的关系，以及优化各种理化性质，合成了“第三代”PEM化合物，如本文所述，例如表1(化合物79-118)和实例35-74。在引物延伸反应中使用以下长度的DNA模板测试这些PEM：A)45mer；B)100mer；C)150mer；和D)222mer。引物延伸反应在与实例77和78中描述的那些相当的条件下进行，类似地通过凝胶电泳分析延伸产物。显示PEM活性的第三代化合物的初步功能表征总结在下表2中。
表2
PEM活性总结
Figure BDA0003485831380001551
Figure BDA0003485831380001561
实例83
PEM使得能够合成RNA模板的Xpandomer拷贝
为了开始研究PEM增强多种聚合酶反应的潜力，测试了PEMS使DNA聚合酶能够利用RNA作为模板的能力。使用源自HIV2基因组序列的45mer RNA模板对表I中列出的几种化合物进行了初步筛选。引物延伸反应包括以下试剂：50Mm TrisCl、200Mm NH4Oac、20％PEG8K、5％NMS、0.6nmol PP-60.20、0.6Mm MnCl2、2μg Kod单链结合蛋白(SSB)、1M脲、50pmol每种XNTP、0.5pmol模板、0.5pmol寡核苷酸引物、1.2μg纯化的重组C4760 DNA聚合酶(DPO4的变体，参见SEQ ID NO：2)和2Mm PEM。10μL引物延伸反应在37℃下运行30分钟，并通过凝胶电泳分析反应产物。令人惊讶的是，发现几种化合物在RNA模板上显示出PEM活性；这些RNAPEM包括以下化合物：化合物51、73、49、17、75、76、93、105、106、110、116和118。这些结果表明，某些PEM可能会在通过扩展RNA模板进行测序方面发挥作用。
本说明书中提及和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、国外专利、国外专利以及非专利公开，包括但不限于2019年6月26日提交的美国临时专利申请号62/867,049，均通过引用整体并入本文。为了描述和公开例如出版物中描述的材料和方法的目的，可以通过引用并入这些文件，其可以与当前描述的发明结合使用。提供以上和通篇讨论的出版物仅用于它们在本申请的申请日之前的公开。本文中的任何内容均不应被解释为承认发明人无权凭借在先发明早于任何引用出版物。
Figure IDA0003485831450000011
Figure IDA0003485831450000021
Figure IDA0003485831450000031
Figure IDA0003485831450000041
Figure IDA0003485831450000051
Figure IDA0003485831450000061
Figure IDA0003485831450000071
Figure IDA0003485831450000081
Figure IDA0003485831450000091

Claims (100)

1.一种增强核酸聚合酶反应的方法，所述方法包括：
a.形成核酸聚合酶反应组合物，其包含：
i.模板核酸，
ii.核酸聚合酶，
iii.核苷酸或核苷酸类似物的混合物，和
iv.至少一种式(I)化合物；以及
b.在允许核酸聚合反应的条件下孵育所述核酸聚合酶反应组合物，其中所述至少一种式(I)化合物增加所述核酸聚合酶反应的持续合成能力、速率或保真度；
其中所述式(I)化合物由以下表示：
Figure FDA0003485831370000011
或其溶剂化物、水合物、互变异构体、螯合物或盐，其中：
m为1、2或3；
m′为1、2或3；
n为0、1或2；
p为0、1或2；
当X为C时W为N，或者当X为N时W为C；
Figure FDA0003485831370000012
为单键或双键，其中所述双键开始于W或X中为碳的任一者处；
L为连接基团；
M在每次出现时独立地选自氢、卤素和C1-C4烷基；
Ar1在每次出现时独立地选自任选地经取代的吡啶、吡嗪、哒嗪、呋喃、噻吩、萘、芴、菲、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、萘啶、菲咯啉、嘌呤和咔唑，其中：
Ar1的取代基在每次出现时独立地选自卤素、-OH、-CN、-NO2、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6环烷基、-OR0、-CONH2、-C(O)NR1R1′、-NR1R1′、-NR1C(O)R3、-C(O)SR3、-COR3、-OC(O)R3、-C(O)OR3、硫醇、-R4-H、-SOR1、-S(O)2R1、-S(O)2NR1R1′和-NS(O)2R3；
并且其中
R0在每次出现时独立地选自C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂芳基；
R1和R1′在每次出现时独立地选自H、羟基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳基烷基、和经取代或未经取代的杂芳基、-C(＝NH)NH2、-CH2CO2R0、-CH2C(O)NHCH2CO2H、-CH2CH2OH、-CH2CH2NHC(O)R3、-CH2C(O)NHCH2CO2H、
Figure FDA0003485831370000021
并且
其中R1和R1′可以一起形成杂环，包括但不限于氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、
Figure FDA0003485831370000022
R2在每次出现时独立地选自C2-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、和经取代或未经取代的卤代烷氧基；
R3在每次出现时独立地选自H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的卤代烷氧基、以及胍；
R4在每次出现时独立地选自被一个或多个杂原子间断的亚烷基，其中所述杂原子为O、S、NH或其组合；
Y在每次出现时独立地选自Ar2、-(CH2)3PO(OEt)2或-CH2CO2Me；
Ar2在每次出现时独立地选自经取代的5元和6元单环芳香环和包含两个在一起的单环的9元和10元稠合双环，其中两个单环中至少一个为芳香环，其中：
Ar2经G1、G2、G3、G4和G5取代，其中：
当Ar2经单基取代时，G1在每次出现时独立地选自氧代、-NH2、-COR3、-E-CO2H、-C(O)NR1R1′、-E-PO(OR1)2、和经G2、G3、G4和G5取代的芳基；
G2、G3、G4和G5在每次出现时独立地选自不存在或选自包含以下的基团：卤素、-CN、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-E-CO2H、-E-CHO、-E-C(O)R3、-E-C(O)NH(OH)、-E-C(O)NHR1、-E-CONR1R1′、-E-NR1R1′和-E-OR2，其中：
E在每次出现时独立地选自直接键和C1-C6亚烷基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中Ar1为单环碳环芳基。
3.根据权利要求1所述的方法，其中Ar1为单环杂环芳基。
4.根据权利要求1所述的方法，其中Ar1为双环芳基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中Ar1为三环芳基。
6.根据权利要求1所述的方法，其中Ar1为未经取代的芳基。
7.根据权利要求1所述的方法，其中Ar1为经取代的芳基。
8.根据权利要求1所述的方法，其中Ar2为5元单环芳香环，其选自由以下项组成的组：噻吩、1，2-噻唑、1，3-噻唑、呋喃、1，2-噁唑、1，3-噁唑、1H-吡咯、1H-吡唑、噁二唑、噻二唑、1，2，4-三唑、1，2，3-三唑和1H-咪唑。
9.根据权利要求1所述的方法，其中Ar2为6元单环芳香环，其选自由以下项组成的组：苯、吡啶、哒嗪、嘧啶和吡嗪。
10.根据权利要求1所述的方法，其中Ar2为9元稠合双环芳香环体系，其选自由以下项组成的组：苯并呋喃、1，3-苯并噁唑、呋喃并[3，2-b]吡啶、呋喃并[3，2-c]吡啶、呋喃并[2，3-c]吡啶、呋喃并[2，3-b]吡啶、吲哚、1H-苯并咪唑、1H-吡咯并[3，2-b]吡啶、1H-吡咯并[3，2-c]吡啶、1H-吡咯并[2，3-c]吡啶、1H-吡咯并[2，3-b]吡啶、苯并噻吩、1，3-苯并噻唑、噻吩并[3，2-b]吡啶、噻吩并[3，2-c]吡啶、噻吩并[2，3-c]吡啶、苯并噁二唑、苯并噻二唑、苯并异噁唑、苯并三唑和噻吩并[2，3-b]吡啶。
11.根据权利要求1所述的方法，其中Ar2为10元稠合双环芳香环体系，其选自由以下项组成的组：亚萘基、喹啉、喹唑啉、喹喔啉、1，5-萘啶、1，6-萘啶、1，7-萘啶、1，8-萘啶、异喹啉、酞嗪、2，6-萘啶和2，7-萘啶。
12.根据权利要求1所述的方法，其中Ar2上的取代包括甲酸。
13.根据权利要求1所述的方法，其中Ar2上的取代包括甲酰胺。
14.根据权利要求1所述的方法，其中Ar2上的取代包括三氟甲基。
15.根据权利要求1所述的方法，其中Ar2上的取代包括羟基。
16.根据权利要求1所述的方法，其中n为0且m为2，并且至少一种式(I)化合物由选自(III)或(IV)的式描述：
Figure FDA0003485831370000041
Figure FDA0003485831370000051
17.根据权利要求1所述的方法，其中Ar2上的取代包括羟基、甲酸和三氟甲基中的至少两个。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一种式(I)化合物由选自(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)的式描述：
Figure FDA0003485831370000052
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述式(I)化合物为螯合物的形式。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述螯合物为铜螯合物。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述式(I)化合物具有至少4.9的logP。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述式(I)化合物选自：
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(吡啶-3，5-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯甲酸；
4，4′-((4-甲氧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-羧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-硝基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
5，5′-((4-氰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-甲基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
5，5′-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(甲氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(甲基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-氨基甲酰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(吡嗪-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(1，3-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯胺；
4，4′-(1，3-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯甲酸；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯甲酸；
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯甲酸；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯甲酸；
4，4′-((3，5-二甲基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((413-吡啶-2，6-二基)双(5-碘-1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-乙酰氨基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((9-乙酰基-9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(N，2-二羟基苯甲酰胺)；
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酰胺)；
4，4′-((4-羧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((1，10-菲咯啉-2，9-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(三氟甲基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((3-氰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((3-硝基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
3，3′-((4-氰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(叔丁氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4-(4-(4-氰基吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-羟基苯甲酸；
5-(4-(6-(4-(3-羧基-4-羟基-5-甲基苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-4-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-羟基-3-甲基苯甲酸；
4，4′-((4-(二甲基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(环丙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(丁-3-炔-1-基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(二乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(叔丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(吗啉-4-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(丙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(苯基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-((2-乙酰氨基乙基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(4-环丙基哌嗪-1-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(甲脒基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(哌啶-1-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(环丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((1，10-菲咯啉-3，8-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(环戊基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(二丙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(二仲丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(萘-2，7-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(萘-2，3-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(二丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-((2-羟基乙基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(环己基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(苄基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯甲酸；
4，4′，4″，4″′-((((丁烷-1，4-二基双(氮烷二基))双(羰基))双(吡啶-4，2，6-三基))四(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))四(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3，5，6-三氯吡啶甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
7，7′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基-1，8-萘啶-4-甲酸)；
5，5′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-氟苯甲酸)；
5，5′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-氟苯甲酸)；
4，4′-((4-(甲基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(吗啉-4-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(二乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-氨基甲酰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(氮杂环丁烷-1-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基(甲基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
N-乙基-2，6-双(1-(4-(2，2，2-三氟乙酰基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)异烟酰胺；
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(环丙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
5，5′-((4-(二乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
5，5′-((4-(吗啉-4-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-(哒嗪-3，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
5，5′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-(三氟甲基)苯甲酸)；
3，3′-(((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(4，1-亚苯基))二丙酸；
4，4′-(((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(4，1-亚苯基))二丁酸；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二邻苯二甲酸；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-甲氧基苯甲酸)；
5，5′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二间苯二甲酸；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-羟基苯甲酸)；
(3-(4-(6-(1-(3-(二乙氧基磷酰基)丙基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙基)膦酸二乙酯；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-甲基苯甲酸)；
2，2′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-((2-羟基乙基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-硝基苯甲酸)；
4，4′-((4-((3，3，3-三氟丙基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
(4-(4-(4-(乙基氨基甲酰基)-6-(1-(4-膦酰基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯基)膦酸；
4，4′，4″，4″′-((((丁烷-1，4-二基双(氮烷二基))双(羰基))双(吡啶-4，2，6-三基))四(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))四(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))二乙酸；
2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))二乙酸二甲酯；
(2S，2′S)-2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))二琥珀酸；
2，2′-((2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))双(乙酰基))双(氮烷二基))二乙酸；
2，6-双(1-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-N-乙基异烟酰胺；
4，4′-(噻吩-2，5-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；和
4，4′-(呋喃-2，5-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
3′-(4-(4-(乙基氨基甲酰基)-6-(1-(3′-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-3-基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-3-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-4-甲酸；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-氰基苯甲酸)；以及
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-氯苯甲酸)。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中与缺乏所述式(I)化合物的核酸聚合酶反应相比，所述式(I)化合物增加所得核酸产物的长度。
24.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述至少一种式(I)化合物包含多种式(I)化合物。
25.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述核酸聚合酶为DNA聚合酶。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述DNA聚合酶为DPO4或其变体。
27.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述核苷酸或核苷酸类似物的混合物为包含核苷三磷酸氨基酯的核苷酸类似物的混合物，其中所述核苷三磷酸氨基酯中的每一者包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合物系链部分，其中所述聚合物系链部分的第一末端连接到所述核碱基，并且所述聚合物系链部分的第二末端连接到所述核苷三磷酸氨基酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割提供所述核苷酸类似物的扩展。
28.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述核酸聚合反应产生核苷酸类似物的可扩展聚合物，其中所述可扩展聚合物编码所述模板核酸的核碱基序列信息。
29.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述允许核酸聚合反应的条件包括合适的聚合缓冲剂和寡核苷酸引物。
30.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述合适的缓冲剂包含Tris OAc、NH4OAc、PEG、水混溶性有机溶剂、多磷酸盐60、NMS和MnCl2中的至少一种。
31.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含单链结合蛋白。
32.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含脲。
33.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述核苷酸或核苷酸类似物的混合物包含含有可检测标记物的核苷酸类似物。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述可检测标记物为选自由发光、化学发光、发荧光、荧光、发色或生色标记物组成的组的光学可检测标记物。
35.一种对DNA或RNA模板进行测序的方法，所述方法包括以下步骤：
a.形成DNA聚合酶反应组合物，其包含：
i.DNA或RNA模板，
ii与所述模板复合的复制引物，
iii.DNA聚合酶，
iv.核苷酸或核苷酸类似物的混合物，
v.至少一种式(I)化合物，
b.在允许DNA聚合反应的条件下孵育所述DNA聚合酶反应组合物，其中所述至少一种式(I)化合物增加所述DNA聚合酶反应的速率、保真度或持续合成能力；以及
c.确定核苷酸或核苷酸类似物的所得聚合物中所述核苷酸或核苷酸类似物的序列；
其中所述式(I)化合物为：
Figure FDA0003485831370000141
或其溶剂化物、水合物、互变异构体、螯合物或盐，其中：
m为1、2或3；
m′为1、2或3；
n为0、1或2；
p为0、1或2；
当X为C时W为N，或者当X为N时W为C；
Figure FDA0003485831370000142
为单键或双键，其中所述双键开始于W或X中为碳的任一者处；
L为连接基团；
M在每次出现时独立地选自氢、卤素和C1-C4烷基；
Ar1在每次出现时独立地选自任选地经取代的吡啶、吡嗪、哒嗪、呋喃、噻吩、萘、芴、菲、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、萘啶、菲咯啉、嘌呤和咔唑，其中：
Ar1的取代基在每次出现时独立地选自卤素、-OH、-CN、-NO2、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6环烷基、-OR0、-CONH2、-C(O)NR1R1′、-NR1R1′、-NR1C(O)R3、-C(O)SR3、-COR3、-OC(O)R3、-C(O)OR3、硫醇、-R4-H、-SOR1、-S(O)2R1、-S(O)2NR1R1′和-NS(O)2R3；并且其中
R0在每次出现时独立地选自C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂芳基；
R1和R1′在每次出现时独立地选自H、羟基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳基烷基、和经取代或未经取代的杂芳基、-C(＝NH)NH2、-CH2CO2R0、-CH2C(O)NHCH2CO2H、-CH2CH2OH、-CH2CH2NHC(O)R3、-CH2C(O)NHCH2CO2H、
Figure FDA0003485831370000151
并且
其中R1和R1′可以一起形成杂环，包括但不限于氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、
Figure FDA0003485831370000152
R2在每次出现时独立地选自C2-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、和经取代或未经取代的卤代烷氧基；
R3在每次出现时独立地选自H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的卤代烷氧基、以及胍；
R4在每次出现时独立地选自被一个或多个杂原子间断的亚烷基，其中所述杂原子为O、S、NH或其组合；
Y在每次出现时独立地选自Ar2、-(CH2)3PO(OEt)2或-CH2CO2Me；
Ar2在每次出现时独立地选自经取代的5元和6元单环芳香环和包含两个在一起的单环的9元和10元稠合双环，其中两个单环中至少一个为芳香环，其中：
Ar2经G1、G2、G3、G4和G5取代，其中：
当Ar2经单取代时，G1在每次出现时独立地选自氧代、-NH2、-COR3、-E-CO2H、-C(O)NR1R1′、-E-PO(OR1)2、和经G2、G3、G4和G5取代的芳基；
G2、G3、G4和G5在每次出现时独立地选自不存在或选自包含以下的基团：卤素、-CN、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-E-CO2H、-E-CHO、-E-C(O)R3、-E-C(O)NH(OH)、-E-C(O)NHR1、-E-CONR1R1′、-E-NR1R1′和-E-OR2，其中：
E在每次出现时独立地选自直接键和C1-C6亚烷基。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述核苷酸类似物的混合物包含核苷三磷酸氨基酯，其中所述核苷三磷酸氨基酯中的每一者包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合物系链部分，其中所述聚合物系链部分的第一末端连接到所述核碱基，并且所述聚合物系链部分的第二末端连接到所述核苷三磷酸氨基酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割提供所述核苷酸类似物的扩展。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述DNA聚合酶为DPO4或其变体。
38.根据权利要求37所述的方法，其中核苷酸类似物的所得聚合物为可扩展聚合物。
39.根据权利要求38所述的方法，其进一步包括使所述可扩展聚合物与氨基磷酸酯切割剂接触以产生核苷酸类似物的经扩展的聚合物的步骤。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述核苷酸类似物中的每一者的所述聚合物系链部分包含所述类似物的核碱基所特有的报告部分。
41.根据权利要求36所述的方法，其中所述报告部分产生特征电子信号。
42.根据权利要求36所述的方法，其中确定所述核苷酸类似物的序列的步骤包括将核苷酸类似物的所述经扩展聚合物转移通过纳米孔的步骤。
43.一种式(I)化合物
Figure FDA0003485831370000171
或其溶剂化物、水合物、互变异构体、螯合物或盐，其中：
m为1、2或3；
m′为1、2或3；
n为0、1或2；
p为0、1或2；
当X为C时W为N，或者当X为N时W为C；
Figure FDA0003485831370000172
为单键或双键，其中所述双键开始于W或X中为碳的任一者处；
L为连接基团；
M在每次出现时独立地选自氢、卤素和C1-C4烷基；
Ar1在每次出现时独立地选自任选地经取代的吡啶、吡嗪、哒嗪、呋喃、噻吩、萘、芴、菲、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、萘啶、菲咯啉、嘌呤和咔唑，其中：
Ar1的取代基在每次出现时独立地选自卤素、-OH、-CN、-NO2、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6环烷基、-OR0、-CONH2、-C(O)NR1R1′、-NR1R1′、-NR1C(O)R3、-C(O)SR3、-COR3、-OC(O)R3、-C(O)OR3、硫醇、-R4-H、-SOR1、-S(O)2R1、-S(O)2NR1R1′和-NS(O)2R3；并且其中
R0在每次出现时独立地选自C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂芳基；
R1和R1′在每次出现时独立地选自H、羟基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳基烷基、和经取代或未经取代的杂芳基、-C(＝NH)NH2、-CH2CO2R0、-CH2C(O)NHCH2CO2H、-CH2CH2OH、-CH2CH2NHC(O)R3、-CH2C(O)NHCH2CO2H、
Figure FDA0003485831370000181
并且
其中R1和R1′可以一起形成杂环，包括但不限于氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、
Figure FDA0003485831370000182
R2在每次出现时独立地选自C2-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、和经取代或未经取代的卤代烷氧基；
R3在每次出现时独立地选自H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6杂烷基、或经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的卤代烷氧基、以及胍；
R4在每次出现时独立地选自被一个或多个杂原子间断的亚烷基，其中所述杂原子为O、S、NH或其组合；
Y在每次出现时独立地选自Ar2、-(CH2)3PO(OEt)2或-CH2CO2Me；
Ar2在每次出现时独立地选自经取代的5元和6元单环芳香环和包含两个在一起的单环的9元和10元稠合双环，其中两个单环中至少一个为芳香环，其中：
Ar2经G1、G2、G3、G4和G5取代，其中：
当Ar2经单取代时，G1在每次出现时独立地选自氧代、-NH2、-COR3、-E-CO2H、-C(O)NR1R1′、-E-PO(OR1)2、和经G2、G3、G4和G5取代的芳基；
G2、G3、G4和G5在每次出现时独立地选自不存在或选自包含以下的基团：卤素、-CN、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-E-CO2H、-E-CHO、-E-C(O)R3、-E-C(O)NH(OH)、-E-C(O)NHR1、-E-CONR1R1′、-E-NR1R1′和-E-OR2，其中：
E在每次出现时独立地选自直接键和C1-C6亚烷基。
44.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar1为单环杂环芳基。
45.根据权利要求44所述的化合物，其中Ar1选自：
Figure FDA0003485831370000191
其中三唑环位于Ar1上的位置k。
46.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar1为双环芳基。
47.根据权利要求46所述的化合物，其中Ar1为双环碳环芳基，其选自：
Figure FDA0003485831370000201
其中三唑环位于Ar1上的位置k。
48.根据权利要求46所述的化合物，其中Ar1为双环杂环芳基，其选自：
Figure FDA0003485831370000202
其中三唑环位于Ar1上的位置k。
49.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar1为三环芳基。
50.根据权利要求49所述的化合物，其中Ar1为三环碳环芳基，其选自：
Figure FDA0003485831370000203
51.根据权利要求49所述的化合物，其中Ar1为三环杂芳基，其选自：
Figure FDA0003485831370000204
其中三唑环位于Ar1上的位置k。
52.根据权利要求49所述的化合物，其中Ar1为三环杂芳基，其选自
Figure FDA0003485831370000211
其中所述三唑环位于Ar1上的位置k。
53.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2为经取代的5元单环芳香环，其选自由以下项组成的组：噻吩、1，2-噻唑、1，3-噻唑、呋喃、1，2-噁唑、1，3-噁唑、1H-吡咯、1H-吡唑、噁二唑、噻二唑、1，2，4-三唑、1，2，3-三唑和1H-咪唑。
54.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2为6元单环芳香环，其选自由以下项组成的组：苯、吡啶、哒嗪、嘧啶和吡嗪。
55.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2为9元稠合双环芳香环体系，其选自由以下项组成的组：苯并呋喃、1，3-苯并噁唑、呋喃并[3，2-b]吡啶、呋喃并[3，2-c]吡啶、呋喃并[2，3-c]吡啶、呋喃并[2，3-b]吡啶、吲哚、1H-苯并咪唑、1H-吡咯并[3，2-b]吡啶、1H-吡咯并[3，2-c]吡啶、1H-吡咯并[2，3-c]吡啶、1H-吡咯并[2，3-b]吡啶、苯并噻吩、1，3-苯并噻唑、噻吩并[3，2-b]吡啶、噻吩并[3，2-c]吡啶、噻吩并[2，3-c]吡啶、苯并噁二唑、苯并噻二唑、苯并异噁唑、苯并三唑和噻吩并[2，3-b]吡啶。
56.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2为10元稠合双环芳香环体系，其选自由以下项组成的组：亚萘基、喹啉、喹唑啉、喹喔啉、1，5-萘啶、1，6-萘啶、1，7-萘啶、1，8-萘啶、异喹啉、酞嗪、2，6-萘啶和2，7-萘啶。
57.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2为选自以下的吡啶基环：
Figure FDA0003485831370000212
其中取代基G在所述吡啶基环上出现0、1或2次。
58.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2为下式的苯基环：
Figure FDA0003485831370000221
其中取代基G在所述苯基环上出现0、1或2次。
59.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2为选自以下的苯基环：
Figure FDA0003485831370000222
60.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2为经取代的苯基基团，其中所述苯基基团的取代基为进一步经G2、G3、G4和G5取代的芳基。
61.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2上的取代包括氨基。
62.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2上的取代包括甲氧基。
63.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2上的取代包括甲酸。
64.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2上的取代包括-CH2-CO2-CH3。
65.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2上的取代包括三氟甲基。
66.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2上的取代包括羟基。
67.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2上的取代是一个甲酸和一个羟基。
68.根据权利要求43所述的化合物，其中Ar2上的取代是一个甲酸和一个三氟甲基。
69.根据权利要求43所述的化合物，其为螯合物的形式。
70.根据权利要求68所述的化合物，其中所述螯合物为铜螯合物。
71.根据权利要求43所述的化合物，其具有至少4.9的logP。
72.根据权利要求43所述的化合物，其中n为0且m为2，其具有以下结构(III)或(IV)中的一者：
Figure FDA0003485831370000231
73.根据权利要求43所述的化合物，其在Ar2上具有取代，所述取代包括羟基、甲酸甲酰胺和三氟甲基中的至少两者。
74.根据权利要求43所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)中的一者：
Figure FDA0003485831370000232
75.根据权利要求43所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构(X)、(XI)或(XII)中的一者：
Figure FDA0003485831370000233
Figure FDA0003485831370000241
76.根据权利要求43所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构(XIII)、(XIV)或(XV)中的一者：
Figure FDA0003485831370000242
Figure FDA0003485831370000251
77.根据权利要求43所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)或(XXII)中的一者：
Figure FDA0003485831370000252
Figure FDA0003485831370000261
78.根据权利要求43所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构(XXIII)、(XXIV)或(XXV)中的一者：
Figure FDA0003485831370000271
79.根据权利要求43所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构(XXVI)、(XXVII)或(XXVIII)中的一者：
Figure FDA0003485831370000272
Figure FDA0003485831370000281
80.根据权利要求43所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构(XXIX)、(XXX)、(XXXI)或(XXXII)中的一者：
Figure FDA0003485831370000282
Figure FDA0003485831370000291
81.根据权利要求43所述的化合物，其选自：
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(吡啶-3，5-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯甲酸；
4，4′-((4-甲氧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-羧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-硝基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
5，5′-((4-氰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-甲基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
5，5′-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(甲氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(甲基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-氨基甲酰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(吡嗪-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(1，3-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯胺；
4，4′-(1，3-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯甲酸；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯甲酸；
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯甲酸；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯甲酸；
4，4′-((3，5-二甲基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((413-吡啶-2，6-二基)双(5-碘-1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-乙酰氨基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((9-乙酰基-9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(N，2-二羟基苯甲酰胺)；
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酰胺)；
4，4′-((4-羧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((1，10-菲咯啉-2，9-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(三氟甲基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((3-氰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((3-硝基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
3，3′-((4-氰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(叔丁氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4-(4-(4-氰基吡啶-2-基)--1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-羟基苯甲酸；
5-(4-(6-(4-(3-羧基-4-羟基-5-甲基苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-4-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-羟基-3-甲基苯甲酸；
4，4′-((4-(二甲基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(环丙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(丁-3-炔-1-基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(二乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(叔丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(吗啉-4-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(丙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(苯基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-((2-乙酰氨基乙基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(4-环丙基哌嗪-1-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(甲脒基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(哌啶-1-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(环丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((1，10-菲咯啉-3，8-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(环戊基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(二丙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(二仲丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(萘-2，7-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(萘-2，3-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(二丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-((2-羟基乙基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(环己基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(苄基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯甲酸；
4，4′，4″，4″′-((((丁烷-1，4-二基双(氮烷二基))双(羰基))双(吡啶-4，2，6-三基))四(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))四(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3，5，6-三氯吡啶甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
7，7′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基-1，8-萘啶-4-甲酸)；
5，5′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-氟苯甲酸)；
5，5′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-氟苯甲酸)；
4，4′-((4-(甲基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(吗啉-4-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(二乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-氨基甲酰基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙氧基羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(氮杂环丁烷-1-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基(甲基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
N-乙基-2，6-双(1-(4-(2，2，2-三氟乙酰基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)异烟酰胺；
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(环丙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(丁基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
5，5′-((4-(二乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
5，5′-((4-(吗啉-4-羰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-(哒嗪-3，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
5，5′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-(三氟甲基)苯甲酸)；
3，3′-(((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(4，1-亚苯基))二丙酸；
4，4′-(((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(4，1-亚苯基))二丁酸；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二邻苯二甲酸；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-甲氧基苯甲酸)；
5，5′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二间苯二甲酸；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-羟基苯甲酸)；
(3-(4-(6-(1-(3-(二乙氧基磷酰基)丙基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙基)膦酸二乙酯；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-甲基苯甲酸)；
2，2′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(3-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-((2-羟基乙基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-硝基苯甲酸)；
4，4′-((4-((3，3，3-三氟丙基)氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
(4-(4-(4-(乙基氨基甲酰基)-6-(1-(4-膦酰基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯基)膦酸；
4，4′，4″，4″′-((((丁烷-1，4-二基双(氮烷二基))双(羰基))双(吡啶-4，2，6-三基))四(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))四(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶一2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))二乙酸；
2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))二乙酸二甲酯；
(2S，2′S)-2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))二琥珀酸；
2，2′-((2，2′-((4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酰基))双(氮烷二基))双(乙酰基))双(氮烷二基))二乙酸；
2，6-双(1-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-N-乙基异烟酰胺；
4，4′-(噻吩-2，5-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；和
4，4′-(呋喃-2，5-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
3′-(4-(4-(乙基氨基甲酰基)-6-(1-(3′-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-3-基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)吡啶-2-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-3-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-4-甲酸；
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-氰基苯甲酸)；以及
4，4′-((4-(乙基氨基甲酰基)吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-氯苯甲酸)。
82.一种化合物，其选自以下：
4，4′-(1，3-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-((9H-咔唑-3，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯胺；
3，6-双(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-9H-咔唑；
4，4′-(1，4-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
4，4′-(1，3-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯胺；
4，4′-(1，3-亚苯基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯甲酸；
1，3-双(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯；
4，4′-(吡啶-2，6-二基双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))二苯胺；
4-(4-(3-(1-(4-羧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-羟基苯甲酸；
4-(4-(3-(1-(4-甲氧基苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苯甲酸；
4，4′-((4-羧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-羟基苯甲酸)；
2-(1-(1H-苯并[d]咪唑-4-基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-6-(1-(1H-苯并[d]咪唑-7-基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-N-乙基异烟酰胺；
4，4′-((4-羧基吡啶-2，6-二基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((5-羧基-1，3-亚苯基)双(1H-1，2，3-三唑-4，1-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；
4，4′-((5-羧基-1，3-亚苯基)双(1H-1，2，3-三唑-1，4-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)；和
4，4′-((5-(乙基氨基甲酰基)-1，3-亚苯基)双(1H-1，2，3-三唑-1，4-二基))双(2-(三氟甲基)苯甲酸)。
83.一种组合物，其包含根据权利要求43至82中任一项所述的化合物，和分子拥挤剂。
84.根据权利要求83所述的组合物，其中所述分子拥挤剂为聚亚烷基二醇。
85.一种组合物，其包含根据权利要求43至82中任一项所述的化合物，和水性缓冲剂。
86.根据权利要求85所述的组合物，其中所述水性缓冲剂为Tris HCl。
87.一种组合物，其包含根据权利要求43至82中任一项所述的化合物，和多核苷酸。
88.根据权利要求87所述的组合物，其中所述多核苷酸为20-60mer寡核苷酸。
89.一种组合物，其包含根据权利要求43至82中任一项所述的化合物，和蛋白质。
90.根据权利要求89所述的组合物，其中所述蛋白质为DNA聚合酶。
91.一种组合物，其包含根据权利要求43至82中任一项所述的化合物，和核苷酸或核苷酸类似物的混合物。
92.一种用于增强DNA聚合酶反应的持续合成能力、保真度或速率的组合物，其包含至少一种根据权利要求43至82中任一项所述的化合物，和核苷酸类似物的混合物。
93.一种组合物，其包含至少一种根据权利要求43至82中任一项所述的化合物，和核苷酸类似物的混合物，其中相对于不存在所述至少一种根据权利要求43至82中任一项所述的化合物的相同聚合反应而言，所述至少一种根据权利要求43至82中任一项所述的化合物增加在模板依赖性聚合反应期间掺入子链的核苷酸类似物的数量和准确性。
94.根据权利要求92所述的组合物，其中所述核苷酸类似物的混合物包含核苷三磷酸氨基酯，其中所述核苷三磷酸氨基酯中的每一者包含选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成的组的核碱基和聚合物系链部分，其中所述聚合物系链部分的第一末端连接到所述核碱基，并且所述聚合物系链部分的第二末端连接到所述核苷三磷酸氨基酯的α磷酸酯以通过氨基磷酸酯键的切割提供所述核苷酸类似物的扩展。
95.根据权利要求92所述的组合物，其进一步包含选自以下的缓冲剂组分：Tris OAc、NH4OAc、PEG、水混溶性有机溶剂、多磷酸盐60、NMS、和MnCl2中的至少一种。
96.根据权利要求92所述的组合物，其进一步包含单链结合蛋白。
97.根据权利要求92所述的组合物，其进一步包含脲。
98.根据权利要求92所述的组合物，其中所述核苷酸类似物的混合物包含含有可检测标记物的核苷酸类似物。
99.根据权利要求98所述的组合物，其中所述可检测标记物为选自由发光、化学发光、发荧光、荧光、发色或生色标记物组成的组的光学可检测标记物。
100.一种用于对核酸模板进行测序的试剂盒，其包含至少一种根据权利要求83至99中任一项所述的组合物。
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