ES2675111T3

ES2675111T3 - Métodos para etiquetar bibliotecas con codificación de ADN

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Publication number: ES2675111T3
Application number: ES12830083.7T
Authority: ES
Inventors: Anthony D. Keefe; Richard W. Wagner; Alexander Litovchick; Matthew Clark; John W. CUOZZO; Paolo A. Centrella; Ying Zhang; Christopher D. Hupp
Original assignee: X Chem Inc
Current assignee: X Chem Inc
Priority date: 2011-09-07
Filing date: 2012-09-07
Publication date: 2018-07-06
Anticipated expiration: 2032-09-07
Also published as: IL231191A0; IL279796A; AP2014007483A0; KR20140059256A; AU2012304387B2; CN103998658A; KR102242879B1; EP3828271A1; CA3077662A1; NZ722289A; SG11201400374TA; AU2019200965B2; JP6674738B2; AU2017201146B2; JP2020176121A; EP3351631A2; AU2019200965A1; WO2013036810A1; EA201490534A1; AU2017201146A1

Abstract

Un método para marcar una primera biblioteca que comprende una entidad química codificada por oligonucleótidos, comprendiendo dicho método: (i) proporcionar una cabeza de dominio que consiste en un oligonucleótido de cadena sencilla que tiene un primer grupo funcional y un segundo grupo funcional, comprendiendo dicha cabeza de dominio al menos un nucleótido sustituido en 2' terminal que comprende dicho segundo grupo funcional, en el que dicha cabeza de dominio comprende un nucleótido 2' - sustituido en el extremo 5' y/o el extremo 3'; (ii) unir dicho primer grupo funcional de dicha cabeza de dominio a un primer componente de dicha entidad química, en el que dicha cabeza de dominio está conectada directamente a dicho primer componente o dicha cabeza de dominio está conectada indirectamente a dicho primer componente mediante un ligador bifuncional; y (iii) ligar dicho segundo grupo funcional de dicha cabeza de domino a una primera etiqueta de bloque de construcción que consiste en un oligonucleótido de cadena sencilla para formar un complejo, en el que la primera etiqueta de bloque de construcción comprende un nucleótido 2'-sustituido terminal en el extremo 5' y 3' y la ligación comprende ligación enzimática; en la que dichas etapas (ii) y (iii) pueden realizarse en cualquier orden y en donde dicha primera etiqueta de bloque de construcción codifica la reacción de unión de dicha etapa (ii), proporcionando de ese modo una biblioteca etiquetada.

Description

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DESCRIPCIÓN

Métodos para etiquetar bibliotecas con codificación de ADN Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de las solicitudes provisionales estadounidenses números 61/531,820, presentada el 7 de septiembre de 2011 y 61/536,929, presentada el 20 de septiembre de 2011.

Antecedentes de la invención

En general, esta invención se refiere a bibliotecas de compuestos codificados por ADN y a métodos para utilizar y crear dichas bibliotecas. La invención también se refiere a composiciones para uso en dichas bibliotecas.

Las bibliotecas combinatorias codificadas por ADN proporcionan muchos beneficios para el descubrimiento de fármacos. Estas bibliotecas pueden proporcionar una gran cantidad de compuestos diversos que pueden examinarse e interrogarse rápidamente. Para aumentar aún más la complejidad, se pueden programar y automatizar varias etapas del proceso de descubrimiento. Estos pasos incluyen el uso de la síntesis de varias etapas y división para agregar bloques de construcción a andamios atómicos o poliatómicos y el uso de ligadura enzimática y/o química para agregar etiquetas de ADN que codifican las etapas sintéticas y los bloques de construcción.

A pesar de estos beneficios, pueden surgir numerosos problemas cuando deben sintetizarse y desconvolucionarse bibliotecas muy grandes o complejas. A medida que aumenta el tamaño de la biblioteca, pueden ser necesarios métodos mejorados para proporcionar altos rendimientos de ligadura de etiquetas. Para crear bibliotecas bajo diversas condiciones de reacción, las construcciones de nucleótidos ligados estables serían beneficiosas, tales como construcciones que son estables en condiciones de pH alto y temperatura elevada. Para simplificar la desconvolución de las etiquetas, la secuencia de las etiquetas podría reconocerse mediante polimerasas dependientes de ADN o ARN, de forma que los datos demográficos de la población de etiquetas se puedan determinar mediante polimerización dependiente de la plantilla y determinación de la secuencia. Pueden surgir dificultades al crear una biblioteca que tenga todos estos atributos beneficiosos. De acuerdo con lo anterior, existe la necesidad de métodos mejorados y más robustos para seleccionar e identificar pequeños compuestos en bibliotecas codificadas por ADN.

El documento WO 2007/062664 divulga un método para obtener un complejo bifuncional que comprende una molécula unida a un oligonucleótido identificador de cadena sencilla, en el que un complejo bifuncional naciente que comprende un sitio de reacción química y un sitio de cebado para la adición enzimática de una etiqueta se hace reaccionar a el sitio de reacción química con uno o más reactivos y reaccionó enzimáticamente en el sitio de cebado con una o más etiquetas que identifican el (los) reactivo (s). No hay descripción que se refiera a una cabeza de dominio que comprende un nucleótido 2’-sustituido en el extremo 5’ y/o el extremo 3’.

Los documentos WO 2006/135786 y WO 2005/058479 proporcionan un método para sintetizar bibliotecas de moléculas que incluyen una etiqueta de oligonucleótido codificante.

El documento WO 2010/094036 proporciona un método para identificar uno o más compuestos que se unen a un objetivo biológico que comprende sintetizar una biblioteca de compuestos en donde los compuestos contienen una fracción funcional que tiene una o más posiciones de diversidad, por lo que la fracción funcional está unido a un oligonucleótido iniciador que identifica la estructura de la fracción funcional.

Resumen de la invención

La presente invención presenta métodos para crear bibliotecas, en el que el método incluye una o más condiciones que mejoran la ligación de etiquetas de una sola cadena, y composiciones para utilizar en la creación de bibliotecas. Las condiciones ejemplares incluyen el uso de una o más bases sustituidas en 2’dentro de las etiquetas, tales como 2’-O-metil o 2’-fluoro; el uso de etiquetas de longitud particular; el uso de una o más enzimas; opcionalmente, la inclusión de capacidades de reconocimiento de errores en el diseño de la etiqueta; y/o el uso de uno o más agentes durante el ligado.

De acuerdo con lo anterior, la invención presenta un método para marcar una primera biblioteca que incluye una entidad química codificada por oligonucleótidos, el método incluye: (i) proporcionar una cabeza de dominio que tiene un primer grupo funcional y un segundo grupo funcional, donde la cabeza de dominio incluye al menos un nucleótido 2’-sustituido; (ii) unir el primer grupo funcional de la cabeza de dominio a un primer componente de la entidad química, donde la cabeza

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de dominio se conecta directamente al primer componente o la cabeza de dominio se conecta indirectamente al primer componente mediante un ligador bifuncional (por ejemplo, un ligador de polietilenglicol o - (CH2CH2O)nCH2CH2-, donde n es un número entero de 1 a 50); y (iii) unir el segundo grupo funcional de la cabeza de dominio a una primera etiqueta del bloque de construcción para formar un complejo, donde las etapas (ii) y (iii) pueden realizarse en cualquier orden y donde la primera etiqueta del bloque de construcción codifica la reacción de unión de la etapa (ii), proporcionando de este modo una biblioteca etiquetada.

La cabeza de dominio incluye un nucleótido 2’-sustituido en uno o más del extremo 5’ o el extremo 3’ de la cabeza de dominio. En algunas realizaciones, la cabeza de dominio incluye el nucleótido 2’-sustituido y el segundo grupo funcional en el extremo 5’ o en el extremo 3’.

En otras realizaciones, la primera etiqueta del bloque de construcción incluye al menos un (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco o más) nucleótidos 2’-sustituidos. En realizaciones particulares, la primera etiqueta del bloque de construcción incluye un nucleótido 2’-sustituido en uno o más del extremo 5’, el extremo 3’, o la posición interna de la primera etiqueta del bloque de construcción (por ejemplo, un nucleótido 2’-O-metilo o un nucleótido de 2’- fluoro en los extremos 5’ y 3’). En algunas realizaciones, la primera etiqueta del bloque de construcción incluye un grupo protector en el extremo 3’ o en el extremo 5’.

En cualquiera de las realizaciones descritas en este documento, el nucleótido 2’-sustituido es un nucleótido 2’-O-metilo (por ejemplo, 2’-O-metilguanina o 2’-O-metiluracilo) o un nucleótido 2’-flúoro (por ejemplo, 2’-fluoro guanina o 2’-fluoro uracilo).

En cualquiera de las realizaciones anteriores, la etapa (ii) puede incluir unir, ligar o asociar operativamente la cabeza de dominio directamente al primer componente (por ejemplo, un andamio o un primer bloque de construcción). En aún otras realizaciones, la etapa (ii) incluye unir la cabeza de dominio indirectamente al primer componente (por ejemplo, un andamio o un primer bloque de construcción) a través de un ligador bifuncional (por ejemplo, el método incluye unir la cabeza de dominio con el primer grupo funcional del ligador y unir el primer componente con el segundo grupo funcional del ligador).

En cualquiera de las realizaciones anteriores, el método puede incluir además (iv) unir una segunda etiqueta de bloque de construcción al extremo 5’ o al extremo 3’ del complejo; y (v) unir un segundo componente (por ejemplo, un primer bloque de construcción o un segundo bloque de construcción) de la biblioteca química al primer componente, donde las etapas (iv) y (v) se pueden realizar en cualquier orden. En algunas realizaciones, la segunda etiqueta de bloque de construcción codifica la reacción de unión de la etapa (v). En otras realizaciones, la etapa (iv) puede incluir unir la segunda etiqueta de bloque de construcción al extremo 5’ del complejo; el complejo incluye un grupo fosfato en el extremo 5’; y la segunda etiqueta de bloque de construcción incluye un grupo hidroxilo en los extremos 3’ y 5’. En otras realizaciones, la etapa (iv) puede incluir además purificar el complejo y hacer reaccionar el complejo con una polinucleótido quinasa para formar un grupo fosfato en el extremo 5’antes de unir la segunda etiqueta del bloque de construcción. En otras realizaciones, la etapa (iv) puede incluir unir la segunda etiqueta de bloque de construcción al extremo 3’del complejo; el complejo incluye un grupo protector en el extremo 3’; y la segunda etiqueta del bloque de construcción incluye un grupo fosfato en el extremo 5’ y un grupo protector en el extremo 3’. En otras realizaciones más, la etapa (iv) puede incluir además la reacción del complejo con un agente hidrolizante para liberar el grupo protector del complejo antes de unir la segunda etiqueta del bloque de construcción al complejo.

En otras realizaciones, la segunda etiqueta del bloque de construcción incluye un nucleótido 2’-sustituido (por ejemplo, un nucleótido 2’-O-metilo o un nucleótido 2’-fluoro) en uno o más del 5’-terminal, 3’-terminal, o la posición interna de la segunda etiqueta de bloque de construcción (por ejemplo, un nucleótido de 2’-O-metilo y/o un nucleótido de 2’-fluoro en los extremos 5’ y 3’).

En algunas realizaciones, la etapa (iv) puede incluir el uso de una RNA ligasa (por ejemplo, RNA ligasa T4) y/o una ADN ligasa (por ejemplo, una ssADN ligasa) para unir la segunda etiqueta de bloque de construcción al complejo (por ejemplo, puede incluir el uso tanto de la ARN ligasa como de la ADN ligasa).

En otras realizaciones, la etapa (iii) puede incluir el uso de un ARN ligasa (por ejemplo, ARN ligasa T4) y/o una ADN ligasa (por ejemplo, ssADN ligasa) para unir la cabeza de dominio a la primera etiqueta del bloque de construcción (por ejemplo, puede incluir el uso tanto de la ARN ligasa como de la ADN ligasa).

En realizaciones adicionales, la etapa (iii) y/o la etapa (iv), si están presentes, pueden incluir el uso de polietilenglicol y/o uno o más cationes multivalentes solubles (por ejemplo, cloruro de magnesio, cloruro de manganeso (II) o cloruro de hexamina cobalto (III). En algunas realizaciones, el polietilenglicol está en una cantidad de aproximadamente 25% (p/v) a aproximadamente 35% (p/v) (por ejemplo, de aproximadamente 25% (p/v) a aproximadamente 30% (p/v)), de

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aproximadamente 30% (p/v) a aproximadamente 35% (p/v), o aproximadamente 30% (p/v)). En otras realizaciones, el polietilenglicol tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 5,500 Dalton (por ejemplo, aproximadamente 4,600 Dalton). En otras realizaciones. el uno o más cationes multivalentes solubles están en una cantidad de aproximadamente 0.05 mM a aproximadamente 10.5 mM (por ejemplo. de 0.05 mM a 0.5 mM, de 0.05 mM a 0.75 mM, de 0.05 mM a 1.0 mM, a partir de 0.05 mM a 1.5 mM, de 0.05 mM a 2.0 mM, de 0.05 mM a 3.0 mM, de 0.05 mM a 4.0 mM, de 0.05 mM a 5.0 mM, de 0.05 mM a 6.0 mM, de 0.05 mM a 7.0 mM, de 0.05 mM a 8.0 mM, de 0.05 mM a 9.0 mM, de 0.05 mM a 10.0 mM, de 0.1 mM a 0.5 mM, de 0.1 mM a 0.75 mM, de 0.1 mM a 1.0 mM, de 0.1 mM a

1.5 mM, de 0.1 mM a 2.0 mM, de 0.1 mM a 3.0 mM, de 0.1 mM a 4.0 mM, de 0.1 mM a 5.0 mM, de 0.1 mM a 6.0 mM, de 0.1 mM a 7.0 mM, de 0.1 mM a 8.0 mM, de 0.1 mM a 9.0 mM, de 0.1 mM a 10.0 mM, de 0.1 mM a 10.5 mM, de 0.5 mM a 0.75 mM, de 0.5 mM a 1.0 mM, de 0.5 mM a 1.5 mM, de 0.5 mM a 2.0 mM, de 0.5 mM a 3.0 mM . de 0.5 mM a 4.0 mM, de 0.5 mM a 5.0 mM, de 0.5 mM a 6.0 mM, de 0.5 mM a 7.0 mM, de 0.5 mM a 8.0 mM, de 0.5 mM a 9.0 mM, de 0.5 mM a 10.0 mM, de 0.5 mM a 10.5 mM, de 0.75 mM a 1.0 mM, de 0.75 mM a 1.5 mM, de 0.75 mM a 2.0 mM, de 0.75 mM a 3.0 mM, de 0.75 mM a 4.0 mM, de 0.75 mM a 5.0 mM, de 0.75 mM a 6.0 mM, de 0.75 mM a 7.0 mM, de 0.75 mM a 8.0 mM, de 0.75 mM a 9.0 mM, de 0.75 mM a 10.0 mM, de 0.75 mM a 10.5 mM, de 1.0 mM a 1.5 mM, de 1.0 mM a 2.0 mM, de 1.0 mM a 3.0 mM, de 1.0 mM a 4.0 mM, de 1.0 mM a 5.0 mM, de 1.0 mM a 6.0 mM, de 1.0 mM a 7.0 mM, de 1.0 mM a 8.0 mM, de 1.0 mM a 9.0 mM, de 1.0 mM a 10.0 mM, de 1.0 mM a 10.5 mM, de 1.5 mM a 2.0 mM, de 1.5 mM a 3.0 mM, de

1.5 mM a 4.0 mM, de 1.5 mM a 5.0 mM, de 1.5 mM a 6.0 mM, de 1.5 mM a 7.0 mM, de 1.5 mM a 8.0 mM, de 1.5 mM a

9.0 mM, de 1.5 mM a 10.0 mM, de 1.5 mM a 10.5 mM, de 2.0 mM a 3.0 mM, de 2.0 mM a 4.0 mM, de 2.0 mM a 5.0 mM, de 2.0 mM a 6.0 mM, de 2.0 mM a 7.0 mM, de 2.0 mM a 8.0 mM, de 2.0 mM a 9.0 mM, desde 2.0 mM a 10.0 mM, y desde

2.0 mM a 10.5 mM). En algunas realizaciones. uno o más cationes multivalentes están en una cantidad de aproximadamente 1 mM (por ejemplo. de 0.5 mM a 1.5 mM). En una realización particular, el catión multivalente está en forma de cloruro de hexamina cobalto (III).

En otras realizaciones, el método incluye además separar el complejo de cualquier etiqueta sin reaccionar o cabeza de dominio sin reaccionar antes de cualquiera de las etapas de unión (ii) - (v). En otras realizaciones, el método incluye además purificar el complejo antes de cualquiera de las etapas de unión (ii) - (v). En otras realizaciones, el método incluye además unir uno o más componentes adicionales (por ejemplo, un andamio o un primer bloque de construcción) y una o más etiquetas de bloques de construcción adicionales, en cualquier orden y después de cualquiera de las etapas de unión (ii) - (v)

La invención también presenta un método para marcar una primera biblioteca que incluye una entidad química codificada por oligonucleótidos, el método incluye: (i) proporcionar una cabeza de dominio que tiene un primer grupo funcional y un segundo grupo funcional, donde la cabeza de dominio incluye un nucleótido 2’ - sustituido en el extremo 5’, opcionalmente uno o más nucleótidos en la posición interna de la cabeza de dominio, y un grupo protector en la posición 2’ y/o la posición 3’ en el extremo 3’; (ii) unir el primer grupo funcional de la cabeza de dominio a un primer componente de la entidad química, donde la cabeza de dominio se conecta directamente al primer componente o la cabeza de dominio se conecta indirectamente al primer componente mediante un ligador bifuncional; y (iii) unir el segundo grupo funcional de la cabeza de dominio a una primera etiqueta del bloque de construcción, donde la primera etiqueta del bloque de construcción incluye un nucleótido 2’-sustituido y un grupo hidroxilo en el extremo 5’, opcionalmente uno o más nucleótidos en la posición interna de la etiqueta, y un nucleótido 2’-sustituido y un grupo hidroxilo en el extremo 3’; donde las etapas (ii) y (iii) pueden realizarse en cualquier orden y donde la primera etiqueta de bloque de construcción codifica la reacción de unión de la etapa (ii), proporcionando de ese modo una biblioteca etiquetada.

En algunas realizaciones, el nucleótido 2’-sustituido es un nucleótido 2’-O-metilo (por ejemplo, 2’-O-metilguanina) o un nucleótido 2’-fluoro (por ejemplo, 2’-fluoroguanina). En otras realizaciones, uno o más nucleótidos en la posición interna de la cabeza de dominio son 2’-desoxinucleótidos. En aún otras realizaciones, el ligador bifuncional es un ligador de polietilenglicol (por ejemplo, - (CH2CH2O)nCH2CH2-, donde n es un número entero de 1 a 50).

En otras realizaciones, uno o más nucleótidos (por ejemplo, uno o más 2’-desoxinucleótidos) están presentes en la posición interna de la cabeza de dominio o la etiqueta.

En algunas realizaciones, la etapa (iii) puede incluir el uso de uno o más cationes multivalentes solubles (por ejemplo, cloruro de magnesio, cloruro de manganeso (II) o cloruro de hexamina cobalto (III)), polietilenglicol (por ejemplo, teniendo un peso molecular medio de aproximadamente 4.600 Dalton) y ARN ligasa (por ejemplo, ARN ligasa T4).

En otro aspecto, la invención presenta métodos para identificar y/o descubrir una entidad química, el método incluye el etiquetado de una primera biblioteca que incluye una entidad química codificada por oligonucleótidos (por ejemplo, que incluye las etapas (i) a (iii) y que incluye opcionalmente las etapas (iv) a (v)) y seleccionar una característica o función particular (por ejemplo, seleccionar la unión a un objetivo de proteína que incluye exponer la entidad química o entidad química codificada por oligonucleótidos al objetivo de proteína y seleccionar una o más entidades químicas o entidades

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químicas codificadas por oligonucleótidos que se unen al objetivo de proteína (por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión por tamaño)). La invención también presenta un complejo que incluye una cabeza de dominio y una etiqueta de bloque de construcción, donde la etiqueta incluye de 5 a 20 nucleótidos, un nucleótido 2’-sustituido en el extremo 5’, y un nucleótido 2’-sustituido en el extremo 3’. En algunas realizaciones, el nucleótido 2’-sustituido en el extremo 5’ y/o el extremo 3’ es un nucleótido 2’-O-metilo (por ejemplo, 2’-O-metilguanina o 2’-O-metiluracilo) o un nucleótido 2’- fluoro (por ejemplo, 2’ - fluoro guanina o 2’- fluorouracilo). En realizaciones particulares, la cabeza de dominio incluye una estructura de horquilla. En algunas realizaciones, la cabeza de dominio incluye un nucleótido 2’-sustituido en uno o más del extremo 5’, el extremo 3’ o la posición interna de la cabeza de dominio. En otras realizaciones, la cabeza de dominio incluye además un extremo 5’ preadenilado. En otras realizaciones más, la cabeza de dominio incluye de 5 a 20 nucleótidos.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, la cabeza de dominio, la primera etiqueta del bloque de construcción, la segunda etiqueta del bloque de construcción, o la una o más etiquetas de bloques de construcción adicionales, si están presentes, incluyen un extremo 5’ preadenilado.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, el método incluye además el enlace de una o más (por ejemplo, Una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) etiquetas de bloques de construcción adicionales al complejo y vincular uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) componentes adicionales (por ejemplo, andamios o bloques de construcción) al complejo, donde una o más etiquetas de bloques de construcción adicionales codifica para uno o más componentes adicionales o codifican para la reacción de unión de uno o más componentes adicionales, proporcionando de ese modo una biblioteca etiquetada.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, el nucleótido 2’-sustituido es un nucleótido 2’-O-metilo, tal como 2’-O- metilguanina, 2’-O-metiluracilo, 2’-O-metilo adenosina, 2’-O-metil timidina, 2’-O-metil inosina, 2’-O-metil citidina o 2’-O-metil diamino purina. Alternativamente, en cualquiera de las realizaciones anteriores, el nucleótido 2’-sustituido es un nucleótido 2’-fluoro, tal como 2’-fluoro guanina, 2’-fluorouracilo, 2’-fluoro adenosina, 2’-fluoro timidina, 2’-fluoro inosina, 2’-fluoro citidina o 2’-fluoro diamino purina.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, la ARN ligasa es ARN ligasa T4 y/o la ADN ligasa es una ADNss.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, el método incluye una pluralidad de cabeza de dominios. En algunas realizaciones de este método, cada cabezal de la pluralidad de cabeza de dominios incluye una región de secuencia idéntica y una región de codificación diferente. En realizaciones particulares, la región de secuencia idéntica es una región de unión de cebador. En otras realizaciones, la región de codificación diferente es una etiqueta de bloque de construcción inicial que codifica para la cabeza de dominio o para una adición de un componente inicial.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, la unión en al menos una de las etapas (ii) - (iv), si está presente, incluye la ligación enzimática y/o la ligación química. En algunas realizaciones, la ligación enzimática incluye el uso de una RNA ligasa (por ejemplo, RNA ligasa T4) o una ADN ligasa (por ejemplo, ADNss ligasa). En otras realizaciones, la ligación enzimática incluye el uso de una ARN ligasa (por ejemplo, ARN ligasa T4) y una ADN ligasa (por ejemplo, ADN ligasa de ADN). En algunas realizaciones, la ligación química incluye el uso de uno o más pares químicamente co-reactivos (por ejemplo, un par que incluye un grupo alquinilo opcionalmente sustituido con un grupo azido opcionalmente sustituido, un par que incluye un dieno opcionalmente sustituido que tiene un sistema de electrones 4p por ejemplo, un compuesto 1,3- insaturado opcionalmente sustituido, tal como 1,3-butadieno opcionalmente sustituido, 1 -metoxi-3-trimetilsililoxi-1,3- butadieno, ciclopentadieno, ciclohexadieno o furano) con un dienófilo opcionalmente sustituido o un heterodienófilo opcionalmente sustituido que tiene un sistema de electrones 2p (por ejemplo, un grupo alquenilo opcionalmente sustituido o un grupo alquinilo opcionalmente sustituido); un par que incluye un nucleófilo (por ejemplo, una amina opcionalmente sustituida o un tiol opcionalmente sustituido) con un heterociclilo electrófilo filtrado (por ejemplo, epóxido, aziridina, ion aziridinio o episulfonio opcionalmente sustituidos), un par que incluye un grupo fosforotioato con un grupo yodo (por ejemplo, un grupo fosforotioato en el extremo 3’ y un grupo yodo en el extremo 5’); o un par que incluye un grupo aldehído con un grupo amino (por ejemplo, un amino primario o un grupo amino secundario, que incluye un grupo hidrazido)). En realizaciones particulares, el par químicamente co-reactivo produce un separador resultante que tiene una longitud de aproximadamente 4 a aproximadamente 24 átomos (por ejemplo, de aproximadamente 4 a aproximadamente 10 átomos). En otras realizaciones, la ligación química incluye el uso de un grupo fosforotioato (por ejemplo, en el extremo 3’) y un grupo yodo (por ejemplo, en el extremo 5’). En realizaciones adicionales, la ligación química incluye un oligonucleótido de empalme en la reacción de unión. En algunas realizaciones, la ligación química incluye el uso de un grupo fosforotioato (por ejemplo, en el extremo 3’ de la cabeza de dominio, la primera etiqueta del bloque de construcción, la segunda etiqueta del bloque de construcción, la una o más etiquetas adicionales del bloque de construcción, la etiqueta de identificación de biblioteca, la etiqueta de uso y/o la etiqueta de origen, si está presente), un grupo yodo (por ejemplo, en el extremo 5’ de la cabeza de dominio, la primera etiqueta del bloque de construcción, la segunda etiqueta del bloque de construcción, una o más etiquetas de bloques de construcción adicionales, la etiqueta de identificación de la biblioteca, la etiqueta de uso,

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y/o la etiqueta de origen, si está presente), y un oligonucleótido de empalme en la reacción de unión, donde el uso evita el uso de uno o más grupos protectores. En otras realizaciones, la ligación química de etiquetas múltiples comprende el uso alternativo de pares co-reactivos químicamente ortogonales (por ejemplo, dos o más pares químicamente co-reactivos descritos en este documento) para ligar etiquetas sucesivas.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, la cabeza de dominio puede incluir una estructura de una sola cadena (por ejemplo, horquilla).

En cualquiera de las realizaciones anteriores, la cabeza de dominio, la primera etiqueta de bloque de construcción, la segunda etiqueta de bloque de construcción, la una o más etiquetas de bloque de construcción adicionales, la etiqueta de identificación de biblioteca, la etiqueta de uso y/o la etiqueta de origen , si está presente, incluye una secuencia que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 %, o 100% idéntica) a cualquier secuencia descrita en este documento (por ejemplo, la secuencia en una cualquiera de SEQ ID NOs: 6-21,26, 27 o 29-31), o una secuencia que es complementaria a una secuencia que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica) a cualquier secuencia descrita en la presente memoria (por ejemplo, la secuencia en cualquiera de las SEQ ID NOs: 6-21, 26, 27 o 29-31). En realizaciones particulares, la primera etiqueta de bloque de construcción, la segunda etiqueta de bloque de creación, la una o más etiquetas adicionales de bloque de creación, la etiqueta de identificación de biblioteca, la etiqueta de uso y/o la etiqueta de origen, si están presentes, incluyen además una secuencia que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos) a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, los métodos o complejos incluyen solo moléculas de una sola cadena, donde la cabeza de dominio, la primera etiqueta del bloque de construcción, la segunda etiqueta del bloque de construcción y/o la una o más etiquetas adicionales del bloque de construcción son de una sola cadena. En algunas realizaciones, una o más de las moléculas de una sola cadena tienen una estructura en horquilla. En realizaciones particulares, la cabeza de dominio incluye una estructura de horquilla y la una o más etiquetas de bloques de construcción no incluyen una estructura de horquilla.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, el método comprende adicionalmente una o más etapas opcionales para diversificar la biblioteca o interrogar a los miembros de la biblioteca, como se describe en este documento. En algunas realizaciones, el método comprende además identificar un pequeño miembro de la biblioteca similar a un fármaco que se une o inactiva una proteína de interés terapéutico. En otras realizaciones, el método comprende además contactar a un miembro de la biblioteca con un objetivo biológico en condiciones adecuadas para que al menos un miembro de la biblioteca se una al objetivo, eliminando uno o más miembros de la biblioteca que no se unen al objetivo, y analizar la una o más etiquetas de oligonucleótidos asociadas con ellas.

Como se describe en este documento, el uso de moléculas de una sola cadena (por ejemplo, que incluyen moléculas en horquilla) podría tener numerosos beneficios. De acuerdo con lo anterior, en cualquiera de las realizaciones descritas en este documento, los métodos y complejos incluyen una cabeza de dominio, una o más etiquetas de bloque de construcción, un complejo, una entidad química, una molécula o cualquier miembro de una biblioteca etiquetada que tiene masa disminuida, solubilidad incrementada (por ejemplo , en un solvente orgánico), coste reducido, reactividad aumentada, accesibilidad aumentada del objetivo, radio hidrodinámico disminuido, y/o exactitud aumentada de evaluaciones analíticas, en comparación con un método que incluye una o más moléculas de cadena doble (por ejemplo, una cabeza de dominio de cadena doble o una etiqueta de bloque de construcción de cadena doble). En algunas realizaciones, cada una de las etiquetas de bloque de construcción (por ejemplo, la primera etiqueta de bloque de construcción, la segunda etiqueta de bloque de construcción y/o una o más etiquetas de bloque de construcción adicionales, si están presentes) tiene aproximadamente la misma masa (por ejemplo, cada etiqueta de bloque de construcción tiene una masa que es aproximadamente +/- 10% de la masa promedio entre dos o más etiquetas de bloques de construcción). En realizaciones particulares, la etiqueta del bloque de construcción tiene una masa disminuida (por ejemplo, menos de aproximadamente

15.000 Dalton, aproximadamente 14,000 Dalton, aproximadamente 13,000 Dalton, aproximadamente 12,000 Dalton, aproximadamente 11,000 Dalton, aproximadamente 10,000 Dalton, aproximadamente 9,000 Dalton, aproximadamente

8.000 Dalton, aproximadamente 7,500 Dalton, aproximadamente 7,000 Dalton, aproximadamente 6,000 Dalton, aproximadamente 6,500 Dalton, aproximadamente 5,000 Dalton, aproximadamente 5,500 Dalton, aproximadamente 4,000 Dalton, aproximadamente 4,500 Dalton, o aproximadamente 3,000 Dalton en comparación con una etiqueta bicatenaria (por ejemplo, una etiqueta de cadena doble que tiene una masa de aproximadamente 15,000 Dalton, aproximadamente

14.000 Dalton, aproximadamente 13,000 Dalton, o aproximadamente 12,000 Dalton). En otras realizaciones, la etiqueta del bloque de construcción tiene una longitud reducida en comparación con una etiqueta de cadena doble (por ejemplo, una etiqueta de cadena doble que tiene una longitud de menos de aproximadamente 20 nucleótidos, menos de aproximadamente 19 nucleótidos, menos de aproximadamente 18 nucleótidos, menos de aproximadamente 17

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nucleótidos, menos de aproximadamente 16 nucleótidos, menos de aproximadamente 15 nucleótidos, menos de aproximadamente 14 nucleótidos, menos de aproximadamente 13 nucleótidos, menos de aproximadamente 12 nucleótidos, menos de aproximadamente 11 nucleótidos, menos de aproximadamente 10 nucleótidos, menos que aproximadamente 9 nucleótidos, menos de aproximadamente 8 nucleótidos, o menos de aproximadamente 7 nucleótidos). En algunas realizaciones, una o más etiquetas o elementos de bloque de construcción de la biblioteca carecen de una región de unión de cebador y/o una región constante (por ejemplo, durante una etapa de selección, tal como selección utilizando cromatografía de exclusión de tamaño). En algunas realizaciones, uno o más marcadores de bloques de construcción o miembros de la biblioteca tienen una región constante reducida (por ejemplo, una longitud inferior a aproximadamente 30 nucleótidos, inferior a aproximadamente 25 nucleótidos, inferior a aproximadamente 20 nucleótidos, inferior a aproximadamente 19 nucleótidos, inferior de aproximadamente 18 nucleótidos, menos de aproximadamente 17 nucleótidos, menos de aproximadamente 16 nucleótidos, menos de aproximadamente 15 nucleótidos, menos de aproximadamente 14 nucleótidos, menos de aproximadamente 13 nucleótidos, menos de aproximadamente 12 nucleótidos, menos de aproximadamente 11 nucleótidos, menos de aproximadamente 10 nucleótidos, menos de aproximadamente 9 nucleótidos, menos de aproximadamente 8 nucleótidos o menos de aproximadamente 7 nucleótidos). En otras realizaciones, los métodos incluyen una cabeza de dominio que codifica una molécula, una porción de una entidad química, una reacción de unión (por ejemplo, ligadura química o enzimática) de una etapa, o la identidad de una biblioteca, donde la cabeza codificadora elimina la necesidad de una etiqueta de bloque de construcción adicional para codificar dicha información.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, un oligonucleótido (por ejemplo, la cabeza de dominio, la primera etiqueta del bloque de construcción, la segunda etiqueta del bloque de construcción y/o una o más etiquetas de bloques de construcción adicionales, si están presentes) codifica para la identidad de la biblioteca. En algunas realizaciones, el oligonucleótido (por ejemplo, la cabeza de dominio, la primera etiqueta de bloque de construcción, la segunda etiqueta de bloque de construcción, y/o una o más etiquetas de bloque de construcción adicionales, si están presentes) incluye una primera secuencia de identificación de biblioteca, donde la secuencia codifica para la identidad de la primera biblioteca. En realizaciones particulares, el oligonucleótido es una primera etiqueta identificadora de biblioteca. En algunas realizaciones, el método incluye proporcionar una primera etiqueta de identificación de biblioteca, donde la etiqueta incluye una secuencia que codifica para una primera biblioteca y/o unir la primera etiqueta de identificación de biblioteca al complejo. En algunas realizaciones, el método incluye proporcionar una segunda biblioteca y combinar la primera biblioteca con una segunda biblioteca. En realizaciones adicionales, el método incluye proporcionar una segunda etiqueta de identificación de biblioteca, donde la etiqueta incluye una secuencia que codifica para una segunda biblioteca.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, un oligonucleótido (por ejemplo, una cabeza de dominio y/o uno o más bloques de construcción) codifica para el uso del miembro de la biblioteca (por ejemplo, uso en una etapa de selección o una etapa de enlace, como se describe aquí). En algunas realizaciones, el oligonucleótido (por ejemplo, la cabeza de dominio, la primera etiqueta de bloque de construcción, la segunda etiqueta de bloque de construcción, y/o una o más etiquetas de bloque de construcción adicionales, si están presentes) incluye una secuencia de uso, donde la secuencia codifica para uso de un subconjunto de miembros en la biblioteca en uno o más pasos (por ejemplo, una etapa de selección y/o una etapa de enlace). En realizaciones particulares, el oligonucleótido es una etiqueta de uso que incluye una secuencia de uso. En algunas realizaciones, un oligonucleótido (por ejemplo, una cabeza de dominio y/o uno o más bloques de construcción) codifica el origen del miembro de la biblioteca (por ejemplo, en una parte particular de la biblioteca). En algunas realizaciones, el oligonucleótido (por ejemplo, la cabeza de dominio, la primera etiqueta de bloque de construcción, la segunda etiqueta de bloque de construcción y/o una o más etiquetas de bloque de construcción adicionales, si está presente) incluye una secuencia de origen (por ejemplo, una secuencia degenerada aleatoria que tiene una longitud de aproximadamente 10, 9, 8, 7 o 6 nucleótidos), donde la secuencia codifica el origen del miembro en la biblioteca. En realizaciones particulares, el oligonucleótido es una etiqueta de origen que incluye una secuencia de origen. En algunas realizaciones, el método incluye además unir, ligar o asociar operativamente una etiqueta de uso y/o una etiqueta de origen al complejo.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, los métodos, composiciones y complejos incluyen opcionalmente una cola de dominio, donde la cola de dominio incluye una o más de una secuencia identificadora de la biblioteca, una secuencia de uso o una secuencia de origen, como se describe en este documento. En realizaciones particulares, los métodos incluyen además unir, ligar o asociar operativamente la cola de dominio (que incluye, por ejemplo, una o más de una secuencia identificadora de la biblioteca, una secuencia de uso o una secuencia de origen) al complejo.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, los métodos, composiciones y complejos, o porciones de los mismos (por ejemplo, la cabeza de dominio, la primera etiqueta del bloque de construcción, la segunda etiqueta del bloque de construcción y/o la una o más etiquetas de bloques de construcción adicionales, si está presente), incluye un grupo fosfato modificado (por ejemplo, un fosforotioato o un enlace 5’-N-fosforamidito) entre el nucleótido terminal en el extremo 3’ y el nucleótido adyacente al nucleótido terminal. En realizaciones particulares, el grupo fosfato modificado minimiza la mezcla

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durante la ligación enzimática entre dos oligonucleótidos (por ejemplo, minimiza la inclusión de un nucleótido adicional o la escisión de un nucleótido en el producto o complejo final, en comparación con las secuencias de dos oligonucleótidos a ligar, tales como entre una cabeza de dominio a una etiqueta de bloque de construcción o entre una primera etiqueta de bloque de construcción y una segunda etiqueta de bloque de construcción), en comparación con el ligado entre dos oligonucleótidos (por ejemplo, una cabeza de dominio y una etiqueta de bloque de construcción o una primera etiqueta de bloque de construcción y un segundo etiqueta del bloque de construcción) que carece del grupo de fosfato modificado. En algunas realizaciones, el complejo puede incluir un fosforotioato o un grupo triazol.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, los métodos, composiciones y complejos, o partes de los mismos (por ejemplo, la cabeza de dominio, la primera etiqueta del bloque de construcción, la segunda etiqueta del bloque de construcción, y/o la una o más etiquetas de bloques de construcción adicionales, si está presente), incluye una modificación que respalda la solubilidad en condiciones semi, reducidas o no acuosas (por ejemplo, orgánicas). En algunas realizaciones, el ligador bifuncional, la cabeza de dominio o una o más etiquetas de bloque de construcción se modifican para aumentar la solubilidad de un miembro de dicha biblioteca química codificada por ADN en condiciones orgánicas. En algunas realizaciones, la modificación es una o más cadenas de alquilo, una unidad de polietilenglicol, una especie ramificada con cargas positivas o una estructura de anillo hidrófoba. En algunas realizaciones, la modificación incluye uno o más nucleótidos modificados que tienen una fracción hidrófoba (por ejemplo, modificado en las posiciones C5 de las bases T o C con cadenas alifáticas, como en 5’-dimetoxitritil-N4-diisobutilaminometilideno-5- (1 -) propinil) -2’-desoxicitidina, 3’- [(2-cianoetil) - (N, N-diisopropil)] - fosforamidita; 5’-dimetoxitritil-5- (1 -propinil) -2’-desoxiuridina, 3’- [(2-cianoetil) - (N, N- diisopropil)] - fosforamidita; 5’-dimetoxitritil-5-fluoro-2’-desoxiuridina, 3’- [(2-cianoetil) - (N, N-diisopropil)] -fosforamidita y 5’-dimetoxitritil-5- (piren-1-il-etinil) -2’-desoxiuridina, o 3’- [(2-cianoetil) - (N, N-diisopropil)] - fosforamidita) o inserción que tiene una fracción hidrófoba (por ejemplo, un azobenceno). En algunas realizaciones, el miembro de la biblioteca tiene un coeficiente de octanol: agua de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 2.5 (por ejemplo. aproximadamente 1.0 a aproximadamente 1.5. aproximadamente 1.0 a aproximadamente 2.0. aproximadamente 1.3 a aproximadamente 1.5. aproximadamente 1.3 a aproximadamente 2.0. aproximadamente 1.3 a aproximadamente 2.5. aproximadamente 1.5 a aproximadamente 2.0. aproximadamente 1.5 a aproximadamente 2.5. o aproximadamente 2.0 a aproximadamente 2.5).

En cualquiera de las realizaciones anteriores, la cabeza de dominio, la cola de dominio, la primera etiqueta del bloque de construcción, la segunda etiqueta del bloque de construcción, la una o más etiquetas de bloques de construcción adicionales, la etiqueta de identificación de la biblioteca, la etiqueta de uso y/o la etiqueta de origen, si está presente, puede incluir de 5 a 20 nucleótidos (por ejemplo, de 5 a 7 nucleótidos, de 5 a 8 nucleótidos, de 5 a 9 nucleótidos, de 5 a 10 nucleótidos, de 5 a 11 nucleótidos, de 5 a 12 nucleótidos, de 5 a 13 nucleótidos, de 5 a 14 nucleótidos, de 5 a 15 nucleótidos, de 5 a 16 nucleótidos, de 5 a 17 nucleótidos, de 5 a 18 nucleótidos, de 5 a 19 nucleótidos, de 6 a 7 nucleótidos , de 6 a 8 nucleótidos, de 6 a 9 nucleótidos, de 6 a 10 nucleótidos, de 6 a 11 nucleótidos, de 6 a 12 nucleótidos, de 6 a 13 nucleótidos, de 6 a 14 nucleótidos, de 6 a 15 nucleótidos, de 6 a 16 nucleótidos, de 6 a 17 nucleótidos, de 6 a 18 nucleótidos, de 6 a 19 nucleótidos, de 6 a 20 nucleótidos, de 7 a 8 nucleótidos, de 7 a 9 nucleótidos, de 7 a 10 nucleótidos, de 7 a 11 nucleótidos, de 7 a 12 nucleótidos, de 7 a 13 nucleótidos, de 7 a 14 nucleótidos, de 7 a 15 nucleótidos, de 7 a 16 nucleótidos, de 7 a 17 nucleótidos, de 7 a 18 nucleótidos, de 7 a 19 nucleótidos, de 7 a 20 nucleótidos, de 8 a 9 nucleótidos, de 8 a 10 nucleótidos, de 8 a 11 nucleótidos, de 8 a 12 nucleótidos , de 8 a 13 nucleótidos, de 8 a 14

nucleótidos, de 8 a 15 nucleótidos, de 8 a 16 nucleótidos, de 8 a 17 nucleótidos, de 8 a 18 nucleótidos, de 8 a 19

nucleótidos, de 8 a 20 nucleótidos, de 9 a 10 nucleótidos, de 9 a 11 nucleótidos, de 9 a 12 nucleótidos, de 9 a 13

nucleótidos, de 9 a 14 nucleótidos, de 9 a 15 nucleótidos, de 9 a 16 nucleótidos, de 9 a 17 nucleótidos, de 9 a 18

nucleótidos, de 9 a 19 nucleótidos, de 9 a 20 nucleótidos, de 10 a 11 nucleótidos, de 10 a 12 nucleótidos, de 10 a 13 nucleótidos leotardos, de 10 a 14 nucleótidos, de 10 a 15 nucleótidos, de 10 a 16 nucleótidos, de 10 a 17 nucleótidos, de 10 a 18 nucleótidos, de 10 a 19 nucleótidos, de 10 a 20 nucleótidos, de 11 a 12 nucleótidos, de 11 a 13 nucleótidos, de 11 a 14 nucleótidos, de 11 a 15 nucleótidos, de 11 a 16 nucleótidos, de 11 a 17 nucleótidos, de 11 a 18 nucleótidos, de 11 a 19 nucleótidos, de 11 a 20 nucleótidos, de 12 a 13 nucleótidos, de 12 a 14 nucleótidos, de 12 a 15 nucleótidos, de 12 a 16 nucleótidos, de 12 a 17 nucleótidos, de 12 a 18 nucleótidos, de 12 a 19 nucleótidos, de 12 a 20 nucleótidos, de 13 a 14

nucleótidos, de 13 a 15 nucleótidos, de 13 a 16 nucleótidos, de 13 a 17 nucleótidos, de 13 a 18 nucleótidos, de 13 a 19

nucleótidos, de 13 a 20 nucleótidos, de 14 a 15 nucleótidos, de 14 a 16 nucleótidos, de 14 a 17 nucleótidos, de 14 a 18

nucleótidos, de 14 a 19 nucleótidos, de 14 a 20 nucleótidos, de 15 a 16 nucleótidos, de 15 a 17 nucleótidos, de 15 a 18

nucleótidos, de 15 a 19 nucleótidos, de 15 a 20 nucleótidos, de 16 a 17 nucleótidos, de 16 a 18 nucleótidos, de 16 a 19

nucleótidos, de 16 a 20 nucleótidos, de 17 a 18 nucleótidos, de 17 a 19 nucleótidos, de 17 a 20 nucleótidos, de 18 a 19

nucleótidos, de 18 a 20 nucleótidos y de 19 a 20 nucleótidos). En realizaciones particulares, la cabeza de dominio, la primera etiqueta de bloque de construcción, la segunda etiqueta de bloque de construcción, la una o más etiquetas de bloque de construcción adicionales, la etiqueta de identificación de biblioteca, la etiqueta de uso y/o la etiqueta de origen, si están presentes, tienen una longitud de menos de 20 nucleótidos (por ejemplo, menos de 19 nucleótidos, menos de 18 nucleótidos, menos de 17 nucleótidos, menos de 16 nucleótidos, menos de 15 nucleótidos, menos de 14 nucleótidos, menos de 13 nucleótidos, menos de 12 nucleótidos, menos de 11 nucleótidos, menos de 10 nucleótidos, menos de 9 nucleótidos, menos de 8 nucleótidos o menos de 7 nucleótidos).

En realizaciones particulares, la primera etiqueta de bloque de construcción y la segunda etiqueta de bloque de construcción incluyen el mismo número de nucleótidos. En otras realizaciones, la primera etiqueta de bloque de construcción o la segunda etiqueta de bloque de construcción incluye más de 8 nucleótidos (por ejemplo, más de 9 nucleótidos, más de 10 nucleótidos, más de 11 nucleótidos, más de 12 nucleótidos, más de 13 nucleótidos, más de 14 5 nucleótidos y más de 15 nucleótidos). En algunas realizaciones, la primera etiqueta de bloque de construcción es una etiqueta de donante (por ejemplo, como se define en la presente memoria) que tiene de 8 a 20 nucleótidos (por ejemplo, de 8 a 9 nucleótidos, de 8 a 10 nucleótidos, de 8 a 11 nucleótidos, de 8 a 12 nucleótidos, de 8 a 13 nucleótidos, de 8 a 14 nucleótidos, de 8 a 15 nucleótidos, de 8 a 16 nucleótidos, de 8 a 17 nucleótidos, de 8 a 18 nucleótidos, de 8 a 19 nucleótidos, de 8 a 20 nucleótidos , de 9 a 10 nucleótidos, de 9 a 11 nucleótidos, de 9 a 12 nucleótidos, de 9 a 13 10 nucleótidos, de 9 a 14 nucleótidos, de 9 a 15 nucleótidos, de 9 a 16 nucleótidos, de 9 a 17 nucleótidos, de 9 a 18 nucleótidos, de 9 a 19 nucleótidos, de 9 a 20 nucleótidos, de 10 a 11 nucleótidos, de 10 a 12 nucleótidos, de 10 a 13 nucleótidos, de 10 a 14 nucleótidos, de 10 a 15 nucleótidos, de 10 a 16 nucleótidos, de 10 a 17 nucleótidos, de 10 a 18 nucleótidos, de 10 a 19 nucleótidos, de 10 a 20 nucleótidos, para m 11 a 12 nucleótidos, de 11 a 13 nucleótidos, de 11 a 14 nucleótidos, de 11 a 15 nucleótidos, de 11 a 16 nucleótidos, de 11 a 17 nucleótidos, de 11 a 18 nucleótidos, de 11 a 19 15 nucleótidos, de 11 a 20 nucleótidos, de 12 a 13 nucleótidos, de 12 a 14 nucleótidos, de 12 a 15 nucleótidos, de 12 a 16 nucleótidos, de 12 a 17 nucleótidos, de 12 a 18 nucleótidos, de 12 a 19 nucleótidos, de 12 a 20 nucleótidos, de 13 a 14

20 nucleótidos, de 15 a 19 nucleótidos, de 15 a 20 nucleótidos, de 16 a 17 nucleótidos, de 16 a 18 nucleótidos, de 16 a 19 nucleótidos, de 16 a 20 nucleótidos, de 17 a 18 nucleótidos, de 17 a 19 nucleótidos, de 17 a 20 nucleótidos, de 18 a 19

nucleótidos, de 18 a 20 nucleótidos y de 19 a 20 nucleótidos).

Definiciones

Por “nucleótido 2’-sustituido” se entiende una base de nucleótidos que tiene una sustitución en la posición 2’de la ribosa 25 en la base.

Por “aproximadamente” se entiende +/- 10% del valor indicado.

Por “bifuncional” se entiende que tiene dos grupos reactivos que permiten la unión de dos fracciones químicas. Por ejemplo, un ligador bifuncional es un ligador, como se describe en este documento, que tiene dos grupos reactivos que permiten la unión de una cabeza de dominio y una entidad química.

30 Por “unión” se entiende unir por un enlace covalente o un enlace no covalente. Los enlaces no covalentes incluyen los formados por fuerzas de van der Waals, enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, atrapamiento o encapsulación física, absorción, adsorción y otras fuerzas intermoleculares. La unión se puede llevar a cabo por cualquier medio útil, tal como por unión enzimática (por ejemplo, ligamiento enzimático) o por unión química (por ejemplo, ligamiento químico).

Por “bloque de construcción” se entiende una unidad estructural de una entidad química, donde la unidad está directamente 35 unida a otras unidades estructurales químicas o está unida indirectamente a través del andamio. Cuando la entidad química es polimérica u oligomérica, los bloques de construcción son las unidades monoméricas del polímero u oligómero. Los bloques de construcción pueden tener uno o más nodos de diversidad que permiten la adición de uno o más bloques de construcción o andamios. En la mayoría de los casos, cada nodo de diversidad es un grupo funcional capaz de reaccionar con uno o más bloques de construcción o andamios para formar una entidad química. En general, los bloques de 40 construcción tienen al menos dos nodos de diversidad (o grupos funcionales reactivos), pero algunos bloques de construcción pueden tener un nodo de diversidad (o grupo funcional reactivo). Alternativamente, las etapas químicas o de unión codificados pueden incluir varios componentes químicos (por ejemplo, reacciones de condensación multicomponente o procesos de múltiples etapas). Los grupos reactivos en dos bloques de construcción diferentes deberían ser complementarios, es decir, capaces de reaccionar juntos para formar un enlace covalente o no covalente.

45 Por “etiqueta de bloque de construcción” se entiende una porción de oligonucleótido de la biblioteca que codifica la adición (por ejemplo, mediante una reacción de unión) de un componente (es decir, un andamio o un bloque de construcción), la cabeza de dominio en la biblioteca, la identidad de la biblioteca, el uso de la biblioteca y/o el origen de un miembro de la biblioteca. Por “marcador aceptor” se entiende una etiqueta de bloque de construcción que tiene una entidad reactiva (por ejemplo, un grupo hidroxilo en el extremo 3’en el caso de la ligación enzimática). Por “etiqueta de donante” se entiende 50 una etiqueta de bloque de construcción que tiene una entidad capaz de reaccionar con la entidad reactiva en la etiqueta de aceptación (por ejemplo, un grupo fosforilo en el extremo 5’ en el caso de la ligación enzimática).

Por “entidad química” se entiende un compuesto que comprende uno o más bloques de construcción y opcionalmente un andamio. La entidad química puede ser cualquier molécula pequeña o fármaco peptídico o candidato a fármaco diseñado o construido para tener una o más características deseadas, por ejemplo, capacidad para unir un objetivo biológico, solubilidad, disponibilidad de donantes y aceptores de enlaces de hidrógeno, grados de libertad de rotación de los enlaces, 5 carga positiva, carga negativa y similares. En ciertas realizaciones, la entidad química puede hacerse reaccionar adicionalmente como una entidad bifuncional o trifuncional (o mayor).

Por “par químicamente co-reactivo” se entiende un par de grupos reactivos que participan en una reacción modular con alto rendimiento y una alta ganancia termodinámica, produciendo así un separador. Las reacciones ejemplares y los pares químicamente co-reactivos incluyen una reacción de cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen con un par de un grupo alquinilo 10 opcionalmente sustituido y un grupo azido opcionalmente sustituido; una reacción de Diels-Alder con un par de un dieno opcionalmente sustituido que tiene un sistema de electrones de 4p y un dienófilo opcionalmente sustituido o un heterodienófilo opcionalmente sustituido que tiene un sistema de electrones de 2p; una reacción de apertura de anillo con un nucleófilo y un electrófilo heterociclilo en cadena; una reacción de ligadura de empalme con un grupo fosforotioato y un grupo yodo; y una reacción de aminación reductiva con un grupo aldehído y un grupo amino, como se describe en este 15 documento.

Por complejo “complejo” o “complejo ligado” se entiende una cabeza de dominio que se asocia operativamente con una entidad química y/o una o más marcas de oligonucleótidos mediante un enlace covalente o un enlace no covalente. El complejo puede incluir opcionalmente un ligador bifuncional entre la entidad química y la cabeza de dominio.

Por “componente” de una entidad química se entiende un andamio o un bloque de construcción.

20 Por “nodo de diversidad” se entiende un grupo funcional en una posición en el andamio o en el bloque de construcción que permite agregar otro bloque de construcción.

Por “cabeza de dominio” se entiende un oligonucleótido de partida para la síntesis de bibliotecas que está operativamente unido a un componente de una entidad química y a una etiqueta de bloque de construcción. Opcionalmente, un ligador bifuncional conecta la cabeza de dominio con el componente.

25 Por “biblioteca” se entiende una biblioteca de moléculas o entidades químicas. Opcionalmente, las moléculas o entidades químicas están unidas a uno o más oligonucleótidos que codifican las moléculas o porciones de la entidad química.

Por “ligador” se entiende una entidad de conexión química que une la cabeza de dominio a una entidad química.

Por “catión multivalente” se entiende un catión capaz de formar más de un enlace con más de un ligando o anión. El catión multivalente puede formar un complejo iónico o un complejo de coordinación. Ejemplos de cationes multivalentes incluyen 30 los de metales alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio) y metales de transición (por ejemplo, manganeso (II) o cobalto (III)) y aquellos que están opcionalmente unidos a uno o más aniones y/o uno o más compuestos univalentes o ligandos polidentados, tales como cloruro, amina y/o etilendiamina.

Por “oligonucleótido” se entiende un polímero de nucleótidos que tiene un extremo 5’, un extremo 3’ y uno o más nucleótidos en la posición interna entre los extremos 5’ y 3’. El oligonucleótido puede incluir ADN, ARN o cualquier derivado 35 del mismo conocido en la técnica que pueda sintetizarse y utilizarse para el reconocimiento de pares de bases. El oligonucleótido no tiene que tener bases contiguas, pero se puede intercalar con fracciones ligadoras. El polímero oligonucleotídico puede incluir bases naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina, desoxicitidina, inosina o diamino purina), análogos de base (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, C5-propinilcitidina, C5- 40 propiniluridina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-metilcitidina, 7-deazaadenosina, 7- deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O (6) -metilguanina y 2-tiocitidina), nucleótidos modificados (por ejemplo, nucleótidos 2’-sustituidos, tales como bases 2’-O-metiladas y bases 2’-fluoro), bases intercaladas, azúcares modificados (por ejemplo, 2’ -fluororibosa, ribosa, 2’-desoxirribosa, arabinosa y hexosa), y/o grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos y enlaces 5’-N-fosforamiditos). Otras bases modificadas se describen en este documento. Por 45 “oligonucleótido aceptor” se entiende un oligonucleótido que tiene una entidad reactiva (por ejemplo, un grupo hidroxilo en el extremo 3’en el caso de la ligación enzimática o un grupo azido opcionalmente sustituido en el caso de la ligación química). Por “oligonucleótido donante” se entiende un oligonucleótido que tiene una entidad capaz de reaccionar con la entidad reactiva en el oligonucleótido aceptor (por ejemplo, un grupo fosforilo en el extremo 5’en el caso de la ligación enzimática o un grupo alquinilo opcionalmente sustituido en el caso de ligadura química).

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Por “ligado operativamente” o “asociado operativamente” se entiende que dos o más estructuras químicas están unidas directa o indirectamente entre sí de tal manera que permanecen unidas a través de las diversas manipulaciones que se espera que experimenten. Típicamente, la entidad química y la cabeza de dominio están operativamente unidas de manera indirecta (por ejemplo, De forma covalente a través de un ligador apropiado). Por ejemplo, el ligador puede ser una fracción bifuncional con un sitio de unión para la entidad química y un sitio de unión para la cabeza de dominio. Además, la entidad química y la etiqueta de oligonucleótido pueden estar operativamente unidas directa o indirectamente (por ejemplo, De forma covalente a través de un ligador apropiado).

Por “grupo protector” se entiende un grupo destinado a proteger el extremo 3’o el extremo 5’ de un oligonucleótido frente a reacciones indeseables durante una o más etapas de unión de etiquetar una biblioteca codificada por ADN. Los grupos protectores usados comúnmente se describen en Greene, “Protective Groups in Organic Synthesis”, 4a edición (John Wiley & Sons, Nueva York, 2007).

Los ejemplos de grupos protectores incluyen grupos protectores irreversibles, tales como didesoxinucleótidos y didesoxinucleósidos (ddNTP o ddN), y, más preferiblemente, grupos protectores reversibles para grupos hidroxilo, tales como grupos éster (por ejemplo, éster O- (a-metoxietilo), éster O-isovalerílico y éster O-levulinílico), grupos tritilo (por ejemplo, Dimetoxitritilo y monometoxitritilo), grupos xantilo (por ejemplo, 9-fenilxanten-9-ilo y 9- (p-metoxifenil) xanten-9- ilo), acilo grupos (por ejemplo, fenoxiacetilo y acetilo) y grupos sililo (por ejemplo, t-butildimetilsililo).

Por “purificar” se entiende la eliminación de cualquier producto sin reaccionar o cualquier agente presente en una mezcla de reacción que pueda reducir la actividad de un agente químico o biológico para ser utilizado en una etapa sucesiva. El purificador puede incluir una o más de separación cromatográfica, separación electroforética y precipitación del producto o reactivo sin reaccionar a eliminar.

Por “andamio” se entiende una fracción química que muestra uno o más nodos de diversidad en una geometría especial particular. Los nodos de diversidad normalmente se unen al andamio durante la síntesis de la biblioteca, pero en algunos casos se puede unir un nodo de diversidad al andamio antes de la síntesis de la biblioteca (por ejemplo, adición de uno o más bloques de construcción y/o una o más etiquetas). En algunas realizaciones, el andamio se deriva de manera que puede desprotegerse ortogonalmente durante la síntesis de la biblioteca y posteriormente reaccionarse con diferentes nodos de diversidad.

Por fármaco de “molécula pequeña” o candidato de fármaco de “molécula pequeña” se entiende una molécula que tiene un peso molecular por debajo de aproximadamente 1,000 Dalton. Las moléculas pequeñas pueden ser orgánicas o inorgánicas, aisladas (por ejemplo, A partir de bibliotecas de compuestos o fuentes naturales) u obtenidas por derivación de compuestos conocidos.

Por “identidad sustancial” o “sustancialmente idéntica” se entiende una secuencia de polipéptido o polinucleótido que tiene el mismo polipéptido o secuencia de polinucleótido, respectivamente, como una secuencia de referencia, o tiene un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, que son iguales en la ubicación correspondiente dentro de una secuencia de referencia cuando las dos secuencias están alineadas de manera óptima. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que es “sustancialmente idéntica” a una secuencia de referencia tiene al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de referencia. Para los polipéptidos, la longitud de las secuencias de comparación generalmente será de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos contiguos, más preferiblemente al menos 25, 50, 75, 90, 100, 150, 200, 250, 300 o 350 aminoácidos contiguos, y lo más preferiblemente la secuencia de aminoácidos de longitud completa. Para ácidos nucleicos, la longitud de las secuencias de comparación generalmente será de al menos 5 nucleótidos contiguos, preferiblemente al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, o 25 nucleótidos contiguos, y más preferiblemente la secuencia de nucleótidos de longitud completa. La identidad de secuencia puede medirse utilizando un software de análisis de secuencia en la configuración predeterminada (por ejemplo, Paquete de Software de Análisis de Secuencia del Genetics Computer Group, Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Tal software puede coincidir con secuencias similares al asignar grados de homología a varias sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones.

Por “pieza de cola” se entiende una parte de oligonucleótido de la biblioteca que está unida al complejo después de la adición de todas las etiquetas de bloques de construcción y codifica la identidad de la biblioteca, el uso de la biblioteca y/o el origen de un miembro de la biblioteca.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un método de ejemplo para la síntesis general de bibliotecas químicas que usa etiquetas de ADN de cadena sencilla que se unen secuencialmente por medio de ligamiento enzimático y/o químico. “BB” se refiere a un bloque de construcción.

Las Figuras 2A-2B muestran métodos a modo de ejemplo para el marcado de ADN de cadena sencilla de bibliotecas utilizando ligamiento enzimático. La Figura 2A muestra un método de ejemplo para etiquetar bibliotecas utilizando ligamiento enzimático de cadena sencilla con un oligonucleótido 5’-monofosfato (5’-P) protegido (reinstalado), donde los recuadros grises se refieren a nucleótidos 2’-OMe, “X” se refiere a un grupo protector o un componente de una entidad química, y “PNK” se refiere a polinucleótido quinasa. La figura 2B muestra un método de ejemplo para etiquetar bibliotecas utilizando ligación de cadena sencilla con un oligonucleótido 3’-OH protegido, donde recuadros negros unidas a -O-se refieren a un grupo protector del extremo 3’-OH y “LC” se refiere a líquido separación cromatográfica del grupo protector.

La Figura 3 muestra un método de ejemplo para etiquetar bibliotecas utilizando ligamiento de cadena sencilla con un oligonucleótido 5’-preadenilado (etiquetado como “5’-App”) (cabeza de dominio) con un extremo 3’ que está bloqueado, por ejemplo, por una entidad química (etiquetado “X-3'“). Este método se puede utilizar para ligar una etiqueta de oligonucleótido 5’-fosforilada (etiquetada como “Tag A”) a la cabeza de dominio y etiquetas adicionales que tienen un extremo 3’-OH (etiquetado como “Etiqueta B” y “Etiqueta C”) al complejo en la presencia de ATP.

Las Figuras 4A-4E muestran complejos ejemplares, cada uno con una cabeza de dominio, un ligador y una molécula pequeña que incluye un andamio (“S”) y nodos de diversidad A, B y C. Los recuadros de color gris oscuro se refieren a nucleótidos 2’-OMe, y las líneas de puntos se refieren a la presencia de una o más bases complementarias. Las Figuras 4A-4B son esquemas para complejos que tienen una cabeza de dominio de oligonucleótido lineal de cadena sencilla, en el que el ligador y la molécula pequeña están conectados al extremo 3’ (Figura 4A) o al extremo 5’ (Figura 4B) de la cabeza de dominio. Las Figuras 4C-4D son esquemas para complejos que tienen una cabeza de dominio de oligonucleótido en horquilla de cadena sencilla, donde el ligador y la molécula pequeña están conectados a la posición interna (Figura 4C) o al extremo 3’ (Figura 4D) de la cabeza de dominio. La Figura 4E muestra un método de ejemplo para etiquetar bibliotecas que tienen una cabeza de dominio de oligonucleótido en horquilla, donde la estrella se refiere a una fracción química e “Y” en el extremo 3’se refiere a un grupo protector. Las etiquetas de oligonucleótidos se marcan 1 -4, y la secuencia adaptadora es la línea negra en el extremo 5’.

Las Figuras 5A-5C muestran la ligación de oligonucleótidos por ARN ligasa T4 o CircLigase ™ ADNss ligasa. La Figura 5A es un esquema de la reacción de ligación enzimática. El oligonucleótido donante está 5’-fosforilado y lleva una etiqueta de 3’-fluoresceína, que imita una cabeza de dominio con una biblioteca química en el extremo 3’. El oligonucleótido aceptor no está fosforilado. La Figura 5B muestra el análisis de electroforesis en gel de una reacción de ligación en un gel de urea 8 M/poliacrilamida al 15% (PAAG). “SM” se refiere a un donante etiquetado fluorescentemente, “Producto” se refiere a un producto de ligación, y “donante Adenilado” se refiere a 5’App-Donor, como se describió anteriormente. La Figura 5C muestra la ligación de alto rendimiento lograda para ARN ligasa T4 a altas concentraciones de enzima y oligonucleótido.

Las Figuras 6A-6B representan la optimización del peso molecular de PEG (Figura 6A) y la concentración (Figura 6B) para lograr el máximo rendimiento de ligación mediante la ARN ligasa T4. Las condiciones de reacción son como se describió anteriormente para las Figuras 5A-5C. La Figura 6A es un gráfico que cuantifica el análisis electroforético de una reacción de ligación con MNA/DNA 15mero donante y etiquetas aceptoras después de la incubación durante 5 horas o 20 horas con 25% (p/v) de PEG que tiene un peso molecular de 300 a 20.000 (20K). La Figura 6B muestra el efecto de la concentración en el ligado después de la incubación durante 18-20 horas en presencia de 5% a 45% (p/v) de PEG4600.

Las Figuras 7A-7B muestran una correlación entre la eficacia de ligación por CircLigase ™ (Figura 7A) y la ARN ligasa T4 (Figura 7B) y la longitud de los oligonucleótidos donantes o aceptores. La Figura 7A representa un gráfico que cuantifica el efecto de la longitud del aceptor sobre el rendimiento de ligación en la reacción de ligación CircLigase ™. La Figura 7B representa un gráfico y una tabla que cuantifica el efecto de la longitud de nucleótidos de las etiquetas de MNA/ADN del aceptor y del donante en la ligación de cadena sencilla con la ARN ligasa T4. Estos datos representan un promedio de dos experimentos independientes obtenidos por densitometría de geles fluorescentes a 450 nm de excitación.

Las Figuras 8A-8B son espectros de LC-MS para una etiqueta de MNA/ADN antes y después de la fosforilación. Los datos se muestran para la etiqueta 15mero 5’-HO-mUAC GTA TAC GAC TGmG-OH-3’(sEü ID NO: 13) (a 250 gM) antes (Figura 8A) y después (Figura 8B) de reacción con polinucleótido quinasa T4 ( 50 unidades por 5 nmoles de etiqueta).

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La Figura 9 muestra un gel electroforético para la ligación secuencial de una sola cadena de las etiquetas A-C. El extremo 3’incluía fluoresceína para representar un compuesto de la biblioteca (o entidad química), y el asterisco (*) indica la purificación del producto ligado (o complejo) antes de la fosforilación.

Las Figuras 10A-10B muestran esquemas de una reacción de “par químicamente co-reactivo” entre oligonucleótidos donantes y aceptores dando como resultado un separador “corto” de 5 átomos (Figura 10A) y un separador “largo” de 24 átomos (Figura 10B).

Las Figuras 11A-11E muestran los resultados de la transcripción inversa (RT) y el análisis por PCR de plantillas de ADN de 75mero que contienen un único separador corto o largo, como se representa en las Figuras 10A-10B. La Figura 11A es un esquema de la reacción de RT. Los espectros LCMS de la RT se registraron tanto a 260 nm como a 650 nm para la plantilla de ADN de 75 mero de control (Figura 11B), la plantilla de ADN de 75mero contenía un solo separador de 5 átomos (“corto”) (Figura 11C), y la plantilla de ADN de 75 mero que contiene un solo separador de 24 átomos (“largo”) (Figura 11D). La Figura 11E muestra el análisis por RT-PCR de la plantilla de ADN de 75mero de control (“temp175”), una plantilla de ADN de 75mero con un separador de 5 átomos (“clic corto”) y una plantilla de ADN de 75mero con un separador de á4 átomos (“clic largo”).

Las Figuras 12A-12G muestran los resultados de una reacción de ligación química entre un oligonucleótido de ADN modificado con 5’-yodo y un oligonucleótido de ADN de 3’-fosforotioato en presencia o ausencia de un oligonucleótido de empalme complementario. La Figura 12A muestra un esquema de ejemplo de la reacción. El oligonucleótido 5’-yodo se marca con 6-FAM en el extremo 3’, mientras que el oligonucleótido 3’-fosforotioato se marca con Cy5 en el extremo 5’. La Figura 12B muestra un análisis de electroforesis en gel de las reacciones de ligación en presencia (+ spl) o ausencia (-spl) de un empalme complementario. CCy5 y CFL indican bandas visibles de Cy5 y material de partida marcado con fluoresceína, respectivamente. La Figura 12C muestra un transcurso de tiempo de la reacción de ligamiento empalmada en las condiciones anteriores, que se cuantificó utilizando detección de Cy5 (635 nm) y fluoresceína (450 nm). La Figura 12D muestra el análisis de LC-MS del ligado de CFL y CCy5 en ausencia (superior, a 260 nm, 495 nm y 650 nm) y presencia (inferior, a 260 nm, 495 nm y 650 nm) de un empalme, donde las reacciones de ligación se incubaron durante siete días. La Figura 12E muestra el análisis de LC-MS de la ligación de CFL y CCy5 en ausencia de un empalme (a 260 nm, 495 nm y 650 nm), donde las reacciones de ligación se incubaron durante ocho días. La Figura 12F muestra el análisis por EM de la reacción del oligonucleótido de CFL con piperidina, donde esta reacción pretendía desplazar el yodo. Las condiciones de reacción incluyeron oligonucleótidos a 100 pM, piperidina a 40 mM (400 equivalentes) en tampón de borato 100 mM, pH 9.5, durante 20 horas a temperatura ambiente (izquierda); y oligonucleótidos a 400 pM, piperidina a 2 M (4.000 equivalentes) en tampón de borato 200 mM, pH 9.5, durante 2 horas a 65°C (derecha). La Figura 12G muestra el análisis de MS de una reacción de ligamiento empalmada de CFL y oligonucleótidos de CCy5 a 50 mM realizada en presencia de 400 equivalentes de piperidina en tampón de borato 100 mM, pH 9,5, durante 20 horas a temperatura ambiente.

Las Figuras 13A-13C muestran el uso de oligonucleótidos modificados para minimizar la mezcla. La Figura 13A muestra un análisis de LC-MS de una reacción de ligación de una sola cadena de una cabeza de dominio de 5’-fosforilada ssHP (3,636 Da) y una etiqueta (tag 15; 2,469 Da) que tiene nucleótidos 2’-O metilo. El análisis LC-MS mostró tres picos: pico 1 para la etiqueta (2,469 Da); pico 2 para la cabeza de dominio adenilado (3,965 Da); y el pico 3 que tiene dos (en algunos casos tres) subpicos que contienen productos con pesos moleculares de 6,089 Da (producto de ligación esperado); 5,769 Da (esperado 6,089 Da -320 Da); y 6,409 Da (esperado 6.089 Da + 320 Da). Esta diferencia de masa de 320 Da corresponde exactamente a la eliminación o a la adición de un nucleótido 2’-O-Me C adicional. Las Figuras 13B-1 a 13B- 3 muestran un mecanismo propuesto no limitativo de la mezcla de nucleótidos, en el que aproximadamente el 90% de la reacción proporciona el producto de ligación esperado (normal) y aproximadamente el 10% de la reacción proporciona productos de ligación aberrantes (“Producto -1 nt “y” Producto + 1 nt “). La figura 13C muestra un análisis de LC-MS de ligadura de la cabeza de dominio HP-PS con la etiqueta 15. La cabeza de dominio HP-PS tiene la secuencia ssHP de la cabeza de dominio, pero incluye un enlace fosforotioato en el extremo 5’. El análisis de LC mostró tres picos: el pico 1 para la etiqueta (2,469), el pico 2 para la cabeza de dominio adenilada (3,984) y el pico 3 para un solo producto de ligamiento (6,107), sin casi ningún movimiento de nucleótidos observado. Las trazas de +/- 320 picos corresponden probablemente a la conversión oxidativa del enlace fosforotioato en un enlace fosfodiéster nativo o se deben a una sulfuración incompleta.

La Figura 14 es un gráfico que muestra la separación de los miembros de la biblioteca utilizando cromatografía de exclusión de tamaño, donde los miembros de la biblioteca objetivo (izquierda en el gráfico) eluyen en un tiempo más corto que los miembros de la biblioteca no enlazados (derecha en el gráfico).

La Figura 15A es un esquema de ejemplo que muestra la ligación química de etiquetas de ADN codificantes que usan una única química que no depende del empalme, por ejemplo, 5’-azido/3’-alquinilo. Los grupos reactivos están presentes en los extremos 3’ y 5’ de cada etiqueta (Tag A, B y C), y uno de los grupos reactivos en cada extremo (por ejemplo, el extremo 3’) está protegido para evitar la ciclación, polimerización o ligadura de ciclo erróneo de las etiquetas. El ciclo de

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ligación de la etiqueta incluye la ligación química, seguida de la desprotección del grupo funcional restante para hacer que la entidad ligada en crecimiento sea competente para el siguiente ciclo de ligación. Cada ciclo también incluye la adición de uno o más bloques de construcción (bBa, BBB y BBC, que están codificados por la etiqueta A, B y C, respectivamente). El proceso de ligación química puede incluir opcionalmente la adición de una cola de dominio.

La Figura 15B es un esquema de ejemplo que muestra la ligación química de etiquetas de ADN codificantes que usan una única química que depende del empalme. La naturaleza dependiente de plantilla de este enfoque reduce la frecuencia de aparición de polimerización de etiqueta, ciclación de etiqueta, así como de eventos de confusión. Similar a la Figura 15A, este esquema incluye etiquetas (Etiqueta A, B y C) y uno o más bloques de construcción codificados por etiquetas (BBA, BBB y BBC).

La Figura 15C es un esquema de ejemplo que muestra el uso de una sucesión de etiquetas químicamente ligadas como plantilla para la polimerización dependiente de plantilla, generando ADNc que es competente para la amplificación y secuenciación de PCR, así como también el uso de una polimerasa dependiente de plantilla capaz de leer a través de las uniones químicamente ligadas.

La Figura 16A es un esquema de ejemplo que muestra la ligación química de etiquetas de ADN codificantes utilizando etiquetas de alquinilo protegidas con TIPS y química de “clic”. Cada ciclo de síntesis de la biblioteca incluye la ligación química catalizada por Cu (I) de la etiqueta TIPS-protejido para el alquino desprotegido del ciclo anterior. Después de la ligación, el grupo TIPS se elimina (desprotege), activando de este modo el alquino para la siguiente etapa de ligación química.

La Figura 16B muestra la estructura de CPT-succinil-3’-O-TIPS-propargil uridina CPG que se usa para iniciar la síntesis en fase sólida de oligonucleótidos que portan 3’-O-TIPS-propargil uridina en el extremo 3’.

La Figura 16C es un esquema de ejemplo que muestra el uso de una sucesión de etiquetas ligadas químicamente con “clic” como plantilla para la polimerización dependiente de plantilla, generando ADNc que es competente para la amplificación y secuenciación por PCR, así como utilizando una polimerasa dependiente de plantilla capaz de leyendo a través de las uniones químicamente ligadas “clic”.

Las Figuras 17A-17C muestran la síntesis de las plantillas Y55 e Y185 con 5’ biotinilado y de un solo clic. La Figura 17A proporciona un esquema a modo de ejemplo. La Figura 17B y la Figura 17C muestran análisis de LC-MS de Y55 e Y185, respectivamente.

Las Figuras 18A-18C proporcionan un ensayo ejemplar para la “lectura directa” de una plantilla de “un solo clic”. La Figura 18A muestra un esquema, en el que el cebador marcado con FAM se hibrida con la plantilla biotinilada y se incuba con la polimerasa dependiente de la plantilla, de acuerdo con las condiciones recomendadas por el fabricante. Los complejos se incuban posteriormente con perlas de estreptavidina, se lavan, se eluyen con NaOH, y luego se neutralizan. Después de la neutralización, las muestras se analizan mediante LC-MS. La Figura 18B y la Figura 18C muestran datos de LC-MS de la copia del fragmento de Klenow de las plantillas Y55 e Y185, respectivamente.

Las Figuras 19A-19D proporcionan la síntesis de YDC de plantilla “doble clic” 5’-biotinilada y plantilla YTC de “triple clic” utilizando una etiqueta de alquinilo protegida con TIPS. Las Figuras 19A y 19B muestran esquemas de ejemplo para esta síntesis. Las Figuras 19C y 19D muestran el análisis LC-MS de las plantillas YDC e YTC, respectivamente.

Las Figuras 20A-20C proporcionan un ensayo de “lectura directa” de clic a modo de ejemplo utilizando plantillas de “doble clic” y “triple clic”. La Figura 20A es un esquema, en el que el cebador marcado con FAM se hibrida con la plantilla biotinilada y se incuba con el fragmento Klenow de E. coli DNA polimerasa I de acuerdo con las condiciones de reacción recomendadas por el fabricante. Los complejos se incuban con perlas de estreptavidina, se lavan, se eluyen con NaOH y se neutralizan. Después de la neutralización, las muestras son analizadas por LC-MS. Las Figuras 20B y 20C muestran datos de LC-MS de la copia del fragmento Klenow de las plantillas YDC e YTC, respectivamente.

La Figura 21 es un gráfico que muestra la eficiencia del clic de “lectura directa” utilizando plantillas de “solo clic”, “doble clic” y “triple clic” en comparación con una plantilla de ADN “sin clic” de control. Estos datos se obtuvieron utilizando el ensayo de “lectura directa” descrito en este documento, y los rendimientos se midieron mediante análisis de LC MS en comparación con un estándar interno.

Las Figuras 22A-22C proporcionan esquemas de ejemplo de ligación química con química ortogonal. La Figura 22A es un esquema de la estrategia de ligamiento químico para etiquetas de codificación de ADN que (i) utiliza dos químicas

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ortogonales sucesivas para (ii) estrategias de lectura directa disponibles. Cada etiqueta contiene dos grupos reactivos ortogonales, indicados por diferentes símbolos para el extremo 5’ y el extremo 3’ de cada etiqueta. En cada ciclo sucesivo de ligadura química, se utiliza una química ortogonal. Esta estrategia reduce la frecuencia de ocurrencia de eventos de etiquetado incorrecto y también puede utilizarse sin la protección de los grupos terminales reactivos. La figura 22B es un esquema de la polimerización dependiente de la plantilla “lectura directa” de una plantilla generada por la ligación química ortogonal de las etiquetas de DNA ortogonales para generar cADN a partir del cual se puede deducir la secuencia de las etiquetas. La figura 22C es la misma que la figura 22B, pero incluye una cola de dominio de autocebado, que puede convertirse en de cadena doble por digestión de restricción para facilitar la separación de cadena durante la amplificación por PCR.

La Figura 23 es un esquema de ejemplo que muestra la estrategia de ligación química para etiquetas de codificación de ADN que utiliza dos químicas ortogonales sucesivas específicas. Cada etiqueta contiene grupos reactivos a clic y fosforotioato/reactivo al yodo. Las etiquetas que llevan grupos reactivos ortogonales en sus extremos 3' y 5' no pueden polimerizar y tienen una frecuencia reducida de aparición de eventos de etiquetado incorrecto. Sin desear estar limitado, este enfoque puede eliminar la necesidad de la protección TIPS del 3'-alquino. En el ciclo A, el marcador 5'-yodo/3'-alquinilo se liga utilizando ligadura dependiente del empalme a la cabeza de dominio de 3'-fosforotioato, dejando un alquino 3' reactivo para el próximo ciclo de ligadura química a una etiqueta de 5'-azido/3'-fosforotioato. Los ciclos de ligadura ortogonales pueden repetirse tantas veces como se desee.

Las Figuras 24A-24B muestran la protección y el uso de grupos 3’-fosforotioato/5’-yodo en etiquetas de ADN. La figura 24A muestra un esquema a modo de ejemplo para utilizar grupos protectores (PG) para estas etiquetas. La figura 24B muestra un esquema de ejemplo para el uso de etiquetas de 3’-fosforotioato/5’-yodo para ligar químicamente la sucesión de etiquetas de ADN codificantes que codifican una biblioteca química instalada covalentemente sobre el extremo 5’.

Las Figuras 25A-25B muestran la protección y el uso de grupos 3’-fosforotioato en etiquetas de ADN. La Figura 25A muestra el esquema de protección de estos grupos. La Figura 25B muestra el esquema para el uso de etiquetas 3’- fosforotioato/5’-azido y 3’-propargilo/5’-yodo para ligar químicamente una sucesión de etiquetas de ADN codificadoras ortogonales que codifican una biblioteca química covalentemente instalada sobre el extremo 5’.

Descripción detallada

La invención presenta métodos para utilizar la ligación de una sola cadena para instalar marcadores de oligonucleótidos sobre complejos de entidad química-oligonucleótido. Este método se puede utilizar para crear diversas bibliotecas de entidades químicas seleccionables estableciendo una relación codificada entre etiquetas particulares y reacciones químicas particulares o bloques de construcción. Para identificar una o más entidades químicas, las etiquetas de oligonucleótidos pueden amplificarse, clonarse, secuenciarse y correlacionarse utilizando la relación establecida. En particular, se identificaron las condiciones de reacción que promueven la ligación de una sola cadena de etiquetas. Estas condiciones incluyen el uso de uno o más nucleótidos sustituidos en 2’ (por ejemplo, nucleótidos 2’-O-metilo o nucleótidos 2’-fluoro) dentro de las etiquetas, el uso de etiquetas de longitud particular (por ejemplo, entre 5 y 15 nucleótidos), el uso de una o más enzimas (por ejemplo, ARN ligasa y/o ADN ligasa), y/o el uso de uno o más agentes durante la ligación (por ejemplo, polietilenglicol y/o un catión multivalente soluble, tal como Co(NH3)6Cl3). Estos métodos incluyen adicionalmente métodos de unión química de oligonucleótidos, de modo que la secuencia del producto oligonucleotídico unido puede utilizarse como plantilla para una reacción de polimerasa dependiente de plantilla. Los métodos para crear y etiquetar bibliotecas de estos complejos se describen en detalle a continuación.

Métodos para etiquetar bibliotecas codificadas

Esta invención presenta un método para ligar operativamente etiquetas de oligonucleótidos con entidades químicas, de manera que se pueden establecer relaciones de codificación entre la secuencia de la etiqueta y las unidades estructurales (o bloques de construcción) de la entidad química. En particular, la identidad y/o el historial de una entidad química pueden inferirse a partir de la secuencia de bases en el oligonucleótido. Usando este método, una biblioteca que incluye diversas entidades o miembros químicos (por ejemplo, moléculas pequeñas o péptidos) puede abordarse con una secuencia de etiqueta particular.

En general, estos métodos incluyen el uso de una cabeza de dominio, que tiene al menos un grupo funcional que puede elaborarse químicamente y al menos un grupo funcional al que se puede unir (o ligar) un oligonucleótido de cadena sencilla. La unión puede realizarse por cualquier medio útil, tal como mediante unión enzimática (por ejemplo, ligación con una o más de una ARN ligasa y/o una ADN ligasa) o mediante unión química (por ejemplo, mediante una reacción de sustitución entre dos grupos funcionales, tales como un nucleófilo y un grupo saliente).

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Para crear numerosas entidades químicas dentro de la biblioteca, una solución que contiene la cabeza de dominio se puede dividir en alícuotas múltiples y luego colocar en una multiplicidad de compartimentos físicamente separados, tales como los pozos de una placa de múltiples pozos. En general, esta es la etapa “dividida”. Dentro de cada compartimento o pozo, se realizan sucesivas etapas de reacción química y ligación con una etiqueta de una sola cadena dentro de cada alícuota. La relación entre las condiciones de reacción química y la secuencia de la etiqueta de una sola cadena se registran. las etapas de reacción y ligamiento pueden realizarse en cualquier orden. Luego, las alícuotas reaccionadas y ligadas se combinan o “agrupan” y, opcionalmente, se puede realizar la purificación en este punto. Estos pasos divididos y agrupados se pueden repetir opcionalmente.

A continuación, la biblioteca puede probarse y/o seleccionarse para una característica o función particular, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la mezcla de entidades químicas marcadas se puede separar en al menos dos poblaciones, donde la primera población se une a un objetivo biológico particular y la segunda población no. La primera población puede capturarse selectivamente (por ejemplo, eluyendo en una columna que proporciona el objetivo de interés o incubando la alícuota con el objetivo de interés) y, opcionalmente, analizarse o probarse más a fondo, como con lavado opcional, purificación, selección negativa, selección positiva o pasos de separación.

Finalmente, las historias químicas de uno o más miembros (o entidades químicas) dentro de la población seleccionada se pueden determinar mediante la secuencia del oligonucleótido unido de forma operativa. Tras correlacionar la secuencia con el bloque de construcción particular, este método puede identificar los miembros individuales de la biblioteca con la característica seleccionada (por ejemplo, una mayor tendencia a unirse a la proteína diana y de ese modo provocar un efecto terapéutico). Para pruebas y optimización adicionales, los compuestos terapéuticos candidatos pueden prepararse entonces sintetizando los miembros de la biblioteca identificados con o sin sus etiquetas de oligonucleótidos asociadas.

Las Figuras 1-3 proporcionan diversos métodos a modo de ejemplo para etiquetar bibliotecas usando ligamiento monocatenario con una cabeza de dominio, donde las etiquetas pueden ligarse en el extremo 5' o en el extremo 3' la cabeza de dominio. Para controlar el orden en el que se unen las etiquetas y para reducir las reacciones secundarias, estos métodos aseguran que solo estén presentes un extremo 5 'reactivo y un extremo 3' reactivo durante la ligadura. Además, estos métodos ejemplares usan nucleótidos 2'-sustituidos (por ejemplo, nucleótidos 2'-desoxi/2'-O-metílicos mixtos) en las etiquetas, y estas etiquetas actúan como plantillas para una polimerasa dependiente de ADN o ARN capaz de polimerizar nucleótidos de una manera dependiente de la plantilla. Sin desear estar limitado por la teoría, el uso de uno o más nucleótidos 2'-sustituidos (por ejemplo, nucleótidos 2'-O-metilo y/o nucleótidos 2'-fluoro) dentro de una etiqueta podría promover la ligadura por ARN ligasa de forma más estrecha parecido al ARN, al tiempo que conserva la solidez física y química del medio de grabación, así como la capacidad de extraer información de secuencia utilizando una polimerización dependiente de la plantilla.

La Figura 1 proporciona un método de ejemplo para reducir las reacciones secundarias, donde el complejo ligado y las etiquetas se diseñan para evitar reacciones indeseadas entre los grupos reactivos 3'-OH y 5'-monofosfato (“5'-P”). En particular, este esquema representa el enfoque del ciclo de fosforilación-ligación. Durante la ligadura, solo están disponibles un grupo 3'-OH (en la etiqueta) y un grupo 5'-P (en la cabeza de dominio), y, por lo tanto, solo es posible un evento de ligadura. Después de las etapas de ligación y purificación, se forma un grupo 5'-Oh en el complejo, y este grupo se puede convertir en un 5'-P para añadir marcadores de oligonucleótidos posteriores. El extremo 3' del complejo está bloqueado por X, que puede ser un grupo protector o un componente de una entidad química (por ejemplo, que incluye opcionalmente un enlazador que actúa como un separador entre la entidad química y la cabeza de dominio).

Como se muestra en la figura 1, el método de ejemplo incluye la ligadura de la etiqueta 1 del bloque de construcción (“etiqueta 1”) al extremo 5' de la cabeza de dominio, creando así un complejo, y realizando ligaciones sucesivas al extremo 5' del complejo. El extremo 5' reactivo es un grupo fosfato en el complejo, y el extremo 3' reactivo es un grupo hidroxilo en las etiquetas. Después de la adición de cada etiqueta, el complejo ligado se separa de la cabeza de dominio y etiquetas sin ligar y sin reaccionar y de otros reactivos (por ejemplo, fosfato, cobalto u otros reactivos presentes durante la etapa de ligación). La separación se puede realizar mediante cualquier método útil (por ejemplo, mediante separación cromatográfica o electroforética de productos ligados y no ligados o mediante precipitación de un reactivo). Luego, el complejo ligado se expone a un agente (por ejemplo, una polinucleótido quinasa o un agente de fosforilación química) para formar un grupo fosfato en el extremo 5' del complejo. Las etapas de separación y fosforilación se pueden realizar en cualquier orden. En particular, si se utiliza una quinasa en la etapa de fosforilación, la quinasa debe inactivarse o eliminarse antes de la adición de las etiquetas subsiguientes que también pueden contener un grupo 5'-OH, o se deben eliminar los reactivos que pueden inhibir la quinasa. de la mezcla de reacción antes de la etapa de fosforilación.

En otra realización, el método incluye ligar etiquetas sucesivas del extremo 3’del complejo ligado precedente. En este método, el complejo ligado carece de un grupo 3’-OH reactivo inmediatamente después de la etapa de ligación, pero contiene un grupo que se puede convertir en un grupo 3’-OH (por ejemplo, mediante la liberación de un grupo protector).

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La figura 2A proporciona un esquema que muestra un método de ejemplo para etiquetar el extremo 3’ de un complejo, y la figura 2B proporciona un esquema de reacción ejemplar para un extremo 3’ protegido que contiene un grupo 3’-OH convertible después de la liberación del grupo protector ligado a 3’. Como se muestra en la Figura 2A, la etiqueta 1 del bloque de construcción (“etiqueta 1”) tiene un grupo protegido en 3’. En la primera etapa, el método de ejemplo incluye el ligado de la etiqueta al extremo 3’ de la cabeza de dominio, creando de ese modo un complejo. Se llevan a cabo ligaciones sucesivas al extremo 3’ del complejo. El extremo 5’ reactivo es un grupo fosfato en la etiqueta, y el extremo 3’ reactivo es un grupo hidroxilo en el complejo. Después de la adición de cada etiqueta, el complejo ligado se desprotege (por ejemplo, mediante la adición de un agente hidrolizante) para liberar el grupo 3’ - protector.

En aún otra realización, el método incluye el enlace de etiquetas sucesivas utilizando un oligonucleótido 5’-preadenilado (5’-App) y una ligasa (por ejemplo, ARN ligasa T4). En presencia de ATP, la ARN ligasa T4 usará el cofactor de ATP para formar un intermedio adenilado antes de la ligación. En ausencia de ATP, la ARN ligasa T4 solo ligará oligonucleótidos preadenilados, y no se producirán posibles reacciones secundarias con los oligonucleótidos de 5’-P. Por lo tanto, la ligación de una sola cadena con reacciones secundarias reducidas se puede realizar con un oligonucleótido 5’-App químicamente sintetizado en presencia de etiqueta 5’-monofosforilada, donde el oligonucleótido 5’-App se puede ligar a una cabeza de dominio antes del marcado o un complejo formado después de múltiples rondas de etiquetado.

La figura 3 proporciona un esquema que muestra un método a modo de ejemplo para marcar el extremo 5’de una cabeza de dominio preadenilado. La adenilación del nucleótido donante en el grupo 5’-fosfato es la primera etapa en la reacción de ligación, y esta reacción generalmente requiere una molécula de ATP. En la segunda etapa, el grupo 3’-OH del oligonucleótido aceptor reacciona con el donante adenilado y forma un enlace diéster entre dos oligonucleótidos, liberando así una molécula de AMP. El grupo 5’-fosfato químicamente adenilado del oligonucleótido donante imita un producto de la primera etapa de la reacción de ligación y se puede ligar al segundo oligonucleótido en ausencia de ATP. En el siguiente esquema, una cabeza de dominio de 5’-App se liga al grupo 3’-OH de una etiqueta de oligonucleótido 5’-fosforilada (etiquetada como “Tag A”). Debido a la presencia del extremo 5’adenilado del oligonucleótido, la ligación puede ocurrir en ausencia de ATP. En estas condiciones, el grupo 5’-fosfato de Tag A no sirve como donante de ligación. La etiqueta B del bloque de construcción se puede ligar proporcionando un nucleótido que tiene un extremo 3’-OH (marcado como “Etiqueta B”) en presencia de ATP, y se pueden incluir etiquetas adicionales (etiquetadas como “Etiqueta C”).

En la figura 3, el extremo 3’de la cabeza de dominio puede bloquearse con cualquier grupo protector (por ejemplo, un grupo protector irreversible, tal como ddN, o un grupo protector reversible). En la primera etapa, el método incluye el ligado de la etiqueta al extremo 5’de la cabeza de dominio en ausencia de ATP, creando así un complejo. Se llevan a cabo ligaciones sucesivas al extremo 5’del complejo en presencia de ATP. Este método puede modificarse para realizar una ligación sucesiva al extremo 3’de un complejo. Por ejemplo, el método puede incluir el uso de una etiqueta 5’- preadenilada y una cabeza de dominio que tiene un extremo 3’ - OH reactivo. Este método puede requerir además el bloqueo del extremo 3’de la etiqueta para evitar reacciones cruzadas entre etiquetas, tales como el método descrito anteriormente y en la Figura 2.

El método general proporcionado en la figura 3 se puede modificar reemplazando el cebador con una cabeza de dominio. En este caso, la cabeza de dominio debe adenilarse químicamente en el extremo 5’, y la etiqueta A se fosforila en el extremo 5’. El ligado de esta etiqueta A fosforilada a la cabeza de dominio adenilada se produce en las mismas condiciones estándar, descritas en este documento, pero omitiendo el ATP. Al utilizar esta condición de ligación, se puede evitar la ligación del extremo 5’fosforilado. En la siguiente etapa, la ligación de la etiqueta B requiere que esta etiqueta tenga un grupo hidroxilo libre en el extremo 5’ (es decir, no fosforilado). Pueden realizarse reacciones de ligación sucesivas en presencia de ATP, seguido de fosforilación del extremo 5’ del oligonucleótido resultante si se desea una extensión adicional de las etiquetas (por ejemplo, etiqueta C en la Figura 3).

Los métodos descritos en este documento pueden incluir cualquier cantidad de pasos opcionales para diversificar la biblioteca o interrogar a los miembros de la biblioteca. Para cualquier método de etiquetado descrito en este documento (por ejemplo, como en las Figuras 1 a 3), puede añadirse un número sucesivo de “n” etiquetas con un número “n” adicional de etapas de ligación, separación y/o fosforilación. Las etapas opcionales de ejemplo incluyen la restricción de los miembros de la biblioteca que usan una o más endonucleasas de restricción; ligación de una o más secuencias adaptadoras a uno o ambos extremos de la biblioteca, por ejemplo, tal como una o más secuencias adaptadoras para proporcionar una secuencia de cebado para la amplificación y secuenciación o para proporcionar una etiqueta, tal como biotina, para la inmovilización de la secuencia; transcripción inversa o transcripción, opcionalmente seguida de transcripción inversa, de las etiquetas ensambladas en el complejo utilizando una transcriptasa inversa, transcriptasa u otra polimerasa dependiente de plantilla; la amplificación de las etiquetas ensambladas en el complejo usando, por ejemplo, PCR; generación de aislados clonales de una o más poblaciones de etiquetas ensambladas en el complejo, por ejemplo, mediante el uso de transformación bacteriana, formación de emulsión, dilución, técnicas de captura de superficie, etc.; amplificación de aislados clonales de una o más poblaciones de etiqueta ensamblada en el complejo, por ejemplo,

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utilizando aislados clónales como plantillas para la polimerización de nucleótidos dependiente de plantilla; y determinación de la secuencia de aislados clonales de una o más poblaciones de etiquetas ensambladas en el complejo, por ejemplo, utilizando aislados clonales como plantillas para la polimerización dependiente de plantilla con nucleótidos marcados fluorescentemente. Métodos adicionales para amplificar y secuenciar las etiquetas de oligonucleótidos se describen en este documento.

Estos métodos se pueden utilizar para identificar y descubrir cualquier cantidad de entidades químicas con una característica o función particular, por ejemplo, en una etapa de selección. La característica o función deseada se puede utilizar como la base para dividir la biblioteca en al menos dos partes con el enriquecimiento concomitante de al menos uno de los miembros o miembros relacionados en la biblioteca con la función deseada. En realizaciones particulares, el método comprende identificar un pequeño miembro de la biblioteca similar a un fármaco que se une o inactiva una proteína de interés terapéutico. En otra realización, se diseña una secuencia de reacciones químicas, y se elige un conjunto de bloques de construcción de modo que la reacción de los bloques de construcción elegidos bajo las condiciones químicas definidas generará una pluralidad combinatoria de moléculas (o una biblioteca de moléculas), donde una o más moléculas pueden tener utilidad como agente terapéutico para una proteína particular. Por ejemplo, las reacciones químicas y los bloques de construcción se eligen para crear una biblioteca que tenga grupos estructurales comúnmente presentes en inhibidores de quinasas. En cualquiera de estos casos, las etiquetas codifican el historial químico del miembro de la biblioteca y, en cada caso, una biblioteca de posibilidades químicas puede representarse mediante cualquier combinación de etiqueta particular.

En una realización, la biblioteca de entidades químicas, o una parte de las mismas, se pone en contacto con un objetivo biológico en condiciones adecuadas para que al menos un miembro de la biblioteca se una al objetivo, seguido de la eliminación de miembros de la biblioteca que no lo hacen unirse al objetivo y analizar una o más etiquetas de oligonucleótidos asociadas a ellos. Este método puede incluir opcionalmente amplificar las etiquetas mediante métodos conocidos en la técnica. Los objetivos biológicos de ejemplo incluyen enzimas (por ejemplo, quinasas, fosfatasas, metilasas, desmetilasas, proteasas y enzimas de reparación del ADN), proteínas implicadas en interacciones proteína: proteína (por ejemplo, ligandos para receptores), etiquetas receptoras (por ejemplo, GPCR y RTK), canales de ion, bacterias, virus, parásitos, ADN, ARN, priones y carbohidratos.

En otra realización, las entidades químicas que se unen a un objetivo no están sujetas a amplificación, sino que se analizan directamente. Los métodos de análisis ejemplares incluyen análisis de microarreglo, que incluyen análisis de cristal fotónico de resonancia evanescente; métodos basados en glóbulos para desconvertir etiquetas (por ejemplo, utilizando etiquetas his); el análisis del biosensor de cristal fotónico libre de etiqueta (por ejemplo, un lector BIND® de SRU Biosystems, Inc., Woburn, MA); o enfoques basados en la hibridación (por ejemplo, utilizando arreglos de oligonucleótidos inmovilizados complementarios a las secuencias presentes en la biblioteca de etiquetas).

Además, los pares correactivos químicamente (o grupos funcionales) se pueden incluir fácilmente en esquemas de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida y apoyarán la ligación química eficiente de oligonucleótidos. Además, los oligonucleótidos ligados resultantes pueden actuar como plantillas para la polimerización dependiente de plantilla con una o más polimerasas. Por consiguiente, cualquiera de las etapas de unión descritas en este documento para etiquetar bibliotecas codificadas puede modificarse para incluir una o más de las técnicas de ligación enzimática y/o ligación química. Las técnicas de ligación de ejemplo incluyen ligación enzimática, tal como el uso de una o más aRn ligasas y/o ADN ligasas; y ligación química, tal como el uso de pares químicamente correactivos (por ejemplo, un par que incluye grupos funcionales alquinilo y azido opcionalmente sustituidos).

Además, una o más bibliotecas se pueden combinar en una etapa de división y mezcla. Con el fin de permitir la mezcla de dos o más bibliotecas, el miembro de la biblioteca puede contener una o más secuencias que identifican la biblioteca, como en una etiqueta identificadora de la biblioteca, en una etiqueta del bloque de construcción ligada, o como parte de la secuencia de la cabeza de dominio, como se describe aquí en.

Métodos que tienen masa reducida

Una gran parte de la motivación para las estrategias de codificación de una sola cadena surge de la masa reducida de una etiqueta individualizada cuando se compara con una etiqueta de cadena doble. La masa reducida potencialmente confiere varios beneficios, incluyendo una mayor solubilidad, menor costo, mayor reactividad, mayor accesibilidad del objetivo, disminución del radio hidrodinámico, mayor precisión de las evaluaciones analíticas, etc. Además de utilizar una metodología de etiquetado de cadena sencilla, se pueden lograr reducciones adicionales de la masa incluyendo el uso de uno o más de los siguientes: una o más etiquetas que tienen una longitud reducida, conjuntos de etiquetas de masa constante, una cabeza de dominio de codificación, uno o más miembros de una biblioteca que carecen de una región de

unión de cebador y/o una región constante, uno o más miembros de una biblioteca que tiene una región constante reducida, o cualquier otra metodología descrita en este documento.

Para minimizar la masa de los miembros en la biblioteca, se puede reducir la longitud de una o más etiquetas de bloque de construcción, tal como una longitud lo más corta posible para codificar cada tamaño de división. En particular, las 5 etiquetas pueden tener menos de 20 nucleótidos (por ejemplo, menos de 19 nucleótidos, menos de 18 nucleótidos, menos de 17 nucleótidos, menos de 16 nucleótidos, menos de 15 nucleótidos, menos de 14 nucleótidos, menos de 13 nucleótidos, menos de 12 nucleótidos, menos de 11 nucleótidos, menos de 10 nucleótidos, menos de 9 nucleótidos, menos de 8 nucleótidos o menos de 7 nucleótidos). Como se describe a continuación en los ejemplos, se pueden utilizar etiquetas más cortas (por ejemplo, aproximadamente 10 nucleótidos o más cortas) para la ligación de etiquetas.

10 También se pueden utilizar estrategias de masa constante, que podrían ayudar en el análisis durante la síntesis de la biblioteca. Además, los conjuntos de etiquetas de masa constantes podrían permitir el reconocimiento de todas las ocurrencias de errores individuales (por ejemplo, errores que surgen de una lectura errónea de una secuencia o de la ligación química o enzimática6 de una etiqueta) y la mayoría de las ocurrencias de errores múltiples. La relación entre la longitud de un conjunto de etiquetas de cadena sencilla de masa constante y la capacidad de codificación (por ejemplo,

15 longitudes mínimas para soportar tamaños de división de bloque de construcción específicos o identidades de biblioteca, etc.) se describe a continuación en la Tabla 1. Por consiguiente, el uso de conjuntos de etiqueta de masa constante se podría usar para proporcionar una capacidad de codificación beneficiosa, mientras se mantiene el reconocimiento de errores durante la formación de la biblioteca.

Tabla 1

Longitud: Base #1 Base #2 Base #3 Base #4 Combinaciones

1
1: 0 0 0
1

2: 1 1 0 0
2

3: 1 1 1 0 6

4: 1 1 1 1 24

5: 2 1 1 1 60

6: 2 2 1 1 180

7: 2 2 2 1 630

8: 2 2 2 2 2,520

9: 3 2 2 2 7,560

10: 3 3 2 2 25,200

11: 3 3 3 2 92,400

12: 3 3 3 3 369,600

13: 4 3 3 3 1,201,200

14: 4 4 3 3 4,204,200

15: 4 4 4 3 15,765,750

16: 4 4 4 4 63,063,000

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17: 5 4 4 4 214,414,200

18: 5 5 4 4 771,891,120

19: 5 5 5 4 2,933,186,256

20: 5 5 5 5 11,732,745,024

Para minimizar la masa en la biblioteca, la cabeza de dominio se puede utilizar no solo para unir la fracción química y una etiqueta, sino también para codificar la identidad de una biblioteca particular o para una etapa particular. Por ejemplo, la cabeza de dominio puede codificar información, por ejemplo, una pluralidad de cabezas de dominio que codifican la primera división (es) o la identidad de la biblioteca, tal como utilizando una secuencia particular relacionada con una biblioteca específica.

Además, las regiones de unión del cebador (por ejemplo, constantes) de la biblioteca de entidades químicas codificadas por ADN pueden excluirse durante la (s) etapa (s) de selección. Entonces, estas regiones se pueden agregar después de la selección mediante, por ejemplo, ligación de cadena sencilla. Una estrategia de ejemplo incluiría proporcionar una entidad química en el extremo 5’ de un oligonucleótido codificante, seleccionar una entidad química particular basada en cualquier característica o función particular útil, y ligar un oligonucleótido cola de dominio al extremo 3’ del oligonucleótido codificante que incluye una secuencia de unión de cebador y puede opcionalmente contener una o más etiquetas, por ejemplo, una etiqueta de “uso”, una etiqueta de “origen”, etc., como se describe en este documento. Esta secuencia de unión al cebador podría usarse entonces para iniciar la polimerización dependiente de plantilla para generar ADNc (o ARNc) que sea complementario al miembro de la biblioteca seleccionado. El ADNc o ARNc se ligaría entonces en su extremo 3’ a un oligonucleótido que contiene una secuencia de unión de cebador y, ahora que la información de codificación está flanqueada en ambos lados por secuencias de unión de cebador, el oligonucleótido puede secuenciarse y/o amplificarse utilizando enfoques establecidos, tales como los descritos aquí.

La masa se puede minimizar adicionalmente omitiendo o reduciendo el tamaño de una o más secuencias constantes que separan las etiquetas de codificación. La ligación de una cadena sencilla no requiere una relación complementaria entre los extremos a ligar o entre estos extremos y un empalme. Por lo tanto, no se requiere una secuencia fija para soportar la ligación enzimática. Las regiones fijas cortas entre etiquetas pueden ser útiles para el análisis informático de etiquetas u otros procesos de deconvolución in silico.

Etiquetas de oligonucleótidos

Las etiquetas de oligonucleótidos descritas en este documento (por ejemplo, una etiqueta de bloque de construcción o una porción de una cabeza de dominio) pueden usarse para codificar cualquier información útil, tal como una molécula, una porción de una entidad química, la adición de un componente (por ejemplo, un andamio o un bloque de construcción), una cabeza de dominio, en la biblioteca, la identidad de la biblioteca, el uso de uno o más miembros de la biblioteca (por ejemplo, el uso de los miembros en una alícuota de una biblioteca), y/o el origen de un miembro de la biblioteca (por ejemplo, mediante el uso de una secuencia de origen).

Se puede utilizar cualquier secuencia en un oligonucleótido para codificar cualquier información. De este modo, una secuencia de oligonucleótidos puede servir a más de un propósito, tal como codificar dos o más tipos de información o proporcionar un oligonucleótido de partida que también codifica para uno o más tipos de información. Por ejemplo, la primera etiqueta del bloque de construcción puede codificar para la adición de un primer bloque de construcción, así como para la identificación de la biblioteca. En otro ejemplo, se puede utilizar una cabeza de dominio para proporcionar un oligonucleótido de partida que enlace operativamente una entidad química a una etiqueta de bloque de construcción, donde la cabeza de dominio incluye adicionalmente una secuencia que codifica para la identidad de la biblioteca (es decir, la secuencia de identificación de la biblioteca). De acuerdo con esto, cualquiera de la información descrita aquí puede codificarse en etiquetas de oligonucleótidos separadas o puede combinarse y codificarse en la misma secuencia de oligonucleótidos (por ejemplo, una etiqueta de oligonucleótido, tal como una etiqueta de bloque de construcción, o una cabeza de dominio).

Una secuencia de bloque de construcción codifica la identidad de un bloque de construcción y/o el tipo de reacción de unión conducida con un bloque de construcción. Esta secuencia de bloque de construcción se incluye en una etiqueta de bloque de construcción, donde la etiqueta puede incluir opcionalmente uno o más tipos de secuencia descritos a

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continuación (por ejemplo, una secuencia de identificación de biblioteca, una secuencia de uso y/o una secuencia de origen).

Una secuencia de identificación de la biblioteca codifica la identidad de una biblioteca particular. Con el fin de permitir la mezcla de dos o más bibliotecas, un miembro de la biblioteca puede contener una o más secuencias que identifican la biblioteca, como en una etiqueta identificadora de la biblioteca (es decir, un oligonucleótido que incluye una secuencia identificadora de la biblioteca) en una etiqueta de bloque de construcción ligada, en una parte de la secuencia de la cabeza de dominio, o en una secuencia de cola de dominio Estas secuencias de identificación de bibliotecas se pueden utilizar para deducir relaciones de codificación, donde la secuencia de la etiqueta se traduce y se correlaciona con información de historial químico (síntesis). De acuerdo con esto, estas secuencias que identifican la biblioteca permiten la mezcla de dos o más bibliotecas juntas para selección, amplificación, purificación, secuenciación, etc.

Una secuencia de uso codifica el historial (es decir, uso) de uno o más miembros de la biblioteca en una alícuota individual de una biblioteca. Por ejemplo, alícuotas separadas pueden tratarse con diferentes condiciones de reacción, bloques de construcción y/o pasos de selección. En particular, esta secuencia puede usarse para identificar tales alícuotas y deducir su historial (uso) y de ese modo permitir la mezcla de alícuotas de la misma biblioteca con diferentes historias (usos) (por ejemplo, experimentos de selección distintos) para los fines de la mezcla juntas de muestras para selección, amplificación, purificación, secuenciación, etc. Estas secuencias de uso se pueden incluir en una cabeza de dominio, una cola de dominio, una etiqueta de bloque de construcción, una etiqueta de uso (es decir, un oligonucleótido que incluye una secuencia de uso) o cualquier otra etiqueta descrita en el presente documento (por ejemplo, una etiqueta de identificación de biblioteca o una etiqueta de origen).

Una secuencia de origen es una secuencia de oligonucleótidos degenerada (aleatoria) de cualquier longitud útil (por ejemplo, aproximadamente seis oligonucleótidos) que codifica para el origen del miembro de la biblioteca. Esta secuencia sirve para subdividir estocásticamente los miembros de la biblioteca que son idénticos en todos los aspectos en entidades distinguibles por información de secuencia, tales que las observaciones de productos de amplificación derivados de plantillas únicas de progenitores (por ejemplo, miembros de la biblioteca seleccionados) pueden distinguirse de las observaciones de múltiples productos de amplificación derivados de la misma plantilla progenitora (por ejemplo, un miembro de la biblioteca seleccionado). Por ejemplo, después de la formación de la biblioteca y antes de la etapa de selección, cada miembro de la biblioteca puede incluir una secuencia de origen diferente, tal como en una etiqueta de origen. Después de la selección, los miembros de la biblioteca seleccionados pueden amplificarse para producir productos de amplificación, y la porción del miembro de la biblioteca que se espera que incluya la secuencia de origen (por ejemplo, en la etiqueta de origen) puede ser observada y comparada con la secuencia de origen en cada una de las otras bibliotecas miembros. Como las secuencias de origen son degeneradas, cada producto de amplificación de cada miembro de la biblioteca debe tener una secuencia de origen diferente. Sin embargo, una observación de la misma secuencia de origen en el producto de amplificación podría indicar una fuente de error, como un error de amplificación o un error de ciclación en la secuencia que produce secuencias repetidas, y el origen o punto de partida de estos errores puede rastrearse al observar la secuencia de origen en cada paso (por ejemplo, en cada etapa de selección o etapa de amplificación) de utilizar la biblioteca. Estas secuencias de origen pueden incluirse en una cabeza de dominio, una cola de dominio, una etiqueta de bloque de construcción, una etiqueta de origen (es decir, un oligonucleótido que incluye una secuencia de origen) o cualquier otra etiqueta descrita aquí (por ejemplo, una etiqueta de identificación de biblioteca o una etiqueta de uso).

Cualquiera de los tipos de secuencias descritos en este documento puede incluirse en la cabeza de dominio. Por ejemplo, la cabeza de dominio puede incluir una o más de una secuencia de bloque de construcción, una secuencia de identificación de biblioteca, una secuencia de uso o una secuencia de origen.

Cualquiera de estas secuencias descritas aquí se puede incluir en una cola de dominio. Por ejemplo, la cola de dominio puede incluir una o más de una secuencia de identificación de la biblioteca, una secuencia de uso o una secuencia de origen.

Estas secuencias pueden incluir cualquier modificación descrita aquí para oligonucleótidos, tal como una o más modificaciones que promueven la solubilidad en disolventes orgánicos (por ejemplo, cualquiera aquí descrito, tal como para la cabeza de dominio), que proporcionan un análogo del enlace fosfodiéster natural (por ejemplo, un análogo de fosforotioato), o que proporciona uno o más oligonucleótidos no naturales (por ejemplo, nucleótidos 2’-sustituidos, tales como nucleótidos 2’-O-metilados y nucleótidos 2’-fluoro, o cualquiera de los descritos en este documento).

Estas secuencias pueden incluir cualquier característica descrita aquí para oligonucleótidos. Por ejemplo, estas secuencias se pueden incluir en una etiqueta que tiene menos de 20 nucleótidos (por ejemplo, como se describe en la presente memoria). En otros ejemplos, las etiquetas que incluyen una o más de estas secuencias tienen aproximadamente la misma

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masa (por ejemplo, cada etiqueta tiene una masa que es aproximadamente +/- 10% de la masa promedio entre dos o más etiquetas); carecen de una región de unión de cebador (por ejemplo, constante); carecen de una región constante; o tienen una región constante de longitud reducida (por ejemplo, una longitud inferior a 30 nucleótidos, inferior a 25 nucleótidos, inferior a 20 nucleótidos, inferior a 19 nucleótidos, inferior a 18 nucleótidos, inferior a 17 nucleótidos, inferior a 16 nucleótidos, inferior a 15 nucleótidos, inferior de 14 nucleótidos, inferior de 13 nucleótidos, inferior de 12 nucleótidos, inferior de 11 nucleótidos, inferior de 10 nucleótidos, inferior de 9 nucleótidos, inferior de 8 nucleótidos o inferior de 7 nucleótidos.

Las estrategias de secuenciación para bibliotecas y oligonucleótidos de esta longitud pueden incluir opcionalmente estrategias de concatenación o catenación para aumentar la fidelidad de lectura o la profundidad de la secuenciación, respectivamente. En particular, la selección de bibliotecas codificadas que carecen de regiones de unión a cebador se ha descrito en la literatura para SELEX, tal como se describe en Jarosch et al., Nucleic Acids Res. 34: e86 (2006).

Por ejemplo, un miembro de la biblioteca puede modificarse (por ejemplo, después de una etapa de selección) para incluir una primera secuencia adaptadora en el extremo 5’ del complejo y una segunda secuencia adaptadora en el extremo 3’ del complejo, donde la primera secuencia es sustancialmente complementaria a la segunda secuencia y da como resultado la formación de un dúplex. Para mejorar aún más el rendimiento, se añaden dos nucleótidos colgantes fijos (por ejemplo, CC) al extremo 5’. En realizaciones particulares, la primera secuencia adaptadora es 5’-GTGCTGC-3’ (SEQ ID NO: 1), y la segunda secuencia adaptadora es 5’-GCAGCAcCc-3’ (SEQ ID NO: 2).

Cabeza de dominio

En la biblioteca, la cabeza de dominio une operativamente cada entidad química con su etiqueta de oligonucleótido de codificación. Generalmente, la cabeza de dominio es un oligonucleótido de partida que tiene dos grupos funcionales que pueden derivarse adicionalmente, donde el primer grupo funcional une operativamente la entidad química (o un componente de la misma) a la cabeza de dominio y el segundo grupo funcional une operativamente una o más etiquetas a la cabeza de dominio. Un ligador puede usarse opcionalmente como separador entre la cabeza de dominio y la entidad química.

Los grupos funcionales de la cabeza de dominio se pueden utilizar para formar un enlace covalente con un componente de la entidad química y otro enlace covalente con una etiqueta. El componente puede ser cualquier parte de la molécula pequeña, como un andamio con nodos de diversidad o un bloque de construcción. Alternativamente, la cabeza de dominio puede derivarse para proporcionar un ligador (es decir, un separador que separa la cabeza de dominio de la molécula pequeña que se formará en la biblioteca) que termina en un grupo funcional (por ejemplo, un grupo hidroxilo, amina, carboxilo, sulfhidrilo, alquinilo, azido, o fosfato), que se usa para formar el enlace covalente con un componente de la entidad química. El ligador se puede unir al extremo 5’, en una de las posiciones internas, o al extremo 3’ de la cabeza de dominio. Cuando el ligador está unido a una de las posiciones internas, el ligador puede unirse operativamente a una base derivada (por ejemplo, la posición C5 de uridina) o colocarse internamente dentro del oligonucleótido utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica. Los ligadores de ejemplo se describen en el presente documento.

La cabeza de dominio puede tener cualquier estructura útil. La cabeza de dominio puede ser, por ejemplo, de 1 a 100 nucleótidos de longitud, preferiblemente de 5 a 20 nucleótidos de longitud, y lo más preferiblemente de 5 a 15 nucleótidos de longitud. La cabeza de dominio puede ser de cadena sencilla o de cadena doble y puede consistir en nucleótidos naturales o modificados, como se describe en este documento. Las realizaciones de ejemplo particulares de la cabeza de dominio se describen en las figuras 4A-4D. Por ejemplo, la fracción química puede estar unido operativamente al extremo 3’ (figura 4A) o al extremo 5’ (figura 4B) de la cabeza de dominio. En realizaciones particulares, la cabeza de dominio incluye una estructura en horquilla formada por bases complementarias dentro de la secuencia. Por ejemplo, la fracción química puede vincularse operativamente a la posición interna (figura 4C), el extremo 3’ (figura 4D) o el extremo 5’ de la cabeza de dominio.

En general, la cabeza de dominio incluye una secuencia no complementaria en el extremo 5’ o 3’ que permite unir una etiqueta de oligonucleótido por polimerización, ligación enzimática o reacción química. En la Figura 4E, La cabeza de dominio de ejemplo permite la ligación de etiquetas de oligonucleotido (marcadas 1- 4), y el método incluye etapas de purificación y fosforilación. Después de la adición de la etiqueta 4, se puede añadir una secuencia adaptadora adicional al extremo 5’ de la etiqueta 4. Las secuencias adaptadoras de ejemplo incluyen una secuencia de unión de cebador o una secuencia que tiene una etiqueta (por ejemplo, biotina). En los casos en que se usan muchos bloques de construcción y etiquetas correspondientes (por ejemplo, 100 etiquetas), se puede emplear una estrategia de mezcla y división durante la etapa de síntesis de oligonucleótidos para crear el número necesario de etiquetas. Tales estrategias de mezcla y división para la síntesis de ADN son conocidas en la técnica. Los miembros de la biblioteca resultante pueden amplificarse mediante PCR siguiendo la selección de entidades de unión frente a un objetivo (s) de interés.

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la cabeza de dominio o el complejo puede incluir opcionalmente una o más secuencias de unión del cebador. Por ejemplo, la cabeza de dominio tiene una secuencia en la región de bucle de la horquilla que sirve como región de unión de cebador para la amplificación, donde la región de unión del cebador tiene una temperatura de fusión más alta para su cebador complementario (por ejemplo, que puede incluir regiones identificadoras de flanqueo) que para una secuencia en la cabeza de dominio. En otras realizaciones, el complejo incluye dos secuencias de unión de cebador (por ejemplo, para permitir una reacción de PCR) en cualquier lado de una o más etiquetas que codifican uno o más bloques de construcción. Alternativamente, la cabeza de dominio puede contener una secuencia de unión de cebador en el extremo 5’ o 3’. En otras realizaciones, la cabeza de dominio es una horquilla, y la región de bucle forma un sitio de unión de cebador o el sitio de unión de cebador se introduce a través de la hibridación de un oligonucleótido con la cabeza de dominio en el lado 3’ del bucle. Un oligonucleótido cebador, que contiene una región homóloga al extremo 3’ de la cabeza de dominio y que lleva una región de unión del cebador en su extremo 5’ (por ejemplo, para permitir una reacción de PCR) puede hibridarse con la cabeza de dominio y puede contener una etiqueta que codifica un bloque de construcción o la adición de un bloque de construcción. El oligonucleótido cebador puede contener información adicional, tal como una región de nucleótidos aleatorizados, por ejemplo, de 2 a 16 nucleótidos de longitud, que se incluye para el análisis bioinformático.

La cabeza de dominio puede incluir opcionalmente una estructura en horquilla, donde esta estructura se puede lograr mediante cualquier método útil. Por ejemplo, la cabeza de dominio puede incluir bases complementarias que forman compañeros de pares base intermoleculares, tales como pares base de ADN Watson-Crick (por ejemplo, adenina-timina y guanina-citosina) y/o pares base inestable (por ejemplo, guanina-uracilo, inosina-uracilo, inosina-adenina e inosina- citosina). En otro ejemplo, la cabeza de dominio puede incluir nucleótidos modificados o sustituidos que pueden formar formaciones dúplex de mayor afinidad en comparación con nucleótidos no modificados, siendo conocidos tales nucleótidos modificados o sustituidos en la técnica. En otro ejemplo más, la cabeza de dominio incluye una o más bases reticuladas para formar la estructura en horquilla. Por ejemplo, las bases dentro de una única cadena o bases en diferentes cadenas dobles se pueden reticular, por ejemplo, utilizando psoraleno.

La cabeza de dominio o complejo puede incluir opcionalmente una o más etiquetas que permiten la detección. Por ejemplo, la cabeza de dominio, una o más etiquetas de oligonucleótidos y/o una o más secuencias de cebadores pueden incluir un isótopo, un agente de radioimágenes, un marcador, un rastreador, una marca fluorescente (por ejemplo, rodamina o fluoresceína), una marca quimioluminiscente, un punto cuántico y una molécula informadora (por ejemplo, biotina o una etiqueta his).

En otras realizaciones, la cabeza de dominio o etiqueta puede modificarse para soportar la solubilidad en condiciones semi, reducidas o no acuosas (por ejemplo, orgánicas). Las bases de nucleótidos de la cabeza de dominio o etiqueta pueden hacerse más hidrófobas modificando, por ejemplo, las posiciones C5 de las bases T o C con cadenas alifáticas sin alterar significativamente su capacidad para formar enlaces de hidrógeno con sus bases complementarias. Los nucleótidos modificados o sustituidos a modo de ejemplo son 5’-dimetoxitritil-N4-diisobutilaminometiliden-5- (1 -propinil) - 2’-desoxicitidina, 3’-[(2-cianoetil)-(N, N-diisopropil)] - fosforamidita; 5’-dimetoxitritil-5- (1 -propinil) -2’-desoxiuridina, 3’- [(2- cianoetil) - (N, N-diisopropil)] - fosforamidita; 5’-dimetoxitritil-5-fluoro-2’-desoxiuridina, 3’- [(2-cianoetil) - (N, N-diisopropil)] - fosforamidita; y 5’-dimetoxitritil-5- (piren-1-il-etinil) -2’-desoxiuridina, o 3’- [(2-cianoetil) - (N, N-diisopropil)] - fosforamidita.

Además, el oligonucleótido de la cabeza de dominio se puede intercalar con modificaciones que promueven la solubilidad en disolventes orgánicos. Por ejemplo, la fosforamidita de azobenceno puede introducir una fracción hidrófoba en el diseño de la cabeza de dominio. Tales inserciones de amiditas hidrófobas en la cabeza de dominio pueden ocurrir en cualquier parte de la molécula. Sin embargo, la inserción no puede interferir con el etiquetado posterior utilizando etiquetas de ADN adicionales durante la síntesis de la biblioteca o la PCR subsiguiente una vez que se completa una selección o análisis de microarreglo, si se usa para la deconvolución de la etiqueta. Tales adiciones al diseño de la cabeza de dominio aquí descrita harán la cabeza de dominio soluble en, por ejemplo, 15%, 25%, 30%, 50%, 75%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de disolvente orgánico. De este modo, la adición de residuos hidrófobos en el diseño de la cabeza de dominio permite una solubilidad mejorada en condiciones semi o no acuosas (por ejemplo, orgánicas), al tiempo que hace que la cabeza de dominio sea competente para el etiquetado de oligonucleótidos. Además, las etiquetas de ADN que se introducen posteriormente en la biblioteca también pueden modificarse en la posición C5 de las bases T o C de manera que también hagan que la biblioteca sea más hidrófoba y soluble en disolventes orgánicos para las siguientes etapas de la síntesis de la biblioteca.

En realizaciones particulares, la cabeza de dominio y la primera etiqueta de bloque de construcción pueden ser la misma entidad, es decir, se puede construir una pluralidad de entidades de etiqueta de cabeza de dominio que comparten partes comunes (por ejemplo, una región de unión de cebador) y todas difieren en otra parte (por ejemplo, región de codificación). Estos pueden utilizarse en la etapa de “dividir” y agruparse después de que haya ocurrido la codificación.

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En realizaciones particulares, la cabeza de dominio puede codificar información, por ejemplo, incluyendo una secuencia que codifica el primer paso de división (es) o una secuencia que codifica la identidad de la biblioteca, tal como mediante el uso de una secuencia particular relacionada con una etapa con una biblioteca específica.

Ligación enzimática y técnicas de ligadura química

Se pueden utilizar diversas técnicas de ligamiento para agregar andamios, bloques de construcción, ligadores, etiquetas de bloques de construcción y/o la cabeza de dominio para producir un complejo. Por consiguiente, cualquiera de las etapas de unión descritas en el presente documento puede incluir cualquier técnica de ligación útil, tal como la ligación de enzimas y/o la ligación química. Estos pasos de unión pueden incluir la adición de una o más etiquetas de bloque de construcción a la cabeza de dominio o complejo; la adición de un ligador a la cabeza de dominio; y la adición de uno o más andamios o bloques de construcción a la cabeza de dominio o complejo. En realizaciones particulares, las técnicas de ligación usadas para cualquier oligonucleótido proporcionan un producto resultante que puede transcribirse y/o transcribirse inversamente para permitir la decodificación de la biblioteca o para la polimerización dependiente de plantilla con uno o más ADN o ARN polimerasas.

En general, la ligación enzimática produce un oligonucleótido que tiene un enlace fosfodiéster nativo que puede transcribirse y/o transcribirse inversamente. Los métodos ilustrativos de ligación de enzimas se proporcionan en la presente e incluyen el uso de una o más ARN o ADN ligasas, tales como ARN ligasa T4, ADN ligasa T4, ssADN ligasa CircLigase™, ssADN ligasa CircLigase™ II y ssADN ligasa ThermoPhage™ (Prokazyme Ltd., Reykjavik, Islandia).

La ligación química también se puede utilizar para producir oligonucleótidos capaces de transcribirse o transcribirse de forma inversa. Un beneficio de la ligación química es que la síntesis en fase sólida de tales oligonucleótidos se puede optimizar para soportar un rendimiento de ligación eficiente. Sin embargo, puede ser necesario probar la eficacia de una técnica de ligación química para proporcionar oligonucleótidos capaces de transcribirse o transcribirse de forma inversa. Esta eficacia se puede analizar mediante cualquier método útil, como cromatografía líquida-espectrometría de masas, análisis de RT-pCr y/o análisis de PCR. Ejemplos de estos métodos se proporcionan en el Ejemplo 5.

En realizaciones particulares, la ligación química incluye el uso de uno o más pares químicamente correactivos para proporcionar un separador que puede transcribirse o transcribirse de forma inversa. En particular, las reacciones adecuadas para pares correactivos químicamente son candidatos preferidos para el proceso de ciclación (Kolb et al., Angew. Chem. Int. Ed., 40: 2004-2021 (2001); Van der Eycken et al., QSAR Comb. Sci., 26: 1115 - 1326 (2007)). Los ejemplos de pares correactivos químicamente son un par que incluye un grupo alquinilo opcionalmente sustituido y un grupo azido opcionalmente sustituido para formar un separador de triazol mediante una reacción de cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen; un dieno opcionalmente sustituido que tiene un sistema de electrones 4n (por ejemplo, un compuesto 1,3- insaturado opcionalmente sustituido, tal como 1,3-butadieno opcionalmente sustituido, 1 -metoxi-3-trimetilsililoxi-1,3- butadieno, ciclopentadieno, ciclohexadieno o furano) y un dienófilo opcionalmente sustituido o un heterodienófilo opcionalmente sustituido que tiene un sistema de electrones 2n (por ejemplo, un grupo alquenilo opcionalmente sustituido o un grupo alquinilo opcionalmente sustituido) para formar un separador de cicloalquenilo a través de una reacción de Diels-Alder; un nucleófilo (por ejemplo, una amina opcionalmente sustituida o un tiol opcionalmente sustituido) con un electrófilo heterociclilo encadenado (por ejemplo, epóxido, aziridina, ion aziridinio opcionalmente sustituido o ion episulfonio) para formar un separador heteroalquilo a través de una reacción de apertura de anillo; un grupo fosforotioato con un grupo yodo, tal como en una ligadura empalmada de un oligonucleótido que contiene 5’-yodo dT con un oligonucleótido 3’-fosforotioato; y un grupo aldehído y un grupo amino, tal como una reacción de un oligonucleótido modificado con 3’-aldehído, que se puede obtener opcionalmente oxidando un oligonucleótido modificado con 3’-glicerilo, comercialmente disponible, con 5’-amino oligonucleótido (es decir, en una reacción de aminación reductiva) o un oligonucleótido 5’-hidrazido.

En otras realizaciones, la ligación química incluye la introducción de un análogo del enlace de fosfodiéster, por ejemplo, para el análisis y la secuenciación de la PCR postseleccion: Ejemplos de análogos de un fosfodiéster incluyen un enlace fosforotioato (por ejemplo, como se introdujo mediante el uso de un grupo fosforotioato y un grupo saliente, tal como un grupo yodo), un enlace de fosforamida o un enlace fosforoditioato (por ejemplo, introducido por el uso de un grupo fosforoditioato y un grupo saliente, como un grupo yodo).

Condiciones de reacción para promover la ligación enzimática o la ligación química

La invención también presenta una o más condiciones de reacción que promueven la ligación enzimática o química entre la cabeza de dominio y una etiqueta o entre dos etiquetas. Estas condiciones de reacción incluyen utilizar nucleótidos modificados dentro de la etiqueta, como se describe aquí; utilizar etiquetas de donante y etiquetas de aceptador que tienen diferentes longitudes y variar la concentración de las etiquetas; utilizando diferentes tipos de ligasas, así como

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combinaciones de las mismas (por ejemplo, ligasa de ADN CircLigase™ y/o ligasa de ARN de T4) y variando su concentración; utilizar polietilenglicoles (pEg) que tienen diferentes pesos moleculares y variar su concentración; uso de agentes de amontonamiento que no sean PEG (por ejemplo, betaína o albúmina de suero bovino); variando la temperatura y la duración para la ligación; variando la concentración de diversos agentes, incluyendo ATP, Co (NH3) 6Cl3 y pirofosfato inorgánico de levadura; utilizando etiquetas oligonucleotídicas fosforiladas enzimática o químicamente; utilizando etiquetas 3’-protegidas; y utilizando etiquetas preadeniladas. Estas condiciones de reacción también incluyen ligaciones químicas.

La cabeza de dominio y/o las etiquetas pueden incluir uno o más nucleótidos modificados o sustituidos. En realizaciones preferidas, la cabeza de dominio y/o las etiquetas incluyen uno o más nucleótidos modificados o sustituidos que promueven la ligación enzimática, tales como 2’-O-metil nucleótidos (por ejemplo, 2’-O-metilguanina o 2’-O-metiluracilo), 2’- fluoro- nucleótidos o cualquier otro nucleótido modificado que se utilice como sustrato para la ligación. Alternativamente, la cabeza de dominio y/o etiquetas se modifican para incluir uno o más grupos químicamente reactivos para soportar la ligación química (por ejemplo, un grupo alquinilo opcionalmente sustituido y un grupo azido opcionalmente sustituido). Opcionalmente, los oligonucleótidos de etiqueta están funcionalizados en ambos extremos con grupos químicamente reactivos y, opcionalmente, uno de estos extremos está protegido, de manera que los grupos pueden abordarse independientemente y las reacciones secundarias pueden reducirse (por ejemplo, reacciones secundarias de polimerización reducida).

La ligación enzimática puede incluir una o más ligasas. Ejemplos de ligasas incluyen ssADN ligasa CircLigase™ (EPICENTER Biotechnologies, Madison, WI), ssADN ligasa CircLigase™ II (también de EPICENTER Biotechnologies), ssADN ligasa ThermoPhage™ (Prokazyme Ltd., Reykjavik, Islandia), ARN ligasa T4, y ADN ligasa T4. En realizaciones preferidas, la ligación incluye el uso de una ARN ligasa o una combinación de una ARN ligasa y una ADN ligasa. La ligación puede incluir además uno o más cationes multivalentes solubles, tales como Co (NH3)6Cl3, en combinación con una o más ligasas.

Antes o después de la etapa de ligación, el complejo se puede purificar por tres razones. En primer lugar, el complejo se puede purificar para eliminar cabezas de dominio o etiquetas sin reaccionar que pueden dar lugar a reacciones cruzadas e introducir “ruido” en el proceso de codificación. En segundo lugar, el complejo se puede purificar para eliminar cualquier reactivo o material de partida sin reaccionar que pueda inhibir o disminuir la actividad de ligación de una ligasa. Por ejemplo, el fosfato puede dar como resultado una actividad de ligación reducida. En tercer lugar, las entidades que se introducen en una etapa química o de ligación pueden necesitar ser eliminadas para permitir el siguiente paso químico o de ligación. Los métodos de purificación del complejo se describen en este documento.

La ligación enzimática y química puede incluir polietilenglicol que tiene un peso molecular promedio de más de 300 Dalton (por ejemplo, más de 600 Dalton, 3.000 Dalton, 4.000 Dalton o 4.500 Dalton). En realizaciones particulares, el polietilenglicol tiene un peso molecular medio de aproximadamente 3.000 Dalton a 9.000 Dalton (por ejemplo, de 3.000 Dalton a 8.000 Dalton, de 3.000 Dalton a 7.000 Dalton, de 3.000 Dalton a 6.000 Dalton, y de 3.000 Dalton a 5.000 Dalton). En realizaciones preferidas, el polietilenglicol tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 3.000 Dalton a aproximadamente 6.000 Dalton (por ejemplo, de 3.300 Dalton a 4.500 Dalton, de 3.300 Dalton a 5.000 Dalton, de 3.300 Dalton a 5.500 Dalton, de 3.300 Dalton a 6.000 Dalton, de 3.500 Dalton a 4.500 Dalton, de 3.500 Dalton a 5.000 Dalton, de 3.500 Dalton a 5.500 Dalton, y de 3.500 Dalton a 6.000 Dalton, como 4.600 Dalton. El polietilenglicol puede estar presente en cualquier cantidad útil, tal como desde aproximadamente el 25% (p/v) hasta aproximadamente el 35% (p/v), tal como el 30% (p/v).

En una realización preferida de esta invención, las etiquetas del bloque de construcción se instalan por ligación de un oligonucleótido de cadena sencilla a un oligonucleótido de cadena sencilla utilizando el protocolo de ligación descrito a continuación:

Cabeza de dominio: 25 pM (extremo 5’: 5’-monofosfo/2’-OMe G, nucleótidos intermedios: 2’-

deoxi, y extremo 3’: 2’-bloqueado/3’ -bloqueado)

Etiqueta de bloque de construcción: 25 pM (extremo 5’: 2’-OMe/5’-OH G, nucleótidos intermedios: 2’-deoxi, y

extremo 3’: 3’-OH/2’-OMe)

Co(NH3)6Cl3: 1 mM

PEG 4600: 30% (p/v)

ARN Ligasa T4 (Promega): 1.5 unidades/pl

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Pirofosfatasa inorgánica de levadura: 0.0025 unidades/gl

Tris: 50 mM

MgCl2: 10 mM

ATP: 1 mM

pH: 7.5

Agua: Balance

En otras realizaciones, el protocolo incluye incubación a 37 °C. por 20 horas para los propósitos de la construcción real de la biblioteca, se puede utilizar una mayor concentración de etiquetas, y/o ligasa, y tales modificaciones a estas concentraciones serían evidentes para los expertos en la técnica.

Métodos para codificar entidades químicas dentro de una biblioteca

Los métodos de la invención se pueden utilizar para sintetizar una biblioteca que tiene un número diverso de entidades químicas que están codificadas por etiquetas de oligonucleótidos. Ejemplos de bloques de construcción y etiquetas de ADN codificantes se encuentran en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos No. 2007/0224607.

Cada entidad química está formada por uno o más bloques de construcción y, opcionalmente, un andamio. El andamio sirve para proporcionar uno o más nodos de diversidad en una geometría particular (por ejemplo, una triazina para proporcionar tres nodos dispuestos espacialmente alrededor de un anillo de heteroarilo o una geometría lineal).

Los bloques de construcción y sus etiquetas de codificación se pueden añadir directa o indirectamente (por ejemplo, a través de un ligador) a la cabeza de dominio para formar un complejo. Cuando la cabeza de dominio incluye un ligador, el bloque de construcción o andamio se agrega al extremo del ligador. Cuando el ligador está ausente, el bloque de construcción se puede agregar directamente a la cabeza de dominio o el propio bloque de construcción puede incluir un ligador que reacciona con un grupo funcional de la cabeza de dominio. Se describen ligadores y cabezas de dominio de ejemplo.

El andamio se puede agregar de cualquier manera útil. Por ejemplo, el andamio se puede agregar al extremo del ligador o la cabeza de dominio, y se pueden agregar bloques de construcción sucesivos a los nodos de diversidad disponibles del andamio. En otro ejemplo, el bloque de construcción An primero se agrega al ligador o a la cabeza de dominio, y luego el nodo de diversidad del andamio S se hace reaccionar con un grupo funcional en el bloque de construcción An. Las etiquetas de oligonucleótidos que codifican un andamio particular se pueden agregar opcionalmente a la cabeza de dominio o al complejo. Por ejemplo, Sn se agrega al complejo en n recipientes de reacción, donde n es un número entero más de uno, y la etiqueta Sn (es decir, la etiqueta S1, S2, ... Sn-1, Sn) se une al grupo funcional del complejo.

Los bloques de construcción se pueden agregar en múltiples etapas sintéticas. Por ejemplo, una alícuota de la cabeza de dominio, que tiene opcionalmente un ligador unido, se separa en n recipientes de reacción, donde n es un número entero de dos o más. En el primer paso, se agrega el bloque de construcción An a cada n recipiente de reacción (es decir, el bloque de construcción A1, A2, ... An-1, An se agrega al recipiente de reacción 1,2, ... n-1, n), donde n es un número entero y cada bloque de construcción An es único. En la segunda etapa, se agrega el armazón S a cada recipiente de reacción para formar un complejo An-S. Opcionalmente, el andamio Sn se puede agregar a cada recipiente de reacción desde un complejo An-Sn, donde n es un número entero de más de dos, y cada andamio Sn puede ser único. En la tercera etapa, el bloque de construcción Bn es para cada n recipiente de reacción que contiene el complejo An-S (es decir, el bloque de construcción B1, B2, ... Bn-1, Bn se agrega al recipiente de reacción 1,2, ... n -1, n que contiene el complejo A1-S, A2-S, ... An-1 -S, An-S), donde cada bloque de construcción Bn es único. En etapas adicionales, puede añadirse el bloque de construcción Cn a cada n recipiente de reacción que contiene el complejo de Bn-An-S (es decir, el bloque de construcción C1, C2, ... Cn-1, Cn se agrega al recipiente de reacción 1,2, ... n-1, n que contiene el complejo B1-A1-S ... Bn-An-S), donde cada bloque de construcción Cn es único. La biblioteca resultante tendrá n3 cantidad de complejos con etiquetas n3. De esta manera, se pueden utilizar etapas sintéticas adicionales para unir bloques de construcción adicionales para diversificar aún más la biblioteca.

Después de formar la biblioteca, los complejos resultantes pueden purificarse opcionalmente y someterse a una reacción de polimerización o ligación utilizando uno o más cebadores. Esta estrategia general se puede ampliar para incluir nodos

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de diversidad adicionales y bloques de construcción (por ejemplo, D, E, F, etc.). Por ejemplo, el primer nodo de diversidad se hace reaccionar con bloques de construcción y/o S y se codifica mediante una etiqueta de oligonucleótido. A continuación, se hacen reaccionar bloques de construcción adicionales con el complejo resultante, y el nodo de diversidad posterior se deriva mediante bloques de construcción adicionales, que se codifica mediante el cebador utilizado para la reacción de polimerización o ligación.

Para formar una biblioteca codificada, se añaden etiquetas de oligonucleótidos al complejo después o antes de cada etapa de síntesis. Por ejemplo, antes o después de la adición del bloque de construcción An a cada recipiente de reacción, la etiqueta An se une al grupo funcional de la cabeza de dominio (es decir, etiqueta A1, A2, ... An-1, An se agrega al recipiente de reacción 1, 2, ... n-1, n que contiene la cabeza de dominio). Cada etiqueta An tiene una secuencia distinta que se correlaciona con cada bloque de construcción único An, y la determinación de la secuencia de etiqueta An proporciona la estructura química del bloque de construcción An. De esta manera, se usan etiquetas adicionales para codificar para bloques de construcción adicionales o andamios adicionales.

Además, la última etiqueta añadida al complejo puede incluir una secuencia de cebador o proporcionar un grupo funcional para permitir la unión (por ejemplo, mediante ligación) de una secuencia de cebador. La secuencia de cebador se puede utilizar para amplificar y/o secuenciar las etiquetas de oligonucleótidos del complejo. Los métodos de ejemplo para amplificar y secuenciar incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación de cadena lineal (LCR), la amplificación por círculo rodante (RCA) o cualquier otro método conocido en la técnica para amplificar o determinar secuencias de ácidos nucleicos.

Usando estos métodos, se pueden formar grandes bibliotecas que tienen una gran cantidad de entidades químicas codificadas. Por ejemplo, una cabeza de dominio se hace reaccionar con un ligador y un bloque de construcción An, que incluye 1,000 variantes diferentes (es decir, n = 1.000). Para cada bloque de construcción An, se liga una etiqueta de ADN An o cebador extendido a la cabeza de dominio. Estas reacciones se pueden realizar en una placa de 1,000 pozos o en placas de 10 x 100 pozos. Todas las reacciones pueden agruparse, opcionalmente purificarse, y dividirse en un segundo conjunto de placas. A continuación, se puede realizar el mismo procedimiento con el bloque de construcción Bn, que también incluye 1,000 variantes diferentes. Una etiqueta de ADN Bn se puede ligar al complejo An-cabeza de dominio, y todas las reacciones se pueden agrupar. La biblioteca resultante incluye 1,000 x 1,000 combinaciones de An x Bn (es decir, 1,000,000 de compuestos) etiquetados por 1,000,000 combinaciones diferentes de etiquetas. El mismo enfoque puede extenderse para agregar los bloques de construcción Cn, Dn, En, etc. La biblioteca generada se puede utilizar para identificar compuestos que se unen al objetivo. La estructura de las entidades químicas que se unen a la biblioteca se puede evaluar opcionalmente mediante pCr y la secuenciación de las etiquetas de ADN para identificar los compuestos que se enriquecieron.

Este método se puede modificar para evitar el etiquetado después de la adición de cada bloque de construcción o para evitar la acumulación (o la mezcla). Por ejemplo, el método puede modificarse añadiendo el bloque de construcción An a n recipientes de reacción, donde n es un número entero de más de uno, y añadiendo el bloque de construcción idéntico B1 a cada pozo de reacción. Aquí, B1 es idéntico para cada entidad química, y, por lo tanto, no es necesaria una etiqueta de oligonucleótido que codifique este bloque de construcción. Después de agregar un bloque de construcción, los complejos se pueden agrupar o no agrupar. Por ejemplo, la biblioteca no se agrupa después de la etapa final de la adición de bloque de construcción, y los conjuntos se seleccionan individualmente para identificar el (los) compuesto (s) que se unen a un objetivo. Para evitar agrupar todas las reacciones después de la síntesis, un lector BIND® (de SRU Biosystems, Inc.), por ejemplo, se puede utilizar para monitorear la unión en una superficie del sensor en formato de alto rendimiento (por ejemplo., placas de 384 pozos y placas de 1,536 pozos). Por ejemplo, el bloque de construcción An puede estar codificado con la etiqueta de ADN An, y el bloque de construcción Bn puede estar codificado por su posición dentro de la placa del pozo. Los compuestos candidatos pueden identificarse utilizando un ensayo de unión (por ejemplo, utilizando un Biosensor BIND®, también disponible por sRu Biosystems, Inc., o utilizando un ensayo ELISA) y analizando las etiquetas An mediante secuenciación, análisis de microarreglo y/o análisis de digestión de restricción. Este análisis permite la identificación de combinaciones de bloques de construcción An y Bn que producen las moléculas deseadas.

El método de amplificación puede incluir opcionalmente formar una emulsión de agua en aceite para crear una pluralidad de microrreactores acuosos. Las condiciones de reacción (por ejemplo, concentración de complejo y tamaño de microrreactores) pueden ajustarse para proporcionar, en promedio, un microrreactor que tiene al menos un miembro de una biblioteca de compuestos. Cada microrreactor también puede contener el objetivo, un único glóbulo capaz de unirse a un complejo o una porción del complejo (por ejemplo, una o más etiquetas) y/o unirse al objetivo, y una solución de reacción de amplificación que tiene uno o más reactivos necesarios para realizar amplificación de ácido nucleico. Después de amplificar la etiqueta en los microrreactores, las copias amplificadas de la etiqueta se unirán a los glóbulos en los microrreactores, y los glóbulos recubiertos se pueden identificar por cualquier método útil.

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Una vez que se han identificado los bloques de construcción de la primera biblioteca que se unen al objetivo de interés, se puede preparar una segunda biblioteca de forma iterativa. Por ejemplo, se pueden agregar uno o dos nodos adicionales de diversidad, y se crea y se muestra la segunda biblioteca, como se describe aquí. Este proceso se puede repetir tantas veces como sea necesario para crear moléculas con las propiedades moleculares y farmacéuticas deseadas.

Se pueden utilizar diversas técnicas de ligación para agregar el andamio, los bloques de construcción, los ligadores y las etiquetas de bloques de construcción. En consecuencia, cualquiera de las etapas de unión descritas en el presente documento puede incluir cualquier técnica o técnicas de ligación útiles. Las técnicas de ligación de ejemplo incluyen la ligación enzimática, tal como el uso de una o más ARN ligasas y/o ADN ligasas, como se describe en la presente memoria; y ligación química, tal como el uso de pares correactivos químicamente, como se describe aquí.

Andamios y bloques de construcción

El andamio S puede ser un solo átomo o un andamio molecular. Ejemplos de andamios de átomos individuales incluyen un átomo de carbono, un átomo de boro, un átomo de nitrógeno o un átomo de fósforo, etc. Los andamios poliatómicos ilustrativos incluyen un grupo cicloalquilo, un grupo cicloalquenilo, un grupo heterocicloalquilo, un grupo heterocicloalquenilo, un grupo arilo o un grupo heteroarilo. Las realizaciones particulares de un andamio de heteroarilo incluyen una triazina, tal como 1,3,5-triazina, 1,2,3-triazina o 1,2,4-triazina; una pirimidina; una pirazina; una piridazina; un furano; un pirrol; una pirrolina; una pirrolidina; un oxazol; un pirazol; un isoxazol; un pirano; una piridina; un indol; un indazol; o una purina.

El andamio S se puede unir operativamente a la etiqueta mediante cualquier método útil. En un ejemplo, S es una triazina que está vinculada directamente a la cabeza de dominio. Para obtener este andamio de ejemplo, la triclorotriazina (es decir, un precursor clorado de la triazina que tiene tres cloros) se hace reaccionar con un grupo nucleófilo de la cabeza de dominio. Usando este método, S tiene tres posiciones que tienen cloro que están disponibles para sustitución, donde hay dos posiciones disponibles para diversidad de nodos y una posición para la cabeza de dominio. A continuación, se agrega el bloque de construcción An a un nodo de diversidad del andamio, y la etiqueta An que codifica para el bloque de construcción An (“etiqueta An”) se liga a la cabeza de dominio, donde estas dos etapas se pueden realizar en cualquier orden. Luego, se agrega el bloque de construcción Bn al nodo de diversidad restante, y la codificación de etiqueta Bn para el bloque de construcción Bn se liga al final de la etiqueta An. En otro ejemplo, S es una triazina que está operativamente unida al ligador de una etiqueta, donde la triclorotriazina se hace reaccionar con un grupo nucleofílico (por ejemplo, un grupo amino) de un ligador de PEG, alifático o aromático de una etiqueta. Se pueden agregar bloques de construcción y etiquetas asociadas, como se describe arriba.

En otro ejemplo más, S es una triazina que está operativamente unida al bloque de construcción An. Para obtener este andamio, el bloque de construcción An que tiene dos nodos de diversidad (por ejemplo, un grupo electrofílico y un grupo nucleofílico, tal como un Fmoc-aminoácido) reacciona con el grupo nucleofílico de un ligador (por ejemplo, el grupo terminal de un PEG, alifático, o un ligador aromático, que está unido a una cabeza de dominio). Luego, la triclorotriazina se hace reaccionar con un grupo nucleofílico del bloque de construcción An. Usando este método, las tres posiciones de cloro de S se usan como nodos de diversidad para bloques de construcción. Como se describe aquí, se pueden agregar bloques de construcción y andamios adicionales Sn.

Los An del bloque de construcción de ejemplo incluyen, por ejemplo, aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos alfa, beta, gamma, delta y épsilon, así como derivados de aminoácidos naturales y no naturales), reactivos químicamente correactivos (por ejemplo, cadenas de azida o alquino) con una amina, o un reactivo de tiol, o combinaciones de los mismos. La elección del bloque de construcción An depende, por ejemplo, de la naturaleza del grupo reactivo utilizado en el ligador, la naturaleza de una fracción de armazón y el disolvente utilizado para la síntesis química.

Los Bn y Cn de los bloques de construcción de ejemplo incluyen cualquier unidad estructural útil de una entidad química, tal como grupos aromáticos opcionalmente sustituidos (por ejemplo, fenilo o bencilo opcionalmente sustituido), grupos heterociclilo opcionalmente sustituidos (por ejemplo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, isoindolilo, azaindolilo, bencimidazolilo, azabencimidazolilo, bencisoxazolilo, piridinilo, piperidilo o pirrolidinilo opcionalmente sustituidos), grupos alquilo opcionalmente sustituidos (por ejemplo, grupos alquilo C1-6 lineales o ramificados opcionalmente sustituidos o grupos aminoalquilo C1-6 opcionalmente sustituidos), o grupos carbociclilo opcionalmente sustituidos (por ejemplo, ciclopropilo, ciclohexilo o ciclohexenilo opcionalmente sustituidos). Los Bn y los Cn de los bloques de construcción particularmente útiles incluyen aquellos con uno o más grupos reactivos, tales como un grupo opcionalmente sustituido (por ejemplo, cualquiera descrito aquí) que tiene uno o sustituyentes opcionales que son grupos reactivos o pueden modificarse químicamente para formar grupos reactivos. Los ejemplos de grupos reactivos incluyen uno o más de amina (-NR2, donde cada R es, independientemente, H o un alquilo C1-6 opcionalmente sustituido), hidroxi, alcoxi (-OR, donde R es un alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, tal como metoxi), carboxi (-COOH), amida o sustituyentes químicamente

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correactivos. Se puede introducir un sitio de restricción, por ejemplo, en la etiqueta Bn o Cn, donde se puede identificar un complejo realizando PCR y digestión de restricción con una de las enzimas de restricción correspondientes.

Ligadores

El ligador bifuncional entre la cabeza de dominio y la entidad química se puede variar para proporcionar un separador apropiado y/o para aumentar la solubilidad del cabezal en el disolvente orgánico. Existe una amplia variedad de ligadores disponibles comercialmente que pueden acoplar la cabeza de dominio con la biblioteca de moléculas pequeñas. El ligador típicamente consta de cadenas lineales o ramificadas y puede incluir un alquilo C1-10, un heteroalquilo de 1 a 10 átomos, un alquenilo C2-10, un alquinilo C2-10, arilo C5-10, un sistema cíclico o policíclico de 3 a 20 átomos, un fosfodiéster, un péptido, un oligosacárido, un oligonucleótido, un oligómero, un polímero o un polialquilglicol (por ejemplo, un polietilenglicol, como - (CH2CH2O)nCH2CH2-, donde n es un número entero de 1 a 50), o combinaciones de los mismos.

El ligador bifuncional puede proporcionar un separador apropiado entre la cabeza de dominio y una entidad química de la biblioteca. En ciertas realizaciones, el ligador bifuncional incluye tres partes. La Parte 1 puede ser un grupo reactivo, que forma un enlace covalente con ADN, como, por ejemplo, un ácido carboxílico, preferiblemente activado por un éster de N- hidroxi succinimida (NHS) para reaccionar con un grupo amino en el ADN (por ejemplo, dT amino modificado), una amidita para modificar el extremo 5’ o 3’ de una cabeza de dominio de cadena sencilla (conseguido mediante química de oligonucleótidos estándar), pares químicamente correactivos (por ejemplo, cicloadición de azidoalquino en presencia de catalizador de Cu (I), o cualquiera descrito aquí), o grupos tiol reactivos. La Parte 2 también puede ser un grupo reactivo, que forma un enlace covalente con la entidad química, ya sea un bloque de construcción An o un andamio. Tal grupo reactivo podría ser, por ejemplo, una amina, un tiol, una azida o un alquino. La Parte 3 puede ser un separador químicamente inerte de longitud variable, introducido entre las Partes 1 y 2. Dicho separador puede ser una cadena de unidades de etilenglicol (por ejemplo, PEG de diferentes longitudes), un alcano, un alqueno, una cadena de polieno o una cadena peptídica El ligador puede contener ramificaciones o insertos con fracciones químicas hidrófobas (tales como, por ejemplo, anillos de benceno) para mejorar la solubilidad de la cabeza de dominio en disolventes orgánicos, así como fracciones fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína o Cy-3) utilizados para fines de detección de bibliotecas. Los residuos hidrófobos en el diseño de la cabeza de dominio se pueden variar con el diseño del ligador para facilitar la síntesis de la biblioteca en disolventes orgánicos. Por ejemplo, la combinación de cabeza de dominio y ligador está diseñada para tener residuos apropiados en los que el coeficiente de octanol: agua (Poct) es de, por ejemplo, 1.0 a 2.5.

Los ligadores pueden seleccionarse empíricamente para un diseño de biblioteca de molécula pequeña dado, de modo que la biblioteca puede sintetizarse en disolvente orgánico, por ejemplo, en 15%, 25%, 30%, 50%, 75%, 90%, 95 %, 98%, 99% o 100% de disolvente orgánico. El ligador puede variarse utilizando reacciones modelo antes de la síntesis de la biblioteca para seleccionar la longitud de cadena apropiada que solubiliza la cabeza de dominio en un disolvente orgánico. Los ligadores a modo de ejemplo incluyen aquellos que tienen una longitud de cadena alquílica aumentada, unidades de polietilenglicol aumentadas, especies ramificadas con cargas positivas (para neutralizar las cargas de fosfato negativas en la cabeza de dominio), o cantidades aumentadas de hidrofobicidad (por ejemplo, adición de estructuras de anillo de benceno).

Los ejemplos de ligadores disponibles en el mercado incluyen ligadores aminocarboxílicos, tales como aquellos que son péptidos (por ejemplo, Z-Gly-Gly-Gly-Osu (N-alfa-benciloxicarbonil- (glicina)3-N-succinimidil éster) o Z -G ly-Gly-G ly-G ly- Gly-Gly-Osu (N-alfa-benciloxicarbonil-(Glicina)6-N-succinimidil ester, SEQ ID N°: 3)), PEG (por ejemplo, Fmoc- aminoPEG2000-NHS o amino -PEG (12-24) -NHS), o cadenas de ácido alcano (por ejemplo, ácido Boc-s-aminocaproico- Osu); ligadores de pares químicamente correactivos, tales como aquellos pares químicamente correactivos descritos aquí en combinación con una fracción peptídica (por ejemplo, azidohomoalanina-Gly-Gly-Gly-OSu (SEQ ID NO: 4) o propargilglicina-Gly-Gly-Gly-OSu (SeQ ID NO: 5)), PeG (por ejemplo, azido-PEG-NHS) o una fracción de cadena de ácido alcano (por ejemplo, ácido 5-azidopentanoico, (S) -2- (azidometil)-1-Boc- pirrolidina, 4 - azidoanilina o éster de N - hidroxisuccinimida del ácido 4 - azido - butan - 1 - oico); ligadores reactivos con tiol, tales como los que son PEG (por ejemplo, SM (PEG) n NHS-PEG-maleimida), cadenas de alcano (por ejemplo, ácido 3- (piridin-2-ildisulfanil)- propiónico- Osu o sulfosuccinimidil 6-(3’-[2-piridilditio]-propionamido) hexanoato)); y amiditas para la síntesis de oligonucleótidos, tales como modificadores de amino (por ejemplo, 6-(trifluoroacetilamino) -hexil- (2-cianoetil) - (N, N-diisopropil) -fosforamidita), modificadores de tiol (por ejemplo, S-tritil-6-mercaptohexil-1-[(2-cianoetil)-(N, N-diisopropil)] - fosforamidita, o modificadores de pares químicamente correactivos (por ejemplo, 6-hexin-1-il-(2-cianoetil) - (N, N- diisopropil)-fosforamidita, 3-dimetoxitritiloxi-2- (3-(3-propargiloxipropanamido) propanamido) propil-1-O-succinoil, alquilamino de cadena larga CPG o éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-azido-butan-1-oico)). En la técnica se conocen ligadores adicionales, y los que se pueden utilizar durante la síntesis de la biblioteca incluyen, pero no se limitan a, 5’-O-dimetoxitritil-1', 2’-didesoxirribosa- 3’-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita; 9-Odimetoxitritiltietilén glicol, 1 - [(2-cianoetil) - (N, N-diisopropil)] - fosforamidita; 3- (4,4'-dimetoxitritiloxi) propil-1 -[(2-cianoetil)-(N, N-diisopropil)]-fosforamidita; y 18-O-dimetoxitritil

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hexaetilenglicol, 1-[(2-cianoetil)-(N, N-diisopropil)]- fosforamidita. Cualquiera de los ligadores de la presente invención se puede agregar en tándem entre sí en diferentes combinaciones para generar ligadores de diferentes longitudes deseadas.

Los ligadores también pueden ser ramificados, donde los ligadores ramificados son bien conocidos en la técnica y los ejemplos pueden consistir en dobladores simétricos o asimétricos o un trebler simétrico. Véase, por ejemplo, Newcome et al., Dendritic Molecules: Concepts, Synthesis, Perspectives, VCH Publishers (1996); Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7297 - 7301 (1995); y Jansen et al., Science 266: 1226 (1994).

Ejemplo 1

Estrategia general para mejorar la ligación de una sola cadena de las etiquetas de ADN

Se exploraron diversas condiciones de reacción para mejorar la ligación de una sola cadena de etiquetas para formar una biblioteca codificada. Estas condiciones de reacción incluyen utilizar nucleótidos modificados dentro de la etiqueta (por ejemplo, uso de uno o más nucleótidos que tienen un grupo 2’-OMe para formar una etiqueta MNA/ADN, donde “MNA” se refiere a un oligonucleótido que tiene al menos un 2’-O -metilnucleótido); utilizar etiquetas de donantes y etiquetas de aceptación que tienen diferentes longitudes y variar la concentración de las etiquetas; utilizando diferentes tipos de ligasas, así como combinaciones de las mismas (por ejemplo, ssADN ligasa Cir4cLigase™ y/o ARN ligasa T4), y variando su concentración; purificar el complejo eliminando los materiales de partida sin reaccionar; utilizar polietilenglicoles (PEG) que tienen diferentes pesos moleculares y variar su concentración; variando la temperatura y la duración de la reacción, tal como ligación; variando la concentración de diversos agentes, incluyendo ATP, Co(NH3)6Cl3 y pirofosfato inorgánico de levadura; utilizando etiquetas oligonucleotídicas fosforiladas enzimática o químicamente; utilizando etiquetas 3’-protegidas; y utilizando etiquetas 5’- químicamente adeniladas.

Después de un análisis exhaustivo de diferentes condiciones, combinaciones óptimas de parámetros que proporcionaron hasta 90% de eficacia de ligación (por ejemplo, Figura 5C), determinada por la fracción de producto final ligado a reactivo de partida no ligado (“fracción ligada”)), fueron encontrados. En la Figura 5A se muestra un esquema de la reacción de ligación utilizando ligasa, y en la Figura 5B se muestra una electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante típica. El oligonucleótido donante se marcó en el extremo 3’ y se pudo detectar en un gel escaneando a una excitación a 450 nm en un PhosphorImager Storm™ 800. El gel representa un donante no ligado (o material de partida) y el producto ligado. En particular, el donante adenilado puede resolverse y distinguirse del material de partida en este gel.

La Tabla 2 proporciona eficacias de ligación medidas en función de la composición del oligonucleótido (es decir, oligonucleótidos con todos los nucleótidos de ADN frente a oligonucleótidos con al menos un nucleótido 2’-O-metilo, marcado como “MNA”) y el tipo de ligasa (es decir, ARN ligasa frente a ssADN ligasa). Estos experimentos de ligación incluyeron las siguientes etiquetas: un donante todo ADN que tiene la secuencia de 5’-P-GCT GTG CAG GTA GAG TGC- 6-FAM-3’(SEQ ID NO: 6); un donante 5’-MNA-DNA que tiene la secuencia de 5’-P-mGCT GTG CAG GTA GAG TGC-6- FAM-3’ (SEQ ID NO: 7); un donante todo MNA que tiene la secuencia de 5’-P-mGmUmG mCmAmG mGmUmA mGmAmG mUmGmC-6-FAM-3’ (SeQ ID NO: 8); un aceptor de DNA-3’MNA que tiene la secuencia de 5’-HO-TAC GTA TAC GAC TGmG-OH-3’ (SEQ iD NO: 9); un aceptor de todo ADN que tiene la secuencia de 5’-HO-GCA GAC TAC GTA TAC GAC TGG-OH-3’ (SEQ ID NO: 10); y un aceptor todo-MNA que tiene la secuencia de 5’-HO-mUmAmC mGmUmA mUmAmC mGmAmC mUmGmG-OH-3’ (SEQ ID NO: 11), donde “m” indica una base 2’-OMe, “P” indica un nucleótido fosforilado, y “FAM” indica fluoresceína.

Se calcularon las eficacias de ligación a partir de datos de densitometría de gel como la relación entre la intensidad del producto de ligación y la suma de la intensidad del producto de ligación y el material de partida no ligado. Las condiciones de reacción para T4 ARN ligasa incluyen lo siguiente: 5 pM de oligonucleótidos donantes y aceptores (15-18 nucleótidos (nts) de longitud) en una solución tampón que contiene Tris HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, cloruro de hexamina cobalto 1 mM, ATP 1 mM, PEG4600 al 25% y 5 unidades de ARN ligasa T4 (unidades nuevas NEB) a pH 7.5. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 16 horas. Las condiciones de reacción para CircLigase™ incluyeron lo siguiente: 5 pM de oligonucleótidos donantes y aceptores (longitud 15 o 18 nts) incubados en un tampón que contiene 50 mM de MOPs (pH 7.5), 10 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 0.05 mM de ATP, 2.5 mM de MnCl2 y PEG 8000 al 25% (p/v) con 20 unidades de CircLigase™ (Epicentre) a 50 °C durante 16 horas. Las reacciones se resolvieron con urea 8M/PAAG al 15%, seguido de densitometría con excitación a 450 nm.

Tabla 2

Donante: Aceptor ARN ligasa T4 CircLigase™

All-DNA
All-DNA: 9% 89%

All-DNA: All-MNA 14% 68%

All-DNA: DNA-3’MNA 46% 85%

All-MNA: All-DNA 11% 84%

All-MNA
All-MNA: 20% 29%

All-MNA: DNA-3’MNA 32% 73%

5’-MNA-DNA: All-DNA 29% 90%

5’-MNA-DNA: All-MNA 16 % 46%

5’-MNA-DNA: DNA-3’MNA 69% 81%

Generalmente, CircLigase™ produjo rendimientos de ligación más elevados que la ARN ligasa de T4 (Tabla 2). Cuando tanto el donante como el aceptor eran oligonucleótidos híbridos de ADN/MNA, se logró una unión eficaz con la ARN ligasa 5 de T4.

La Figura 5C muestra la ligación de alto rendimiento lograda para ARN ligasa T4 a altas concentraciones de enzima y oligonucleótido. Las condiciones de reacción incluyen: 250 pM cada uno de los oligonucleótidos donantes y aceptores en un tampón que contiene Tris HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, cloruro de hexamina cobalto 1 mM, ATP 2.5 mM, PEG4600 al 30% (p/v), pH 7.5, diferentes cantidades de ARN ligasa de T4 a 40 unidades/pl (unidades nuevas NEB) y 0.1 unidades de 10 pirofosfatasa inorgánica de levadura. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 y 20 horas y se resolvieron con urea 8 M/PAAG al 15%, seguido de densitometría utilizando excitación a 450 nm.

En general, estos datos sugieren que la ligación enzimática puede optimizarse incluyendo uno o más nucleótidos 2’ modificados y/o utilizando una ARN o ADN ligasa. Detalles adicionales para varias otras condiciones probadas, tales como PEG o longitud de la etiqueta, que pueden contribuir a la eficacia del ligado se discuten a continuación.

15 Ejemplo 2

Efecto del PEG en la ligación de cadena sencilla

Para determinar el efecto del peso molecular de PEG (PM) sobre la ligación, se ligaron etiquetas de cadena sencilla con un 25% (p/v) de PEG que tenía un PM de 300 a 20,000 Dalton. Como se muestra en la Figura 6A, se observó un 80% o más de ligadura para PEG que tenía un PM de 3,350, 4,000, 6,000, 8,000 y 20,000. Estos experimentos de ligación 20 incluyeron las siguientes etiquetas: un donante 15mero que tiene la secuencia de 5’-P-mGTG CAG GTA GAG TGC-6- FAM-3’ (SEQ ID NO: 12) y un aceptor 15mero que tiene la secuencia de 5’-HO-mUAC GTA TAC GAC TGmG-OH-3’ (SEQ ID NO: 13). Estas etiquetas de oligonucleótidos eran secuencias de ADN con una o dos bases de ARN 2’O-metil (2’-OMe) terminales (por ejemplo, 2’-OMe-U (mU) o 2’-OMe-G (mG)).

También se llevaron a cabo experimentos para determinar el efecto de la concentración de PEG. Las etiquetas de cadena 25 sencilla se ligaron con diversas concentraciones de PEG que tenían un PM de 4,600 Dalton (PEG4600). Como se muestra en la Figura 6B, se observó una ligación del 70% o mayor, en promedio, para PEG4600 del 25% (p/v) al 35% (p/v).

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Ejemplo 3

Efecto de la longitud de la etiqueta en la ligación de cadena sencilla

Para determinar el efecto de la longitud de la etiqueta sobre la ligación, se construyeron etiquetas de aceptor y donantes de varias longitudes. Para los experimentos de CircLigase™, un donante 15mero que tiene la secuencia 5’-P-mGTG CAG GTA GAG TGC-6-FAM-3’ (SEQ ID NO: 12) se utilizó y emparejado con Oligonucleótidos aceptores de ADN 10, 12, 14, 16, y 18mero. Para los experimentos de ARN ligasa T4, las etiquetas incluyen una o más bases 2’-OMe (designadas como etiquetas MNA/ADN). La Tabla 3 proporciona la secuencia para las tres etiquetas de donantes (15mero, 8mero y 5mero) y las tres etiquetas de aceptor (15mero, 8mero y 5mero).

Tabla 3

Etiqueta de Oligonucleótido: Secuencia

Donante 15mero: 5’-P-mGTG CAG GTA GAG TGC-6-FAM-3’ (SEQ ID NO: 12)

Aceptor 15mero: 5’-HO-mUAC GTA TAC GAC TGmG-OH-3’ (SEQ ID NO: 13)

Donante 8mero: 5’-P-mGT GAG TGC-6-FAM-3’ (SEQ ID NO: 14)

Aceptor 8mero: 5’-HO-C A GAC TGmG-OH-3’ (SEQ ID NO: 15)

Donante 5mero: 5’-P-mGT GAC-6-FAM-3’ (SEQ ID NO: 16)

Aceptor 5mero: 5’-HO-mAC TGmG-OH-3’ (SEQ ID NO: 17)

* "m" indica una base 2’-OMe, "P" indica un nucleótido fosforilado, y "FAM" indica fluoresceína.

El grado de ligación se analizó mediante densitometría de geles electroforéticos (Figuras 7A-7B). Los resultados de las reacciones de CircLigase™ indican una fuerte dependencia del rendimiento de ligación en la longitud del oligonucleótido aceptor (Figura 7A). El mayor rendimiento de ligación se observó con un aceptor de 18 meros (62%), mientras que el rendimiento de ligación con un aceptor de 10 meros fue inferior al 10%. Los resultados de las reacciones de ARN ligasa T4 indican que la combinación de un aceptor 8mero con un donante 8mero proporcionó el rendimiento más alto y que las combinaciones que tienen un donante 15mero con cualquiera de los aceptores probados proporcionaron rendimientos superiores al 75% (Figura 7B). Si una biblioteca incluye etiquetas más cortas (es decir, aproximadamente 10 mero más cortas), entonces la ARN ligasa T4 puede ser preferida para la ligación de la etiqueta. En otros casos, la ligación se puede optimizar adicionalmente utilizando CircLigase™ o una combinación de ARN ligasa T4 y CircLigase™.

Ejemplo 4

Efecto de la purificación en la ligación de cadena sencilla

Para determinar el efecto de la purificación sobre la ligación, se ligaron las etiquetas de cadena sencilla para imitar el proceso de síntesis de la biblioteca. Para estos experimentos, las etiquetas incluyeron etiquetas donantes 15mero y etiquetas aceptoras 15mero, como se proporciona anteriormente en la Tabla 3. La entidad química se unió al extremo 3’ de la biblioteca, donde la entidad química era fluoresceína en este ejemplo para ayudar en la visualización. Como se muestra en la Figura 9 (derecha), las etiquetas sucesivas se ligaron al grupo 5’-Oh del complejo después de la fosforilación por T4 PNK.

Los experimentos también se realizaron purificando el producto ligado (es decir, el complejo) antes de la reacción PNK, donde agentes particulares útiles en la reacción de ligación (por ejemplo, fosfato, cobalto y/o marcas sin reaccionar) pueden inhibir la reacción de fosforilación con PNK o reducir el rendimiento de ligación. Como se muestra en la Figura 9 (izquierda), la purificación del complejo (es decir, la precipitación mínima) antes de la reacción PNK aumentó la ligación

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(ver datos marcados con *, que indica purificación). Las Figuras 8A-8B muestran los espectros de LC-MS para una etiqueta MNA/ADN de 15 mero antes y después de la fosforilación. La presencia o ausencia de DTT no tuvo efecto sobre la fosforilación.

Ejemplo 5

Ligación de pares químicamente correactivos y transcripción inversa de uniones

Los métodos descritos en la presente memoria pueden incluir además técnicas de ligación de pares correactivos químicamente, así como técnicas de ligamiento enzimático. De acuerdo con ello, como un ejemplo de ligación química, un par químicamente correactivo de ejemplo (es decir, un par alquino y uno azido en una reacci6ón de cicloadición) en dos variantes: un par químicamente correactivo corto y un par químicamente correactivo largo, se utilizó.

Materiales

En una primera variante, se usó un par corto químicamente correactivo (Figura 10A). El par incluía (i) un oligonucleótido que tenía la secuencia 5’-GCG TGA ACA TGC ATC TCC CGT ATG CGT ACA GTC CAT T/propargilG/-3’ (“5 extremo3propargilo”, SEQ ID NO: 18) y (ii) un oligonucleótido que tiene la secuencia 5’-/azidoT/ATA GCG CGA TAT aCa CAC TgG CGA GCT TGC GTA CTG-3’ (“3extremo5azido”, SEQ ID NO: 19). Este par de oligonucleótidos fue preparado por TriLink BioTechnologies, Inc. (San Diego, CA). Estos oligonucleótidos se diseñaron para producir un separador corto entre dos oligonucleótidos luego de la ligación, donde el ligador tendría 5 átomos de longitud (contando desde la posición C3’ del oligonucleótido 5extremo3propargilo hasta la posición C5’ del oligonucleótido 3extremo5azido). Además, el oligonucleótido 5’-azido (3extremo5azido) se preparó convirtiendo el grupo yodo en el oligonucleótido 5’-yodo correspondiente en un grupo azido.

En una segunda variante, se usó un par largo correactivo químicamente (Figura 10B). El par incluía (i) un oligonucleótido que tenía la secuencia 5’-GCG TGA ACA TGC ATC TCC CGT ATG CGT ACA GTC CaT TG/separador- azida/3’(“5extremo3azida”, SEQ ID NO: 20) y (ii) un oligonucleótido que tiene la secuencia 5’-/hexinil/TA GCG CGA TAT ACA CAC TGG CGA GCT TGC GTA CtG-3’ (“3extremo5hexinilo”, SEQ ID NO: 21). Este par de oligonucleótidos fue preparado por Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA, San Diego, CA, y Coralville, IA). El oligonucleótido 5extremo3azida se preparó haciendo reaccionar un éster de azidobutirato N-hidroxisuccinimida con un modificador 3’- amino C7 (2-dimetoxitritil oximetil-6-fluorenilmetoxicarbonilamino-hexano-1-succinoil-alquilamino de cadena larga), que se introdujo durante la síntesis de columnas de oligonucleótidos. Este par se diseñó para producir un separador de 24 átomos de longitud entre los oligonucleótidos (contando desde la posición C3’ del oligonucleótido 5extremo3azida hasta la posición C5’ del oligonucleótido 3extremo5hexinilo).

Para la transcripción inversa (como se muestra por el esquema en la Figura 11A), los cebadores y las plantillas incluyeron lo siguiente: un cebador de transcripción inversa que tiene la secuencia de 5’-/Cy5/CAG TAC GCA AGC tCg-3’ (“Cy5s_primer cebador15”, “SEQ ID NO: 22”); una plantilla de control que tiene la secuencia de 5’-GCG TGA ACA TGC ATC TCC CGT ATG CGT ACA GTC CAT TGT ATA GCG CGA TAT ACA CAC TGG CGA GCT TGC GTA CTG-3’(“templ75”, SEQ ID NO: 23); un cebador 5’-PCR que tiene la secuencia de 5’-GCG TGA ACA TGC ATC TCC-3’ (SEQ ID NO: 24); y un cebador 3’-PCR que tiene la secuencia de 5’-CAG TAC GCA AGC TCG CC-3’ (SEQ ID NO: 25), donde estas secuencias se obtuvieron a partir de ADN de IDT. Se utilizó un cebador de ADN marcado con Cy5 para los experimentos para permitir la detección por separado de los productos de transcripción inversa por LC.

Condiciones experimentales

Para las ligaciones del par correactivo químicamente, se incubaron soluciones 1 mM de pares químicamente correactivos, tales como 5extremo3propargyl + 3extremo5azido (corto) o 5extremo3azida + 3extremo5hexinilo (largo), durante 12 horas en presencia de 100 equivalentes de Ligando de TBTA (tris - [(1 -bencil-1 H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina) y 50 equivalentes de CuBr en una mezcla de agua/acetato de dimetilo. Después de la reacción, se añadió un exceso de eDtA, y las mezclas de reacción se desalaron utilizando columnas Zeba Spin Desalting Columns (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) y luego se precipitaron con etanol. Para las reacciones de transcripción inversa, las plantillas se purificaron en un gel de poliacrilamida al 15% que contenía urea 8M.

La cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) se realizó en una Flota Thermo Scientific LCQ utilizando una columna ACE 3 C18-300 (50 x 2.1 mm) y un gradiente de 5 minutos de 5-35% de tampón B utilizando tampón A (1% de hexafluoroisopropanol (hFiP), 0.1% de diisopropiletilamina (DIEA), 10 mM de EDTA en agua) y tampón B (0.075% de

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HFIP, 0.0375% de DIEA, 10 |jM de EDTA, 65% de acetonitrilo/35% de agua). LC se controló a 260 nm y 650 nm. MS se detectó en el modo negativo, y la desconvolución del pico de masa se realizó utilizando el software ProMass.

Las reacciones de transcripción inversa se realizaron utilizando ThermoScript™ RT (Invitrogen Corp.), de acuerdo con el protocolo del fabricante, a 50 °C durante 1-2 horas. Los resultados fueron analizados por LC-MS y por PCR. La PCR se realizó utilizando Platinum® SuperMix y se resolvió en agarosa al 4% E-Gels (ambos de Invitrogen Corp.). Once y dieciocho ciclos de PCR se realizaron con o sin una reacción de RT previa. La plantilla de 75 meros no se transcribió de forma inversa y se usó directamente para la amplificación por PCR.

Resultados y discusión

En ambas ligaciones que forman un separador corto y un separador largo, los rendimientos de la reacción fueron altos, casi cuantitativos, según se analizó mediante LC-MS. En consecuencia, la ligación química proporciona una técnica de alto rendimiento para unir o asociar operativamente una cabeza de dominio a una o más etiquetas de bloques de construcción.

Para una estrategia de ligación química viable para producir bibliotecas codificadas por ADN, el complejo resultante debería ser capaz de someterse a PCR o RT-PCR para aplicaciones de secuenciación adicionales. Si bien la PCR y la RT-PCR pueden no ser un problema con las etiquetas enzimáticamente ligadas, tales como las descritas anteriormente, los ligadores químicos no naturales pueden ser difíciles de procesar mediante ARN o ADN polimerasas. Los datos proporcionados en las Figuras. 11B-11E sugieren que los oligonucleótidos que tienen un separador de longitudes particulares pueden transcribirse y/o transcribirse inversamente.

En el caso de un par ligador químicamente correactivo que da como resultado un oligonucleótido unido a triazol, se observó una dependencia de la longitud del ligador. Para el par corto químicamente correactivo, la plantilla resultante se transcribió de forma inversa y se analizó mediante LC-MS. El análisis de LC reveló tres picos de absorción principales a los 2.79 minutos, 3.47 minutos y 3.62 minutos. para 260 nm, donde los picos a 3.47 min. y 3.62 min. también proporcionó picos de absorción a 650 nm. Análisis de MS del pico a 3.47 min. mostró solo la presencia de la plantilla 23097.3 (calculado 23098.8), y el pico a 3.62 min. contenía una plantilla (23098.0) y un cebador completamente extendido (23670.8, calculado: 23671.6) a una proporción de aproximadamente 1.7: 1, sugiriendo un rendimiento del 50-60% para esta reacción de RT (Figura 11C). Para comparación, la transcripción inversa (RT) del control que tiene una plantilla de todo ADN produjo el cebador extendido (pico 23068.9) en una cantidad aproximadamente equivalente a la plantilla (23078.7), sugiriendo un rendimiento cercano al 100% (Figura 11B).

Para el par químicamente correactivo largo, LC de la reacción RT mostró dos picos de absorción a 2.77 min y 3.43 min para 260 nm, donde el pico a 3.43 min también proporcionó picos de absorción a 650 nm, es decir, contenía un material etiquetado Cy5, que es el producto RT esperado. Análisis de Ms del pico a 3.43 min. reveló la plantilla (observado 23526.6, calculada: 23534.1), así como el cebador Cy5 extendido al ligador (11569.1). No se observó producto de longitud completa por LC-MS, lo que indica que la reacción de RT no se produjo en una cantidad medible (Figura 11D).

Se realizó la RT-PCR con las plantillas descritas anteriormente y reveló que solo el ligador corto producía un producto de transcripción inversa, aunque con una eficacia 5-10 menor (Figura 11E). La eficiencia de la RT se estimó en aproximadamente 2 veces menor que la plantilla (temp175). Por ejemplo, el producto de PCR de la plantilla ligada corta aproximadamente 2 veces más baja después de RT y alrededor de 5-10 veces menor sin RT, en comparación con el producto de PCR de la plantilla 75 de todo ADN (temp175). En consecuencia, estos datos proporcionan apoyo para el uso de ligación química para producir un complejo que puede ser transcrito de manera inversa y/o transcrito, y cabezas de dominio y/o etiquetas químicamente ligadas se pueden utilizar en cualquiera de las etapas de unión descritas en el presente documento para producir bibliotecas codificadas.

Ejemplo 6

Ligación de oligonucleótidos de 3’-fosforotioato con oligonucleótidos de 5’-yodo

Para determinar la flexibilidad de los métodos descritos en este documento, se determinó la eficacia de ligación de oligonucleótidos que tienen otras modificaciones. En particular, los análogos del enlace de fosfodiéster natural (por ejemplo, un análogo de fosforotioato) podrían proporcionar una fracción alternativa para el análisis y la secuenciación de la PCR posterior a la selección.

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Los siguientes oligonucleótidos fueron sintetizados por TriLink BioTechnologies, Inc. (San Diego, CA): (i) 5'-/Cy5/CGA TAT ACA CAC TGG CGA GCT/tiofosfato/-3' (“CCy5”, SEQ ID NO: 26), (ii) 5'-/IododT/GC GTA CTG AGC/6- FAM/-3' (“CFL”, SEQ ID N°: 27), como se muestra en la figura 12A, y (iii) un oligonucleótido de empalme que tiene la secuencia de CAG TAC GCA AGC TCG CC (“spl”, SEQ ID NO: 28). Las reacciones de ligación se realizaron con 100 pM de cada oligonucleótido reactivo en un tampón que contenía Tris HCl 50 mM (pH 7.0), NaCl 100 mM y MgCl2 10 mM (“tampón de ligación”) a temperatura ambiente. Las reacciones de ligación se complementaron con cualquiera de los siguientes: 100 pM del oligonucleótido de empalme, 10 mM de Co (NH3)6Cl3, 40% (p/v) de PEG4000, o 80% (p/v) de PEG300. La reacción se dejó progresar durante hasta 48 horas. Los productos de ligación se analizaron por LC-MS utilizando detección a 260 nm, 495 nm y 650 nm, así como por un gel de urea 8M /gel de poliacrilamida al 15% (PAAG) que se exploró adicionalmente a 450 y 635 nm de excitación en un PhosphorImager Storm™ 800.

En ausencia del oligonucleótido de empalme, no se observó ligación (Figura 12B, carriles etiquetados “-spl”). En presencia del oligonucleótido de empalme se produjo el ligado y alcanzó aproximadamente el 60% de la fracción ligada después de 48 horas (Figuras 12B-12C). LC-MS reveló varios picos en el cromatograma, con un pico a 3.00 min absorbiendo a 260 nm, 495 nm y 650 nm. La MS de este pico mostró principalmente el producto de la ligación a 11539.6 Da (calculado 11540) con menos del 10% de oligonucleótido CCy5 a 7329.8 Da (calculado 7329.1). Se detectaron bajos niveles de ligación en presencia de PEG y hexamina cobalto, donde la hexamina cobalto causó la precipitación del oligonucleótido marcado con Cy5. Estos datos sugieren que las cabezas de dominio y/o etiquetas que tienen grupos fosfato modificados (por ejemplo, enlaces fosfodiéster modificados, tales como enlaces fosforotioato) se pueden utilizar en cualquiera de las etapas de unión descritas aquí para producir bibliotecas codificadas.

Para estudiar más a fondo la reacción de ligación de yodo-fosforotioato, se realizó la ligación de 5'-I dT-oligo-3'-FAM (CFL) y 5'-Cy5-oligo-3'-PS (CCy5) en ausencia y presencia de un empalme bajo diferentes condiciones de reacción.

En un primer conjunto de condiciones, se llevaron a cabo experimentos de ligación con incubación de siete a ocho días. Estos experimentos se realizaron en el mismo tampón de ligación que antes con 50 pM de cada oligonucleótido y se incubaron durante una semana a temperatura ambiente. La figura 12D muestra el análisis de LC-MS de la ligación de CFL y CCy5 en ausencia (arriba) y presencia (parte inferior) de un empalme (control positivo), donde las reacciones de ligación se incubaron durante siete días. Se registraron tres trazas LC para cada reacción a 260 nm (para detectar todos los ácidos nucleicos), a 495 nm (para detectar el oligonucleótido CFL y el producto de ligación), y a 650 nm (para detectar el oligonucleótido CCy5 y el producto de ligación).

En ausencia de el empalme, no se produjo ligación, y solo se detectaron materiales de partida CFL (4339 Da) y CCy5 (7329 Da) (Figura 12D, arriba). Cuando el oligonucleótido de empalme estuvo presente durante siete días, se observó un pico característico en el canal de 495 nm con un tiempo de retención de 2.98 min, que corresponde al producto ligado (11542 Da) (Figura 12D, parte inferior). Este pico se solapó con el del oligonucleótido CCy5 observado en el canal de 650 nm y, por lo tanto, era indistinguible de CCy5 a 650 nm.

La Figura 12E muestra el análisis de LC-MS de CFL y CCy5 en ausencia de un empalme, en la que las reacciones de ligación se incubaron durante ocho días a 400 mM de cada oligonucleótido. No se detectó ningún producto de ligación. El pico 1 (a 495 nm) contenía material de partida de CFL (4339 Da), así como trazas de la pérdida de producto de yodo (4211 Da) y un producto de degradación desconocido (4271 Da, posiblemente desplazamiento de etil mercaptano). El pico 2 (a 650 nm) contenía material de partida de CCy5 (7329 Da) y oligonucleótido de CCy5 oxidado (7317 Da). El pico 3 (a 650 nm) contenía CCy5 dimerizado (14663 Da).

En un segundo conjunto de condiciones, las reacciones de desplazamiento de yodo se realizaron en presencia de piperidina y a un pH superior a 7.0. La Figura 12F muestra el análisis de MS para una reacción de oligonucleótido de CFL con piperidina, donde esta reacción pretendía desplazar el yodo terminal presente en CFL. Una condición de reacción incluía oligonucleótidos a 100 pM, piperidina a 40 mM (400 equivalentes) en tampón de borato 100 mM, pH 9.5, durante 20 horas a temperatura ambiente (los datos se muestran en el panel izquierdo de la Figura 12F); y otra condición de reacción incluía oligonucleótidos a 400 pM, piperidina a 2 M (4.000 equivalentes) en tampón de borato 200 mM, pH 9.5, durante 2 horas a 65°C (los datos se muestran en el panel derecho de la Figura 12F).

En la condición de reacción que incluye 40 mM de piperidina (Figura 12F, izquierda), no se observó desplazamiento de piperidina, y se detectó una pequeña cantidad de producto de hidrólisis (4229 Da). Además, se observaron trazas de pérdida de yodo (4211 Da) y producto de degradación desconocido (4271 Da). En la condición de reacción que incluía 2 M de piperidina (Figura 12F, derecha), se observó desplazamiento de piperidina de yodo (4296 Da), y la cantidad de material de partida se redujo sustancialmente (4339 Da). Además, también se observaron picos correspondientes a la hidrólisis de yodo (por desplazamiento de OH) o impureza (4229 Da) y pérdida de yodo (4214 Da). Estos datos muestran

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que la presencia de una amina (por ejemplo, como parte de la síntesis de la biblioteca química) no afectará negativamente a la porción de oligonucleótido de los miembros de la biblioteca y/o interferirá con esta estrategia de ligación.

En un tercer conjunto de condiciones, las reacciones de ligación de empalmes se llevaron a cabo en presencia de piperidina y a un pH superior a 7.0. La Figura 12G muestra una reacción de ligación de empalmes de CFL y oligonucleótidos de CCy5 a 50 pM realizada en presencia de 400 equivalentes de piperidina en tampón de borato 100 mM, pH 9.5, durante 20 horas a temperatura ambiente. El pico característico detectado en la traza LC (a 495 nm) contenía predominantemente el producto de la ligación a 11541.3 Da (calculado 11540 Da). En base a estos resultados, se puede concluir que la piperidina no altera la ligación enzimática y que la presencia de otras aminas (por ejemplo, como parte de la síntesis de la biblioteca química) probablemente no interfiera con esta estrategia de ligación.

Tomando en conjunto, estos datos indican que esta estrategia de ligación puede realizarse bajo diversas condiciones de reacción que son adecuadas para una amplia gama de transformaciones químicas, que incluyen tiempos de incubación prolongados, condiciones de pH elevadas y/o presencia de una o más aminas. Por lo tanto, los presentes métodos pueden ser útiles para desarrollar miembros de la biblioteca con diversas condiciones de reacción y excluir la necesidad de intercambio de tampón, tal como precipitación u otros métodos intensivos en recursos.

Ejemplo 7

Reorganización de barajado con nucleótidos modificados

Durante la ligación enzimática de cadena sencilla con ARN ligasa T4, puede ocurrir una reorganización de nucleótido terminal de extensión baja a moderada. La reorganización puede dar como resultado la inclusión o escisión de un nucleótido, donde el producto o complejo final incluye o excluye un nucleótido en comparación con la secuencia ligada esperada (es decir, una secuencia que tiene la secuencia completa tanto para el oligonucleótido aceptor como el donante).

Aunque se pueden tolerar bajos niveles de reorganización, la reorganización se puede minimizar incluyendo un grupo fosfato modificado. En particular, el grupo fosfato modificado es un enlace fosforotioato entre el nucleótido terminal en el extremo 3’ de un oligonucleótido aceptor y el nucleótido adyacente al nucleótido terminal. Al utilizar un enlace fosforotioato de este tipo, la reorganización se redujo en gran medida. Solamente se detectó reorganización residual mediante espectrometría de masas, donde probablemente se produjo una reorganización debido a la conversión incompleta del enlace fosfodiéster nativo en el enlace fosforotioato o a bajos niveles de oxidación del enlace fosforotioato seguido por la conversión en el enlace fosfodiéster nativo. Tomando juntos estos datos y los datos de ligación en el Ejemplo 6, uno o más grupos fosfato modificados (por ejemplo, un fosforotioato o un enlace 5’-N-fosforamidita) podrían incluirse en cualquier secuencia de oligonucleótidos descrita en este documento (por ejemplo, entre el nucleótido terminal en el extremo 3’ de una cabeza de dominio, un complejo, una etiqueta de bloque de construcción, o cualquier etiqueta descrita en este documento, y el nucleótido adyacente al nucleótido terminal) para minimizar la reorganización durante la ligación de cadena sencilla.

Se fosforiló una cabeza de dominio de una sola hebra (ssHP, 3636 Da) en el extremo 5’ y se modificó con un ligador de hexilamina en el extremo 3’ para proporcionar la secuencia de 5’-P-mcGAGTCACGTC/Aminohex/-3’ (SEQ ID NO: 29). La cabeza de dominio se ligó a una etiqueta (etiqueta 15, XTAGSS000015, 2469 Da) que tiene la secuencia de 5’- mCAGTGTCmA-3’ (SEQ ID NO: 30), donde mC y mA indican nucleótidos 2’-O metilo. El análisis LC-MS (Figura 13A) reveló que el pico del producto de ligación contenía hasta tres especies, que estaba parcialmente separada por LC y tenía los siguientes pesos moleculares: 6089 Da (esperado), 5769 Da (-320 Da del esperado) y 6409 Da (+320 Da de lo esperado). Esta diferencia de masa de 320 Da corresponde exactamente a la eliminación o a la adición de un nucleótido O-Me C adicional (“reorganización de nucleótidos terminal”).

Los experimentos con otros nucleótidos O-Me terminales, así como con los nucleótidos terminales 2’-fluoro, confirmaron que la reorganización se produce probablemente por escisión del nucleótido 5’-terminal del oligonucleótido donante, probablemente después de la adenilación de este último. El mecanismo de este evento es desconocido. Sin estar limitado por el mecanismo, la Figura 13B ilustra un posible esquema para la reorganización de nucleótidos durante la reacción de ARN ligasa T4 entre una cabeza de dominio y una etiqueta, donde un experto en la técnica entendería que esta reacción podría ocurrir entre cualquier donante y oligonucleótidos aceptores (por ejemplo, entre dos etiquetas, donde una etiqueta es el oligonucleótido donante y la otra etiqueta es el oligonucleótido aceptor).

Generalmente, la mayoría de la reacción de ligación con ARN ligasa T4 (T4Rnl1) proporciona el producto de ligación esperado (normal) que tiene la secuencia combinada de los oligonucleótidos donante y aceptor (Figura 13B-1, reacción a la izquierda). Una pequeña minoría de la reacción proporciona productos de ligación aberrantes (Figura 13B-1, reacción a

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la derecha), donde estos productos aberrantes incluyen aquellos que tienen la eliminación o adición de un nucleótido terminal (“Producto-1 nt” y “Producto + 1 nt, “, respectivamente, en la Figura 13B-2).

Sin estar limitado por el mecanismo, puede producirse la escisión del oligonucleótido donante (“cabeza de dominio” o “HP” en la figura 13B-1) al reaccionar con el grupo 3’-OH del aceptor (“etiqueta”), proporcionando de ese modo un donante fosforilado en 5’ que carece de un nucleótido (“HP-1 nt”) y un nucleótido adenilado con un grupo 3’-OH accesible (“1 nt”). La figura 13B-2 muestra dos esquemas de ejemplo para la reacción entre la cabeza de dominio (HP), la etiqueta, HP-1 nt y 1 nt. Para proporcionar un producto con un nucleótido terminal extirpado (Figura 13B-2, izquierda), el donante 5’- fosforilado que carece de un nucleótido (HP-1 nt) actúa como sustrato para el evento de ligación. Esta cabeza de dominio HP-1 nt es readenilada mediante ARN ligasa T4 (para proporcionar “HP-1 nt adenilado” en la Figura 13B-2) y ligado a la etiqueta, lo que da como resultado un producto de ligación menos un nucleótido (“Producto-1 nt“). Para proporcionar un producto con un nucleótido terminal adicional (Figura 13B-2, izquierda), el nucleótido adenilado (1 nt) probablemente sirve como un sustrato para la ligación a la etiqueta, produciendo así un oligonucleótido que tiene un nucleótido más largo que el aceptor (“Etiqueta +1 nt“). Este oligonucleótido Tag + 1 nt probablemente sirve como un aceptor para la cabeza de dominio no alterado, donde esta reacción proporciona un producto de ligación que tiene un nucleótido adicional (“Producto + 1 nt”). Se realizaron análisis de LC-MS de “Producto”, “Producto-1 nt” y “Producto + 1 nt” (Figura 13B-3). Cuando una etiqueta aberrante y una cabeza de dominio aberrante (es decir, Tag + 1 nt y HP-1 nt, respectivamente) se recombinan, entonces el producto de ligación resultante es indistinguible del producto esperado.

Para estudiar adicionalmente el mecanismo de nueva reorganización de nucleótidos terminales, se preparó una cabeza de dominio (HP-PS) que tenía la secuencia de 5’P-mC * GAGTCACGTC/Aminohex/-3’ (SEQ ID nO: 31). la cabeza de dominio HP-PS tiene la misma secuencia que ssHP pero contiene una modificación, es decir, el primer enlace fosfodiéster entre el nucleótido 5’-terminal mC y el siguiente G fue sintetizado como un enlace fosforotioato (un oxígeno de fosfato no puente fue sustituido por un azufre). El análisis de LC-MS de la ligación de HP-PS a la etiqueta 15 reveló que la reorganización se inhibía casi por completo (Figura 13C). Las trazas de +/- 320 picos probablemente corresponden a la conversión oxidativa del enlace fosforotioato en enlaces fosfodiéster nativos o sulfuración incompleta.

Ejemplo 8

Cromatografía de exclusión por tamaño de miembros de la biblioteca

Las bibliotecas de entidades químicas que se generan utilizando oligonucleótidos cortos de cadena sencilla como elementos de codificación son muy adecuadas para el enriquecimiento de aglutinantes mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). SEC es una técnica cromatográfica que separa las moléculas en función del tamaño, donde las moléculas más grandes que tienen mayor peso molecular fluyen a través de la columna más rápido que las moléculas más pequeñas que tienen un peso molecular más bajo.

Los complejos de las proteínas y los miembros de la biblioteca ssADN se pueden separar fácilmente de miembros de la biblioteca sin unir utilizando SEC. La Figura 14 es una traza ultravioleta de un experimento SEC en el que se mezcló una molécula pequeña unida covalentemente a ADNss corto (un intervalo de oligonucleótidos con longitudes definidas en el intervalo de 20-50 mero) con un objetivo de proteína que se sabe que se une a la molécula pequeña. Los picos que eluyen primero de la columna, en el intervalo de tiempo de 11-13 minutos, representan miembros de la biblioteca asociados a un objetivo. Los picos posteriores, que eluyen de 14 a 17 minutos, representan miembros de la biblioteca no unidos. La proporción de proteína objetivo a molécula de biblioteca fue de 2: 1, por lo que aproximadamente el 50% de las moléculas de la biblioteca deberían asociarse con la proteína en la fracción de elución temprana, como se observa en la Figura 14. Las bibliotecas con regiones de codificación de oligonucleótidos de cadena doble más grandes no pueden seleccionarse utilizando este método ya que los miembros de la biblioteca no enlazados migran conjuntamente con los miembros de la biblioteca enlazados en SEC. Por lo tanto, las bibliotecas de moléculas pequeñas unidas a oligonucleótidos de cadena sencilla codificantes en el rango de 20-50 metros de longitud permiten el uso de una poderosa técnica de separación que tiene el potencial de aumentar significativamente la relación señal a ruido requerida para la selección efectiva de aglutinantes de molécula pequeña a uno o más objetivos, por ejemplo, nuevas dianas de proteínas que son opcionalmente no marcadas y/o proteínas de tipo silvestre. En particular, estos enfoques permiten identificar entidades químicas de unión a objetivos en bibliotecas codificadas generadas combinatoriamente sin la necesidad de etiquetar o inmovilizar el objetivo (por ejemplo, un objetivo de proteína).

Ejemplo 9

Codificación con etiquetas de ADN ligadas químicamente utilizando la misma química para cada etapa de ligación

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Las etiquetas de ADN codificante pueden ligarse enzimática o químicamente. En la Figura 15A se ilustra un enfoque general para el ligado de la etiqueta de ADN químico. Cada etiqueta lleva grupos reactivos cocomplementarios en sus extremos 5' y 3'. Con el fin de evitar la polimerización o ciclación de las etiquetas, (i) protección de uno o ambos grupos reactivos (Figura 15A), por ejemplo, en el caso de alquinos 3' protegidos con TIPS, o (ii) química de ligamiento dependiente del empalme (Figura 15B), por ejemplo, en el caso de la unión 5'-yodo/3'-fosforotioato, se usa. Para (i), las etiquetas sin ligar se pueden eliminar o cerrar después de cada ciclo de biblioteca para evitar el etiquetado errado o la polimerización de la etiqueta desprotegida. Esta etapa puede ser opcional para (ii), pero aún puede incluirse. Las reacciones de extensión del cebador, utilizando enzimas polimerasas que son capaces de leer a través de uniones químicamente ligadas, también pueden realizarse para demostrar que las etiquetas ligadas son legibles y, por lo tanto, la información codificada es recuperable mediante amplificación y secuenciación postselección (Figura 15C).

En la Figura 16A se muestra una estrategia de etiquetado de biblioteca que implementa la ligación de las etiquetas utilizando “química clic” (cicloadición de azida/alquino catalizada por Cu (I)). La implementación de esta estrategia depende de la capacidad de ligamiento sucesivo preciso de las etiquetas, evitando error de etiquetado y polimerizaciones de etiqueta, así como la capacidad de copiar el ADN químicamente ligado en ADN natural amplificable (ADNc) para la amplificación y secuenciación postselección (Figura 16C).

Para lograr el ligado con etiqueta precisa, se usaron nucleótidos 3' propargil protegidos con triisopropilsililo (TIPS) (sintetizados a partir del propargilo U en forma de una matriz de CPG utilizada para la síntesis de oligonucleótidos) (Figura 16B). El grupo protector TIPs se puede eliminar específicamente mediante tratamiento con fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF) en DmF a 60 °C durante 1-4 horas. Como resultado, la ligación durante la síntesis de la biblioteca incluye un nucleótido 5'-azido/3'-TIPS-propargilo (etiqueta A) que reacciona con el 3'-propargilo de la cabeza de dominio a través de una reacción clic. Después de la purificación, el ciclo anterior se trata con TBAF para eliminar TIPS y generar el alquino reactivo que a su vez reacciona con la siguiente etiqueta de ciclo. El procedimiento se repite para tantos ciclos como sea necesario para producir 2, 3 o 4 o más etiquetas de codificación instaladas sucesivamente (Figura 16A).

Materiales y métodos

Oligos: Los siguientes oligos fueron sintetizados por Trilink Biotechnologies, San Diego CA: ss-HP-alquino: 5'-NH2-TCG AAT GAC TCC GAT AT (3'-Propargilo G) -3' (SEQ ID NO: 32); ss-azido-TP: 5'-azido dT ATA GCG CGA TAT ACA CAC TGG CGA GCT TGC GTA CTG-3' (SEQ ID NO: 33); y B-azido: 5'azido dT ACA CAC TGG CGA GCT TGC GTA CTG-3' (SEQ ID NO: 34).

ClickTag-TIPS: 5'-azido dT AT GCG TAC AGT CC (propargilo U-TIPS) -3' (SEQ ID NO: 35) y 5'Dimetoxitritil 2'-succinil 3'- O-(triisopropil sililo) Propargyl uridina cpg fue sintetizado por Prime Organics, Woburn MA.

Los siguientes oligos se sintetizaron por tecnologías de IDT DNA Technologies, Coralville, IA: Cebador FAM-clic: (5'-6- FAM) CAG TAC GCA AGC TCG CC-3' (SEQ ID NO: 36) y el cebador Cy5-clic: (5'-Cy5) CAG TAC GCA AGC TCG CC-3' (SEQ ID NO: 37).

DNA55-control:/5'Biotin-TEG// ispC3 // ispC3/-TCGAATGACTCCGATATGT ATA GCG CGA TAT ACA CAC TGG CGA GCT TGC GTA CTG-3' (SEQ ID NO: 38).

rDNA55-control:/5Bio-TEG // ispC3 // ispC3/-TCGAATGACTCCGATAT (riboG) T ATA GCG CGA TAT ACA CAC TGG CGA GCT TGC GTA CTG-3' (SEC ID N°: 39)

Síntesis de las plantillas: en los ejemplos siguientes, la frase “etiquetas químicamente ligadas”, o secuencias de control relacionadas con ellas, se denominan “plantillas” porque la etapa siguiente (“lectura”) las utiliza como plantillas para la plantilla polimerización dependiente de plantilla.

Ligación de etiqueta: a una solución de 1 equivalente (1 mM) de ssHP-alquino y 1 equivalente (1 mM) de ss-azidoTP en tampón de fosfato 500 mM pH 7.0, se añadió una solución de 2 eq premezclados de acetato de Cu (II) (hasta una concentración final de 2 mM), 4 eq de ascorbato de sodio (hasta una concentración final de 4 mM), 1 eq de tBtA (hasta una concentración final de 1 mM) en DMF/agua. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante la noche. Después de la confirmación de LC-MS de la finalización de la reacción, la reacción se precipitó utilizando sal/etanol.

Las plantillas Y55 y Y185 de “clic sencillo” se sintetizaron mediante la reacción de ss-HP-alquino con ss-azido-TP y B- azido, respectivamente. Se sintetizaron plantillas de clic doble y triple (YDC y YTC) mediante ligadura de clic de ss- HPalkino con ClickTag-TIPS, seguido de la desprotección de TIPS utilizando TBAF (fluoruro de tetrabutilamonio) en DMF

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a 60 °C durante una hora, seguido de ligación de clic con ss-azido TP. Para la plantilla de triple clic (YTC), la ligación y desprotección de ClickTag-TIPS se repitió dos veces.

Las plantillas se hicieron reaccionar con biotina- (EG)4-NHS y se desalinizaron (Figura 17A). Los productos finales se purificaron por RP HPLC y/o en un gel de poliacrilamida al 15-20%/urea 8 M y se analizaron mediante LC-MS.

Enzimas: Las siguientes ADN polimerasas con sus tampones de reacción se compraron de New England Biolabs: fragmento de Klenow de E. coli ADN polimerasa I, fragmento de Klenow (exo-), E. coli ADN polimerasa I, Therminator™, 9° N™, Superscript III™.

Se adquirieron Dynabeads® M280 magnéticos de estreptavidina de Invitrogen.

Evaluación de polimerización dependiente de plantilla: cada plantilla (5 pM) se incubó con 1 equivalente de cebador Clic de Cy5 o FAM en 40 a 50 pl del tampón de reacción 1x correspondiente y cada enzima, utilizando condiciones de reacción de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Durante 1 hora. Ciertas reacciones (tales como transcripciones SSII o SSIII) se suplementaron adicionalmente con 1 mM de MnCl2. El producto de la reacción se cargó en 125 ml de glóbulos SA lavadas previamente durante 30 minutos con agitación. Los glóbulos se recogieron luego, y el flujo se descartó. Los glóbulos se lavaron con 1 ml de solución salina tamponada con Tris (pH 7.0) y se eluyeron con 35 pl de NaOH 100 mM. El eluyente se neutralizó inmediatamente añadiendo 10 pl de Tris HCl 1 M, pH 7.0. Los productos se analizaron utilizando LC-MS.

Resultados y discusión

Preparación de plantilla: cada plantilla, Y55, Y185 (Figuras 17B y 17C), YDC y YTC (Figura 19) se sintetizaron y se purificaron hasta una pureza superior al 85% (siendo la impureza principal la plantilla no biotinilada). LC-MS reveló los siguientes PM para las plantillas: Y55 17.624 (calculado 17.619) Da; YDC 22,228 (calculado 22,228) Da; y YTC 26,832 (calculado 26,837) Da.

Las plantillas de solo clic Y55 y Y185 (Figuras 17B y 17C) se sintetizaron a partir de oligonucleótidos que tienen solo una funcionalidad química de clic (alquino o azida). La eficacia de la reacción de clic (ligación química) fue superior al 90% en una reacción de una noche utilizando catalizador de Cu (I) generado in situ.

Las plantillas YDC y YTC (Figuras 19A-19D) sirven para demostrar ligaciones químicas sucesivas. Tanto YDC como YTC usan etiquetas individuales que contienen simultáneamente funcionalidades alquino tanto azido como TIPS-protegidas. La plantilla YTC demuestra tres ciclos sucesivos de etiquetado que se pueden utilizar para codificar tres pasos de la generación de la biblioteca química.

Todas las plantillas anteriores se probaron para la extensión del cebador a través y más allá de los enlaces de ligadura por clic para demostrar que las etiquetas ligadas son legibles y, por lo tanto, esa información codificada es recuperable.

Polimerización dependiente de la plantilla que usa la plantilla Y55 de “un solo clic”: se probó un conjunto grande de polimerasas para leer a través de un enlace de clic de triazol (Figura 18A). Los experimentos iniciales se realizaron utilizando cebador Cy5-clic. En experimentos posteriores se usó cebador FAM-clic. El fluoróforo no tuvo efecto sobre la copia de la plantilla, es decir, los resultados fueron equivalentes utilizando cualquier cebador. Como plantilla de control, se usaron control de DNA55 y control rDNA55 (para probar el efecto de un único ribonucleótido en la plantilla, ya que el propargil-G utilizado para una ligación por clic es un derivado de ribonucleótido).

Los productos de longitud completa esperados en las tres plantillas tienen el mismo peso molecular, que es 17446 (cebador FAM) (figura 18B) o 17443 (cebador Cy5). También se observó una pequeña cantidad del producto que corresponde a la extensión del cebador hasta, pero que se detiene en, el enlace de ligación de clic (11880 Da) para algunas polimerasas.

Se descubrió un conjunto de polimerasas que pueden producir un grado sustancial de lectura a través del enlace de clic (producción de ADNc de longitud completa) y se tabulan a continuación.

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Rendimientos de ADNc de longitud completa sobre 50%

fragmento Klenow de AND polimerasa I de E. coli fragmento Klenow (exo-)

AND polimerasa I de E. coli Therminator™

9°N™

Superscript III™ suplementado con 1 mM de MnCl2

Los rendimientos más altos (más del 80% de lectura en una unión de un solo clic) se lograron cuando se usó el fragmento Klenow con incubación a 37 °C (Figura 18B). Se observó un rendimiento algo menor utilizando ADN polimerasa I de E. coli. Se obtuvieron rendimientos del 50% con polimerasas Therminator™ y 9°N™, así como con el fragmento de Klenow exo-.

La transcriptasa inversa Superscript III™ produjo aproximadamente 50% de rendimiento de ADNc cuando el tampón se complementó con 1 mM de MnCl2. Sin embargo, el manganeso provocó la incorporación errónea de nucleótidos que se observó por MS, es decir, se redujo la fidelidad de la polimerización.

Polimerización dependiente de la plantilla utilizando la plantilla Y185 de un solo clic: La plantilla Y185 presenta el mismo sitio de unión de cebador que todas las plantillas usadas en este ejemplo, excepto que, debido a una cola B-azido diferente, la distancia entre el último nucleótido del sitio de unión del cebador al enlace de clic es de 8 nucleótidos, en comparación con 20 nucleótidos en Y55 y todas las demás plantillas. La plantilla se usó para probar si la transcripción de un enlace de clic todavía era posible cuando la enzima estaba en conformación de elongación temprana de iniciación. Klenow fue capaz de copiar la plantilla Y185 con una eficiencia similar a Y55, abriendo la posibilidad de reducir la longitud de las etiquetas de codificación ligadas por clic (Figura 18C).

Polimerización dependiente de plantilla utilizando plantillas dobles y triples ligadas por clic YDC y YTC: Después de establecer que el fragmento Klenow era la enzima más eficiente para leer a través de los enlaces de ligación clic bajo la condición de ensayo empleada, cADN utilizando plantillas YDC y YTC (Figuras 20A-20C) también se generó. Las reacciones de extensión de cebador con plantillas yDc y YTC produjeron productos de longitud completa. Otros productos observados, que componían alrededor del 10-15% de la salida de reacción total, correspondían a un cebador parcialmente extendido, estancado en cada unión de clic, tal como, por ejemplo, 11880 Da y 16236 Da. Los rendimientos se midieron mediante análisis LC-MS en presencia del estándar interno y fueron de aproximadamente 80-90% por unión (es decir, alrededor del 85% para 1 clic, 55% para 2-clic y 50% para 3-clic de plantillas, ver la Figura 21).

El producto de la transcripción YDC carecía de 1 nucleótido dA (calculado 22110, observado 27197 Da; -313 dA Figura 20B) y el producto de la transcripción YTC carecía de 2 nucleótidos dA (calculado 26773, observado 26147; -626 2xdA) (Figura 20C). Esto se correlaciona con el número de nucleótidos U de propargilo en la plantilla6. Sin desear estar limitado por el mecanismo, se puede formular la hipótesis de que Klenow omitió esas U en el contexto de la unión T-triazol-U. Por el contrario, el nucleótido de propargilo G en la primera unión de clic se copió correctamente.

Ejemplo 10

Uso de etiquetas 3’-fosforotioato/5’-yodo para ligar químicamente una sucesión de etiquetas de ADN codificadoras que codifican una biblioteca química instalada covalentemente sobre el extremo 5’

Protección de 3’-fosforotioato en la etiqueta: Como se muestra en la Figura 24A, una etiqueta de 5’-yodo-3’-fosforotioato (1 eq.) Se disolvió en agua para dar una concentración final de 5 mM. Posteriormente, se añadió vinil metilsulfona (20 eq.)

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Y la reacción se incubó a temperatura ambiente durante la noche. Una vez completada la reacción, el producto se precipitó con etanol.

Síntesis de la biblioteca (Figura 24B)

Ciclo A: A cada pozo en la división se añadió cabeza de dominio de ADN de cadena sencilla (1 eq., Solución 1 mM en tampón de borato 500 mM pH 9.5), una etiqueta protegida ciclo A (1.5 eq.), y empalme (1.2 eq.). La ligación química se incubó a temperatura ambiente durante la noche. A cada pozo (en la división) se añadió entonces un aminoácido Fmoc (100 eq.), seguido de cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (100 eq.). La reacción química se incubó a temperatura ambiente durante la noche. Al finalizar, todos los pozos se combinaron y los productos se precipitaron utilizando etanol. El conjunto del ciclo A se purificó utilizando LC y se liofilizó a sequedad, y luego se disolvió en agua para dar una concentración final de 1 mM y se añadió piperidina (10% v/v) para realizar la desprotección de la etiqueta de ciclo A (60 °C, 2h) El producto desprotegido se precipitó de nuevo utilizando etanol.

Ciclo B: El conjunto del ciclo A desprotegido se disolvió en 500 mM, pH 9.5, tampón de borato para dar una concentración de 1 mM y luego se dividió en pozos de reacción separados (1 eq. del producto del ciclo A en cada pozo). A cada pozo se añadió una etiqueta protegida de ciclo B (1.5 eq.) y empalme (1.2 eq.). La ligación química se incubó a temperatura ambiente durante la noche. A cada pozo (en la división) se añadió una mezcla de un ácido formílico (100 eq.), Diisopropil carbodiimida (100 eq.) y 1-hidroxi-7-aza-benzotriazol (100 eq.). La reacción química se incubó a temperatura ambiente durante la noche. Al finalizar, todos los pozos se agruparon y los productos se precipitaron utilizando etanol. El conjunto del ciclo B se purificó utilizando LC y se liofilizó a sequedad, y luego se disolvió en agua para dar una concentración final de 1 mM y se añadió piperidina (10% v/v) para realizar la desprotección de la etiqueta del ciclo B (60 °C, 2 h). El producto desprotegido se precipitó de nuevo utilizando etanol.

Ciclo C: El conjunto del ciclo B desprotegido se disolvió en tampón fosfato 500 mM pH 5.5 para dar una concentración 1 mM y luego se dividió en pozos de reacción separados (1 eq. de producto del ciclo B en cada pozo). A cada pozo se añadió una etiqueta ciclo C (1.5 eq.) y un empalme (1.2 eq.). La ligación química se incubó a temperatura ambiente durante la noche. A cada pozo (en la división) se añadió una amina (80 eq.) y cianoborohidruro de sodio (80 eq.). La reacción química se incubó a 60 °C durante 16 h. Al finalizar, todos los pozos se agruparon y los productos se precipitaron utilizando etanol. El conjunto del ciclo C se purificó utilizando LC y se liofilizó a sequedad.

Ejemplo 11

Codificación con etiquetas de ADN ligadas químicamente utilizando un par de químicas ortogonales para cada etapa de ligación de etiqueta sucesiva

Otro enfoque para la generación de etiquetas de ADN que codifican químicamente es el uso de un par de químicas ortogonales para ligaciones sucesivas (Figura 22A). Las etiquetas que llevan grupos reactivos ortogonales en sus extremos no etiquetarán polimerizarán o ciclarán, y la naturaleza ortogonal de las sucesivas etapas de ligación reducirá la frecuencia de mal etiquetado. Dichos enfoques requieren (i) tener al menos dos químicas ortogonales disponibles para la conjugación de oligonucleótidos, y (ii) una estrategia de lectura directa disponible para cada una de las uniones así creadas (Figuras 22B y 22C). Este enfoque también puede obviar la necesidad del uso de grupos de protección o etapas de limitación, simplificando de este modo el proceso de ligación de etiqueta.

Estrategia de ligación química ortogonal que utiliza ligación 5’-Azido/3’-alquinilo y 5’-yodo/3’-fosforotioato para etapas sucesivas: Un ejemplo del uso de dos ligaciones de etiqueta de químicas ortogonal es la combinación de ligaciones de 5’- azido/3’-alquinil y 5’-yodo/3’-fosforotioato. La Figura 23 muestra un esquema de ejemplo de la síntesis de una estrategia de etiquetado de ligación química ortogonal de 3 ciclos utilizando estas químicas de ligación sucesivas. Las Figuras 25A- 25B muestran un ejemplo del uso de etiquetas de 3’-fosforotioato/5’-azido y 3’-propargilo/5’-yodo para ligar químicamente una sucesión de etiquetas de ADN codificadoras ortogonales que codifican una biblioteca química covalentemente instalada sobre el extremo 5’.

Protección de 3’-fosforotioato en etiquetas: Como se muestra en la Figura 25A, se disolvió una etiqueta de 5’-azido-3’- fosforotioato (1 eq.) en agua para dar una concentración final de 5 mM. Posteriormente, se añadió vinil metilsulfona (20 eq.) y la reacción se incubó a temperatura ambiente durante la noche. Una vez completada la reacción, el producto se precipitó con etanol.

Síntesis de la biblioteca (Figura 25B)

Ciclo A: A cada pozo de la división se añadió cabeza de dominio de ADN de cadena sencilla (1 eq., solución 1 mM en tampón borato 500 mM pH 9.5), una etiqueta ciclo A (1.5 eq.) y empalme (1.2 eq.). La ligación química se incubó a temperatura ambiente durante la noche. A cada pozo (en la división) se añadió entonces un aminoácido Fmoc (100 eq.), seguido de cloruro de 4- (4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (100 eq.). La reacción química se incubó a 5 temperatura ambiente durante la noche. Al finalizar, todos los pozos se combinaron y los productos se agruparon utilizando etanol. El conjunto del ciclo A se purificó utilizando LC 6y se liofilizó a sequedad. La desprotección de Fmoc se realizó en el grupo del ciclo A tratando el conjunto (1 mM en agua) con piperidina (10% v/v) durante 2 h a temperatura ambiente. El producto desprotegido se precipitó de nuevo utilizando etanol.

Ciclo B: El conjunto del ciclo A purificado se disolvió en tampón de fosfato 500 mM, pH 7.0 para dar una concentración de 10 1 mM y luego se dividió en pozos de reacción separados (1 eq. de producto de ciclo A en cada pozo). A cada pozo se

añadió una etiqueta protegida de ciclo B (1.2 eq.), acetato de cobre (II) (2 eq.), ascorbato de sodio (4 eq.) y tris- (benciltriazolilmetil) amina (1 eq.). La ligación química se incubó a temperatura ambiente durante la noche. Al finalizar, los productos se precipitaron (en la división) utilizando etanol y luego se diluyeron hasta una concentración de 1 mM utilizando tampón de borato 500 mM, pH 9.5. A cada pozo (en la división) se añadió luego una mezcla de un ácido formílico (100 15 eq.), diisopropil carbodiimida (100 eq.) y 1-hidroxi 7-aza-benzotriazol (100 eq.). La reacción química se incubó a

temperatura ambiente durante la noche. Al finalizar, todos los pozos se agruparon y los productos se precipitaron utilizando etanol. El conjunto del ciclo B se disolvió entonces en agua para dar una concentración final de 1 mM, y se añadió piperidina (10% v/v) para realizar la desprotección de la etiqueta del ciclo B (temperatura ambiente, 18 h). El producto desprotegido se precipitó de nuevo utilizando etanol. El conjunto del Ciclo B desprotegido se purificó utilizando LC y se liofilizó a 20 sequedad.

Ciclo C: El conjunto del ciclo B purificado se disolvió en tampón de fosfato 500 mM, pH 5.5 para dar una concentración de 1 mM y luego se dividió en pozos de reacción separados (1 eq. de producto del ciclo B en cada pozo). A cada pozo se agregó una etiqueta del ciclo C (1.5 eq.) y un empalme (1.2 eq.). La ligación química se incubó a temperatura ambiente durante la noche. A cada pozo (en la división) se añadió una amina (80 eq.) y cianoborohidruro de sodio (80 eq.). La 25 reacción química se incubó a 60 °C durante 16 h. Al finalizar, todos los pozos se agruparon y los productos se precipitaron utilizando etanol. El conjunto de del ciclo C se purificó utilizando LC y se liofilizó a sequedad.

Otras realizaciones

Aunque la invención se ha descrito en relación con las realizaciones deseadas específicas, debe entenderse que la invención tal como se reivindica no debería estar indebidamente limitada a dichas realizaciones específicas.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un método para marcar una primera biblioteca que comprende una entidad química codificada por oligonucleótidos, comprendiendo dicho método:

(i) proporcionar una cabeza de dominio que consiste en un oligonucleótido de cadena sencilla que tiene un primer grupo funcional y un segundo grupo funcional, comprendiendo dicha cabeza de dominio al menos un nucleótido sustituido en 2’ terminal que comprende dicho segundo grupo funcional, en el que dicha cabeza de dominio comprende un nucleótido 2’ - sustituido en el extremo 5’ y/o el extremo 3’;

(ii) unir dicho primer grupo funcional de dicha cabeza de dominio a un primer componente de dicha entidad química, en el que dicha cabeza de dominio está conectada directamente a dicho primer componente o dicha cabeza de dominio está conectada indirectamente a dicho primer componente mediante un ligador bifuncional; y

(iii) ligar dicho segundo grupo funcional de dicha cabeza de domino a una primera etiqueta de bloque de construcción que consiste en un oligonucleótido de cadena sencilla para formar un complejo, en el que la primera etiqueta de bloque de construcción comprende un nucleótido 2’-sustituido terminal en el extremo 5’ y 3’ y la ligación comprende ligación enzimática;

en la que dichas etapas (ii) y (iii) pueden realizarse en cualquier orden y en donde dicha primera etiqueta de bloque de construcción codifica la reacción de unión de dicha etapa (ii), proporcionando de ese modo una biblioteca etiquetada.
2. El método de la reivindicación 1, en el que dichos nucleótidos 2’-sustituidos son un nucleótido 2’-O-metilo o un nucleótido 2’-fluor.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, donde dichos nucleótidos 2’-sustituidos son 2’-O-metilguanina, 2’-O-metiluracilo, 2’-O-metil adenosina, 2’-O-metil timidina, 2’-O-metil inosina, 2’-O-metil citidina, 2’-O-metil diamino purina, 2’-fluoro guanina, 2’-fluoro uracilo, 2’-fluoro adenosina, 2’-fluoro timidina, 2’ -fluoro inosina, 2’-fluoro citidina o 2’-fluoro diamino purina.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en el que la etapa (ii) comprende unir dicha cabeza de dominio directamente a dicho primer componente.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en el que la etapa (ii) comprende unir dicha cabeza de dominio indirectamente a dicho primer componente a través de un ligador bifuncional.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende adicionalmente

(iv) unir una segunda etiqueta de bloque de construcción que consiste en un oligonucleótido de cadena sencilla al extremo 5’ o extremo 3’ de dicho complejo; y

(v) unir un segundo componente de dicha biblioteca química a dicho primer componente, en el que dichas etapas (iv) y (v) pueden realizarse en cualquier orden.
7. El método de la reivindicación 6, en el que dicha segunda etiqueta de bloque de construcción comprende un nucleótido terminal 2’-sustituido en uno o más del extremo 5’, el extremo 3’ o la posición interna de dicha segunda etiqueta de bloque de construcción.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicha etapa (iii) y/o la etapa (iv), si está presente, comprende una ARN ligasa y/o una ADN ligasa para unir dicha segunda etiqueta de bloque de construcción a dicho complejo y/o comprende polietilenglicol y/o uno o más cationes multivalentes solubles.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicho método comprende además separar dicho complejo de cualquier etiqueta sin reaccionar o cabeza de dominio sin reaccionar antes de cualquiera de las etapas de unión (ii)-(v) y/o purificar dicho complejo antes que cualquiera de las etapas de unión (ii)-(v).
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho método comprende además unir una o más etiquetas de bloques de construcción adicionales a dicho complejo y unir uno o más componentes adicionales a dicho complejo.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicha cabeza de dominio comprende una estructura 5 de horquilla.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que dicha cabeza de dominio, dicha primera etiqueta de bloque de construcción, dicha segunda etiqueta de bloque de construcción, y/o dicha etiqueta de bloque de construcción adicional, si está presente, comprende además una primera biblioteca- secuencia de identificación, secuencia de uso y/o secuencia de origen.

10 13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que dicho método comprende además unir una primera

etiqueta de identificación de biblioteca, una secuencia de uso, una secuencia de origen, y/o una cola de dominio de dicho complejo.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que dicho método comprende una pluralidad de cabezas de dominio.