JP6906492B2 - ポリメラーゼによって読み取れないコードオリゴヌクレオチドリンケージを有するdnaコード化ライブラリー - Google Patents
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Description
本出願は、2012年7月13日に出願された米国仮出願第61/671,406号の恩典を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
一般的に、本発明は、化合物のDNAコード化ライブラリー、ならびにそのようなライブラリーの使用および作成方法に関する。本発明はまた、そのようなライブラリーで使用するための組成物に関する。
「2'-置換ヌクレオチド」とは、リボースの2'位置に置換を有するヌクレオチド塩基を意味する。
(i)1つ以上の足場または1つ以上のビルディングブロックを含む化学物質;
(ii)前記1つ以上の足場またはビルディングブロックの少なくとも1つのアイデンティティをコードする第1オリゴヌクレオチドタグ;および
(iii)第1官能基と第2官能基とを有するヘッドピースであって、第1官能基は前記化学物質と機能的に結び付いており、かつ第2官能基は、ポリメラーゼが読み通すまたは通過して移動する(read or translocate through)能力が低下している第1リンケージを介して、前記第1タグと機能的に結び付いている、ヘッドピース
を含む、複合体。
[本発明1002]
(i)1つ以上の足場または1つ以上のビルディングブロックを含む化学物質;
(ii)n-1個のリンケージを有するn個のオリゴヌクレオチドタグであって、ここでnは1と10の間の整数であり、かつ前記リンケージのそれぞれは2つの隣接するタグの間にあり、かつ各タグは前記1つ以上の足場またはビルディングブロックの少なくとも1つのアイデンティティをコードしている、オリゴヌクレオチドタグ;および
(iii)前記化学物質と機能的に結び付いた第1官能基と、前記n個のタグの少なくとも1つと第1リンケージを介して機能的に結び付いた第2官能基とを有するヘッドピース
を含み、ポリメラーゼは第1リンケージおよびn-1個のリンケージの少なくとも1つを読み通すまたは通過して移動する能力が低下している、複合体。
[本発明1003]
前記ポリメラーゼは、第1リンケージおよびn-1個のリンケージの少なくとも約10%を読み通すまたは通過して移動する能力が低下している、本発明1002の複合体。
[本発明1004]
1つ以上のタグが、該1つ以上のタグの5'末端に5'-コネクタ、および該1つ以上のタグの3'末端に3'-コネクタを含む、本発明1001〜1003のいずれかの複合体。
[本発明1005]
各5'-コネクタが同じ配列を含む、本発明1004の複合体。
[本発明1006]
各3'-コネクタが同じ配列を含む、本発明1004または1005の複合体。
[本発明1007]
各5'-コネクタおよび/または各3'-コネクタが異なる配列を含む、本発明1004の複合体。
[本発明1008]
第1リンケージおよび/またはn-1個のリンケージが少なくとも約3オングストロームの長さである、本発明1001〜1007のいずれかの複合体。
[本発明1009]
第1リンケージおよび/またはn-1個のリンケージが約30オングストローム未満の長さである、本発明1001〜1008のいずれかの複合体。
[本発明1010]
DNAポリメラーゼおよび/またはRNAポリメラーゼは、第1リンケージおよび/またはn-1個のリンケージを読み通すまたは通過して移動する能力が低下している、本発明1001〜1009のいずれかの複合体。
[本発明1011]
第1リンケージおよびn-1個のリンケージの約50%未満が酵素的リンケージを含む、本発明1001〜1010のいずれかの複合体。
[本発明1012]
第1リンケージおよびn-1個のリンケージが化学的リンケージを含む、本発明1001〜1011のいずれかの複合体。
[本発明1013]
化学的リンケージが化学反応基、光反応基、インターカレート部分(intercalating moiety)、または架橋性オリゴヌクレオチドを含む、本発明1012の複合体。
[本発明1014]
少なくとも1つの化学反応基、光反応基、またはインターカレート部分が、前記タグの5'末端にあるもしくは5'末端に近接する5'-コネクタ中に存在し、かつ/または前記タグの3'末端にあるもしくは3'末端に近接する3'-コネクタ中に存在する、本発明1013の複合体。
[本発明1015]
前記5'-コネクタの少なくとも1つの配列が、隣接する3'-コネクタの配列に相補的であるか、または別個のハイブリダイゼーション事象において接合部の両側にある同じ相補的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にするために同一であるかもしくは十分に類似している、本発明1014の複合体。
[本発明1016]
前記化学反応基が、置換されてもよいアルキニル基と、置換されてもよいアジド基の対;4π電子系を有する置換されてもよいジエンと、2π電子系を有する置換されてもよいジエノフィルまたは置換されてもよいヘテロジエノフィルの対;求核剤とひずみのあるヘテロシクリル求電子剤の対;置換されてもよいアミノ基とアルデヒドもしくはケトン基の対;置換されてもよいアミノ基とカルボン酸基の対;置換されてもよいヒドラジンとアルデヒドもしくはケトン基の対;置換されてもよいヒドロキシルアミンとアルデヒドもしくはケトン基の対;求核剤と置換されてもよいハロゲン化アルキルの対;白金錯体;アルキル化剤;またはフラン修飾ヌクレオチドから選択される、本発明1013〜1015のいずれかの複合体。
[本発明1017]
前記光反応基が、インターカレート部分、ソラレン誘導体、置換されてもよいシアノビニルカルバゾール基、置換されてもよいビニルカルバゾール基、置換されてもよいシアノビニル基、置換されてもよいアクリルアミド基、置換されてもよいジアジリン基、置換されてもよいベンゾフェノン、置換されてもよい5-(カルボキシ)ビニル-ウリジン基、または置換されてもよいアジド基を含む、本発明1013〜1015のいずれかの複合体。
[本発明1018]
前記インターカレート部分が、ソラレン誘導体、アルカロイド誘導体、エチジウムカチオン、アクリジン誘導体、アントラサイクリン誘導体、またはサリドマイドである、本発明1013〜1015のいずれかの複合体。
[本発明1019]
前記ソラレン誘導体が、ソラレン、8-メトキシソラレン、または4-ヒドロキシメチル-4,5,8-トリメチル-ソラレンである、本発明1018の複合体。
[本発明1020]
前記化学的リンケージが前記架橋性オリゴヌクレオチドを含み、ここで、前記架橋性オリゴヌクレオチドの5'末端の少なくとも5個のヌクレオチドの配列は、1つ以上のタグの3'末端の少なくとも5個のヌクレオチドの配列に相補的であり、かつ前記架橋性オリゴヌクレオチドの3'末端の少なくとも5個のヌクレオチドの配列は、1つ以上のタグの5'末端の少なくとも5個のヌクレオチドの配列に相補的である、本発明1013の複合体。
[本発明1021]
前記1つ以上のタグの3'末端が3'-コネクタを含む、本発明1020の複合体。
[本発明1022]
前記1つ以上のタグの5'末端が5'-コネクタを含む、本発明1020または1021の複合体。
[本発明1023]
前記架橋性オリゴヌクレオチドの5'末端および/または3'末端が可逆的な共反応基を含む、本発明1020〜1022のいずれかの複合体。
[本発明1024]
3'-コネクタおよび/または5'-コネクタが可逆的な共反応基を含む、本発明1021または1022の複合体。
[本発明1025]
前記可逆的な共反応基がシアノビニルカルバゾール基、シアノビニル基、アクリルアミド基、チオール基、またはビニルスルホン基である、本発明1023または1024の複合体。
[本発明1026]
前記化学物質が2官能性スペーサーを介して前記ヘッドピースに機能的に結び付けられる、本発明1001〜1025のいずれかの複合体。
[本発明1027]
前記化学物質が前記ヘッドピースに共有結合で取り付けられる、本発明1001〜1026のいずれかの複合体。
[本発明1028]
前記ヘッドピースが、二本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、またはヘアピンオリゴヌクレオチドからなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む、本発明1001〜1027のいずれかの複合体。
[本発明1029]
前記ヘッドピースがプライマー結合領域を含む、本発明1028の複合体。
[本発明1030]
1つ以上の第1ライブラリー識別タグ、使用タグ、および/または起源タグをさらに含む、本発明1001〜1029のいずれかの複合体。
[本発明1031]
前記複合体が2〜20のタグを含む、本発明1001〜1030のいずれかの複合体。
[本発明1032]
前記タグのそれぞれが5〜75個のヌクレオチドを含む、本発明1001〜1031のいずれかの複合体。
[本発明1033]
個々のタグセット内の前記タグのそれぞれがほぼ同じ質量を含む、本発明1001〜1032のいずれかの複合体。
[本発明1034]
RNA、DNA、修飾DNA、および/または修飾RNAを含む、本発明1001〜1033のいずれかの複合体。
[本発明1035]
修飾DNAまたは修飾RNAがPNA、LNA、GNA、TNA、または同じオリゴヌクレオチド内のそれらの混合物である、本発明1034の複合体。
[本発明1036]
テイルピースをさらに含む、本発明1001〜1035のいずれかの複合体。
[本発明1037]
本発明1001〜1036のいずれかの1つ以上の複合体を含むライブラリー。
[本発明1038]
前記ライブラリーが複数のヘッドピースを含む、本発明1037のライブラリー。
[本発明1039]
前記複数のヘッドピースの各ヘッドピースが同一の配列領域および異なるコード領域を含む、本発明1038のライブラリー。
[本発明1040]
同一の配列領域がプライマー結合領域である、本発明1039のライブラリー。
[本発明1041]
異なるコード領域が、ライブラリーの使用、ライブラリーの起源、ライブラリーのアイデンティティ、ライブラリーの履歴、リンケージ、スペーサー、もしくは第1構成成分の付加をコードする第1タグ;またはハイブリダイゼーション、増幅、クローニングもしくは配列決定技術を容易にするオリゴヌクレオチド配列である、本発明1039または1040のライブラリー。
[本発明1042]
約102〜1020の複合体を含む、本発明1037〜1041のいずれかのライブラリー。
[本発明1043]
各複合体が異なっている、本発明1037〜1042のいずれかのライブラリー。
[本発明1044]
コード化した化学物質を含む第1ライブラリーをタグ付けする方法であって:
(a)第1官能基と第2官能基を有するヘッドピースを提供する工程;
(b)該ヘッドピースの第1官能基を該化学物質の第1構成成分に結合させる工程であって、該ヘッドピースは第1構成成分に直接接合されるか、または該ヘッドピースは2官能性スペーサーによって第1構成成分に間接的に接合される、工程;および
(c)該ヘッドピースの第2官能基を第1オリゴヌクレオチドタグに第1リンケージを介して結合させて複合体を形成する工程であって、ポリメラーゼは第1リンケージを読み通すまたは通過して移動する能力が低下している、工程
を含み、
前記工程(b)および(c)は任意の順序で実施することができ、かつ前記第1タグは工程(b)の結合反応をコードしており、それによってタグ付けされたライブラリーを提供する、方法。
[本発明1045]
コード化した化学物質を含む第1ライブラリーをタグ付けする方法であって:
(a)第1官能基と第2官能基を有するヘッドピースを提供する工程;
(b)該ヘッドピースの第1官能基を化学物質の第1構成成分に結合させる工程であって、該ヘッドピースは第1構成成分に直接接合されるか、または該ヘッドピースは2官能性スペーサーによって第1構成成分に間接的に接合される、工程;
(c)該ヘッドピースの第2官能基を第1オリゴヌクレオチドタグに第1リンケージを介して結合させる工程;
(d)化学物質のnc個の追加の構成成分を結合させる工程であって、ここでncは1と10の間の整数である、工程;および
(e)nt個のリンケージを有するnt個の追加のオリゴヌクレオチドタグを結合させて複合体を形成する工程であって、ここでntは1と10の間の整数であり、かつ前記リンケージのそれぞれは2つの隣接するタグの間にあり、かつ各タグは前記構成成分の少なくとも1つのアイデンティティをコードする、工程
を含み、
ポリメラーゼは第1リンケージおよびnt個のリンケージの少なくとも1つを読み通すまたは通過して移動する能力が低下しており、
前記工程(b)および(c)は任意の順序で実施することができ、かつ前記第1タグは工程(b)の結合反応をコードしており、前記工程(d)および(e)は任意の順序で実施することができ、かつ追加の各タグは工程(d)の追加の各構成成分の結合反応をコードしており、それによってタグ付けされたライブラリーを提供する、方法。
[本発明1046]
前記ポリメラーゼは、第1リンケージおよびnt個のリンケージの少なくとも約10%を読み通すまたは通過して移動する能力が低下している、本発明1045の方法。
[本発明1047]
第1構成成分および/または追加の構成成分が足場またはビルディングブロックを含む、本発明1044〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
工程(b)が前記ヘッドピースを、2官能性スペーサーを介して、第1構成成分に間接的に結合させることを含む、本発明1044〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
使用タグおよび/または起源タグを前記複合体に結合させることをさらに含む、本発明1044〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
第1ライブラリー識別タグを前記複合体に結合させることをさらに含む、本発明1044〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
第2ライブラリーを提供し、かつ第1ライブラリーを第2ライブラリーと組み合わせることをさらに含む、本発明1050の方法。
[本発明1052]
テイルピースを前記複合体に結合させることをさらに含む、本発明1044〜1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記結合させる工程が化学反応基、光反応基、インターカレート部分、または架橋性オリゴヌクレオチドを含む、本発明1044〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
1つ以上の工程でスプリット・アンド・プール合成を実施すること、1つ以上の複合体を分離すること、および/または1つ以上の複合体を精製することをさらに含む、本発明1044〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
本発明1001〜1036のいずれかの複合体および/または本発明1037〜1043のいずれかのライブラリーをさらに含む、本発明1044〜1053のいずれかの方法。
[本発明1056]
複数の化学物質をスクリーニングする方法であって:
(a)標的を本発明1001〜1036のいずれかの複合体および/または本発明1037〜1043のいずれかのライブラリーと接触させる工程;および
(b)対照と比較して、該標的に対して所定の特性を有する1つ以上の複合体を選択し、それによって化学物質をスクリーニングする工程
を含む、方法。
[本発明1057]
前記所定の特性が、対照と比較して、増加した前記標的への結合を含む、本発明1056の方法。
[本発明1058]
工程(a)の前に、1つ以上の操作を実施し、該操作が、1つ以上のリレープライマー(relay primer)を前記複合体とアニーリングすることであって、ここで、該1つ以上のリレープライマーは第1リンケージおよび/またはn-1個のリンケージにまたがっている、こと;該リレープライマーをポリメラーゼを用いて伸長させてオリゴヌクレオチド断片を生成すること;および該オリゴヌクレオチド断片をライゲーションして鋳型を生成することからなるリストより選択される、本発明1056または1057の方法。
[本発明1059]
本発明1001〜1036のいずれかの複合体のヌクレオチド配列を決定する方法であって:
(a)1つ以上のリレープライマーを該複合体とアニーリングする工程であって、該1つ以上のリレープライマーは第1リンケージおよび/またはn-1個のリンケージにまたがっている、工程;
(b)該リレープライマーをポリメラーゼを用いて伸長させてオリゴヌクレオチド断片を生成する工程;
(c)該オリゴヌクレオチド断片をライゲーションして鋳型を生成する工程;
(d)任意で、該鋳型をポリメラーゼ連鎖反応により増幅して、増幅混合物を生成する工程;および
(e)前記任意で増幅された混合物を配列決定して該複合体の配列を決定する工程
を含む、方法。
[本発明1060]
前記複合体が、1つ以上のタグの5'末端に5'-コネクタおよび1つ以上のタグの3'末端に3'-コネクタを含み、かつ前記1つ以上のリレープライマーのそれぞれが隣接する5'-および3'-コネクタにハイブリダイズする、本発明1059の方法。
[本発明1061]
各5'-コネクタが同じ配列を含む、本発明1060の方法。
[本発明1062]
各3'-コネクタが同じ配列を含む、本発明1061の方法。
[本発明1063]
前記5'-コネクタの少なくとも1つの配列が、隣接する3'-コネクタの配列に相補的であるか、または別個のハイブリダイゼーション事象において接合部の両側にある同じ相補的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にするように同一であるかもしくは十分に類似している、本発明1060〜1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
5'-コネクタを隣接する3'-コネクタにハイブリダイズすることをさらに含む、本発明1063の方法。
[本発明1065]
5'-コネクタと3'-コネクタの間の特定の接合部のための各リレープライマーが同じ配列を含む、本発明1060〜1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
本発明1001〜1036のいずれかの複合体のヌクレオチド配列を決定する方法であって:
(a)化学的リンケージを含む複合体を提供する工程であって、該化学的リンケージは、2つの隣接タグ間の接合部にまたがりかつ1つ以上の可逆的共反応基を介して該2つの隣接タグと機能的に結び付く、架橋性オリゴヌクレオチドである、工程;
(b)該架橋性オリゴヌクレオチドを放出させて鋳型を生成する工程;
(c)任意で、該鋳型をポリメラーゼ連鎖反応により増幅して、増幅混合物を生成する工程;および
(d)前記任意で増幅された混合物を配列決定して該複合体の配列を決定する工程
を含む、方法。
[本発明1067]
前記架橋性オリゴヌクレオチドの一部が2つの隣接タグの末端にハイブリダイズし、それによって該2つの隣接タグ間にニックまたはギャップを生成する、本発明1066の方法。
[本発明1068]
工程(b)の前に、化学的方法または酵素的方法を用いて前記タグをライゲーションすることをさらに含む、本発明1067の方法。
[本発明1069]
前記化学的方法または酵素的方法が5'-リン酸化を含む、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記任意増幅工程または前記配列決定工程の前に、前記鋳型を修復する工程をさらに含む、本発明1059〜1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
前記修復する工程が第1リンケージおよび/またはn-1個のリンケージの少なくとも1つを修正して、ポリメラーゼが読み通すまたは通過して移動することが可能な、修復されたリンケージとすることを含む、本発明1070の方法。
[本発明1072]
前記ポリメラーゼが、修復されたリンケージの少なくとも90%を読み通すまたは通過して移動することができる、本発明1071の方法。
[本発明1073]
前記修復する工程が前記鋳型に修復酵素を提供することを含む、本発明1070〜1072のいずれかの方法。
[本発明1074]
前記修復酵素がフォトリアーゼ、グリコシラーゼ、エンドヌクレアーゼ、フラップエンドヌクレアーゼ、脱プリン/脱ピリミジン(AP)エンドヌクレアーゼ、ポリADPリボースポリメラーゼ、またはメチルトランスフェラーゼである、本発明1073の方法。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本発明者らは、ポリメラーゼが読み通すまたは通過して移動する能力が低下している、少なくとも1つのリンケージ(例えば、化学的リンケージ)を有する複合体を開発した。ポリメラーゼの可読性によって制約されることなくライブラリーをタグ付けすることができると、使用できるタグ付け方法の範囲が大幅に拡大する。考えられる非限定的な利点としては、以下が挙げられる:タグおよび/またはライブラリーメンバーの質量の減少;種々の反応条件(例えば、化学物質とタグの両方の合成に適する水性および/または有機条件)でのライブラリーメンバーの溶解度の増加;安定性の向上(例えば、水性および/または有機反応条件下、その場合、このようなオリゴヌクレオチドタグおよびリンケージは、そうしたリンケージを含まないタグと比較して、特定の反応条件に対してより耐性であり得る);コストの削減(例えば、高価な酵素試薬の使用を減らす);使いやすさの向上(例えば、シアノビニルカルバゾール架橋の使用は、5.5〜9.5の広いpH範囲にわたって行われ、これは複合体の化学物質の部分を形成するのに適した反応条件下での架橋を可能にする);反応工程数の減少および試薬の使用の低減(例えば、何千もの個々の小さなアリコートを独立して処理する必要があるコンビナトリアルスプリット反応中の、バッファー交換工程、沈殿工程、またはpH調整工程の使用の減少);忠実度の向上(例えば、誤タグ付け事象の発生頻度を減少させるためにハイブリダイゼーション媒介方法が使用される場合);および化学物質を形成するための反応条件との適合性の増加(例えば、オルソゴナル官能基の使用を可能にする、ここでは、ポスト-スプリット/ミックス工程中には生じない、ユニークなタグ付け化学(例えば、UV照射の使用)を使用することができ、さらに誤タグ付け事象の発生頻度をも減らすであろう)。
本発明は、化学物質と、1つ以上のタグと、該化学物質および1つ以上のタグに機能的に結び付いたヘッドピースとを含む複合体を特徴とする。ヘッドピースとタグの間または2つのタグの間のリンケージの少なくとも1つは、ポリメラーゼが読み通すまたは通過して移動する能力が低下しているリンケージである。化学物質、ヘッドピース、タグ、および2官能性スペーサーは、以下でさらに説明される。
本発明の化学物質またはメンバー(例えば、小分子またはペプチド)は1つ以上のビルディングブロックを含むことができ、任意で1つ以上の足場を含んでもよい。
ライブラリーでは、ヘッドピースは、各化学物質をそのコードオリゴヌクレオチドタグに機能的に連結する。一般に、ヘッドピースは、さらに誘導体化され得る2つの官能基を有する出発オリゴヌクレオチドであり、ここで、第1官能基は化学物質(またはその構成成分)をヘッドピースに機能的に連結し、第2官能基は1つ以上のタグをヘッドピースに機能的に連結する。ヘッドピースと化学物質の間のスペーシング部分として、任意で、2官能性スペーサーを用いることができる。
本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドタグ(例えば、タグまたはヘッドピースの一部またはテイルピースの一部)は、例えば以下のような、有用な情報をコードするために使用することができる:分子、化学物質の一部、構成成分(例えば、足場もしくはビルディングブロック)の付加、ライブラリー内のヘッドピース、ライブラリーのアイデンティティ、1つ以上のライブラリーメンバーの使用(例えば、ライブラリーのアリコート内のメンバーの使用)、および/またはライブラリーメンバーの起源(例えば、起源配列の使用による)。
であり、第2アダプター配列は
である。
本発明のリンケージは、情報をコードするオリゴヌクレオチド間(例えば、ヘッドピースとタグ間、2つのタグ間、またはタグとテイルピース間など)に存在し、こうしたリンケージには、ポリメラーゼが読み通すまたは通過して移動する能力が低下している任意のリンケージが含まれる。例示的なリンケージには、化学反応基、光反応基、インターカレート部分、架橋性オリゴヌクレオチド、または可逆的共反応基の1つ以上を含む化学的リンケージが含まれる。
ヘッドピースと化学物質の間の2官能性スペーサーは、適切なスペーシング部分を提供するために、および/または有機溶媒中のヘッドピースの溶解性を増大させるために、変化させることができる。ヘッドピースを小分子ライブラリーと連結することができる、多種多様なスペーサーが市販されている。スペーサーは典型的には直鎖または分岐鎖からなり、以下を含むことができる:C1-10アルキル、1〜10原子のヘテロアルキル、C2-10アルケニル、C2-10アルキニル、C5-10アリール、3〜20原子の環式もしくは多環式系、ホスホジエステル、ペプチド、オリゴサッカライド、オリゴヌクレオチド、オリゴマー、ポリマー、ポリアルキルグリコール(例えば、ポリエチレングリコール、-(CH2CH2O)nCH2CH2-など、ここでnは1〜50の整数である)、またはこれらの組み合わせ。
さまざまなライゲーション技術を用いて、足場、ビルディングブロック、スペーサー、リンケージ、タグ、および/またはヘッドピースを付加して複合体を形成することができる。したがって、本明細書に記載の結合工程はどれも、例えば、酵素的ライゲーションおよび/または化学的ライゲーションなどの、有用なライゲーション技術を含むことができる。こうした結合工程は、ヘッドピースまたは複合体への1つ以上のタグの付加;ヘッドピースへのスペーサーの付加;およびヘッドピースまたは複合体への1つ以上の足場またはビルディングブロックの付加を含むことができる。特定の態様において、任意のオリゴヌクレオチドに使用されるライゲーション技術は、その結果として得られる生成物を提供するが、こうした生成物は、ライブラリーの解読(decoding)を可能にするために、および/または1種以上のDNAもしくはRNAポリメラーゼによる鋳型依存的重合を可能にするために、転写および/または逆転写され得る。
本明細書に記載の方法は、ヘッドピースとタグの間または2つのタグの間の酵素的または化学的ライゲーションを促進する1つ以上の反応条件を含み得る。こうした反応条件としては、以下が挙げられる:本明細書に記載するように、タグ内で修飾ヌクレオチドを使用すること;異なる長さを有するドナータグとアクセプタータグを使用すること、およびそれらのタグの濃度を変化させること;異なるタイプのリガーゼと、それらの組み合わせ(例えば、CircLigase(商標)DNAリガーゼおよび/またはT4 RNAリガーゼ)を使用すること、およびそれらの濃度を変化させること;異なる分子量を有するポリエチレングリコール(PEG)を使用すること、およびそれらの濃度を変化させること;非PEGクラウディング剤(例えば、ベタインまたはウシ血清アルブミン)を使用すること;ライゲーションのための温度および持続時間を変化させること;ATP、Co(NH3)6Cl3、および酵母無機ピロホスフェートを含めて、さまざまな剤の濃度を変えること;酵素的または化学的にリン酸化されたオリゴヌクレオチドタグを使用すること;3'-保護されたタグを使用すること;ならびにプレアデニル化されたタグを使用すること。これらの反応条件はまた、化学的ライゲーションを含む。
本発明は、コードする関係がタグの配列と化学物質の構造単位(またはビルディングブロック)との間に確立され得るように、複合体のヌクレオチド配列を決定するための方法を特徴とする。特に、化学物質のアイデンティティおよび/または履歴は、オリゴヌクレオチドの塩基配列から推論することが可能である。この方法を使用して、多様な化学物質またはメンバー(例えば、小分子またはペプチド)を含むライブラリーは、特定のタグ配列によりアドレス指定され得る。
本発明は、コードする関係がタグの配列と化学物質の構造単位(またはビルディングブロック)の間に確立され得るように、オリゴヌクレオチドタグを化学物質と機能的に結び付けるための方法を特徴とする。特に、化学物質のアイデンティティおよび/または履歴をオリゴヌクレオチドの塩基配列から推測することが可能である。この方法を用いて、多様な化学物質またはメンバー(例えば、小分子もしくはペプチド)を含むライブラリーは、特定のタグ配列によりコード化され得る。
一本鎖コード戦略のための動機の多くは、二本鎖タグと比較したときの一本鎖タグの質量の減少に起因する。質量の減少は、潜在的に、溶解性の向上、コストの低下、反応性の増加、標的接近性の増加、流体力学半径の減少、分析評価の精度向上などを含む、いくつかの利点を与える。一本鎖タグ付けの方法論を使用することに加えて、質量のさらなる減少は、以下の1つ以上の使用を含めることによって達成することができる:長さを短縮させた1つ以上のタグ、一定質量のタグのセット、コードするヘッドピース、プライマー結合領域および/または定常領域を欠くライブラリーの1つ以上のメンバー、定常領域を短縮させたライブラリーの1つ以上のメンバー、または本明細書に記載の他のいずれかの方法論。
本発明の方法は、オリゴヌクレオチドタグでコード化した多様な多数の化学物質を有するライブラリーを合成するために使用することができる。ビルディングブロックおよびコードDNAタグの例は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2007/0224607号に見出される。
複合体のための一般的な戦略
本発明の複合体は、ポリメラーゼが読み通すまたは通過して移動する能力が低下している、1つ以上のリンケージを含むように形成することができる。例えば、複合体は、(5'から3'の方向へ)化学物質(星印)、固定された定常配列(例えば、ヘッドピース)、続いて3つの可変コード配列(例えば、3つのタグ)、および別の固定された定常配列(例えば、テイルピース)を含むように形成され、ここで、固定された定常配列と可変コード配列の間のリンケージは読み取り不能であり得る(図1B)。
1つのタグ付け事象をモデル化するためのシアノビニルカルバゾールを用いた光化学オリゴヌクレオチド架橋
2つのシアノビニルカルバゾール修飾を含むオリゴヌクレオチドCNVKJを日本テクノサービス社(日本)から入手した(図5)。オリゴヌクレオチドCNVK2_P_TagB、CNVK2_NP_TagBおよびCNVK2_TagAは、Integrated DNA Technologies(IDT)社(IA)から入手した。各オリゴヌクレオチドを水に溶解して1mMの濃度とした。
であり、ここでXはCNVKであり、Biosearch Technologies社(CA)で合成された)を含む複合体を調製し、単一のオリゴヌクレオチドDouble_CNVK_Template
へと光化学架橋した。この複合体をLCMSで分析した:実測値MW 25,079Da(計算値25,055Da)。次に、それを水に溶解して100μMの濃度にし、上記のように再度、UV 312nmを用いて80℃で1時間照射した。この生成物をLCMSで分析したところ、出発Double_CNVK_templateの回復が見られた:実測値MW 16,492Da(計算値16,492Da)(図8)。
光化学架橋されたタグからの配列情報の回復をモデル化するためのシアノビニルカルバゾール光化学架橋されたオリゴヌクレオチドのライゲーションおよび光化学脱架橋
実施例2に記載したように、CNVK2_P_TagB、CNVK2_TagAおよびCNVKJの複合体を調製し、光化学架橋して、ゲル精製した。
1つのタグ付け事象をモデル化するためのステム内にソラレンを用いた光化学オリゴヌクレオチド架橋
5'末端でC2-ソラレンにより修飾されたオリゴヌクレオチド5PSO2_A9_TAはBiosearch社(CA)から入手した(図11)。オリゴヌクレオチドPSO_HP_A9_TCTはIDT社(IA)から入手した(図11)。両方のオリゴヌクレオチドをpH7.0の500mMリン酸緩衝液中にそれぞれ0.5mM濃度で溶解し、95℃に加熱した後に室温へと冷却することによってアニーリングさせた。次に、この反応物を、UVL-21コンパクトUVランプ(UVP社)を用いて365nmのUV光を4℃で30分間照射した。生成物をLCMSで分析した。本発明者らは、17,643Daの実測値MW(計算値MW 17,643.4Da)を有する光化学架橋された生成物の急速な形成を観察した(図12参照)。
1つのタグ付け事象をモデル化するためのソラレンを用いた光化学オリゴヌクレオチドライゲーション
オリゴヌクレオチドTag1_PsoCVUおよびSplintC_PsoC2をIDT社(IA)から入手した(図13)。オリゴヌクレオチド5PSOC2_A9_GA(5'末端でC2ソラレンにより修飾)はBiosearch社(CA)から入手した(図13)。
単一のタグ付け事象の読み取りをモデル化するための、末端プライマー伸長、非末端プライマー伸長、およびライゲーションを用いたポリメラーゼ読み取り不能な光化学ライゲーションされたソラレン結合モデルタグからのcDNAの作成
ソラレン-チミジン光化学ライゲーションされたオリゴヌクレオチド結合体(Bio_Pso)は、実施例5に記載したのと同様の方法を用いて、次の2つのモデルタグオリゴヌクレオチド:5'-ビオチニル化オリゴヌクレオチド5Bio_Tag_PsoCVUおよび5'-ソラレンオリゴヌクレオチド5PsoC2_A9_GAを、スプリントオリゴヌクレオチドSplintC_PsoC2と共に用いて生成させた。3種すべてのオリゴヌクレオチドはIDT社(IA)から入手し、図17に示される。24時間の反応後、Bio_Psoを10%TBE-尿素変性PAAGで精製し、LCMSで分析したところ、15,834.0Daの実測値MW(計算値MW 15,812.7Da)を有する生成物が明らかになった(図18)。
1つのタグ付け事象をモデル化するためのカルボキシビニルウリジンを用いた光化学オリゴヌクレオチドライゲーション
オリゴヌクレオチドCVU_GおよびCVU_Aは、Trilink社(CA)で合成された(図21)。両方のオリゴヌクレオチドは、5-(カルボキシ)ビニル-2'-デオキシウリジンにより5'-修飾されている(図21)。オリゴヌクレオチドTag1_PsoCVU、SplintC_CVUおよびSplintA_CVUはIDT DNA社(IA)から入手した(図21)。
単一のタグ付け事象の読み取りをモデル化するための、末端プライマー伸長、非末端プライマー伸長、およびライゲーションを用いたポリメラーゼ読み取り不能な光化学ライゲーションされたカルボキシビニルウリジン結合モデルタグからのcDNAの作成
カルボキシビニルウリジン-チミジン光化学ライゲーションされたオリゴヌクレオチド結合体(Bio_CVU)は、実施例7に記載したのと同様の方法を用いて、次の2つのモデルタグオリゴヌクレオチド:5'-5-カルボキシビニルウリジンオリゴヌクレオチド5'-CVU_Aおよび5'-ビオチニル化オリゴヌクレオチド5Bio_Tag_PsoCVUを、スプリントオリゴヌクレオチドSplintA_CVUと共に用いて生成された。3種すべてのオリゴヌクレオチドはIDT社(IA)から入手し、図21および25に示される。この反応生成物を実施例6に記載したようにゲル精製し、LCMS分析から、15,811.8Daの実測値MW(計算値MW 15,792.3Da)を有する生成物が明らかになった(図25)。
1つのタグ付け事象をモデル化するためのポリメラーゼ読み取り不能なクリック結合を用いたオリゴヌクレオチドのライゲーション
オリゴヌクレオチドS_IDTN3およびS_IDTalkyneはIDT社(IA)から入手した(図27)。オリゴヌクレオチドS_IDTN3の3'-アジド修飾は、IDT社の専売の修飾である(3'IDTアジド修飾/3アジドN/(MW 350))。
ストック溶液を次のように調製した:Cu(OAc)2.H2O(FW 181.6)、DMF中に10mM;アスコルビン酸ナトリウム(FW 198.1)、H2O中に20mM;およびトリス-(ベンジルトリアゾリルメチル)アミン(TBTA)(FW 530.6)、DMF中に10mM。エッペンドルフチューブに、10μLのpH7.0リン酸緩衝液(500mM水溶液)、10μLのS_IDTalkyne(1mM水溶液、10nmol、1当量)および10μLのS-IDTN3(1mM水溶液、10nmol、1モル当量)を加えた。この溶液に、5μLのCu_Pre-mix(2モル当量のCu(OAc)2、4モル当量のアスコルビン酸ナトリウム、1モル当量のTBTA)を加えた。この反応物を室温で終夜インキュベートした。その生成物をLCMS(Thermo社)で分析し(図28)、MWは26,304.8Da(計算値:26311.2Da)であることが見出された。この結合体を10%PAAG/8M尿素を用いた電気泳動によりさらに精製した。この結合生成物をConjugate_Click_Sと命名した。
一対のオルソゴナルタグ付け事象をモデル化するためのオルソゴナルなポリメラーゼ読み取り不能クリック結合の対を用いたオリゴヌクレオチドのライゲーション
TKR_CentralおよびS_IDTN3オリゴはIDT社から入手した(図29)。5'-ジベンゾ-シクロオクチン(DBCO)修飾オリゴTKR_DBCO_SはBiosearch Technologies社(CA)から入手した(図29)。
化学的に結合されたタグからの配列情報の読み取りをモデル化するための、自由溶液中および乳化水性液滴中での非末端プライマー媒介組換えを用いたポリメラーゼ読み取り不能なクリック結合型モデルタグに由来するcDNAのPCR増幅
Conjugate_Click_S(図32)は、実施例9に記載したように、S_IDTN3とS_IDTalkyneとの結合により調製した。
とL_IDTalkyne:
との結合により調製した。ゲル精製後のLCMSから、MWは37,582.6Da(計算値37,584.4Da)であると確認された。
単一のタグ付け事象の読み取りをモデル化するための、自由溶液中での反復相同性媒介組換えを用いたポリメラーゼ読み取り不能なクリック結合型モデルタグに由来するcDNAのPCR増幅
2つの結合体TKR_SおよびTKR_L(図38)は、それぞれ、Cu(I)触媒による環化付加反応および実施例9に記載したプロトコルを用いて3'-アジド修飾オリゴヌクレオチドと5'-ヘキシニル修飾オリゴヌクレオチドの間に形成された単一のポリメラーゼ読み取り不能なクリック結合リンケージを含む。TKR_SおよびTKR_Lは、それぞれ、ポリメラーゼ読み取り不能なリンケージの両側に重複する12-merのGGAATGAACAGGを含有する。TKR_Sは、次の2つのIDT DNAオリゴヌクレオチドTKR_S_N3:
(実施例9ではS_IDTN3とも称される)およびTKR_S_Hex:
を結合させることにより調製した。一方、TKR_Lは、2つのIDT DNAオリゴヌクレオチドTKR_L_N3:
およびTKR_L_Hex:
を結合させることにより調製した。両方の結合体を変性条件下でPAGE精製し、LCMSで分析したところ、TKR_Sについては26,447.5Da(計算値26,449.2Da)、TKR_Lについては37,582.6Da(計算値37,584.4)の分子量が明らかになった。
およびリバースプライマー:
と共に使用した。
一対のタグ付け事象の読み取りをモデル化するための、自由溶液中での反復相同性媒介組換えを用いた読み取り不能な2回クリック結合型タグに由来するcDNAのPCR増幅
2つの結合体2_cl_Sおよび2_cl_L(図41)は、それぞれが2つの読み取り不能なクリック結合リンケージを含み、各リンケージの両側には異なる12-merの反復配列:
がそれぞれ配置されているが、実施例10に記載したのと同様の2工程の手順で調製した。
とTKR_DBCO_S:
またはTKR_DBCO_L:
のいずれかとの間でシクロオクチンベースの銅フリーのクリック反応を用いて実施した。両方のDBCO含有オリゴヌクレオチドはBiosearch社(CA)から入手し、DBCOは5'-ジベンゾ-シクロオクチン修飾であり、そのためのホスホルアミダイト試薬はGlen Research社(VA)から入手可能である。これらの結合の生成物は、それぞれTKR_S_N3およびTKR_L_N3と命名された。
およびリバースプライマー:
を、5μLの10×Thermopol緩衝液;2.5μLの各フォワードおよびリバースプライマーの10μM溶液;2.5μLの10mM dNTPミックス(NEB社);40pM最終濃度のいずれか一方の結合体またはそれらの1:1混合物;2.5μLのDeep Vent(エキソ-)ポリメラーゼ;および水を加えて50μLとすることで使用した。この反応は次のように熱的に22サイクル実施した:94℃で30秒、52℃で30秒および72℃で60秒。増幅生成物は4%アガロースミニゲル(Invitrogen社)上で可視化した。
本明細書中で挙げたすべての刊行物、特許出願、および特許は、参照により本明細書に組み入れられる。
Claims (43)
- (i)1つ以上の足場または1つ以上のビルディングブロックを含む化学化合物;
(ii)該化学化合物に結合したオリゴヌクレオチドヘッドピース;
(iii)該1つ以上の足場またはビルディングブロックの少なくとも1つのアイデンティティをコードするオリゴヌクレオチドタグ;および
(iv)ポリメラーゼが読み通すまたは通過して移動する(read or translocate through)能力が低下しているリンケージであって、該リンケージが光反応基を含む化学的リンケージであり、該光反応基がシアノビニルカルバゾール基、ビニルカルバゾール基、シアノビニル基、アクリルアミド基、ジアジリン基、ベンゾフェノン、5-(カルボキシ)ビニル-ウリジン、またはアジド基を含む、リンケージ、
を含む、コード化した化学化合物であって、
該オリゴヌクレオチドヘッドピースが、該リンケージを介して該オリゴヌクレオチドタグに結合される、
コード化した化学化合物。 - (i)1つ以上の足場または1つ以上のビルディングブロックを含む化学化合物;
(ii)該化学化合物におよび該1つ以上の足場またはビルディングブロックの少なくとも1つのアイデンティティをコードするオリゴヌクレオチドタグに結合したオリゴヌクレオチドヘッドピース;
(iii)該1つ以上の足場またはビルディングブロックの少なくとも1つのアイデンティティをコードする追加のオリゴヌクレオチドタグ;および
(iv)ポリメラーゼが読み通すまたは通過して移動する能力が低下しているリンケージであって、該リンケージが光反応基を含む化学的リンケージであり、該光反応基がシアノビニルカルバゾール基、ビニルカルバゾール基、シアノビニル基、アクリルアミド基、ジアジリン基、ベンゾフェノン、5-(カルボキシ)ビニル-ウリジン、またはアジド基を含む、リンケージ
を含む、コード化した化学化合物であって、
該オリゴヌクレオチドタグが、リンケージを介して該追加のオリゴヌクレオチドタグに結合される、
コード化した化学化合物。 - 前記光反応基が5-(カルボキシ)ビニル-ウリジンを含む、請求項1または2記載のコード化した化学化合物。
- 前記化学化合物が2官能性スペーサーを介して前記オリゴヌクレオチドヘッドピースに結合される、請求項1〜3のいずれか一項記載のコード化した化学化合物。
- 前記化学化合物が前記オリゴヌクレオチドヘッドピースに共有結合で取り付けられる、請求項1〜4のいずれか一項記載のコード化した化学化合物。
- 前記オリゴヌクレオチドヘッドピースが、二本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、またはヘアピンオリゴヌクレオチドからなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のコード化した化学化合物。
- 前記オリゴヌクレオチドヘッドピースがプライマー結合領域を含む、請求項6記載のコード化した化学化合物。
- 前記コード化した化学化合物が、1つ以上の第1ライブラリー識別タグ、1つ以上の使用タグ、および/または1つ以上の起源タグをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のコード化した化学化合物。
- 前記コード化した化学化合物が2〜20のオリゴヌクレオチドタグを含む、請求項1〜8のいずれか一項記載のコード化した化学化合物。
- 前記オリゴヌクレオチドタグのそれぞれが5〜75個のヌクレオチドを含む、請求項1〜9のいずれか一項記載のコード化した化学化合物。
- 前記オリゴヌクレオチドタグのそれぞれがほぼ同じ質量を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載のコード化した化学化合物。
- 前記コード化した化学化合物が、RNA、DNA、修飾DNA、および/または修飾RNAを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載のコード化した化学化合物。
- 前記修飾DNAまたは修飾RNAがPNA、LNA、GNA、TNA、または同じオリゴヌクレオチド内のそれらの混合物である、請求項12記載のコード化した化学化合物。
- 前記コード化した化学化合物が、テイルピースをさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項記載のコード化した化学化合物。
- 請求項1〜14のいずれか一項記載の1つ以上のコード化した化学化合物を含むライブラリー。
- 前記ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドヘッドピースを含む、請求項15記載のライブラリー。
- 前記複数のオリゴヌクレオチドヘッドピースの各オリゴヌクレオチドヘッドピースが同一の配列領域および異なるコード領域を含む、請求項16記載のライブラリー。
- 前記同一の配列領域がプライマー結合領域である、請求項17記載のライブラリー。
- 前記異なるコード領域が、ライブラリーの使用、ライブラリーの起源、ライブラリーのアイデンティティ、ライブラリーの履歴、リンケージ、スペーサー、もしくは第1構成成分の付加をコードする第1タグ;またはハイブリダイゼーション、増幅、クローニングもしくは配列決定技術を容易にするオリゴヌクレオチド配列である、請求項17または18記載のライブラリー。
- 約102〜1020のコード化した化学化合物を含む、請求項15〜19のいずれか一項記載のライブラリー。
- 各コード化した化学化合物が異なっている、請求項15〜20のいずれか一項記載のライブラリー。
- コード化した化学化合物を生成する方法であって:
(a)オリゴヌクレオチドヘッドピースを提供する工程;
(b)該オリゴヌクレオチドヘッドピースを該化学化合物に結合させる工程であって、該オリゴヌクレオチドヘッドピースは該化学化合物の構成成分に直接接合されるか、または該オリゴヌクレオチドヘッドピースは2官能性スペーサーによって該化学化合物の構成成分に間接的に接合される、工程;および
(c)該オリゴヌクレオチドヘッドピースをオリゴヌクレオチドタグにポリメラーゼが読み通すまたは通過して移動する能力が低下しているリンケージを介して結合させる、工程
を含み、
工程(b)および(c)は任意の順序で実施することができ、
該オリゴヌクレオチドタグは工程(b)の結合反応をコードしており、かつ
該リンケージが光反応基を含む化学的リンケージであり、該光反応基がシアノビニルカルバゾール基、ビニルカルバゾール基、シアノビニル基、アクリルアミド基、ジアジリン基、ベンゾフェノン、5-(カルボキシ)ビニル-ウリジン、またはアジド基を含み、
それによってコード化した化学化合物を提供する、方法。 - コード化した化学化合物を生成する方法であって:
(a)オリゴヌクレオチドヘッドピースを提供する工程;
(b)該オリゴヌクレオチドヘッドピースを該化学化合物の構成成分に結合させる工程であって、該オリゴヌクレオチドヘッドピースは該化学化合物の該構成成分に直接接合されるか、または該オリゴヌクレオチドヘッドピースは2官能性スペーサーによって該化学化合物の該構成成分に間接的に接合される、工程;
(c)該オリゴヌクレオチドヘッドピースをオリゴヌクレオチドタグに結合させる工程;
(d)該オリゴヌクレオチドヘッドピースを該化学化合物の追加の構成成分に結合させる工程;および
(e)該オリゴヌクレオチドタグを追加のオリゴヌクレオチドタグにポリメラーゼが読み通すまたは通過して移動する能力が低下しているリンケージを介して結合させる工程
を含み、
該リンケージが光反応基を含む化学的リンケージであり、該光反応基がシアノビニルカルバゾール基、ビニルカルバゾール基、シアノビニル基、アクリルアミド基、ジアジリン基、ベンゾフェノン、5-(カルボキシ)ビニル-ウリジンまたはアジド基を含み、
前記工程(b)および(c)は任意の順序で実施することができ、
前記オリゴヌクレオチドタグは工程(b)の結合反応をコードしており、
前記工程(d)および(e)は任意の順序で実施することができ、かつ
該追加のオリゴヌクレオチドタグは工程(d)をコードしており、
それによってコード化した化学化合物を提供する、方法。 - 前記化学化合物の前記構成成分が足場またはビルディングブロックを含む、請求項22または23記載の方法。
- 工程(b)が前記オリゴヌクレオチドヘッドピースを、2官能性スペーサーを介して、前記化学化合物の前記構成成分に間接的に結合させることを含む、請求項22〜24のいずれか一項記載の方法。
- 前記方法が、使用タグおよび/または起源タグを前記コード化した化学化合物に結合させることをさらに含む、請求項22〜25のいずれか一項記載の方法。
- 前記方法が、第1ライブラリー識別タグを前記コード化した化学化合物に結合させることをさらに含む、請求項22〜26のいずれか一項記載の方法。
- 前記方法が、追加のコード化した化学化合物を提供し、かつ前記コード化した化学化合物を前記追加のコード化した化学化合物と組み合わせることをさらに含む、請求項27記載の方法。
- 前記方法が、テイルピースを前記コード化した化学化合物に結合させることをさらに含む、請求項22〜28のいずれか一項記載の方法。
- 前記方法が、1つ以上の工程でスプリット・アンド・プール合成を実施すること、1つ以上のコード化した化学化合物を分離すること、および/または1つ以上のコード化した化学化合物を精製することをさらに含む、請求項22〜29のいずれか一項記載の方法。
- 前記光反応基が5-(カルボキシ)ビニル-ウリジンを含む、請求項22〜30のいずれか一項記載の方法。
- 複数のコード化した化学化合物をスクリーニングする方法であって:
(a)標的を請求項1〜14のいずれか一項記載のコード化した化学化合物および/または請求項15〜21のいずれか一項記載のライブラリーと接触させる工程;および
(b)対照と比較して、該標的に対して所定の特性を有する1つ以上のコード化した化学化合物を選択し、それによってコード化した化学化合物をスクリーニングする工程
を含む、方法。 - 前記所定の特性が、対照と比較して、増加した前記標的への結合を含む、請求項32記載の方法。
- 工程(a)の前に、1つ以上の操作を実施し、該操作が、1つ以上のリレープライマー(relay primer)を前記コード化した化学化合物とアニーリングすることであって、ここで、該1つ以上のリレープライマーは前記リンケージにまたがっている、こと;該1つ以上のリレープライマーをポリメラーゼを用いて伸長させてオリゴヌクレオチド断片を生成すること;および該オリゴヌクレオチド断片をライゲーションして鋳型を生成することからなるリストより選択される、請求項32または33記載の方法。
- 請求項1〜14のいずれか一項記載のコード化した化学化合物のヌクレオチド配列を決定する方法であって:
(a)1つ以上のリレープライマーを該コード化した化学化合物とアニーリングする工程であって、該1つ以上のリレープライマーは前記リンケージにまたがっている、工程;
(b)該リレープライマーをポリメラーゼを用いて伸長させてオリゴヌクレオチド断片を生成する工程;
(c)該オリゴヌクレオチド断片をライゲーションして鋳型を生成する工程;
(d)任意で、該鋳型をポリメラーゼ連鎖反応により増幅して、増幅混合物を生成する工程;および
(e)前記任意で増幅された混合物を配列決定して該コード化した化学化合物の配列を決定する工程
を含む、方法。 - (i)1つ以上の足場または1つ以上のビルディングブロックを含む化学化合物;
(ii)該化学化合物に結合したオリゴヌクレオチドヘッドピース;
(iii)該足場またはビルディングブロックの少なくとも1つのアイデンティティをコードするオリゴヌクレオチドタグ;および
(iv)ポリメラーゼが読み通すまたは通過して移動する能力が低下しているリンケージであって、該リンケージが光反応基を含む化学的リンケージであり、該光反応基がシアノビニルカルバゾール基、ビニルカルバゾール基、シアノビニル基、アクリルアミド基、ジアジリン基、ベンゾフェノン、5-(カルボキシ)ビニル-ウリジン、またはアジド基を含む、リンケージ、
を含む、コード化した化学化合物であって、
該オリゴヌクレオチドヘッドピースが、該リンケージを介して該オリゴヌクレオチドタグに結合される、コード化した化学化合物
のヌクレオチド配列を決定する方法であって、
該方法が、
(a)1つ以上のリレープライマーを該コード化した化学化合物とアニーリングする工程であって、該1つ以上のリレープライマーは該リンケージにまたがっている、工程;
(b)該リレープライマーをポリメラーゼを用いて伸長させてオリゴヌクレオチド断片を生成する工程;
(c)該オリゴヌクレオチド断片をライゲーションして鋳型を生成する工程;
(d)任意で、該鋳型をポリメラーゼ連鎖反応により増幅して、増幅混合物を生成する工程;および
(e)該任意で増幅された混合物を配列決定して該コード化した化学化合物の配列を決定する工程
を含む、方法。 - (i)1つ以上の足場または1つ以上のビルディングブロックを含む化学化合物;
(ii)該化学化合物におよび該足場またはビルディングブロックの少なくとも1つのアイデンティティをコードするオリゴヌクレオチドタグに結合したオリゴヌクレオチドヘッドピース;
(iii)該足場またはビルディングブロックの少なくとも1つのアイデンティティをコードする追加のオリゴヌクレオチドタグ;および
(iv)ポリメラーゼが読み通すまたは通過して移動する能力が低下しているリンケージであって、該リンケージが光反応基を含む化学的リンケージであり、該光反応基がシアノビニルカルバゾール基、ビニルカルバゾール基、シアノビニル基、アクリルアミド基、ジアジリン基、ベンゾフェノン、5-(カルボキシ)ビニル-ウリジン、またはアジド基を含む、リンケージ
を含むコード化した化学化合物であって、
該オリゴヌクレオチドタグが、該リンケージを介して該追加のオリゴヌクレオチドタグに結合される、コード化した化学化合物
のヌクレオチド配列を決定する方法であって、
該方法が、
(a)1つ以上のリレープライマーを該コード化した化学化合物とアニーリングする工程であって、該1つ以上のリレープライマーは該リンケージにまたがっている、工程;
(b)該リレープライマーをポリメラーゼを用いて伸長させてオリゴヌクレオチド断片を生成する工程;
(c)該オリゴヌクレオチド断片をライゲーションして鋳型を生成する工程;
(d)任意で、該鋳型をポリメラーゼ連鎖反応により増幅して、増幅混合物を生成する工程;および
(e)該任意で増幅された混合物を配列決定して該コード化した化学化合物の配列を決定する工程
を含む、方法。 - 前記光反応基が5-(カルボキシ)ビニル-ウリジンを含む、請求項35〜37のいずれか一項記載の方法。
- 前記コード化した化学化合物が、前記オリゴヌクレオチドタグの5'末端に5'-コネクタ、前記オリゴヌクレオチドタグの3'末端に3'-コネクタ、前記追加のオリゴヌクレオチドタグの5'末端に5'-コネクタ、および前記追加のオリゴヌクレオチドタグの3'末端に3'-コネクタを含み、前記1つ以上のリレープライマーのそれぞれが、隣接する5'-および3'-コネクタにハイブリダイズする、請求項35〜38のいずれか一項記載の方法。
- 各5'-コネクタが同じ配列を含む、請求項39記載の方法。
- 各3'-コネクタが同じ配列を含む、請求項39または40記載の方法。
- 各リレープライマーが同じ配列を含む、請求項35〜41のいずれか一項記載の方法。
- 前記光反応基が、前記タグの5'末端のもしくは5'末端に近接する5'-コネクタ中に、および/または前記タグの3'末端のもしくは3'末端に近接する3'-コネクタ中に、存在する、請求項35〜42のいずれか一項記載の方法。
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