JPWO2017081926A1 - α−アミラーゼに結合する核酸分子およびその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明のα−アミラーゼ結合核酸は、α−アミラーゼに対する解離定数が、17nM以下の核酸分子であることを特徴とし、例えば、配列番号1から22のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むことが好ましい。本発明の核酸分子によれば、唾液中におけるα−アミラーゼを検出することができる。
Description
前記核酸分子が、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のα−アミラーゼを検出することを特徴とする。
(a)配列番号1〜6および18〜21のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a1)配列番号7〜10および22のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a2)配列番号11〜14のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a3)配列番号15〜17のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子は、前述のように、α−アミラーゼに対する解離定数が、17nM以下の核酸分子であることを特徴とする。
(a)配列番号1〜6および18〜21のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a1)配列番号7〜10および22のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a2)配列番号11〜14のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a3)配列番号15〜17のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)前記(a)のいずれかの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、前記α−アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
(c)前記(a)のいずれかの塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記α−アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
(d)前記(a)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、α−アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
[ヌクレオチド残基]−[リンカー]−[アデニン残基]
[ヌクレオチド残基]−[リンカー]−[置換アデニン残基]
[ヌクレオチド残基] =C‐C(=O)-NH‐(CH2)n- [アデニン残基]
[ヌクレオチド残基] =C‐C(=O)-NH‐(CH2)n- [置換アデニン残基]
[ヌクレオチド残基] =C‐C(=O)-NH‐CH2-CH2- [アデニン残基]
[ヌクレオチド残基] =C‐C(=O)-NH‐CH2-CH2- [置換アデニン残基]
本発明の分析用センサは、前述のように、α−アミラーゼの分析用センサであって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の分析用センサは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の分析用センサを使用すれば、例えば、前記核酸分子と前記α−アミラーゼとを結合させることで、前述のように、前記α−アミラーゼを検出できる。
本発明の分析方法は、前述のように、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のα−アミラーゼを検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のα−アミラーゼを検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明の分析方法は、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のα−アミラーゼ分析用センサを使用してもよい。
本発明の検出キットは、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記α−アミラーゼの検出等を行うことができる。
本例では、配列番号1〜22のアプタマーについて、α−アミラーゼに対する結合能および動態パラメータを、SPRにより確認した。
下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。配列番号1〜17および22のアプタマーは、下記表3Aの下線で示すチミンを含むヌクレオチド残基が、前記式(1)に示すヌクレオチド残基であり、配列番号18〜21のアプタマーは、下記表3Bの二重下線で示すチミンを含むヌクレオチド残基が、前記式(2)に示すヌクレオチド残基である。
市販のヒトα−アミラーゼ(Lee Biosolutions社製、以下同様)を、試料として、以下の試験に使用した。
結合能の解析には、ProteON XPR36(BioRad社)を、その使用説明書にしたがって使用した。
ネガティブコントロール1(KS9 random pool)
GGATACCTTAACGCCGCCTATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGTTGCACCCGTCTCGAAATC
ネガティブコントロール2(KK10 random pool)
GGTTACGCCCAGGACACATTTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAAGCTCGGTCTCCTCGGATAATC
本例では、配列番号1〜3、7〜19、21および22のアプタマーについて、α−アミラーゼに対する結合能(解離定数)を、SPRにより確認した。
本例では、本発明のアプタマーについて、α−アミラーゼに対する結合能を、キャピラリー電気泳動(以下、「CAE」という)により、確認した。
配列番号1、2、3および19のアプタマーの5’末端を、蛍光物質(TYE665、IDT社製)で標識化して、この標識化アプタマーを本実施例に使用した。また、ネガティブコントロール(NC)として、前記実施例1と同じネガティブコントロール1(配列番号23)の5’末端を、同様にラベル化して使用した。
前記市販のヒトα−アミラーゼまたはヒトの唾液を、試料として、以下の実験に使用した。
前記標識化アプタマー(配列番号1)を含む反応液を調製した。前記反応液を、下記条件でCAEに供し、前記反応液中の成分を分離しながら移動させ、前記蛍光物質の最大吸収波長(665nm)における蛍光を測定した。前記反応液は、前記標識化アプタマーのみを含む反応液1、前記標識化アプタマーとα−アミラーゼとを含む反応液2、前記標識化アプタマーと唾液とを含む反応液3、ネガティブコントロールの前記標識化アプタマーと唾液とを含む反応液4を使用した。前記各反応液において、前記標識化アプタマーの濃度は、200nmol/Lとした。前記反応液2において、前記α−アミラーゼの濃度は、2μmol/Lとし、前記反応液3および4において、前記唾液の濃度は、10%とした。そして、前記各反応液の残分は、緩衝液で調製した。前記緩衝液の組成は、40mmol/L HEPES(pH7.5)、125mmol/L NaCl、5mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2とした。
測定装置:SV1210形コスモアイ(日立ハイテクノロジー社)
測定チップ:i−チップ12(日立化成社)
泳動ゲル:0.6% ヒドロキシプロピル)メチルセルロース(粘度2.600−5.600、シグマ社、#H7509)
ゲル溶解バッファー:40mmol/L HEPES(pH7.5)、5mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2
インジェクション電圧:600v
インジェクション時間:120秒
分離電圧:350v
分離時間:240sec
前記標識化アプタマー(配列番号1、2、3および19)を使用した以外は、前記(3)と同様にして、前記反応液2を調製し、CAEにより結合能の解析を行った。また、前記標識化アプタマーのα−アミラーゼに対する特異性を確認するために、前記α−アミラーゼに代えて、N末端にHisタグが融合したヒトクロモグラニンA(CgA、組換え全長タンパク質、Creative BioMart社、#CHGA-26904TH)またはヒトIgA(分泌性、Biomedicals、LLC−Cappel Products社、#55905)を用いた以外は、前記反応液2と同様して、CAEにより結合能の解析を行った。
本例では、配列番号1のアプタマーについて、α−アミラーゼに対する結合能を、磁気ビーズによるプルダウンにより確認した。
磁気ビーズの表面にストレプトアビジン(SA)が結合したSAビーズ(Invitrogen社、商品名MyOne−SA C1)に、前記アプタマーを結合させ、アプタマー結合ビーズを作製した。具体的には、まず、前記アプタマーに100%相補的な相補鎖を調製した。他方、前記アプタマーの5’領域の配列(配列番号25、GGATACCTTAACGCCGCCTATTG)を準備し、その5’末端をビオチン化して、ビオチン化プライマーを調製した。そして、前記相補鎖を鋳型として、前記ビオチン化プライマーを用い、PCRによる増幅を行い、5’末端がビオチン化された前記アプタマーを合成した。前記合成された前記アプタマーと前記相補鎖とからなる二本鎖に対して、前記SAビーズを反応させ、前記二本鎖におけるビオチンと前記SAビーズのアビジンとを結合させた。つぎに、前記二本鎖とSAビーズとが結合した複合体を、NaOHでアルカリ処理し、前記二本鎖の解離を行うことによって、前記相補鎖を除去した。これによって、前記SAビーズに、ビオチン−アビジン結合により前記ビオチン化アプタマーが結合した、前記アプタマー結合ビーズを作製した。
ヒトの唾液を、試料として、以下の実験に使用した。
前記アプタマー結合ビーズ(終濃度10mg/ml)と前記試料(終濃度90%)とを、SB1T緩衝液(40mmol/L HEPES、125mmol/L NaCl、5mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2および0.01% Tween(登録商標)20、pH7.4)中で混合し、この反応液を、室温で30分間反応させた。前記反応液を遠心して前記ビーズを回収し、前記SB1T緩衝液で3回遠心洗浄した。前記アプタマーがα−アミラーゼに結合する場合、前記ビーズには、前記アプタマーを介してα−アミラーゼが結合していることになる。そこで、前記ビーズをSDSバッファー緩衝液に混合し、95℃で10分間、加熱処理することによって、前記ビーズからα−アミラーゼを遊離させた。そして、加熱処理後の前記SDS緩衝液から、前記ビーズを除去して、PAGEL(C520L、アトー社)を用いてSDS−PAGEに供した。泳動用のバッファーは、前記SDSバッファーを使用した。前記SDSバッファーの組成は、25mmol/L Tris、192mmol/L グリシン、0.1% SDSとした。
カラム:PicoFrit column BetaBasic C18(New Objective社)
移動相A液:0.1%ギ酸/2%アセトニトリル
移動相B液:0.1%ギ酸/80%アセトニトリル
グラジエント:
0−30分 5− 40% B液
30−40分 40−100% B液
40−60分 100% B液
流速:300nL/min
〔MSの実験条件〕
イオン化モードnanoESI+
MS測定範囲:MS1 m/z400−1500、MS2 m/z50−1500×3
data dependentスキャンモード
Claims (14)
- α−アミラーゼに対する解離定数が、17nM以下の核酸分子であることを特徴とするα−アミラーゼ結合核酸分子。
- 前記核酸分子が、下記(a)のポリヌクレオチド、またはその部分配列からなるポリヌクレオチドを含む、請求項1記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
(a)配列番号1〜6および18〜21のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド - 前記部分配列からなるポリヌクレオチドが、下記(a1)、(a2)および(a3)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドである、請求項2記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
(a1)配列番号7〜10および22のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a2)配列番号11〜14のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a3)配列番号15〜17のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド - 前記結合核酸分子が、塩基が修飾基で修飾された修飾塩基を含む、請求項2または3記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
- 前記修飾塩基が、修飾チミンである、請求項4記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
- 前記修飾基が、アデニン残基または置換アデニン残基である、請求項4または5記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
- 前記置換アデニン残基が、9位のNに置換基を有する置換アデニン残基である、請求項6記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
- 前記置換基が、アミジノアミノアルキル基である、請求項7記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
- 前記アミジノアミノアルキル基が、4−アミジノアミノブチル基である、請求項8記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
- 前記修飾塩基が、プリン塩基の7位が前記修飾基で修飾された修飾プリン塩基またはピリミジン塩基の5位が前記修飾基で修飾された修飾ピリミジン塩基である、請求項4から9のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
- 前記ポリヌクレオチドが、DNAである、請求項2から10のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子を含むことを特徴とするα−アミラーゼ分析用センサ。
- 試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のα−アミラーゼを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、請求項1から11のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のα−アミラーゼを検出することを特徴とする、α−アミラーゼの分析方法。 - 前記試料が、唾液、尿、血漿および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項13記載のα−アミラーゼの分析方法。
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