EP3673268A1 - Mittel und verfahren zur detektion von analyten mittels makroskopischer granulat-partikel - Google Patents

Mittel und verfahren zur detektion von analyten mittels makroskopischer granulat-partikel

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EP3673268A1
EP3673268A1 EP17768986.6A EP17768986A EP3673268A1 EP 3673268 A1 EP3673268 A1 EP 3673268A1 EP 17768986 A EP17768986 A EP 17768986A EP 3673268 A1 EP3673268 A1 EP 3673268A1
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EP
European Patent Office
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analyte
detection
granules
sample
macroscopic
Prior art date
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Pending
Application number
EP17768986.6A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Timo Hillebrand
Elmara Graser
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AJ Innuscreen GmbH
Original Assignee
AJ Innuscreen GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by AJ Innuscreen GmbH filed Critical AJ Innuscreen GmbH
Publication of EP3673268A1 publication Critical patent/EP3673268A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Definitions

  • the present invention relates to the use of a magnetically separable macro-granules polymer-based for performing immunoassays for the detection of various analytes for medical, biological, biotechnological areas.
  • Immunoassays and their derivatives are always used when the analyte is not in the form of a nucleic acid that could be amplified for detection by molecular biology techniques. This concerns the detection of different molecules, such. Hormones, toxins, alcohols and proteins in general.
  • Immunoassays are also used as so-called rapid tests when a quick detection z. B. a whole cell or a virus particle is sought.
  • detection technologies include ELISAs (for detection of proteins or nucleic acids, R. Yalow, et al., J. Clin. Invest .. 39, 1157-75 (1960), blotting techniques (for detecting proteins and nucleic acids Southern, EMJ Mol. Biol., 98: 503-517 (1975); Alwine JC et al., Proc. Natl. Acad., U.S.A., 74, 5350-5354 (1977): Renart, J. et al., Proc. Natl.
  • Sample volume provide for the use of beads to which the analyte is bound [2].
  • the size of the beads used is in the range of micrometers and nanometers. This seems very advantageous at first, since beads have a very large surface area with a small total volume.
  • the antibodies coupled with beads are added to the sample and then fed together with the antigen bound thereto either by centrifugation or by magnetic separation to the further detection method.
  • beads are also used for the separation of various sample constituents, e.g. Exosomes, cells and molecules used. The separation of the beads from a solution but is always problematic, especially as beads in the micrometer or
  • pipette tips offer protection against cross-contamination, the usable volume of the sample material is very limited (the authors use a 30 ⁇ sample). In addition, this method requires a very complicated apparatus and an extremely complex production of functionalized tips and therefore can not be used cost-effectively / cost-effectively for routine diagnostic applications.
  • the object of the present invention is defined by the listed
  • the agent according to the invention allows a rapid signal generation, if necessary from a large sample volume without complicated device technology, a very high
  • Sensitivity is also suitable for an automated process of any kind. It represents an alternative, novel means of performing previous ELISA applications.
  • the means according to the invention for the detection of an analyte uses specific macroscopic granule particles ("MGP"), whereby these particles can have different shapes and sizes, preferably sizes between 1 mm and 5 mm
  • the particles may consist of the known materials which have the ability to detect on their surface the functional detection molecules
  • the granules used can be separated by means of a magnet.
  • a magnet Such a material is known as granules under the trade name TECACOPM®.
  • composition of the invention also knows the necessary for ELI SA process coatable surface. After coating, the granules according to the invention can be used for carrying out the detection reaction. This is based on the processes known for ELI SA applications:
  • a surface coated granule is contacted with a sample containing an analyte to be detected. This can be done by the granules being free in the sample or by passing the sample past the granules.
  • the analyte binds specifically to the granules.
  • the granulate is separated from the sample by means of magnetic separation and subsequently washed briefly.
  • the granules are then contacted with detection molecules (e.g., HRP-labeled antibody).
  • detection molecules e.g., HRP-labeled antibody
  • the final proof is e.g. after addition of a substrate solution and by colorimetric measurement of the substrate conversion reaction.
  • the analyte bound to the agent of the invention acts as a bridge between the agent of the invention and the other detection components.
  • Detection components may be labeled molecules which on the one hand bind specifically to the analyte and on the other hand allow the possibility of detection (e.g.
  • the agent according to the invention is ideally suited to enable a detection reaction.
  • the granules provide a sufficiently large binding surface for the analyte. It may be because of his
  • Sample volume (eg 1 ml - 100 ml) can be used.
  • sample volume eg 1 ml - 100 ml
  • composition according to the invention over a bead-based ELISA application is that due to the size of the granules, the separation of the granules from the sample takes place very rapidly. In contrast, nano- and micrometer-sized beads take an extremely long time to be separated. Loss of beads does not occur at all. This is a significant problem with small beads.
  • a special embodiment for automating the detection method consists in a pipette tip, which is filled with the granules according to the invention.
  • the pipetting up and down of the sample enables the desired fluid fluctuation on the surface of the agent according to the invention.
  • the granules can also be brought into contact with the detection components.
  • the granules can be brought into contact with a large volume of sample even before being transferred to the tip and transferred to the tip after a magnetic separation, which is not the case when using a pipette tip as the solid phase in an ELISA [3] is possible.
  • the agent according to the invention is particularly suitable for use e.g. for online monitoring in flow systems.
  • the binding of the analyte to the agent according to the invention takes place within a bypass line and the analyte can subsequently be detected within the shortest possible time outside the line.
  • Embodiment 1 The invention will be described below with reference to examples. The embodiments do not represent a limitation of the invention. Embodiment 1
  • CRP C-reactive protein
  • the detection limit of CRP in commercial assays is 1 mg / L.
  • a polypropylene magnetic granulate (diameter about 4 mm) was incubated with anti-CRP antibody (Senova GmbH) for 5 hours. The antibody attached to the granule surface through hydrophobic interactions. Subsequently, the functionalized granules were blocked. One functionalized granule was used per detection reaction. The second anti-CRP antibody was conjugated with HRP (horseradish peroxidase) for later colorimetric detection.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the immunoassay was carried out as follows:
  • a magnetic granule bead was contacted with 50 ⁇ CRP antigen from the dilution series and 150 ⁇ PBS.
  • the magnetic granules were transferred to an ELISA reader-compatible microtiter plate.
  • FIG. 1 shows the representation of the measured values minus idle control.
  • the experiment demonstrates a low-background detection of the antigen CRP to the detection limits, which are below the detection limit of conventional CRP ELISA.
  • Embodiment 2 is a diagrammatic representation of Embodiment 1:
  • the antigen CRP was prepared at a concentration of 0.03 mg / L.
  • the magnetic granules were incubated with the following volumes of the sample:
  • FIG. 2 shows the representation of the measured values minus the blank value.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft magnetisch separierbare Makro-Granulate auf Polymer-Basis zur Durchführung von Immunoassays zur Detektion unterschiedlichster Analyten für medizinische, biologische, biotechnologische Bereiche. Die die Größe der makroskopischen Granulat-Partikel beträgt zwischen 0,5 mm und 10 mm im Querschnitt, vorzugsweise zwischen 1 mm und 5 mm. Vorzugsweise sind die Makro-Granulate magnetisch separierbar. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich die Makro-Granulate auf Polymer-Basis in einer Pipettenspitze.

Description

MITTEL UND VERFAHREN ZUR DETEKTION VON ANALYTEN MITTELS MAKROSKOPISCHER GRANULAT-PARTIKEL
Beschreibung
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines magnetisch separierbaren Makro-Granulats auf Polymer-Basis zur Durchführung von Immunoassays zur Detektion unterschiedlichster Analyten für medizinische, biologische, biotechnologische Bereiche.
Stand der Technik
[0002] Neben der molekularbiologischen Diagnostik sind die Analyse und der Nachweis von Proteinen, Antikörpern etc. zu einem unverzichtbaren Bestandteil in der modernen medizinischen Labordiagnostik, der forensischen Diagnostik, der veterinärmedizinischen Labordiagnostik und in der Lebensmittel- und Umweltdiagnostik geworden.
[0003] Immunoassays und ihre Derivate kommen immer dann zum Einsatz, wenn der Analyt nicht in Form einer Nukleinsäure vorliegt, die zur Detektion durch molekularbiologische Techniken vervielfältigt werden könnte. Dies betrifft den Nachweis von unterschiedlichen Molekülen, wie z. B. Hormone, Toxine, Alkohole und Proteine im Allgemeinen.
Immunoassays finden darüber hinaus als sogenannte Schnelltests Verwendung, wenn ein schneller Nachweis z. B. einer ganzen Zelle oder eines Viruspartikels angestrebt wird. Diese Nachweistechnologien sind u.a. ELISAs (zum Nachweis von Proteinen oder Nukleinsäuren, R. Yalow et al. J. Clin. luvest.. 39, 1157-75 (1960), Blotting- Techniken (zum Nachweis von Proteinen und Nukleinsäuren Southern, E.M. J. Mol. Biol. 98 503-517 (1975); Alwine JC et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 74,5350-5354 (1977): Renart, j. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. (7), 3116-3120 (1979), Biochip-Techniken (zum Nachweis von Proteinen und Nukleinsäuren z.B. WO 8808875), Lateral Flow Teststreifen (zum Nachweis von Proteinen und Nukleinsäuren z.B. US 4956302) oder der Nachweis mittels Biobarcodes (Proteine und Nukleinsäuren US 20030054358 AI). Als Detektionsmoleküle werden in diesen Assays sowohl Antikörper als auch Aptamere, Enzyme (z.B. Alkoholtest) oder einzelne, chemisch aktive Moleküle (wie z.B. Nitrittest) verwendet. Viele der Nachweismethoden für Proteine sind aber an teure geräteabhängige Systeme gekoppelt (ELISA -Reader, Elektrophoresen, Blotter, Washer, etc.) und erfordern zugleich eine zeitaufwendige Methodik (ELISA, Western-Blotting, Chip-basierte Detektion). Lateral Flow Assays stellen dagegen eine einfach und schnell durchzuführende Alternative dar, sind aber oftmals in Bezug auf ihre Sensitivität nur begrenzt einsetzbar.
[0004] Die erzielbaren Sensitivitäten stellen ein generelles Problem der vorgestellten
Nachweistechnologien dar. Einerseits liegt dies an der nur begrenzt möglichen
Signalverstärkung, andererseits an der geringen Menge an Probe, die für das entsprechende Testformat eingesetzt werden kann (bei einem konventionellen ELISA max. 100 μΐ). Hinzu kommen noch Probleme mit etwaigen Matrixeffekten bei schwierigen Probenmaterialien, wie z. B. Blutplasma, Lebensmitteln etc.. Diese Probleme werden teilweise durch Verwendung von unterschiedlichen LowCross-Puffern gelöst [1]. Mit diesen Puffern wird die
ursprüngliche Probe verdünnt und einem Antikörper zugefügt. Dies erhöht zwar die Spezifität der Antikörper- Antigen-Bindung, führt aber durch die Verdünnung des Ausgangsmaterials zu einem Sensitivitätsverlust.
[0005] Bisherige Technologien zur Lösung des Problems bezüglich des limitierten
Probenvolumens sehen den Einsatz von Beads vor, an die der Analyt gebunden wird [2]. Die Größe der eingesetzten Beads liegt hierbei im Bereich von Mikro- und Nanometern. Dies erscheint zunächst sehr vorteilhaft, da Beads bei einem kleinen Gesamtvolumen eine sehr große Oberfläche besitzen. Die mit Antikörpern gekoppelten Beads werden der Probe zugefügt und anschließend zusammen mit dem darauf gebundenen Antigen entweder durch eine Zentrifugation oder durch magnetische Separation dem weiteren Nachweisverfahren zugeführt. Beads werden darüber hinaus auch für die Separation diverser Probenbestandteile, wie z.B. Exosomen, Zellen und Molekülen verwendet. Die Separation der Beads aus einer Lösung ist aber stets problematisch, da insbesondere Beads im Mikrometer- bzw.
Submikrometermaßstab sehr viel Zeit benötigen, um mittels eines Magnetfeldes separiert zu werden. Dies umso mehr, je viskoser die zu untersuchende Probe ist. Man muss deshalb immer mit einem Verlust an Beads während der Magnetseparation oder mit einer sehr langen Separationszeit rechnen. Bei Verwendung größerer Probenvolumina verstärkt sich diese Problematik entsprechend, weshalb das Gesamtreaktionsvolumen bei diesen Methoden auf 1 bis 2 ml begrenzt ist. Ein weiteres Problem entsteht durch die magnetischen Eigenschaften solcher Beads. Dies ist die Ursache für eine Aggregation der Beads, welche zum Verlust der Assayfunktionalität während der Lagerung führen können.
[0006] Einen Vorteil könnten sogenannte Makropartikel-basierte ELISA bieten. Die
Verwendung von funktionalisierten ca. 0,6 cm großen Makropartikeln für ELISA ist bereits publiziert [4], allerdings besitzen die bisher bekannten Makropartikel keine magnetischen bzw. paramagnetischen Eigenschaften. Dies erlaubt deshalb auch keine magnetische Separation der Beads zur Durchführung der Nachweisreaktion. Ein weiteres Problem besteht in der fehlenden Automatisierungsmöglichkeit von Makropartikel-basierten
Nachweisverfahren. Eine sehr interessante Entwicklung hinsichtlich einer ELISA- Automatisierung ist die Benutzung einer modifizierten Pipettenspitze [3]. Hierbei wurden die Pipettenspitzen selbst mit einem Antikörper beschichtet. Der nachfolgende ELISA wurde auf der Oberfläche der Spitzen als feste Phase durchgeführt. Die in sich geschlossenen
Pipettenspitzen bieten zwar einen Schutz gegen Kreuzkontaminationen, das einsetzbare Volumen des Probenmaterials ist hierbei aber sehr begrenzt (von den Autoren werden 30 μΐ Probe verwendet). Darüber hinaus bedarf diese Methodik einer sehr komplizierten Apparatur und einer äußerst aufwendigen Herstellung der funktionalisierten Spitzen und ist demzufolge für diagnostische Routineanwendungen nicht kostengünstig/kostendeckend einsetzbar.
Aufgabe der Erfindung
[0007] Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung definiert sich aus den aufgeführten
Nachteilen von bekannten Nachweissystemen.
Lösung der Aufgabe
[0008] Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.
[0009] Das erfindungsgemäße Mittel ermöglicht eine schnelle Signalgenerierung ggf. aus einem großen Probenvolumen ohne komplizierte Gerätetechnik, eine sehr hohe
Empfindlichkeit und ist darüber hinaus für einen automatisierten Ablauf jeglicher Art geeignet. Es stellt ein alternatives, neuartiges Mittel zur Durchführung bisheriger ELISA- Anwendungen dar.
[0010] Das erfindungsgemäße Mittel zum Nachweis eines Analyten nutzt spezifische makroskopische Granulat - Partikel - („MGP"). Dabei können diese Partikel verschiedene Formen und Größen aufweisen, vorzugsweise Größen zwischen 1 mm und 5 mm im
Querschnitt. Die Partikel können aus den bekannten Materialien bestehen, welche die Fähigkeit besitzen, auf ihrer Oberfläche die funktionsfähigen Detektionsmoleküle
(Antikörper, Aptamere, chemische Gruppen etc.) zu tragen. Darüber hinaus kann das eingesetzte Granulat mittels eines Magneten separiert werden. [0011] Solch ein Material ist als Granulat unter dem Markennamen TECACOPM® bekannt.
[0012] Das erfindungsgemäße Mittel weißt ebenfalls die für ELI SA- Verfahren notwendige beschichtbare Oberfläche auf. Nach erfolgter Beschichtung kann das erfindungsgemäße Granulat für die Durchführung der Nachweisreaktion eingesetzt werden. Dies basiert auf den für ELI SA- Anwendungen bekannten Abläufen:
1. Ein oberflächenbeschichtetes Granulat wird mit einer Probe in Kontakt gebracht, welche einen nachzuweisenden Analyten enthält. Dies kann dadurch erfolgen, dass das Granulat sich frei in der Probe befindet oder indem die Probe am Granulat vorbeigeleitet wird. Der Analyt bindet dabei spezifisch an das Granulat.
2. Nach einer kurzen Inkubation wird das Granulat mittels magnetischer Separation von der Probe getrennt und nachfolgend kurz gewaschen.
3. Anschließend wird das Granulat mit Nachweismolekülen (z.B. HRP -markiertes Antikörper) in Kontakt gebracht.
4. Danach wird das Granulat erneut unter Anwendung der magnetischen Separation gewaschen, um nichtgebundene Nachweismoleküle effizient abzutrennen.
5. Der finale Nachweis erfolgt z.B. nach Zugabe einer Substratlösung und durch kolorimetrische Messung der Substrat-Umsatzreaktion.
[0013] Der am erfindungsgemäßen Mittel gebundene Analyt fungiert als Brücke zwischen dem erfindungsgemäßen Mittel und den übrigen Nachweiskomponenten.
Nachweiskomponenten können dabei markierte Moleküle sein, die sich einerseits spezifisch an den Analyten binden und anderseits die Möglichkeit einer Detektion erlauben (z.B.
Meerettichperoxidase- markierter Antikörper, mit einem fluoreszierenden Stoff markiertes Aptamer, ein weiteres Nachweismolekül gekoppelt an Partikel, welche selbst die
Detektionsmoleküle enthalten etc.).
[0014] Gemäß der Zielstellung der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße Mittel in idealster Weise geeignet, eine Nachweisreaktion zu ermöglichen. Das Granulat bietet eine ausreichend große Bindungsoberfläche für den Analyten. Es kann wegen seiner
Makroeigenschaften und seiner magnetischen Eigenschaften in einem sehr großen
Probenvolumen (z.B. 1 ml - 100 ml) eingesetzt werden. Hierzu nutzt man vorzugsweise ein Verfahren, bei welchem die Probe am erfindungsgemäßen Mittel vorbeigeleitet wird. Damit wird erreicht, dass die in der Probe enthaltenen Analyten akkumulierend an der Oberfläche des Granulats angereichert werden. Diese Vorgehensweise ermöglicht einerseits die
Sensitivität des Verfahrens zu erhöhen, anderseits die Probe mit dem Analyten mit einem für die Bindung günstigeren Puffer zu verdünnen und damit die Matrixeffekte der Probe zu minimieren. Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Mittels gegenüber einer Bead-basierten ELISA- Anwendung besteht darin, dass auf Grund der Größe der Granulate die Separation der Granulate aus der Probe sehr schnell erfolgt. Im Gegensatz dazu benötigen Nano- und Mikrometer große Beads extrem lange, um separiert werden zu können. Verluste an Beads treten überhaupt nicht mehr auf. Dies ist ein erhebliches Problem bei kleinen Beads.
[0015] Eine spezielle Ausführungsform zur Automatisierung des Nachweisverfahrens besteht in einer Pipettenspitze, welche mit dem erfindungsgemäßen Granulat befüllt ist. Das Auf- und Abpipettieren der Probe ermöglicht die gewünschte Flüssigkeitsfluktuation an der Oberfläche des erfindungsgemäßen Mittels. Durch Pipettierschritte kann das Granulat auch in Kontakt mit den Nachweiskomponenten gebracht werden. Anderseits kann bei Bedarf das Granulat schon vor der Verbringung in die Spitze mit einem großen Volumen an Probe in Kontakt gebracht werden und nach einer magnetischen Separation in die Spitze überführt werden, was bei der Benutzung einer Pipettenspitze als Feste Phase in einem ELISA [3] nicht möglich ist.
[0016] In dem Fall der Verbringung des Granulates in eine Pipettenspitze treten seine magnetischen Eigenschaften in der Bedeutung zurück, seine makroskopischen Eigenschaften können aber genutzt werden: MGP verbleiben in der Pipettenspitze während der
Pipettierschritte. Die Verbringung des Granulates in eine Pipettenspitze löst auch das Problem mit der Kreuzkontamination der benachbarten Proben. Es ist auch möglich, alle
Automatisierungssysteme, die auf magnetischer Separation basieren, für die
durchzuführenden ELISA zu verwenden, was mit nicht-magnetischen Makropartikeln nicht möglich ist. Darüber hinaus kann auch in einer Pipettenspitze die Separation der Granulate mittels eines Magnetfeldes erfolgen.
[0017] Besonders gut einsetzbar ist das erfindungsgemäße Mittel z.B. für ein Online- Monitoring in Durchflusssystemen. Hierbei erfolgt die Bindung des Analyten an das erfindungsgemäße Mittel innerhalb einer Bypassleitung und der Analyt kann anschließend innerhalb kürzester Zeit außerhalb der Leitung detektiert werden.
[0018] Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Beispielen näher beschrieben werden. Dabei stellen die Ausführungsbeispiele keine Limitierung der Erfindung dar. Ausführungsbeispiel 1:
Nachweis des C-reaktiven Proteins (CRP)
[0019] Die Nachweisgrenze von CRP bei kommerziellen Assays liegt bei 1 mg/L.
Ein Polypropylen- Magnetgranulat (Durchmesser ca. 4 mm) wurde mit anti-CRP -Antikörper (Senova GmbH) 5 Stunden lang inkubiert. Der Antikörper lagerte sich durch die hydrophoben Wechselwirkungen an der Granulatoberfiäche an. Anschließend wurde das funktionalisierte Granulat geblockt. Jeweils ein funktionalisiertes Granulatkorn wurde pro Nachweisreaktion verwendet. Der zweite anti-CRP -Antikörper wurde mit HRP (Horseradish peroxidase) für einen späteren kolorimetrischen Nachweis konjugiert.
[0020] Eine Verdünnungsreihe des CRP -Antigens wurde hergestellt:
1 : 30 mg/L, 2: 3 mg/L, 3 : 1,5 mg/L, 4: 0,75 mg/L, 5: 0,37 mg/L, 0,06 mg/L
[0021] Der Immunoassay wurde wie folgt durchgeführt:
1. Ein Magnet-Granulat-Korn wurde mit 50 μΐ CRP Antigen aus der Verdünnungsreihe und 150 μΐ PBS in Kontakt gebracht.
2. Inkubation 30 min unter rotierender Bewegung
3. 3x Waschen mit konventionellen ELISA- Washing-Buffer (AJRobescreen GmbH).
Begleitet von Magnetseparation des Magnet-Granulats.
4. Zugabe des HRP-markierten anti-CRP Detektionsantikörpers zu dem Granulatkorn.
5. Inkubation 30 min unter rotierender Bewegung
6. 3x Waschen mit konventionellen ELISA- Washing-Buffer (AJRobescreen GmbH).
Begleitet von Magnetseparation des Magnet-Granulats.
7. Die Magnet-Granulat-Körner wurden in eine ELISA-Reader-kompatible Mikrotiterplatte überführt.
8. Eine kolorimetrische HRP -vermittelte TMB-Färbung diente der Vermessung der Proben in einem ELISA-Reader bei 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm (Thermo Fisher). Messergebnisse (Mittelwert aus 3xReaktion) s. Tab. l . Tab. 1 Messwerte bei 450 nm
[0022] Figur 1 zeigt die Darstellung der Messwerte abzüglich Leerkontrolle.
[0023] Der Versuch belegt eine hintergrundarme Detektion des Antigens CRP bis zur Detektionsgrenzen, die unterhalb der Detektionsgrenze konventioneller CRP-ELISA liegen.
Ausführungsbeispiel 2:
Einfluss des Probenvolumens auf die Signalstärke bei der Detektion von CRP
[0024] Die Vorbereitung des Magnetgranulats für den Versuch erfolgte wie im
Ausführungsbeispiel 1 beschrieben.
[0025] Das Antigen CRP wurde in einer Konzentration von 0,03 mg/L hergestellt.
[0026] Die Magnet-Granulat-Körner wurden mit folgenden Volumina der Probe inkubiert:
1. 50 μΐ, 2. 100 μΐ, 3. 1 ml, 4. 5 ml, 5. 10 ml
[0027] Nach einer Inkubation für eine Stunde wurden die Granulat-Körner wie im Beispiel 1 für eine Detektion mit einem ELISA-Reader vorbereitet. Die Ergebnisse der Messung s. Tabelle 2 (Mittelwert aus 3x Bestimmung) Tab. 2 Messwerte bei 450 nm
[0028] Figur 2 zeigt die Darstellung der Messwerte abzüglich Leerwert.
[0029] Der Versuch zeigt, dass die Erhöhung des Probenvolumens zu einer höheren
Sensitivität führt, was einen Vorteil gegenüber eines herkömmlichen ELISA darstellt, bei dem das Probenvolumen durch die Größe der Mikrotiterplatte limitiert ist.
Literatur:
[1] http://www.candor-bioscience.de/methoden/elisa.html
[2] A new method of measuring C-reactive protein, with a low limit of detection, suitable for risk assessment of coronary heart disease.
Eda S, Kaufmann J, Molwitz M, Vorberg E.
Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1999;230:32-5.
[3] An automated ELISA System using a pipette tip as a solid phase
and a pH-sensitive field effect transistor as a detector
Hitoshi Tsuruta, Hideaki Yamada, Yukiko Motoyashiki, Keiko Oka, Chieko Okada,
Michihiro Nakamura Journal of Immuno logical Methods 183 (1995) 221-229
[4] Vadim V Shmanai, Tamara A Nikolayeva, Ludmila G Vinokurova, and Anatoli A
Litoshka Oriented antibody immobihzation to polystyrene macrocarriers for immunoassay modified with hydrazide derivatives of poly(meth)acrylic acid
BMC Biotechnol. 2001; 1 : 4.

Claims

Patentansprüche
1. Mittel zur Detektion eines Analyten, umfassend magnetische makroskopische Granulat- Partikel, dadurch gekennzeichnet, dass diese eine Oberflächenbeschichtung aufweisen, an der der zu bestimmende Analyt spezifisch bindet.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der makroskopischen Granulat-Partikel zwischen 0,5 mm und 10 mm im Querschnitt, vorzugsweise zwischen 1 mm und 5 mm, beträgt.
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die makroskopischen
Granulat-Partikel aus einem Konglomerat zwischen einem Polymer und einem
magnetischen bzw. paramagnetischen Material bestehen und dadurch magnetisch separierbar sind.
4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als
Oberflächenbeschichtung Antikörper, Aptamere oder chemische funktionelle Gruppen dienen.
5. Testkit zur Detektion eines Analyten, umfassend das Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, sowie Waschpuffer, Nachweismoleküle und Mittel zum Sichtbarmachen des Nachweisprozesses.
6. Vorrichtung zur Detektion eines Analyten, umfassend mindestens eine Pipettenspitze, in der sich makroskopische Granulat-Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 befinden
7. Testkit zur Detektion eines Analyten, umfassend die Vorrichtung gemäß der Ansprüche 6 bis 5 sowie Waschpuffer, Nachweismoleküle und Mittel zum Sichtbarmachen des Nachweisprozesses.
8. Testkit nach Anspruch 5 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen ELISA handelt.
9. Automatisches Gerät zur Detektion eines Analyten, umfassend mehrere Pipettenspitzen gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 sowie Behälter mit der Probe des Analyten,
Waschpuffern, Nachweismolekülen und Mittel zum Sichtbarmachen des
Nachweisprozesses, wobei die Pipettenspitzen nach dem walk-away-Prinzip nacheinander in die Behälter des Analyten, der Waschpuffer und der Nachweismoleküle eingetaucht werden und final die Substrat-Umsatzreaktion auf einem geeigneten Mittel sichtbar gemacht wird.
10. Verfahren zur Detektion eines Analyten, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
a) makroskopische magnetische Granulat-Partikel, die eine Oberfiächenbeschichtung aufweisen, an der der zu bestimmende Analyt spezifisch bindet, werden mit einer Probe in Kontakt gebracht, die einen nachzuweisenden Analyten enthalten, wobei der Analyt an die Granulat-Partikel gebunden wird, die sich entweder frei in der Probe befinden oder indem die Probe am Granulat vorbeigeleitet wird
b) nach einer kurzen Inkubation wird das Granulat mittels magnetischer Separation von der Probe getrennt und nachfolgend kurz gewaschen.
c) anschließend wird das Granulat mit Nachweismolekülen in Kontakt gebracht.
d) danach wird das Granulat erneut unter Anwendung der magnetischen Separation
gewaschen, um nichtgebundene Nachweismoleküle abzutrennen.
e) der finale Nachweis des Analyten erfolgt nach Zugabe einer Substratlösung und durch Messung der Substrat-Umsatzreaktion auf einem geeigneten Mittel bzw. einer direkten Messung der markierten Nachweismoleküle.
11. Verwendung der Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für das Online- Monitoring in Durchflusssystemen.
EP17768986.6A 2017-08-26 2017-08-26 Mittel und verfahren zur detektion von analyten mittels makroskopischer granulat-partikel Pending EP3673268A1 (de)

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WO (1) WO2019042521A1 (de)

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