CN111615632A - 借助于大颗粒粒子检测分析物的器件和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于执行免疫测定以便检测医学、生物、生物技术领域的不同分析物的可磁性分离的基于聚合物的大颗粒。这些大颗粒粒子的大小在横截面中介于0.5mm与10mm之间、优选介于1mm与5mm之间。优选地，这些大颗粒是可磁性分离的。根据优选的实施方式，这些基于聚合物的大颗粒位于移液器吸头中。
Description
说明书
本发明涉及可磁性分离的基于聚合物的大颗粒用于执行免疫测定以便检测医学、生物、生物技术领域的不同分析物的用途。
现有技术
除了分子生物学诊断，蛋白质、抗体等的分析和验证已成为现代医学实验室诊断、法医诊断、兽医实验室诊断以及食品和环境诊断中不可缺少的组成部分。
当分析物不以核酸形式存在时(核酸可能被增殖，以便通过分子生物学技术进行检测)，则总是使用免疫测定及其衍生技术。这涉及验证不同的分子，例如一般而言激素、毒素、醇类和蛋白质。此外，当追求例如整个细胞或病毒颗粒的快速验证时，免疫测定还作为所谓的快速测试使用。这些验证技术尤其是ELISA(用于验证蛋白质或核酸，R.Yalow etal.J.Clin.Invest..39,1157-75(1960)，印迹技术(用于验证蛋白质和核酸南部,E.M.J.Mol.Biol.98 503-517(1975)；Alwine JC et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 74,5350-5354(1977):Renart,J.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(7)，3116-3120(1979)，生物芯片技术(用于验证蛋白质和核酸，例如WO 8808875)，侧流型免疫测定试纸(用于验证蛋白质和核酸，例如US 4956302)或借助于生物条形码的验证(蛋白质和核酸，US20030054358A1)。在这些化验中，使用抗体以及核酸适配体、酶(例如酒精测试)或单独的化学活性分子(例如亚硝酸盐测试)作为检测分子。然而这些用于蛋白质的验证方法中的许多与昂贵的与设备相关的系统相关(ELISA读取器、电泳设备、印迹仪、垫圈等)并且同时要求耗时的方法(ELISA、免疫印迹、基于芯片的检测)。相反，侧流型化验形成可以简单并且快速执行的替代方案，然而通常由于其灵敏度只能有限地使用。
可实现的灵敏度形成上述验证技术的一般问题。这一方面在于只能受限地进行的信号放大，另一方面在于能够以对应测试形式使用的样品量很少(在常规的ELISA中最大为100μl)。在困难的样品材料(例如血浆、食品等)的情况下还产生了与可能的基质效应有关的问题。这些问题部分通过使用不同的低交叉缓冲液(LowCross-Puffern)解决[1]。用这些缓冲液使原始的样品稀释并且加入抗体。这虽然提高了抗体-抗原结合的特异性，但是由于初始材料的稀释导致灵敏度损失。
迄今用于解决关于有限的样品体积问题的技术提出使用珠，分析物可以结合在这些珠上[2]。所使用的珠的大小在此处于微米和纳米范围中。这首先看起来是非常有利的，因为珠在小的总体积下拥有非常大的表面积。将与抗体联接的珠加入到样品中并且随后与其上结合的抗原一起通过离心或者通过磁性分离被供应给另外的验证方法。此外，珠还被用于分离不同的样品成分，例如外泌体、细胞和分子。然而从溶液中分离珠始终是有问题的，因为尤其微米或亚微米尺度中的珠需要非常多的时间才能借助于磁场分离。要研究的样品黏度越大，需要的时间越多。因此，必须总是将在磁分离期间珠的损耗或非常长的分离时间计算在内。在使用更大的样品量时，这个问题对应地放大，因此在这个方法中总反应体积限制在1至2ml。另一个问题由于这些珠的磁性特性产生。这是珠聚集的原因，这在存放期间可能导致化验功能的损失。
所谓的基于大粒子的ELISA可能提供优点。使用官能化的大约0.6cm大小的大粒子用于ELISA是已公开的[4]，然而迄今已知的大粒子并不拥有磁性的或顺磁性的特性。这因此也不允许珠的磁性分离来执行验证反应。另一个问题在于，基于大粒子的验证方法的自动化可能性的缺乏。就ELISA自动化而言，一个非常有趣的发展是使用改性的移液器吸头[3]。在此，移液器吸头本身涂覆有抗体。在吸头的表面作为固相执行随后的ELISA。封闭的移液器吸头虽然提供对交叉污染的保护，然而在此可使用的样品材料的体积是非常有限的(作者使用30μl的样品)。此外，这个方法需要非常复杂的仪器和官能化的吸头的极其复杂的生产，并且因此对于常规诊断应用而言不能以成本有效/收回成本的方式使用。
发明目的
本发明的目的由已知的验证系统的所提及的缺点限定。
发明内容
已经根据本专利权利要求所述的特征实现了这个目的。
根据本发明的器件可以实现在适当时在没有复杂仪器技术的情况下从大的样品体积实现快速信号生成，实现非常高的敏感度，并且还适合任何类型的自动化过程。该器件形成了对执行迄今为止的ELISA应用的替代性新型器件。
根据本发明的用于验证分析物的器件使用特异的大颗粒粒子(“MGP”)。在此，这些粒子可以具有不同的形状和大小，优选具有在横截面中介于1mm与5mm之间的大小。这些粒子可以由已知的材料组成，这些材料具有在其表面承载有效用的检测分子(抗体、核酸适配体、化学基团等)的能力。此外，所使用的颗粒可以借助于磁体分离。
这种材料作为颗粒在商标名称
下是已知的。
根据本发明的器件同样具有ELISA方法需要的可涂覆的表面。进行涂覆后，根据本发明的颗粒可以用于执行验证反应。这基于用于ELISA应用已知的流程：
1.将带表面涂层的颗粒与样品接触，该样品包含待验证的分析物。这可以通过以下方式进行，使颗粒自由地位于样品中或将样品引导经过颗粒。在此，分析物特异地结合在颗粒上。
2.经过短暂的培养后，借助于磁性分离将颗粒与样品分离并且随后短暂清洗。
3.接着，将颗粒与验证分子(例如HRP标记的抗体)接触。
4.随后，在重新应用磁性分离的情况下清洗颗粒，以高效地分离出未结合的验证分子。
5.在添加基质溶液之后并且通过比色测量基质转化反应来进行最终验证。
与根据本发明的器件结合的分析物作为根据本发明的器件与其余的验证组分之间的桥梁起作用。验证组分在此可以是经标记的分子，这些分子一方面特异地结合在分析物上，并且另一方面允许检测的可能性(例如辣根过氧化物酶标记的抗体、以荧光材料标记的核酸适配体、与本身包含检测分子的粒子联接的另外的验证分子等)。
根据本发明的目的，根据本发明的器件以最理想的方式适合于实现验证反应。颗粒为分析物提供足够大的结合表面积。由于其大颗粒特性和其磁性特性，该颗粒可以在非常大的样品体积(例如1ml-100ml)中使用。为此优选地使用一种方法，其中样品被引导经过根据本发明的器件。因此实现，使包含在样品中的分析物积累地富集在颗粒的表面上。这种工作方式一方面可以实现提高方法的灵敏度，另一方面用更有利于结合的缓冲液稀释了带有分析物的样品并且由此使样品的基质效应最小化。相对于基于珠的ELISA应用，根据本发明的器件的另一显著的优点在于，由于颗粒的大小，可以非常快速地进行颗粒从样品中的分离。与此相反，纳米和微米大小的珠需要非常长的时间才能分离。完全不再出现珠的损耗。这在小珠的情况下是重大问题。
用于使验证方法自动化的特殊实施方式在于用根据本发明的颗粒填充的移液器吸头。样品的吸液和放液可以实现在根据本发明的器件的表面上期望的液体波动。通过移液步骤还可以使颗粒与验证组分接触。另一方面，在需要时可以在安置在吸头中之前已使颗粒与大体积的样品接触并且在磁性分离之后将颗粒转移到吸头中，这在ELISA[3]中在使用移液器吸头作为固相时是不可能的。
在将颗粒安置到移液器吸头的情况下，其磁性特性消退，然而可以利用其大颗粒特性：在移液步骤期间，MGP保持在移液器吸头中。将颗粒安置到移液器吸头中也解决了与邻近的样品交叉污染相关的问题。还可能的是，所有基于磁性分离的自动化系统用于待执行的ELISA，这用非磁性的大粒子是不可能的。此外还可以在移液器吸头中借助于磁场进行颗粒的分离。
根据本发明的器件可以特别好地用于例如通流系统的在线监测。在此，分析物与根据本发明的器件的结合在旁通管路中进行，并且随后可以在最短的时间内在管路外检测分析物。
下面应借助于实例详细说明本发明。这些实施例在此不形成对本发明的限制。
实施例1：
验证C反应蛋白质(CRP)
CRP的验证限值在商业化验中为1mg/L。将聚丙烯磁性颗粒(直径大约4mm)与抗CRP抗体(Senova有限公司)一起培养5小时。抗体通过疏水的交互作用吸附在颗粒表面上。接着，将官能化的颗粒被封阻。每个验证反应分别使用一个官能化的颗粒粗粒。使第二个抗CRP抗体与HRP(Horseradish peroxidase，辣根过氧化物酶)共轭，用于随后的比色验证。
制备了CRP抗原的稀释系列：
1：30mg/L，2：3mg/L，3：1.5mg/L，4：0.75mg/L，5：0.37mg/L，0.06mg/L
如下执行免疫测定：
1.将磁体颗粒粗粒与来自稀释系列的50μl CRP抗原和150μl PBS接触。
2.在旋转运动下培养30分钟
3.用常规的ELISA清洗缓冲液(AJRobescreen有限公司)清洗3次。伴随磁体颗粒的磁分离。
4.将HRP标记的抗CRP检测抗体添加到颗粒粗粒中。
5.在旋转运动下培养30分钟
6.用常规的ELISA清洗缓冲液(AJRobescreen有限公司)清洗3次。伴随磁体颗粒的磁分离。
7.将磁体颗粒粗粒转移到兼容ELISA读取器的微量滴定板上。
8.HRP介导的比色式TMB着色用于在450nm以及在630nm的参考波长下时在ELISA读取器中测量样品(Thermo Fisher)。测量结果(来自3次反应的平均值)见表l。
表1在450nm下的测量值
| 编号 | 浓度 | 测量值OD<sup>450nm</sup> |
| 1 | 30mg/L | 2.859 |
| 2 | 3mg/L | 1.488 |
| 3 | 1.5mg/L | 0.725 |
| 4 | 0.75mg/L | 0.374 |
| 5 | 0.37mg/L | 0.185 |
| 6 | 0.06mg/L | 0.097 |
| 7 | 无Ag | 0.060 |
| 8 | ELISA BG | 0.055 |
图1示出减去空白对照的测量值的图示。
实验表明直至低于常规CRP-ELISA检测限的检测限的抗原CRP低背景检测。
实施例2：
在检测CRP时样品体积对信号强度的影响
用于实验的磁体颗粒的准备如在实施例1中所述地进行。
抗原CRP以0.03mg/L的浓度制备。
磁体颗粒粗粒以如下样品体积来培养：
1.50μl，2.100μl，3.1ml，4.5ml，5.10ml
培养一小时后，如在实例1中准备颗粒粗粒，用于以ELISA读取器进行检测。测量的结果见表2(来自3次测定的平均值)
表2在450nm下的测量值
| 编号 | 体积 | 测量值OD450nm |
| 1 | 50μl | 0.062 |
| 2 | 100μl | 0.192 |
| 3 | 1ml | 0.82 |
| 4 | 5ml | 1.016 |
| 5 | 10ml | 1.041 |
| 6 | 100μl仅PBS | 0.095 |
| 7 | ELISA BG | 0.055 |
图2示出减去空白值的测量值的图示。
实验示出，样品体积的增大实现了更高的灵敏度，这形成相对于常规ELISA(其中样品体积受到微量滴定板的大小限制)的优点。
文献：
[1]http://www.candor-bioscience.de/methoden/elisa.html
[2]A new method of measuring C-reactive protein,with a low limit ofdetection,suitable for risk assessment of coronary heart disease.Eda S,Kaufmann J,Molwitz M,Vorberg E.Scand J Clin Lab Invest Suppl.1999；230:32-5.[一种检测C反应蛋白的新方法，检测限低，适用于冠心病的风险评估。Eda S,Kaufmann J,Molwitz M,Vorberg E.Scand J Clin Lab Invest Suppl.1999；230:32-5.]。
[3]An automated ELISA System using a pipette tip as a solid phase anda pH-sensitive field effect transistor as a detector Hitoshi Tsuruta,HideakiYamada,Yukiko Motoyashiki,Keiko Oka,Chieko Okada,Michihiro Nakamura Journalof Immuno logical Methods 183(1995)221-229[一种自动ELISA系统，使用移液器吸头作为固相，并使用pH敏感的场效应晶体管作为检测器,Hitoshi Tsuruta,Hideaki Yamada,Yukiko Motoyashiki,Keiko Oka,Chieko Okada,Michihiro Nakamura Journal ofImmuno logical Methods 183(1995)221-229]
[4]Vadim V Shmanai,Tamara A Nikolayeva,Ludmila G Vinokurova,andAnatoli A Litoshka Oriented antibody immobilization to polystyrenemacrocarriers for immunoassay modified with hydrazide derivatives of poly(meth)acrylic acid BMC Biotechnol.2001；1:4.[Vadim V Shmanai,Tamara ANikolayeva,Ludmila G Vinokurova和Anatoli A Litoshka定向抗体固定在聚苯乙烯大载体上，用于用聚(甲基)丙烯酸的酰肼衍生物修饰的免疫测定,BMC Biotechnol.2001；1:4.]。
Claims (11)
1.一种用于检测分析物的器件，该器件包括磁性的大颗粒粒子，其特征在于，这些大颗粒粒子具有表面涂层，待测定的分析物特异地结合在该表面涂层上。
2.根据权利要求1所述的器件，其特征在于，这些大颗粒粒子的大小在横截面中介于0.5mm与10mm之间、优选介于1mm与5mm之间。
3.根据权利要求1或2所述的器件，其特征在于，这些大颗粒粒子由聚合物与磁性或顺磁性的材料之间的聚集物组成并且因此能够磁性分离。
4.根据权利要求1至3之一所述的器件，其特征在于，抗体、核酸适配体或化学官能团作为表面涂层。
5.一种用于检测分析物的测试套件，该测试套件包括根据权利要求1至4之一所述的器件、以及清洗缓冲液、验证分子和用于使验证过程可视化的器件。
6.一种用于检测分析物的设备，该设备包括至少一个移液器吸头，根据权利要求1至4之一所述的大颗粒粒子位于该移液器吸头中。
7.一种用于检测分析物的测试套件，该测试套件包括根据权利要求6至5所述的设备、以及清洗缓冲液、验证分子和用于使验证过程可视化的器件。
8.根据权利要求5和7所述的测试套件，其特征在于，涉及ELISA。
9.一种用于检测分析物的自动设备，该自动设备包括多个根据权利要求6至8之一所述的移液器吸头以及带有该分析物的样品的容器、清洗缓冲液，验证分子和用于使验证过程可视化的器件，其中根据走开原理(walk-away-Prinzip)将移液器吸头相继地浸入该分析物的容器中、该清洗缓冲液中和该验证分子中，并且最后在合适的器件上使基质转化反应可视化。
10.一种用于检测分析物的方法，其特征在于以下步骤：
a)将具有表面涂层的磁性大颗粒粒子与样品接触，待测定的分析物特异地结合在该表面涂层上，该样品包含待验证的分析物，其中将该分析物结合在这些颗粒粒子上，这些颗粒粒子自由地位于样品中或者将该样品引导经过该颗粒
b)经过短暂的培养后，借助于磁性分离将该颗粒与该样品分离并且随后短暂清洗。
c)接着，将该颗粒与验证分子接触。
d)随后，在重新应用磁性分离的情况下清洗该颗粒，以分离出未结合的验证分子。
e)在添加基质溶液之后并且通过在合适的器件上测量基质转化反应或直接测量经标记的验证分子来进行该分析物的最终验证。
11.根据权利要求1至4之一所述的器件用于在线监测通流系统的用途。
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