JP6342433B2 - 関心対象のための新規のフロー分析方法 - Google Patents

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Description

本発明は、粒子の凝集体の形成を経由する液体溶媒における関心対象（
）（または要素）のフロー分析方法に関し、該粒子は、かかる関心対象に特異的な少なくとも１つの機能的分子（さらに本明細書本文では、受容体として言及される）で表面に機能付加される。
本発明によれば、「関心対象」という用語は、少なくとも２つの受容体によって特異的に認識され得る限り任意の物質を意味することが意図される。既知の特定の受容体を有するかぎり、抗体もしくはアプタマーと反応し得る任意の抗原、相補的な核酸分子によって認識され得る任意の核酸分子、任意の細胞もしくは細胞片、または任意の微小生物もしくは微小生物断片、あるいはその他の任意の化学物質の例によって、限定されることなく、関心対象として言及がなされ得る。従って、タンパク質、抗体、核酸、細胞、細胞片、微小生物（例えば、バクテリア、特定の菌類、緑藻類またはその他のウイルス）、微小生物断片または他の化学分子を定量するために本発明による方法を使用することは可能であるように思われる。
ほとんどの実験室応用では、生物体液内の生化学化合物の分析には反応が必要であり、該反応は、求められる物質と、かかる物質に特異的な受容体との間の結合を確立することを目標とする。この受容体は、例えば、タンパク質を検出することに関連する抗体またはアプタマー、または相補的な核酸を検出することに関連する核酸配列であり得る。
先行技術において広く使用される免疫診断システムは、受容体でのマイクロ粒子またはナノ粒子の機能付加に基づき、該受容体は、求められる関心対象を認識し、関心対象に結合することができ、求められるかかる関心対象の存在下において、求められるかかる関心対象に前記受容体によって結合した少なくとも１の機能付加された粒子から構成される微粒子複合体、または関心対象によって互いに結合した少なくとも２つの機能付加された粒子を含む微粒子凝集体の形成を可能にする。
その後に、形成された微粒子複合体または凝集体の検出はしばしば光学的測定を用いて行われる。感度は、これに関する限り、非常に多くの場合、使用される検出原理及び関連器具に関係している。
例えば、求められる関心対象が、既定の溶媒に存在する抗原である場合、前記抗原が、いくつかのエピトープを有し得る。かかる抗原に対する抗体が、その後、粒子に機能付加するために、使用される粒子の表面に化学的に付着し得る。かかる機能付加された粒子が溶媒に導入される場合、前記機能付加された粒子及び前記抗原の間で反応が起こり得る。従って、第１の機能付加された粒子は、求められる抗原を捕捉し、第１粒子複合体を形成し得る。しかしながら、当然ながら、ブラウン運動のため、第１の機能付加された粒子に付着したこの同じ抗原が、第２の粒子を捕捉し得、該第２の粒子自体が機能付加される。従って、２つの機能付加された粒子が、抗体‐抗原‐抗体結合の形成によって結合され、ひいては凝集体を構成する。その結果、同じ原理に従って互いに結合された多数の粒子を結合する更に大きな凝集体を形成するように、反応が継続し得る。
同じ溶媒内に凝集体が存在することにより光散乱が増大し、かかる溶媒を通過する光線の強度が減少する。これが、光学比濁法の原理であり、該光学比濁法の主な利点は、使いやすく、価格競争力のある装置を製造するという構想を可能にすることである。
しかしながら、かかるシステムの性能水準は比較的限定される。実際には、合理的な期間内に結合を形成することを可能にするために、粒子濃度が多量でなければならない。更に、反応しない粒子（結合せずに残る導入粒子）は、有用なシグナルに寄与しない。他方、光を散乱させる能力のおかげで、これらは、背景ノイズが生じることに寄与し、該背景ノイズが、測定のために煩雑であることが判明し得る。
結合せずに残る導入粒子の量を減少させるため、粒子間の衝突頻度を増大させるための技術が開発された。これらの方法は、磁界［Baudry J. et al., PNAS、 １０３ （２００６） １６０７６‐１６０７８］または電界［Iwata K. et al., Annals of Chemical Biochemistry, ４６ （２００９） １１７‐１２２］、あるいは超音波［Wiklund M., Hertz H.M., Lab on a Chip, ６ （２００６）, １２７９‐１２９２］を使用して、局所的に粒子濃度を増加させ、また、粒子凝集の形成を促進し得る。
しかしながら、この場合であっても、他の問題に直面し得る。例えば、１ピコモル濃度（ｐＭ）より小さい関心対象の濃度は、特に、光シグナルの変動を引き起こす溶媒の熱変動に起因して、通常、検出できない。
サンプル中、好都合には生物学的サンプル中の関心対象、特に生物学的関心対象のフロー測定による検出及び分析が、当業者に知られている。全ての先行技術の方法は、マイクロ粒子を使用し、該マイクロ粒子の分散レベルは、２パラメータの表現空間において識別されることを可能にする程度に十分に低い。例えば、前方散乱（ＦＳＣ）×側面散乱（ＳＳＣ）の２パラメータによる表現が、任意の種類のコロイド凝集体の存在を識別することを可能にし、２パラメータの表現処理が、これらの凝集体の数及び特質を知ることを可能にする。しかしながら、２つより多い粒子の凝集体が形成される場合、単分散の粒子の使用であっても凝集体の集団が互いに重複することを抑制しない。
通常、関心対象の濃度は、それゆえ、凝集体の多重性を考慮することなく、分離された粒子の数に対する形成された凝集体の数の割合を計算することによって決定される。高濃度の関心対象において、凝集体は、多数の粒子からなり得る。あいにく、先行技術の定量方法では、凝集体のサイズがどのようなものであっても、これらの凝集体は考慮されるが、形成された結合の数によって重みをつけられない。これらは、そのため、凝集体のより大きな状態を示すにもかかわらず、関心対象によって互いに結合された２つの粒子によって形成された凝集体として定義されるダブレットと同じサイズを有するものとみなされるだろう。従って、関心対象によって作り出されたかなりの数の結合が無視され、その結果として、測定の正確性が、高濃度の関心対象において損なわれるだろう。
更に、フロー検出のための先行技術では、粒子が、求められる関心対象の正確な分析用の検出を可能にするために十分なレベルの量を有する必要がある。反応溶媒においてランダムにとられた２つの粒子が凝集体の形成を引き起こすはずであり、該凝集体の実効断面積が実質的に不変であるに違いないため、理想的には、粒子が、特にその体積に関して同一である必要がある。通常、使用される粒子が球体であり得、該球体の直径が、粒子の分別の質の特性を示すある標準偏差を伴って平均値の周囲にランダムに分散され得る。その結果、粒子サイズの変動係数が、１０％以下であり得ると考慮される。それゆえに、先行技術では、フロー測定を用いる生物学的テストを実施するには、十分な品質の粒子が必要であり、該粒子のサイズ分散が十分に管理され、再現可能である必要がある。
１０％より小さい変動係数が、粒子のため、その結果として測定のために高い原価をもたらす多量の製造上の注意を必要とするため、このことが産業上の強い制約を構成する。また、特に、蛍光または磁性等の特定の物理的特性を組み合わせて粒子の物理的特性を付与しようとする場合には、粒子サイズの変動係数をうまく管理することは、実現が困難である。
このことが起こるので、かかる特性が、凝集反応を早めるために望ましくなり得る。
粒子のフロー検出を用いて関心対象を検出するための他の技術が存在する。言及は、ルミネックス技術からなり得、該ルミネックス技術は、かかる抗原に特異的な抗体で覆われた天然蛍光性のマイクロメーター粒子（一次蛍光）によって抗原を検出する。かかる抗原が粒子を覆う前記特異的抗体によって捕捉されるとすぐに、二次抗体によって二次的に標識され、該二次抗体は、前記粒子の一次蛍光とは異なる波長でそれ自体が蛍光性である（二次蛍光）。二次蛍光は、二次抗体‐抗原複合体の検出のために使用される。しかしながら、この方法は、第１に、インキュベーション及びそれから、第２に、測定に干渉し得る過剰な試薬を除くための洗浄といういくつかのステップを必要とすることが容易に理解される。それゆえ、１のステップのみを必要とする凝集テストよりも実行することがより長く、より複雑になる。
多数の調査研究後、本発明者らは、先行技術の問題を克服しつつ、所定の関心対象と接触する機能付加された粒子の懸濁液の凝集状態を決定することに基づいて、所定の関心対象を定量するための方法を開発した。特に、本発明による方法は、先行技術の場合とは異なり、無視できないサイズ分散を有する機能付加された粒子のセットに適用され得る。
本発明は、それゆえ、先行技術の公知の方法の全てまたは一部の難点を克服する方法により、求められる関心対象／機能付加された粒子の反応中に形成された凝集体のフロー測定によって、予めサンプリングされた所定の関心対象を定量するための新規の方法を提供することを目的とする。
本発明によれば、「凝集体」という用語は、関心対象によって互いに結合された少なくとも２つの機能付加された粒子（ダブレット）を含む微粒子凝集体を意味することが意図される。それゆえ、本発明によれば、「凝集体」という用語は、関心対象によって互いに結合される２つの機能付加された粒子、またはいくつかの関心対象によって互いに結合される２つより多くの機能付加された粒子からなる任意の微粒子凝集体に付与されると理解される。単独の関心対象に結合された機能付加された粒子が、シングレットであるとみなされるとも理解される。
本明細書本文では、「シングレット」という用語は、それゆえ、結合のない機能付加された粒子、及び単独の機能付加された粒子に結合された関心対象の両方を意味することが意図される。
本発明による方法は、それゆえ、いわば凝集テストのようなものであり得る（または他の接合テスト）。
凝集テストにおける有用なシグナルは、粒子間において作り出された結合の数である。この測定結果は、方法の開始時に存在し、かつ、所定体積（Ｖ）において測定されたシングレットの数（Ｎ１）と、凝集反応の終了時にまだ存在し、かつ、方法の終了時に同じ体積（Ｖ）において測定された凝集体及びシングレットの数（Ｎ２）との間の違いにより、所定の体積に関して得ることができる。この違い（Ｎ１‐Ｎ２）は、測定中に２つの機能付加された粒子間に形成された生物学的結合の数に相当する。Ｎ１が非特異性凝集体（関心対象以外の任意の手段により互いに結合した少なくとも２つの機能付加された粒子からなる凝集体）を含む場合、本発明による違いによる測定結果が、かかる非特異的凝集体を省くことを可能にする。
本発明によれば、有用なシグナルが、凝集の程度（ＤＡ）であり、該凝集の程度が、分析すべきかかる関心対象を含む液体溶媒における測定の開始時、言い換えれば、導入後及び凝集前に存在するシングレットの総数（Ｎ１）に対する、形成された生物学的結合の数（Ｎ１‐Ｎ２）に相当する。従って、本発明によれば、凝集の程度が、ＤＡ＝（Ｎ１‐Ｎ２）／Ｎ１によって表現される。
従って、測定結果が、システムの初期状態に対して標準化される。このことが、反応混合物作製のエラーの影響を減少させることに寄与し得る。
本発明によれば、未知のサンプルの関心対象の濃度が、関心対象の既知の量の存在下においてかかる機能付加された粒子の凝集の程度を測定することによって予め確立されたキャリブレーションカーブ上における測定された凝集の度合いについて決定され得る。
前述の事柄から、本発明による新規の定量方法は、一方では、反応開始時の反応溶媒に存在するシングレットの数（Ｎ１）を決定することを必要とし、他方では、反応溶媒に形成された凝集体と、凝集反応の終了時にまだ存在するシングレットとの総数（Ｎ２）を決定することを必要とすると理解される。
数（Ｎ１）または（Ｎ２）は、以下の方法で測定され得る:各粒子または凝集体は、光学的、電気的または他の方法によって検出され得る。従って、検出器を横切る各粒子または凝集体の通過により、記録可能なパルスが生じる。集計時間中のパルスの総数が、その結果、決定され得る。凝集ステップより前に、シングレットの数Ｎ１が測定される。凝集ステップ後、凝集体及び残っているシングレットの数Ｎ２が決定される。本発明によれば、k‐１個の結合によって凝集されたｋ個の粒子を含む形成された各凝集体は、そのサイズがどうであっても、単一の要素として数えられる。
更に、本発明による方法は、シングルパラメータまたはマルチパラメータの表現において集団の分離を省略することを可能にする。
本発明による方法は、検出される対象の１以上の物理的パラメータの多様性に依存することを回避しつつ、結合の数を測定することを可能にする;物理的パラメータの多様性に依存しないことの利点は、小さな凝集体が、大きな粒子よりも小さなサイズを有し、調査された対象の不適切な分類を引き起こし得るということである。
本発明による方法は、高濃度の関心対象においても形成された各凝集体が個別に考慮されるように、先に記述された通りの全ての凝集体を考慮することを可能にする。従って、関心対象によって形成された全ての結合が考慮され、測定の正確性が、その結果、特に高濃度の関心対象の場合に改善される。
本発明による方法の別の利点は、粒子のより多様な選択肢が、反応を実行するために利用可能であるという事実にある。特に、超常磁性の特質等の都合の良い特性を有する粒子は、既存の検出技術がそのサイズ分散のためにその使用を妨げるのに対し、これらの粒子が、反応を促進するために使用され得る。
従って、本発明の第１の主題は、液体溶媒において少なくとも１の関心対象を定量するための方法であって、その特徴が、分析すべき前記関心対象に特異的な少なくとも１の受容体で表面に機能付加された粒子を使用し、かつ該方法では:
- 第１ステップにおいて、かかる機能付加された粒子を分析すべき関心対象に接触させ、 既定時間（t１）の混合が行われ、得られた前記混合物の体積（ｖ）がすぐにサンプリ ングされ、非凝集粒子（シングレット）の数Ｎ１が、フロー測定手段によってこの中で
数えられ;
- 第２ステップにおいて、ステップ１において得られた前記混合物が凝集体の形成を可
能にするのに十分な時間（t２）、インキュベートされ、体積（ｖ）がサンプリングさ れ、反応後の体積（ｖ）に含まれる非凝集粒子及び凝集体の両方に相当する数Ｎ２が、
ステップ１において使用されたものと同じフロー測定技術を用いて数えられ;
- 第３ステップにおいて、凝集の程度ＤＡ＝（Ｎ１‐Ｎ２）／Ｎ１（計算されたＤＡ）
が決定され、予め定められた濃度（［Ｃ］）の前記関心対象において同じ前記関心対象
とともに同じフロー測定技術を用いて得られる凝集の前記程度を測定することによって
先に作成される標準範囲（ＤＡ＝ｆ（［Ｃ］）と、前記計算されたＤＡを比較すること
によって、前記関心対象が定量される。
例として、分析すべき関心対象が、生物体液等の溶媒に含まれ得る。該生物体液のうち、体液、例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿または脳脊髄液、あるいは骨髄等の他の組織抽出物である。例えば、浄水場廃液（les rejets de stations
）、摂取を意図した水等の言及もなされ得る。好都合には、本発明は、生物体液または組織抽出物を目的としている。
機能付加された粒子間の衝突は、自然的なブラウン運動に起因する。かかる運動は、いくつかのパラメータによって決まり、該パラメータが、必然的に衝突の頻度に影響する。最初の衝突が起こる前に十分な期間を有するための好ましい状態を作り出し、該期間内に、かかる凝集反応が起こる前に溶媒を分析することにより、例えば、反応開始時に存在するシングレットの量（Ｎ１）を測定することができるように、これらのパラメータを調整することができる。
更に、粒子間の衝突頻度を増大させ、ひいては凝集反応を大幅に早めるための技術が知られている。本発明による方法は、粒子間の衝突頻度を増大させるための公知技術の方法の間に適用することにより、凝集反応を促進するかかるステップを含むことができ、または含まなくてもよい。
従って、本発明によれば、定量方法が、粒子間の衝突頻度を増大させるためのステップも含み、第１ステップの終了と、第２ステップの開始または第２ステップに組み込まれるその他のものの開始との間にかかるステップがあってもよい。
本発明によれば、「機能付加された粒子」という用語は、先行技術において記載された任意のタイプの機能付加された粒子を意味し、本発明に従って使用され得ることが意図される。例として、金属ビーズまたは、例えばポリスチレンビーズなどのプラスチックビーズ、またはシリカまたは高分子粒子あるいは、例えば、ビニールカバーをした酸化鉄粒子等の混合組成物のその他の粒子（混合粒子）、またはその他の非固体の粒子、例えば、リポソームの言及がなされ得る。優先的には、本発明によれば、混合粒子が使用され得る。
本発明によれば、かかる粒子のサイズが、５ｎｍ及び１００００ｎｍの間であり得、より優先的には、１００ｎｍ及び１０００ｎｍの間であり得る。
本発明の１の形態によれば、かかる粒子は、磁界または電界あるいは超音波を使用する技術等の粒子間の衝突頻度を増大させるために使用され得る技術に反応し得、または反応するように作製されていてもよい。優先的には、磁界が、本発明に従って使用されるだろう。
磁性粒子を手段として、常磁性の、反磁性の、強磁性のもしくはフェリ磁性の、またはその他の超常磁性の粒子が本発明に従って使用され得る。かかる粒子の使用により、凝集ステップを早めることや、より大きなシグナルを生成することが可能になる。これらが磁界にさらされる場合、これらの粒子が鎖状に配置される。局所濃度が増大し、反応が早められる。
従って、凝集体が低濃度の関心対象及び粒子を有して形成され得る。形成された生物学的結合の数は、その結果、低濃度の様々な種類に起因して低い。フロー測定方法は、少量の粒子を測定するために特に適し、それゆえ磁性粒子の凝集の程度を測定するための本発明による定量方法において好都合に使用され得る。
当業者は、困難性を伴うことなく、実行したいと望む測定に適した粒子を多数の公知の供給業者から選択することができるだろう。好都合には、本発明によれば、適切な磁界では、鎖を形成しながらブラウン運動の影響下において磁性粒子が自己を回転させる能力を保持するように、超常磁性粒子を使用することが可能である。
結果的に、任意の公知のフロー測定方法、例えば、フローサイトメトリーあるいはその他のキャピラリー電気泳動法またはマイクロ流体チャネルにおけるフローが、本発明に従って使用され得る。好都合には、本発明によれば、フローサイトメトリーが使用され得る。
本発明によれば、前記特定の受容体が、かかる受容体が関心対象と結合可能である限り、天然又は合成であり得、例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、サッカリド、脂質、ホルモン、及び任意の他の生物学的または合成的物質であり得る（Antibodies a laboratory manual E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
必要であれば、当業者は、困難性を伴うことなく、粒子に受容体を融合させることができるだろう。
これらの受容体は、当業者に知られた様々な技術、例えば、吸着、共有結合性及び／または高親和性の相互作用により、粒子の表面に固定され得る。情報については、G. T. Hermansonによるハンドブック"Bioconjugate Techniques"（Academic Press、 １９９６）に言及がなされ得る。
本発明による方法は、当業者に公知の反応状態を使用し、当業者は、それ故に、該反応状態を実施することに何の困難もないだろう。
本発明によれば、非イオンの（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、イオンの（コール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム）または他の両性イオンの（３‐［（３‐コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］‐１‐プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ））洗浄剤、タンパク質溶液（牛血清アルブミン（ＢＳＡ））、または高分子化合物（ポリビニルアルコール（ＰＶＡ））を第１ステップの反応混合物に加えることが可能である。
洗浄剤を加えることにより、関与する関心対象がないにもかかわらず、衝突後に２つの粒子が結合したままになることを抑制することが可能になる。従って、非特異性の凝集が抑制される。
本発明によれば、第１ステップの持続時間は、短く、溶媒においてほぼ粒子の急速な混合時間t１のみ持続する。従って、第１ステップは、数秒から数分持続し、好都合には多くても３分、非常に好都合には２分持続し得る。
本発明によるこの方法の第１ステップにより、反応開始時にサンプリングされた体積（ｖ）における凝集されていない機能付加された粒子の数Ｎ１を測定することが可能になる。このため、評価され、分析されるべき関心対象物を含むサンプル体積（ｖ）に粒子が導入されるとすぐに、反応混合物のフラクションがサンプリングされ得る。粒子の導入及び前記混合物のアリコートのサンプリングの間の経過時間は、液体溶媒における粒子の受動的凝集のための時間に比べて短いため、この値Ｎ１が、反応開始時にかかる液体溶媒に導入された凝集されていない機能付加された粒子の濃度に相当する。
本発明によれば、第２ステップの持続時間は、５秒及び３時間の間、優先的には５分及び６０分の間であり得る。この時間は、全サイズの最大量の凝集体形成を可能にし得るが、測定の合理的な合計持続時間に適合したままである必要がある。
本発明の１の変形例によれば、本方法の第２ステップの直前または第２ステップ中に、磁界、電界または超音波が、粒子間の衝突頻度を増大させるために適用され得る。
例えば、磁界が適用される場合、溶媒は、１回から１０回の３ｍＴから１００ｍＴの界サイクルを経ることができ、緩和期間（磁界は適用されない）と交互に起こる、各サイクルのために１から６００秒、優先的には１００から５００秒、好都合には３００秒の持続時間を有することができる。
本発明によれば、本方法の第３ステップにおいて、凝集の程度ＤＡ＝（Ｎ１‐Ｎ２）／Ｎ１が計算される（計算されたＤＡ）。サンプルにおける関心対象の濃度が、計算されたＤＡをＤＡの標準範囲と比較することにより、その後決定され得、該ＤＡの標準範囲は、既知の量の同一の関心対象の存在下における粒子の凝集を測定することによって予め構築される。
図１は、本発明による方法の原理を図示し、図の左部分では、全く結合していない機能付加された粒子及び単独の機能付加された粒子に結合した関心対象（シングレット）を示す。本発明による方法の第１ステップにおいて測定されたシングレットの数Ｎ１である。一方においては、図の右部分では、凝集後にまだ存在するシングレット（ｎα）、または凝集体に関与する機能付加された粒子（ｎβ）、シングレット及び凝集後の凝集体の数Ｎ２に相当する合計ｎα＋ｎβを示す。従って、Ｎ１‐Ｎ２（１０‐６＝４）が、形成されたｎβ（３）個の凝集体における結合の数に相当し、この理論的なケースでは、凝集の程度（ＤＡ）は、（Ｎ１‐Ｎ２）／Ｎ１＝（１０‐６）／１０＝０．４に等しいと理解される。 図２は、１ｐＭのＣＲＰの存在下における凝集のための自動装置による検出結果を示す。連続線の曲線は、凝集前に自動測定装置によって３０秒間検出されたパルスを示す。これらのパルスの合計がＮ１に相当する。破線の曲線は、凝集後の自動測定装置によって３０秒間検出されたパルスを示す。これらのパルスの合計がＮ２に相当する。 図３は、様々なＣＲＰ濃度（０から５ｐＭ）に対する５００ｎｍの粒子の凝集の程度を測定することによって得られた標準曲線を示す。 図４は、様々なＣＲＰ濃度（０から１５ｐＭ）に対する２００ｎｍの粒子の凝集の程度を測定することによって得られた標準曲線を示す。 図５は、ビオチン化ウシ血清アルブミン（０から５００ｐＭ）の様々な濃度に対する２００ｎｍの粒子の凝集の程度を測定することによって得られた標準曲線を示す。
本発明の他の主題、特徴及び長所が、次に続く実施例から明らかになり得る。
実施例１：直径５００ｎｍの超常磁性粒子を用いるＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）の分析
抗ＣＲＰポリクローナル抗体（Ｌ６６６１６Ｇ, Meridian Life Science）（ビーズ１mg当たり約１０μｇの抗体）を直径５００ｎｍの超常磁性粒子に融合した（MasterBeads Carboxylic Acid 0215, Ademtech）。
分析は、変動する濃度のＣＲＰを含むｐＨ８．５の３０ｍＭグリシン緩衝剤において行った（ABX Pentra CRP cal, Horiba Medical）。
ＣＲＰがない状態では、粒子間の結合の形成を制限するために、タウロコール酸（Ｔ４００９, Sigma-Aldrich）を反応混合物中の最終濃度３ｍＭで溶媒に加えた。
溶媒における粒子の最終濃度は、約０．６ｐＭである。４８８ｎｍで作用するレーザを用いて粒子に光を当てることにより、フロー分析を行う。ハママツブランドのモデルＨ９３０７‐０２の光電子増倍管を用いて測定細胞を通過する各対象に対して、９０°での分散を測定する。
様々な試薬を接触させた後、溶媒を、２分間インキュベートするために放置する。この２分の間、５３μＬの体積（Ｖ１）の混合物を、サンプリングし、フローアナライザに注入する。後者が体積Ｖ１を１／１００に希釈し、３５．５μＬの体積Ｖ２のこの混合物において３０秒のカウントを行う。前記体積Ｖ２において反応開始時の懸濁液に存在するシングレットの数（Ｎ１）を、その後決定する。
２分後、溶媒は、１０ｍＴにおいて３０秒、その後に３ｍＴにおいて３００秒、最後に、０ｍＴにおいて緩和の３０秒からなる５つの界サイクルを経る。
磁化サイクル後、先にサンプリングされた体積（５３μＬ）と同一である混合物の第２体積（Ｖ１）をサンプルし、同じ準備サイクルによるフローアナライザによって分析する。この測定により、形成された凝集体の数（Ｎ２）を決定することが可能になる。
図２は、１ｐＭのＣＲＰの存在下において凝集するための自動装置による検出結果を示す。３０秒間、体積（Ｖ２）において検出された要素の数を、かかる要素に関連付けられたパルスの高さの関数として示し、該要素自体が、対象のサイズの関数である。凝集前に（連続線）、懸濁液が、存在する多数のサイズの粒子の複雑な分布を有することが留意される。凝集後（破線）、粒子凝集体に明確に関連付けられた集団がみられないが、検出された対象の総数（曲線下の領域）が、明確に減少した。
標準曲線の確立:
先に記述されたプロトコルに従って、様々なＣＲＰ濃度（０から５ｐＭ）について凝集の程度を決定した。結果を図３に示す。
凝集の程度が、溶媒中のＣＲＰ濃度とともに実際には変化することが留意される。ＣＲＰが存在しないいくつかの反復において測定された標準偏差に基づいて、このシステムの検出限界を、約３５分の分析時間、２５ｆＭのＣＲＰにおいて評価できた。
未知の溶液におけるＣＲＰ濃度の分析:
未知のＣＲＰ濃度を有する血清サンプルを、ｐＨ８．５の３０ｍＭグリシン緩衝液中で１００００倍に希釈した。先に用いられたように、２７．６μＬのこの混合物を、直径５００ｎｍの機能付加された同じ超常磁性粒子（MasterBeads Carboxylic Acid ０２１５, Ademtech）及びタウロコール酸も含む３０ｍＭのグリシン緩衝液に加えた。溶剤の最終体積は、０．６ｐＭの粒子及び３ｍＭのタウロコール酸の最終濃度を有する６００μＬである。
様々な試薬を接触させた後、溶剤を２分間、インキュベートするために放置する。この２分の間、５３μＬの体積（Ｖ１）の混合物をサンプリングし、フローアナライザに注入する。後者が、体積Ｖ１を１／１００に希釈し、３５．５μＬの体積（Ｖ２）のこの混合物において３０秒のカウントを行う。かかる体積Ｖ２において反応開始時の懸濁液に存在するシングレットの数（Ｎ１）をその後決定する。
２分後、溶剤は、１０ｍＴにおける３０秒、３ｍＴにおける３０秒及び０ｍＴにおける緩和の３０秒からなる５回の界サイクルを経る。
磁化サイクル後、先にサンプリングされた体積（５３μＬ）と同一の混合物の第２の体積（Ｖ１）を、Ｎ２の値を決定するために第１のサンプリングと同一の方法でサンプリングし、分析する。
従って、先に記載されたプロトコルによれば、未知のサンプルのために、ＤＡ＝０．２３の凝集の程度を決定することができた。これをキャリブレーション曲線に関連づけることにより、０．１７ｐＭ、すなわち、３７ｎＭの未知の血清におけるＣＲＰ濃度と等しい反応溶剤においてＣＲＰ濃度を決定することが可能になる。
実施例２:２００ｎｍの超常磁性粒子を用いるＣＲＰの分析
標準曲線の確立:
粒子１mg当たり約３５μｇの抗ＣＲＰポリクローナル抗体（Ｌ６６６１６Ｇ, Meridian Life Science）を、直径２００ｎｍの磁性粒子に融合させた（Carboxyl Adembeads, ０２１２, Ademtech）。
分析を、変動する濃度のＣＲＰ（ABX Pentra CRP cal, Horiba Medical）を含む３０ｍＭ、ｐＨ８．５のグリシン緩衝液において行った。
ＣＲＰがない場合に粒子間の結合の形成を制限するため、サポニン（３０５０２‐４２, Nacalai Tesque）を、洗浄剤としての反応混合物において０．０８重量％で溶剤に加えた。
溶剤における粒子の最終濃度は、約３ｐＭである。
様々な試薬を接触させた後、溶媒を２分間のインキュベートのために放置する。これらの２分の間、５３μＬの体積（Ｖ１）の混合物をサンプリングし、フローアナライザに注入する。後者は、体積Ｖ１を１／１２００に希釈し、３５．５μＬの体積（Ｖ２）のこの混合物において３０秒間のカウントを行う。前記体積Ｖ２において反応開始時の懸濁液に存在するシングレットの数（Ｎ１）を、その後決定する。
２分後、溶媒は、５０ｍＴにおける３０秒、２０ｍＴにおける３００秒及び０ｍＴにおける緩和の３０秒からなる２回の磁界サイクルを経る。
磁化サイクル後、Ｎ２の値を決定するために第１のサンプリングと同一の方法で、先にサンプリングされた体積（５３μＬ）と同一の混合物の第２の体積（Ｖ１）を、サンプリングし、分析する。この測定により、形成される凝集体の数（Ｎ２）を決定することが可能になる。
先に記載されたプロトコルによる様々なＣＲＰ濃度（０から１６ｐＭ）に対し、凝集の程度が決定された。得られた標準曲線は、図４において付与される。
ＣＲＰのない場合における反復に基づいて、検出限界を、約１５分の分析時間、１００ｆＭのＣＲＰにおいて評価した。
未知の溶液におけるＣＲＰ濃度の分析:
未知のＣＲＰ濃度を有する血清サンプルを、ｐＨ８．５の３０ｍＭグリシン緩衝液において１００倍に希釈した。２μＬのこの反応液を、直径２００ｎｍの機能付加された同一の磁性粒子、及びサポニンも含む３０ｍＭグリシン緩衝液に加えた。溶媒の最終体積は、３ｐＭの粒子及び０．０８％（重量／体積）のサポニンの最終濃度を有する６００μＬである。
様々な試薬を接触させた後、溶媒を、２分間インキュベートするために放置する。この２分の間、５３μＬの体積（Ｖ１）の混合物を、サンプリングし、フローアナライザに注入する。後者は、体積Ｖ１を１／１２００に希釈し、３５．５μＬの体積（Ｖ２）のこの混合物を３０秒、カウントする。かかる体積Ｖ２における反応開始時の懸濁液に存在するシングレットの数（Ｎ１）を、その後、決定する。
２分後、溶媒が、５０ｍＴにおける３０秒、２０ｍＴにおける３００秒及び０ｍＴにおける緩和の３０秒からなる２回の界サイクルを経る。
磁化サイクル後、先にサンプリングされた体積（５３μＬ）と同一の混合物の第２の体積（Ｖ１）を、Ｎ２の値を決定するために第１のサンプリングと同一の方法でサンプリングし、分析する。この測定により、形成された凝集体の数（Ｎ２）を決定することが可能になる。
従って、未知のサンプルに対し、凝集の程度ＤＡ＝０．５５を決定することが可能であった。これをキャリブレーション曲線に関連付けることにより、６．３ｐＭ、すなわち、１８９ｎＭの未知の血清におけるＣＲＰ濃度に等しい反応溶媒におけるＣＲＰ濃度を決定することが可能になる。
実施例３：２００ｎｍの超常磁性粒子を用いるビオチンの分析
標準曲線の確立:
直径２００ｎｍのストレプトアビジンでカバーされた粒子を使用した（Bio-Adembeads Streptavidin 0312, Ademtech）。
分析は、０．５％のウシ血清アルブミン（BSA Protease Free, ID Bio）及び変動する濃度のビオチン化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡｂ）（A8549, Sigma-Aldrich）も含むｐＨ８．５の３０ｍＭグリシン緩衝液において行った。溶媒における粒子の最終濃度は、約６ｐＭである。
多様な試薬を接触させた後、溶媒を、２分間のインキュベートのために放置する。この２分の間、５３μＬの体積（Ｖ１）の混合物を、サンプリングし、フローアナライザに注入する。後者は、体積Ｖ１を１／２４００に希釈し、３５．５μＬの体積（Ｖ２）のこの混合物において３０秒間のカウントを行う。かかる体積Ｖ２における反応開始時の懸濁液に存在するシングレットの数（Ｎ１）が、その後決定される。
２分後、溶媒が、５０ｍＴにおける３０秒、２０ｍＴにおける３００秒及び０ｍＴにおける緩和の３０秒からなる２回の界サイクルを経る。
磁化サイクル後、先にサンプリングされた体積（５３μＬ）と同一の混合物の第２の体積（Ｖ）を、Ｎ２の値を決定するために第１のサンプリングと同一の方法でサンプリングし、分析する。この測定により、形成された凝集体の数（Ｎ２）を決定することが可能になる。
先に記載されたプロトコルに従って、様々なビオチン濃度（０から５００ｐＭ）に関して、凝集の程度を決定した。得られた標準曲線を図５に示す。ビオチン化ＢＳＡのない場合の反復に基づいて、検出限界を評価した。実験条件はこの分析のために最適化されず、約７ｐＭのビオチン化ＢＳＡの高い検出限界が、約１５分の分析時間のために見出される。
未知の溶液におけるビオチン濃度の分析:
未知のＢＳＡｂ濃度を有するサンプルを、５％ＢＳＡ溶液において１０倍に希釈した。６０μＬのこの混合物を、直径２００ｎｍの機能付加された同じ磁性粒子を含む３０ｍＭのグリシン緩衝液に加えた。溶媒の最終体積は、６ｐＭの粒子及び０．５％（重量／体積）のＢＳＡの最終濃度を有する６００μＬである。
多様な試薬を接触させた後、溶媒を、２分間インキュベートするために放置する。この２分の間、５３μＬの体積（Ｖ１）の混合物を、サンプリングし、フローアナライザに注入する。後者は、体積Ｖ１を１／２４００に希釈し、３５．５μＬの体積（Ｖ２）のこの混合物において３０秒間カウントした。かかる体積Ｖ２における反応の開始時の懸濁液に存在するシングレットの数（Ｎ１）を、その後、決定する。
２分後、溶媒は、５０ｍＴにおける３０秒、２０ｍＴにおける３００秒及び０ｍＴにおける緩和の３０秒からなる２回の界サイクルを経る。
磁化サイクル後、先にサンプルされた体積（５３μＬ）と同一である第２の体積（Ｖ１）の混合液を、Ｎ２の値を決定するために第１のサンプリングと同じやり方で、サンプリングし、分析する。この測定により、形成された凝集体の数（Ｎ２）を決定することが可能になる。
従って、未知のサンプルのために、凝集の程度ＤＡ＝０．３３を決定することが可能になった。これをキャリブレーションカーブに関連付けることにより、６１．４ｐＭに等しい反応溶媒におけるＢＳＡｂ濃度、すなわち、６１４ｐＭの未知のサンプルにおけるＢＳＡｂ濃度を決定することが可能になる。

Claims (13)

  1. 液体溶媒において、少なくとも１の関心対象を定量する方法であって、その特徴が、分析すべき前記関心対象に特異的な少なくとも１の受容体で表面に機能付加された粒子を使用し、かつ該方法では:
    - 第１ステップにおいて、前記機能付加された粒子を分析すべき前記関心対象に接触させ、所定時間（t１）の混合が行われ、得られた前記混合物の体積（ｖ）がすぐにサンプリングされ、非凝集粒子の数Ｎ１（シングレット）が、フロー測定手段によってこの中で数えられ;
    - 第２ステップにおいて、ステップ１で得られた前記混合物が、凝集体の形成を可能にするのに十分な時間（t２）、インキュベートされ、かつ、体積（ｖ）がサンプリングされ、反応後の前記体積（ｖ）に含まれる前記非凝集粒子及び前記凝集体の両方に相当する数Ｎ２が、ステップ１において使用されたものと同じフロー測定技術を用いて数えられ、
    - 第３ステップにおいて、凝集の程度ＤＡ＝（Ｎ１‐Ｎ２）／Ｎ１（計算されたＤＡ）が決定され、予め定められた濃度（［Ｃ］）の前記関心対象において同じ前記関心対象とともに同じフロー測定技術を用いて得られる凝集の前記程度を測定することによって先に作成される標準範囲（ＤＡ＝ｆ（［Ｃ］）と、前記計算されたＤＡを比較することによって、前記関心対象が定量される、
    少なくとも１の関心対象を定量する方法。
  2. 分析すべき前記関心対象が、タンパク質、抗体、核酸、細胞、細胞片、微生物、微生物断片または他の化学分子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 分析すべき前記関心対象が、生物液もしくは組織抽出物または浄水場廃液あるいは摂取を意図された水に含まれることを特徴とする、請求項１及び２のいずれか１つに記載の方法。
  4. 前記生物液が、血液、血清、血漿、唾液、尿及び脳脊髄液から選択され、前記組織抽出物が、骨髄であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 前記受容体が、ペプチド、タンパク質、核酸、サッカリド、脂質及びホルモンから選択されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記粒子のサイズが、５ｎｍ及び１００００ｎｍの間であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１つに記載の方法。
  7. 前記機能付加された粒子が磁性粒子であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
  8. 前記第１ステップの持続時間が数秒から数分であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１つに記載の方法。
  9. 前記第２ステップの方法において、粒子間の衝突の頻度を増加させることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１つに記載の方法。
  10. 磁界または電界の適用または超音波の適用によって粒子間の前記衝突の前記頻度を増加させることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  11. 前記第２ステップの持続時間が、５秒及び３時間の間であり得ることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか１つに記載の方法。
  12. 測定が、フローモードにおいて実行されることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか１つに記載の方法。
  13. 前記測定が、フローサイトメトリーまたはキャピラリー電気泳動法あるいはマイクロ流体チャネルにおけるフローによって行われることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
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