CN105102982A - 用于目标物的流式计量分析的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于在液体介质中对目标物(或成分)进行流式计量分析的方法,其通过形成在表面上经由至少一种对于所述目标物来说特异的功能化分子或接受体进行功能化的颗粒的聚集体来进行。
Description
本发明涉及用于在液体介质中对目标物(或成分)进行流式计量分析的方法,其通过形成在表面上经由至少一种对于所述目标物来说特异的功能化分子(在文中也称为接受体)进行功能化的颗粒的聚集体来进行。
根据本发明,“目标物”是指任何物质,条件是它可以被至少两种接受体特异地识别。作为目标物,可以提及(作为例子但非限制性地)任何能够与抗体或适体反应的抗原、任何能够被互补核酸分子识别的核酸分子、任何细胞或细胞碎片或者任何微生物或微生物碎片、或者任何化学分子,只要对于它们稍微知道特异性接受体。因此,看起来可能使用根据本发明的方法来对蛋白质、抗体、核酸、细胞、细胞碎片、微生物(例如,细菌、某些真菌、绿藻或者病毒)、微生物碎片或者化学分子进行定量。
在大多数的实验室应用中,在生物学流体内的生物化学化合物的计量分析借助于旨在在所研究的物质与对其来说特异的接受体之间建立联系的反应。例如,该接受体在检测蛋白质的情形下可以为抗体或适体,或者在检测互补核酸的情形下可以为核酸序列。
在现有技术中非常多地使用的免疫诊断系统基于经由能够识别所研究的目标物并与之结合的接受体对微颗粒或纳米颗粒进行功能化,从而允许在所研究的所述目标物存在下形成由至少一个通过所述接受体与所研究的所述目标物相结合的经功能化的颗粒所构成的颗粒复合物,或者形成包含至少两个通过目标物而彼此相结合的经功能化的颗粒的颗粒聚集体。
在这之后,通常通过光学测量来对所形成的颗粒复合物或颗粒聚集体进行检测。而灵敏度常常与所使用的检测原理和相关仪器相关联。
例如,当所研究的目标物为存在于给定介质中的抗原时,所述抗原可以具有多个表位。因而,可以将针对所述抗原的抗体以化学方式固定至所使用的颗粒的表面,以使所述颗粒功能化。在将所述经功能化的颗粒引入到所述介质中时,在所述经功能化的颗粒与所述抗原之间可以发生反应。因此,第一经功能化的颗粒可以捕获所研究的抗原并形成第一颗粒复合物。但是,当然,由于布朗运动,固定至第一经功能化的颗粒的该同一抗原可以捕获自身经功能化的第二颗粒。因此,这两个经功能化的颗粒通过形成“抗体-抗原-抗体”连接而相结合,并由此构成聚集体。该反应可以继续进行,以便由此形成汇集了大量的根据相同原理而彼此相结合的颗粒的具有更大大小的聚集体。
在所述介质内聚集体的存在增加了光散射,从而使得穿过所述介质的光束强度减弱。这是光学比浊法的原理,其主要优点是使用简单,从而使得能够设想以竞争价格制造装置。
然而,此类系统的性能是相对有限的。这是因为,为了允许在合理的期限内形成连接,颗粒的浓度应当是很大的。此外,未反应的颗粒(保持游离的所引入的颗粒)对于有用信号没有贡献。相反地,由于其散射光的能力,它们有助于形成可能显现为对于测量来说有妨碍的背景噪声。
为了减少保持游离的所引入的颗粒的量,已研发了技术来提高颗粒之间的碰撞频率。这些方法可以利用磁场[BaudryJ.等人,PNAS,103(2006)16076-16078]或电场[IwataK.等人,AnnalsofChemicalBiochemistry,46(2009)117-122]或超声波[WiklundM.,HertzH.M.,LabonaChip,6(2006),1279-1292]来局部增加颗粒浓度并促进颗粒聚集体的形成。
然而,即使在这种情况下,也可能遇到其他问题。例如,通常无法检测到小于皮体积摩尔浓度(pM)的目标物浓度,这尤其是由于介质的热波动,其引起光学信号的波动。
通过流式测量来进行的在样品(有利地,生物学样品)中的目标物(特别地,生物学目标物)的检测和计量分析是本领域技术人员已知的。所有的现有技术方法都使用微颗粒,其分散水平对于允许在双参数表示法空间中对其进行鉴定来说是足够低的。例如,“小角度散射(前向散射,FSC)×大角度散射(侧向散射,SSC)”这种双参数表示法使得能够鉴定所有种类的胶态聚集体的存在,并且对双参数表示法进行的处理使得能够获知这些聚集体的数目和性质。然而,当形成具有超过两个颗粒的聚集体时,即使使用单分散颗粒也无法防止聚集体群体相互重叠。
因此,通常通过计算所形成的聚集体的数目与分离的颗粒的数目之间的比例来确定目标物的浓度,而不考虑聚集体的多重性。在高的目标物浓度下,聚集体可以由许多颗粒组成。不幸的是,不论聚集体的大小为何,在现有技术的定量方法中,尽管考虑到了这些聚集体,但其并未用所形成的连接的数目进行加权。如此,它们将会被视为具有与双重体(其被定义为由通过目标物而彼此相结合的两个颗粒所形成的聚集体)相同的重要性,但它们代表了更大的聚集状态。因此,在高的目标物浓度下,不可忽略的数目的通过目标物而产生的连接将会被忽略,并且测量的精确度将会由此降低。
此外,在现有技术中,对于流式检测,颗粒应当具有对于允许对其进行检测以便精确计量分析所研究的目标物来说足够的品质水平。理想地,颗粒应当是同一的,尤其是在其体积方面,因为在反应介质中随机选取的两个颗粒应当导致形成其有效截面应当几乎不变的聚集体。通常,所使用的颗粒将可以为球体,所述球体的直径将可以以某一对于颗粒分级的品质来说特征性的标准偏差围绕平均值随机分布。因而估计,颗粒大小的变化系数将可以小于或等于10%。因此,在现有技术中,通过使用流式测量来实施生物学测试需要具有足够品质的颗粒,其大小散布应当足够地受到控制并且可重现。
这构成了强的工业限制,因为小于10%的变化系数要求大量的制造看管,从而导致更高的颗粒成本,并因此导致更高的测量成本。此外,难以达到对颗粒大小的变化系数的良好控制,尤其是当寻求向颗粒提供尤其是组合了诸如荧光或磁性的特定物理性质的物理性质时。
然而,此类性质对于进行聚集反应的加速来说可能是希望的。
存在有通过使用颗粒的流式检测来检测目标物的其他技术。可以提及Luminex技术,其借助于包被有对于抗原来说特异的抗体的固有地发荧光(初级荧光)的微米级颗粒来检测所述抗原。一旦所述抗原被包被颗粒的所述特异性抗体捕获,那么就用二抗对其进行第二次标记,所述二抗自身以与所述颗粒的初级荧光不同的波长发荧光(次级荧光)。该次级荧光用于检测“二抗-抗原”复合物。但是,容易理解的是,这种方法需要多个步骤:一方面进行温育,然后另一方面进行洗涤以去除可能干扰测量的过量试剂。因此,这种方法相比于仅需要单个步骤的聚集测试而言实施的时间更长且更复杂。
在众多研究后,发明人研发出了用于对给定目标物进行定量的方法,该方法基于测定与给定目标物相接触的经功能化的颗粒的悬浮液的聚集状态,其中克服了现有技术的问题。特别地,根据本发明的方法将可以应用于具有大的大小散布的经功能化的颗粒的全体,这不是现有技术的情况。
因此,本发明旨在提供用于通过在“所研究的目标物/经功能化的颗粒”反应期间所形成的聚集体的流式测量来对事先抽取的给定目标物进行定量的新方法,其中采用克服了现有技术的已知方法的全部或部分缺点的方法。
根据本发明,“聚集体”是指包含至少两个通过目标物而彼此相结合的经功能化的颗粒的颗粒聚集体(双重体)。因此,应当理解,根据本发明,将任何颗粒聚集体称为“聚集体”,不论它由两个通过目标物而彼此相结合的经功能化的颗粒形成,还是由超过两个的通过多个目标物而彼此相结合的经功能化的颗粒形成。还应当理解,与单个目标物相结合的经功能化的颗粒被视为单态体。
因此,在本文中,“单态体”是指没有任何连接的经功能化的颗粒以及与单个经功能化的颗粒相结合的目标物。
因此,根据本发明的方法可看作与聚集测试(或者凝集测试)相似。
在聚集测试中的有用信号为在颗粒之间所产生的连接的数目。对于给定体积,可以通过在方法开始时存在的且在给定体积(V)中测得的单态体的数目(N1)与在方法结束时在同一体积(V)中测得的聚集体和在聚集反应结束时仍存在的单态体的数目(N2)之间的差值来获得这一测量。该差值(N1-N2)相应于在测量期间在2个经功能化的颗粒之间形成的生物学连接的数目。在N1包括可能的非特异性聚集体(由至少2个通过除了目标物以外的任何其他方式而彼此相结合的经功能化的颗粒构成的聚集体)的情况下,根据本发明的通过差值来进行的测量使得能够摆脱之。
根据本发明,有用信号为聚集度(DA),其相应于相对于在包含所述待计量分析的目标物的液体介质中在测量开始时(换言之,在引入之后且在聚集之前)存在的单态体的总数目(N1)而言,所形成的生物学连接的数目(N1-N2)。因此,根据本发明,聚集度表示为DA=(N1-N2)/N1。
因此,将测量结果相对于系统的初始状态进行标准化,这将可能有助于减少反应混合物制备的可能误差的影响。
根据本发明,未知样品的目标物浓度可以通过将所测得的聚集度转移到校正曲线上来确定,所述校正曲线是事先通过测量在已知量的目标物存在下所述经功能化的颗粒的聚集度而建立的。
从上述内容中可以理解,根据本发明的新的定量方法一方面需要测定在反应开始时在反应介质中存在的单态体的数目(N1),和另一方面需要测定在反应介质中形成的聚集体和在聚集反应结束时仍存在的单态体的总数目(N2)。
数目(N1)或(N2)可以以下方式来测量:可以使每一个颗粒或聚集体经历通过光学方法、电学方法或其他方法来进行的检测。因此,每一个颗粒或聚集体在检测器处的通过产生可以被记录的脉冲。因而可以测定在计数持续时间期间的脉冲的总数目。在聚集步骤之前,测量单态体的数目N1。在聚集步骤之后,测量聚集体和剩余单态体的数目N2。根据本发明,包含通过k-1个连接而凝集的k个颗粒的每个所形成的聚集体(不论其大小为何)均作为单一成分进行计数。
此外,根据本发明的方法使得能够摆脱在单参数或多参数表示法上的群体分开。
根据本发明的方法使得能够测量连接数目,而同时避免依赖于所检测的物体的一个或多个物理量值的变化;不依赖于物理量值的变化的益处为,小聚集体可能具有小于大颗粒的幅度,从而导致所研究的物体的不正确分类。
根据本发明的方法使得能够考虑所有前面所定义的聚集体,从而使得即使在高的目标物浓度下,也将会独个地考虑每一个所形成的聚集体。因此,将会考虑通过目标物而产生的所有连接,并且改善其测量的精确度,特别是在高的目标物浓度的情况下。
根据本发明的方法的另一优点在于:呈现出更多的颗粒选择用于驱动反应。特别地,具有有利性质(例如,超顺磁特性)的颗粒将可以用于促进反应,而现有的检测技术由于所述颗粒的大小散布而阻碍了其使用。
因此,本发明的第一个目标在于在液体介质中对至少一种目标物进行定量的方法,其特征在于,使用在表面上经由至少一种对于所述待计量分析的目标物来说特异的接受体进行功能化的颗粒,并且其中:
·在第一步骤中,使所述经功能化的颗粒与所述待计量分析的目标物相接触,将它们混合给定时间(t1),并且立即抽取一定体积(v)的所述所获得的混合物,其中通过流式测量来对未聚集的颗粒(单态体)的数目N1进行计数;
·在第二步骤中,将在步骤1中所获得的所述混合物温育足以使得能够形成聚集体的时间(t2),并且抽取一定体积(v),并通过与在步骤1中所使用的那种相同的流式测量技术来对相应于在反应后在该体积(v)中所包含的未聚集的颗粒和聚集体这二者的数目N2进行计数;
·在第三步骤中,确定聚集度DA=(N1-N2)/N1(计算出的DA),并且通过将该计算出的DA与标准范围(DA=f([C]))进行比较来对所述目标物进行定量,所述标准范围是通过测量对于相同的目标物在所述目标物的预定浓度([C])下通过相同的流式测量技术而获得的聚集度而事先产生的。
作为例子,待计量分析的目标物可以包含在介质中,所述介质例如为生物学流体,其中包括体液例如血液、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊髓液,或者组织提取物例如骨髓。还可以提及例如提纯站废弃物、用于消费的水等。有利地,本发明针对生物学流体或组织提取物。
经功能化的颗粒之间的碰撞是由于天然的布朗运动而引起的。所述布朗运动取决于天然地影响碰撞频率的多个参数。可能依靠这些参数以产生有利于在首次碰撞发生之前具有足够时间的条件,在所述时间期间可能在所述聚集反应未发生之前分析该介质,以便例如测量在反应开始时存在的单态体的量(N1)。
此外,使得能够提高颗粒之间的碰撞频率并因此大大地加速聚集反应的技术是已知的。根据本发明的方法可以包括或不包括通过在所述方法的过程中应用已知的用于提高颗粒之间的碰撞频率的技术来加速聚集反应的这样的步骤。
因此,根据本发明,该定量方法还可以包括使得能够提高颗粒之间的碰撞频率的步骤,所述步骤可以位于第一步骤结束与第二步骤开始之间,或者整合到第二步骤中。
根据本发明,“经功能化的颗粒”是指任何类型的在现有技术中所描述的并且根据本发明可使用的经功能化的颗粒。作为例子,可以提及金属或塑料(例如聚苯乙烯)珠粒,或者二氧化硅或聚合物颗粒,或者具有混合组成的颗粒(混合颗粒),例如经塑料包覆的氧化铁颗粒,或者非固体颗粒,例如脂质体。优选地,根据本发明将会使用混合颗粒。
根据本发明,所述颗粒的大小可以为5至10000nm,和更优选地100至1000nm。
根据本发明的一个形式,所述颗粒将可以对于可用于提高颗粒之间的碰撞频率的技术(例如,使用磁场或电场或超声波的技术)是敏感的,或者可以被使得对于所述技术敏感。优选地,根据本发明将会使用磁性颗粒。
作为磁性颗粒,根据本发明将可以使用顺磁性、抗磁性、铁磁性或亚铁磁性或者超顺磁性颗粒。这样的颗粒的使用使得能够加速聚集步骤并且产生更大的信号。当使它们经历磁场时,这些颗粒组织成链。局部浓度增加,并且反应加速。
因此,可以以低的目标物和颗粒的浓度来形成聚集体。因而,由于各种种类的低浓度,所以所形成的生物学连接的数目是少的。流式测量方法特别好地适合于测量少量的颗粒,并且因此可以有利地用在根据本发明的定量方法中以测量磁性颗粒的聚集度。
本领域技术人员将会毫无困难地知晓从众多已知的供应商中选择适合于其所希望实施的测量的颗粒。有利地,根据本发明,可以使用超顺磁性颗粒,从而在适当的磁场中,这些颗粒保留了在布朗运动的影响下围绕自身旋转的能力,而同时形成链。
由此,根据本发明可以使用所有已知的流式测量方法,例如流式细胞术或毛细管电泳或在微观流体管道中流动。有利地,根据本发明,将可以使用流式细胞术。
根据本发明,所述特异性接受体可以是天然或合成的,例如为肽、蛋白质、核酸、糖类、脂质、激素和任何其他生物学或合成物质,只要稍微所述接受体能够与目标物结合(Antibodies:alaboratorymanual,E.Harlow和D.Lane,ColdSpringHarborLaboratory,1988)。
如果需要,本领域技术人员将会毫无困难地知晓将接受体接枝到颗粒上。
可以通过本领域技术人员已知的各种技术,例如通过吸附、共价和/或高亲和力的相互作用,来将这些接受体固定到颗粒的表面上。作为参考,可参阅“BioconjugateTechniques”,G.T.Hermanson(AcademicPress,1996)这本书。
根据本发明的方法使用本领域技术人员已知并因此将会没有任何困难地进行实施的反应条件。
根据本发明,可能向第一步骤的反应混合物中添加非离子型去污剂(80)、离子型去污剂(胆酸钠、牛磺胆酸钠)或两性离子型去污剂(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)),蛋白质(牛血清白蛋白(BSA))溶液,或者聚合物(聚乙烯醇(PVA))。
去污剂的添加使得能够避免两个颗粒在碰撞后保持结合,然而却不牵涉目标物。如此避免非特异性聚集。
根据本发明,第一步骤的持续时间是短的,并且仅持续大约在介质中快速混合颗粒的时间t1。因此,第一步骤可以持续数秒钟至数分钟,有利地至多3分钟,非常有利地2分钟。
根据本发明,所述方法的该第一步骤使得能够测量在反应开始时抽取的体积(v)中的未聚集的经功能化的颗粒的数目N1。为此,可以在将颗粒引入到包含待计量分析的目标物的所抽取的体积(v)中时起抽取一部分反应混合物并且进行分析。由于在引入颗粒与抽取所述混合物的等分试样之间经过的时间相较于在液体介质中颗粒被动聚集的时间而言是短的,因而该值N1相应于在反应开始时的引入到所述液体介质中的未聚集的经功能化的颗粒的浓度。
根据本发明,第二步骤的持续时间可以为5秒钟至3小时,优选地5分钟至60分钟。该时间可以允许形成最大量的所有大小的聚集体,但应当保持与合理的测量总持续时间相容。
根据本发明的一个变化形式,恰好在所述方法的第二步骤之前或者在第二步骤期间,可以施加磁场、电场或超声波以便提高颗粒之间的碰撞频率。
例如,如果施加磁场,那么所述介质可以经历1至10个周期的3mT至100mT的场,每个周期可以具有1至600秒钟,优选地100至500秒钟,有利地300秒钟的持续时间,其中与弛豫期(没有施加的场)交替。
根据本发明,在所述方法的第三步骤中,计算聚集度DA=(N1-N2)/N1(计算出的DA)。从而,可以通过将该计算出的DA与DA标准范围进行比较来确定在样品中的目标物浓度,所述DA标准范围是通过在已知量的相同目标物存在下测量颗粒的聚集而事先建立的。
图1是根据本发明的方法的原理的示意性图示,其中在该示意图的左侧部分处描绘了不含任何连接的经功能化的颗粒和与单个经功能化的颗粒相结合的目标物(单态体)。单态体的数目N1是在根据本发明的方法的第一步骤中测量的。在该示意图的右侧部分处描绘了,一方面,在聚集后仍存在的单态体(nα),和另一方面,在聚集体中所牵涉的经功能化的颗粒(nβ),其中总和“nα+nβ”相应于在聚集后的单态体和聚集体的数目N2。因而,应当理解,N1-N2(10-6=4)相应于在所形成的聚集体nβ(3)中的连接的数目,并且在该理论情况下,聚集度(DA)等于(N1-N2)/N1=(10-6)/10=0.4。
图2显示了在1pMCRP存在下通过自动装置对于聚集进行检测的结果。实线曲线表示在聚集之前通过自动测量装置在30秒钟期间检测到的脉冲。这些脉冲之和相应于N1。虚线曲线表示在聚集之后通过自动测量装置在30秒钟期间检测到的脉冲。这些脉冲之和相应于N2。
图3显示了通过对于各种不同的CRP浓度(0至5pM)测量500nm的颗粒的聚集度而获得的标准曲线。
图4显示了通过对于各种不同的CRP浓度(0至15pM)测量200nm的颗粒的聚集度而获得的标准曲线。
图5显示了通过对于各种不同的经生物素化的牛血清白蛋白的浓度(0至500pM)测量200nm的颗粒的聚集度而获得的标准曲线。
从下面的实施例中将能够清晰地显现出本发明的其他目标、特征和优点。
实施例1:通过使用直径为500nm的超顺磁性颗粒来对CRP(C反应蛋白)进行计量分析
将抗-CRP多克隆抗体(L66616G,MeridianLifeScience)(大约10μg抗体/mg珠粒)接枝到直径为500nm的超顺磁性颗粒(MasterBeadsCarboxylicAcid0215,Ademtech)上。
所述检定是在包含可变浓度的CRP(ABXPentraCRPcal,HoribaMedical)的30mM甘氨酸缓冲液(pH8.5)中进行的。
为了在CRP不存在时限制颗粒之间的连接的形成,以在反应混合物中3mM的最终浓度将牛磺胆酸(T4009,Sigma-Aldrich)添加到介质中。
在介质中颗粒的最终浓度为大约0.6pM。通过用在488nm下工作的激光照射颗粒来进行流式分析。用Hamamatsu牌的H9307-02型光电倍增器,对于穿过测量小室的每一个物体测量在90°处的散射。
在使各种试剂进行接触后,让介质温育2分钟。在这2分钟期间,抽取53μL的体积(V1)的该混合物并将其注射到流式分析仪中。所述流式分析仪确保将体积V1稀释至1/100,并且在30秒钟期间对于35.5μL的体积V2的该混合物进行计数。从而确定在所述体积V2中在反应开始时存在于悬浮液中的单态体的数目(N1)。
在2分钟后,使介质经历5个周期的场,其由在10mT下30秒钟、然后在3mT下300秒钟和最后在0mT下弛豫30秒钟组成。
在磁化周期之后,按照相同的准备周期,抽取与前面所抽取的体积(53μl)相同的第二个体积(V1)的该混合物,并且通过流式分析仪来进行分析。该测量使得能够确定所形成的聚集体的数目(N2)。
图2显示了在1pMCRP存在下通过自动装置对于聚集进行检测的结果。该图描绘了在30秒钟期间在体积(V2)中检测到的成分的数目,其随与所述成分相关的脉冲高度而变化,而所述脉冲高度自身随物体大小而变化。可以看出,在聚集之前(实线),悬浮液具有复杂的分布,其中存在的颗粒有着众多的大小。在聚集之后(虚线),没有出现明确地与颗粒的聚集体相关的群体,然而所检测到的物体的总数目(曲线下面积)明显减少。
标准曲线的建立:
按照前面所描述的方案,对于各种不同的CRP浓度(0至5pM)测定聚集度。结果呈现在图3中。
可以看出,聚集度实际上随在介质中的CRP浓度而变化。从在CRP不存在下对于多次重复而测量出的标准偏差开始,对于大约35分钟的分析持续时间,可以在25fMCRP处评价出了该系统的检出限。
在未知溶液中的CRP浓度的计量分析:
将CRP浓度未知的血清样品在30mM甘氨酸缓冲液(pH8.5)中稀释10000倍。将27.6μL的该混合物添加到包含与前面所使用的相同的直径为500nm的经功能化的超顺磁性颗粒(MasterBeadsCarboxylicAcid0215,Ademtech)以及牛磺胆酸的30mM甘氨酸缓冲液中。介质的最终体积为600μL,其中颗粒的最终浓度为0.6pM,并且牛磺胆酸的最终浓度为3mM。
在使各种试剂进行接触后,让介质温育2分钟。在这2分钟期间,抽取53μL的体积(V1)的该混合物并将其注射到流式分析仪中。所述流式分析仪确保将体积V1稀释至1/100,并且在30秒钟期间对于35.5μL的体积(V2)的该混合物进行计数。从而确定在所述体积V2中在反应开始时存在于悬浮液中的单态体的数目(N1)。
在2分钟后,使介质经历5个周期的场,其由在10mT下30秒钟、在3mT下300秒钟和在0mT下弛豫30秒钟组成。
在磁化周期之后,以与第一次抽取相同的方式,抽取与前面所抽取的体积(53μl)相同的第二个体积(V1)的该混合物并且进行分析,以便确定N2的值。
按照前面所描述的方案,因此对于该未知样品可能确定凝集度DA=0.23。向校正曲线上的转移使得能够确定在反应介质中的CRP浓度等于0.17pM,即在该未知血清中的CRP浓度为37nM。
实施例2:通过使用200nm的超顺磁性颗粒来对CRP进行计量分析
标准曲线的建立:
将大约35μg抗-CRP多克隆抗体(L66616G,MeridianLifeScience)/mg颗粒接枝到直径为200nm的磁性颗粒(CarboxylAdembeads,0212,Ademtech)上。
所述检定是在包含可变浓度的CRP(ABXPentraCRPcal,HoribaMedical)的30mM甘氨酸缓冲液(pH8.5)中进行的。
为了在CRP不存在时限制颗粒之间的连接的形成,以在反应混合物中的0.08重量%,将皂苷(30502-42,NacalaiTesque)作为去污剂添加到介质中。
在介质中颗粒的最终浓度为大约3pM。
在使各种试剂进行接触后,让介质温育2分钟。在这2分钟期间,抽取53μL的体积(V1)的该混合物并将其注射到流式分析仪中。所述流式分析仪确保将体积V1稀释至1/1200,并且在30秒钟期间对于35.5μL的体积(V2)的该混合物进行计数。从而确定在所述体积V2中在反应开始时存在于悬浮液中的单态体的数目(N1)。
在2分钟后,使介质经历2个周期的磁场,其由在50mT下30秒钟、在20mT下300秒钟和在0mT下弛豫30秒钟组成。
在磁化周期之后,以与第一次抽取相同的方式,抽取与前面所抽取的体积(53μl)相同的第二个体积(V1)的该混合物并且进行分析,以便确定N2的值。该测量使得能够确定所形成的聚集体的数目(N2)。
按照前面所描述的方案,对于各种不同的CRP浓度(0至16pM)测定聚集度。所获得的标准曲线呈现在图4中。
从在CRP不存在下的重复开始,对于大约15分钟的分析持续时间,在100fMCRP处评价出了检出限。
在未知溶液中的CRP浓度的计量分析:
将CRP浓度未知的血清样品在30mM甘氨酸缓冲液(pH8.5)中稀释100倍。将2μL的该混合物添加到包含相同的直径为200nm的经功能化的磁性颗粒以及皂苷的30mM甘氨酸缓冲液中。介质的最终体积为600μL,其中颗粒的最终浓度为3pM,并且皂苷的最终浓度为0.08%(重量/体积)。
在使各种试剂进行接触后,让介质温育2分钟。在这2分钟期间,抽取53μL的体积(V1)的该混合物并将其注射到流式分析仪中。所述流式分析仪确保将体积V1稀释至1/1200,并且在30秒钟期间对于35.5μL的体积(V2)的该混合物进行计数。从而确定在所述体积V2中在反应开始时存在于悬浮液中的单态体的数目(N1)。
在2分钟后,使介质经历2个周期的场,其由在50mT下30秒钟、在20mT下300秒钟和在0mT下弛豫30秒钟组成。
在磁化周期之后,以与第一次抽取相同的方式,抽取与前面所抽取的体积(53μl)相同的第二个体积(V1)的该混合物并且进行分析,以便确定N2的值。该测量使得能够确定所形成的聚集体的数目(N2)。
因此,对于该未知样品可以确定凝集度DA=0.55。向校正曲线上的转移使得能够确定在反应介质中的CRP浓度等于6.3pM,即在该未知血清中的CRP浓度为189nM。
实施例3:通过使用200nm的超顺磁性颗粒来对生物素进行计量分析
标准曲线的建立:
使用经链霉抗生物素蛋白包被的直径为200nm的颗粒(Bio-AdembeadsStreptavidin0312,Ademtech)。
所述检定是在包含0.5%牛血清白蛋白(BSAProteaseFree,IDBio)以及可变浓度的经生物素化的牛血清白蛋白(BSAb)(A8549,Sigma-Aldrich)的30mM甘氨酸缓冲液(pH8.5)中进行的。在介质中颗粒的最终浓度为大约6pM。
在使各种试剂进行接触后,让介质温育2分钟。在这2分钟期间,抽取53μL的体积(V1)的该混合物并将其注射到流式分析仪中。所述流式分析仪确保将体积V1稀释至1/2400,并且在30秒钟期间对于35.5μL的体积(V2)的该混合物进行计数。从而确定在所述体积V2中在反应开始时存在于悬浮液中的单态体的数目(N1)。
在2分钟后,使介质经历2个周期的场,其由在50mT下30秒钟、在20mT下300秒钟和在0mT下弛豫30秒钟组成。
在磁化周期之后,以与第一次抽取相同的方式,抽取与前面所抽取的体积(53μl)相同的第二个体积(V)的该混合物并且进行分析,以便确定N2的值。该测量使得能够确定所形成的聚集体的数目(N2)。
按照前面所描述的方案,对于各种不同的生物素浓度(0至500pM)测定聚集度。所获得的标准曲线呈现在图5中。从在经生物素化的BSA不存在下的重复开始,评价出了检出限。实验条件未对于该检定进行优化,并且对于大约15分钟的分析持续时间,发现大致7pM的经生物素化的BSA的高的检出限。
在未知溶液中的生物素浓度的计量分析:
将BSAb浓度未知的样品在5%BSA溶液中稀释10倍。将60μL的该混合物添加到包含相同的直径为200nm的经功能化的磁性颗粒的30mM甘氨酸缓冲液中。介质的最终体积为600μL,其中颗粒的最终浓度为6pM,并且BSA的最终浓度为0.5%(重量/体积)。
在使各种试剂进行接触后,让介质温育2分钟。在这2分钟期间,抽取53μL的体积(V1)的该混合物并将其注射到流式分析仪中。所述流式分析仪确保将体积V1稀释至1/2400,并且在30秒钟期间对于35.5μL的体积(V2)的该混合物进行计数。从而确定在所述体积V2中在反应开始时存在于悬浮液中的单态体的数目(N1)。
在2分钟后,使介质经历2个周期的场,其由在50mT下30秒钟、在20mT下300秒钟和在0mT下弛豫30秒钟组成。
在磁化周期之后,以与第一次抽取相同的方式,抽取与前面所抽取的体积(53μl)相同的第二个体积(V1)的该混合物并且进行分析,以便确定N2的值。该测量使得能够确定所形成的聚集体的数目(N2)。
因此,对于该未知样品可以确定凝集度DA=0.33。向校正曲线上的转移使得能够确定在反应介质中的BSAb浓度等于61.4pM,即在该未知样品中的BSAb浓度为614pM。
Claims (13)
1.在液体介质中对至少一种目标物进行定量的方法,其特征在于,使用在表面上经由至少一种对于所述待计量分析的目标物来说特异的接受体进行功能化的颗粒,并且其中:
·在第一步骤中,使所述经功能化的颗粒与所述待计量分析的目标物相接触,将它们混合给定时间(t1),并且立即抽取一定体积(v)的所述所获得的混合物,其中通过流式测量来对未聚集的颗粒(单态体)的数目N1进行计数;
·在第二步骤中,将在步骤1中所获得的所述混合物温育足以使得能够形成聚集体的时间(t2),并且抽取一定体积(v),并通过与在步骤1中所使用的那种相同的流式测量技术来对相应于在反应后在该体积(v)中所包含的未聚集的颗粒和聚集体这二者的数目N2进行计数;
·在第三步骤中,确定聚集度DA=(N1-N2)/N1(计算出的DA),并且通过将该计算出的DA与标准范围(DA=f([C]))进行比较来对所述目标物进行定量,所述标准范围是通过测量对于相同的目标物在所述目标物的预定浓度([C])下通过相同的流式测量技术而获得的聚集度而事先产生的。
2.根据权利要求1的方法,其特征在于,所述待计量分析的目标物为蛋白质、抗体、核酸、细胞、细胞碎片、微生物、微生物碎片或者化学分子。
3.根据权利要求1或2中任一项的方法,其特征在于,所述待计量分析的目标物包含在生物学流体或组织提取物或提纯站废弃物或用于消费的水中,有利地包含在生物学流体或组织提取物中。
4.根据权利要求3的方法,其特征在于,所述生物学流体选自血液、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊髓液,并且所述组织提取物来自骨髓。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法,其特征在于,所述接受体选自肽、蛋白质、核酸、糖类、脂质、激素。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法,其特征在于,所述颗粒的大小为5至10000nm,和更优选地100至1000nm。
7.根据权利要求1至6中任一项的方法,其特征在于,所述经功能化的颗粒为磁性颗粒。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法,其特征在于,第一步骤的持续时间为数秒钟至数分钟,有利地至多3分钟,非常有利地2分钟。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法,其特征在于,在该方法的第二步骤中,增加颗粒之间的碰撞频率。
10.根据权利要求9的方法,其特征在于,通过施加磁场或电场或者施加超声波来增加颗粒之间的碰撞频率。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法,其特征在于,第二步骤的持续时间可以为5秒钟至3小时,优选地5分钟至60分钟。
12.根据权利要求1至11中任一项的方法,其特征在于,所述测量以流式方式来进行。
13.根据权利要求12的方法,其特征在于,所述测量通过流式细胞术或毛细管电泳或在微观流体管道中流动来进行,优选地通过流式细胞术来进行。
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