CN1170875A - C型肝炎病毒感染病的诊断试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供能够高灵敏度且迅速测定多个检测样品的HCV感染病诊断试剂及其诊断方法。其中C型肝炎病毒感染病诊断试剂是通过用固相使HCV抗原或HCV抗原与载体蛋白通过化学结合调制成的复合抗原致敏后得到的。其诊断方法是将该诊断试剂添加到检测样品中,测定载体粒子的凝集度。
Description
本发明涉及利用免疫凝集反应检测C型肝炎病毒(HCV)感染病的诊断试剂。
1988年美国的Chiron Corporation的研究组首先于病毒中发现了HCV基因。为了检测该HCV的抗体,进行了各种重组抗原和合成多肽的研究,开发了检测与HCV相关的抗体的试剂盒。而作为检测方法主要有琼脂凝胶扩散法、对流免疫电泳法、放射免疫测定法、酶免疫测定法、被动红细胞凝集法、胶乳凝集法等方法。
为了检测与HCV相关的抗体所用的HCV抗原蛋白质,其中作为结构域蛋白有人们已知的核心和被膜蛋白,而作为非结构域蛋白质有NS1~NS5蛋白质。若只用一种HCV抗原蛋白质,检测灵敏度不是特别高,特异性上也有问题,所以要将结构域和非结构域的蛋白质适当组合起来使用(Proc.Natl.Acad.Soi.USA 89:10011-10015,1992)。并且也进行了为进一步提高检测灵敏度的试验。例如,在粒子凝集法中有时要使致敏的HCV抗原数进一步增加,有时对有HCV抗原活性的多肽进行加热处理(特开平6-1002273号),或者是使HCV抗原蛋白质和载体蛋白质的融合蛋白质用亲水性粒子致敏后再用于试验(特开平7~198723号)。
虽然也曾尝试用合成多肽作抗原,但一般来说使用合成多肽时检测灵敏度降低。
因此,需要能高灵敏度且迅速测定多个检测样品的HCV感染病的诊断试剂以及诊断方法。
为达到上述目的,进行了深入的研究,结果发现,利用戊二醛法将载体蛋白质和各种C型肝炎病毒的核心抗原、NS3抗原、NS4抗原以及NS5抗原通过化学结合调制成复合抗原,然后用载体粒子使复合抗原致敏,这样可以提高灵敏度,同时通过使用复合抗原也可大幅度地改善粒子的稳定性。
本发明提供了用固相使HCV抗原、HCV抗原与载体蛋白质通过化学结合调制的复合抗原致敏后得到的C型肝炎病毒感染病的诊断试剂。
作为载体蛋白质,只要是水溶性蛋白质,没有特别的限制。理想的载体蛋白质的分子量是10,000~1,000,000,更理想的是30,000~150,000之间的蛋白质,具体讲,最合适的是牛血清清蛋白(BSA)、卵清清蛋白、血蓝蛋白等。另外,还可以使用水溶性的合成高分子,如聚乙二醇、葡聚糖等。
作为固相可使用载体粒子、微型血凝反应盘、试管等。最好是用载体粒子。作为载体粒子,可使用通常粒子凝集法的诊断试剂中用的公知的粒子。例如,可以使用象聚苯乙烯胶乳那样的疏水性粒子,以及粒子表面含有氨基、羧基等亲水基团的共聚合粒子、红细胞、明胶粒子等。最理想的是用聚苯乙烯胶乳。
在本发明的诊断试剂中使用的HCV抗原蛋白质是众所周知的结构域蛋白质和非结构域蛋白质。作为结构域蛋白质可以使用核心蛋白质,作为非结构域蛋白质可使用NS3蛋白质、NS4蛋白质和NS5蛋白质。有关这些抗原蛋白质的氨基酸和核苷酸序列在文献(特表平5-508219号)中已有记载。至于抗原蛋白质的来源,只要它有HCV抗原活性,并不受特别限制。即可以使用从天然分离的蛋白,也可使用化学合成的,以及通过基因重组制造出来的蛋白质。作为抗原蛋白质可以使用上述范围内的蛋白质中的各种长度的多肽。最好是用含有至少一个抗原决定簇的由8个以上氨基酸组成的多肽。最理想的是用分子量为1,000~5,000的合成多肽。多肽的合成可利用本专业中众所周知的方法,例如固相合成法、片段缩合法、或是用经典的溶液合成法进行。理想的方法是文献(Merrifield.J.Am.Chem.Soc.85:2149,1963)记载的固相多肽合成法。而本发明中,核心、NS3、NS4、NS5合种抗原蛋白质,通过组合,这种组合是至少含有一个以上的不同抗原决定簇的1种以上的抗原蛋白质的组合,组合的抗原蛋白可直接地用载体粒子致敏,或是与载体蛋白结合,以复合抗原的形式用载体粒子致敏。后面叙述的实施例中作为核心抗原使用的是包含特表平5-508219号记载的核心区内氨基酸序列中49-68的多肽,作为NS4多肽使用的是含有特表平5-508219号记载的NS4区内氨基酸序列中1706~1725、1718~1739以及1724~1743的多肽,而作为NS5多肽使用的是含有特表平5-508219号记载的NS5区内氨基酸序列中的2287-2306、2299~2318,以及2311~2330的多肽,而作为NS3抗原使用的是含有特表平5~508219号记载的NS3区内氨基酸序列中的1192~1457的多肽,但本发明并不受此限制。
将上述各种抗原蛋白质与载体蛋白通过化学键结合后制成复合抗原。发现用载体粒子使复合抗原致敏后其检测灵敏度比直接用载体粒子使抗原蛋白质致敏后的检测灵敏度高。但是,本发明中使用的象NS3那样的分子量在10,000以上的抗原没有观察到显著的差别。因此,可以直接用载体粒子使象NS3那样的抗原蛋白质致敏,也可以与其它抗原蛋白质结合以复合抗原形式用载体粒子致敏。载体蛋白与抗原蛋白质的结合可以采用众所周知的方法,例如可以使用碳二亚胺法、过碘酸法、马来酰亚胺法、戊二醛法等方法。通过戊二醛搭桥可增大反应性,所以最理想的是用戊二醛法。调制复合抗原时,载体蛋白与抗原蛋白质的分子数比大约是1∶3~1∶20,理想的是大约1∶4~1∶9,最理想的比例大约是1∶6~1∶8。利用众所周知的方法,将这样调制的复合抗原与载体粒子结合(致敏)。例如可通过物理吸附、或化学吸附结合。如上所述,NS3抗原不只是与载体蛋白质形成复合抗原后用载体粒子致敏,也可以直接用载体粒子致敏,这可以用同样的方法致敏。致敏是在有缓冲作用的缓冲液中进行的,例如可使用磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液,理想的pH是3-8,最理想的pH是pH4-5。
本发明还提供C型肝炎病毒感染病的诊断方法,其特征是将上述的C型肝炎病毒感染病诊断试剂加到检测样品中,用流式细胞仪测定载体粒子的凝集程度。本发明的C型肝炎病毒感染病诊断试剂,在检测样品中若存在HCV抗体就可与它反应引起凝集。产生的凝集可以目视,或通过浊度、吸光度等进行测定。若使用应用了流式细胞仪原理的全自动免疫凝集测定装置(例如东亚医用电子社制的PAMIA-30TM)通过光学手段测定凝集粒子的大小,其测定迅速,而且灵敏度和精度都高。即通过鞘流机构将样品导入流动室,排成一列通过,用激光照射,通过测定散射光的强度就可知道凝集的程度,给出凝集的粒子数(P:Polymer)和未凝集的粒子数(M:Monomer),由P和M推算出P/T(T=P+M),根据予先得到的临界值判断有无HCV抗体。利用这一方法可使HCV抗体的检测灵敏度更高。而如果使粒径变成合适的粒径,通过采用了电阻法的血液分析装置或粒度分析装置进行测定也是有可能的。但若考虑到检测器的堵塞等问题,最好还是用光学方法测定。
若使用本发明的C型肝炎病毒感染病诊断试剂,则不仅诊断灵敏度高,而且可以比市售的诊断试剂更早期地诊断出有无感染。就是说,在使用下列一组血清作试验时,这组血清是同一个人的HCV抗体阳性化过程中随时间的推移采集的数个样品(例如产生HCV抗体的系列血清,进口商:协和医学、制造商:BOSTON BIOMEDICA.INC)。试验的结果表明:本发明的C型肝炎病毒感染病诊断试剂与以往采用的使用红细包的被动血球凝集法(PHA)、酶免疫检测法(EIA)以及酶联免疫吸附检测法(ELISA)相比,可以更早地、即在感染初期就可检测出受HCV的感染。
将本发明的诊断试剂与使用相同的抗原(但并不是与载体蛋白质调制成复合抗原)直接致敏制成的诊断试剂相比,结果表明,还是本发明的诊断试剂的检测灵敏度高。
另外,本发明的诊断试剂在长期保存后其检测灵敏度也不下降,可以说是个稳定的诊断试剂。
本发明的诊断方法与以往的ELISA等方法相比,省去了繁琐的清洗工序,只是简单地将本发明的HCV感染病诊断试剂(最好是将HCV抗原致敏的胶乳粒子)与检测样品(最好是被验者血液)混合就可实施。还有本发明的诊断方法也可以通过能全自动地进行上述混合操作和测定操作的测定仪器实施,适用于多个检测样品的测定。
实施例
在以下的实施例中进一步详细说明本发明,但本发明的范围不受此限制。
实施例1:HCV复合抗原的调制
作为HCV抗原,使用的NS3抗原是根据特表平5-508219号的实施例1记载通过基因重组制造的。采用的NS3多肽是HCV蛋白质中的1192~1457氨基酸序列。
使用的核心抗原、NS4抗原、NS5抗原是分别含有特表平5-508219号记载的49~68、1706~1725、2287~2306氨基酸序列的多肽、这些多肽是使用PERKIN ELMER社的多肽合成仪(Model431A)合成的。
首先将BSA(市售品、分子量66,000)溶于10mM PBS、pH7.0缓冲液中配成0.1%(w/v)浓度的BSA溶液,然后再将核心抗原(49~68氨基酸序列的多肽)溶于10mM PBS、pH7.0缓冲液中配成0.1%(w/v)浓度的核心抗原溶液。将7体积的核心抗原溶液加到1体积的BSA溶液中,最后加10mM PBS、pH7.0缓冲液配成9体积的混合溶液。然后加入1%的戊二醛水溶液,使反应开始,反应温度是30℃,30分钟后加1体积20%甘氨酸水溶液终止反应。
对于NS3、NS4、NS5抗原也进行同样的操作,用10mM PBS、pH6-8的缓冲液,对于1体积的1%(w/v)BSA溶液用1~8体积的0.1%(w/v)HCV抗原溶液与其反应,调制HCV复合抗原。
实施例2:HCV抗原致敏的胶乳的制造
将粒径0.78μm的聚苯乙烯胶乳粒子(积水化学工业株式会社制)于10mM PBS、pH4.0的缓冲液中配成5%(w/v)浓度胶乳分散液,然后向里边加入实施例1中调制的NS3复合抗原、NS4复合抗原、NS5复合抗原,添加的比例是每1ml胶乳分散液加50μg上述抗原,于4℃下反应24小时。然后离心(12000rpm,10分钟),再加入与起始同量的含有1mg/ml BSA的0.1M PBS、pH7.0的缓冲液,使粒子分散,再次离心,于同样的缓冲液中使粒子分散即制成HCV抗原致敏的胶乳。
实施例3:凝集反应
向10μl检测样品(被验者血液)中加10上l实施例2调制的HCV抗原致敏的胶乳(5%),再加入80μl含1mg/ml BSA的0.1M磷酸缓冲液,于45℃反应15分钟后,测定胶乳粒子的凝集度。该反应及测定可利用全自动免疫测定仪器PAMIA-30(东亚医用电子株式会社制)进行,测定前向角散射光。
凝集度以凝集的粒子数占总粒子数的百分数(P/T%)表示。
测定结果如表1所示。如表1表明的那样,在HCV抗体阳性检测样品中有很高的凝集度。而在HCV抗体阴性的检测样品中胶乳不凝集。因为在含有HCV抗体的检测样品中看到了凝集,由此可知HCV抗原致敏的胶乳粒子是通过与HCV抗体反应形成凝集的。
实施例4:早期检测灵敏度
利用市售的HCV抗体的系列血清PHV901,PHV902和PHV903(进口商:协和医学,制造商Boston Biomedica.Inc)进行HCV抗体阳性化的早期检测灵敏度试验,这组血清,是从同一个人HCV抗体阳性化过程中不同时间间隔采集的血组成的数个检测样品。将使用了实施例2中调制的诊断试剂的本发明的计数免疫测定法(CIA)与使用以下方法的其他商社的制品比较:
A社:利用红细胞的被动血球凝集法(PHA)
使用HCV抗原:核心、NS3、NS4
B社:酶免疫检测法(EIA)
使用HCV抗原:核心、NS3、NS4
C社:酶联免疫吸附检测法(ELISA)
使用HCV抗原:核心、NS3、NS4
得到的结果如以下表2、表3和表4所示。(表中B社和C社的数据给出了附带值)。若使用本发明的诊断试剂和诊断方法,与其他任一商社的诊断试剂相比,可以更早地检测出PHV902和PHV903(这些被验者系列血清,从采血的第一天开始,利用PCR检查抗体,就是阳性的)中HCV感染。
表2
表3
含有HCV抗体的系列血清PHV902
表4
含有HCV抗体的系列血清PHV903
实施例5:与将HCV抗原直接致敏的诊断试剂的比较
使用本发明的诊断试剂以及使用同一抗原直接致敏后制成的诊断试剂,进行HCV抗体检测灵敏度的比较试验。
将NS3抗原(通过基因重组法制得的)、核心抗原(通过合成法得到的多肽)、NS4(通过合成法得到的多肽)和NS5抗原(通过合成法得到的多肽)分别与BSA作成复合抗原后,通过实施例2的方法致敏,制成HCV复合抗原致敏的胶乳。
作为对照,使用同一抗原和同样的致敏条件,通过直接致敏,调制HCV抗原直接致敏的胶乳。
使用这些胶乳,利用实施例3的方法测定HCV抗体阳性的检测样品(A-E)以及HCV抗体阴性的样品(F~J)的凝集度(P/T%)。考虑到临界值(对于复合抗原致敏的乳胶是1.95%;对于抗原直接致敏的乳胶是1.01%)后进行了各个检测样品的HCV抗体阳性或阴性的判断。结果如表5所示。
表5
检测样品 | 复合抗原致敏胶乳 | 抗原直接致敏乳胶 | ||
凝集度(%) | 判定 | 凝集度(%) | 判定 | |
A | 15.87 | 阳性 | 0.34 | 阴性 |
B | 66.28 | 阳性 | 24.36 | 阳性 |
C | 35.28 | 阳性 | 6.35 | 阳性 |
D | 50.98 | 阳性 | 15.56 | 阳性 |
E | 17.88 | 阳性 | 0.55 | 阴性 |
F | 0.46 | 阴性 | 0.34 | 阴性 |
G | 0.56 | 阴性 | 0.36 | 阴性 |
H | 0.79 | 阴性 | 0.35 | 阴性 |
I | 0.62 | 阴性 | 0.56 | 阴性 |
J | 0.65 | 阴性 | 0.55 | 阴性 |
对于HCV抗体阳性检测样品A和E,若使用抗原直接致敏的诊断试剂不能检测出HCV抗体,但使用本发明的复合抗原致敏的诊断试剂却可以检测出HCV抗体。
实施例6:长期保存的稳定性试验
将实施例5的5%(w/v)的HCV抗原致敏的胶乳、0.1MPBS、pH7.0的悬浊液冷藏保存,进行试剂保存稳定性试验。所得结果如以下表6所示。
表6
HCV抗体阴性混合血清 | HCV抗体阳性混合血清 | |||
复合抗原致敏 | 直接致敏 | 复合抗原致敏 | 直接致敏 | |
0个月 | 0.71% | 0.75% | 41.90% | 12.46% |
1个月 | 0.71% | 0.72% | 40.85% | 11.56% |
3个月 | 0.75% | 1.02% | 46.83% | 10.79% |
6个月 | 0.78% | 1.22% | 43.47% | 10.62% |
9个月 | 0.82% | 1.50% | 43.86% | 9.79% |
12个月 | 0.75% | 1.62% | 41.62% | 8.62% |
13个月 | 0.78% | 1.97% | 43.35% | 8.65% |
临界值 | ||
复合抗原致敏 | 直接致敏 | |
0个月 | 2.35% | 1.25% |
1个月 | 2.51% | 1.35% |
3个月 | 2.56% | 1.56% |
6个月 | 2.55% | 1.82% |
9个月 | 2.25% | 2.10% |
12个月 | 2.33% | 2.32% |
13个月 | 2.44% | 2.57% |
以上结果清楚表明,复合抗原致敏的胶乳既使保存了13个月其凝集度仍很稳定。另外,使用直接致敏的胶乳在HCV抗体阴性的混合血清的试验中,其凝集度随保存期的延长逐渐地上升,而在用HCV抗体阳性的混合血清的试验中,其凝集度渐渐地下降,同时还可观察到临界值渐渐地上升。
实施例7:HCV抗原致敏胶乳的调制(2)
使用与实施例1相同的HCV抗原,除了不将NS3抗原作成复合抗原,而是直接致敏之外,其它操作与实施例2一样,调制HCV抗原致敏的胶乳。
实施例8:HCV抗原致敏胶乳的调制(3)
使用与实施例1一样的NS3抗原,核心抗原是上述公报(特表平5-508219号)记载的氨基酸序列49-68的多肽,NS4抗原是同一氨基酸序列中的1706-1725、1718-1737的多肽,用的NS5抗原是同一氨基酸序列中的2287-2306、2299-2318的多肽,与实施例1操作一样,使1~8体积的0.1%(w/v)HCV抗原溶液与1体积的1%(w/v)的BSA溶液反应来调制HCV复合抗原。而调制HCV抗原致敏胶乳的操作与实施例2一样。
实施例9:HCV抗原致敏胶乳的调制(4)
使用的NS3抗原与实施例1用的一样,而核心抗原是上述公报记载的氨基酸序列中的49~68一段多肽,NS4抗原是同一氨基酸序列中的1706~1725、1718~1737、1724~1743多肽,用的NS5抗原是同一氨基酸序列中的2287-2306、2299-2318、2311-2330多肽,与实施例1一样使1~8体积的0.1%(w/v)HCV抗原溶液与1个体积的1%(w/v)BSA溶液反应,调制HCV复合抗原,然后与实施例2同样操作调制HCV抗原致敏胶乳。
Claims (11)
1.一种C型肝炎病毒感染病诊断试剂,是用固相使HCV抗原、HCV抗原与载体蛋白通过化学结合调制的复合抗原致敏得到的。
2.权利要求1中记载的C型肝炎病毒感染病诊断试剂,其中HCV抗原是从核心抗原、NS3抗原、NS4抗原和NS5抗原中选择的抗原。
3.权利要求1或权利要求2中记载的C型肝炎病毒感染病诊断试剂,是用固相使从以下抗原和复合抗原中选出的3种以上的HCV抗原致敏后得到的,
a.核心抗原与载体蛋白质通过化学结合调制的复合抗原;
b.NS3抗原或NS3抗原与载体蛋白质经化学结合调制的复合抗原;
c.NS4抗原与载体蛋白质经化学结合调制的复合抗原;
d.NS5抗原与载体蛋白质经化学结合调制的复合抗原。
4.根据权利要求1-3中的任一项记载的C型肝炎病毒感染病诊断试剂,其中HCV抗原是一种以上的抗原,其中含有至少一种具有HCV抗原活性的不同的抗原决定簇。
5.权利要求1~4中任一项记载的C型肝炎病毒感染病的诊断试剂,其中载体蛋白质是从BSA、卵清清蛋白或血蓝蛋白中选择的。
6.权利要求1~5中任一项记载的C型肝炎病毒感染病的诊断试剂,其中固相是载体粒子。
7.权利要求6中记载的C型肝炎病毒感染病诊断试剂,其中载体粒子是疏水性粒子。
8.权利要求7中记载的C型肝炎病毒感染病诊断试剂,其中疏水性粒子是聚苯乙烯胶乳。
9.C型肝炎病毒感染病的诊断方法,是将权利要求6记载的C型肝炎病毒感染病诊断试剂加到检测样品中,测定载体粒子的凝集度。
10.权利要求9中记载的C型肝炎病毒感染病的诊断方法,其中凝集度是通过流式细胞仪测定的。
11.权利要求10中记载的C型肝炎病毒感染病的诊断方法,其中通过流式细胞仪测定的是前向角散射光。
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