CN1207174A - 使用参考微粒的分析法 - Google Patents
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Abstract
公开了测定样品中至少一种分析物是否存在的分析法,它包括步骤:(a)将样品与预定数量的第一测试微粒及惰性参考微粒混合以形成反应混合物,其中测试微粒上配置有可结合第一分析物的结合分子,然后让第一结合分子与第一分析物结合;(b)计数未反应的第一测试微粒和参考微粒的数目;和(c)将未反应的第一测试微粒数目与参考微粒比较,得出测量值,从而确定样品中分析物存在与否。在一优选例中,将第一测量值与非反应样品的对照值进行比较,并计算出变化值。还公开了含有微粒的组合物和试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及诊断领域,更具体地涉及使用分析方法在给定流体中检测感兴趣分析物。
背景技术
长久以来,凝集反应便被用于定性和定量地分析各种不同的细菌、细胞表面抗原、血清蛋白和临床上感兴趣的其他分析物。凝集作用通常是由抗体和有关抗原之间的反应造成的,从而产生可用不同方式检测和/或测量的聚集体。在典型的凝集分析方式中,先在诸如聚苯乙烯微粒(常称为“胶乳”)之类的颗粒上涂覆一种能结合感兴趣抗原的物质,然后将涂覆后的颗粒与样品(如血液或其他体液)混合。取决于具体的抗原,相互作用可能会导致颗粒相互凝集,或者可能阻碍凝集作用。在任何一种情况下,在颗粒与体液反应之后所存在的凝集颗粒数目会显示抗原的存在数目。通过添加与抗体结合的相应抗原,从而发生凝集反应,已将相同类型的反应用于检测特异性抗体。
已开发出了大量基于颗粒的免疫分析方法,它们利用抗原-抗体反应的特异性并避免了与常规诊断方法(如发射化学标记法)相关的问题。例如,比浊法和浊度法监测从大体积溶液(bulk solution)中众多颗粒所散射的光线。前一技术测量通过颗粒聚集体悬浮液的透光性,而后一技术直接测量特定方向上的散射光。这些方法的优点是不需要分离步骤,但是仅在用于分析样品中的单一分析物时它们才令人满意。
已经开发出了几种使用光学流动颗粒分析仪的凝集分析法,它们通过测量使用不同大小颗粒时的前向散射光,来感测聚集体的形成或非凝集化的程度。通过测定凝集的程度或者未反应(即未凝集)颗粒的数目,可确定样品中分析物的存在与否和/或数量。在授予Masson等人的美国专利No.4,279,617中所公开的凝集分析法中,包括以下步骤:将液体样品与第一颗粒试剂混合,该第一颗粒试剂可与感兴趣的抗原或抗体结合从而形成复合体;然后向混合物中加入第二种不同的颗粒试剂,该第二颗粒试剂会与复合体结合从而形成聚集体,但是不与游离的第一颗粒试剂结合。通过分析未凝集的第一或第二颗粒试剂,可以确定抗原或抗体的存在与否或数量。因此,为了进行定性分析,′617号专利指出,仅需要计数在反应混合物中仍处于游离状态的第一试剂颗粒数目,然后将该数据与第一步骤中所加入的该颗粒数目加以比较。在较新的Meth.Enzymol.74:106-141(1981)中出版的文章中,Masson等人新创了缩略词PACIA(particle counting immunoassay,即颗粒计数免疫分析法),来描述通过计数游离颗粒或未反应颗粒的数目来表明样品中分析物是否存在的凝集分析法。Masson公开了,可使用自动计数仪来测量来自某一大小范围内非凝集颗粒的前向光散射,但排除所有其他颗粒的光散射。但是,PACIA法的用途很有限,尤其是因为非特异性凝集反应和类风湿因子干扰所造成的不准确性。请参见Newman等人,Ann.Clin.Biochem.29:22-42(1992)和Limet等人,J.Immunol.Meth.28:25-32(1979)。
授予Cambiaso等人的美国专利No.4,184,849也指出了在凝集分析中使用光学计数系统如自动计数仪,其中通过将样品与两种不同的颗粒试剂混合,这两种颗粒试剂可相互凝集,但该凝集反应可被待分析的特定抗体或抗原所抑制,从而检测液体中是否存在抗体或抗原。通过测定凝集程度或非凝集程度,可以测定样品中存在的抗原或抗体数量,非凝集程度可简单地计数非凝集颗粒的数目或使用鉴别性的标记即可。
授予Uzgiris等人的美国专利No.4,191,739涉及一种凝集分析法,它通过用电阻脉冲分析(resistive pulse analysis)检测具有某一大小的复合颗粒(multiplets)来确定样品中蛋白质的存在与否,其中该种颗粒是只有具有第一预定大小的颗粒与具有第二预定大小的颗粒凝集才能形成的。该方法声称,通过考虑非特异形成的复合颗粒的最初分布情况,可提高分析的准确度。
授予Cohen等人的美国专利No.4,851,329涉及一种凝集分析法,其中通过光学脉冲颗粒尺寸分析法确定凝集颗粒的团粒尺寸分布。通过测量在一系列已知浓度的分析物稀释液中颗粒二聚体数目与颗粒单体数目之比,或者其他任何团粒尺寸分布的量度,可以建立标准的定量关系。
这些分析局限于单种分析物的分析。因此,仍需要一种凝集分析法,该分析法可同时测量给定样品中的多种分析物,而且还通过减少稀释误差的效应、仪器缺陷等对分析结果的影响来提高精确度。
发明概述
本发明的一个方面涉及检测样品中分析物是否存在的分析法,该方法包括下列步骤:
(a)将样品与预定数量或比例的测试微粒及参考微粒混合,以形成液体反应混合物,其中在测试微粒上配置有(dispose)可结合分析物的结合分子,而参考微粒不与分析物和结合分子发生反应,然后让结合分子与分析物结合;
(b)计数参考微粒和未反应的测试微粒的数目;以及
(c)将未反应的测试微粒数目与参考微粒比较,得出测量值,从而确定样品中分析物的存在与否。
较佳地,分析方法还包括步骤(d):将上述测量值与不含分析物的非反应样品的对照值进行比较,在这种情况下通过计算测量值与对照值之间的变化值而确定样品中分析物的存在与否。在一个更佳例子中,测量值是反应后步骤(c)中未反应测试微粒数目与参考微粒数目之比。在步骤(d)中的对照值,是对非反应样品采用相同程序而获得的未反应测试微粒数目与参考微粒数目之比。因此,对照值可称为“对照比值”,而测量值可称为“测量比值”。通过获得对照比值与测量比值之间的差值,然后将该差值除以对照比值,可以计算出变化值。该结果也可以百分比表示。在一个更佳例子中,变化值是通过将对照比值除以测量比值而计算出的,而该结果也可以百分比表示。
根据本发明这一方面的方法,提供了显著的优点。因为测量值和对照值代表的是未凝集颗粒的减少,而不是特定大小范围内颗粒凝集物的形成,所以基本上消除了形成稍大或稍小凝集物所造成的误差。此外,因为测量值和对照值是作为未凝集的测试微粒数目与惰性参考微粒数目之间的相互关系计算出的(如上述的测量比值和对照比值),因此,也基本上消除了因反应混合物稀释不准确以及颗粒计数不准确所造成的误差。该方法还提供了每种测试颗粒更高的分辨率,从而可同时进行多种测量。它还降低了对大的颗粒聚集体进行计数时固有的不精确性。
参考微粒还提高了本发明分析方法的准度和精度,因为它们可作为总体的表露性(on-board)诊断方法来评估仪器和分析方法本身。参考微粒所产生的响应质量如直方图宽度或受检微粒的速率(rate),可表示系统的扰动,包括系统的流体(如阻塞)、电学或光学特征。超过预定任意数值的参考微粒的聚集化,如二聚化、三聚化等,可表示测试微粒的非特异性结合。参考微粒还进一步提高了稀释准确度(它是计数速率的函数)。它们可鉴别出或解释诸如系统漂移之类的现象。
本发明的另一个方面涉及检测样品中至少2种分析物是否存在的分析法,该方法包括下列步骤:
(a)将样品与预定数量或比例的第一测试微粒、第二测试微粒及参考微粒混合以形成反应混合物,其中在第一测试微粒上配置有可结合第一分析物的第一结合分子,在第二测试微粒上配置有可结合第二分析物的第二结合分子,而参考微粒不与第一和第二分析物以及第一和第二结合分子发生反应,然后让第一结合分子与第一分析物结合,让第二结合分子与第二分析物结合;
(b)计数未反应的第一测试微粒、未反应的第二测试微粒和参考微粒的数目;以及
(c)将未反应的第一测试微粒数目与参考微粒比较,得出第一测量值,并将未反应的第二测试微粒数目与参考微粒比较,得出第二测量值,从而确定样品中第一和第二分析物的存在与否。
较佳地,分析方法还包括步骤(d):将第一测量值与非反应样品(该样品不含第一分析物)的第一对照值进行比较以确定样品中第一分析物的存在与否,并将第二测量值与非反应样品(该样品不含第二分析物)的第二对照值进行比较以确定样品中第二分析物的存在与否。该分析法可对单一样品同时进行多分析物分析,并提供上面论述的优点。如果需要测量2种以上的分析物,可以使用额外的测试微粒。
另一方面,本发明涉及一种在检测样品中分析物是否存在的分析法中使用的试剂盒。该试剂盒包括下列组份:
(a)测试微粒,在测试微粒上配置有可结合分析物的结合分子;和
(b)参考微粒,参考微粒不与分析物、测试微粒和结合分子反应;
其中测试微粒和参考微粒以预定数量或比例位于该试剂盒的每个反应容器中。
还提供了用于检测样品中是否存在多种分析物的试剂盒,该试剂盒包括下列组份:
(a)第一测试微粒,在第一测试微粒上配置有可结合第一分析物的第一结合分子;
(b)第二测试微粒,在第二测试微粒上配置有可结合第二分析物的第二结合分子;和
(c)参考微粒,该参考微粒不与第一和第二分析物、第一和第二测试微粒以及第一和第二结合分子反应;
其中第一和第二测试微粒及参考微粒以预定数量或比例位于该试剂盒的每个反应容器中。
在优选例子中,微粒以干燥形式提供,并被合适地包装起来以便与样品混合。例如,可将预定数量的每种干微粒独立地放置在多凹腔密封容器的凹腔中,当向容器中加入流体样品时会导致干微粒重组(reconstitution)并形成反应混合物,从而允许分析物和各自结合分子之间发生特异性结合反应。干微粒还可以组合物形式混合提供,一旦与样品流体接触便会重组。
本发明的分析法可有利地用于确定各种不同分析物的存在与否,如对风疹病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、梅毒、巨细胞病毒和弓形体特异的抗体。可分析各种不同样品,其中包括血液和其他流体如血清、血浆、唾液、脑脊液(CSF)、尿液和固体的洗出液(eluate)。
附图简述
图1是在其中实施本发明一个优选例子的多凹腔容器的剖面图。
实施发明的最佳方式
本发明涉及分析样品以检测感兴趣分析物是否存在的方法。术语“样品”指可能含有感兴趣分析物的生物流体如血液、血浆、血清、唾液、CSF、和尿液,以及其他类型的流体、细胞或材料。“细胞”指从身体器官或其他组织(如肿瘤)获得的任何样品,可用其制备细胞悬浮液。术语“分析物”指这样的任何物质;对于该物质存在特异性的结合物(即结合分析物的结合分子),或者对于该物质可制备特异性的结合物,并且该物质在分析中会与特异性结合物发生结合。代表性的分析物包括:抗原、半抗原、抗体及其组合形式,包括蛋白质、肽、氨基酸、激素、类固醇、维生素、药物、核酸及其代谢产物。可用本发明方法检测的有关抗体、抗原或核酸包括一旦与结合分子接触或反应能够凝集的任何抗体、抗原或核酸,尤其是那些存在于生物样品中就表明炎症或疾病状态的抗体和抗原。代表性的抗体包括抗风疹病毒抗体、抗-HSV I抗体、抗梅毒抗体、抗巨细胞病毒抗体、抗弓形体抗体、抗真菌抗体、抗寄生虫抗体和抗-HIV抗体。代表性的感兴趣抗原包括:蛋白质,比如激素如TSH、HCG、T4,糖蛋白,药物和微生物(如细菌、病毒和原生动物,以及它们的抗原片段如HBsAg。术语“半抗原”指一种低分子量的、有生理活性的物质,它单独时不能在哺乳动物中产生抗体应答反应,但是结合于本身有免疫原性的物质时就能够产生抗体并与该抗体反应。典型的半抗原包括:药物如雄激素、雌激素、孕激素、肾上腺皮质激素、甲状腺激素、生理活性胺、药物等,以及它们的代谢副产物。词语“结合分析物的结合分子”指特异性结合配对物中的一个成员,其中,配对物的一个分子可通过化学或物理方式特异性地结合于第二个分子,并且与其他物质没有交叉反应。典型的结合分子包括抗原、抗原片段、受体、核酸、多克隆或单克隆抗体、以及它们的片段或复合物。这种对某一分析物特异的结合分子可通过市售渠道获得,或者用标准程序制得。
为了实施本发明的分析法,首先需要提供在上面配置有与分析物结合的结合分子的微粒(以下称为“测试微粒”),以及对分析物和结合分子基本上惰性(即不反应)的微粒(以下称为“参考微粒”)。测试微粒可用任何天然的或合成的、能够在上面配置配置结合分子(如抗原或抗体)的材料制备,这样的材料包括:玻璃;丙烯酰胺或甲基丙烯酸酯;尼龙;微观氧化物粉末;胶乳聚合物材料和它们的磁性衍生物,如烯属不饱和单体的聚合物比如聚苯乙烯、丙烯腈和聚丁二烯以及它们的衍生物和共聚物(参见例如Bangs,L.B.,
Uniform Latex Particle,Seragen,Indianapolis,1984和美国专利No.4,305,925);葡聚糖;纤维素及其衍生物;以及天然颗粒物质如红细胞、花粉、脂质体和细菌。参考颗粒可用与测试颗粒相同或不同的材料制成。同样,参考颗粒应对配置在测试颗粒上的结合分子及分析物基本上惰性(即不反应)。可通过已知程序如化学处理而赋予参考颗粒惰性。优选的用于参考颗粒的材料列于上面。
在优选例子中,选择测试微粒和参考微粒的化学构成和/或尺寸,以使它们在检测器的灵敏度水平和选定的计数未反应(即未凝集)的测试微粒和参考微粒的方式下能彼此分辨开。但应理解,能够产生均一的检测器响应的任何其他特性或可测量的特征都可提供合适而可靠的基础,并在此基础上选择微粒用于所公开的分析方法。较佳地,每个测试微粒和参考微粒都大小均一。在颗粒是通过基于粒径而分辨不同颗粒的技术进行计数的场合,如在电子计数法和各种光学计数法中,测试颗粒和参考颗粒应大小不同。同样,在使用数种不同测试颗粒的场合,如在同时检测某一样品中是否存在多种分析物的凝集分析中,颗粒也可大小不同。一般,载体微粒的大小约为0.1μ-20μ。而参考微粒的大小约为0.1μ-20μ。这些大小范围也取决于所用的计数技术和结合分子的性质。采用光学计数技术分析,还可根据各自的折光率而分辨或区分测试微粒和参考微粒。众所周知,不同组成的颗粒在不同方向上散射光的情况会不同。参见,M.Kerker,
《光和其他电 磁辐射的散射》(The Scattering of Light and Other Electromagnetic Radiation),Academic Press,N.Y.1969,和授予Hansen等人的美国专利No.5,369,037。
可根据标准技术如物理(被动)吸附法、易化(facilitated)(加强)吸附法和共价偶联法,将结合分子配置在测试颗粒上。例如,可通过用能连接蛋白质的化学官能团进行改性,而将结合分子共价地偶联于测试微粒表面。美国专利No.4,064,080公开了具有末端氨基苯基基团的苯乙烯聚合物,以及连接于该聚合物的蛋白质。美国专利No.4,181,636指出了通过水溶性激活剂偶联至免疫活性材料上的羧化的胶乳聚合物。美国专利No.4,210,723指出了一种外壳-核心式的胶乳聚合物颗粒,其直径为0.15-1.5微米且在颗粒表面上有自由的环氧基。美国专利No.4,264,766涉及一种胶乳聚合物,它具有诸如羧基和氨基之类的活性基团,水溶性的多羟基化合物可共价连接在这些基团上,而且用与活性试剂(如碳化二亚胺)处理后,这些基团可共价偶联于免疫活性物质。还可参见美国专利No.4,521,521和4,305,925。可使用这些专利中公开的技术,将结合分子连接于测试微粒。在测试微粒是聚苯乙烯颗粒的优选例子中,可用各种其他官能团如羟基、羧基、胺、丙烯酰胺、和聚合物型羧酸根等,在颗粒表面上替换稳定颗粒的硫酸根带电基团,从而有利于结合分子配置(如涂覆或吸附)在微粒表面上。还可参见SeamanG.V.F.(编辑)
Latex Based Technology in Diagnostics,Health & ScienceCommunications,Washington,D.C.20005(1990)。涂有结合分子的测试微粒也可购得。
测试微粒和参考微粒宜包装在一起,以方便在测试中使用。一种优选的包装是图1所示的杯子。杯子10由分别具有内表面13和外表面13′的壁12构成。杯子10宜由惰性聚合物材料如聚丙烯、聚乙烯或其他合适的热塑性材料制成。内表面13的底部具有凹槽或腔14和16,其中分别含有干测试微粒14′和参考微粒16′。杯子用可剥离或可穿刺的密封件19加以封闭,密封件19可以是热封的金属箔或其他膜。可在干燥之后将微粒置于凹腔中。更佳地,微粒可以浆料形式装入各凹腔中,然后在凹腔中就地干燥。在干燥之前,各保持着微粒使其相互隔开。在干燥之后搬动杯子时,微粒可相互混合,但是这种混合在没有液体介质的情况下是不会引发反应的。然而,本发明的例子并不局限于上面所叙述的特征。将各种测试微粒和参考微粒隔开(如放置在独立的各自凹腔中)并不是必需的。在没有凹槽或凹腔的容器中进行分析测试甚至是更佳的。此外,微粒也可以液体形式提供。
然后在合适的条件下,将可能含有有关分析物的样品与预定数量的测试微粒(其上配置有结合分析物的结合分子)及参考微粒混合,以形成液体反应混合物并让结合分子与分析物之间发生可测量的反应。如果样品本身是液态,那么可将微粒加入样品,反之亦然。作为替换形式或额外形式,样品和微粒也可与液态稀释剂(通常是水性稀释剂)混合。在一个优选例子中,反应是在图1所示的容器中进行的。为了进行反应,将封盖19刺穿,或者从杯子凸缘18上取下。接着通过加入待测试的样品(可有或没有水性稀释剂),并适当地进行分散和拌合操作如搅拌和摇晃而重组微粒。任选地,可对重组的微粒进行超声波处理。
取决于分析物的性质以及所用的样品和微粒的数量等因素,反应通常约为1分钟-2小时。一旦让可测量的反应进行了,则可计数未反应的测试微粒和参考微粒并相互比较以得到测试值。在本发明的一个优选例子中,微粒是用细胞计量术计数的:让悬浮液通过电子的或化学的流动颗粒分析仪(FPA),该仪器可通过监测各颗粒或其聚集体(当它们各自通过电子或光学感测区时)的大小而检测颗粒凝集情况。电子型FPA一般测量反应混合物的电阻抗,即让反应混合物通过一狭窄的小口(orifice)然后测量通过小口的电阻抗。当混合物中的液体是导电的而颗粒是不导电的情况下,当颗粒或颗粒团聚物(agglomerate)通过小口时,横跨小口的电阻抗会增加。增加的程度与微粒或凝集物的大小直接相关,而且代表不同大小颗粒的信号可相互分开。
如下所述,光学FPA通过测量各微粒光散射的不同性质来区分微粒凝集体的粒径和形成情况。光学FPA的例子公开于美国专利No.4,279,617、4,184,849、4,1919,739、5,286,452、5,369,037、以及未审定的共同拥有的美国专利申请08/473,187中。使用光学FPA,尤其是那些公开于美国专利No.5,286,452、5,369,037、和美国专利申请08/473,187中的FPA,是优选的。在该例子中,未反应的测试微粒和参考微粒可根据大小和/或折射率、荧光或吸光度而加以区分。
如上所述,用于计数不同类型的微粒和微粒凝集体的技术是众所周知的,因而并不是本发明的组成部分。然而,为了便于理解,在下面描述了用FPA进行的颗粒计数和分类。为了用光学FPA进行本发明分析方法,让反应混合物的细流通过流通池(flow cell),并用一束来自入射光源(如激光)的光线照射该流通池。选择流动流形式和光束形式,使得各微粒或各微粒凝集体一个接一个地通过光束,而且任何时候只有一个微粒或凝集体处于光束之中。当各微粒或凝集体通过入射光束时所散射、反射和发射出的光线,被合适的传感器所检测,从而产生各微粒或凝集体的信号。不同类型微粒和凝集体的各自信号特征是不同的。按具体类型微粒或凝集体的特有信号进行归类,从而计数出不同类型的微粒或凝集体。例如,在光散射FPA中,由各微粒或凝集体所产生的散射光强度与颗粒或团聚体的大小直接相关,而且与微粒或凝集体的折射率直接相关。因此,在某一强度范围内的散射光信号表示单个的非凝集的测试微粒,而另一范围内的信号表示非凝集的参考微粒。通过计数各范围内的信号,可以计数出反应混合物中未凝集测试微粒和未凝集参考微粒的数目。在另一个光强度范围内的信号表示2个测试微粒构成的凝集体(即二聚体);在另外一个范围内的信号表示3个或更多个测试微粒构成的凝集体(即三聚体或多聚体)。在另一个光强度范围内的信号表示2个参考微粒构成的凝集体(即二聚体);在另外一个范围内的信号表示3个参考微粒构成的凝集体(即三聚体等,统称为自我凝集体)。用这种方式,还可以通过计数出处于自我凝集体如二聚体和三聚体形式的微粒,而确定测试微粒和参考微粒的数目。
信号的分类和计数程序可通过确定一个统计分布而进行,如基于各种类型微粒所产生的光散射的某一具体特征(如脉冲高度)的直方图。直方图通过生成微粒的频数分布,可作为FPA所检测到的微粒类型和数目的统计总结。在本发明的一个优选例子中,用模拟-数字转换器将各受照射微粒产生的脉冲峰高度数字化,然后将大于某一任意确定的数值(例如为了消除因噪音而造成的假信号)的每个数字化数值(如以伏特表示)传输给计算机程序,从而得到直方图。该步骤可用合适的收集方式完成,如用涉及至少一个数据收集周期的直接存储器存取。程序将信号数作为数字化值(如伏特)的函数画出。为每种类型的微粒或凝集体确定一个涵盖脉冲高度值预期散布的窗(window)或范围。可修改收集方式以便为每个窗建立预定数目的计数。在一个更佳例子中,一旦得到直方图,那么就可以通过建立预定的窗或通过自动峰值搜索分类而确定不同的微粒数目。上述关于FPA操作和颗粒分类及计数技术的描述,仅仅是代表性的。有另一些FPA技术基于除散射光之外信号,如荧光颗粒发射出的光线或微粒反射的光线。还有其他一些技术使用特征组合来区分信号,如各颗粒发射的荧光和该颗粒散射光之间的关系。任何一种已知的用于计数和分类微粒的技术都可使用。
然后计数位于未反应的测试微粒窗和参考微粒窗中的次数(即各数据点)的总数。在发生参考微粒非特异性凝集的情况下,还可通过计数这类凝集体并乘上每种类型中各参考微粒的数目,而进一步提高分析准确度。
然后将未反应测试微粒的数目与参考微粒的数目进行比较,得出测试值。在本发明的一个优选例子中,测量值是未反应的测试微粒数目与参考微粒数目的比值。但是,也可使用基于这两个数目的其他测量值,如未凝集的测试微粒数目和参考微粒数目之间的差值。在一个优选例子中,将测量值与非反应样品(不含分析物)的对照值进行比较(该对照值是用相同的上述程序测定的),然后根据测量值和对照值计算出变化值。在一个较佳例子中,计算出的变化值是以百分比表示的测试微粒的下降值(相对于最初的预定的粒子数)。根据该优选例子(其中测量值和对照值为比值),用对照比值减去测量比值,再将差值除以对照比值,并乘以100,从而得到变化比值。在本发明的一个更佳例子中,用对照比值除以测量比值而得到变化比值,这样对于含有更多数量分析物的样品变化比值就增大。可将变化值与根据标准程序(如测试已知的阳性和阴性样品)而得的阈值相比较。例如,如果变化值大于上阈值,那么就认为分析为阳性而且证实流体样品中存在分析物。相反,低于下阈值的变化值就表示阴性结果。
本发明分析法还可用于检测给定样品中的多种分析物。为了以这种形式进行分析,需要提供对每种待检测分析物具有特异作用并可相互分辨的测试微粒,以及用于给定计数方法的参考微粒。例如,在检测样品中是否存在2种分析物的分析方法中,需要提供第一测试微粒、第二测试微粒和参考微粒,其中在第一测试微粒上配置有可结合第一分析物的第一结合分子,在第二测试微粒上配置有可结合第二分析物的第二结合分子。对于每种不同的未反应测试微粒的测量值,可根据同一参考微粒数目而计算出。
与测定单一分析物的情况相同,可将用于多分析物分析法的试剂各自加工成干粉末或片剂,或者混合形成组合物。另外地或额外地,试剂还可被包装在测试盒中,该测试盒可包括:适用于在与样品和任选的物质(如液态稀释剂等)混合后重组微粒,并且进行结合分子-分析物反应的容器。
在本发明的上述优选的、涉及使用光学细胞计量术分析样品的例子中,可将微粒或凝集体产生的散射光的峰高度用作判据,来区分属于特定类型的微粒或凝集体,如未反应的测试微粒、参考微粒、测试微粒的凝集体等。也可使用其他的光散射性质,包括脉冲振幅、脉冲宽度、脉冲振幅与宽度的乘积、积分脉冲面积、或者在相同或不同散射角处这些参数其他线性或非线性函数。由通过FPA的每种类型颗粒所产生的光散射信号,可在前向低角度(即与入射光束轴成约3-7度)、成约85-95度(即基本上为侧散射信号)、或成约95-180度(即反向散射信号)的位置加以测量。
然而更常见地,也可这样实施本发明方法,其中未反应的测试微粒和参考微粒是通过测量反应混合物的电特性而计数的,如电阻-脉冲(阻抗)、电容或电阻。阻抗-脉冲技术是将颗粒悬浮在电解质溶剂中,使得进入孔的每个颗粒取代了一部分溶剂,从而造成孔导电率的改变。因为导电率的改变与颗粒体积大小成比例,因此通过让成千上万的颗粒通过孔,可以累积得到样品的大小分布。因为测量及随后的信号处理是很快速的,所以可在短时间内(通常为数分钟)获得统计学上有意义的分布。请参见,例如美国专利No.4,191,739。在美国专利No.4,072,576中公开了基于电容的分析系统的一种例子。基于颗粒电测量值的其他分析系统公开于美国专利No.5,284,748。本发明方法还可用非细胞计量术技术(如图像分析)进行。
如上所述,并不需要计数测试微粒的凝集体;有关凝集程度的信息,是根据反应后留下的未凝集的测试微粒并与参考微粒数目比较而得出的。然而,如果计数凝集体,那么该计数可用作分析方法的交叉核对措施。因此,如果反应后混合物中未凝集的测试微粒与参考微粒之比显著低于不反应的对照混合物中的相应比例(这就表明测试微粒发生了明显的凝集),那么凝集微粒的计数就应高。如果不是,就表明计算机给出了错误信号。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于阐述目的,而不起限制作用,除非另外说明。
实施例
实施例1
同时检测对鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、风疹病毒和巨细胞病毒(CMV)特异的抗体的分析
分析试剂的制备
从Interfacial Dynamics,Inc.(Portland,OR)获得直径为1.1微米、1.6微米、1.7微米、和1.9微米的聚苯乙烯胶乳颗粒。鼠弓形体、风疹病毒和CMV抗原分别从Ross Southern Laboratories(Salt Lake City,UT)、Viral Antigens,Inc.(Memphis,TN)、和Advanced Biotechnologies(Columbia,MD)购得。3种抗原用洗涤剂进行破碎,超声波处理,并如下用pH9.6的碳酸盐/碳酸氢盐溶液进行稀释:弓形体抗原稀释为50微克/毫升;风疹病毒稀释为10微克/毫升;而CMV稀释为50微克/毫升。将洗涤过的聚苯乙烯颗粒以2%(w/v)浓度悬浮在相同的缓冲液中,并混入相同份数的颗粒和抗原,即1.6微米颗粒与弓形体溶液、1.7微米颗粒与风疹病毒溶液、以及1.9微米颗粒与CMV溶液。混合物在室温下晃动,即对弓形体和风疹病毒晃动2小时而对CMV晃动1小时。过多的抗原通过离心法去除,3种涂覆后的颗粒悬浮液,每种都在0.1M甘氨酸pH7.0、0.1%BSA、5%蔗糖和0.1%叠氮化钠中洗涤3次。洗涤后的颗粒以1%(w/v)再悬浮于相同的缓冲液中。
为了制备内部参考颗粒(IRP),将1.1微米聚苯乙烯颗粒加以洗涤并再悬浮在0.1%SDS中,然后晃动1.5小时。接着在碳酸盐/碳酸氢盐溶液中洗涤3次,并在0.1M甘氨酸pH7.0、0.1%BSA、5%蔗糖和0.1%叠氮化钠中洗涤3次,再以1%(w/v)浓度再悬浮于相同的缓冲液中。
然后在各杯子中干燥4种涂覆颗粒的混合物。先用超声波短暂地处理每种涂覆颗粒以便分开聚集体,然后制备4种类型颗粒的混合物。对于每个待用杯子,混合下列份数的1%(w/v)涂覆颗粒悬浮液:IRP为3.5微升;弓形体为15微升;风疹病毒为10微升以及CMV为20微升。离心处理该混合物,从而将混合物浓缩至20微升/杯,以供使用。然后用超声波短暂地处理混合物以便分开聚集体。然后将20微升的混合物加入每个1500CC的杯子。
含有颗粒混合物的杯子在37℃真空炉中干燥过夜。然后在杯子被密封之前,在每个杯子中放一根金属搅拌棒。密封后的杯子储藏在室温下,以供使用。
为了进行分析,将所需数目的杯子置于CopalisTM One免疫分析仪器上(每次最多可放24只杯子)。用仪器刺穿杯子封盖,加入180微升反应缓冲液(0.5M溴化钾、0.1M甘油、pH9.0、1%BSA、0.2%叠氮化钠、1.5%聚乙二醇,MW6000-8000)。用该设备短暂地超声波处理各杯子以便分开聚集体,然后将待测试样品(20微升人血清或对照物质)加入每个杯子中。对照物是已知存在或不存在鼠弓形体、风疹病毒和CMV特异性抗体的样品。一个没有反应性的样品(1%β-乳球蛋白),被用于获得下面分析章节所讨论的阴性反应对照计数。当样品加入各杯子时,仪器就开始使该杯中搅拌棒运动,从而开始10分钟的保温期。
数据分析
在每个杯子中的物质被搅拌10分钟之后,仪器从每个杯子中取出一份样品。对于弓形体(在表1中为“A”)、风疹(“B”)和CMV(“C”),都相对内部参考微粒,计数剩下的未反应颗粒(即单体)的数目,当计数到10,000个内部参考微粒时,就结束每个杯子中对未反应测试微粒的计数工作。用这些数目进行表1中所列的计算。
用数种已知的抗体阴性或抗体阳性样品进行相同的程序,以便为3种抗体测试中的每一种建立截止值(cutoff)或阈值。对于鼠弓形体、风疹病毒和CMV的截止值列于表2。
表2
分析成分 | 截止值(CTR) | 结果分析 |
鼠弓形体抗体 | <111≥111 | 阴性阳性 |
风疹病毒抗体 | <114≥114 | 阴性阳性 |
CMV抗体 | <111≥111 | 阴性阳性 |
根据截断值进行解释,将未知样品的结果列于表3。
表3
样品类型(1) | 鼠弓形体数据 | 结果分析 | 风诊病毒 | CMV | ||
T-,R-,C- | 100 | - | 98 | - | 100 | - |
T+,R-,C- | 140 | + | 100 | - | 99 | - |
T-,R+,C- | 106 | - | 153 | + | 103 | - |
T-,R-,C+ | 99 | - | 107 | - | 286 | + |
T+,R+,C- | 150 | + | 144 | + | 99 | - |
T-,R+,C+ | 105 | - | 356 | + | 175 | + |
T+,R-,C+ | 154 | + | 106 | - | 194 | + |
T+,R+,C+ | 166 | + | 280 | + | 197 | + |
说明
1.用商业化的,用于检测鼠弓形体、风疹病毒和CMV抗体的测试方法加以测试,而确定了这些样品的确切的抗体状况。
工业应用性
本发明主要可被用作诊断工具来鉴别感染或疾病。因此,它可被相关领域的常规测试人士如医务检验人员有利地使用,以确定生物流体中分析物的存在与否。本发明还可用于从其他来源如环境中取得的流体样品。
所有在本说明书中提到的出版物和专利申请代表了本发明相关领域中技术人员的水平。所有这些出版物和专利申请都在此引用作为参考,就好象每篇出版物和专利申请被具体地和单独地指明被引用作为参考。
此处所描述的本发明的各种变动形式对本领域技术人员而言是显而易见的。这些变动形式也在所附权利要求限定的范围内。
Claims (46)
1.一种测定样品中分析物是否存在的分析方法,其特征在于,该方法包括下列步骤:
(a)将样品与预定数量的测试微粒及参考微粒混合,以形成反应混合物,其中在测试微粒上配置有可结合分析物的结合分子,而参考微粒不与分析物和结合分子发生反应,然后让结合分子与分析物结合;
(b)计数未反应的测试微粒和参考微粒的数目;以及
(c)将未反应的测试微粒数目与参考微粒比较,得出测量值,从而确定样品中分析物的存在与否。
2.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,还包括步骤(d):将该测量值与非反应样品的对照值进行比较。
3.如权利要求2所述的分析方法,其特征在于,该比较步骤(d)包括步骤(e):计算测量值与对照值之间的变化值。
4.如权利要求3所述的分析方法,其特征在于,该步骤(e)包括步骤(f):获得该对照值与测量值之间的差值。
5.如权利要求4所述的分析方法,其特征在于,该步骤(f)还包括步骤(g):将该差值除以对照值。
6.如权利要求3所述的分析方法,其特征在于,该步骤(e)包括步骤(h):将该对照值除以测量值。
7.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,该步骤(c)包括步骤(i):计算未反应测试微粒的数目与参考微粒数目之比。
8.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,该计数步骤(b)包括:用电子学方法计数未反应测试微粒和参考微粒的数目。
9.如权利要求8所述的分析方法,其特征在于,该计数步骤(b)包括:测量反应混合物的阻抗。
10.如权利要求9所述的分析方法,其特征在于,该计数步骤(b)还包括:测量反应混合物的电阻。
11.如权利要求8所述的分析方法,其特征在于,该计数步骤(b)包括:测量反应混合物的电容。
12.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,该计数步骤(b)包括:用光学方法计数未反应测试微粒和参考微粒的数目。
13.如权利要求12所述的分析方法,其特征在于,该计数步骤(b)包括:用细胞计量术测量未反应测试微粒和参考微粒的光散射特性。
14.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,该计数步骤(b)包括:计数处于自我凝集体形式的未反应测试微粒和参考微粒的数目。
15.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,测试微粒、参考微粒或测试微粒和参考微粒两者含有聚合物材料。
16.如权利要求15所述的分析方法,其特征在于,该聚合物材料包括聚苯乙烯或其衍生物。
17.如权利要求16所述的分析方法,其特征在于,胶乳聚合物包括聚丁二烯或其衍生物。
18.如权利要求15所述的分析方法,其特征在于,测试微粒是具有表面化学官能团的聚合物材料。
19.如权利要求18所述的分析方法,其特征在于,该表面化学官能团是丙烯酰胺基团。
20.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,该分析物是抗体。
21.如权利要求20所述的分析方法,其特征在于,结合分子是与分析物抗体结合的抗原。
22.如权利要求21所述的分析方法,其特征在于,该分析物抗体是抗风疹病毒抗体。
23.如权利要求22所述的分析方法,其特征在于,结合分子是灭活的风疹病毒的抗原性片段。
24.如权利要求20所述的分析方法,其特征在于,该分析物抗体是抗-HSV I抗体。
25.如权利要求24所述的分析方法,其特征在于,结合分子是灭活的HSV I的抗原性片段。
26.如权利要求20所述的分析方法,其特征在于,该分析物抗体是抗梅毒抗体。
27.如权利要求20所述的分析方法,其特征在于,该分析物抗体是抗-巨细胞病毒抗体。
28.如权利要求27所述的分析方法,其特征在于,结合分子是灭活的巨细胞病毒的抗原性片段。
29.如权利要求20所述的分析方法,其特征在于,该分析物抗体是抗弓形体抗体。
30.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,该样品是血液。
31.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,该样品是血清。
32.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,该样品是血浆。
33.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,该样品是唾液。
34.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,该样品是脑脊液。
35.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,该样品是尿液。
36.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,该样品包括从身体器官或组织获得的细胞。
37.一种检测样品中至少2种分析物是否存在的分析方法,其特征在于,该方法包括下列步骤:
(a)将样品与预定数量的第一测试微粒、第二测试微粒及参考微粒混合以形成反应混合物,其中在第一测试微粒上配置有可结合第一分析物的结合分子,在第二测试微粒上配置有可结合第二分析物的结合分子,而参考微粒不与第一和第二分析物以及第一和第二结合分子发生反应,然后让第一结合分子与第一分析物结合,让第二结合分子与第二分析物结合;
(b)计数未反应的第一测试微粒、未反应的第二测试微粒和参考微粒的数目;以及
(c)将未反应的第一测试微粒数目与参考微粒比较,得出第一测量值,并将未反应的第二测试微粒数目与参考微粒比较,得出第二测量值,从而确定样品中第一和第二分析物的存在与否。
38.一种在检测样品中分析物是否存在的分析法中使用的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括:
(a)测试微粒,在测试微粒上配置有可结合分析物的结合分子;和
(b)参考微粒,参考微粒不与分析物和结合分子反应;
其中测试微粒和参考微粒以预定比例存在。
39.如权利要求38所述的试剂盒,其特征在于,还包括用于将所述测试微粒和参考微粒与样品混合的容器。
40.如权利要求39所述的试剂盒,其特征在于,该测试微粒和参考微粒被放置于该容器中。
41.如权利要求39所述的试剂盒,其特征在于,该容器包括用于将测试微粒和参考微粒密封在该容器中的密封件。
42.如权利要求38所述的试剂盒,其特征在于,该测试微粒和参考微粒为干燥形式。
43.一种在检测样品中至少2种分析物是否存在的分析法中使用的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括:
(a)第一测试微粒,在第一测试微粒上配置有可结合第一分析物的第一结合分子;
(b)第二测试微粒,在第二测试微粒上配置有可结合第二分析物的第二结合分子;和
(c)参考微粒,该参考微粒不与第一和第二分析物以及第一和第二结合分子反应;
其中第一和第二测试微粒及参考微粒以预定比例存在。
44.一种组合物,它用于检测流体样品中至少一种分析物是否存在的分析法中,其特征在于,它包括下列组份的混合物:
(a)第一测试微粒,在第一测试微粒上配置有可结合第一分析物的第一结合分子;和
(b)参考微粒,该参考微粒不与第一分析物及第一结合分子反应;
其中该第一测试微粒和参考微粒以预定数量存在于该组合物中。
45.如权利要求44所述的组合物,其特征在于,还包括(c)预定数量的第二测试微粒,在第二测试微粒上配置有可结合第二分析物的第二结合分子,且该参考微粒不与第二分析物及第二结合分子反应。
46.如权利要求44或45所述的组合物,其特征在于,它为干燥形式。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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