CN112415079B - 一种单颗粒电感耦合等离子体质谱的双参数自验证均相免疫分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明目的为提供一种双参数自验证的均相免疫分析方法，同时对单个金纳米粒子（AuNPs）探针的频率和强度进行分析，实现对CEA的双参数检测。本发明的原理是：当修饰有特异性CEA抗体的AuNPs探针与含有CEA靶点的样品混合时，AuNPs探针对CEA靶点的结合导致AuNPs探针形成二聚体或低聚物。这种基于分析物CEA诱导的AuNPs探针聚集使探针聚合物数量减少和探针聚合物尺寸增加，从而引起单个纳米颗粒聚集的频率和强度的变化。通过SP‑ICPMS的频率和强度两种模式对于AuNPs探针聚集变化的测定，即可实现对于CEA的双参数的测定。同时两种模式对于CEA检测的相互验证可以提高样品检测的可信度。
Description
技术领域
本发明属于分析化学的检测领域，涉及单颗粒无机质谱(Single ParticleInductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，SP-ICPMS)传感领域，特别涉及一种基于单颗粒电感耦合等离子质谱双参数自验证的癌胚抗原（Carcinoembryonic Antigen，CEA）检测方法。
背景技术
精准医疗正在经历迅速发展的阶段，并通过研究、技术和针对个体化治疗的政策开启了医学的新纪元。然而，精准医疗往往面临着“不精准”的困境，而对生物分子进行快速、灵敏、明确的定量则是至关重要的。均匀免疫分析是完成这一任务的一种有吸引力的技术，其在检测前只需要混合样本和免疫化学试剂。非分离的便宜将时间、实验室消耗和自动化要求降至最低。一系列均相免疫分析方法已经成功开发，甚至商业化（如Perkinelemer公司的alphalisa和Lumigen公司的sparcl），在过去取得了巨大的成功。均匀免疫分析是临床诊断的主要分析技术之一，尽管取得了巨大的成功，但由于样品成分没有通过分离或洗涤步骤去除，因此在实际应用中进行均匀免疫分析的一个主要挑战是与基质效应相关的不精确性。为了保证准确的定量，本发明提出了一种自验证的均匀免疫分析方法，通过同时对单个金纳米粒子（AuNPs）探针的频率和强度进行分析，实现了对CEA的双参数检测。单颗粒电感耦合等离子体质谱（SP-ICPMS）的两种分析模式相互关联良好，为CEA的准确免疫分析提供了一种自验证机制。两种模式都提供了两个数量级的线性范围和pmol水平的检出限（LOD）。由于具有自我验证的策略和ICPMS对基质效应的高耐受性，本发明方法在一系列人血清样品的免疫检测中成功得到了应用，其结果与临床常规方法一致。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于单颗粒精确计数的自验证均相免疫分析方法，及其在对癌胚抗原检测方面的应用。本发明的原理是：本方法基于分析物诱导的AuNPs探针团聚。当修饰有特异性CEA抗体的AuNPs探针与含有CEA靶点的样品混合时，AuNPs探针对CEA靶点的结合导致AuNPs探针形成二聚体或低聚物。这种结合诱导的AuNPs探针聚集导致探针聚合物数量减少和AuNPs探针聚合物尺寸增加，从而引起单个纳米颗粒聚集的频率和强度的变化。通过SP-ICPMS的频率和强度两种模式对于AuNPs探针聚集变化的测定，即可实现对于CEA 的双参数的测定。两种模式对于CEA检测的相互验证还可以提高样品检测的可信度。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明首先制备特异性CEA抗体修饰的AuNPs探针。原理是：通过静电吸附的原理，在硼酸缓冲（pH 9.0）调节为弱碱性（pH 8.0）的30 nm AuNPs溶液中，加入CEA抗体。在pH8.0左右的条件下，抗体在等电点附近，自身不带电，可以通过静电吸附的方式吸附到负电包裹的AuNPs表面。随后加入牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）对AuNPs表面未吸附位点进行封堵，防止非特异性吸附。
对CEA的双参数检测过程为：样品与AuNPs探针的反应时间经一系列的优化后定为在37oC的反应温度下孵育60 min；检测之前需对样品进行10000倍的稀释，再对稀释溶液进行SP-ICPMS双参数时间分辨检测；在SP-ICPMS频率模式下，对稀释之后的样品溶液进行时间分辨信号采集，采集时间为60 s，采集速率为50 μs。在SP-ICPMS强度模式下，对稀释后的样品溶液进行时间分辨信号采集，采集时间为60 s，采集速率为50 μs/次；其中CEA样品检测的线性范围为0.78 ng/mL–100 ng/mL（频率模式）和1.25 ng/mL–100 ng/mL（强度模式）；样品的检测的整个过程是在PBS缓冲（0.01M pH 7.4，含137 mM NaCl和2.7 mM KCl溶液）进行的；该发明方法的检出限在频率模式和强度模式下可分别达到0.21 ng/mL（约1.2 pM）和0.68 ng/mL（约3.8 pM）。
本发明具有如下优势：本发明提供了一种自我验证的双参数免疫分析方法，通过SP-ICPMS对单个AuNPs探针的精确计数和粒径分析对CEA进行定量检测。在不同浓度的分析物存在下，AuNPs探针聚集成不同程度的低聚物。SP-ICPMS的脉冲频率信息揭示了AuNPs探针的数目变化，脉冲强度信息呈现了AuNPs探针聚集体的尺寸变化。通过对这两种模式的同时监测，两种模式皆提供了两个数量级的线性范围，并伴随着pM水平的检出限。由于这两种模式的自我验证优势和ICPMS本身的高耐受性，该发明方法提出的均相免疫分析在人血清样品中成功得到应用，体现出该方法在临床诊断中的巨大潜力。
附图说明
本发明采用的基于分析物诱导的AuNPs探针团聚对CEA的双参数分析性能研究。
图1 为本发明分析方法的机理和现象证明图
图2 为本发明分析方法中两种定量模式的可行性探究图
图3 为本发明分析方法在频率模式和强度检测模式下的分析性能示意图
图4 为本发明分析方法对实际血样的双参数自验证检测结果图
图5 为本发明分析方法对于血样的加标回收探究结果图。
具体实施方案
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用到的水均为超纯水，经Milli-Q超纯水净化系统处理而成。下述实例中所有样品在使用前均未进行纯化。
本发明按以下具体步骤进行：
均相免疫反应：
a.30 nm AuNPs的制备
a1 取1 mL 1%氯金酸（w/v）加入到90 mL超纯水中，在三口瓶中放入磁子混匀，在水浴中回流加热至沸5 min，
a2 加入1.7 mL的1%柠檬酸钠还原剂，搅拌下保持回流20 min，
a3 关闭水浴，保持搅拌子搅拌，待溶液缓慢降温至室温，倒出溶液至100 mL储备瓶中，定容至100 mL；
b.30 nm AuNPs的抗体修饰
b1 取1 mL AuNPs，先加入100 μL pH 9.0的硼酸缓冲溶液，调节pH大约至8.0-8.4左右，使得IgG蛋白在等电点附近（自身不带电荷），用涡旋混匀，
b2 加入30 μg CEA抗体，涡旋混匀，在室温（25℃）下反应30 min，
b3 加入封闭剂10 %的BSA溶液150 uL，在室温（25℃）下封阻30 min，
b4 反应后溶液在4oC下离心（8000-11000 rpm）25 min，吸去上清之后，沉淀溶解于含1% BSA的PBS缓冲溶液中；
c.免疫反应
c1 于500 μL离心管中加入100 μL 稀释10倍的AuNPs-CEA抗体生物探针，然后加入30 μL血清样本，最后另外加入100 μL稀释10倍的AuNPs-CEA抗体生物探针，
c2 溶液涡旋均匀后，在37oC下孵育60 min；
d.样品稀释
d1 吸取20 μL反应好的溶液，加入到2 mL离心管中，加入超纯水2 mL，用涡旋混匀，
d2 另取上述稀释好的溶液40 μL，加入到4 mL离心管中，加入超纯水 4 mL，用涡旋混匀；
e.SP-ICPMS频率模式测定
e1 将ICPMS的吸液泵管插入到稀释好的溶液中,
e2 设定频率模式对溶液进行信号采集，采集时间为60 s，速度为50 μs/次；
f.SP-ICPMS强度模式测定
f1 将ICPMS的吸液泵管插入到稀释好的溶液中,
f2 设定强度模式对溶液进行信号采集，采集时间为60 s，速度为50 μs/次；
下面结合说明书附图做进一步的说明，但本发明分析方法并不限于下述实施例。
实施例1、分析物诱导AuNPs探针聚集是否会导致SP-ICPMS信号改变的探究
为探究由CEA诱导的AuNPs探针的聚集是否能导致在SP-ICPMS中的信号改变，以CEA的抗原抗体反应为研究基础，探究AuNPs探针在不同浓度的CEA存在下，反应样品在SP-ICPMS中实时信号的改变。实验中，在AuNPs探针溶液中加入不同浓度的CEA，反应后的溶液通过稀释用SP-ICPMS进行分析。由图1可以看出，在没有CEA样品存在时，实时信号呈现强度相对较低，且信号相对较稳定和均匀。随着CEA浓度的不断增加，实时信号有强度增大的趋势，同时信号的数量也随着AuNPs探针的聚集而呈下降趋势。在浓度为100 ng/mL的CEA存在下，可以观察到明显增强的实时信号和降低的信号数量。因此，本实施例充分证明了在CEA存在下，方法所建立的抗原抗体识别系统在CEA存在下可以引起SP-ICPMS信号的改变，可以利用这些有价值的信号变化实现对CEA 的双参数定量检测。
实施例2、本发明分析方法中两种模式的可行性探究
由于本发明分析方法采用双参数的自验证机制，在应用于均相免疫分析之前，需对两种模式进行可行性分析；
a. 对频率模式的可行性探究：在频率模式下，仪器所分析出的频率信息可以反应出样品中AuNPs探针聚集体的数量多少。将新制的AuNPs探针按一定倍数连续稀释，得到一系列浓度的探针溶液。在稀释一定倍数之后，在频率模式SP-ICPMS下分析不同浓度的AuNPs探针溶液，扫描时间为60 s，速度为50 μs/次。结果如图2所示，从Ⅰ-Ⅴ，AuNPs探针的浓度从0到5.11×105 个/mL，其对应的SP-ICPMS频率数也相应增多，这一变化与改变的AuNPs的浓度变化呈线性关系，相关系数为0.9991。由此说明，在有CEA的情况下，AuNPs探针可以发生不同程度的团聚，可以通过反应前后AuNPs探针团聚物数量的变化对CEA浓度进行研究；
b. 对强度模式的可行性探究：在强度模式下，仪器所分析出的强度信息可以反应出样品中AuNPs探针聚集体的尺寸大小。配制一系列粒径不同的AuNPs样品溶液以模拟形成的不同粒径的AuNPs探针聚集体，其粒径分别为21 nm，30 nm，34 nm，43 nm，78 nm。在分别稀释一定倍数之后，保持各粒径的AuNPs样品溶液浓度相当。在强度模式SP-ICPMS下分析不同粒径的AuNPs探针溶液，扫描时间为60 s，速度为50 μs/次。结果如图2所示，随着AuNPs溶液粒径的逐渐增大，其对应的SP-ICPMS信号强度也相应增大，这一强度的变化与改变的AuNPs粒径在对数上呈线性关系，其相关系数为0.9999。由此说明，在有CEA的情况下，AuNPs探针可以发生不同程度的团聚，可以通过反应前后AuNPs探针团聚物粒径大小的变化对CEA浓度进行研究。
实施例3、探究本发明分析方法对CEA的检测线性
本实施例探究了基于SP-ICPMS对CEA的均相免疫分析，分别探究了所建立的双参数自验证机制中两种模式的线性；
a. 频率模式对CEA检测的线性：在频率模式下，将反应完成的样品溶液稀释10000倍后，在SP-ICPMS下，用频率模式进行时间分辨信号采集，采集时间为60 s，采集速率为50μs/次。结果如图3所示，根据CEA浓度与频率响应信号所呈的正比关系，得到了0.78-100ng/mL的线性关系，其线性相关系数为0.9991。对线性回归分析，计算出检出限为0.21 ng/mL；
b. 强度模式对CEA检测的线性：在强度模式下，将反应完成的样品溶液稀释10000倍后，在SP-ICPMS下，用强度模式进行时间分辨信号采集，采集时间为60 s，采集速率为50μs/次。结果如图3所示，根据CEA浓度与强度响应信号所呈的正比关系，得到了1.25-100ng/mL的线性关系，其线性相关系数为0.9993。对线性回归分析，计算出检出限为0.68 ng/mL。
实施例4、探究本发明分析方法对CEA的选择性，两种模式的相关性
a. 本发明方法对CEA 的选择性：本方法采用100 ng/mL作为干扰实验中CEA样品的浓度，所采用的干扰抗原以及浓度分别为为甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）1 μg/mL，人免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）1 μg/mL，糖类抗原199（carbohydrateantigen 19-9，CA199）500 U/mL。本方法还探究一定的盐度条件对反应体系的影响，用10mg/mL NaCl溶液作为盐度探究。按实验步骤，依次将CEA与干扰物质相混合，与AuNPs探针反应完全之后，样品稀释10000倍，在SP-ICPMS下用强度模式对样品进行分析。结果如图4所示，除CEA会引起AuNPs探针特异性识别并聚集，产生明显的强度信息改变之外，其余的干扰物质均和空白的信号相当，证明所建立的均相免疫方法对CEA的特异性和对盐度的耐受性是可观的；
b. 本发明方法中两种模式之间的相关性：方法分别采用频率模式和强度模式对人血清样品中CEA浓度进行检测，所得结果分别按照两种模式所得出的线性对结果进行计算，得出的CEA浓度值。最后将两种模式得出的浓度值彼此进行比较。结果如图4所示，血清中CEA浓度在0-80 ng/mL的范围之内，频率模式所测出的CEA浓度与强度模式所测出的CEA浓度彼此之间吻合度良好，两种模式之间的相关系数为0.9875。
实施例5、探究本发明分析方法对实际血样中CEA的检测和加标回收探究
a. 血清采集：本发明分析方法的应用中所采用的血清均来自于成都市七医院；
b.血样检测：每个血清样品取样量为30 uL，用本发明分析方法检测之前，每个血清中CEA含量用ELISA试剂盒（购于上海领潮生物科技有限公司）检测得出。检测的分析过程与上述一致。结果如图4所示，在发明方法的CEA检测线性范围内，SP-ICPMS测出的CEA含量与ELISA所得出的值有良好的吻合，两种方法的相关系数为0.9948；
c. 加标回收：12组血清样品，分为2组，其中一组的6个血清样品分别与100 ng/mL的CEA标准品等体积（100 μL）混合，另一组的6个血清样品分别与50 ng/mL的CEA标准品等体积（100 μL）混合。得到的样品溶液按上述研究过程进行探究，用SP-ICPMS进行检测。结果如图5所示，所建立的方法可以得到93%-116%的回收率，证明本发明分析方法具有实际样品分析检测能力。
Claims (2)
1.一种单颗粒电感耦合等离子体质谱的双参数自验证均相免疫分析方法，其特征在于：所述分析方法包括CEA抗体功能化的金纳米（AuNPs）探针，在CEA存在下，可以通过抗原抗体特异性识别，基于CEA诱导的AuNPs探针聚集，通过单颗粒电感耦合等离子体质谱（SP-ICPMS）对CEA进行定量检测；体系采用在pH 7.4的PBS缓冲溶液（0.01M pH 7.4，含137 mMNaCl和2.7 mM KCl）中进行；发明方法通过静电吸附的方式，每1 mL AuNPs溶液中加入30 μg CEA抗体对AuNPs进行修饰，探针纯化的离心条件为在4 oC下以8000-11000 rpm的速度离心25 min，修饰上CEA特异性抗体的AuNPs探针，对于有CEA存在的样品，会发生抗原抗体特异性识别，导致分析物CEA诱导的AuNPs探针聚集，体系反应时间为60 min，温度为37oC；通过单颗粒电感耦合等离子体质谱（SP-ICPMS）的两种模式：频率模式与强度模式，对分析物CEA诱导的AuNPs探针的聚集物进行分析，达到对CEA进行定量检测的目的，对频率模式可行性的探究是通过测定不同浓度的30 nm AuNPs探针的频率来实现的；对强度模式可行性的探究是通过测定不同粒径的AuNPs溶液中Au的强度来实现的；免疫测定之前对样品稀释倍数为10000倍，SP-ICPMS中频率模式测定的时间为60 s，扫描速率为50 μs/次；强度模式测定的时间为60 s，扫描速率为50 μs/次。
2.如权利要求 1所叙述的检测方法，其特征在于，通过结合SP-ICPMS的频率和强度两种模式，实现了对分析物CEA的双参数检测，频率模式对CEA测定的线性范围为0.78 ng/mL–100 ng/mL，检出限为0.21 ng/mL；强度模式对CEA测定的线性范围为1.25 ng/mL–100 ng/mL，检出限为0.68 ng/mL。
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