JPH01245155A - 分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 レクチン（Ｉｅｃｔｉｎ）は炭水化物と反応するタンパ
ク買の範晴に属する。レクチンはその多価性（＋ｎｕｌ
ｔｉｖａｌｅｎｃｙ）と種々な生細胞に対するその凝集
活性によって特徴付けられる。

これらの高度に特異的な炭水化物結合性分子の凝集活性
は、通常単純な単糖類によって阻害されるが、レクチン
のある種のものは三糖類、三糖類及び多糖類をも要求す
る。

レクチンは種子、植物根と樹皮、カビ、細菌、海草と海
綿、軟体動物、魚卵、無を椎動物と下等を椎動物の体液
を含む広範囲の柱頭の天然物及び呻乳動物の細胞膜から
単離されている。実際のレクチンの正しい生理的役割は
今なお知られていないが、レクチンは種々な細胞表面及
び細胞相互間の機能、細胞外物質の構成、認識機能など
の目的に応じてその化学構造の一部が変えられて関与し
ているという多くの証拠が示されている。

レクチンは広範囲の種類の試験管内（ｉｎ　　ｖｉｔｒ
ｏ）の応用、すなわち、血液分類と赤血球多凝集研究、
リンパ球の分裂促進、リンパ球の固体群研究、細胞と他
粒子の分画、炭水化物含有分子の単離、精製及び構造研
究、正常及び病理学的状態の組織化学的研究に極めて有
用であることが判明した。

レクチンに関する情報は次の各文献に見い出すことがで
きる。

（１）シャロン（Ｓ　ｈａｒｏｎ）及びリス（ＬｉＳ）
、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）（１９７２年）、１７
７巻、９４９ページ （２）　　リス及びシャロン、アニュアル・レビュー・
オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

ｂｉｏｃｈｅ論、　）（１９７３年）、４２巻、５４１
ページ（３）　　シャロン、「アトパンシス・イン・イ
ミュノロジー（Ａｄｖａｎｃｅｓ　　ｉｎ　　Ｉ　ａｓ
ｕｎｏｌｏｇｙ）」（デイクソン（Ｄ　１ｘｏｎ）及び
クンゲル（Ｋｕｎｋｅｌ）ｌｉｔＡ）（１９８３年、ア
カデミツク・プレス・ロンドン・アンド・ニューヨーク
（Ａｃａｄｅｍｉｃ　　ＰｒｅｓｓＬ　ｏｎｄｏｎ　　
ａｎｄ　　Ｎ　ｅｗ　　Ｙ　ｏｒｋ）刊）、２１３ベー
ジ（４）　　バロンデス（Ｂ　ａｒｏｎｄｅｓ）　、ア
ニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（１９
８１年）。

５０巻、２０７ページ （５）　　ボグーハンセン（Ｂ　ｏｇ　−Ｈａｎｓｅｎ
）著、「レクチン；バイオロジー、バイオケミストリー
、クリニカル・バイオケミストリー（Ｌｅｃｔｉｎｓ：
Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ。

Ｂｉｏｃｈｅ＋１ｉｓｒｙ、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　　Ｂｉ
ｏｃｈｅ＋＊１ｓｒｙ）」（ダブリュー・デ　グリュイ
ターーベルリン＜Ｗ、ｄｅＧｒｕｙｔｅｒ　−Ｂｅｒｌ
ｉｎ）刊）、１巻〜Ｖ巻この発明は凝集分析法における
レクチンの使用に関し、レクチンの凝集力を特に粒子分
析に関連させる発想に端を発する。良く知られているよ
うに、凝集分析法においてはポリスチレン（通常うに定
温保持すると、粒子は試料中の分析物の濃度に応じた程
度に凝集するようになる０種々の分析方法が知られてお
り文献に記述されているが、それらの内の２つはこの段
階で説明する価値がある。

直接分析法においては、分析物は凝集を起こし、その程
度は一般に試料中の分析物の濃度に直接比例する。阻害
分析法においては、分析物は凝集を阻害し、その程度は
一般に試料中の分析物の濃度に逆比例する。多くの方法
において、２つの異なる分析物の両方を測定するために
直接法又は阻害法の両方で分析を行うことができる。こ
の発明が関連する凝集分析法は、一般に直接法又は阻害
法のいずれでも行うことができる。

一つの態様において、この発明は、分析物は特異的結合
対の構成要素（１債Ｂｌ）ｅｒＯｆ　ａ　ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃｂｉｎｄｉｎｇｐａｉｒ＞であり、 （ａ）　　特異的結合対の構成要素で被覆した粒子の懸
濁液、（ｂ）　　（ａ）の懸濁液に存在しない場き、分
析物に対して特異的な結合対の相補的構成要素。

及び（ｃ）　　糖類に結合するレクチンを使用し、分析
物又は試薬（、）と（ｂ）の１つのいずれかは糖類を持
ち、 任意の順序で試薬（ａ）、（ｃ）及びもし存在する場合
は（ｂ）と共に試料を定温保持し、試料中の分析物の濃
度に依存して変化する粒子の凝集の程度を観察すること
から成る試料中の分析物の分析方法を提供する。

分析物は特異的結合対の構成要素である。特異的結合対
の重要な例は抗原又はハプテン（ｌｌａｐｔｅｎ）及び
それと結合している抗体である。この場合、分析法は２
つの間の免疫反応に依存しており、免疫分析法と呼ばれ
る。特異的結合対の他の例は２つの相補的−重鎖オリゴ
ヌクレオチド又はＤＮＡ及び／又はＲＮＡの相補的−重
鎖である０種々の他の特異的結合対は当該技術分野で公
知である。

分析物が特異的結合対の構成要素であるという要件があ
れば、分析物の性質は本願発明のこの！ｌ！！様にとっ
て重要ではない０分析法に使用する特異的結合対の他の
構成要素は分析物に対して相補的であると云われる０分
析物のアナローグは分析物と同じ様に春異的結合〃相手
と結合する物買であって、しばしば分析物の誘導体であ
り、従ってそれは特異的結合相手との結合について分析
物と拮抗する。

他の態様においては、この発明は糖タンパク質又は糖類
で被覆した粒子を使用し、糖タンパク質又は糖類と結合
するレクチンの存在下で試料を粒子の懸濁液と共に定温
保持し、試料中の細菌濃度に依存して変化する粒子の凝
集の程度を観察することから成る試料中の細菌の分析方
法を提供する。

試料の性質は発明にとって重要ではない、しばしば、そ
れは血清又は血漿のような体液である。

この発明は分析試薬で被覆した粒子の懸濁液の使用を含
む、これらの粒子は面微鏡的大きさ又は顕微鏡でも見え
ないほどの大きさであり、すなわち一般に１５ミクロン
より小さく、しばしば数ミスｔｘｔミ２０ン クロか丁Ｑ　了；；　％を大きさである。そのような大
きさのポリスチレン粒子は市販されており、その懸濁液
は一般にラテックスとして知られている。ラテックスの
ような諏微鏡的粒子状物質に分析試薬を結合することは
公知であり、それを行う技術をここで説明しようとは思
わない、ある分析法においては、磁気的に誘引可能な粒
子を使用するのが便利であり、これらも又公知であり市
販されている。

ある凝集分析法は２つの異なる粒子状試薬の使用を含む
、一般に、これらの試薬は２つの異なるそうでなくする
ことができる。この発明の方法は２つの異なる粒子状試
薬の使用を含む分析法を包含する。

この発明の分析方法は糖類又は糖タンパク質と結合する
レクチンの使用を含む、ある場合レクチン又は糖類もし
くは糖タンパク質は分析物の成分として存在することも
でき、そのような場合相補的試薬（Ｗ類または糖タンパ
ク貫もしくはレクチン）の選択は予め決められる。他の
分析方法においては、レクチン及び糖類又は糖タンパク
質は添加する分析試薬として存在する。それらは相互に
結合することを条件として、これらの試薬の選択は本願
発明にとって重要ではない、単糖顕又は二Ｗｆｆはある
場合可能であるが、糖類は一般に多糖類である。

方法の最終段階は粒子の凝集の観察を含む。これは粒子
の計数、北風分析、比濁分析又は単純な凝集の視覚評価
によって行うことができる。凝集の程度はＩＭＰＡＣＴ
（商標）診断技術のような粒子計数法により測定するの
が好ましい。この方法は限定された量の液泳中の粒子の
計数を含む０粒子は均一な大きさであり、装置はほぼそ
の大きさの粒子のみを計数することにより測定し、それ
によ より凝ｓ−くで形成された２つ又はそれ以上の粒子の集
合体は拒絶し計数しない。

上述のように、この発明の分析方法は一般に直接法又は
阻害法により実行することができる。凝集の程度は試料
中の分析物の濃度に依存するが、この関係は比例又は反
比例のいずれであってもよ見出だすことが予期される範
囲に拡がる既知の分析物濃度の標準試料の数を測定し、
その結果を用いて分析物濃度に対する凝集のグラフを作
成し、それにより未知試料の分析物濃度を読み取ること
ができることである。

以下に、この発明による５つの分析法について記述する
。分析物は方法１ないし３においては免疫結合対の構成
要素、方法４においてはポリヌクレオチド、及び方法５
においては細菌である。

１、第２の抗体としてのレクチンの使用ラテックス粒子
を抗原又はハプテンタンパク質結合物で被覆する。第一
段階で、特異的抗体を添加し、抗体はラテックスと反応
し、濃度が十分に高い場合遂には凝集する。第二段階は
第一段階と同時又はそれに引き続いて実行することがで
きるが、そこでは、抗体の天然糖類又は抗体に人工的に
結合した糖に特異的なレクチンを添加し、粒子を凝集す
るか又は存在する凝集を増強する。

直接法では、この方法は抗体測定（血清学）に役立つこ
とができる。

阻害法では、この方法は抗原又はハプテンを定量するの
に役立ち、この場合当該ハプテン又は抗原は反応のａ集
水率を減少させるため最初に抗体と反応させなければな
らない。

２、可逆的凝集剤としてのレクチンの使用研究室におけ
る数回の実験により、磁気的手段（磁気的誘引可能粒子
に対する）又は遠心分離によるラテックス粒子の濃縮は
凝集反応の感度を改良することが示された。改良は遠心
分離又は磁気的手段による濃縮により引き起こされる局
部的に増加した粒子数によるものと想像された。

この分析法はレクチン−糖類相互作用にこの効果を利用
する。第一段階で、抗体と糖類の両方を被覆したラテッ
クス粒子を定量する抗原と適当なレクチンと共に定温保
持する。レクチンによる粒子の凝集は抗原−抗体凝集の
ためのラテックス粒子の有効な衝突回数を増加すると考
えられる。第二段階で、特異的糖（レクチンがそれに結
合する）をレクチン−糖反応によるすべての凝集結合を
破壊するために添加し、抗原−抗体反応による凝集結合
のみが歿る。

この方法は直接法又は阻害法で使用することが可能であ
る。抗体を定量するため、ラテックスを抗体と糖類で被
覆することも可能である。

３、抗体結合力を増強するためのレクチンの使用結合力
は抗体の多官能性に基づ＜（ＩｇＭ抗体は−ｍに親和力
は低いが結合力は高い）ので、レクチンの多結合部位は
ＩｇＧ／レクチン比が１より大きいＩｇＧ−レクチン複
合体の調製を可能にするように見える。複合体を調製す
るには、糖の尾部をＩｇＧ抗体に結合することが必要で
あるか又は便利である。このようにして得られるレクチ
ン−抗体複合体はラテックス高抗原粒子に対して遊離形
の抗体より強い凝集力を示すことが期待される。この方
法はレクチン−抗体複合体が分析物を含む試料との定温
保持の後よりむしろ前において形成される点を除いて、
上の１と類似することに注意すべきである。

４、ＤＮＡプローブとしてのレクチンの使用ＤＮＡ断片
で被覆したラテックス粒子は予め糖類と結合した相補的
ＤＮＡ断片と反応することができる。この活性化したラ
テックスは選択された糖類に特異的なレクチンによって
凝集可能である。

生物学的試料の相補的ＤＮＡによる凝集の阻害は可能で
あり、又その濃度に比例する。

５、細菌の定量 粒子凝集分析により特異的に細菌を検出するのにレクチ
ン−細菌タンパク質と細菌レクチン−糖類反応を使用す
ることは可能である。２つの可能な反応手順は下記の通
りである。

（ｉ）　　ラテックス粒子を細菌糖タンパク質又は細菌
多糖類で被覆し、次いで１つ又は複数の適当なレクチン
により特異的凝集が可能になる。定量は適当な多糖類を
持つ細菌を分析物とすることにより阻害法で行う。

（ｉｉ）　　ラテックス粒子を再び糖タンパク質又は多
Ｗ類で被覆する。これらは糖タンパク質又は多糖類被覆
に特異的なレクチンを持つ細菌により特異的に凝集可能
である。

次の実施例はこの発明を例示するものである。

実施例１ この反応手順は生物学的液体中で細菌を検出することが
どのようにしてできるかを例証するものである。ＩｇＡ
、は細菌又は限定された細菌群に対して特異的な糖タン
パク質である。糖タンパク質で被覆したラテックスは特
異的レクチン、この場合はジャカリン（Ｊ　ａｃａｌｉ
ｎ）と凝集可能である。同じ糖タンパク質を持つ細菌の
存在は、それらが凝集を阻害する能力によって検出する
ことができる。

実際には試験は次のように行う、３０μｌの阻害剤、こ
の場合例えばガラクトースを３０μｌのジャカリン溶液
及びＩｇＡｌ被覆ラテックスと混合する。

ＩＭＰＡＣＴ装置中で３７℃、３０分定量保持後、反応
をｗｉ液で希釈することにより停止し、粒子を計数する
。阻害剤が存在しない場合最大の凝集（最小の遊離粒子
）が得られ、これを反応のブランクとする。阻害剤の添
加量を増加すると阻害は増加する（遊離粒子数は増加す
る）。

ガラクトースをジャカリンと反応性の糖類（ガラクトー
スのような）を持つ細菌を含む可能性のある試料で置き
換えることにより、この試験細菌の定量の目的に使用す
ることが可能になる。

実施例２ 試験はＩＭＰＡＣＴ装置中で次のように行う。

３０μｒの種々な濃度のコンカナバリン（Ｃｏｎｃａｎ
ａｖａｌ　１ｎ）Ａをトキソ抗原（Ｔｏｘｏａｎｔｉｇ
ｅｎ）で被覆した３０μｌのラテックスと混合する。混
合物を３７℃で３０分定旦簗持し、希釈し、次いで粒子
を計数する。コンカナバリンＡ濃度と盛暑比例する凝集
曲線が得られる。希釈用Ｋｍ液にα−メチルグルコシド
を添加すると（１０ｍＭ）、すべてのａ集は破壊される
。ＩＢＭ抗体を含む試料の存在下で試験を行うと、ＩＢ
Ｍ濃度に依存する比率の凝集がα−メチルグルコシド添
加後に残る。

かくしてこの試験はＩｇＭ定量法として用いることがで
きる。

実施例３ 抗プルセラ（ａｎｔｉ　−Ｂｒｕｃｅｌｌａ）　Ｉ　ｇ
Ｍ３０μｌのプルセラ・リボ多糖類（ＬＰＳ）で被覆し
たラテックスを抗プルセラＩＢＭ陽性血清の種々な希釈
液（３０μｌ）と混合した０次いでＭ衝液（ＧＢＳ−Ｂ
ＳＡＩ％）又は１２５μｇ・コンカナバリンＡ／ｍｌを
含むＭ新液の３０μｌを添加した。ボルテックシング・
トレー（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇｔｒａｙ）上で撹拌しなが
ら１０分間定温保持後、反応物を希釈し、ＩＭＰＡＣＴ
装置で計数した。コンカナバリンＡの存在下で、２とい
う因子（ａ　ｆａｃｔｏｒ　　ｏｆ　　ｔｗｏ）による
凝集曲線の増強が認められた。

実方伍Ｃ号４ 抗トキソＩｇＭ トキソ抗原を被覆した３０μｌのラテックスをＩＢＭ陽
性血清の種々な希釈液（ＧＢＳ−ＢＳＡ［階液中１：１
ないし１　：５１２＞と混合した０次いで３０μｍのａ
Ｂｓ−ＢｓｇＩ街液又衝液２５．ｃｚｙ・コンカナバリ
ンＡ　／　ｍｌを含むＧＢＳ−ＢＳＡ［ｖＲ液を添加し
た。ボルテックシング・トレー上で１５分間定温保持後
、反応物を希釈しＪＭＰＡＣＴ装置で計数した。コンカ
ナバリンＡの存在下で、１６という因子（ａ　ｆａｃｔ
ｏｒ　　ｏｆ　　１６　）による改善が凝集曲線に認め
られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分析物は特異的な結合対の構成要素であり、（ａ）
   特異的結合対の構成要素で被覆した粒子の懸濁液、（ｂ
   ）（ａ）の懸濁液に存在しない場合、分析物に対して特
   異的な結合対の相補的構成要素、及び（ｃ）糖類に結合
   するレクチンを使用し、分析物又は試薬（ａ）及び（ｂ
   ）のうちの一つのいずれかは糖類を持ち、 任意の順序で試薬（ａ）、（ｃ）及びもし存在する場合
   は（ｂ）と共に試料を定温保持し、試料中の分析物の濃
   度に依存して変化する粒子の凝集の程度を観察すること
   から成る試料中の分析物の分析方法。 ２、分析物は糖類を持つ抗体であり、試薬（ａ）は当該
   抗体に対する抗原で被覆した粒子の懸濁液である請求項
   １記載の分析方法。 ３、分析物は抗原又はハプテンであり、試薬（ａ）は分
   析物又はそのアナローグで被覆した粒子の懸濁液であり
   、及び試薬（ｂ）は分析物に対する抗体であつて前記抗
   体は糖類を持つ請求項１記載の分析方法。 ４、試薬（ｂ）と（ｃ）を、試薬（ａ）及び試料と共に
   定温保持するに先立って、いっしょに反応させる請求項
   ３記載の分析方法。 ５、分析物は抗原であり、 試薬（ａ）は当該抗原に対する抗体で被覆した粒子の懸
   濁液であって当該粒子は糖類を持ち、分析は次の二段階
   、すなわち、（ｉ）試料を試薬（ａ）、（ｂ）、及び（
   ｃ）と共に定温保持することによつて粒子凝集を起こす
   こと、及び（ｉｉ）過剰の糖類を定温保持混合物に添加
   し、その後粒子凝集の程度を観察することの二段階によ
   って行われる請求項１記載の分析方法。 ６、糖蛋白質又は糖類で被覆した粒子を使用し、糖蛋白
   質又は糖類と結合するレクチンの存在下で前記粒子の懸
   濁液を試料と共に定温保持し、試料の細菌濃度に依存し
   て変化する粒子の凝集の程度を観察することから成る試
   料中の細菌の分析方法。 ７、最終段階は試料中の細菌により引き起こされる粒子
   凝集の阻害の程度を観察することを含む請求項６記載の
   分析方法。 ８、レクチンは試料中の細菌上に存在する請求項６記載
   の分析方法。 ９、凝集の程度は粒子計数技術により測定する請求項１
   ないし請求項８のいずれかに記載の分析方法。