CN111849996A - 一种高特异性识别肺癌血清的寡核酸适配体Seq-32及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高特异性识别肺癌血清的寡核酸适配体序列Seq‑32及应用，属于分子生物医学领域。所述寡核酸适配体Seq‑32的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明设计Seq‑32特异性序列，采用5'端或3'端修饰、标记(如同位素、地高辛或者生物素等)的方法能够特异性识别肺癌血清。Seq‑32作为肺癌血清的检测指标，用于肺癌的辅助诊断、靶向治疗或者进行肺癌疾病的发生、发展、进程相关的基础研究等。本发明方法简单、迅速、灵敏，适用于临床前肺癌的辅助诊断、肿瘤生物导向治疗，具有广泛的临床应用前景和基础应用前景。

Description

一种高特异性识别肺癌血清的寡核酸适配体Seq-32及应用

技术领域

本发明涉及一种高特异性识别肺癌血清的寡核酸适配体Seq-32及应用，属于分子生物医药领域。

背景技术

肺癌是最常见的恶性肿瘤，严重威胁着人类健康，在癌症发病率中居于首位，给人们的生命财产安全带来了巨大威胁。在临床中，70％～80％的肺癌患者临床就诊时都属于中晚期。国际公认的一种肺癌普查手段，包括X线胸片检查、胸部低剂量螺旋CT等，由于缺乏科学性标准化的依据，90％的肺癌患者在早期X线胸片检查中已存在异常改变，但因结节隐藏于心脏后、肺门旁等隐秘区域或读片不慎等因素，会造成误诊、漏诊的情况。如果能有一种像常规体检一样以一种无痛方式确定出高危人群，就可以提供早期治疗方法，提高肺癌患者的生存率。目前，肿瘤标志物的检测是实现肺癌早期诊断的重要手段，但现在仍然缺少有效特异的肺癌肿瘤标志物。

指数富集的配基系统进化技术，简称SELEX(Systematic Evolution of Ligandsby Exponential Enrichment)技术，是近十几年迅速发展起来的高通量生物文库筛选技术。应用大容量的随机寡核苷酸适配体文库(ssDNA或RNA)，结合实时荧光PCR技术，筛选出逐步富集的寡核苷酸，经反复体外筛选、扩增，最终获得与靶标分子结合呈高特异性、高亲和力的寡核苷酸适配体。

核酸适配体是在体外通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)从人工合成的DNA或RNA文库中筛选出来的一小段寡核苷酸，具有高亲和力强特异性结合靶标分子的优点，并且适配体分子量小，免疫原性低，化学修饰性强，应用领域广等。早期适配体的筛选多以单一蛋白为靶标进行筛选，但是以单一蛋白筛选在血清诊断及筛查中的应用价值不高，因此，近年来运用复合靶标筛选适配体受到了广泛关注。复合靶标筛选与常规筛选不同之处在于靶标不再是单一蛋白，而是复杂的多种类蛋白，这就造成整个适配体的筛选过程更为复杂化。消减SELEX筛选是通过去除与非目标靶蛋白识别的一系列寡核苷酸，筛选出与非目标靶蛋白不结合但与目标靶蛋白特异性结合的寡核苷酸，然后再将其应用到后序实验中。这样将消减筛选应用到复合靶标筛选中会大大降低筛选难度，从而提高成功率。另外筛选出来的适配体有非常广泛的应用前景，可以用来发现新的肿瘤标志物，还可以设计新型生物传感器等实现可视化检测。

发明内容

本发明通过SELEX技术筛选获得一条寡核苷酸配基Seq-32序列。经鉴定，Seq-32能够特异性识别肺癌血清蛋白，而与其他癌症血清或健康人血清不结合。

本发明目的在于提出特异性识别肺癌血清的寡核酸适配体Seq-32的序列及其应用领域，用于肺癌的临床辅助诊断、靶向治疗或者进行肺癌疾病的发生、发展、进程相关的基础研究等。

一种寡核酸适配体Seq-32，所述寡核酸适配体Seq-32利用消减SELEX技术，以肺癌患者血清为正筛靶标，以健康人血清和其他癌症患者血清为反筛靶标，经过多轮反复孵育，洗脱，扩增，从随机文库中筛选出一条特异性结合肺癌患者血清的核酸适配体，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，上述技术方案中，所述寡核酸适配体Seq-32可以特异识别肺癌血清。

进一步地，上述技术方案中，所述寡核酸适配体Seq-32可以是体外化学合成的，也可以是通过PCR或其他分子生物学方法制备的。

进一步地，上述技术方案中，对寡核酸适配体Seq-32可以通过磷酸骨架修饰、截断、延长、颠换，或对核酸适配体碱基进行化学修饰，或在寡核酸适配体Seq-32的5'端或3'端结合生物素、地高辛、荧光物质及纳米发光材料或者酶标记。

进一步地，上述技术方案中，所述寡核酸适配体Seq-32的核酸序列还包括如下三种序列中的一种：

(1)与所述寡核酸适配体Seq-32同源性在80％以上的寡核酸序列；

(2)与所述寡核酸适配体Seq-32进行杂交的序列；

(3)所述寡核酸适配体Seq-32转录的RNA序列。

本发明提供了寡核酸适配体Seq-32在制备抗肺癌药物中的应用。

本发明提供了寡核酸适配体Seq-32在制备判断肺癌分期及分型药物中的应用。

本发明依据与筛选同一技术构思，用50例肺癌患者血清和50例健康人血清对寡核酸适配体Seq-32与肺癌血清的特异性和亲和力进行验证。经应用研究，筛选出多条寡核酸适配体序列，通过对这些寡核酸适配体序列进行序列比对和同源性分析，确定出4条寡核酸适配体序列进行特异性和亲和力验证。结果发现，寡核酸适配体Seq-32表现出对肺癌血清强特异性和高亲和力的特性。鉴定了寡核苷酸适配体Seq-32与肺癌血清的特异性和亲和力。经统计学分析，并计算寡核酸适配体Seq-32对肺癌患者血清检测的阳性率。

发明有益效果

1.与抗体相比，核酸适配体性质更加稳定：适配体可直接体外合成，进行化学修饰，易于运输，生产成本低，在实际操作中更为简单、迅速。

2.本发明证实Seq-32能特异性识别肺癌血清肿瘤标志物。因此，Seq-32序列在肿瘤研究相关领域具有广泛的应用价值和开发市场。

附图说明

图1为核酸适配体筛选PCR检测图，图中，+12代表肺癌患者血清，-12代表乳腺癌患者血清。

图2为肺癌血清候选核酸适配体Seq-32与靶标结合的Kd解离常数。

图3为肺癌血清候选核酸适配体Seq-32与靶标结合的特异性验证。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

以下将参考附图详细说明本发明的示例性实施例、特征和性能方面。附图中相同的附图标记表示功能相同或相似的元件。尽管在附图中示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。

本发明通过以下技术方案实现：

实施例1核酸适配体Seq-32的制备

(1)构建初始寡核苷酸文库：

5'-CTATAGCAATGGTACGGTACTTCC-(40N)-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'

其中N代表A，T，C，G中任意碱基。所述的寡核酸文库两端固定序列为PCR扩增引物结合区，中间为40个碱基的随机序列。

(2)血清的处理

血清收集来自秦皇岛市第一医院。取20例健康人血清混合均匀后，15000g，4℃离心30min，去除血清中的红细胞；离心完后取上清液置于1.5mL离心管中再次15000g，4℃离心15min，去除上层脂肪，收集血清。肺癌、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌血清处理过程同前。

按血清：水：乙腈＝1：2：1(体积比)配制，水浴超声5min，15000g，离心30min，弃去沉淀，收集上清。肺癌血清和消减靶标血清(健康人血清、乳腺癌血清、卵巢癌血清和宫颈癌血清)均需要做相同处理。

(3)磁珠与血清的偶联

正筛：已经处理过的肺癌血清和磁珠(PuriMag Biotech，PMAG016)37℃旋转孵育2h，形成磁珠-血清复合物。

反筛：已经处理过的消减靶标血清与磁珠37℃旋转孵育2h，形成磁珠-血清复合物。

(4)文库的处理

步骤(1)所述的寡核酸文库用DEPC水溶解，95℃变性10min后立即冰浴5min，使ssDNA恢复三维空间结构。

(5)靶标消减替换筛选

步骤(3)所述反筛磁珠用PBS洗3遍，加入封闭液(蔗糖0.2g，酪蛋白0.025g，BSA0.025g溶于20mL PBS)封闭，PBS洗3遍，加入步骤(4)所述处理好的寡核酸文库，37℃孵育1h，收集不结合的上清，保留磁珠，即处理后的反筛磁珠。

步骤(3)所述正筛磁珠用PBS洗3遍，加入封闭液(蔗糖0.2g，酪蛋白0.025g，BSA0.025g溶于20mL PBS)封闭，PBS洗3遍，加入上述收集不结合的上清，37℃孵育1h，即得处理后的正筛磁珠。

将处理后的正筛磁珠和处理后的反筛磁珠分别同时用PBS洗液洗涤，然后分别加入DEPC水95℃变性5min，收集有寡核酸的上清，得到阴、阳性模板，进行PCR(先37℃下5min使整个体系处于适配体筛选时的条件，然后94℃预变性7min，之后95℃5s，60℃34s，共39个循环)扩增。监测阴性模板和阳性模板的PCR扩增结果。

(6)链霉亲和素磁珠法制备次级库

阳性模板PCR扩增产物和阴性模板PCR扩增产物均为5’端带有生物素的dsDNA，将阳性模板PCR扩增产物与链霉亲和素磁珠(上海生工生物工程股份有限公司的链霉亲和素与磁珠在37℃条件下旋转孵育过夜，形成链霉亲和素磁珠)37℃孵育30min，经1mL 5％的甲酰胺在40℃水浴5min后，加500μL 0.1M的氢氧化钠溶液，在95℃条件下变性5min，0℃冰浴5min后收集上清，即为制备的次级库，用于下一轮筛选。

(7)使用步骤(6)制备的次级库重复步骤(2)-(6)的筛选流程，共进行12轮筛选。其中，步骤(3)反筛时，第1-5轮时加入健康人血清作为消减靶标血清；在第6、7轮时加入乳腺癌血清作为消减靶标血清；第8、9轮时加入乳腺癌和卵巢癌作为消减靶标血清；第10轮时加入健康人血清作为消减靶标血清；第11轮时加入乳腺癌和宫颈癌血清作为消减靶标血清；第12轮时用乳腺癌血清作为消减靶标血清。第12轮筛选PCR监测结果如图1所示，表示寡核酸与阳性靶标(肺癌血清)的结合能力强于阴性靶标(乳腺癌血清)。最后高通量测序第12轮的寡核酸库，挑选得到核酸适配体Seq-32，所述核酸适配体Seq-32的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

实施例2通过荧光标记法检测核酸适配体Seq-32与肺癌血清的结合能力

(1)根据实施例1所述的方法将已处理过的肺癌血清和磁珠37℃旋转孵育2h，形成磁珠-血清复合物。

(2)将寡核酸适配体Seq-32用FAM标记，配置等体积不同浓度梯度的带FAM标记的寡核酸适配体Seq-32，并分别与磁珠-血清复合物37℃旋转孵育0.5h，PBS洗3次，以去除与非靶标蛋白非特异结合的核酸适配体。

(3)将步骤(2)中与寡核酸适配体Seq-32孵育后的磁珠-血清复合物重悬于超纯水中，加入微孔板中，使用多功能酶标仪在450nm处进行荧光测定，Origin 8软件做荧光值-适配体浓度曲线，结果如图2所示，得到核酸适配体Seq-32的平衡解离常数(Kd)为19.79±0.84nM。

实施例3通过PCR法验证核酸适配体Seq-32与肺癌血清的特异识别

(1)血清的处理：按血清：水：乙腈＝1：2：1(体积比)配制，水浴超声5min，15000g，离心30min，弃去沉淀，收集上清。

(2)按步骤(1)所述方法将已处理过的肺癌血清与磁珠37℃旋转孵育2h，形成磁珠-肺癌血清复合物。

(3)按步骤(1)所述方法将已处理过的健康人血清与磁珠37℃旋转孵育2h，形成磁珠-健康人血清复合物。

(4)将适配体Seq-32进行浓度比例稀释，分别与磁珠-肺癌血清复合物和磁珠-健康人血清复合物于37℃旋转孵育0.5h。

(5)PBS洗5次，加10μL超纯水95℃高温变性5min，收集上清，进行PCR检测(PCR条件如实施例1所示)。结果如图3所示，15例肺癌血清中阳性(肺癌血清)Ct值小于阴性(健康人血清)Ct值的占93.3％，由此可以得出适配体Seq-32对肺癌血清具有强特异性结合能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 燕山大学

<120> 一种高特异性识别肺癌血清的寡核酸适配体Seq-32及应用

<130> 2020

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

ctatagcaat ggtacggtac ttccgaagaa gacccctaga ccagaacggg gagtatcacg 60

cagacaaaag tgcacgctac tttgctaa 88

Claims (7)

1.一种寡核酸适配体Seq-32，其特征在于，所述寡核酸适配体Seq-32的核酸序列如SEQID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的寡核酸适配体Seq-32，其特征在于，所述寡核酸适配体Seq-32可以特异识别肺癌血清。

3.根据权利要求1所述的寡核酸适配体Seq-32，其特征在于，所述寡核酸适配体Seq-32可以是体外化学合成的，也可以是通过PCR或其他分子生物学方法制备的。

4.根据权利要求1所述的寡核酸适配体Seq-32，其特征在于，对寡核酸适配体Seq-32可以通过磷酸骨架修饰、截断、延长、颠换，或对核酸适配体碱基进行化学修饰，或在寡核酸适配体Seq-32的5’端或3’端结合生物素、地高辛、荧光物质及纳米发光材料或者酶标记。

5.根据权利要求1所述的寡核酸适配体Seq-32，其特征在于，所述寡核酸适配体Seq-32的核酸序列还包括如下三种序列中的一种：

(1)与所述寡核酸适配体Seq-32同源性在80％以上的寡核酸序列；

(2)与所述寡核酸适配体Seq-32进行杂交的序列；

(3)所述寡核酸适配体Seq-32转录的RNA序列。

6.寡核酸适配体Seq-32在制备抗肺癌药物中的应用。

7.寡核酸适配体Seq-32在制备判断肺癌分期及分型药物中的应用。

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