CN112680452B - 一种特异性结合肺癌血清的寡核苷酸适配体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种特异性结合肺癌血清的寡核苷酸适配体及应用，涉及分子生物医药技术领域。本发明首次利用细胞培养液的方法筛选出所述寡核苷酸适配体CellAPT‑2，经验证CellAPT‑2能够特异性识别两种肺癌细胞株细胞培养液和肺癌血清蛋白。在本发明实施例中，所述寡核苷酸适配体Cell APT‑2与肺癌细胞培养液的Kd值为9.026±3.244nM，因此可将所述寡核苷酸适配体CellAPT‑2作为肺癌血清的检测试剂，用于肺癌的辅助诊断、靶向治疗或者进行肺癌疾病的发生、发展、进程相关的基础研究等。

Description

一种特异性结合肺癌血清的寡核苷酸适配体及应用

技术领域

本发明属于分子生物医药技术领域，具体涉及一种特异性结合肺癌血清的寡核苷酸适配体及应用。

背景技术

近年来，肺癌仍是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，然而，早期肺癌一般没有明显的症状，所以又叫无症状期，短则数月长则几年，因人而异，因此患者很难发现也就很少就医，临床上也很难发现，患者查出病情后大多数处在患病的中到后期阶段，严重影响了病情的治疗，导致疾病恶化，随着环境的不断恶化以及人们对自身健康的不重视导致了肺癌的高发病率。由于肺癌患者被查出病情的时期大部分处在患病的中到晚期阶段，常常失去了治疗疾病的最佳医治时间。此外，对于肺癌患者来说，一旦患病面临的就是痛苦的治疗和可怕的心理压力，根据有关报道患者患肺癌以后能存活5年以上的概率仅仅只有15％。很多人在发病的3年内发生了癌症恶化，这些问题的根源主要是患者不能早期发现病情，因此，研究肺癌的早期诊断方法是临床研究热点之一。肿瘤标志物的检测是实现肺癌早期诊断的重要手段，但现在仍然缺少有效特异的肺癌肿瘤标志物。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特异性结合肺癌血清的寡核苷酸适配体及应用，利用寡核苷酸适配体Cell APT-2可特异性结合肺癌肿瘤血清蛋白，可用于肺癌的临床辅助诊断、靶向治疗或者进行肺癌疾病的发生、发展、进程相关的基础研究等。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种特异性结合肺癌血清的寡核苷酸适配体Cell APT-2，所述寡核苷酸适配体Cell APT-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述寡核苷酸适配体Cell APT-2还包括磷酸骨架修饰、截断、延长、颠换，或对碱基进行化学修饰，或在所述寡核苷酸适配体Cell APT-2的5’端或3’端结合生物素、地高辛、荧光物质及纳米发光材料或者酶标记。

优选的，所述寡核苷酸适配体Cell APT-2的核苷酸序列，还包括：与所述寡核苷酸适配体Cell APT-2同源性在80％以上的寡核苷酸序列，或与所述寡核苷酸适配体CellAPT-2进行杂交的序列，或所述寡核苷酸适配体Cell APT-2转录的RNA序列。

本发明还提供了上述寡核苷酸适配体Cell APT-2的制备方法，包括利用体外化学合成或通过PCR扩增或其他分子生物学方法获得所述寡核苷酸适配体Cell APT-2。

本发明还提供了上述寡核苷酸适配体Cell APT-2在制备肺癌诊断试剂中的应用。

本发明还提供了一种肺癌诊断试剂，所述试剂的有效成分包括上述寡核苷酸适配体Cell APT-2。

本发明还提供了上述寡核苷酸适配体Cell APT-2在制备抗肺癌药物中的应用。

本发明还提供了一种抗肺癌药物，所述药物的有效成分包括上述寡核苷酸适配体Cell APT-2。

本发明还提供了上述寡核苷酸适配体Cell APT-2在制备判断肺癌肿瘤分期和分型的药物中的应用。

本发明还提供了一种判断肺癌肿瘤分期和分型的药物，所述药物的有效成分包括上述寡核苷酸适配体Cell APT-2。

本发明提供了一种特异性结合肺癌血清的寡核苷酸适配体Cell APT-2，首次利用细胞培养液的方法筛选出所述寡核苷酸适配体Cell APT-2，经验证Cell APT-2能够特异性识别两种肺癌细胞株细胞培养液，进一步鉴定，Cell APT-2能够特异性识别肺癌血清蛋白，而与其他癌症血清或健康人血清不结合。在本发明实施例中，通过q-PCR法检测寡核苷酸适配体Cell APT-2与肺癌细胞培养液的结合能力，结果显示所述寡核苷酸适配体Cell APT-2的平衡解离常数(Kd)为9.026±3.244nM，因此可将所述寡核苷酸适配体Cell APT-2作为肺癌血清的检测试剂，用于肺癌的辅助诊断、靶向治疗或者进行肺癌疾病的发生、发展、进程相关的基础研究等。本发明所述寡核苷酸适配体Cell APT-2能够简单、迅速、灵敏，适用于临床前肺癌的辅助诊断、肿瘤生物导向治疗，具有广泛的临床应用前景和基础应用前景。

附图说明

图1为寡核苷酸适配体筛选结合比监测图，图中，结合比表示与蛋白结合的寡核苷酸适配体摩尔数与蛋白质量的比例；

图2为肺癌血清候选寡核苷酸适配体Cell APT-2与靶标结合的Kd解离常数；

图3为肺癌血清候选寡核苷酸适配体Cell APT-2与肺癌细胞培养液结合的特异性验证；

图4为肺癌血清候选寡核苷酸适配体Cell APT-2与肺癌血清结合的特异性验证。

具体实施方式

本发明提供了一种特异性结合肺癌血清的寡核苷酸适配体Cell APT-2，所述寡核苷酸适配体Cell APT-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：ctatagcaatggtacggtacttcctagttgagcattatacacattgactgggctgttcttctgtcaaaagtgcacgctactttgctaa。

本发明优选通过指数富集的配基系统进化技术(Systemic evolution ofligands by exponential enrichment，简称SELEX)筛选获得所述寡核苷酸适配体CellAPT-2的序列，具体的以肺癌细胞培养液为正筛靶标，以肺上皮细胞培养液为反筛靶标，经过多轮反复孵育，洗脱，扩增，从随机文库中筛选出出多条寡核苷酸适配体序列，通过对这些寡核苷酸适配体序列进行序列比对和同源性分析，确定出7条寡核苷酸适配体序列进行特异性和亲和力验证；用肺癌细胞培养液、肺上皮细胞培养液、宫颈癌细胞培养液对7条寡核苷酸适配体的特异性和亲和力进行验证。结果发现，寡核苷酸适配体Cell APT-2表现出对肺癌细胞培养液强特异性和高亲和力的特性，同时还鉴定出寡核苷酸适配体Cell APT-2与肺癌血清具有很强的特异性和亲和力。

在本发明中，所述寡核苷酸适配体Cell APT-2优选还包括修饰，所述修饰包括：磷酸骨架修饰、截断、延长、颠换，或对碱基进行化学修饰，或在所述寡核苷酸适配体CellAPT-2的5’端或3’端结合生物素、地高辛、荧光物质及纳米发光材料或者酶标记。

本发明所述寡核苷酸适配体Cell APT-2的核苷酸序列，优选还包括：与所述寡核苷酸适配体Cell APT-2同源性在80％以上的寡核苷酸序列，或与所述寡核苷酸适配体CellAPT-2进行杂交的序列，或所述寡核苷酸适配体Cell APT-2转录的RNA序列。

本发明还提供了上述寡核苷酸适配体Cell APT-2的制备方法，包括利用体外化学合成或通过PCR扩增或其他分子生物学方法获得所述寡核苷酸适配体Cell APT-2。本发明对所述体外化学合成或PCR扩增的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段即可。

本发明还提供了上述寡核苷酸适配体Cell APT-2在制备肺癌诊断试剂中的应用。

本发明所述寡核苷酸适配体Cell APT-2能够特异性识别并结合肺癌细胞培养液和肿瘤血清，与肺癌细胞培养液的平衡解离常数(Kd)为9.026±3.244nM，可将其用于制备肺癌诊断试剂。

本发明还提供了一种肺癌诊断试剂，所述试剂的有效成分包括上述寡核苷酸适配体Cell APT-2。

本发明优选利用所述试剂中的寡核苷酸适配体Cell APT-2，利用q-PCR方法对肺癌进行辅助性判断，即根据是否与血清有特异性结合，如有特异性结合则可判断为肺癌，如没有特异性结合，则可判断为正常组织。

本发明还提供了上述寡核苷酸适配体Cell APT-2在制备抗肺癌药物中的应用。本发明所述应用优选与上述应用相同，在此不再赘述。

本发明还提供了一种抗肺癌药物，所述药物的有效成分包括上述寡核苷酸适配体Cell APT-2。本发明可利用所述适配体的靶向作用，将抗肺癌药物精准携带到肿瘤位置，达到精准医疗。

本发明还提供了上述寡核苷酸适配体Cell APT-2在制备判断肺癌肿瘤分期和分型的药物中的应用。本发明所述应用优选与上述应用相同，在此不再赘述。

本发明还提供了一种判断肺癌肿瘤分期和分型的药物，所述药物的有效成分包括上述寡核苷酸适配体Cell APT-2。本发明所述药物优选与上述试剂相同，在此不再赘述。

下面结合实施例对本发明提供的一种特异性结合肺癌血清的寡核苷酸适配体进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

寡核苷酸适配体Cell APT-2的制备

(1)构建初始寡核苷酸文库(SEQ ID NO.2)：

5'-CTATAGCAATGGTACGGTACTTCC-(40N)-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'

其中N代表A，T，C，G中任意碱基，且所述的寡核苷酸文库两端固定序列为PCR扩增引物结合区，中间为40个碱基的随机序列。

(2)细胞培养液的处理

所有细胞株均来自ATCC细胞库，对肺癌细胞A549与肺上皮细胞HMVEC在高糖DMEM培养基中进行培养，生长到80％左右时，换为无酚红、无血清DMEM培养基继续培养24h，进行收集。将收集到的细胞培养基收集至1.5mL离心管中，1000g，4℃离心5min，去除悬浮细胞及死细胞，收集离心后的上清，继续在2000g，4℃条件下离心5min去除细胞碎片，收集离心后上清，继续在5000g，4℃条件下离心5min去除更细小的细胞碎片，收集上清至10mL离心管中，混匀后分装到1.5mL离心管中。

(3)文库的处理

步骤(1)所述的寡核苷酸文库用DEPC水溶解，95℃变性10min，冰浴5min，室温5min，使ssDNA形成特定的三维空间结构。

(4)磁珠活化

用1mLMES(MES 1.564g溶于500mL超纯水中)溶液洗涤磁珠(PuriMag Biotech，PMAG016)三遍，加入EDC(50mg/mL)混匀后，加入NHS(50mg/mL)，室温旋转孵育30min，弃上清，用MES溶液洗涤3遍。

(5)文库与细胞培养液的结合

反筛：已经处理过的肺上皮细胞培养液与处理过的文库室温旋转孵育1h，随后与活化磁珠继续旋转孵育1h，形成复合物。

正筛：将与反筛结合的上清溶液与处理过的肺癌细胞培养液室温旋转孵育1h，随后与活化磁珠继续旋转孵育1h，形成复合物。

(6)筛选过程的监测

弃与正筛结合的上清溶液，用1mL含有0.1％吐温-20的筛选Buffer(HEPES5.9575g，NaCl 2.922g，MgCl₂0.047605g，KCl 0.74551g，CaCl₂ 0.0555g溶于500mL超纯水中)洗一遍，95℃变性，吸上清，q-PCR分析：

引物：P7 primer(SEQ ID NO.3，5′-CTATAGCAATGGTACGGTACTTCC-3′)；

P11 biotin-labeled primer(简称P11-bio，SEQ ID NO.4，5′biotin-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3′)购自上海生工生物工程股份有限公司。

20μL体系：Taq HS 0.1μL、10×PCR buffer 2μL、dNTP mixture 1.6μL、EVA Green1μL、P70.2μL、P11-bio 0.2μL、DEPC-Water 11.9μL、ssDNA模板3μL。

程序：37℃5min；94℃2min，95℃5s，60℃34s，39个循环；65℃5s；95℃5s。

(7)链霉亲和素磁珠法制备次级库

PCR扩增产物均为5’端带有生物素的dsDNA，将阳性模板普通PCR(引物为SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4，程序与q-PCR相同)扩增产物与链霉亲和素磁珠(上海生工生物工程股份有限公司的链霉亲和素与活化磁珠在37℃条件下旋转孵育0.5h，形成链霉亲和素磁珠)37℃孵育30min，经1mL 5％的甲酰胺在40℃水浴5min后，加250μL 0.1M的NaOH溶液，在95℃条件下变性5min，0℃冰浴5min，用0.1M的HCl中和后收集上清，即为制备的次级库，用于下一轮筛选。

普通PCR体系(20μL)：Taq HS 0.1μL、10×PCRbuffer 2μL、dNTP mixture 1.6μL、P70.2μL、P11-bio 0.2μL、DEPC-Water 12.9μL、ssDNA模板3μL。

(8)使用步骤(7)制备的次级库重复步骤(2)-(7)的筛选流程，共进行9轮筛选。其中，步骤(5)含有反筛过程，将随机寡核苷酸文库与肺上皮细胞培养液进行结合，在第1、8轮前进行了反筛过程，其余均为正筛过程，前9轮筛选PCR监测结果如图1所示，表示寡核苷酸与阳性靶标(肺癌细胞培养液)的结合能力在第8轮达到了饱和状态。最后高通量测序第4、8轮的寡核苷酸库，挑选得到寡核苷酸适配体Cell APT-2，所述寡核苷酸适配体Cell APT-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2

通过q-PCR法检测寡核苷酸适配体Cell APT-2与肺癌细胞培养液的结合能力

配制等体积不同浓度梯度(0nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM和400nM)的寡核苷酸适配体Cell APT-2，根据实施例1所述的方法与肺癌细胞培养液室温旋转孵育1h，随后与活化磁珠37℃继续旋转孵育1h形成复合物。用1mL含有0.1％吐温-20的筛选Buffer洗1次，以去除与非靶标蛋白非特异结合的寡核苷酸适配体，95℃变性，收集上清，进行与实施例1相同的q-PCR分析，将相对荧光强度RFU(1/Ct×10³)作为监测指标，结果如图2所示，得到寡核苷酸适配体Cell APT-2的平衡解离常数(Kd)为9.026±3.244nM。

实施例3

通过q-PCR法验证寡核苷酸适配体Cell APT-2与肺癌细胞培养液的特异识别

将适配体Cell APT-2进行浓度比例稀释至100nM，分别与肺癌细胞A549和NCI-H441、结直肠癌细胞HT-29和SW480、宫颈癌细胞HeLa、肺上皮细胞HMVEC培养液于室温旋转孵育1h，随后与磁珠37℃旋转孵育1h。用1mL含有0.1％吐温-20的筛选Buffer洗1次，以去除与非靶标蛋白非特异结合的寡核苷酸适配体，95℃变性，收集上清，进行q-PCR监测，将RFU(1/Ct×10³)作为监测指标。结果如图3所示，寡核苷酸适配体Cell APT-2对肺癌细胞株A549与NCI-H441均有很强的结合能力，因此适配体Cell APT-2对肺癌细胞培养液具有强特异性结合能力。

表1寡核苷酸适配体Cell APT-2对肺癌细胞株的结合能力

实施例4

通过q-PCR法验证寡核苷酸适配体Cell APT-2与肺癌血清的特异识别

(1)血清收集来自秦皇岛市第一医院。取10例健康人血清，15000g，4℃离心30min，去除血清中的红细胞，收集血清。肺癌、结直肠癌血清处理过程同前。

(2)将适配体Cell APT-2进行浓度比例稀释，分别与肺癌血清、结直肠癌血清、健康人血清于室温旋转孵育1h，随后与磁珠在37℃旋转孵育1h。

(3)用1mL含有0.1％吐温-20的筛选Buffer洗1次，以去除与非靶标蛋白非特异结合的寡核苷酸适配体，95℃变性，收集上清，进行q-PCR分析，将RFU(1/Ct×10³)作为监测指标。结果如图4所示，肺癌血清中阳性(肺癌血清)RFU均值明显高于阴性(健康人血清)与结直肠癌血清RFU均值，因此适配体Cell APT-2对肺癌血清具有强特异性结合能力。

表2寡核苷酸适配体Cell APT-2与肺癌血清的结合能力

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 燕山大学

<120> 一种特异性结合肺癌血清的寡核苷酸适配体及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ctatagcaat ggtacggtac ttcctagttg agcattatac acattgactg ggctgttctt 60

ctgtcaaaag tgcacgctac tttgctaa 88

<210> 2

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ctatagcaat ggtacggtac ttccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

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<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ctatagcaat ggtacggtac ttcc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ttagcaaagt agcgtgcact tttg 24

Claims (5)

1.一种特异性结合肺癌血清的寡核苷酸适配体CellAPT-2，其特征在于，所述寡核苷酸适配体CellAPT-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述寡核苷酸适配体CellAPT-2通过指数富集的配基系统进化技术筛选获得，具体的以肺癌细胞培养液为正筛靶标，以肺上皮细胞培养液为反筛靶标，经过多轮反复孵育，洗脱，扩增，从随机文库中筛选出出多条寡核苷酸适配体序列，通过对这些寡核苷酸适配体序列进行序列比对和同源性分析，确定出7条寡核苷酸适配体序列进行特异性和亲和力验证；用肺癌细胞培养液、肺上皮细胞培养液、宫颈癌细胞培养液对7条寡核苷酸适配体的特异性和亲和力进行验证。

2.根据权利要求1所述寡核苷酸适配体CellAPT-2，其特征在于，所述寡核苷酸适配体CellAPT-2还包括对碱基进行化学修饰，或在所述寡核苷酸适配体CellAPT-2的5’端或3’端结合生物素、地高辛、荧光物质及纳米发光材料或者酶标记。

3.权利要求1或2所述寡核苷酸适配体CellAPT-2的制备方法，其特征在于，包括利用体外化学合成或通过PCR扩增或其他分子生物学方法获得所述寡核苷酸适配体CellAPT-2。

4.权利要求1或2所述寡核苷酸适配体CellAPT-2在制备肺癌诊断试剂中的应用。

5.一种肺癌诊断试剂，其特征在于，所述试剂的有效成分包括权利要求1或2所述寡核苷酸适配体CellAPT-2。

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