CN109682970A - 肺癌肿瘤标志物及其应用 - Google Patents
肺癌肿瘤标志物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109682970A CN109682970A CN201811488459.5A CN201811488459A CN109682970A CN 109682970 A CN109682970 A CN 109682970A CN 201811488459 A CN201811488459 A CN 201811488459A CN 109682970 A CN109682970 A CN 109682970A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lung cancer
- clec3b
- agglutinin
- sera
- tumor marker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种肺癌肿瘤标志物及其应用,该肺癌新肿瘤标志物为C型凝集素CLEC3B,是通过SELEX技术从肺癌血清中筛选获得的核酸适配体,再以该适配体为探针从肺癌血清中钓取蛋白得到的。该蛋白在肺癌血清中的表达高于正常血清,可以作为肺癌诊断的一种标志物,并能为肺癌患者做出早期诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域,涉及一种肺癌肿瘤标志物及其应用。
背景技术
肺癌是全球的“头号癌症杀手”,是发病率和死亡率均居世界首位的恶性肿瘤。在我国,肺癌已经成为恶性肿瘤死亡的首位,占全部恶性肿瘤死亡病例的22.7%,且发病率和死亡率仍在继续上升。2000-2005年间,我国肺癌患者增加了12万,全国肿瘤登记中心2014年发布的数据显示,2010年,我国新发肺癌病例60.59万,占恶性肿瘤新发病例的19.59%,如不及时采取有效的控制措施,预计到2025年,患者人数将达到100万,成为世界第一肺癌大国。
肺癌可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中后者占大约80%。非小细胞肺癌又可以分为三类:鳞癌、腺癌和大细胞癌。导致肺癌发生的因素有很多,吸烟、遗传因素,放射性氡气、石棉等都是风险因素。
目前,肺癌已成为一个严重的公共健康问题。肺癌的死亡率高,五年生存率不足15%。一个重要的原因是早期诊断率低,不足2%,80%以上患者就诊时已在晚期。对高危人群进行定期的肺癌筛查,早诊断、早治疗是提高肺癌患者生存率的有效途径。然而在癌症早期,肿瘤细胞往往表现为低丰度,筛查手段灵敏度低,操作人员的判断也有可能导致偏差。目前的诊断方法有X-射线检查、CT扫描、支气管镜检、痰细胞学检查以及肺癌生物标志物检测等。这些方法都存在各自的缺陷,如影像学技术难以发现瘤体较小的肿瘤,早期普查的漏检率较高。因此,筛选和鉴定一种高特异性、高灵敏度的肺癌肿瘤标志物已经成为肺癌研究中的重点和难点。
所谓肿瘤标志物,是指特征性存在于恶性肿瘤细胞的一类物质,是肿瘤细胞产生或释放的某种物质,常以抗原、酶、激素等代谢产物的形式存在于肿瘤细胞或宿主体液中,它的存在或量变可以提示肿瘤的性质,从而有利于对肿瘤的诊断、分类、转移、预后以及复发等做出判断,肿瘤标志物应该具有良好的敏感度和特异性,并能在肿瘤早期检测。而现有的肺癌肿瘤标志物存在早期病人阳性率低,单一标志物诊断有限等问题,因此,本领域急需一种特异性高、灵敏度好、可用于早期诊断的新肿瘤标志物。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供一种肺癌肿瘤标志物,具有高特异性、高灵敏性,可用于肺癌的早期诊断。
本发明是这样实现的:
一种肺癌肿瘤标志物,所述肺癌肿瘤标志物为C型凝集素CLEC3B。
优选地,所述C型凝集素CLEC3B的序列为:
MELWGAYLLLCLFSLLTQVTTEPPTQKPKKIVNAKKDVVNTKMFEVLKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVCLKGTKVHMKCFLAFTQTKTFHEASEDCISRGGTLSTPQTGSENDALYEYLRQSVGNEAEIWLGLNDMAAEGTWVDMTGARIAYKNWETEITAQPDGGKTENCAVLSGAANGKWFDKRCRDQLPYICQFGIV。
优选地,C型凝集素CLEC3B蛋白在确认肺癌患者血清中的高表达。
本发明的另一个目的是提供C型凝集素CLEC3B作为肺癌肿瘤标志物用于肺癌的早期诊断的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的肺癌肿瘤标志物是在前期利用SELEX技术从肺癌血清中筛选得到的核酸适配体的基础上,以该适配体为探针从肺癌血清中钓取蛋白得到的,且C型凝集素CLEC3B蛋白在肺癌血清中的高表达,具有高特异性、高灵敏性,可用于肺癌的早期诊断。
附图说明
图1为钓取得到的蛋白测序序列结果。
图2通过SPR测定凝集素CLEC3B和肺癌适配体结合的亲和力。
图3通过EMSA鉴定凝集素CLEC3B和肺癌适配体结合的特异性。
图4ELISA检测中,人C型凝集素CLEC3B标准品的标准曲线。
图5为检测的50例肺癌血清和健康人血清中凝集素CLEC3B浓度散点图。
图6ELISA检测肺癌血清和健康人血清中凝集素CLEC3B浓度均值图。
具体实施方式
以下将参考附图详细说明本发明的示例性实施例、特征和性能方面。附图中相同的附图标记表示功能相同或相似的元件。尽管在附图中示出了实施例的各种方面,但是除非特别指出,不必按比例绘制附图。
本发明提供一种肺癌肿瘤标志物,该肺癌肿瘤标志物为C型凝集素CLEC3B。C型凝集素CLEC3B的序列为:
MELWGAYLLLCLFSLLTQVTTEPPTQKPKKIVNAKKDVVNTKMFEVLKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVCLKGTKVHMKCFLAFTQTKTFHEASEDCISRGGTLSTPQTGSENDALYEYLRQSVGNEAEIWLGLNDMAAEGTWVDMTGARIAYKNWETEITAQPDGGKTENCAVLSGAANGKWFDKRCRDQLPYICQFGIV。
该C型凝集素CLEC3B蛋白在确认肺癌患者血清中的高表达。
本发明的另一个目的是提供C型凝集素CLEC3B作为肺癌肿瘤标志物用于肺癌的早期诊断的应用。
肺癌肿瘤标志物C型凝集素CLEC3B是在前期利用SELEX技术从肺癌血清中筛选得到的核酸适配体的基础上,以该适配体为探针从肺癌血清中钓取蛋白得到的,然后并利用前期的肺癌核酸适配体对凝集素CLEC3B进行亲和力和特异性检测,并验证了凝集素CLEC3B在肺癌血清中的高表达。
实施例1
肺癌血清中凝集素CLEC3B的钓取
将PCR扩增完的带生物素的肺癌核酸适配体与链霉亲和素包被的磁珠37℃孵育1h,甲酰胺洗脱,DEPC水变性,PBS+Mg2+二次变性。将结合有带生物素标记的适配体的磁珠迅速与处理好的肺癌血清在37℃下孵育1h,用PBS洗脱,将洗脱下的蛋白测序,测序结果如图1所示,序列为:
MELWGAYLLLCLFSLLTQVTTEPPTQKPKKIVNAKKDVVNTKMFEVLKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVCLKGTKVHMKCFLAFTQTKTFHEASEDCISRGGTLSTPQTGSENDALYEYLRQSVGNEAEIWLGLNDMAAEGTWVDMTGARIAYKNWETEITAQPDGGKTENCAVLSGAANGKWFDKRCRDQLPYICQFGIV;
鉴定为C型凝集素CLEC3B。
实施例2
通过SPR测定凝集素CLEC3B和肺癌适配体的亲和力
使用CM5芯片,先用EDC/NHS 10μL/min活化芯片420s,然后10μL/min偶连链霉亲和素蛋白(用pH 4.5醋酸稀释至50μg/mL)30min,偶连量达到2000RU响应值时,再用乙醇胺封闭芯片表面(10μL/min,500s)。用制备好的链霉亲和素包被的CM5芯片,捕获生物素标记的核酸适配体(1μg/mL,200μL),核酸偶连量达到600RU。用PBS-P稀释凝集素CLEC3B溶液分别为125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91nM,体积为190μL,以50μL/min进样120s,解离300s。
结果如图2所示,从上到下1-6分别是用PBS-P稀释凝集素CLEC3B溶液为125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91nM,实验表明随着蛋白浓度的增加,凝集素CLEC3B和肺癌核酸适配体的结合响应值增加。亲和力数值如下表1所示,KD值用来表征核酸和蛋白的结合亲和力,KD值越小,亲和力越高;kd值用来表示结合产物解离的快慢,kd值越小,说明解离越慢,结合力也就越强;ka值用来表征核酸和蛋白结合的快慢,ka值越大,说明结合越快。由此可知:凝集素CLEC3B跟肺癌核酸适配体的亲和力很强。
表1亲和力数值
实施例3
通过EMSA鉴定凝集素CLEC3B和肺癌适配体的特异性
表2结合反应体系
采用的DNA探针是由上海生工直接合成5’-FAM标记的肺癌核酸适配体探针。
结合条件:25℃,30min。
配置8%PAGE gel,用预冷的0.5×TBE buffer,120V恒压预电泳30min。将蛋白DNA的结合产物上样,继续低温电泳150V 30min。
电泳后的胶直接通过ImageQuant LAS 4000mini(GE Healthcare)曝光显影。
实验结果如图3所示,其中,泳道1为核酸适配体探针;泳道2为0.5μg凝集素CLEC3B和适配体的结合产物;泳道3为1.0μg凝集素CLEC3B和适配体的结合产物;泳道4为2.0μg凝集素CLEC3B和适配体的结合产物;泳道5为2.0μg BSA和适配体的结合产物。适配体与凝集素CLEC3B结合并产生电泳条带迁移的现象,并且随着凝集素CLEC3B浓度的增加,产生的电泳条带迁移的现象越明显。由于实验体系中添加了鲑鱼精DNA,用于消除蛋白-DNA非特异结合产生的影响,因此判断凝集素CLEC3B与肺癌适配体探针的结合是特异的。同时在同样的体系里加入对照蛋白BSA与适配体探针进行结合,当BSA与凝集素CLEC3B量相同为2μg时,并没有观察到BSA与适配体探针结合产生的电泳条带迁移现象,进一步验证了只有凝集素CLEC3B与肺癌核酸适配体探针是特异性结合的。
实施例4
验证凝集素CLEC3B在肺癌血清中的高表达
ELISA检测步骤:
S1、将人C型凝集素CLEC3B标准品配成20000pg/mL,然后等浓度稀释为10000pg/mL、5000pg/mL、2500pg/mL、1250pg/mL、625pg/mL和312.5pg/mL,加入欲涂层96孔板,每孔100μL,对照孔为100μL样品稀释缓冲液,每组一共做三个平行样;
S2、用提供的新粘合剂盖板密封板,并在37℃孵育90min,取下盖子,丢弃平板内容物,并将平板用吸收纸巾吸干;
S3、每孔加入100μL生物素标记的抗人凝集素抗体工作液,盖上新粘合盖,37℃孵育60min;
S4、用0.01M PBS洗板3次,每次让洗涤缓冲液留在孔中1分钟,丢弃洗涤缓冲液并将纸板吸干在纸巾或其他材料上;
S5、每孔加100μLABC制备的工作溶液,用新的粘合剂盖板密封,37℃孵育30min;
S6、用0.01M PBS洗板5次,每次让洗涤缓冲液留在孔中1-2min,丢弃洗涤缓冲液并将纸板吸干在纸巾或其他材料上;
S7、每孔加入90μl制备号的TMB彩色显影剂,用新的粘合剂盖板密封,37℃孵育15-20min;
S8、向每个孔中加入100μL的终止溶液;在加入终止溶液后30min内在酶标仪中读取450nm处的吸光度,然后绘制标准曲线,如图4所示。
分别取50例肺癌患者血清和健康人血清作为实验组。待血清室温融化,以1000×g,4℃,离心15min,取上清作为试验样品,实验方法同上,分别计算肺癌血清和正常血清中人凝集素CLEC3B的浓度。
结果如图5和图6所示,凝集素CLEC3B在肺癌血清和健康人血清中的浓度分布均比较集中,经计算肺癌血清和健康人血清中凝集素CLEC3B的浓度均值分别为3.749和2.211ng/mL,肺癌患者血清中凝集素CLEC3B含量均值明显高于健康人,且差异显著。因此可看出凝集素CLEC3B在肺癌血清中的高表达,并能证明肺癌患者血清中的凝集素CLEC3B可以作为肺癌肿瘤标志物的参考。
本实施例所用的溶液和洗液均为ELISA试剂盒所提供的或按照说明书配置。
综上,本发明的肺癌新肿瘤标志物C型凝集素CLEC3B是通过SELEX技术从肺癌血清中筛选获得的核酸适配体,再以该适配体为探针从肺癌血清中钓取蛋白得到的。该蛋白在肺癌血清中的表达高于正常血清,可以作为肺癌诊断的一种标志物,具有高特异性、高灵敏性,能为肺癌患者做出早期诊断。
最后应说明的是:以上所述的各实施例仅用于说明本发明技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换;而这些修改或替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (4)
1.一种肺癌肿瘤标志物,其特征在于:所述肺癌肿瘤标志物为C型凝集素CLEC3B。
2.根据权利要求1所述的肿瘤标志物,其特征在于:所述C型凝集素CLEC3B的序列为:
MELWGAYLLLCLFSLLTQVTTEPPTQKPKKIVNAKKDVVNTKMFEVLKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVCLKGTKVHMKCFLAFTQTKTFHEASEDCISRGGTLSTPQTGSENDALYEYLRQSVGNEAEIWLGLNDMAAEGTWVDMTGARIAYKNWETEITAQPDGGKTENCAVLSGAANGKWFDKRCRDQLPYICQFGIV。
3.根据权利要求1所述的肺癌肿瘤标志物,其特征在于,C型凝集素CLEC3B蛋白在确认肺癌患者血清中的高表达。
4.C型凝集素CLEC3B作为肺癌肿瘤标志物用于肺癌的早期诊断的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811488459.5A CN109682970A (zh) | 2018-12-06 | 2018-12-06 | 肺癌肿瘤标志物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811488459.5A CN109682970A (zh) | 2018-12-06 | 2018-12-06 | 肺癌肿瘤标志物及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109682970A true CN109682970A (zh) | 2019-04-26 |
Family
ID=66187319
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811488459.5A Pending CN109682970A (zh) | 2018-12-06 | 2018-12-06 | 肺癌肿瘤标志物及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109682970A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112680452A (zh) * | 2021-01-18 | 2021-04-20 | 燕山大学 | 一种特异性结合肺癌血清的寡核苷酸适配体及应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101509035A (zh) * | 2008-09-05 | 2009-08-19 | 中国人民解放军总医院 | 肺癌分型的基因序列及其应用 |
WO2014047723A1 (en) * | 2012-09-27 | 2014-04-03 | Universite Laval | Gene expression profiling for prognosis of non-small cell lung cancer |
US20150024399A1 (en) * | 2007-06-01 | 2015-01-22 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Molecular diagnosis and typing of lung cancer variants |
-
2018
- 2018-12-06 CN CN201811488459.5A patent/CN109682970A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20150024399A1 (en) * | 2007-06-01 | 2015-01-22 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Molecular diagnosis and typing of lung cancer variants |
CN101509035A (zh) * | 2008-09-05 | 2009-08-19 | 中国人民解放军总医院 | 肺癌分型的基因序列及其应用 |
WO2014047723A1 (en) * | 2012-09-27 | 2014-04-03 | Universite Laval | Gene expression profiling for prognosis of non-small cell lung cancer |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
MARIA PERNEMALM 等: "Use of narrow-range peptide IEF to improve detection of lung adenocarcinoma markers in plasma and pleural effusion", 《PROTEOMICS》 * |
NCBI: "unnamed protein product[Homo sapiens]", 《NCBI》 * |
冯楠楠等: "CL EC 3 B 基因在肺癌中的表达及其启动子甲基化水平", 《全国肿瘤流行病学和肿瘤病因学学术会议论文集》 * |
邸娅 等: "肺癌患者血清特异性核酸适配体的筛选及鉴定", 《分子影像学杂志》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112680452A (zh) * | 2021-01-18 | 2021-04-20 | 燕山大学 | 一种特异性结合肺癌血清的寡核苷酸适配体及应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106885908B (zh) | 血清psmd4蛋白的检测试剂盒及其检测方法与应用 | |
KR100679173B1 (ko) | 위암 진단용 단백질 마커 및 이를 이용한 진단키트 | |
Yu et al. | Development of a clinical chemiluminescent immunoassay for serum GPC3 and simultaneous measurements alone with AFP and CK19 in diagnosis of hepatocellular carcinoma | |
Xie et al. | Development of an Affimer-antibody combined immunological diagnosis kit for glypican-3 | |
WO2020199501A1 (zh) | 一种基于量子点荧光的食品过敏原快速检测方法 | |
CN108398557A (zh) | 一种髓过氧化物酶荧光免疫层析试纸条及试纸卡 | |
DK160108B (da) | Fremgangsmaade og udstyr til direkte eller indirekte paavisning af reaktion mellem et specifikt bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans | |
CN108414748A (zh) | 一种thsd7a抗体的检测试纸条及检测方法 | |
CN104316685B (zh) | 一种二乙酰精胺的检测试剂盒及制备方法和应用 | |
US20120295814A1 (en) | CA-125 Immune Complexes as Biomarkers of Ovarian Cancer | |
CN102844661A (zh) | 胃癌的生物标志物及其应用 | |
CN108351358A (zh) | 肝癌测试方法 | |
CN108761088A (zh) | 用于糖链异常蛋白分离检测的组合物、试剂盒以及方法和用途 | |
Ren et al. | D2-40: an additional marker for myoepithelial cells of breast and the precaution in interpreting tumor lymphovascular invasion | |
Wada et al. | Demonstration of placental alkaline phosphatase in human breast cancer | |
CN109682970A (zh) | 肺癌肿瘤标志物及其应用 | |
Joshi-Barr et al. | High throughput bioassay for beta1-adrenoceptor autoantibody detection | |
CN105445471B (zh) | 心血管疾病标记物palm及利用其的心血管疾病诊断方法 | |
Abelev | a-Fetoprotein production by normal liver and liver tumors | |
DE19806185C2 (de) | Immunoassay und Testkit zur Bestimmung von fucosyliertem Protein in einer biologischen Probe | |
CN108196061A (zh) | 一种基于单克隆抗体检测人pgrn的双夹心elisa试剂盒 | |
Mælan et al. | Localization of thymosin β10 in breast cancer cells: relationship to actin cytoskeletal remodeling and cell motility | |
CN104292322A (zh) | 原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原及其应用 | |
CN105675572B (zh) | 一种肺癌筛查试剂盒 | |
CN104459161A (zh) | 一种甲胎蛋白胶体金检测试剂盒及其使用方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190426 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |