DE102016224234A1 - MEANS AND METHOD FOR THE DETECTION OF ANALYTES BY MEANS OF MACROSCOPIC GRANULATE PARTICLES - Google Patents
MEANS AND METHOD FOR THE DETECTION OF ANALYTES BY MEANS OF MACROSCOPIC GRANULATE PARTICLES Download PDFInfo
- Publication number
- DE102016224234A1 DE102016224234A1 DE102016224234.2A DE102016224234A DE102016224234A1 DE 102016224234 A1 DE102016224234 A1 DE 102016224234A1 DE 102016224234 A DE102016224234 A DE 102016224234A DE 102016224234 A1 DE102016224234 A1 DE 102016224234A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- analyte
- detection
- granules
- sample
- macroscopic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 239000008187 granular material Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 25
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 25
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 11
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 claims 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims 1
- 239000002907 paramagnetic material Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 claims 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 32
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 16
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 10
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- BUHVIAUBTBOHAG-FOYDDCNASA-N (2r,3r,4s,5r)-2-[6-[[2-(3,5-dimethoxyphenyl)-2-(2-methylphenyl)ethyl]amino]purin-9-yl]-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound COC1=CC(OC)=CC(C(CNC=2C=3N=CN(C=3N=CN=2)[C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)C=2C(=CC=CC=2)C)=C1 BUHVIAUBTBOHAG-FOYDDCNASA-N 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007931 coated granule Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000011982 device technology Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012125 lateral flow test Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft magnetisch separierbare Makro-Granulate auf Polymer-Basis zur Durchführung von Immunoassays zur Detektion unterschiedlichster Analyten für medizinische, biologische, biotechnologische Bereiche. Die die Größe der makroskopischen Granulat-Partikel beträgt zwischen 0,5 mm und 10 mm im Querschnitt, vorzugsweise zwischen 1 mm und 5 mm. Vorzugsweise sind die Makro-Granulate magnetisch separierbar. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich die Makro-Granulate auf Polymer-Basis in einer Pipettenspitze.The present invention relates to magnetically separable polymer-based macro-granules for carrying out immunoassays for the detection of a wide variety of analytes for medical, biological and biotechnological fields. The size of the macroscopic granule particles is between 0.5 mm and 10 mm in cross-section, preferably between 1 mm and 5 mm. Preferably, the macro-granules are magnetically separable. According to a preferred embodiment, the macro-granules are polymer-based in a pipette tip.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines magnetisch separierbaren Makro-Granulats auf Polymer-Basis zur Durchführung von Immunoassays zur Detektion unterschiedlichster Analyten für medizinische, biologische, biotechnologische Bereiche.The present invention relates to the use of a magnetically separable polymer-based macro-granules for carrying out immunoassays for the detection of a wide variety of analytes for medical, biological and biotechnological fields.
Stand der Technik State of the art
Neben der molekularbiologischen Diagnostik sind die Analyse und der Nachweis von Proteinen, Antikörpern etc. zu einem unverzichtbaren Bestandteil in der modernen medizinischen Labordiagnostik, der forensischen Diagnostik, der veterinärmedizinischen Labordiagnostik und in der Lebensmittel- und Umweltdiagnostik geworden.In addition to molecular biological diagnostics, the analysis and detection of proteins, antibodies, etc. has become an indispensable component in modern medical laboratory diagnostics, forensic diagnostics, veterinary laboratory diagnostics and in food and environmental diagnostics.
Immunoassays und ihre Derivate kommen immer dann zum Einsatz, wenn der Analyt nicht in Form einer Nukleinsäure vorliegt, die zur Detektion durch molekularbiologische Techniken vervielfältigt werden könnte. Dies betrifft den Nachweis von unterschiedlichen Molekülen, wie z. B. Hormone, Toxine, Alkohole und Proteine im Allgemeinen. Immunoassays finden darüber hinaus als sogenannte Schnelltests Verwendung, wenn ein schneller Nachweis z. B. einer ganzen Zelle oder eines Viruspartikels angestrebt wird. Diese Nachweistechnologien sind u.a.
Die erzielbaren Sensitivitäten stellen ein generelles Problem der vorgestellten Nachweistechnologien dar. Einerseits liegt dies an der nur begrenzt möglichen Signalverstärkung, andererseits an der geringen Menge an Probe, die für das entsprechende Testformat eingesetzt werden kann (bei einem konventionellen ELISA max. 100 µl). Hinzu kommen noch Probleme mit etwaigen Matrixeffekten bei schwierigen Probenmaterialien, wie z. B. Blutplasma, Lebensmitteln etc.. Diese Probleme werden teilweise durch Verwendung von unterschiedlichen LowCross-Puffern gelöst [1]. Mit diesen Puffern wird die ursprüngliche Probe verdünnt und einem Antikörper zugefügt. Dies erhöht zwar die Spezifität der Antikörper-Antigen-Bindung, führt aber durch die Verdünnung des Ausgangsmaterials zu einem Sensitivitätsverlust. The achievable sensitivities represent a general problem of the presented detection technologies. On the one hand this is due to the limited signal amplification, on the other hand the small amount of sample which can be used for the corresponding test format (with a conventional ELISA a maximum of 100 μl). In addition, there are problems with possible matrix effects in difficult sample materials, such. Blood plasma, food, etc. These problems are partially solved by using different low cross buffers [1]. These buffers are used to dilute the original sample and add it to an antibody. Although this increases the specificity of the antibody-antigen binding, but leads by the dilution of the starting material to a loss of sensitivity.
Bisherige Technologien zur Lösung des Problems bezüglich des limitierten Probenvolumens sehen den Einsatz von Beads vor, an die der Analyt gebunden wird [2]. Die Größe der eingesetzten Beads liegt hierbei im Bereich von Mikro- und Nanometern. Dies erscheint zunächst sehr vorteilhaft, da Beads bei einem kleinen Gesamtvolumen eine sehr große Oberfläche besitzen. Die mit Antikörpern gekoppelten Beads werden der Probe zugefügt und anschließend zusammen mit dem darauf gebundenen Antigen entweder durch eine Zentrifugation oder durch magnetische Separation dem weiteren Nachweisverfahren zugeführt. Beads werden darüber hinaus auch für die Separation diverser Probenbestandteile, wie z.B. Exosomen, Zellen und Molekülen verwendet. Die Separation der Beads aus einer Lösung ist aber stets problematisch, da insbesondere Beads im Mikrometer- bzw. Submikrometermaßstab sehr viel Zeit benötigen, um mittels eines Magnetfeldes separiert zu werden. Dies umso mehr, je visköser die zu untersuchende Probe ist. Man muss deshalb immer mit einem Verlust an Beads während der Magnetseparation oder mit einer sehr langen Separationszeit rechnen. Bei Verwendung größerer Probenvolumina verstärkt sich diese Problematik entsprechend, weshalb das Gesamtreaktionsvolumen bei diesen Methoden auf 1 bis 2 ml begrenzt ist. Ein weiteres Problem entsteht durch die magnetischen Eigenschaften solcher Beads. Dies ist die Ursache für eine Aggregation der Beads, welche zum Verlust der Assayfunktionalität während der Lagerung führen können.Previous technologies for solving the problem of limited sample volume involve the use of beads to which the analyte is bound [2]. The size of the beads used is in the range of micrometers and nanometers. This seems very advantageous at first, since beads have a very large surface area with a small total volume. The antibodies coupled with beads are added to the sample and then fed together with the antigen bound thereto either by centrifugation or by magnetic separation to the further detection method. In addition, beads are also used for the separation of various sample constituents, e.g. Exosomes, cells and molecules used. However, the separation of the beads from a solution is always problematic, since in particular beads in the micrometer or Submikrometermästab require a lot of time to be separated by means of a magnetic field. All the more, the more viscous the sample to be examined is. Therefore, one must always expect a loss of beads during magnetic separation or a very long separation time. When larger sample volumes are used, this problem increases accordingly, which is why the total reaction volume in these methods is limited to 1 to 2 ml. Another problem arises due to the magnetic properties of such beads. This is the cause of aggregation of the beads, which can lead to the loss of assay functionality during storage.
Einen Vorteil könnten sogenannte Makropartikel-basierte ELISA bieten. Die Verwendung von funktionalisierten ca. 0,6 cm großen Makropartikeln für ELISA ist bereits publiziert [4], allerdings besitzen die bisher bekannten Makropartikel keine magnetischen bzw. paramagnetischen Eigenschaften. Dies erlaubt deshalb auch keine magnetische Separation der Beads zur Durchführung der Nachweisreaktion. Ein weiteres Problem besteht in der fehlenden Automatisierungsmöglichkeit von Makropartikel-basierten Nachweisverfahren. Eine sehr interessante Entwicklung hinsichtlich einer ELISA-Automatisierung ist die Benutzung einer modifizierten Pipettenspitze [3]. Hierbei wurden die Pipettenspitzen selbst mit einem Antikörper beschichtet. Der nachfolgende ELISA wurde auf der Oberfläche der Spitzen als feste Phase durchgeführt. Die in sich geschlossenen Pipettenspitzen bieten zwar einen Schutz gegen Kreuzkontaminationen, das einsetzbare Volumen des Probenmaterials ist hierbei aber sehr begrenzt (von den Autoren werden 30 µl Probe verwendet). Darüber hinaus bedarf diese Methodik einer sehr komplizierten Apparatur und einer äußerst aufwendigen Herstellung der funktionalisierten Spitzen und ist demzufolge für diagnostische Routineanwendungen nicht kostengünstig/kostendeckend einsetzbar.One advantage could be provided by so-called macroparticle-based ELISA. The use of functionalized about 0.6 cm large macroparticles for ELISA has already been published [4], however, the previously known macroparticles have no magnetic or paramagnetic properties. This therefore also does not allow any magnetic separation of the beads for carrying out the detection reaction. Another Problem consists in the lack of automation possibility of macroparticle-based detection methods. A very interesting development regarding ELISA automation is the use of a modified pipette tip [3]. The pipette tips themselves were coated with an antibody. The subsequent ELISA was performed on the surface of the peaks as a solid phase. Although the self-contained pipette tips provide protection against cross-contamination, the usable volume of the sample material is very limited (the authors use 30 μl sample). In addition, this method requires a very complicated apparatus and an extremely complex production of functionalized tips and therefore can not be used cost-effectively / cost-effectively for routine diagnostic applications.
Aufgabe der ErfindungObject of the invention
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung definiert sich aus den aufgeführten Nachteilen von bekannten Nachweissystemen. The object of the present invention is defined by the disadvantages of known detection systems.
Lösung der AufgabeSolution of the task
Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.The problem has been solved according to the features of the claims.
Das erfindungsgemäße Mittel ermöglicht eine schnelle Signalgenerierung ggf. aus einem großen Probenvolumen ohne komplizierte Gerätetechnik, eine sehr hohe Empfindlichkeit und ist darüber hinaus für einen automatisierten Ablauf jeglicher Art geeignet. Es stellt ein alternatives, neuartiges Mittel zur Durchführung bisheriger ELISA-Anwendungen dar. The agent according to the invention enables rapid signal generation, if necessary from a large sample volume without complicated device technology, a very high sensitivity and, moreover, is suitable for an automated process of any kind. It represents an alternative, novel means to carry out previous ELISA applications.
Das erfindungsgemäße Mittel zum Nachweis eines Analyten nutzt spezifische makroskopische Granulat-Partikel-(„MGP“). Dabei können diese Partikel verschiedene Formen und Größen aufweisen, vorzugsweise Größen zwischen 1 mm und 5 mm im Querschnitt. Die Partikel können aus den bekannten Materialien bestehen, welche die Fähigkeit besitzen, auf ihrer Oberfläche die funktionsfähigen Detektionsmoleküle (Antikörper, Aptamere, chemische Gruppen etc.) zu tragen. Darüber hinaus kann das eingesetzte Granulat mittels eines Magneten separiert werden.The means according to the invention for detecting an analyte uses specific macroscopic granule particles ("MGP"). In this case, these particles may have different shapes and sizes, preferably sizes between 1 mm and 5 mm in cross section. The particles may consist of the known materials, which have the ability to carry on their surface the functional detection molecules (antibodies, aptamers, chemical groups, etc.). In addition, the granules used can be separated by means of a magnet.
Solch ein Material ist als Granulat unter dem Markennamen TECACOPM® bekannt.Such a material is known as granules under the trade name TECACOPM ®.
Das erfindungsgemäße Mittel weißt ebenfalls die für ELISA-Verfahren notwendige beschichtbare Oberfläche auf. Nach erfolgter Beschichtung kann das erfindungsgemäße Granulat für die Durchführung der Nachweisreaktion eingesetzt werden. Dies basiert auf den für ELISA-Anwendungen bekannten Abläufen:
- 1. Ein oberflächenbeschichtetes Granulat wird mit einer Probe in Kontakt gebracht, welche einen nachzuweisenden Analyten enthält. Dies kann dadurch erfolgen, dass das Granulat sich frei in der Probe befindet oder indem die Probe am Granulat vorbeigeleitet wird. Der Analyt bindet dabei spezifisch an das Granulat.
- 2. Nach einer kurzen Inkubation wird das Granulat mittels magnetischer Separation von der Probe getrennt und nachfolgend kurz gewaschen.
- 3. Anschließend wird das Granulat mit Nachweismolekülen (z.B. HRP-markiertes Antikörper) in Kontakt gebracht.
- 4. Danach wird das Granulat erneut unter Anwendung der magnetischen Separation gewaschen, um nichtgebundene Nachweismoleküle effizient abzutrennen.
- 5. Der finale Nachweis erfolgt z.B. nach Zugabe einer Substratlösung und durch kolorimetrische Messung der Substrat-Umsatzreaktion.
- 1. A surface coated granule is contacted with a sample containing an analyte to be detected. This can be done by the granules being free in the sample or by passing the sample past the granules. The analyte binds specifically to the granules.
- 2. After a short incubation, the granulate is separated from the sample by means of magnetic separation and subsequently washed briefly.
- 3. Subsequently, the granules are brought into contact with detection molecules (eg HRP-labeled antibody).
- 4. Thereafter, the granules are washed again using the magnetic separation to efficiently separate unbound detection molecules.
- 5. The final detection is carried out, for example, after addition of a substrate solution and by colorimetric measurement of the substrate conversion reaction.
Der am erfindungsgemäßen Mittel gebundene Analyt fungiert als Brücke zwischen dem erfindungsgemäßen Mittel und den übrigen Nachweiskomponenten. Nachweiskomponenten können dabei markierte Moleküle sein, die sich einerseits spezifisch an den Analyten binden und anderseits die Möglichkeit einer Detektion erlauben (z.B. Meerettichperoxidase-markierter Antikörper, mit einem fluoreszierenden Stoff markiertes Aptamer, ein weiteres Nachweismolekül gekoppelt an Partikel, welche selbst die Detektionsmoleküle enthalten etc.).The analyte bound to the agent of the invention acts as a bridge between the agent of the invention and the other detection components. Detection components can be labeled molecules which on the one hand bind specifically to the analyte and on the other hand allow the possibility of detection (eg horseradish peroxidase-labeled antibody, a fluorescently labeled aptamer, another detection molecule coupled to particles which themselves contain the detection molecules, etc. ).
Gemäß der Zielstellung der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße Mittel in idealster Weise geeignet, eine Nachweisreaktion zu ermöglichen. Das Granulat bietet eine ausreichend große Bindungsoberfläche für den Analyten. Es kann wegen seiner Makroeigenschaften und seiner magnetischen Eigenschaften in einem sehr großen Probenvolumen (z.B. 1 ml–100 ml) eingesetzt werden. Hierzu nutzt man vorzugsweise ein Verfahren, bei welchem die Probe am erfindungsgemäßen Mittel vorbeigeleitet wird. Damit wird erreicht, dass die in der Probe enthaltenen Analyten akkumulierend an der Oberfläche des Granulats angereichert werden. Diese Vorgehensweise ermöglicht einerseits die Sensitivität des Verfahrens zu erhöhen, anderseits die Probe mit dem Analyten mit einem für die Bindung günstigeren Puffer zu verdünnen und damit die Matrixeffekte der Probe zu minimieren. Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Mittels gegenüber einer Bead-basierten ELISA-Anwendung besteht darin, dass auf Grund der Größe der Granulate die Separation der Granulate aus der Probe sehr schnell erfolgt. Im Gegensatz dazu benötigen Nano- und Mikrometer große Beads extrem lange, um separiert werden zu können. Verluste an Beads treten überhaupt nicht mehr auf. Dies ist ein erhebliches Problem bei kleinen Beads.According to the object of the present invention, the agent according to the invention is ideally suited to enable a detection reaction. The granules provide a sufficiently large binding surface for the analyte. Due to its macro properties and its magnetic properties, it can be used in a very large sample volume (eg 1 ml-100 ml). For this purpose, use is preferably made of a method in which the sample is passed past the agent according to the invention. This ensures that the analytes contained in the sample accumulating on the surface of the granules are enriched. On the one hand, this procedure makes it possible to increase the sensitivity of the method, on the other hand to dilute the sample with the analyte with a buffer which is more favorable for the binding and thus to minimize the matrix effects of the sample. Another significant advantage of the agent according to the invention over a bead-based ELISA application is that due to the size of the granules, the separation of the granules from the sample takes place very rapidly. In contrast, nano- and micrometer-sized beads take an extremely long time to be separated. Loss of beads does not occur at all. This is a significant problem with small beads.
Eine spezielle Ausführungsform zur Automatisierung des Nachweisverfahrens besteht in einer Pipettenspitze, welche mit dem erfindungsgemäßen Granulat befüllt ist. Das Auf- und Abpipettieren der Probe ermöglicht die gewünschte Flüssigkeitsfluktuation an der Oberfläche des erfindungsgemäßen Mittels. Durch Pipettierschritte kann das Granulat auch in Kontakt mit den Nachweiskomponenten gebracht werden. Anderseits kann bei Bedarf das Granulat schon vor der Verbringung in die Spitze mit einem großen Volumen an Probe in Kontakt gebracht werden und nach einer magnetischen Separation in die Spitze überführt werden, was bei der Benutzung einer Pipettenspitze als Feste Phase in einem ELISA [3] nicht möglich ist.A special embodiment for automating the detection method consists in a pipette tip which is filled with the granules according to the invention. The pipetting up and down of the sample enables the desired fluid fluctuation on the surface of the agent according to the invention. Through pipetting steps, the granules can also be brought into contact with the detection components. On the other hand, if necessary, the granules can be brought into contact with a large volume of sample even before being transferred to the tip and transferred to the tip after a magnetic separation, which is not the case when using a pipette tip as the solid phase in an ELISA [3] is possible.
In dem Fall der Verbringung des Granulates in eine Pipettenspitze treten seine magnetischen Eigenschaften in der Bedeutung zurück, seine makroskopischen Eigenschaften können aber genutzt werden: MGP verbleiben in der Pipettenspitze während der Pipettierschritte. Die Verbringung des Granulates in eine Pipettenspitze löst auch das Problem mit der Kreuzkontamination der benachbarten Proben. Es ist auch möglich, alle Automatisierungssysteme, die auf magnetischer Separation basieren, für die durchzuführenden ELISA zu verwenden, was mit nicht-magnetischen Makropartikeln nicht möglich ist. Darüber hinaus kann auch in einer Pipettenspitze die Separation der Granulate mittels eines Magnetfeldes erfolgen.In the case of the transfer of the granules into a pipette tip, its magnetic properties decline in importance, but its macroscopic properties can be exploited: MGP remain in the pipette tip during the pipetting steps. Transferring the granules into a pipette tip also solves the problem of cross-contamination of the adjacent samples. It is also possible to use all automation systems based on magnetic separation for the ELISA to be performed, which is not possible with non-magnetic macroparticles. In addition, the separation of the granules by means of a magnetic field can also take place in a pipette tip.
Besonders gut einsetzbar ist das erfindungsgemäße Mittel z.B. für ein Online-Monitoring in Durchflusssystemen. Hierbei erfolgt die Bindung des Analyten an das erfindungsgemäße Mittel innerhalb einer Bypassleitung und der Analyt kann anschließend innerhalb kürzester Zeit außerhalb der Leitung detektiert werden.The agent according to the invention is particularly suitable for use, e.g. for online monitoring in flow systems. In this case, the binding of the analyte to the agent according to the invention takes place within a bypass line and the analyte can subsequently be detected within the shortest possible time outside the line.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Beispielen näher beschrieben werden. Dabei stellen die Ausführungsbeispiele keine Limitierung der Erfindung dar.The invention will be described below with reference to examples. The embodiments do not represent a limitation of the invention.
Ausführungsbeispiel 1:
Nachweis des C-reaktiven Proteins (CRP)Detection of the C-reactive protein (CRP)
Die Nachweisgrenze von CRP bei kommerziellen Assays liegt bei 1 mg/L.The detection limit of CRP in commercial assays is 1 mg / L.
Ein Polypropylen-Magnetgranulat (Durchmesser ca. 4 mm) wurde mit anti-CRP-Antikörper (Senova GmbH) 5 Stunden lang inkubiert. Der Antikörper lagerte sich durch die hydrophoben Wechselwirkungen an der Granulatoberfläche an. Anschließend wurde das funktionalisierte Granulat geblockt. Jeweils ein funktionalisiertes Granulatkorn wurde pro Nachweisreaktion verwendet. Der zweite anti-CRP-Antikörper wurde mit HRP (Horseradish peroxidase) für einen späteren kolorimetrischen Nachweis konjugiert.A polypropylene magnetic granulate (diameter about 4 mm) was incubated with anti-CRP antibody (Senova GmbH) for 5 hours. The antibody attached to the granule surface through hydrophobic interactions. Subsequently, the functionalized granules were blocked. One functionalized granule was used per detection reaction. The second anti-CRP antibody was conjugated with HRP (horseradish peroxidase) for later colorimetric detection.
Eine Verdünnungsreihe des CRP-Antigens wurde hergestellt:
1: 30 mg/L, 2: 3 mg/L, 3: 1,5 mg/L, 4: 0,75 mg/L, 5: 0,37 mg/L, 0,06 mg/LA dilution series of the CRP antigen was prepared:
1: 30 mg / L, 2: 3 mg / L, 3: 1.5 mg / L, 4: 0.75 mg / L, 5: 0.37 mg / L, 0.06 mg / L
Der Immunoassay wurde wie folgt durchgeführt:
- 1. Ein Magnet-Granulat-Korn wurde mit 50 µl CRP Antigen aus der Verdünnungsreihe und 150 µl PBS in Kontakt gebracht.
- 2. Inkubation 30 min unter rotierender Bewegung
- 3. 3× Waschen mit konventionellen ELISA-Washing-Buffer (AJRobescreen GmbH). Begleitet von Magnetseparation des Magnet-Granulats.
- 4. Zugabe des HRP-markierten anti-CRP Detektionsantikörpers zu dem Granulatkorn.
- 5. Inkubation 30 min unter rotierender Bewegung
- 6. 3× Waschen mit konventionellen ELISA-Washing-Buffer (AJRobescreen GmbH). Begleitet von Magnetseparation des Magnet-Granulats.
- 7. Die Magnet-Granulat-Körner wurden in eine ELISA-Reader-kompatible Mikrotiterplatte überführt.
- 8. Eine kolorimetrische HRP-vermittelte TMB-Färbung diente der Vermessung der Proben in einem ELISA-Reader bei 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm (Thermo Fisher). Messergebnisse (
Mittelwert aus 3×Reaktion) s. Tab.1.
- 1. A magnetic granule bead was contacted with 50 μl CRP antigen from the dilution series and 150 μl PBS.
- 2. Incubation for 30 min while rotating
- 3.
Wash 3 × with conventional ELISA Washing Buffer (AJRobescreen GmbH). Accompanied by magnetic separation of the magnetic granules. - 4. Add the HRP-labeled anti-CRP detection antibody to the granule.
- 5. Incubation for 30 min while rotating
- 6.
Wash 3 × with conventional ELISA Washing Buffer (AJRobescreen GmbH). Accompanied by magnetic separation of the magnetic granules. - 7. The magnetic granules were transferred to an ELISA reader-compatible microtiter plate.
- 8. A colorimetric HRP-mediated TMB staining was used to measure the samples in an ELISA reader at 450 nm and a reference wavelength of 630 nm (Thermo Fisher). Measurement results (average of 3 × reaction) s. Table 1.
Tab. 1 Messwerte bei 450 nm
Der Versuch belegt eine hintergrundarme Detektion des Antigens CRP bis zur Detektionsgrenzen, die unterhalb der Detektionsgrenze konventioneller CRP-ELISA liegen.The test demonstrates a low-background detection of the antigen CRP up to the detection limits, which are below the detection limit of conventional CRP-ELISA.
Ausführungsbeispiel 2:Embodiment 2:
Einfluss des Probenvolumens auf die Signalstärke bei der Detektion von CRPInfluence of the sample volume on the signal strength in the detection of CRP
Die Vorbereitung des Magnetgranulats für den Versuch erfolgte wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben.The preparation of the magnetic granules for the experiment was carried out as described in Example 1.
Das Antigen CRP wurde in einer Konzentration von 0,03 mg/L hergestellt.The antigen CRP was prepared at a concentration of 0.03 mg / L.
Die Magnet-Granulat-Körner wurden mit folgenden Volumina der Probe inkubiert:
1. 50 µl, 2. 100 µl, 3. 1 ml, 4. 5 ml, 5. 10 mlThe magnetic granules were incubated with the following volumes of the sample:
1. 50 μl, 2. 100 μl, 3. 1 ml, 4. 5 ml, 5. 10 ml
Nach einer Inkubation für eine Stunde wurden die Granulat-Körner wie im Beispiel 1 für eine Detektion mit einem ELISA-Reader vorbereitet. Die Ergebnisse der Messung s. Tabelle 2 (Mittelwert aus 3× Bestimmung) Tab. 2 Messwerte bei 450 nm
Der Versuch zeigt, dass die Erhöhung des Probenvolumens zu einer höheren Sensitivität führt, was einen Vorteil gegenüber eines herkömmlichen ELISA darstellt, bei dem das Probenvolumen durch die Größe der Mikrotiterplatte limitiert ist. The experiment shows that the increase in the sample volume leads to a higher sensitivity, which is an advantage over a conventional ELISA, in which the sample volume is limited by the size of the microtiter plate.
Literatur:Literature:
-
[1]
http://www.candor-bioscience.de/methoden/elisa.html http://www.candor-bioscience.de/methoden/elisa.html -
[2]
A new method of measuring C-reactive protein, with a low limit of detection, suitable for risk assessment of coronary heart disease. Eda S, Kaufmann J, Molwitz M, Vorberg E. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1999;230:325 A new method of measuring C-reactive protein, with a low limit of detection, suitable for risk assessment of coronary heart disease. Eda S, Merchant J, Molwitz M, Vorberg E. Scand J. Clin Lab Invest Suppl. 1999; 230: 325 -
[3]
An automated ELISA system using a pipette tip as a solid phase and a pH-sensitive field effect transistor as a detector Hitoshi Tsuruta, Hideaki Yamada, Yukiko Motoyashiki, Keiko Oka, Chieko Okada, Michihiro Nakamura Journal of Immunological Methods 183 (1995) 221–229 Hitoshi Tsuruta, Hideaki Yamada, Yukiko Motoyashiki, Keiko Oka, Chieko Okada, Michihiro Nakamura Journal of Immunological Methods 183 (1995) 221- 229 -
[4]
Vadim V Shmanai, Tamara A Nikolayeva, Ludmila G Vinokurova, and Anatoli A Litoshka Oriented antibody immobilization to polystyrene macrocarriers for immunoassay modified with hydrazide derivatives of poly(meth)acrylic acid BMC Biotechnol. 2001; 1:4 Vadim V Shmanai, Tamara A Nikolayeva, Ludmila G Vinokurova, and Anatoli A Litoshka Modified antibody immobilized to polystyrene macrocarriers for immunoassay modified with hydrazide derivatives of poly (meth) acrylic acid BMC Biotechnol. 2001; 1: 4
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.This list of the documents listed by the applicant has been generated automatically and is included solely for the better information of the reader. The list is not part of the German patent or utility model application. The DPMA assumes no liability for any errors or omissions.
Zitierte PatentliteraturCited patent literature
- WO 8808875 [0003] WO 8808875 [0003]
- US 4956302 [0003] US 4956302 [0003]
- US 20030054358 A1 [0003] US 20030054358 A1 [0003]
Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature
- ELISAs (zum Nachweis von Proteinen oder Nukleinsäuren, R. Yalow et al. J. Clin. Invest.. 39, 1157–75 (1960) [0003] ELISAs (for the detection of proteins or nucleic acids, R. Yalow et al J. Clin Invest .. 39, 1157-75 (1960) [0003]
- Blotting-Techniken (zum Nachweis von Proteinen und Nukleinsäuren Southern, E.M. J. Mol. Biol. 98 503–517 (1975) [0003] Blotting techniques (for the detection of proteins and nucleic acids Southern, EMJ Mol. Biol. 98 503-517 (1975) [0003]
- Alwine JC et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 74,5350–5354 (1977) [0003] Alwine JC et al. Proc. Natl. Acad. Sci. US A 74,5350-5,354 (1977) [0003]
- Renart, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (7), 3116–3120 (1979) [0003] Renart, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (7), 3116-3120 (1979) [0003]
Claims (11)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102016212908 | 2016-07-14 | ||
| DE102016212908.2 | 2016-07-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE102016224234A1 true DE102016224234A1 (en) | 2018-01-18 |
Family
ID=60783043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE102016224234.2A Pending DE102016224234A1 (en) | 2016-07-14 | 2016-12-06 | MEANS AND METHOD FOR THE DETECTION OF ANALYTES BY MEANS OF MACROSCOPIC GRANULATE PARTICLES |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE102016224234A1 (en) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0234083A2 (en) * | 1986-02-25 | 1987-09-02 | Tosoh Corporation | Carrier for a biologically active component for immunoassay or enzymatic reaction |
| WO1988008875A1 (en) | 1987-05-05 | 1988-11-17 | The Washington Technology Center | Cycling biochip sensor |
| US4956302A (en) | 1987-09-11 | 1990-09-11 | Abbott Laboratories | Lateral flow chromatographic binding assay device |
| DE4423878A1 (en) * | 1994-07-07 | 1996-01-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Device and method for separating magnetic microparticles |
| US20030054358A1 (en) | 1996-07-29 | 2003-03-20 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
| US9383355B2 (en) * | 2008-10-10 | 2016-07-05 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Methods and related devices for continuous sensing utilizing magnetic beads |
-
2016
- 2016-12-06 DE DE102016224234.2A patent/DE102016224234A1/en active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0234083A2 (en) * | 1986-02-25 | 1987-09-02 | Tosoh Corporation | Carrier for a biologically active component for immunoassay or enzymatic reaction |
| WO1988008875A1 (en) | 1987-05-05 | 1988-11-17 | The Washington Technology Center | Cycling biochip sensor |
| US4956302A (en) | 1987-09-11 | 1990-09-11 | Abbott Laboratories | Lateral flow chromatographic binding assay device |
| DE4423878A1 (en) * | 1994-07-07 | 1996-01-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Device and method for separating magnetic microparticles |
| US20030054358A1 (en) | 1996-07-29 | 2003-03-20 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
| US9383355B2 (en) * | 2008-10-10 | 2016-07-05 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Methods and related devices for continuous sensing utilizing magnetic beads |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| A new method of measuring C-reactive protein, with a low limit of detection, suitable for risk assessment of coronary heart disease. Eda S, Kaufmann J, Molwitz M, Vorberg E. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1999;230:325 |
| Alwine JC et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 74,5350–5354 (1977) |
| An automated ELISA system using a pipette tip as a solid phase and a pH-sensitive field effect transistor as a detector Hitoshi Tsuruta, Hideaki Yamada, Yukiko Motoyashiki, Keiko Oka, Chieko Okada, Michihiro Nakamura Journal of Immunological Methods 183 (1995) 221–229 |
| Blotting-Techniken (zum Nachweis von Proteinen und Nukleinsäuren Southern, E.M. J. Mol. Biol. 98 503–517 (1975) |
| ELISAs (zum Nachweis von Proteinen oder Nukleinsäuren, R. Yalow et al. J. Clin. Invest.. 39, 1157–75 (1960) |
| http://www.candor-bioscience.de/methoden/elisa.html |
| Renart, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (7), 3116–3120 (1979) |
| Vadim V Shmanai, Tamara A Nikolayeva, Ludmila G Vinokurova, and Anatoli A Litoshka Oriented antibody immobilization to polystyrene macrocarriers for immunoassay modified with hydrazide derivatives of poly(meth)acrylic acid BMC Biotechnol. 2001; 1:4 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3322373C2 (en) | Test means and methods for the detection of antigens and / or antibodies | |
| EP2223111B1 (en) | Elispot method having two filter systems | |
| DE102014005993A1 (en) | Method for enriching trace components from a liquid biological sample | |
| EP3011338B1 (en) | Rapid test for detecting pathogen material, in particular in order to support the diagnosis of sepsis, and kit and device for performing a sepsis test | |
| DE102019117289A1 (en) | Carrier material, kit system and method for biological assays | |
| DE60130919T2 (en) | FLOW DEVICE, THIS INCLUDING DIAGNOSTIC KIT, AND USE FOR THE DETECTION OF ANALYTES IN A SAMPLE | |
| DE102017005543A1 (en) | Method for detecting extracellular vesicles in a sample | |
| DE19508772C2 (en) | Methods and connections for the detection of analytes by means of remanence measurement and their use | |
| EP3116650B1 (en) | Method and device for the determination of biological analytes | |
| EP1766401B1 (en) | Method for the simple and rapid detection of cells and biomolecules by means of paramagnetic particles | |
| DE60017017T2 (en) | IMMUNTEST USING PARTICLES WITH CASEIN Hulls | |
| DE102015201422A1 (en) | Magnetic signal measuring device and magnetic signal measuring method | |
| EP2634579B1 (en) | Method for performing immuno-assays in zero gravity | |
| DE112018007595T5 (en) | Method for the detection of the target tumor serum nucleic acid ligand complex and a kit | |
| DE102016224234A1 (en) | MEANS AND METHOD FOR THE DETECTION OF ANALYTES BY MEANS OF MACROSCOPIC GRANULATE PARTICLES | |
| WO2019042521A1 (en) | Means and method for detecting analytes by means of macroscopic granulate particles | |
| EP1564556A1 (en) | Method and apparatus for assaying several analytes simultaneously with an internal control | |
| WO2002029430A1 (en) | Method and device for examining biological and/or chemical samples by means of giant magneto-impedance (gmi) | |
| EP2201132A2 (en) | Marker sequences for multiple sclerosis and use thereof | |
| DE10325152B4 (en) | Method for the quantitative determination of an unknown amount of a target molecule species | |
| WO2021259406A1 (en) | Method, use of the method and kit for detecting bioindicators in a sample | |
| DE4223791C1 (en) | Method and device for the detection of analytes in liquids | |
| DE19857936C1 (en) | In vitro diagnosis of allergy, useful e.g. for early detection of food allergy in babies, by applying whole blood to support carrying allergens and anticoagulant | |
| EP2700948B1 (en) | Method for performing a biochemical analysis, in particular in space | |
| DE102006058374A1 (en) | Analytical method and portable analyzer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R086 | Non-binding declaration of licensing interest | ||
| R163 | Identified publications notified | ||
| R012 | Request for examination validly filed |